TWI547283B - The use of dead bacteria belonging to the genus Lactobacillus of Enterococcus or its treated product for the manufacture of small intestinal villi elongants - Google Patents

The use of dead bacteria belonging to the genus Lactobacillus of Enterococcus or its treated product for the manufacture of small intestinal villi elongants Download PDF

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TWI547283B
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Description

屬於腸球菌屬之乳酸菌之死菌體或其處理物用於製造小腸絨毛伸長劑的用途
本發明係有關一種以乳酸菌、其死菌體或其等之處理物為其有效成分之人類或仔豬等之小腸絨毛伸長劑。
小腸由上而始依序稱為十二指腸、空腸及迴腸，其中，與胃相連的十二指腸係固定於後腹壁，而空腸及迴腸則係附於腸間膜，可作大幅之自由活動。該空腸及迴腸稱為腸間膜小腸，所謂之小腸係指此一部分。小腸在消化-吸收之層面，乃消化管中最重要之器官，為了增大消化-吸收面積，於是作顯著之形態分化。小腸之形態特徵之一係小腸絨毛，其為小腸黏膜之突出，由單層之上皮細胞所覆蓋，且其係細胞表面進一步具有達到數千個之稱為微絨毛之突起。絨毛構造係小腸之一大特徵，對於吸收性能大幅相關。人類之小腸若只將其考慮成圓筒時之表面積約為0.33 m2 ，因輪狀皺褶，進而因絨毛(長1 mm，約500萬個)的形成，其表面積約可達100 m2 。又，每1個吸收細胞有600個微絨毛(長1 μm)存在，因此其表面積進一步達到200 m2 (約600倍)，可使吸收效率顯著增大。亦即，腸容積雖只有1 μl，但卻具有約1 cm2 之吸收表面積。腸絨毛係隨著接近迴腸而變粗，絨毛與絨毛間有小腸陰窩。其黏膜上皮中，大部分係重複進行旺盛的細胞分裂及增殖，一面分化成吸收上皮或杯細胞，並一面向絨毛表面移動，與老舊的絨毛上皮置換。又，腸之上皮細胞中混有許多內分泌細 胞，局部地或全身地分泌各種荷爾蒙。
糖質、蛋白質、脂肪等之營養素係由微絨毛吸收。此部分中，消化酵素一直在待命，營養素碰撞到此等酵素被分成許多分散塊，立即被納入腸內。微絨毛細胞之壽命為24小時，是人體中最短命的細胞。對人類生存而言不可或缺之營養吸收的現場，不管何時都必須存在具有新鮮感度的細胞。另，小腸大致是無菌狀態。哺乳動物的肉眼病變，小腸壁的薄化是其特徵，透過腸壁內容物可被通透觀查到，在哺乳類的豬中，未消化凝固物會留存於胃內。病毒係在小腸的黏膜上皮細胞處增殖，引起細胞的變性壞死。小腸絨毛的萎縮可能會造成絨毛高與陰窩長的比低至約1:1。腸絨毛因具有排除外部而來的異物之強大免疫機構，若發生絨毛萎縮，則細菌將變得易於侵入(感染)，一般有時會成為無感染力之細菌造成感染的原因。
