TWI482858B - 顆粒型培養骨之製造方法 - Google Patents

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Yusuke Hori
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Description

顆粒型培養骨之製造方法 [相關申請案]
本申請案係主張2008年12月3日提出申請之日本國專利申請案第2008-309064號之優先權，並摘錄於此。
本發明係有關在顆粒型培養骨之製造方法中，可改善產率以及骨再生機率的顆粒型培養骨之製造方法。
以往，由於摘除骨腫瘤、外傷等而產生骨缺損時，即進行自體骨的移植等。然而，在自體骨的移植中，由於有傷及自體的正常組織以採取骨組織等的必要性，而有引發採集部位的痛楚及腫脹等症狀以及手術時間增長等之問題。而且，為了減輕患者因採集自體骨所受的侵襲，而在骨的缺損部位填補羥基磷灰石或β-磷酸三鈣(β-TCP)等的骨填補材以進行骨的修復，然而存在著手術後骨的修復極為耗時，以及骨的再生不確實且大小受限之問題。
另外，為了提高骨缺損部位之修復速度，而提案一種將骨填補材與源自採自患者骨髓之間葉系幹細胞(mesenchymal stem cells)一起培養而製造的培養骨。將如此之培養骨填補在骨的缺損部位之方法中，由於從骨填補材內部之間葉系幹細胞亦產生骨形成作用，故相較於僅填補骨填補材之方法，可促進骨的形成，並可縮短至取代為自體骨的天數。
如此之培養骨的製造方法，係將採自患者的骨髓細胞於燒瓶中進行一次培養後，使用如胰蛋白酶之蛋白質分解酵素將細胞由燒瓶內剝離，使其附著於骨填補材並置於培養基內，經由二次培養即可製得(非專利文獻1)。如此之以往培養骨的製造方法中，於二次培養時，在培養基內放置載體(骨填補劑)之後進行細胞接種。然而，此係所使用之載體為多孔質時較為有效，而載體形狀為顆粒狀時，明顯地難以使骨有效率的再生。
[先前技術文獻]
[非專利文獻]
[非專利文獻1]吉川、「由骨髓間葉系細胞培養真皮、培養骨-骨髓間葉系細胞之再生醫療-」，生技產業、第18卷、第7號(2001)、46至53頁
本發明係因鑑於上述之以往技術而施行者，為了解決該課題而提供一種培養骨之製造方法，其係使用以往方法中難以有效率地使骨再生的顆粒狀載體，而製造產率高、骨再生之機率優異的顆粒型培養骨之方法。
為了解決上述課題，本發明者等專心致志進行研究之結果發現，經由改善將間葉系幹細胞接種在擬骨顆粒時之手法即可改良產率以及骨再生機率，遂而完成本發明。
亦即，本發明之顆粒型培養骨的製造方法，其特徵係具備以下步驟：將源自採自患者之骨髓液、骨膜、脂肪等的細胞於培養基內進行培養而培養間葉系幹細胞的一次培養步驟；於預先投入多孔質擬骨顆粒之深底容器中將所培養的間葉系幹細胞與培養液一起投入，使上述多孔質擬骨顆粒在暫時浮起之狀態下進行接種的接種步驟；將經接種的間葉系幹細胞與多孔質擬骨顆粒同時於培養基內進行培養而分化為培養類骨母細胞(osteoblast-like cell)之分化培養步驟。
上述製造方法中，接種步驟所使用之間葉系幹細胞以初代培養(primary culture)及/或第一次繼代培養(subculture)之培養細胞為佳。
上述製造方法中，分化培養步驟中之分化培養期間以2週為佳。
