TWI477292B - 用於防止黑色素沉澱之沙苑子萃取物 - Google Patents

Description

用於防止黑色素沉澱之沙苑子萃取物

本案係有關於一種用於防止黑色素沉澱之沙苑子萃取物，尤其係指一種具有抑制酪胺酸酶活性能力、抑制多巴醌合成能力、抑制微脂粒過氧化能力、清除自由基能力，以及抑制細胞外黑色素生成能力之沙苑子萃取物；藉此，達到改善黑色素沉澱之目的。

雖然傳統觀念中僅亞洲女性具有一白遮三醜的觀念，但是全世界的女性都有預防色素沉澱、斑點形成的需求。不論是預防色素沉澱或是預防斑點形成都是市售改善黑色素沉澱之組成物常標榜的功效，其作用機制都涉及抑制黑色素(Melanin)生成。文獻指出黑色素形成發生於黑色素細胞內，其機制如下：黑色素由體內酪胺酸(Tyrosine)經由酪胺酸酶(Tyrosinase)作用形成多巴(D-Dopa)，再次經由酪胺酸酶作用形成多巴醌(dopaquinone)，再次經一連串的化學反應形成混合型的黑色素；一般來說，改善黑色素沉澱之組成物的作用在於抑制黑色素生成，可透過下列機轉：抑制黑色素細胞內黑色素生成、還原體內黑色素、促進細胞表面黑色素排泄，以及選擇性地對黑色素細胞展現細胞毒性(cytotocixity)；現行的做法 常利用美白成分以改善黑色素沉澱。

比較目前常見的美白成分包括有維生素C(Vitamin C，L-ascorbic acid)、對苯二酚(Hydroquinone)、麴酸(kojic acid)，這些美白成分雖具有顯著功效，卻各有其使用上之限制。維生素C在陽光下或接觸空氣易被氧化，並且不耐熱，當濃度超過5%以上會對皮膚產生刺激性及紅腫。麴酸非常的不穩定容易被氧化變色及引起皮膚過敏，且長期過量使用麴酸產品會導致細胞毒性且發生病變。對苯二酚具細胞毒性，有多數人使用含對苯二酚的產品會有紅斑症狀，或是使用濃度超過5%，會引發白斑症或是色素沉澱。

爰此，尋求有效且穩定的酪胺酸酶抑制劑，以防止皮膚黑色素形成，成為開發美白產品的重要趨勢。

綜上所述，同時考量改善黑色素沉澱之組成物之細胞毒性與其功效，利用中藥萃取物作為改善黑色素沉澱之組成物的來源可降低使用上的疑慮。

本發明主要目的為提供一種用於防止黑色素沉澱之沙苑子萃取物(Flatstem milkvetch seed extract)，尤其係指一種具有抑制酪胺酸酶活性能力、抑制多巴醌合成能力、抑制微脂粒過氧化能力、清除自由基能力，以及抑制細胞外黑色素生成能力之沙苑子萃取物；藉此，達到改善黑色素沉澱之目的。

為了達到上述實施目的，本發明人提出一種用於防止黑色素沉澱之沙苑子萃取物，係以至少一步驟之有機溶劑萃取沙苑子製得；其中， 指標標準品為維生素C時，沙苑子萃取物具有相較於指標標準品1~3倍之抑制酪胺酸酶活性能力，以及1~10倍之抑制細胞外黑色素生成能力。

於本創作之一實施例中，有機溶劑係選自酯類、醇類、烷類及鹵烷所構成之族群；於沙苑子進行萃取時係至少包含以下步驟：步驟一：利用第一有機溶劑，可例如為體積百分比95%的乙醇溶液，萃取一沙苑子材料，以獲得一第一萃取物；步驟二：利用第二有機溶劑，可例如為體積比1：1的正己烷/甲醇溶液，萃取第一萃取物，以劃分出一第一有機相以及一第二有機相，其中第一有機相具有一第二萃取物，且第二有機相具有一第一剩餘物；步驟三：利用一第三有機溶劑，可例如為體積比2：1的乙酸乙酯/水溶液，萃取第一剩餘物，以劃分出一第三有機相以及第一水相，其中第三有機相具有一第三萃取物，且第一水相具有一第二剩餘物；以及步驟四：利用一第四有機溶劑，可例如為體積比1：1的正丁醇/水溶液，萃取第二剩餘物，以劃分出一第四有機相以及一第二水相，其中第四有機相具有一第四萃取物，且第二水相具有一第三剩餘物。

