TWI542342B - 應用白藜蘆醇與薑黃素於脂肪肝治療之用途、醫藥組合物及其製備方法 - Google Patents

Description

應用白藜蘆醇與薑黃素於脂肪肝治療之用途、醫藥組合物及其製備方法

本發明係關於一種醫藥組合物、醫藥組合物的製備方法以及製造醫藥組合物的用途。

隨著社會經濟的提升，環境衛生的改善，與醫療的進步，西方速食文化的流行和精緻美食的盛行，使得現代人的身體健康指標常出現有血壓、血糖偏高及血脂異常等，而此種許多代謝危險因子群聚現象，稱之為代謝症候群。其中，代謝症候群不但與一般常見腦血管疾病、心臟病、糖尿病以及高血壓等慢性疾病有密切相關，也會造成肝臟的疾病，例如脂肪肝。

脂肪肝係為代謝症候群的其中一種臨床病徵，其係指肝臟內的脂肪過量堆積，其形成的原因在於人體攝入過量的脂肪時，肝細胞消化脂肪的負擔加重，使它無法清除過剩的脂肪，而使肝細胞內的脂肪儲量逐漸增多。抑或是，肝細胞受損(如藥物、嗜酒、病毒性肝炎等引起)而不能夠發揮正常脂肪的代謝功能時，使得肝臟內的脂肪異常堆積。而當肝臟的脂肪含量超過肝臟總重量的5%時，則可稱之為脂肪肝。在臨床醫學上，減重與運動是目前唯一確認有效的脂肪肝治療方法，目前少有使用藥物治療脂肪肝。雖然降血糖藥物、肝庇護劑、抗氧化劑等均有研究顯示治療後肝指數或病理上的進步，但仍需更多研究來確認其療效，目前並沒有被確認有效的脂肪肝治療藥物。

白藜蘆醇(Resveratrol)係為非黃酮類的酚類物質。天然的白藜蘆醇在很多植物中存在，是植物為了抵禦病菌入侵而產生的一種抗毒 型物質。而與大部分黃酮類的多酚物質一樣，白藜蘆醇也有很強的抗氧化功能，可以阻止膽固醇在血管的沉積，進而防止心血管疾病等代謝症候群的病徵。

另一方面，薑黃素(Curcumin)係由薑黃(Turmeric)的根莖中所萃取出的物質。而薑黃的萃取物主要包含三種成分，大部分為薑黃素(Curcumin)、較少部分為去甲氧基薑黃素(DemethoxyCurcumin)及二甲氧基薑黃素(BisdemethoxyCurcumin)，而去甲氧基薑黃素與二甲氧基薑黃素亦可稱為薑黃素的衍生物，於本發明所述之薑黃素亦包括其衍生物。

薑黃素很早就作為一種天然色素被使用到食品工業中，而在醫學領域上，更發現薑黃素屬於多酚類化合物的薑黃素，具有廣泛的藥理作用，例如抗發炎、抗氧化、清除自由基、心血管保護等作用。尤其是薑黃素的抗氧化力係為維生素E的10倍，故被認為具有潛力，可被開發為糖尿病、高血脂、心臟病等代謝症候群病徵的治療藥物。另外，薑黃素也能增加膽汁的分泌，促進脂肪的分解。

歸納而言，目前已證實白藜蘆醇、或薑黃素具有較強的抗氧化功能，故其分別對於代謝症候群具有一定程度的緩和之療效，換言之，目前在使用白藜蘆醇或薑黃素作為治療藥物的臨床應用上，大部分還是個別取其抗氧化及抗發炎之功效，以應用於抗老化或減緩代謝症候群的惡化等。然而，對於代謝症候群中具有脂肪肝的患者而言，目前並無被確認有效的脂肪肝治療藥物。

由於目前並無被確認有效的脂肪肝治療藥物，而具有較強氧化功能的白藜蘆醇及薑黃素雖已證實其分別對於代謝症候群具有一定程度的緩和之療效，然，白藜蘆醇及薑黃素是否可應用於治療代謝症候群中具有脂肪肝病徵的患者，並具有一定程度之療效，為本發明所屬技術領域所欲知悉者。因此，本發明據以提出一種合併使用白藜蘆醇與薑黃素於脂肪肝患者之醫藥組合物及其製備方法與用途，有效提升對於脂肪肝的治療效果。