上述製造方法中，多孔質擬骨顆粒係以乾燥時之視比重(apparent specific gravity)小於培養液且在培養液中吸收該培養液而沉降之多孔質體為佳。
上述製造方法中，多孔質擬骨顆粒係以於30分鐘內沉降在深底容器之培養液中的多孔質體為佳。
上述製造方法中，多孔質擬骨顆粒係以一種或二種以上選自包含β-磷酸三鈣(β-TCP)、羥基磷灰石、乾燥骨粉之多孔質活體吸收性顆粒者為佳。
上述製造方法中，係於接種步驟中投入培養液時施加振動而在多孔質擬骨顆粒沉澱後再賦予旋轉者為佳。
上述製造方法中，於接種步驟中投入培養液時所施加之振動以20至120Hz為佳。
上述製造方法中，相對於接種步驟中之50mg多孔質擬骨顆粒，接種細胞濃度以20,000cells/mL至3,000,000cells/mL為佳。
上述製造方法中，以預先投入多孔質擬骨顆粒之深底容器為直立於試管架上之容器，而該容器具有由底部至上方開口部之導溝，且於容器中裝有經殺菌之多孔質擬骨顆粒為佳。
如依本發明，於擬骨顆粒成為浮起之狀態下接種間葉系幹細胞，即可高產率地製造骨再生機率優異的顆粒型培養骨。
以下，對於本發明之較佳實施型態進行說明。
本發明之顆粒型培養骨可經由進行下列步驟而製造：採集骨髓液並將取自骨髓之間葉系幹細胞進行培養的一次培養步驟、將該間葉系幹細胞進行接種之接種步驟、使分化成為培養類骨母細胞之分化培養步驟。對於該等步驟，參照第1圖逐項說明。
同時，以下步驟雖呈示使用骨髓液作為細胞源之型態，然而除了骨髓之外，本發明亦可由骨膜、脂肪、皮膚、末梢血等分離培養，並以相同方法分化誘導成為培養類骨母細胞即可得到顆粒型培養骨，惟該等之中以使用採自骨髓之間葉系幹細胞為理想。
自體血清之調製：用以製造本發明之顆粒型培養骨的細胞培養之生長因子，可使用自體血清、胎牛血清之任一者，惟使用自體血清時之調整方法係如下所示。
首先，在採集骨髓液時或採集骨髓液之前一週內，在被檢者之上臂採血400mL。採集後於4℃下靜置30分鐘左右。再以3000rpm離心分離10分鐘，並經由無菌式地分取血清中的上清液即可獲得。經調製之血清於-20℃中保存。
骨髓液之採集：骨髓液係在手術之前約1個月由腸骨脊後上方以下述方法進行無菌式地吸取回收。
首先，在骨髓液採集部進行麻醉。麻醉可使用局部麻醉或全身麻醉之任一者，而以局部麻醉為佳。由腸骨脊後上方採集骨髓液。
採自骨髓之間葉系幹細胞的培養(一次培養步驟)：將以細胞培養用培養基稀釋4倍之骨髓液10接種在細胞培養用燒瓶12中，如第1圖(A)，開始二氧化碳氣體的培養，培養開始後第4天更換全量的培養基。同時，細胞培養用培養基係於一次培養、分化培養。均可使用含血清之αMEM(α-改性Eagle最低必需培養液)或無血清培養基之任一者，而以使用含血清之αMEM為佳。
在培養過程中未受到一般細菌及真菌感染之確認，除了在每次培養基替換時觀察培養基(如有感染，培養基會混濁)之外，在培養開始時、分化誘導前以及培養類骨母細胞之回收時亦以無菌試驗(是否符合日本藥典之基準)進行確認。
然後，每週進行2次全量培養基的替換。繼代之時點係視細胞狀態而判斷，宜以培養開始21至28天後為目標而進行。繼代時計算活細胞數目以及細胞數目。
間葉系幹細胞之接種(接種步驟)：