於本創作之一實施例中，第一有機相可例如為正己烷相，第二有機相可例如為甲醇相，第三有機相可例如為乙酸乙酯相，以及第四有機相可例如為正丁醇相。

綜上所述，本發明提供一種沙苑子萃取物，其係利用上述萃取步驟製得之沙苑子萃取物，藉此，所萃取而得之沙苑子萃取物，其特徵在於此萃取物可包括利用上述步驟而得各製程階段之沙苑子萃取物，並且具有抑制酪胺酸酶活性與抑制黑色素生成之能力，因此可應用於化妝材料組成物、食品添加物或醫藥組成物，以達到美白的目的。

(101)‧‧‧沙苑子材料

(103)‧‧‧第一萃取物

(105)‧‧‧第二萃取物

(107)‧‧‧第一剩餘物

(109)‧‧‧第三萃取物

(111)‧‧‧第二剩餘物

(113)‧‧‧第四萃取物

(115)‧‧‧第三剩餘物

(S1)‧‧‧步驟一

(S2)‧‧‧步驟二

(S3)‧‧‧步驟三

(S4)‧‧‧步驟四

第一圖：本發明沙苑子萃取物之步驟流程圖

承前所述，本發明提供一種用於防止黑色素沉澱之沙苑子萃取物(Flatstem milkvetch seed extract)，其係利用至少一步驟萃取而得，且本發明之沙苑子萃取物具有抑制酪胺酸酶活性與抑制細胞外黑色素生成之能力。

本文此處所稱之「沙苑子」係指豆科多年生草本植物扁莖黃耆(Astragalus complanatus R.Br.)的成熟種子，沙苑子係一種中藥藥材，中醫上的功效為補腎固精、養肝明目；既有的沙苑子的研究皆著重於抗壓、保肝及抗癌等功效。本案發明人藉由至少一步驟之有機溶劑製得沙苑子萃取物，本文此處所稱之「至少一步驟」，實指利用不同極性的有機溶劑系統製得沙苑子萃取物，並確立其改善黑色素形成之功效，此種功效於先前對於沙苑子的應用屬於非常罕見案例。

首先，本發明之一種用於防止黑色素沉澱之沙苑子萃取物，係以至少一步驟之有機溶劑萃取沙苑子製得，有機溶劑可例如為酯類、醇類、烷類及鹵烷所構成之族群；其中，指標標準品為維生素C時，沙苑子萃取物具有相較於指標標準品1~3倍之抑制酪胺酸酶活性能力，以及1~10倍之抑制細胞外黑色素生成能力；爰此，沙苑子萃取物係可作為化妝材料組成物、食品添加物或醫藥組成物。

於本發明之一實施例中，沙苑子進行萃取時至少包含以下步驟： 步驟一(S1)：利用第一有機溶劑，可例如為乙醇溶液，萃取一沙苑子材料(101)，以獲得一第一萃取物(103)；步驟二(S2)：利用第二有機溶劑，可例如為正己烷/甲醇溶液，萃取第一萃取物(103)，以劃分出一第一有機相以及一第二有機相，其中第一有機相可例如為正己烷相，並具有一第二萃取物(105)，而第二有機相可例如為甲醇相，且具有一第一剩餘物(107)；步驟三(S3)：利用一第三有機溶劑，可例如為乙酸乙酯/水溶液，萃取第一剩餘物(107)，以劃分出一第三有機相以及第一水相，其中第三有機相可例如為乙酸乙酯相，並具有一第三萃取物(109)，而第一水相具有一第二剩餘物(111)；以及步驟四(S4)：利用一第四有機溶劑，可例如為正丁醇/水溶液，萃取第二剩餘物(111)，以劃分出一第四有機相以及一第二水相，其中第四有機相可例如為正丁醇相，具有一第四萃取物(113)，且第二水相具有一第三剩餘物(115)。

於本發明之一實施例中，前述之沙苑子萃取物係以至少一步驟之有機溶劑而製得，係包括在利用體積百分比95%的乙醇溶液萃取後，接著相繼利用體積比1：1的正己烷/95%甲醇溶液、體積比2：1的乙酸乙酯/水溶液以及體積比1：1的正丁醇/水溶液等有機溶劑萃取出沙苑子萃取物。

