TWI466670B - 治療β－地中海型貧血及鐮刀型貧血症之方法及組合物 - Google Patents

Description

治療β-地中海型貧血及鐮刀型貧血症之方法及組合物

人類血色素分子由蛋白質雜四聚體(兩條α-樣(α-like)血球蛋白鏈及兩條β-樣(β-like)血球蛋白鏈)及四個非蛋白質血紅素群組成。α-樣及β-樣血球蛋白基因簇位於不同染色體上，且不同血球蛋白基因在兩個基因簇內之表現在發育期間受到臨時控制。此等血球蛋白基因座內之遺傳缺陷(諸如刪除或突變)會導致血色素之異常合成且因此導致血紅素病。

β-地中海型貧血及鐮刀型貧血症為兩種最常見的血紅素病，其共同影響約4.5%的世界人口。β-地中海型貧血由β-樣血球蛋白基因簇內的刪除或突變，使成人β血球蛋白鏈合成減少而引起。β血球蛋白鏈之嚴重缺乏或不存在會導致成人α血球蛋白鏈之表現失衡，且過度的α血球蛋白鏈會轉而沈澱而破壞紅血球膜，最終誘導紅血球在早期紅血球母細胞產生期間快速細胞凋亡(亦稱為重型β-地中海型貧血或庫利氏貧血(Cooley's anemia))。患有重型β-地中海型貧血之個體在出生後6至9個月內完全變為貧血，該時間為完成血色素自HbF(α2/γ2)轉換為HbA(α2/β2)的時間。

鐮刀型貧血症由β血球蛋白鏈6位上的點突變(Glu突變為Val)引起。患有鐮刀型貧血症之患者特徵為存在鐮刀狀血色素HbS(α2/β^S 2)。突變之成人β血球蛋白鏈促進HbS在低氧條件下聚合，其使紅血球畸變為特徵性鐮刀形。鐮刀型貧血症疾病主要由溶血引起，因為畸形之鐮刀狀細胞在 10-20天內會在脾內被破壞。由於早期死亡之高風險，據報導鐮刀型貧血症患者的預期壽命縮短至平均42-48歲。由於正常成人血色素的產生受損，因此重型β-地中海型貧血及鐮刀型貧血症患者需要定期輸血以補充功能性HbA從而存活。然而，持續輸血伴隨著高成本(僅在美國每年就超過1億美元)及鐵超載之高風險，鐵超載通常會導致死亡。

在β-地中海型貧血及鐮刀型貧血症中，已報導HbF表現之升高有助於改善基本疾病之臨床症狀。在重型β-地中海型貧血患者中，可升高胎兒γ血球蛋白鏈之合成來形成HbF並藉此平衡過量的α血球蛋白鏈，因此可調節患者之嚴重貧血。此外，γ血球蛋白鏈的增加亦可防止HbS的形成，且HbF之存在可直接抑制鐮刀狀細胞患者中HbS的聚合。

因此，在血紅素病患者中藉由藥理學誘導HbF可用作可能有用之治療策略。迄今為止，已證明若干化學治療劑會刺激胎兒血色素產生，諸如曲古抑菌素A(trichostatin A)(組蛋白脫乙醯基酶抑制劑)、阿匹西定(apicidin)(組蛋白脫乙醯基酶抑制劑)、5'-氮雜-胞嘧啶核苷(DNA甲基轉移酶抑制劑)、羥基脲(核糖核苷酸還原酶抑制劑)、丁酸酯及其他短鏈脂肪酸。然而，多數此等HbF誘導劑顯示個體與個體之間易變的功效、血球蛋白基因誘導之低特異性及不可逆細胞凋亡之高毒性。在此等藥物中，羥基脲為第一種由US FDA核可用於治癒血紅素病之藥品。不幸的是，約25%的用者對羥基脲治療的反應不良或無反應。此外，其存在骨髓抑制及生殖毒性的潛在副作用，從而導致羥基脲在患 者中使用的治療顧慮。