形成與體外環境之邊界的消化管黏膜上皮經常曝露於大量的食餌性抗原或腸內細菌叢、或外來性細菌或病毒等之病原體。消化管中，以派亞式淋巴結為首的淋巴組織發達，藉由吸納入監控腸內之微生物或食餌性高分子等之抗原，在免疫監視上可發揮重要之效果。覆蓋派亞式淋巴結之上皮稱為FAE (follicle-associated epithelium)，據知具有與一般絨毛上皮不同的性質。FAE中有稱為M細胞之微絨毛不發達的上皮細胞以點狀存在，可使穿胞運輸此一細胞內輸送系統發達，並積極地納入腸內抗原轉給派亞式淋巴結的免疫細胞，藉此，據信可擔當發動免疫監視之主要機 能。若可了解以穿胞運輸為首之M細胞的機能並人為地予以調節，與免疫應答的控制將會搭上關係，然而，M細胞其絕對數少且無特異標誌分子，因此其分子生物學解析近乎闕如。又，腸管上皮細胞之緊密連接的膜分子之障壁機能(物質透過性)被指出可能與過敏症有關。例如，因小兒期的緊密連接形成的不充分，無法獲得納入之食物抗原的選擇性，而導致過敏症的症狀。
迄今為止，乳酸菌與腸絨毛高度的關聯文獻不多，針對與腸絨毛上皮細胞的關係，例如已有將動物之腸絨毛上皮細胞在乳酸菌糞鏈球菌之存在下組織培養，僅選擇採取進入腸上皮細胞之菌株，使用該選擇之菌株依一般方法形成乳酸菌製劑之腸管固定性確實的乳酸製劑之製法(例如，參見專利文獻1)等等。又，最近，又為人所知的是一種具有增加腸絨毛高度，促進腸吸收作用之對於處置短腸症候群有用的EGF(上皮生長因子)產生重組乳酸菌，具體而言例如EGF產生重組雷特氏乳球菌、EGF產生重組乾酪乳球菌(例如參見專利文獻2)。
另一方面，作為乳酸菌本身或其處理物之用途，可舉的是近年持續增加之過敏性疾病的預防。例如，對糞鏈球菌等之乳酸菌施以特定之處理，自乳酸菌抽出作為抗過敏劑有效之成分之方法(例如參見專利文獻3)，或將屬於鏈球菌屬、腸球菌屬之腸內細菌之生菌體作為抗敏感成分之腸內細菌叢改善組合物(例如參見專利文獻4)，或將嗜酸乳酸桿菌等之乳酸菌的菌體作為有效成分之IgE抗體產生抑制劑 (例如參見專利文獻5)，業已為人所知。
又，作為以屬於腸球菌屬之菌體的酵素處理菌作為主成分之抗敏感劑(例如參見專利文獻6)、或由人類之腸內細菌群所分離之乳酸菌，已有含有糞腸球菌(AD101株)、洛德乳酸桿菌(AD0002株)中1種以上之菌體的具有組胺游離抑制效果的I型過敏抑制劑(例如參見專利文獻7)、以乳酸菌之菌體成分作為主成分之T幫助細胞l型(Th1)誘導劑(例如參見專利文獻8)、以選自包含屬於嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)之乳酸菌、屬於發酵乳酸桿菌(Lactobacillus fermentum)之乳酸菌及其等之組合的群組之乳酸菌為其有效成分之抗過敏劑(例如參見專利文獻9)，業已為人所知。此外，以糞腸球菌(Enterococcus faecalis)等之乳酸菌、其死菌體、其等之處理物、或是埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)為其有效成分之針對帶萬古黴素等耐藥劑性菌或受其感染之家禽、家畜或魚介類之感染預防治療劑，(例如參見專利文獻10)，也已為人所知。
[專利文獻]特公昭46-38592號公報
[專利文獻]特表2005-529622號公報
[專利文獻]特開昭57-154132號公報
[專利文獻]特開平7-265064號公報
[專利文獻]特開平9-2959號公報
[專利文獻]特許第3040744號公報
[專利文獻]特開2000-95697號公報
[專利文獻]特開2003-137795號公報
[專利文獻]特開2004-26729號公報
[專利文獻]特開2006-89421號公報