詳細來說，本發明提供一種治療一脂肪肝患者之醫藥組合物，其包括一白藜蘆醇與一薑黃素以及至少一醫藥上可接受之載體、稀釋 劑或賦形劑。其中，醫藥組合物施予脂肪肝患者，白藜蘆醇與薑黃素提供合併治療之效果。

本發明另提供一種製備治療一脂肪肝患者之醫藥組合物的方法，包含以下步驟：秤取一單位劑量之白藜蘆醇與一單位劑量之薑黃素；乳化白藜蘆醇、薑黃素與至少一醫藥上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑形成第一混合物；以及均勻化第一混合物並形成一第二混合物。其中，醫藥組合物施予脂肪肝患者，白藜蘆醇與薑黃素提供合併治療之效果。

本發明又提供一種白藜蘆醇與薑黃素用於製造治療一脂肪肝患者的醫藥組合物之用途，且當投以醫藥組合物予脂肪肝患者，白藜蘆醇與薑黃素提供合併治療之效果。

為使之後內容能清楚呈現本發明的技術特徵，以下擬先定義特定名詞，爾後進一步說明本發明內容。在本發明中，白藜蘆醇與薑黃素係合併使用，並用於治療具有脂肪肝之患者，並提供合併治療之效果，而「合併治療」係指同時使用白藜蘆醇與薑黃素這兩種成分，而使用方式可以製成一種「醫藥組合物」，其同時包含白藜蘆醇與薑黃素兩種成分。而本發明所述之「醫藥組合物」亦可包含製成一種組合藥品或組合藥物，其同時包括二種醫藥物，其一具有白藜蘆醇成分，另一具有薑黃素成分，並同時使用該二種醫藥物。較佳地，醫藥組合物分別具有一有效劑量之白藜蘆醇以及一有效劑量之薑黃素，其中，該有效劑量係指兩者可產生協同作用而合併治療之劑量。於本實施例中，白藜蘆醇與薑黃素係混合製成一醫藥組合物，並且以膠囊的方式保存，其餘細節特徵於後詳述。

在本說明書中所使用之「脂肪肝患者」一詞意指患者之肝臟的脂肪含量超過其肝臟總重量的5%時，亦即具有脂肪肝的患者。一般而言，脂肪肝係指肝細胞內有脂肪堆積，俗稱為「粉肝」或「肝包油」，脂肪肝是一種多病因卻有相似病理變化的疾病，可分為酒精性脂肪肝及非酒精性脂肪肝。而本發明所述之「脂肪肝患者」同時包括酒精性脂肪肝及非酒精性脂肪肝。其中，非酒精性脂肪肝形成主要為肝臟脂肪代謝異常，主要原因為脂質的堆積與排出失衡，而脂質堆積係以增加脂質的攝入和增加脂質生合成為主因；排出減少的因素則是為減少脂蛋白的合成與分泌與減少脂質的氧化。一般而言，代謝疾病常與不正常的脂質合成速率有關，故在 肝臟受損的情形下，肝臟細胞內的脂肪酸合成酶(Fatty Acid Synthase)表現量大於一般正常肝臟細胞中的脂肪酸合成酶，進而造成脂質堆積的情形，嚴重者則會造成脂肪肝的形成。而於本發明實驗例中，可得知白藜蘆醇與薑黃素係共同調控脂肪酸合成酶，即抑制脂肪酸合成酶之表現，以治療脂肪肝患者。

另外，在本說明書中所使用之「協同作用」意指當合併給予二種或二種以上的物質時，其產生的效應(包括產生相同性質的治療效應，或減少不良反應)等於或大於各單一物質獨自產生的效應之總和。於本發明實驗例中，可知合併給予白藜蘆醇與薑黃素於脂肪肝患者，其所產生之治療效果，較單一的白藜蘆醇或薑黃素的治療效果更好。在本說明書中所使用之「治療」一詞意指可以減輕、舒緩、改變、改善、改進或影響癌症及其症狀，舉例而言，抑制或治療癌症引發之疼痛或出血、或延緩或反轉腫瘤增生速率。