鑒於此，誘導內源胚胎/胎兒血球蛋白鏈表現以治療重型β-地中海型貧血及鐮刀型貧血症之化合物在臨床上受到很大的關注。

本發明提供藉由誘導內源胚胎/胎兒血球蛋白鏈(包括紅血球中之γ血球蛋白基因誘導)治療β-地中海型貧血及鐮刀型貧血症之組合物及方法。本發明方法包括向個體投與包含治療有效量之本發明化合物的醫藥組合物，其有效治療、延遲或預防β-地中海型貧血或鐮刀型貧血症之不良作用。在某些態樣中，治療有效量之本文所述化合物可有效誘導胚胎/胎兒血球蛋白鏈之表現。

在一些態樣中，提供藉由誘導內源胚胎/胎兒血球蛋白鏈治療β-地中海型貧血或鐮刀型貧血症之化合物的醫藥組合物。提供之組合物包含有效量之本文所述化合物及醫藥學上可接受之賦形劑。在其他態樣中，提供具有誘導內源胚胎/胎兒血球蛋白鏈於紅血球系細胞中之表現之特性的化合物，該等紅血球系細胞可存在於哺乳動物宿主或作為活體外模型之培養物中。

在一個方面中，本發明提供包含式(I-a)化合物之醫藥組合物： 或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物，其中R¹ 、R² 、R³ 、R⁴ 、R⁵ 、R^6a 、R^6b 及n如本文所定義。在一些態樣中，本發明提供之醫藥組合物可用於治療β-地中海型貧血或鐮刀狀細胞型貧血。

在另一方面，本發明提供誘導γ血球蛋白之方法，其包含使細胞與本文提供之化合物或組合物接觸。在某些態樣中，接觸步驟係在活體外執行。在其他態樣中，接觸步驟係在活體內執行。在某些態樣中，本發明提供治療β-地中海型貧血之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之本文提供之化合物或組合物。在其他態樣中，本發明提供治療鐮刀狀細胞型貧血之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之本文提供之化合物或組合物。

在另一態樣中，本發明提供鑑別γ血球蛋白表現之誘導劑的方法。在某些態樣中，該方法包含將測試化合物與含有人類γ血球蛋白啟動子、β血球蛋白啟動子及雙重螢光報導體質體的MEL細胞一起培育；及測定相較於背景信號之螢光強度。在某些態樣中，本發明提供含有人類γ血球蛋白啟動子、β血球蛋白啟動子及雙重螢光報導體質體之MEL細胞。

定義

除非另外說明，否則本發明之實施將採用處於此項技術技能範疇內之習知分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學技術。該等技術在諸如以下文獻中充分解釋：「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」，第2版(Sambrook等人，1989)；「Oligonucleotide Synthesis」(M.J.Gait編，1984)；「Animal Cell Culture」(R.I.Freshney編，1987)；「Methods in Enzymology」(Academic Press,Inc.)；「Handbook of Experimental Immunology」(D.M.Weir & C.C.Blackwell編)；「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(J.M.Miller & M.P.Calos編，1987)；「Current Protocols in Molecular Biology」(F.M.Ausubel等人編，1987)；「PCR：The Polymerase Chain Reaction」,(Mullis等人編，1994)；及「Current Protocols in Immunology」(J.E.Coligan等人編，1991)。

如全文所用，「調節」意指增加或降低指定現象(例如調節生物活性係指增加生物活性或降低生物活性)。

如本文所用，術語「治療」及其類似術語係指獲得所要藥理學及/或生理學功效。該功效可為預防功效，即完全或部分預防疾病或病狀，或其症狀，及/或可為治療功效，即部分或完全治癒病狀及/或可歸因於該病狀之不良作用。如本文所用之「治療」涵蓋哺乳動物(尤其人類)中疾病或病狀的任何治療，且包括：(a)預防可能易患病狀但尚未診斷出罹患該病狀之個體會出現的病狀；(b)抑制病狀發展；及/或(c)緩解病狀，亦即使其消退。