然而，斷奶仔豬之消化器，會處於由母乳轉移至豬用飼料之急劇性餌料之變化，或斷奶或環境之變化等的壓力狀態下，在此狀態下，因病原性大腸菌之故常會引起下痢症狀。這是因為，斷奶前後仔豬的腸管內會有變化，健康的腸絨毛會長狀地伸長，因此腸的表面積會格外地擴張而促進消化吸收。又，哺乳期間中，母乳中所含之IgA抗體，在每次哺乳時會由母乳供給，據知其會覆蓋腸絨毛之表面以防止大腸菌等之病原性微生物附著於仔豬之腸絨毛。然而，營養豐富且消化性佳之母乳，若因斷奶而中斷並急劇改吃成豬用飼料時，腸黏膜之消化吸收將無法追得上其變化，且腸絨毛會變短(參見Res Vet Sci 1986 Jan;40(1):32-40)，營養成分之吸收力降低。因此一狀態，無法吸收的養分會到達大腸，而引起含此等病原性微生物之各種微生物的增殖。本發明之課題，係在提供一種在包含人類之動物中，可促進小腸之絨毛伸長而改善消化吸收之絨毛伸長劑。
本發明人等，如同先前技術，不使用產生EGF之重組乳酸菌，將某種糞腸球菌之死菌體經口或經鼻投與至斷奶期之仔豬，發現小腸內之絨毛長度，如就該乳酸菌投與群與 未投與之對照群比較，投與群可做有意義的伸長，據此完成本發明。
具體言之，本發明係有關：(1)一種動物之小腸絨毛伸長劑，其特徵在於：含有乳酸菌(惟EGF產生重組乳酸菌除外)、其死菌體及其等之處理物作為其有效成分；(2)如上述(1)之動物之小腸絨毛伸長劑，其中該乳酸菌係屬於腸球菌屬之微生物；(3)如上述(2)之動物之小腸絨毛伸長劑，其中該屬於腸球菌屬之微生物係糞腸球菌(Enterococcus faecalis); (4)如上述(3)之動物之小腸絨毛伸長劑，其中該糞腸球菌(Enterococcus faecalis)係糞腸球菌(Enterococcus faecalis)EC-12 (FERM BP10284); (5)如上述(1)至(4)中任一項之之動物之小腸絨毛伸長劑，其係被經口或經鼻投與。
此外，本發明係有關：(6)一種將乳酸菌(惟EGF產生重組乳酸菌除外)、其死菌體及其等之處理物，作為動物之小腸絨毛伸長劑使用之方法；(7)如上述(6)之方法，其中該乳酸菌係屬於腸球菌屬之微生物；(8)如上述(7)之方法，其中該屬於腸球菌屬之微生物係糞腸球菌(Enterococcus faecalis); (9)如上述(8)方法，其中該糞腸球菌(Enterococcus faecalis)係糞腸球菌(Enterococcus faecalis)EC-12 (FERM BP10284); (10)如上述(6)至(9)中任一項之之方法，其係經口或經鼻投與。
本發明之小腸絨毛伸長劑藉由伸長小腸絨毛，可改善人 類乳幼兒期或斷奶期之仔豬的消化吸收，可期待能改善起因於消化不良的疾病、小腸切除之短腸症候群患者之消化吸收、及低營養狀態。
本發明之小腸絨毛伸長劑，只要是以乳酸菌(惟EGF產生重組乳酸菌除外)、其死菌體及其處理物作為其有效成分者皆可，並無特殊限制，又，本發明之方法，只要是將含有乳酸菌(惟EGF產生重組乳酸菌除外)、其死菌體及其等之處理物作為動物之小腸絨毛伸長劑使用之方法皆可，並無特殊限制。作為對象之動物可適當例示的是人類以外的家畜-家禽類或寵物類，作為家畜-家禽類，可舉的是豬、牛、馬、羊、山羊等之家畜，雞、野鴨、駝鳥、家鴨等之家禽，作為寵物類，可舉的是狗、貓、兔、倉鼠等。又，使用方法中之動物，可適當例示的是家畜-家禽類或寵物類。
作為上述乳酸菌，宜為腸球菌屬(Entrococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Storeptococcus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、白念珠球菌屬(Leuconostoc)、小球菌屬(Pediococcus)、雙叉桿菌屬(Bifidobacterium)、四體球菌屬(Tetragenococcus)中之任一種，特別好的是屬於腸球菌屬之菌。