繼代係如下進行。吸取燒瓶之培養基後，在杜比克氏磷酸緩衝液(D-PBS：Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)中清洗，然後，吸取D-PBS並添加細胞解離劑，於37℃下培養10分鐘。確認細胞剝離後，添加D-PBS或培養基並回收細胞後，進行離心。再次懸浮於培養基中，計算細胞數目。計算後，在第1圖(B)所示之預先投入多孔質擬骨顆粒14之深底容器16中投入所培養的骨髓液10。此時，將初代培養之細胞接種在載體上，即成為第一次繼代細胞之移植。
由本發明者等之研究可知，經三次繼代後的細胞，骨形成能力明顯地降低。因此，在接種步驟中，可使用初代培養至二次繼代之間葉系幹細胞，惟以使用初代培養以及第一次繼代之細胞為佳，尤以使用初代培養之細胞更佳。
本發明之該顆粒型培養骨的製造方法中，相對於50mg之多孔質擬骨顆粒14，以接種100,000至3,000,000之細胞為佳，惟特別以接種500,000左右之細胞為佳。
而且，在接種步驟中，以接種高濃度的細胞為佳。宜以濃度20,000cells/mL至3,000,000cells/mL進行接種，尤以500,000cells/mL至1,000,000cells/mL左右進行接種更佳。經由接種高濃度的細胞即可提高接種效率。
本實施型態中，宜使用乾燥時之視比重小於培養液的多孔質擬骨顆粒14。亦即，多孔質擬骨顆粒14宜使用包含β-磷酸三鈣(β-TCP)、羥基磷灰石、乾燥骨粉之多孔質活體吸收性顆粒以及該等之混合物等，特別以β-TCP更為適用。
如使用β-TCP作為多孔質擬骨顆粒14時，β-TCP係預先進行殺菌並以乾燥狀態裝入深底容器16內。於其中投入所培養之骨髓液10時，則如第1圖(C)所示，多孔質體的β-TCP係浮在培養液中。其後，β-TCP吸收培養液並緩緩沉降，而如第1圖(D)所示般沉澱。如此，經由使多孔質擬骨顆粒14暫時地呈浮起狀態，然後沉澱，可使多孔質擬骨顆粒14極有效率地附著於細胞，而大幅地提升培養骨之產率以及骨再生機率。
對此原因雖有多處不明之點，惟關於骨形成之間葉系幹細胞具有附著指標性，且長時間的浮游狀態會使細胞活性降低。另外，在培養之骨髓液10投入深底容器16之狀態下，該等之骨形成幹細胞係浮游狀態中，咸認經由吸附、担載該等細胞而使β-TCP沉降，即可在早期獲得良好的細胞担載狀態。
另外，為了使β-TCP以高密度担載浮游狀態之幹細胞，深底容器16以具有70mm以上之深度為佳。而且，多孔質擬骨顆粒14係以在30分鐘內於培養液中沉澱之多孔質體為佳。沉澱速度過快時，細胞担載會有無法充分進行的情形。反之，沉澱速度過緩時，經長時間的浮游而會有細胞活性大幅降低的情形。因此，因應細胞沉澱速度之多孔質擬骨顆粒14的沉澱速度之設定極為重要。
由上述，為了調整多孔質擬骨顆粒14的沉降速度，在投入培養液時，以對深底容器16徐緩地施加振動為佳。經由對深底容器16施加振動而促進孔質擬骨顆粒14的沉降，沉澱的速度係振動愈快、振幅愈大則加快。細胞的沉澱雖與有否振動無關而可在較早期達成，惟此時細胞上堆積著擬骨顆粒而使擬骨顆粒與細胞難以適度地混合。而且，在沉澱之擬骨顆粒上接種細胞時，細胞僅堆積在上方或沉澱在下方，終究無法達到適當的混合。
因此，經由調整施加於深底容器16之振動，使細胞與擬骨顆粒之沉澱速度適度化，而使細胞適當地接種於擬骨顆粒上為宜。
本發明之該顆粒型培養骨的製造方法中，以接種步驟中施加振動使多孔質擬骨顆粒沉澱後賦予旋轉者為宜。經由賦予旋轉即可齊整且良好地接種細胞。