在本說明書中所使用之「白藜蘆醇」一詞除可指白藜蘆醇外，也包括基本白藜蘆醇結構經化學或生物學修飾或取代所產生之衍生物，而且仍保有原基本白藜蘆醇結構的性質或具有與原基本白藜蘆醇結構相似的性質。當然，「白藜蘆醇」一詞亦包括白藜蘆醇之醫藥上可接受之鹽類，其係依據白藜蘆醇化學結構上之酸或鹼基部份而形成。

同樣的，本說明書中所使用之「薑黃素」一詞除可指薑黃素外，也包括基本薑黃素結構經化學或生物學修飾或取代所產生之衍生物，而且仍保有原基本薑黃素結構的性質或具有與原基本薑黃素結構相似的性質，例如前述之去甲氧基薑黃素與二甲氧基薑黃素。當然，「薑黃素」一詞亦包括薑黃素之醫藥上可接受之鹽類，其係依據薑黃素化學結構上之酸或鹼基部份而形成。

另外，在本說明書中有提及且與本發明技術特徵實質相關的化合物或物質，均可涵蓋所稱之化合物或物質以及其任何醫藥上可接受的形式。其中，醫藥上可接受的形式可例如但不限於含非鏡像異構物(diastereomer)與鏡像異構物(enantiomer)的各式異構物(isomer)、鹽類、游離形式、溶劑、前藥(prodrug)、多形體(polymorph)及消旋混合物(racemic mixture)。

在本發明中，白藜蘆醇與薑黃素合併使用時，薑黃素的劑量較佳係介於100至1000毫克之間，且白藜蘆醇的劑量較佳係介於100至1000毫克之間。又在本發明中，白藜蘆醇與薑黃素合併使用時的重量百分比較佳係介於1：1至1：5之間，於本實施例中，係以白藜蘆醇與薑黃素的重量百分比為1：1.3為例說明之。當然，上述有效劑量與重量百分比亦可為醫藥組合物內的成份比例，或是醫藥套組實際使用時的調製比例。

綜上所述，依據本發明之用途、醫藥組合物及其製備方法，其合併白藜蘆醇與薑黃素使用，對於改善或增進治療脂肪肝患者，提供了顯著的功效。

S10~S40‧‧‧步驟

圖1為本發明一實施例之一種製備治療一脂肪肝患者之醫藥組合物的方法流程圖。

圖2A及圖2B為實驗例二中人類肝癌細胞株HepG2的胞內三酸甘油脂含量的結果圖。

圖3為實驗例三中人類肝癌細胞株HepG2的脂肪酸合成酶含量的結果圖。

以下將配合圖式說明本發明之實施例與實驗例，惟相關文義說明可參照前述，於此不再贅述。

依據本發明之一種白藜蘆醇與薑黃素用於製造供合併治療脂肪肝患者的醫藥組合物之用途，在一實施例中，可以透過將兩者共同製備成一個醫藥組合物，再給予患者服用來達成。其中，白藜蘆醇與薑黃素的萃取方法均為本發明所屬領域中具有通常知識者所能理解者，於此不再贅述。上述的醫藥組合物可以為固態、液態或半液態的劑型，較佳的，係為液態的劑型，並可依據本實施例之一種製備治療一脂肪肝患者之醫藥組合物的方法製備該醫藥組合物。

如圖1所示，圖1為本發明一實施例之一種製備治療一脂肪肝患者之醫藥組合物的方法流程圖，該製備方法包含以下步驟：秤取一單位劑量之白藜蘆醇與一單位劑量之薑黃素(S10)；乳化白藜蘆醇、薑黃 素與至少一醫藥上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑形成第一混合物(S20)；以及均勻化第一混合物並形成一第二混合物(S30)；以及將第二混合物壓製於一軟膠囊內(S40)。其中，醫藥組合物施予脂肪肝患者，白藜蘆醇與薑黃素提供合併治療之效果。