於本發明之一實施例中，沙苑子萃取物具有「抗黑色素生成活性(antimelanogenic activity)」，亦即沙苑子萃取物具有抑制酪胺酸酶活性與抑制黑色素生成之能力；當指標標準 品以及沙苑子萃取物之處理濃度分別為50μg/mL以及100μg/mL時，沙苑子萃取物分別具有相較於指標標準品1.38~2.79倍以及1.81~2.38倍之抑制酪胺酸酶活性能力，並具有5.3~9.9倍以及1.18~1.19倍之抑制細胞外黑色素生成能力；藉此，達到改善黑色素沉澱之功效，此外，沙苑子萃取物對黑色素細胞亦具有較低之細胞毒性。

以下利用數個實施例以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。

實施例一：沙苑子萃取物之製備

此實施例係利用第一圖之沙苑子萃取物之步驟流程圖，首先，進行步驟一(S1)，其係利用粉碎機，在室溫或略低於室溫之溫度下，打碎沙苑子材料(101)後，將打碎之沙苑子材料(101)浸於體積百分比95%之乙醇溶液中；接著，進行過濾步驟，其係利用紗布、濾紙或其他過濾方式，過濾上述含有粉碎沙苑子皮材料之95%乙醇溶液，重複四次後，以獲得濾液；然後，利用減壓濃縮法去除乙醇溶液後，獲得第一萃取物(103)，其中第一萃取物(103)為沙苑子之粗萃取物。

隨後，利用組成為體積比1：1的正己烷/95%甲醇溶液的第二有機溶劑對上述第一萃取物(103)進行劃分(partition)步驟，藉以分層獲得第一有機相以及第二有機相，其中第一有機相為正己烷相，而第二有機相為甲醇相。第一有機相內含第二萃取物(105)，利用減壓濃縮法去除有機溶劑以獲得第二萃取物(105)；而第二 有機相內含第一剩餘物(107)。

再者，利用減壓濃縮法去除第二有機相之有機溶劑後，利用組成為體積比2：1的乙酸乙酯/水溶液的第三有機溶劑對上述第一剩餘物(107)進行步驟三(S3)，以劃分出第三有機相以及第一水相，第三有機相為乙酸乙酯相，且第三有機相具有第三萃取物(109)，利用減壓濃縮法去除有機溶劑以獲得第三萃取物(109)；此外，第一水相具有第二剩餘物(111)。

最後，利用減壓濃縮法去除第一水相之水分後，利用組成為體積比1：1的正丁醇/水溶液的第四有機溶劑對第二剩餘物(111)進行步驟四(S4)，藉以分層獲得第四有機相以及第二水相，其中第四有機相為正丁醇相，且第四有機相內含第四萃取物(113)，利用減壓濃縮法去除有機溶劑以獲得第四萃取物(113)；而第二水相內含第三剩餘物(115)。

值得一提的是，利用本發明之方法進行劃分步驟時，分層較為容易，且不易起泡，因此可縮短製程時間；此外，上述萃取步驟之間利用減壓濃縮法去除有機溶劑或水分以獲得不同製程階段之沙苑子萃取物，可藉此找出沙苑子中具有改善黑色素沉澱之有效成分。

實施例二：評估沙苑子萃取物之細胞毒性

在此實施例中，首先係測試實施例一不同製程階段之沙苑子萃取物對於皮膚角質細胞或黑色素細胞是否具有細胞毒性。在此實施例中，使用於測試之細胞株分別為HaCaT人類皮膚角質細胞株(ATCC編號：CCL-155)以及B16小鼠黑色素瘤細胞株(ATCC編 號：CRL-6322)，其中ATCC為美國典型菌種中心(American Type Culture Collection；ATCC)之簡稱。上述細胞係利用無菌技術培養於細胞培養液中，其中HaCaT人類皮膚角質細胞株與B16小鼠黑色素瘤細胞株之細胞培養液為杜貝可改良之伊格氏培養液(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM；Gibco，Grand Island，NY)並另添加10體積百分比之胎牛血清(fetal bovine serum；Hazelton Product，Denver，PA，U.S.A.)以及1體積百分比之抗生素(含有盤尼西林與鏈黴素，penicillin-streptomycin)。上述細胞於96孔盤中每孔種1.0×10⁴ 細胞(細胞密度1.0×10⁵ 細胞/mL，每孔添加的體積為100μL)，然後在37℃保持溼度之5%二氧化碳濃度下培養至少24小時。之後，將濃度50μg/mL之沙苑子萃取物(第一~四萃取物)(103)(105)(109)(113)或濃度100μg/mL之沙苑子萃取物(第一~四萃取物)(103)(105)(109)(113)添加於上述細胞中。培養72小時後，每孔細胞加入10μL之溴化3-(4，5-二甲基唑-2)-2，5-二苯基四氮唑〔3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide；MTT四氮唑；5mg/mL〕，於37℃作用4小時後，移除上清液，再加入100μL之二甲亞碸(dimethyl sulfoxide；DMSO；Sigma Chemical Co，St．Louis， U.S.A.)溶解MTT甲臢(MTT formazan；MTT四氮唑被還原後之產物)，震盪10分鐘後，利用例如多功能微量盤測讀機(Multi-Detection Microplate Reader；Synergy TM 2，BioTek Instruments，Inc.，U.S.A.)測量其於波長570nm的吸光值以計算細胞存活率(cell viability)，其結果如第1表所示。以未經沙苑子萃取物處理的細胞存活率(%)作為對照組(細胞存活率為100%)，其他處理組之細胞存活率與未處理的對照組相比，經換算後所得之值。每筆數值至少由大於或等於3個樣本數所得出。