在使用源自骨髓之培養類骨母細胞的檢討中，特別以經Bioshaker等振動培養機賦予20至120Hz左右的振動為佳。亦可經由其他機器或以手操作賦予同等之振幅。此處，由於沉澱速度係依多孔質擬骨顆粒而異，因此，藉由分別因應各擬骨顆粒而設定適度的振動，即可有效率地接種細胞。完全不賦予振動時，會使多孔質擬骨顆粒14與經培養之骨髓液分離，而有長時間沉降的情形。
本發明之顆粒型培養骨的製造方法中的接種步驟，係使用預先投入多孔質擬骨顆粒之深底容器。
亦即，本發明所使用之深底容器16係直立在試管架18上之容器，該容器以具有由底部至上部開口之導溝20，且在容器中裝有多孔質擬骨顆粒14者為佳。第2圖係對本發明使用之較佳的深底容器詳細說明之圖。
如第2圖所示，深底容器16係圓柱狀深底容器，其容量以10至20mL、高度以70mm至150mm為佳。高度過低時，細胞經擬骨顆粒的但載會有無法充分進行的情形。而高度過高時，會有操作性不良，特別是在培養結束時會有難以取出培養骨的情形。
而且，深底容器16係以在其側壁內面具有由底部至上部開口之導溝20者為佳。導溝20之寬度雖依擬骨顆粒之量而定，惟50mg之擬骨顆粒係以3至5mm為佳。
該深底容器16不僅在接種步驟，在之後的分化培養步驟亦可持續使用，培養結束時，培養骨因骨母細胞等釋出之細胞間物質(膠原纖維等)而具有黏著性，過度的攪拌即會使細胞受到壓力。取出後的培養骨塊可直接使用於手術的施行，而宜維持為塊狀的型態。因此，為了不使培養骨塊分散且容易取出而設置導溝20。
試管架18宜配合深底容器16之形狀而製作。此時，不僅可固定深底容器16，在培養液投入時亦可賦予均等的振動，且易於靜置。且試管架以設有試管架用蓋為佳。
另外，當培養骨塊成為塊狀型態，且載體周圍被緊密細胞層的包覆時，會阻礙內部的營養供給，因而使內部載體上的細胞無法生存，結果內部之載體部分會有難以形成骨的情形。相較於容易取出者，於重視細胞係均勻地接種而各載體確實地骨化之情況時，亦可使培養細胞之營養供給未受到阻礙之方式將細胞接種後，由深底容器16取出至培養皿等再持續地培養以及分化誘導。
對培養類骨母細胞之分化誘導(分化培養步驟)：從細胞對多孔質擬骨顆粒14的接種至次日為止，認為是細胞恢復所需的時間。在接種1天後，如第1圖(D)所示，骨形成之相關細胞等的細胞以及多孔質擬骨顆粒14係沉在深底容器16之下方。此情形經確認後，將培養基換成分化誘導培養基。培養基替換以每週2次為佳。分化誘導期間以1至3週為宜，以2週更理想。分化誘導進行時，如第1圖(E)所示，培養類骨母細胞聚集在多孔質擬骨顆粒14之周圍。
進行分化確認試驗(ALP活性測定)以確認分化的進行，得到培養類骨母細胞。而且，在分化確認試驗中，培養類骨母細胞1×107 個每1分鐘之ALP活性宜為2μmol以上。
依上述方法所製作之顆粒型培養骨，例如可依下述方法再生齒槽骨。
首先，在手術範圍的對應部位以局部麻醉藥浸潤麻醉。接著，在手術範圍的對應部位進行切開，作成黏膜骨瓣膜，標明齒槽骨萎縮部位或缺損部位。將培養骨移植到萎縮部位或缺損部位後，為了維持齒槽脊型態，將移植骨以Gore-Tex等膜包覆，必要時以微型骨螺釘(microscren)固定。依需要而在骨膜施加張力切口(relaxing incision)後，將黏膜骨瓣膜復位、縫合。
並且，使用本發明之顆粒型培養骨在齒槽骨時，於齒槽骨的再生手術後，24週前後即可進行植牙的埋入。
[實施例]