一般而言，白藜蘆醇與薑黃素萃取後係以粉末的方式存在，白藜蘆醇的單位劑量介於100mg至1000mg之間，而薑黃素的有效劑量係介於100mg至1000mg之間。於步驟S10中，秤取一單位劑量之白藜蘆醇與一單位劑量之薑黃素，係指每一配方中可含有一個劑量單位的醫藥組合物，換言之，一個配方即含有足可對脂肪肝患者產生治療效果的劑量，以方便直接投予。於本實施例中，一單位劑量的白藜蘆醇為100mg，而一單位劑量的薑黃素為130mg為例，故秤取102mg之純度98%的白藜蘆醇萃取物，及秤取138mg之純度95%的薑黃素萃取物。於實施上，可一次製備多個劑量單位的醫藥組合物，舉例而言，若欲一次製備100個配方的醫藥組合物，則於步驟S10可秤取100單位劑量之薑黃素與100單位劑量之白藜蘆醇，以進行接續的製備步驟，本實施例係以一單位劑量為例，但不以此為限。

接者，於步驟S20中，乳化白藜蘆醇、薑黃素與至少一醫藥上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑形成第一混合物。於本實施例中，醫藥上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑包括一疏水性液體，即一般稱為油類的物質，且較佳的，疏水性液體係為由多元不飽和脂肪酸所組成的油類物質，於本實施例係以亞麻仁油為例，當然，於其他實施例中，亦可以為魚油、芝麻油或紫蘇油等，本發明不以此為限。另外，載體、稀釋劑或賦形劑更包括其他水性液體，例如純水，或是可作為介面活性劑的低碳醇類或明膠溶液。因此，步驟S20係將疏水性液體加入粉末狀的白藜蘆醇、薑黃素，較佳的，可藉由攪拌將疏水性液體與粉末狀的白藜蘆醇及薑黃素乳化以形成第一混合物。換言之，第一混合物即為白藜蘆醇及薑黃素與疏水性液體乳化後的混合物。較佳的，第一混合物的黏度小於100dPa.s(decipascal-second)。

較佳的，疏水性液體之於白藜蘆醇與薑黃素的重量百分比大於等於60%，換言之，若疏水性液體與白藜蘆醇及薑黃素混合物的重量 百分比視為100%，則疏水性液體所佔之重量百分比大於等於60%，而白藜蘆醇及薑黃素混合物的重量百分比小於等於40%，而於本實施例中，係以疏水性液體的重量百分比為60%，以及白藜蘆醇及薑黃素混合物的重量百分比為40%為例。

由於白藜蘆醇及薑黃素於本實施例係為粉末狀，而以疏水性液體乳化後(步驟S20)所形成第一混合物，其具有複數個大小不均的二相混合粒子，即液態(疏水性液體)包覆固態(白藜蘆醇及薑黃素粉末)的二相混合粒子。故較佳的，於步驟S10及步驟S20之間，可先將白藜蘆醇與薑黃素進行適當的混合程序，以確保第一混合物中的各個二相混合粒子中具有較均等的白藜蘆醇與薑黃素。當然，於其他實施例中，不以白藜蘆醇與薑黃素兩物質均勻混合調製為限，換言之，於同一劑型的醫藥組合物內，白藜蘆醇與薑黃素可以具有其他程度的混合，甚至不混合亦可，舉例而言，醫藥組合物可以為一種軟膠囊，其中部分為白藜蘆醇，另一部分為薑黃素，即將白藜蘆醇及薑黃素分別進行步驟S20及於後詳述之步驟S30及步驟S40。