「有效量」為足以實現有益或所要結果之量。有效量可分一或多次投藥進行投與。有效量對應於根據特定生物劑之已知功效持續預期治療時段提供特定生物劑之所要平均 局部濃度所需之量。如此項技術中已知，可由熟習此項技術者藉由進行初步動物研究並產生劑量反應曲線來確定劑量。如此項技術中已知，劑量反應曲線中之最大濃度將由化合物於溶液中之溶解度及對動物模型之毒性來決定。

根據特定生物劑之功效持續預期時段，有效量另外對應於提供特定生物劑之所要平均局部濃度所需之量。基於身體活動所引起之循環波動而產生的損失(例如10%至90%的損失)，可視個別患者及其日常活動而定。

本文可互換使用之術語「個體(individual、subject)」、「主體」及「患者」係指哺乳動物，包括(但不限於)人類、鼠類、猿猴、貓科動物、犬科動物、馬科動物、牛科動物、家畜型哺乳動物、運動型哺乳動物及寵物型哺乳動物。特別是指人類個體。

如本文所用，術語「測定」、「評定」、「分析」、「量測」及「偵測」係指定量及定性測定，且因而在本文中術語「測定」可與「分析」、「量測」及其類似術語可互換使用。若意欲定量測定，則使用「測定某一量」之用語及其類似用語。若意欲定性或定量測定，則使用「測定增殖程度」或「偵測增殖」之用語。

下文更詳細描述特定官能基及化學術語之定義。對於本發明而言，根據元素週期表(Periodic Table of the Elements),CAS版，Handbook of Chemistry and Physics，第75版封面內頁來鑑別化學元素，且特定官能基一般係如其中所述來定義。此外，有機化學、以及特定官能部分及 反應性之一般原理描述於「Organic Chemistry,」Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito：1999，其全部內容以引用的方式併入本文中。

本發明之某些化合物可以特定幾何或立體異構形式存在。本發明涵蓋屬於本發明之範疇內的所有此等化合物，包括順式異構體及反式異構體、R -對映異構體及S -對映異構體、非對映異構體、(D)-異構體、(L)-異構體、其外消旋混合物及彼等之其他混合物。諸如烷基之取代基中可存在其他不對稱碳原子。所有該等異構體以及其混合物皆包括於本發明內。

可根據本發明利用含有各種異構體比率中任一比率之異構體混合物。舉例而言，在組合僅兩種異構體之情形下，含有50：50、60：40、70：30、80：20、90：10、95：5、96：4、97：3、98：2、99：1或100：0異構體比率之混合物均涵蓋於本發明中。一般技術者容易瞭解，較複雜異構體混合物涵蓋類似比率。

例如若需要本發明化合物之特定對映異構體，則其可藉由不對稱合成或藉由對掌性助劑衍生來製備，再分離所得非對映異構體混合物且裂解輔助基團以提供純的所需對映異構體。或者，若分子含有鹼性官能基(諸如胺基)或酸性官能基(諸如羧基)，則與適當光學活性酸或鹼形成非對映異構鹽，再藉由此項技術中熟知之分步結晶或層析方式解析由此形成之非對映異構體，接著回收純對映異構體。