其次，列舉實施例而具體說明本發明。本發明並不受此等所限定。
<實施例1>
在局部麻醉(0.5%息樂卡因(XYLOCAINE)；藤澤藥品公司)下，將穿刺針(biopsy necdie)刺入單側腸骨脊後上方，使用10mL之注射筒採集骨髓液5mL，調整深度或方向後再採集1次骨髓液5mL(5mL×2，共10mL)。將採集之骨髓液懸浮於4倍量之細胞培養用培養基(含血清之αMEM)，接種於燒瓶中。血清係使用骨髓液採集時所調製的自體血清。
接著，將以培養基稀釋4倍之骨髓液接種於細胞培養用燒瓶(4支)中，並以二氧化碳氣體開始源自骨髓的間葉系幹細胞之培養(37℃、二氧化碳濃度5%，以下之培養條件相同)。同時，在細胞培養用燒瓶中預先加入經殺菌之β-TCP。培養開始後第4天進行全量培養基之替換。各培養過程中無細菌以及真菌者係觀察培養基以及經無菌試驗而確認。
開始培養後第4天，進行每週2次的全量培養基之替換。繼代係在培養開始第28天後進行。繼代時係使用錐蟲藍(trypan blue)溶液計算活細胞數，同時亦計數細胞數。
接著，吸取燒瓶之培養基後，在D-PBS(Invitrogen公司)中清洗1次。清洗後，吸取D-PBS，添加經加溫至37℃的重組型細胞離散劑之TrypleTM Select(Invitrogen公司)，於37℃中培養10分鐘。確認細胞剝離之後，添加培養基並回收細胞。經回收至離心管後，進行離心。再於培養基中懸浮並進行細胞數之計數。
計數後，相對於50mg之β-TCP顆粒，接種100,000至500,000之細胞。分化之確認用試驗係以2×104 /孔之細胞密度在12孔盤(well plate)中接種。
細胞接種在顆粒上經1天後，將培養基替換為分化誘導培養基，分化誘導培養基係於含有自體血清之α-MEM中加入地塞美松(dexamethasone)、L-抗壞血酸磷酸酯鎂鹽n-水合物(和光純藥(股))、β-甘油磷酸者。每週進行2次培養基替換。
並在2週後，於基質中使用對硝基苯磷酸酯測定鹼性磷酸酶活性(ALP活性)作為分化確認試驗。由其結果可知，確認ALP活性上升，分化進展，可得到培養類骨母細胞。
<實施例2>
變更細胞接種條件，將依實施例1之方法製作的顆粒培養骨移植到裸鼠之皮下。將各條件呈示於表1。同時， 表1之條件以外，係以實施例1之方法製作。離心操作係使用TS-多管架離心機EX-125(Tomy精工社；轉子：TS-38LB)進行。於各條件中將有無骨再生能力(分別為+、-)呈示於表2，各條件中以顯微鏡攝影的移植組織影像呈示於表3。而且，PDL係細胞分裂次數之大略計數。
以細胞數1×105 確認骨的再生能力，即可確認條件B中之骨再生能力優異。由此可知，以本發明之方法，在深底容器中進行培養，並在分化誘導前接種細胞，且於細胞接種時未施行離心所製作之顆粒型培養骨中，可得到優異之骨的再生能力。
在此條件B中，將細胞數增加成5×105 而製作時，可確認到更優異之骨的再生能力。
將本發明之方法B所製作之顆粒型培養骨以5名受驗者進行確認之骨再生機率呈示於第4圖。由其結果可知，細胞數為1×105 時，確認有2名骨再生，而細胞數為5×105 時，以100%之機率達成骨再生。
<實施例3>
對於以實施例1之方法與下述方法X所製作之培養類骨母細胞經2週分化誘導後進行細胞數測定。另外，在以下實施例中之細胞數的測定，係使用以WST-8作為發色基質之Cell Counting Kit-8(同仁化學研究所公司)。