而於步驟S20乳化後所得的第一混合物，其二相混合粒子的尺寸較大，而為使所製成之醫藥組合物溶液被人體所吸收，必須減小二相混合粒子的尺寸大小。故於步驟S30中，均勻化第一混合物並形成一第二混合物，即係藉由均勻化的方式細化第一混合物的二相混合粒子，所形成之第二混合物則具有較小尺寸的二相混合粒子。而在操作「均勻化」的方式上，可使用一般市面上常見之均質機，或同時具有乳化或均質功能的乳化均質機，並藉由調整均質機或乳化均質機的轉速或壓力，以形成粒徑大於100奈米的二相混合粒子。而於此所述之「均勻化」係指將第二混合物的二相混合粒子的粒徑大小控制在100至1000奈米之間，即介於乳化後及均質化後的粒子大小尺寸之間。一般而言，乳化後的粒子相較於本實施例之第二混合物的二相混合粒子，乳化後的粒子之粒徑較大，故被人體吸收的速度較慢；而均質化後的粒子相較於本實施例之第二混合物的二相混合粒子，其均質化後的粒子粒徑之粒徑較小，雖吸收速度較快，但亦容易被人體代謝而排出，故本實施例之第二混合物的二相混合粒子的粒徑介於乳化和均質化之間，使製備完成的醫藥組合物被人體吸收及代謝的速度可 維持在較佳的範圍內，以助於人體吸收的較為完整。

較佳的，製備治療一脂肪肝患者之醫藥組合物的方法更可包括步驟S40，將第二混合物壓製於一軟膠囊內。詳細而言，本實施例之載體、稀釋劑或賦形劑更包括明膠溶液，而明膠溶液除了可作為介面活性劑以外，同時可作為形成軟膠囊外殼的成分。於實施上，係將步驟S30所得之第二混合物置入一真空(或負壓)混合膠裝置，並進行溶膠的程序，即於真空(或負壓)且溫度於60~80℃的環境下，持續進行混合，而此時的混合物稱為溶膠，並待溶膠的黏度為13000至15000CPS後，再將溶膠置入模具中壓製成型。在實施上，可依據每次所欲壓製之軟膠囊個數，於步驟S10秤取對應之單位劑量之白藜蘆醇與薑黃素，以形成每一軟膠囊即含有一個劑量單位的醫藥組合物。當然，在其他實施方式中，一個劑量單位亦可由分散於數個次劑量單位或次包裝中的複數個醫藥組合物組成，例如分散於二至三粒軟膠囊內但包裝在同一吸塑包裝(blister pack)中。

如前所述，白藜蘆醇與薑黃素合併使用於治療脂肪肝患者時，白藜蘆醇的劑量範圍控制在約100mg至1000mg之間，而薑黃素的劑量範圍控制在約100mg至1000mg之間為佳，且白藜蘆醇與薑黃素的重量百分比以介於1：1至1：5之間為佳。在上述範圍內，各劑量間所產生的治療效果可能具有落差，以下實驗例係以白藜蘆醇與薑黃素的重量百分比為約1：1.3進行治療。當然，白藜蘆醇或薑黃素的劑量可能會隨配合的治療上活性成份、投予路徑或有需要之個體及其生理狀況的不同而有所變化。普遍而言，口服方式需要較高的劑量，反觀治療初期所使用的劑量則相對較低。

進一步說明，依據本發明之用途，當醫藥組合物投予脂肪肝患者後，其中白藜蘆醇與薑黃素可發生協同作用，以改善或增進單獨使用白藜蘆醇或薑黃素對脂肪肝治療的功效，進而達成消除、抑制、改善、緩解、預防脂肪肝及其症狀、或達到與上述目的相似的醫療效果。詳細而言，白藜蘆醇與薑黃素係藉由共同調控脂肪酸合成酶，即抑制脂肪酸合成酶之表現，以治療脂肪肝患者。

本發明又提供一種治療一脂肪肝患者的醫藥組合物及其製造方法，其包括白藜蘆醇與薑黃素以及至少一醫藥上可接受之載體、稀釋 劑或賦形劑。然而，該醫藥組合物及其製造方法與前述說明之該醫藥組合物的用途大致相同，可參考前述，於此不再贅述。惟要說明的是，醫藥組合物中白藜蘆醇及薑黃素雖可分別形成於不同的軟膠囊中，但白藜蘆醇及薑黃素仍是要以合併使用為限，然則，所稱之合併使用可在兩者其中之一先行投予患者，並未失去作用效果前，另行投予兩者之另一；當然較佳係兩者無時間差地同時投予患者，或其中之一投予後立即投予另一的方式實施。