由第1表之結果可知，相較於對照組細胞的細胞存活率，不同製程階段之沙苑子萃取物中，以50μg/mL沙苑子第一萃取物(103)、第二萃取物(105)、第三萃取物(109)與第四萃取物(1 13)分別處理HaCaT人類皮膚角質細胞株，其細胞存活率分別為45.2±1.5%、85.4±1.9%、73.2±1.9%和41.2±2.9%；而以100μg/mL沙苑子第一萃取物(103)、第二萃取物(105)、第三萃取物(109)與第四萃取物(113)分別處理HaCaT人類皮膚角質細胞株，其細胞存活率分別為37.8±5.6%、10.7±3.6%、19.1±3.4%和40.5±2.7%。然而，以50μg/mL沙苑子第一萃取物(103)、第二萃取物(105)、第三萃取物(109)與第四萃取物(113)分別處理B16小鼠黑色素瘤細胞株，其細胞存活率分別為132.1±1.3%、104.1±3.5%、94.8±3.1%和107.2±3.6%；而以100μg/mL沙苑子第一萃取物(103)、第二萃取物(105)、第三萃取物(109)與第四萃取物(113)分別處理B16小鼠黑色素瘤細胞株，其細胞存活率分別為121.1±3.9%、76.1±2.2%、19.9±2.1%和97.9±3.4%。結果顯示，相較於HaCaT人類皮膚角質細胞株，沙苑子萃取物對B16小鼠黑色素瘤細胞株具有較低的細胞毒性，其中高劑量的沙苑子第一萃取物(103)與第四萃取物(113)對B16小鼠黑色素瘤細胞株幾乎不具細胞毒性。

實施例三：評估沙苑子萃取物抑制酪胺酸酶之活性

此實施例係利用實施例二之B16小鼠黑色素瘤細胞株，進一步評估沙苑子萃取物抑制酪胺酸酶之活性。大體上，B16小鼠黑色素瘤細胞株於24孔盤中每孔種1.0×10⁵ 細胞(每孔添加體積1mL)，然後在37℃保持溼度之5%二氧化碳濃度下培養至少24小時。之後， 使用1μM的α-黑色素細胞刺激激素(α-melanocyte stimulating hormone；α-MSH；Sigma Chemical Co，St.Louis，U.S.A.)(對照組)，或者α-MSH結合濃度50μg/mL或100μg/mL之沙苑子萃取物或維生素C等，於37℃下對B16小鼠黑色素瘤細胞株作用72小時，然後進行以下測定。

1.沙苑子萃取物抑制酪胺酸酶活性能力之分析

B16小鼠黑色素瘤細胞株經上述處理並於37℃作用72小時後，移除每孔細胞的培養液，並以磷酸鹽緩衝(phosphate buffered saline；PBS)溶液潤洗，加入例如900μL之磷酸鈉緩衝溶液(sodium phosphate buffer，50mM，含1% Triton X-100)(pH6.8)，利用冷凍-解凍(freeze-thawed)的方式，於-80℃冷凍30分鐘，接著取出於25℃解凍25分鐘並於37℃解凍5分鐘，使細胞溶解。之後，每孔細胞加入例如100μL之L-多巴(L-DOPA)溶液(10mM)。經上述處理並於37℃作用4小時後，利用分光光度計，例如多功能微量盤測讀機，測量各孔的反應混合物於475nm下的吸光值，並與對照組(DMSO最終濃度為0.1%)以及正對照組(維生素C)比較。