此處，相對於50mg之β-TCP顆粒，所接種之細胞數係以1×105 個進行。細胞數之比例係依試料之吸光度所算出的細胞數之比例(以下述方法X所製作之細胞數為100%)。結果呈示於表3。
方法X：
實施例1中，係將懸浮於培養基之細胞直接接種在乾燥的載體(β-TCP顆粒)上並施以振動，而在方法X中，係將細胞懸浮液添加於預先浸漬在培養基並沉澱之β-TCP顆粒而進行接種。其它製法係與實施例1同樣進行。
由表3可知，依本發明之實施例的方法而製造時，相較於方法X者，可多得到28%左右的培養類骨母細胞。
因此，本發明之顆粒型培養骨的製造方法中，於接種步驟中，必須在預先投入有經乾燥之多孔質擬骨顆粒的深底容器中，同時投入所培養的間葉系幹細胞與培養液而進行接種。更且，在該接種步驟中，宜施加振動。
<實施例4>
其次，於接種步驟中，使接種之細胞濃度變化時，對細胞分化的影響進行檢討。
本發明之下述顆粒型培養骨的製造方法A中，如下述條件1至3，使接種之細胞濃度(懸浮之培養基量)變化並添加在分化誘導培養基經1天後以及2週後測定細胞數。骨髓細胞係採自大鼠之大腿骨。
實驗進行3次，測定值係3次的平均值。以下，細胞數以WST-8之吸光度(OD值)表示，由測定值減去空白組之值而求得。結果呈示於第5圖。
顆粒型培養骨的製造方法A：
基本之步驟係依與上述實施例1之相同方法進行。所變更之處係如下所述。
一次培養步驟中，骨髓細胞係經實驗而採自人體骨髓液或大鼠的大腿骨。使用人體骨髓液時，係將採集之骨髓液懸浮在4倍量的細胞培養用培養基(含血清之α MEM)中。使用大鼠時，係由使用Ficoll之密度梯度離心法來分離單核血球區分，並將其懸浮在細胞培養用培養基而進行接種。血清係使用FBS(胎牛血清)。
接種步驟中，相對於50mg之β-TCP顆粒，接種100,000至2,500,000之細胞。
分化培養步驟中，分化誘導培養基係使用在含有FBS之βMEM中加入地塞美松、抗壞血酸2-磷酸、β-甘油磷酸者。
條件1：接種細胞數為100,000(細胞1×105 懸浮在5mL中)、接種細胞濃度為20,000cells/mL；條件2：接種細胞數為100,000(細胞1×105 懸浮在1mL中)、接種細胞濃度為100,000cells/mL；條件3：接種細胞數為500,000(細胞5×105 懸浮在5mL中)、接種細胞濃度為100,000cells/mL。
由第5圖即可明白，接種細胞數雖為相同，但在濃度不同的條件1、條件2中，分化誘導後之細胞數會產生差異。
在進行高濃度接種之條件2中，在分化誘導1天後以及2週後，細胞數較條件1者為多。
並且，在接種細胞數雖為條件1、條件2之5倍，然而非為高濃度接種之條件3中，試料於分化誘導培養基中添加1天後之細胞數並不如其之多，並且2週後之細胞數大幅度地減少。
由此可知，以高濃度進行細胞接種者之接種效率較佳。因此，在本發明之顆粒型培養骨的製造方法中，宜進行高濃度接種。
<實施例5>
其次，在接種步驟中，於深底容器投入培養液時，對於施加旋轉時對細胞分化的影響進行檢討。
在本發明之顆粒型培養骨的製造方法A中，如下述條件4至7，變更接種之細胞數、旋轉與否以及分化誘導培養基的添加與否，於分化誘導培養基(或一般的培養基)中添加2週後進行細胞數以及ALP活性之測定，求算出ALP值/細胞數。另外，骨髓細胞係採自人體骨髓液。在ALP活性之測定，係使用上述之Cell Counting Kit-8以及對硝基苯磷酸酯錠劑組(Sigma-Aldrich公司)進行。以下，旋轉係在接種步驟中投入培養液，而多孔質擬骨顆粒沉澱後使用旋轉裝置施行。