承上所述，依據本發明之用途、醫藥組合物及其製造方法，其合併白藜蘆醇與薑黃素使用，對於改善或增進治療脂肪肝患者，提供了顯著的功效。

實驗例一：製備醫藥組合物可如圖1所示，秤取100毫克之白藜蘆醇與130毫克之薑黃素(S10)；乳化白藜蘆醇、薑黃素與至少一醫藥上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑形成第一混合物(S20)；以及均勻化第一混合物並形成一第二混合物(S30)。其中，醫藥組合物施予脂肪肝患者，白藜蘆醇與薑黃素提供合併治療之效果。

在步驟S10中，本發明所使用之白藜蘆醇購自利統生物科技股份有限公司，薑黃素購自利統生物科技股份有限公司。取得後，在室溫下分別秤取約102毫克的純度98%白藜蘆醇與138毫克的純度95%薑黃素，依照重量百分比約1：1.3比例混合粉狀的白藜蘆醇與薑黃素，即為一單位劑量。接著，在步驟S20中，至少一醫藥上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑包括亞麻仁油(疏水性液體)，並使用1~2%脂肪酸甘油酯為乳化劑，將白藜蘆醇、薑黃素與亞麻仁油乳化而形成第一混合物。接著，於步驟S30中，將前述之第一混合物置入高速真空乳化攪拌機中進行均勻化，以取得粒徑大小於100至1000奈米之間的第二混合物，並將第二混合物包裝為一軟膠囊之形式(步驟S40)，保存於室溫下。

實驗例二：白藜蘆醇與薑黃素醫藥組合物對於細胞脂質合成反應具有協同作用的抑制效果

以組織培養技術培養人類肝癌(Hepatocellular carcinoma,Human)細胞株HepG2於含有濃度10%之胎牛血清(Bovine Serum,FBS)的細胞培養液DMEM至適當數量。接著，取含有數量2×10⁴之HepG2細胞 的懸浮液，並接種於96孔(96-wells)培養皿，培養16小時後，再將原有培養液取出，以置換成含30mM葡萄糖的細胞培養液DMEM，分別加入不同濃度之白藜蘆醇(100至50μM)、薑黃素(160至40μM)，以及白藜蘆醇與薑黃素的組合物。

於本實驗例中，係分成四種不同濃度(於本實驗例中，係指最終濃度)進行實驗。其中，白藜蘆醇的分子量約為228g/mol，而薑黃素的分子量約為368g/mol，換算成白藜蘆醇與薑黃素的重量百分比為1：1.3至1：2.6。各組之成分劑量整理如下表所示：

細胞株HepG2分別加入上述化合物後，再將組別1、2及組別3、4的培養皿置入37℃的培養箱繼續培養48小時，之後進行脂質合成測試。本實驗例係以檢測細胞株HepG2胞內三酸甘油脂(HepG2 intracellular Triglyceride)的含量為例。

詳細而言，結束前述培養後，依序將各孔中的培養液及加入的化合物吸除，另以生理食鹽水清洗，較佳係清洗二次，再於各孔添加100μL的脂質萃取液，將整個培養皿盤置於95℃並待30分鐘，使脂質萃 取液溶解。於前述30分鐘後，取出培養皿並搖晃一分鐘，再分別取出各孔溶解的脂質萃取液50μl，使培養皿各孔內溶解的脂質萃取液同樣為50μl，再加入三酸甘油脂反應混合液(購自Abnova-KA0902，Adipogenesis Assay kit)50μL於培養皿的各孔內，混合均勻後，放入37℃的培養箱且避光反應30分鐘，用酵素免疫分析測讀儀以波長570nm為基準，偵測培養皿內各孔的吸光值。