上述屬於腸球菌屬之菌，可舉的是糞腸球菌、屎腸球菌、杜蘭氏球菌，特別好的是糞腸球菌EC-12。上述屬於乳球菌屬之菌，可舉的是雷特氏乳球菌、植物乳球菌、棉 子糖乳球菌等等。上述屬於鏈球菌屬之菌，可舉的是嗜熱鏈球菌等。上述屬於乳酸桿菌屬之菌，可舉的是嗜酸乳酸桿菌、唾液乳酸桿菌、短乳酸桿菌、鼠李糖乳酸桿菌、胚芽乳酸桿菌、瑞士乳酸桿菌、發酵乳酸桿菌、副乾酪乳酸桿菌、乾酪乳酸桿菌、戴白氏乳酸桿菌、洛德乳酸桿菌、加氏乳酸桿菌、約氏乳酸桿菌、克菲爾乳酸桿菌、布魯內李乳酸桿菌等等。上述屬於白念珠球菌屬之菌，可舉的是乳明串珠菌、腸膜狀明串珠菌。上述屬於小球菌屬之菌，可舉的是有害片球菌等。上述屬於雙叉桿菌屬之菌，可舉的是短型雙叉桿菌、龍根雙叉桿菌、青春雙叉桿菌、雙岐雙叉桿菌等，特別好的是短型雙叉桿菌。上述屬於四體球菌屬之菌，可舉的是嗜鹽四體球菌等。
此等乳酸菌可混配一種或兩種以上之菌種使用。此等乳酸菌，可依一般方法以任意條件培養獲得。
本發明中，乳酸菌可以生菌、其死菌體或其等之處理物之形態使用。作為上述死菌體，可舉的是將依一般方法培養集菌之乳酸菌之菌體洗淨，予以離心脫水，再因應必要重複洗淨-脫水後，予以懸浮於蒸餾水、生理食鹽水等中，將該懸浮液例如以80~115℃作30分～3秒間之加熱所獲得之死菌體懸浮液或其乾燥物，或是對上述死菌體懸浮液照射伽馬射線或中子線所得之死菌體懸浮液或其乾燥物。作為該死菌體懸浮液之乾燥方法，只要是習知之乾燥方法即可，並無特殊限制，可舉的是噴霧乾燥、冷凍乾燥等等。依場合需要，在利用加熱等殺菌處理前後、或乾燥處 理前後，可進行酵素處理、界面活性劑處理、磨碎-粉碎處理，由此等處理所獲得之處理物也包含在本發明之死菌體或其處理物內。
作為本發明之小腸絨毛伸長劑，特別好的是以含糞腸球菌EC-12之死菌體或其等之處理物作為有效成分之組合物。糞腸球菌EC-12係在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心(〒305-8566日本茨城縣茿波市東1丁目1番地中央地6)中，於2005年2月25日以「FERM BP-10284」寄存。有關此糞腸球菌EC-12(FERM BP-10284)之培養方法，包含一般習知之乳酸菌之培養方法，並無特殊限制，可舉的較佳例為使用乳酸菌生育用培養基，在37℃下將培養pH維持於中性附近，一面作5~120小時，宜作16~28小時之培養，而獲得生菌數約為107 ~1010 /ml，宜約為108 ~1010 /ml之培養液之方法。
將本發明之小腸絨毛伸長劑作為製劑使用時，可混配以澱粉、乳糖、大豆糖蛋白等之載體，及賦形劑、結合材料、崩壞劑、滑劑、安定劑、懸浮劑等之添加劑，以習知方法製劑化成粉劑、錠劑、顆粒劑、膠囊劑、液劑等。此外，也可與葡糖酸鹽、半乳寡糖等之寡糖類或纖維素、β-D-葡萄糖多糖類、脫乙醯甲殼質等之食物纖維素材等之腸內菌叢控制生菌素材組合使用。相關製劑可原狀投與，或與嬰兒食品、飼料等混合。
再者，也可將本製劑作為小腸術後患者等之小腸絨毛伸長劑，添加於食品或食品素材中使用。作為其種類並無特 殊限制，可舉的例如是礦泉水、運動飲料、果汁、牛乳、豆奶、酒類、咖啡、紅茶、煎茶、烏龍茶等之各種飲料，酸奶、飲用式酸奶，布丁、小點心、麵包、蛋糕、果凍、煎餅等之燒烤點心、羊羹等之冷點心、口香糖等之麵包-點心類，或鳥龍麵、簥麥麵等之麵類，或魚板、洋火腿、魚肉香腸等之魚肉練製品，味噌、醬油、散佈性裝飾食品、沙拉醬、甘味料等之調味類，或乳酪、牛油等之乳製品，或豆腐、蒟蒻、其他之海產混煮食物、餃子、馬鈴薯油炸餅、沙拉等之各種日常菜餚。