如本文所用之術語「脂族基」包括飽和及不飽和非芳族 直鏈(亦即未分支)、分支鏈、非環狀及環狀(亦即碳環)烴類，其視情況經一或多個官能基取代。如一般技術者將瞭解，本文之「脂族基」意欲包括(但不限於)烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基及環炔基部分。因此，如本文所用，術語「烷基」包括直鏈、分支鏈及環狀烷基。類似規定適用於其他通用術語，諸如「烯基」、「炔基」及其類似術語。此外，如本文所用，術語「烷基」、「烯基」、「炔基」及其類似術語涵蓋經取代及未經取代之基團。在某些實施例中，如本文所用，「脂族基」用於指示具有1-20個碳原子之彼等脂族基團(環狀、非環狀、經取代、未經取代、分支鏈或未分支)。脂族基團取代基包括(但不限於)本文所述之致使形成穩定部分之任何取代基(例如脂族基、烷基、烯基、炔基、雜脂族基、雜環基、芳基、雜芳基、醯基、側氧基(oxo)、亞胺基、硫代側氧基、氰基、異氰基、胺基、疊氮基、硝基、羥基、硫醇、鹵基、脂族胺基、雜脂族胺基、烷基胺基、雜烷基胺基、芳基胺基、雜芳基胺基、烷基芳基、芳基烷基、脂族氧基、雜脂族氧基、烷氧基、雜烷氧基、芳氧基、雜芳氧基、脂族硫氧基、雜脂族硫氧基、烷基硫氧基、雜烷基硫氧基、芳基硫氧基、雜芳基硫氧基、醯氧基及其類似基團，其各自可經進一步取代或可未經進一步取代)。

如本文所用，術語「烷基」具有其在此項技術中之一般含義且係指飽和脂族基團之基團，包括直鏈烷基、分支鏈烷基、環烷基(脂環)基團、經烷基取代之環烷基及經環烷 基取代之烷基。在一些情況下，烷基可為低碳烷基，亦即具有1至10個碳原子之烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基或癸基)。在一些實施例中，直鏈或分支鏈烷基可在其主鏈中具有30個或30個以下碳原子，且在一些情況下具有20個或20個以下碳原子。在一些實施例中，直鏈或分支鏈烷基可在其主鏈中具有12個或12個以下(例如對於直鏈為C₁ -C₁₂ 、對於分支鏈為C₃ -C₁₂ )、6個或6個以下，或4個或4個以下碳原子。同樣地，環烷基可在其環結構中具有3-10個碳原子，或在環結構中具有5、6或7個碳。烷基之實例包括(但不限於)甲基、乙基、丙基、異丙基、環丙基、丁基、異丁基、第三丁基、環丁基、己基及環己基。

如本文所用之術語「伸烷基」係指二價烷基。「伸烷基」為聚亞甲基，亦即-(CH₂ )_z -，其中z為正整數，例如1至20、1至10、1至6、1至4、1至3、1至2或2至3。經取代之伸烷基鏈為一或多個亞甲基氫原子經取代基置換的聚亞甲基。適合取代基包括本文針對經取代之脂族基團所述之取代基。

一般而言，詞首「伸」用於描述二價基團。因此，本文定義之任何術語可經詞首「伸」修飾以描述彼部分之二價型式。舉例而言，二價碳環為「伸碳環基」，二價芳基環為「伸芳基」，二價苯環為「伸苯基」，二價雜環為「伸雜環基」，二價雜芳基環為「伸雜芳基」，二價烷基鏈為「伸烷基」，二價烯基鏈為「伸烯基」，二價炔基鏈為「伸炔 基」，二價雜烷基鏈為「伸雜烷基」，二價雜烯基鏈為「伸雜烯基」，二價雜炔基鏈為「伸雜炔基」等。

術語「烯基」及「炔基」具有其在此項技術中之一般含義且係指長度及對上述烷基之可能取代類似，但分別含有至少一個雙鍵或參鍵之不飽和脂族基團。

在某些實施例中，本發明中所用之烷基、烯基及炔基含有1-20個脂族碳原子。在某些其他實施例中，本發明中所用之烷基、烯基及炔基含有1-10個脂族碳原子。在其他實施例中，本發明中所用之烷基、烯基及炔基含有1-8個脂族碳原子。在其他實施例中，本發明中所用之烷基、烯基及炔基含有1-6個脂族碳原子。在其他實施例中，本發明中所用之烷基、烯基及炔基含有1-4個碳原子。代表性的脂族基團因此包括(但不限於)例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、烯丙基、正丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基、正戊基、第二戊基、異戊基、第三戊基、正己基、第二己基、部分及其類似基團，其又可攜帶一或多個取代基。烯基包括(但不限於)例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基及其類似基團。代表性炔基包括(但不限於)乙炔基、2-丙炔基(炔丙基)、1-丙炔基及其類似基團。