圖2A及圖2B為實驗例二中人類肝癌細胞株HepG2的胞內三酸甘油脂含量的結果圖。由圖2A可知，細胞株HepG2胞內三酸甘油脂的含量，合併使用50μM白藜蘆醇與40μM的薑黃素時，明顯較單獨使用50μM白藜蘆醇或單獨使用40μM的薑黃素來得更低。同樣的，合併使用100μM白藜蘆醇與80μM的薑黃素時，其對於細胞株HepG2生成三酸甘油脂的抑制效果，又明顯較單獨使用100μM白藜蘆醇或單獨使用80μM的薑黃素來得更好。而由圖2B可知，細胞株HepG2胞內三酸甘油脂的含量，合併使用50μM白藜蘆醇與80μM的薑黃素時，明顯較單獨使用50μM白藜蘆醇或單獨使用80μM的薑黃素來得更低。同樣的，合併使用100μM白藜蘆醇與160μM的薑黃素時，其對於細胞株HepG2生成三酸甘油脂的抑制效果，又明顯較單獨使用100μM白藜蘆醇或單獨使用160μM的薑黃素來得更好。因此，白藜蘆醇與薑黃素的合併使用對於細胞脂質合成反應，如三酸甘油脂的生成，具有協同作用的抑制效果的效果。

實驗例三：白藜蘆醇與薑黃素係共同調控脂肪酸合成酶以治療脂肪肝

依據與實驗例二大致相同的步驟與條件，以組織培養技術培養HepG2細胞，並取取含有數量1.5×10⁶之HepG2細胞的懸浮液，並接種於6公分的培養皿，培養16小時後，再將原有培養液取出，以置換成含5mM葡萄糖及10%之胎牛血清的細胞培養液DMEM，分別加入50μM白藜蘆醇、40μM薑黃素，以及50μM白藜蘆醇與40μM薑黃素的組合物(換算成白藜蘆醇與薑黃素的重量百分比為1：1.3)，再將培養皿置入37℃的培養箱繼續培養48小時。另外，將原有培養液取出後，置換成含5mM葡萄糖、但不含10%之胎牛血清及不含麩胺酸鈉(glutamate)的細胞培養液DMEM，以作為饑餓(starvation)對照組；另將培養液置換成含30mM葡 萄糖的細胞培養液DMEM(含10%之胎牛血清，但不含麩胺酸鈉)，作為營養(re-nutrition)對照組。

接著，將培養皿中的培養液去除，以生理食鹽水沖洗兩次之後，每盤加入100μl的蛋白質萃取液，以刮杓刮取出蛋白質萃取液，即同時取得HepG2細胞及蛋白質萃取液的混合物，並於4℃反應30分鐘後，再藉由高速離心機以轉速12000rpm離心30分鐘，並取其上清液以西方點墨測試法觀察脂肪酸合成酶之蛋白質濃度的表現。首先，進行膠體電泳的程序，於本實驗例中，係將前述各樣品之上清液，取其100μg注入於SDS-PAGE之上層膠的各孔洞中，並施予電壓80伏特，持續30分鐘後，再以電壓120伏特，持續120分鐘。接著，取出電泳完成後的膠體進行蛋白質轉印的程序，即將膠體上的蛋白質轉印至PVDF(poly(vinylidene fluoride))膜上(轉印條件為400mA，30分鐘)。膠體上的蛋白質轉印至PVDF膜後，將轉印後的PVDF膜置於具有5%牛血清白蛋白的緩衝溶液並搖晃15分鐘以上。接著，移除5%牛血清白蛋白的緩衝溶液，並以具有介面活性劑Tween-20的磷酸鹽緩衝溶液(PBST溶液)清洗PVDF膜後，再將PVDF膜置於具有抗脂肪酸合成酶(anti-Fas)抗體溶液(第一抗體)中混和搖晃2小時。其中，anti-Fas抗體係以1：100的比例溶於PBST溶液中。接著，在再以TBST溶液清洗5分鐘，並重複三次後，換置於抗兔子IgG-HRP抗體溶液(第二抗體)並混合搖晃1小時，之後以化學發光增強試劑染色一分鐘，使底片感光，用以檢測細胞株HepG2中的脂肪酸合成酶(Fatty Acid Synthase,FAS)的含量。