由第2表之結果可知，係沙苑子萃取物與維生素C對於B16小鼠黑色素瘤細胞株內酪胺酸酶活性抑制能力之相對比率，50μg/mL維生素C、沙苑子第-萃取物(103)、第二萃取物(105)、第三萃取物(109)與第四萃取物(113)對於細胞內酪胺酸酶活性抑制能力之相對比率分別為35.9±3.2%、100.0±2.1%、49.5±3.1%、64.1±2.8%、57.7±1.3%；而100μg/mL維生素C、沙苑子第-萃取物(103)、第二萃取物(105)、第三萃取物(109)與第四萃取物(113)對於細胞內酪胺酸酶活性抑制能力之相對比率分別為40.3±2.2%、72.8±4.8%、96.1±3.9%、80.6±3.4%和75.1±4.8%。結果顯示沙苑子萃取物皆可有效抑制黑色素細胞內的酪胺酸酶活性，且沙苑子萃取物較維生素C具有更高的酪胺酸酶活性之抑制能力。

2.沙苑子萃取物抑制酪胺酸酶合成多巴醌能力之分析

B16小鼠黑色素瘤細胞株經上述處理並於37℃作用72小時後，移除每孔細胞的培養液，並以PBS溶液潤洗，加入例如20μL之磷酸鈉緩衝溶液(50mM，含0.5% Triton X-100)(pH6.9)，利用冷凍-解凍的方式，於-80℃冷凍30分鐘，接著取出於25℃解凍25分鐘並於37℃解凍5分鐘，使細胞溶解。接著，每孔細胞加入預先回溫且新鮮配製的受質溶液190μL，其中受質溶液可包括6.3mM之3-甲基-2-苯並噻唑啉酮腙(3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone；MBTH)以及1.1mM之多巴溶液(配製於48mM之磷酸鈉緩衝溶液，pH7.1)，並添加4體積百分比(%v/v)之N，N’ -二甲基甲醯胺(N，N’ -dimethylformamide)。經上述處理並於37℃作用4小時後，利用分光光度計，例如上述之多功能微量盤測讀機，測量各孔的反應混合物於508nm下的吸光值，並與對照組(DMSO最終濃度為0.1%)以及正對照組(維生素C)比較。由於細胞內酪胺酸酶與L-多巴溶液作用生成多巴醌，接著環化生成DOPAchrome，而DOPAchrome和MBTH作用會產生粉紅色產物，因而在508nm下具有強的吸光值，藉此法測定沙苑子萃取物抑制酪胺酸酶合成多巴醌之能力。

由第3表之結果可知，係沙苑子萃取物與維生素C抑制B16小鼠黑色素瘤細胞株酪胺酸酶合成多巴醌的能力之相對比率，50μg/mL維生素C、沙苑子第一萃取物(103)、第二萃取物(105)、第三萃取物(109)與第四萃取物(113)對於細胞內酪胺酸酶合成多巴醌的抑制能力之相對比率，分別為76.2±3.6%、34.3±10.7%、20.0±6.4%、5.0±4.7%和37.7±3.8%；而100μg/mL維生素C、沙苑子第一萃取物(103)、第二萃取物(105)、第三萃取物(109)與第四萃取物(113)抑制B16小鼠黑色素瘤細胞株酪胺酸酶合成多巴醌的能力之相對比率，分別為88.3±3.2%、36.8±7.9%、40.6±3.8%、20.7±5.4%和44.5±1.9%。結果顯示沙苑子萃取物皆可抑制酪胺酸酶合成多巴醌；因此，上述結果證實，實施例一之沙苑子萃取物萃取物皆可有效抑制黑色素細胞內的多巴氧化酶活性，且其中以沙苑子第一萃取物(10 3)、第二萃取物(105)與第四萃取物(113)抑制酪胺酸酶合成多巴醌的能力較高。

3.沙苑子萃取物抑制細胞外黑色素生成之能力分析

此項評估測定細胞外黑色素之含量。簡言之，B16小鼠黑色素瘤細胞株於6孔盤中每孔種3.0×10⁵ 細胞(每孔添加體積3mL)，然後在37℃保持溼度之5%二氧化碳濃度下培養至少24小時。之後，使用二甲亞碸(DMSO；Sigma Chemical Co，St.Louis，U.S.A.)(對照組)，或者α-MSH結合濃度50μg/mL或100μg/mL之沙苑子萃取物第一萃取物(103)或維生素C處理，於37℃下對B16小鼠黑色素瘤細胞株作用72小時，其中細胞培養液DMEM不含酚紅(phenol red)。B16小鼠黑色素瘤細胞株經上述處理並於37℃作用72小時後，每孔取100μL細胞培養液加入96孔盤中，利用分光光度計(例如多功能微量盤測讀機)測量各孔細胞培養液於405nm下的吸光值，並與對照組(DMSO最終濃度為0.1%)以及正對照組(維生素C)比較。