如本文所用，術語「環烷基」特定言之係指具有3至10個，較佳3至7個碳原子之基團。適合的環烷基包括(但不限於)環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基及其類似基團，如在其他脂族、雜脂族或雜環部分之情況下，其 可視情況經包括(但不限於)以下之取代基取代：脂族基；雜脂族基；芳基；雜芳基；芳基烷基；雜芳基烷基；烷氧基；芳氧基；雜烷氧基；雜芳氧基；烷硫基；芳硫基；雜烷硫基；雜芳硫基；-F；-Cl；-Br；-I；-OH；-NO₂ ；-CN；-CF₃ ；-CH₂ CF₃ ；-CHCl₂ ；-CH₂ OH；-CH₂ CH₂ OH；-CH₂ NH₂ ；-CH₂ SO₂ CH₃ ；-C(O)R_x ；-CO₂ (R_x )；-CON(R_x )₂ ；-OC(O)R_x ；-OCO₂ R_x ；-OCON(R_x )₂ ；-N(R_x )₂ ；-S(O)₂ R_x ；-NR_x (CO)R_x ，其中R_x 每次出現時獨立地包括(但不限於)脂族基、雜脂族基、芳基、雜芳基、芳基烷基或雜芳基烷基，其中上文及本文所述之脂族基、雜脂族基、芳基烷基或雜芳基烷基取代基中之任一者均可經取代或未經取代、分支鏈或未分支、環狀或非環狀，且其中上文及本文所述之芳基或雜芳基取代基中之任一者均可經取代或未經取代。一般可適用之取代基之其他實例由本文所述之實例中所示之特定實施例說明。

如本文所用，術語「雜脂族基」係指如本文所定義之脂族部分，其包括飽和及不飽和非芳族直鏈(亦即未分支)、分支鏈、非環狀、環狀(亦即雜環)或多環烴類，其視情況經一或多個官能基取代，且含有一或多個例如用於置換碳原子的氧、硫、氮、磷或矽原子。在某些實施例中，雜脂族部分其上之一或多個氫原子可獨立地經一或多個取代基置換取代。如一般技術者將瞭解，本文之「雜脂族基」欲包括(但不限於)雜烷基、雜烯基、雜炔基、雜環烷基、雜環烯基及雜環炔基部分。因此，術語「雜脂族基」包括術 語「雜烷基」、「雜烯基」、「雜炔基」及其類似基團。此外，如本文所用，術語「雜烷基」、「雜烯基」、「雜炔基」及其類似術語涵蓋經取代及未經取代之基團。在某些實施例中，如本文所用，「雜脂族基」用於指示具有1-20個碳原子之彼等雜脂族基團(環狀、非環狀、經取代、未經取代、分支鏈或未分支)。雜脂族基團取代基包括(但不限於)本文所述之致使形成穩定部分之任何取代基(例如脂族基、烷基、烯基、炔基、雜脂族基、雜環基、芳基、雜芳基、醯基、亞磺醯基、磺醯基、側氧基、亞胺基、硫代側氧基、氰基、異氰基、胺基、疊氮基、硝基、羥基、硫醇、鹵基、脂族胺基、雜脂族胺基、烷基胺基、雜烷基胺基、芳基胺基、雜芳基胺基、烷基芳基、芳基烷基、脂族氧基、雜脂族氧基、烷氧基、雜烷氧基、芳氧基、雜芳氧基、脂族硫氧基、雜脂族硫氧基、烷基硫氧基、雜烷基硫氧基、芳基硫氧基、雜芳基硫氧基、醯氧基及其類似基團，其各自可經進一步取代或可未經進一步取代)。