本發明之小腸絨毛伸長劑或使用方法中之投與量或投與次數，可因應對象動物之種類、體重、日齡、月齡、病狀、恢復狀態而適當決定，就人類而言，宜在乳幼兒期或小腸切除後投與，豬等之家畜宜在斷奶期投與。例如，使用糞腸球菌EC-12之死菌體或其處理物時，係在嬰兒食品或飼料中以0.0001%~0.2%含有，更為人所期望的是以0.01%~0.05%含於飼料中，相對成人，可以50 mg~600 mg/日作為通常1日的投與量，次數可適當選擇。
以下，茲以實施例將本發明作更具體說明，本發明之技術範圍不受此等例示之限制。
[實施例1] (實驗目的)
仔豬因斷奶以致小腸絨毛會萎縮而對消化吸收帶來不良影響，因此有必要預防絨毛高之萎縮或使其早日恢復。就糞腸球菌EC-12之死菌體作經口或經鼻投與時之對於小腸 中絨毛的影響，進行組織學評估，一起研討小腸組織培養中之免疫關連分子的基因表現量。
(糞腸球菌EC-12之死菌體之調製)
將糞腸球菌EC-12之死菌體(FERM BP-10824)以Rogosa培養基在37℃下24小時培養所得之前培養液，以0.1(v/v)接種於含酵母萃取物4%、聚蛋白腖3%、及乳糖10%之液體培養基中，使用pH控制計利用苛性鈉水溶液將其pH調整於6.8~7.0之間，一面在37℃下作22~24小時之中和培養。培養終了後，以連續離心機將菌體離心、回收後，加水稀釋成原始之液量，再度以連續離心機將菌體分離、回收。將此操作合計重複4次，將菌體洗淨。其次，將洗淨之菌體懸浮於適量之水中，在100℃下作30分鐘之殺菌後，使用展佈乾燥器將菌體乾燥，調製成加熱處理粉末(以下稱為「EC-12乾燥粉末」)。
(方法)
將EC-12乾燥粉末預先以麵粉製作成10倍稀釋之預混合物，以EC-12乾燥粉末含有0.05%之方式予以添加於基礎飼料SDS No.1(日本配合飼料株式會社製)中，使用所得之飼料。又，對照飼料係採用將0.5%市售麵粉添加於基礎飼料中所得物。作為被檢測動物，係採用剛斷奶之仔豬6頭，予以分成EC-12乾燥粉末經口投與群(OE群)及對照群(OC群)，就OE群以EC-12乾燥粉末含如上之0.05%(w/w)之方式予以添加於飼料中，就OC群則將上述對照飼料分別投與10日或11日。又，將剛斷奶的仔豬6頭分成EC-12經鼻投與 (NE群)及對照群(NC群)，就NE群以10 mg/kg體重之EC-12乾燥粉懸浮PBS，就NC群則以PBS，對於左右鼻腔內分別作1 ml之10日或11日之每日噴灑。，飼育後，將小腸摘出切出其一部分，製作薄切樣本。更具體而言，將小腸兩部位(空腸末端部及迴腸中央部)展開後，為除去其內容物，以生理食鹽水洗淨後，將其伸展貼附於發泡苯乙烯上。以10%中性緩衝福馬林固定後，以使斷面出現之方式細切成3~5 mm程度後，以10%中性緩衝福馬林再固定。將組織包埋於石蠟中，予以薄切成4 μm後，予以貼附於載物玻片上，施以HE染色。將斷面全面以CCD照相機數位攝影，利用NIH Image計測絨毛高及因窩深。另以對物測微計之刻度，以比率算出mm值。
又，採取絨毛黏膜固有層，將組織片在RPMI1640培養基內在37℃下作2日之培養。此時，作為抗原使用EC-12乾燥粉末，解析培養上清液中之IgA及IgG度及培養後之組織中之各種免疫物質基因表現。IgA及IgG濃度之測定係使用Pig IgA ELISA Quantitation Kit (Bethyl Montgomery, TX, USA)及Pig IgG ELISA Quantitation Kit (Bethyl)。使用NucleoSpinRNA II Kit (Macherey-Nagel, Eason, PA, USA)由各組織抽出mRNA，使用ReverTra Ace (TOYOBO, Tokyo)進行逆轉錄。將IFN-γ、IL-8(嗜中性白血球)、IL-10(趨化素合成阻止因子)、TNF-α之mRNA的表現，使用即時PCR解析，以家務基因GAPDH之數值進行補正。