由第4表之結果可知，係沙苑子萃取物與維生素C抑制B16小鼠黑色素瘤細胞外黑色素生成之能力的相對比率，50μg/mL維生素C與沙苑子第一萃取物(103)抑制B16小鼠黑色素瘤細胞外黑色素生成之能力的相對比率分別為11.7±4.0%和80.1±3.7%；而100μg/mL維生素C與沙苑子第一萃取物(103)抑制B16小鼠黑色素瘤細胞外黑色素生成之能力的相對比率分別為77.2±3.7%和91.5±4.5%。結果顯示沙苑子第一萃取物(103)可抑制細胞外黑色素生成，且沙苑子第一萃取物(103)抑制細胞外黑色素生成之能力較等量之維生素C高。

實施例四：評估沙苑子萃取物清除自由基之活性

生物體正常有氧代謝過程中會自然形成許多活性氧物質(reactive oxygen species；ROS)，活性氧物質包括超氧陰離子(superoxide anion radical，O₂ ．^- )、過氧化氫(hydrogen peroxide；H₂ O₂ )、氫氧自由基(hydroxyl radical，OH．)、單重態氧(single oxygen；O₂ )等，會攻擊皮膚組織造成皮膚組織老化。

1.沙苑子萃取物對DPPH．自由基清除能力測定

此實施例係利用實施例一不同製程階段之沙苑子萃取物，評估其清除1，1-二苯基-2-苦醯肼基(1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl；DPPH．)自由基之清除能力。DPPH．自由基是一種穩定的自由基，在波長517nm有最大吸光值。藉由加入樣品乙醇溶液後測量其517nm吸光值變化，即可換算出濃度 下之自由基抑制率。顏色由藍紫轉為淡黃色，吸光值也隨之降低，因此可藉由517nm下吸光值的變化，來評估抗氧化物清除自由基的能力，吸光值越低時表示樣品抗氧化能力越佳。

此例示係以維生素C為標準品，將實施例一所得之沙苑子第一萃取物(103)、第二萃取物(105)、第三萃取物(109)與第四萃取物(113)，分別配製成不同的濃度(50、100μg/mL)之乙醇溶液後，各取10μL之樣品乙醇溶液，加入新鮮配製900μL的100μM DPPH．乙醇溶液以及90μL的DMSO，避光並均勻混合後，以分光光度計檢測混合液於517nm之吸光值，並依下式計算各萃取物的DPPH．自由基之清除效應百分比(scavenging effects；%)，所得之結果如圖二所示，而每筆數值至少由大於或等於3個樣本數所得出：

由第5表之結果可知，50μg/mL維生素C、沙苑子第一萃取物(103)、第二萃取物(105)、第三萃取物(109)與第四萃取物(113)的DPPH．自由基之清除效應百分比(%)，分別為95.8±0.4%、23.0±4.1%、27.1±3.2%、72.1±3.8%和48.9±1.4%；而100μg/mL維生素C、沙苑子第一萃取物(103)、第二萃取物(105)、第三萃取物(109)與第四萃取物(113)的DPPH．自由基之清除效應百分比(%)，分別為98.7±0.2%、27.1±2.1%、33.1±2.5%、78.1±3.7%和70.6±3.1%。結果顯示沙苑子萃取物均具有清除DPPH．自由基的能力，且其中以沙苑子第三萃取物(109)與第四萃取物(113)清除DPPH．自由基之能力較高。

2.沙苑子萃取物對ABTS． ⁺ 陽離子自由基清除活性(ABTS radical scavenging activity)

2，2’-次偶氮基-雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)(2，2’-azino-bis-(3-ethylbenzthia zoline-6-sulfonic acid；ABTS)在過氧化酶(peroxidase)的催化下，會產生ABTS．⁺ 自由基，而呈現穩定的藍綠色。因此藉由加入抗氧化物參與反應，ABTS．⁺ 得以還原成ABTS而抑制藍綠色生成，並經由測定734nm吸光值的變化，可評估抗氧化物的抗氧化能力，且當吸光值越低時，表示樣品的抗氧化能力越佳。由於此測定方式係以水溶性維生素E(6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid；trolox)為正標準品，製作標準曲線以作為對照並評估其總抗氧化能力，因此又稱為trolox當量的抗氧化能力(trolox Equivalent Antioxidant Capacity；TEAC)。