術語「雜烷基」具有其在此項技術中之一般含義且係指如本文所述之烷基中的一或多個碳原子經雜原子置換。適合雜原子包括氧、硫、氮、磷及其類似原子。雜烷基之實例包括(但不限於)烷氧基、胺基、硫酯、聚(乙二醇)及經烷基取代之胺基。

術語「雜烯基」及「雜炔基」具有其在此項技術中之一般含義且係指長度及對上述雜烷基之可能取代類似，但分別含有至少一個雙鍵或參鍵之不飽和脂族基團。

本發明化合物之上述脂族(及其他)部分的取代基之一些實例包括(但不限於)脂族基；雜脂族基；芳基；雜芳基；烷基芳基；烷基雜芳基；烷氧基；芳氧基；雜烷氧基；雜芳氧基；烷硫基；芳硫基；雜烷硫基；雜芳硫基；F；Cl；Br；I；-OH；-NO₂ ；-CN；-CF₃ ；-CHF₂ ；-CH₂ F；-CH₂ CF₃ ；-CHCl₂ ；-CH₂ OH；-CH₂ CH₂ OH；-CH₂ NH₂ ；-CH₂ SO₂ CH₃ ；-C(O)R_x ；-CO₂ (R_x )；-CON(R_x )₂ ；-OC(O)R_x ；-OCO₂ R_x ；-OCON(R_x )₂ ；-N(R_x )₂ ；-S(O)₂ R_x ；-NR_x (CO)R_x ，其中R_x 每次出現時獨立地包括(但不限於)脂族基、脂環基、雜脂族基、雜環基、芳基、雜芳基、烷基芳基或烷基雜芳基，其中上文及本文所述之脂族基、雜脂族基、烷基芳基或烷基雜芳基取代基中之任一者均可經取代或未經取代、分支鏈或未分支、環狀或非環狀，且其中上文及本文所述之芳基或雜芳基取代基中之任一者均可經取代或未經取代。一般可適用之取代基之其他實例由本文所述之實例中所示之特定實施例說明。

術語「芳基」具有其在此項技術中之一般含義且係指視情況經取代之具有單環(例如苯基)、多環(例如聯苯)或多個稠環且其中至少一者為芳族(例如1,2,3,4-四氫萘基、萘基、蒽基或菲基)之芳族碳環基團。亦即，至少一個環可具有共軛π電子系統，而其他鄰接環可為環烷基、環烯基、環炔基、芳基及/或雜環基。如本文所述，芳基可視情況經取代。取代基包括(但不限於)任何先前提及之取代基，亦即對於脂族部分或對於如本文所揭示之其他部分所 述，可形成穩定化合物之取代基。在一些情況下，芳基為較佳具有3-14個碳原子(各自可經取代或未經取代)之穩定單環或多環不飽和部分。「碳環芳基」係指芳族環上之環原子為碳原子之芳基。碳環芳基包括單環碳環芳基及多環或稠合化合物(例如兩個或兩個以上相鄰環原子為兩個鄰接環共用)，諸如萘基。

術語「雜芳基」具有其在此項技術中之一般含義且係指包含至少一個雜原子作為環原子之芳基。「雜芳基」為較佳具有3-14個碳原子(各自可經取代或未經取代)之穩定雜環或多雜環不飽和部分。取代基包括(但不限於)任何先前提及之取代基，亦即對於脂族部分或對於如本文所揭示之其他部分所述，可形成穩定化合物之取代基。在一些情況下，雜芳基為具有5至10個環原子之環狀芳族基團，其中一個環原子係選自S、O及N；0、1或2個環原子為獨立地選自S、O及N之其他雜原子；且其餘環原子為碳，該基團經由任何環原子連接至分子之其餘部分，諸如吡啶基、吡基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、異噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、噻吩基、呋喃基、喹啉基、異喹啉基及其類似基團。