實驗進行3次，測定值係呈示3次的平均值。細胞數與ALP值係經由減去空白組之值而求得。結果示於表4。
條件4：接種細胞數500,000(使用1mL，5×105 cells/mL)；旋轉數1.3rpm(30分鐘)；骨分化誘導(+)
條件5：接種細胞數500,000(使用1mL，5×105 cells/mL)；旋轉數1.3rpm(30分鐘)；骨分化誘導(-)
條件6：接種細胞數500,000(使用5mL，1×105 cells/mL)；無旋轉；骨分化誘導(+)
條件7：未接種細胞
條件8：接種細胞數500,000(使用1mL，5×105 cells/mL)；無旋轉；骨分化誘導(+)
由表4可知，試驗例5-1中，細胞數雖略少但ALP值較高，由於ALP值/細胞數較大，因此骨分化之程度極高。
試驗例5-2中，細胞數雖多但ALP值較低，因而可預測顆粒型培養骨之製造會有難以成功的情形。
另一方面，在無施加旋轉之試驗例5-3中，可知細胞數雖多，惟與試驗例5-1相比，ALP值/細胞數稍小。
因此，在本發明之顆粒型培養骨的製造方法中，宜於接種步驟中，將所培養之間葉系幹細胞與培養液同時投入深底容器後施加旋轉。
<實施例6>
其次，對於接種步驟中施加旋轉時對細胞的影響進行更詳細地檢討。
在本發明之顆粒型培養骨的製造方法A中，係如上述條件4、7、8，變更接種步驟中之旋轉與否。然後，在分化誘導17日後，進行細胞數之測定以及以結晶紫染色。另外，骨髓細胞係採自人體骨髓液。
另外，實驗進行3次，測定值係呈示3次的平均值。將細胞數之測定結果示於表5，細胞之染色結果示於第6圖。
由表5可知，在高濃度接種以及進行旋轉之試驗例6-1中，相較於雖進行高濃度接種但不施加旋轉之試驗例6-2，細胞數減少。
然而，如第6圖(B)可知，未進行旋轉之試料，確認右側有細胞未充分接種之部分。
另一方面，如第6圖(A)可知，進行高濃度接種並旋轉之試料，細胞係齊整的接種。
因此，可明白在接種步驟中施加旋轉者雖有稍微減少細胞數的可能性，惟可將細胞齊整且良好地接種。
<實施例7>
其次，對於接種步驟中之較佳旋轉數以及旋轉時間進行檢討。
本發明之顆粒型培養骨的製造方法A中，使接種步驟時之旋轉數、旋轉時間變更如下述條件9至13，在分化誘導2週後進行細胞數之測定。骨髓細胞係採自大鼠之大腿骨。其中，相對於50mg之β-TCP顆粒，接種之細胞數以100,000(1×105 cells/mL)進行。
另外，實驗進行3次，測定值係呈示3次的平均值。測定結果示於表6。
條件9：旋轉數1.3rpm(30分鐘)
條件10：旋轉數1.3rpm(1小時)
條件11：旋轉數2rpm(30分鐘)
條件12：無旋轉(靜置)
條件13：僅培養基
如依表6，將以旋轉數1.3rpm旋轉30分鐘者、1小時者以及以旋轉數2rpm旋轉30分鐘者、無旋轉者之組群做比較後，雖見到1天後之細胞數大有差別，然而2週後以旋轉數1.3rpm旋轉30分鐘之試驗例7-1係有最多的細胞數。
由上述記載而可明瞭，在本發明之顆粒型培養骨的製造方法之接種步驟中，以投入培養液並在多孔質擬骨顆粒沉澱後，宜施以旋轉數1.3rpm左右之旋轉30分鐘至1小時，以30分鐘左右為佳。