圖3為實驗例三中人類肝癌細胞株HepG2的脂肪酸合成酶含量的結果圖。由圖3的結果可知，細胞株HepG2合併使用白藜蘆醇與薑黃素(重量百分比為1：1.3)對於抑制細胞株HepG2的脂肪酸合成酶相較於單獨使用白藜蘆醇或薑黃素，有較佳的抑制效果。因此，白藜蘆醇與薑黃素可共同調控並抑制脂肪酸合成酶的生成，進而可用於治療脂肪肝。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

S10~S40‧‧‧步驟

Claims (17)

1. 一種治療一脂肪肝患者之醫藥組合物，其包括：一白藜蘆醇與一薑黃素；以及至少一醫藥上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑，該醫藥上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑包括一疏水性液體，其中，該醫藥組合物施予該脂肪肝患者，該薑黃素與該白藜蘆醇係共同調控脂肪酸合成酶以治療該脂肪肝患者，並且該白藜蘆醇、該薑黃素與該疏水性液體係經乳化及均勻化後形成一混合物，該混合物係為複數個二相混合粒子所組成，該等二相混合粒子的粒徑大於100奈米且小於1000奈米。
2. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組合物，其中該白藜蘆醇與該薑黃素協同作用以治療該脂肪肝患者。
3. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組合物，其中該白藜蘆醇的單位劑量係介於100至1000毫克之間，且該薑黃素的單位劑量係介於100至1000毫克之間。
4. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組合物，其中該白藜蘆醇與該薑黃素的重量百分比介於1：1至1：5之間。
5. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組合物，其中該疏水性液體之於該白藜蘆醇與該薑黃素的重量百分比大於等於60%。
6. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組合物，其中該疏水性液體包括具有不飽和脂肪酸的疏水性液體。
7. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組合物，其係呈軟膠囊形式。
8. 一種製備治療一脂肪肝患者之醫藥組合物的方法，包含以下步驟：秤取一單位劑量之白藜蘆醇與一單位劑量之薑黃素；乳化該白藜蘆醇、該薑黃素與至少一醫藥上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑形成第一混合物，該醫藥上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑包括一疏水性液體；以及均勻化該第一混合物並形成一第二混合物， 其中，該第一混合物與該第二混合物係為複數個二相混合粒子所組成，該第二混合物之二相混合粒子的粒徑大於100奈米且小於1000奈米，且該醫藥組合物施予該脂肪肝患者，該白藜蘆醇與該薑黃素係共同調控脂肪酸合成酶以治療該脂肪肝患者。
9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，更包括：將該第二混合物壓製於一軟膠囊內。
10. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該白藜蘆醇的單位劑量係介於100至1000毫克之間，且該薑黃素的單位劑量係介於100至1000毫克之間。
11. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該白藜蘆醇與該薑黃素的重量百分比介於1：1至1：5之間。
12. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該疏水性液體之於該白藜蘆醇與該薑黃素的重量百分比大於等於60%。
13. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該疏水性液體包括具有不飽和脂肪酸的疏水性液體。
14. 一種白藜蘆醇與薑黃素用於製造治療一脂肪肝患者的醫藥組合物之用途，且當投以該醫藥組合物予該脂肪肝患者，該白藜蘆醇與該薑黃素係共同調控脂肪酸合成酶以治療該脂肪肝患者，其中該醫藥組合物包括一白藜蘆醇與一薑黃素以及至少一醫藥上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑，該醫藥上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑包括一疏水性液體，且該白藜蘆醇、該薑黃素與該疏水性液體係經乳化及均勻化後形成一混合物，該混合物係為複數個二相混合粒子所組成，該等二相混合粒子的粒徑大於100奈米且小於1000奈米。
15. 如申請專利範圍第14項所述之用途，其中該白藜蘆醇與該薑黃素係與協同作用以治療該脂肪肝患者。
16. 如申請專利範圍第14項所述之用途，其中該白藜蘆醇的劑量係介於100至1000毫克之間，且該薑黃素的劑量係介於100至1000毫克之間。
17. 如申請專利範圍第14項所述之用途，其中該白藜蘆醇與該薑黃素的重 量百分比介於1：1至1：5之間。