此例示係以水溶性維生素E(trolox)為標準品，將實施例一所得之沙苑子萃取物，分別配製成不同的濃度(5、100μg/mL)之樣品溶液後，取不同濃度點之樣品溶液1.5μL，加入3.5μL ddH₂ O(去離子水)以及145μL之7mM ABTS．⁺ 溶液，避光混合均勻後，於室溫靜置20分鐘。之後，利用分光光度計測定trolox於734nm之吸光值，作出trolox標準曲線，以藉由標準曲線換算出各樣品之TEAC(mg trolox/g)值， 並依下式計算各萃取物的ABTS．⁺ 自由基之清除效應百分比，每筆數值至少由大於或等於3個樣本數所得出：

由第6表之結果得知，50μg/mL水溶性維生素E(trolox)、沙苑子第一萃取物(103)、第二萃取物(105)、第三萃取物(109)與第四萃取物(113)的ABTS．⁺ 自由基之清除效應百分比(%)，分別為99.3±0.8%、10.9±1.4%、12.0±1.7%、33.5±1.5%和60.4±3.8%；而100μg/mL維生素C、沙苑子第一萃取物(103)、第二萃取物(105)、第三萃取物(109)與第四萃取物(113)的ABTS．⁺ 自由基之清除 效應百分比(%)，分別為99.7±0.5%、17.1±6.1%、15.7±2.5%、67.0±3.4%和96.8±4.1%。水溶性維生素E(trolox)、沙苑子第三萃取物(109)與第四萃取物(113)的trolox當量的抗氧化能力(trolox Equivalent Antioxidant Capacity；TEAC)分別為1000、13636與7365mg trolox/g。結果顯示，實施例一所得之沙苑子萃取物濃度與其ABTS．⁺ 自由基之清除效應百分比(%)皆成正相關。其中沙苑子第四萃取物(113)之trolox當量的抗氧化能力數值(TEAC)較水溶性維生素E(trolox)的trolox當量的抗氧化能力數值(TEAC)低，顯示沙苑子第四萃取物(113)較水溶性維生素E(trolox)具有更高的抗氧化能力。

3.沙苑子萃取物對超氧化物生成之抑制能力評估

此實施例係利用微脂粒脂質雙層結構類似細胞膜的特性，來測試體外脂質過氧化實驗。由於脂質過氧化的產物丙二醛(malondialdehyde；MDA)在高溫下可與硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid；TBA)形成紅色的硫代巴比妥酸反應性物質(TBA-reactive substances；TBARS)，可藉由測定於532nm之吸光值，而偵測MDA含量，從而判定脂質過氧化程度。吸光值越低，表示樣品抑制脂質過氧化能力越好。

上述微脂粒的主要脂質成分可例如卵磷脂膽鹼(egg phosphatidylcholine；EPC)，其係利用體積比1： 10之EPC與去離子水於水浴環境中間接進行超音波震盪(即隔水進行超音波震盪)，形成微脂粒，其平均粒徑例如可為225nm至250nm。在此實施例中，取3.2μL的微脂粒溶液(包括10mM之卵磷脂膽鹼)、11μL的硫酸亞鐵(FeSO₄ ；10mM)溶液、11μL的維生素C(10mM)溶液、151.5μL之50mM Tris-HCl緩衝溶液(pH7.4)、2.5μL的實施例一之濃度不等的各萃取物，於37℃下反應1小時。接著，加入80μL之TCA(10%)試劑(內含1%TBA溶液)以及10.6μL之EDTA(0.1M)，加熱至100℃放置20分鐘。經冷卻並以12000rpm之轉速離心10分鐘，待沉澱後，各取100μl之上清液測量其於532nm之吸光值，以獲得MDA的含量。

由第7表之結果得知，50μg/mL水溶性維生素E(trolox)、沙苑子第一萃取物(103)、第二萃取物(105)、第三 萃取物(109)與第四萃取物(113)抑制微脂粒過氧化的能力之比率(%)，分別為32.1±0.1%、17.8±5.9%、54.9±1.5%、16.8±2.4%和19.1±3.6%；而100μg/mL維生素C、沙苑子第一萃取物(103)、第二萃取物(105)、第三萃取物(109)與第四萃取物(113)抑制微脂粒過氧化的能力之比率(%)，分別為36.0±0.5%、51.1±6.8%、60.0±3.4%、29.8±1.9%和27.4±4.1%。結果顯示，實施例一所得之沙苑子萃取物濃度與沙苑子萃取物抑制微脂粒過氧化的能力之比率(%)皆成正相關，而沙苑子第一萃取物(103)與第二萃取物(105)之沙苑子萃取物抑制微脂粒過氧化的能力之比率(%)顯著高於水溶性維生素E(trolox)以及其他不同製程階段之萃取物。