10．．．骨髓液
12．．．細胞培養用燒瓶
14．．．多孔質擬骨顆粒
16．．．深底容器
18．．．試管架
20．．．導溝
22．．．試管用蓋
24．．．再生骨
第1圖之(A)至(E)係顆粒型培養骨製造方法之概略步驟圖。
第2圖係深底容器之概略圖。
第3圖之(A)至(D)係各細胞接種法之移植組織影像。
第4圖係經本細胞接種法之骨再生機率(4週後)
第5圖係改變接種細胞濃度時之分化培養後之細胞數目的圖。
第6圖之(A)及(B)係經結晶紫染色之結果(接種細胞數目：相對於50mg之β-TCP顆粒為5×105 、高濃度接種(5×105 cells/mL))：(A)係進行旋轉的情形(條件1)、(B)係未進行旋轉的情形(條件5)。
10．．．骨髓液
12．．．細胞培養用燒瓶
14．．．多孔質擬骨顆粒
16．．．深底容器

Claims (10)

  1. 一種顆粒型培養骨的製造方法，其特徵係具備以下步驟：將源自採自患者之骨髓液、骨膜或脂肪的細胞經由培養基內的培養而培養間葉系幹細胞(mesenchymal stem cells)的一次培養步驟；於預先投入多孔質擬骨顆粒之高度為70mm至150mm之深底容器中將所培養的間葉系幹細胞與培養液一起投入，使上述多孔質擬骨顆粒在暫時浮起之狀態下接種的接種步驟；將經接種的間葉系幹細胞與多孔質擬骨顆粒同時於培養基內進行培養而使分化為培養類骨母細胞(osteoblast-like cells)之分化培養步驟。
  2. 如申請專利範圍第1項之顆粒型培養骨的製造方法，其中，接種步驟所使用之間葉系幹細胞為初代培養及/或第一繼代培養之培養細胞。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之顆粒型培養骨的製造方法，其中，分化培養步驟中之分化培養期間為2週。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之顆粒型培養骨的製造方法，其中，多孔質擬骨顆粒係乾燥時之視比重小於培養液且在培養液中吸收該培養液而沉降之多孔質體者。
  5. 如申請專利範圍第1或2項之顆粒型培養骨的製造方法，其中，多孔質擬骨顆粒係於30分鐘內沉降在深底容器之培養液中的多孔質體。
  6. 如申請專利範圍第1或2項之顆粒型培養骨的製造方法，其中，多孔質擬骨顆粒係一種或二種以上選自包含β-磷酸三鈣(β-TCP)、羥基磷灰石、乾燥骨粉之多孔質活體吸收性顆粒。
  7. 如申請專利範圍第1或2項之顆粒型培養骨的製造方法，其中，係於接種步驟中投入培養液時，施加振動使多孔質擬骨顆粒沉降後再賦予旋轉。
  8. 如申請專利範圍第1或2項之顆粒型培養骨的製造方法，其中，接種步驟中投入培養液時所施加之振動為20至120Hz。
  9. 如申請專利範圍第1或2項之顆粒型培養骨的製造方法，其中，相對於接種步驟中之50mg多孔質擬骨顆粒，接種細胞濃度為20,000cells/mL至3,000,000cells/mL。
  10. 如申請專利範圍第1或2項之顆粒型培養骨的製造方法，其中，預先投入多孔質擬骨顆粒之深底容器為直立於試管架上之容器，而該容器具有由底部至上方開口部之導溝，且於容器中裝有經殺菌之多孔質擬骨顆粒者。
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