(結果)
圖1係說明小腸組織之模式圖(Kerr, 1999)，圖2係說明小腸組織之用語(絨毛、陰窩)之圖，圖3係表示對於仔豬小腸(空腸部)絨毛高，乳酸菌EC-12乾燥粉末經口投與所帶來之影響。由圖3可知，藉由EC-12乾燥粉末經口投與，空腸部之絨毛伸長變高。又，EC-12乾燥粉末經口投與試驗之迴腸與空腸中之絨毛高的測定結果係示於表1中，EC-12乾燥粉末經鼻投與試驗之迴腸與空腸中之絨毛高的測定結果係示於表2。由表1可知，OE群與OC群比較，小腸絨毛高顯示較高之值。由表2可知，NE群與NC群比較也是，小腸絨毛高顯示較高之值。因不論是經口投與或經鼻投與，絨毛/陰窩比均較對照為大，可確認迴腸與空腸中之絨毛伸長。
測定小腸黏膜組織之培養上清液中之IgA及IgG濃度之結果顯示，不論OE群與OC群及NE群與NC群，對於由小腸黏膜組織之培養所生產之免疫球蛋白量均沒有大的影響。由小腸黏膜固有層之組織切片，就OE群，IFN-γ與IL-8之生產增強，反之，IL-10則有顯示低值之傾向。就NE群，TNF-α之生產亢進，但IL-10則有顯示低值之傾向。因EC-12乾燥粉末之投與，小腸組織中發炎性細胞激素之生產獲得刺激，暗示伴隨於此，上皮細胞之增殖有被刺激的可能 性。
圖1係小腸組織之模式圖(Kerr, 1999)。
圖2係說明小腸組織之用語(絨毛、陰窩)之圖。
圖3係表示對於仔豬小腸(空腸部)絨毛高，乳酸菌經口投與所帶來之影響之圖。
(無元件符號說明)

Claims (8)

  1. 一種屬於腸球菌屬之乳酸菌(惟EGF產生重組乳酸菌除外)之死菌體或其處理物的用途，其係用於製造動物之小腸絨毛伸長劑者。
  2. 如請求項1之用途，其中該屬於腸球菌屬之乳酸菌為糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。
  3. 如請求項2之用途，其中該糞腸球菌(Enterococcus faecalis)為糞腸球菌(Enterococcus faecalis)EC-12(FERM BP10284，國內寄存號碼BCRC 910295)。
  4. 如請求項1至3中任一項之用途，其係被經口或經鼻投與。
  5. 一種將屬於腸球菌屬之乳酸菌(惟EGF產生重組乳酸菌除外)之死菌體或其處理物作為動物之小腸絨毛伸長劑使用之方法。
  6. 如請求項5之方法，其中該屬於腸球菌屬之乳酸菌為糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。
  7. 如請求項6之方法，其中該糞腸球菌(Enterococcus faecalis)為糞腸球菌(Enterococcus faecalis)EC-12(FERM BP10284，國內寄存號碼BCRC 910295)。
  8. 如請求項5至7中任一項之方法，其係經口或經鼻投與。
TW097112425A 2007-04-09 2008-04-03 The use of dead bacteria belonging to the genus Lactobacillus of Enterococcus or its treated product for the manufacture of small intestinal villi elongants TWI547283B (zh)

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