值得一提的是，本發明雖以沙苑子萃取物之萃取方式與其作為改善黑色素沉澱之組成物之用途作為專利申請範圍，但在實施例所附之實驗結果顯示沙苑子萃取物除了具有抑制酪胺酸酶活性與抑制黑色素生成之能力之功效以外，亦具有抗氧化之活性。需補充的是，本發明雖以特定的製程條件、特定分析方法或特定儀器為例示，說明本發明之沙苑子萃取物及其製造方法之應用，惟本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者可知，本發明並不限於此，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明之沙苑子萃取物可使用其他製程條件、其他分析方法或儀器進行。

由上述本發明實施例可知，本發明之用於防止黑色素沉澱之沙苑子萃取物，其優點在於利用至少一萃取步驟，可有效獲得沙苑子萃取物，以提供其改善黑色素沉澱之功效。由於利用本發明之方法進行劃分步 驟時，分層較為容易，不易起泡，縮短製程時間，故所得之沙苑子萃取物可應用於化妝品組合物及/或食品添加物。

雖然本發明已以數個實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

(101)‧‧‧沙苑子材料

(103)‧‧‧第一萃取物

(105)‧‧‧第二萃取物

(107)‧‧‧第一剩餘物

(109)‧‧‧第三萃取物

(111)‧‧‧第二剩餘物

(113)‧‧‧第四萃取物

(115)‧‧‧第三剩餘物

(S1)‧‧‧步驟一

(S2)‧‧‧步驟二

(S3)‧‧‧步驟三

(S4)‧‧‧步驟四

Claims (4)

1. 一種用於抑制酪胺酸酶活性、抑制多巴醌合成、抑制微脂粒過氧化，以及清除自由基之沙苑子萃取物，係以下述步驟製得：步驟一：利用體積百分比95%的乙醇溶液萃取一沙苑子材料，以獲得一第一萃取物；步驟二：利用體積比1：1的正己烷/95%甲醇溶液萃取該第一萃取物，以劃分出一正己烷相以及一甲醇相，其中該甲醇相具有一第二萃取物，且該甲醇相具有一第一剩餘物；步驟三：利用一體積比2：1的乙酸乙酯/水溶液萃取該第一剩餘物，以劃分出一乙酸乙酯相以及第一水相，其中該乙酸乙酯相具有一第三萃取物，且該第一水相具有一第二剩餘物；以及步驟四：利用一體積比1：1的正丁醇/水溶液萃取該第二剩餘物，以劃分出一正丁醇相以及一第二水相，其中該正丁醇相具有一第四萃取物，且該第四萃取物係同時具有抑制酪胺酸酶活性、抑制多巴醌合成、抑制微脂粒過氧化，以及清除自由基能力。
2. 根據申請專利範圍第1項所述之用於抑制酪胺酸酶活性、抑制多巴醌合成、抑制微脂粒過氧化，以及清除自由基之沙苑子萃取物，係作為化妝材料組成物、食品添加物或醫藥組成物。
3. 一種沙苑子萃取物之製備方法，係以下述步驟製得： 步驟一：利用體積百分比95%的乙醇溶液萃取一沙苑子材料，以獲得一第一萃取物；步驟二：利用體積比1：1的正己烷/95%甲醇溶液萃取該第一萃取物，以劃分出一正己烷相以及一甲醇相，其中該甲醇相具有一第二萃取物，且該甲醇相具有一第一剩餘物；步驟三：利用一體積比2：1的乙酸乙酯/水溶液萃取該第一剩餘物，以劃分出一乙酸乙酯相以及第一水相，其中該乙酸乙酯相具有一第三萃取物，且該第一水相具有一第二剩餘物；以及步驟四：利用一體積比1：1的正丁醇/水溶液萃取該第二剩餘物，以劃分出一正丁醇相以及一第二水相，其中該正丁醇相具有一第四萃取物，且該第四萃取物係同時具有抑制酪胺酸酶活性、抑制多巴醌合成、抑制微脂粒過氧化，以及清除自由基能力。
4. 根據申請專利範圍第3項所述之沙苑子萃取物之製備方法，其中該沙苑子萃取物係作為化妝材料組成物、食品添加物或醫藥組成物。