亦應瞭解，如本文中所定義之芳基及雜芳基部分可經由烷基或雜烷基部分連接，因此亦包括-(烷基)芳基、-(雜烷基)芳基、-(雜烷基)雜芳基及-(雜烷基)雜芳基部分。因此，如本文所用，片語「芳基或雜芳基部分」與「芳基、雜芳基、-(烷基)芳基、-(雜烷基)芳基、-(雜烷基)雜芳基 及-(雜烷基)雜芳基」可互換。取代基包括(但不限於)任何先前提及之取代基，亦即對於脂族部分或對於如本文所揭示之其他部分所述，可形成穩定化合物之取代基。

應瞭解，芳基及雜芳基(包括雙環芳基)可未經取代或經取代，其中取代包括其上之一或多個氫原子獨立地經任何一或多個以下部分置換，包括(但不限於)：脂族基；脂環基；雜脂族基；雜環基；芳族基；雜芳族基；芳基；雜芳基；烷基芳基；雜烷基芳基；烷基雜芳基；雜烷基雜芳基；烷氧基；芳氧基；雜烷氧基；雜芳氧基；烷硫基；芳硫基；雜烷硫基；雜芳硫基；F；Cl；Br；I；-OH；-NO₂ ；-CN；-CF₃ ；-CH₂ F；-CHF₂ ；-CH₂ CF₃ ；-CHCl₂ ；-CH₂ OH；-CH₂ CH₂ OH；-CH₂ NH₂ ；-CH₂ SO₂ CH₃ ；-C(O)R_x ；-CO₂ (R_x )；-CON(R_x )₂ ；-OC(O)R_x ；-OCO₂ R_x ；-OCON(R_x )₂ ；-N(R_x )₂ ；-S(O)R_x ；-S(O)₂ R_x ；-NR_x (CO)R_x ，其中R_x 每次出現時獨立地包括(但不限於)脂族基、脂環基、雜脂族基、雜環基、芳族基、雜芳族基、芳基、雜芳基、烷基芳基、烷基雜芳基、雜烷基芳基或雜烷基雜芳基，其中上文及本文所述之脂族基、脂環基、雜脂族基、雜環基、烷基芳基或烷基雜芳基取代基中之任一者均可經取代或未經取代、分支鏈或未分支、飽和或不飽和，且其中上文及本文所述之芳族基、雜芳族基、芳基、雜芳基、-(烷基)芳基或-(烷基)雜芳基取代基中之任一者均可經取代或未經取代。另外，應瞭解，任何兩個相鄰基團連在一起可表示4、5、6或7員經取代或未經取代之脂環或雜環部分。一般可適用之取代基之 其他實例由本文所述之特定實施例說明。

術語「雜環」具有其在此項技術中之一般含義且係指含有至少一個雜原子作為環原子，在一些情況下含有1至3個雜原子作為環原子，其餘環原子為碳原子之環狀基團。適合雜原子包括氧、硫、氮、磷及其類似原子。在一些情況下，雜環可為環結構包括1至4個雜原子之3至10員環結構或3至7員環。

術語「雜環」可包括雜芳基、飽和雜環基(例如環雜烷基)或其組合。雜環可為飽和分子或可包含一或多個雙鍵。在一些情況下，雜環為氮雜環，其中至少一個環包含至少一個氮環原子。雜環可與其他環稠合形成多環雜環。雜環亦可與螺環基團稠合。在一些情況下，雜環可經由環中之氮或碳原子連接至化合物。

雜環包括例如噻吩、苯并噻吩、噻嗯、呋喃、四氫呋喃、哌喃、異苯并呋喃、烯、二苯并哌喃、啡噁噻、吡咯、二氫吡咯、吡咯啶、咪唑、吡唑、吡、異噻唑、異噁唑、吡啶、吡、嘧啶、噠、吲、異吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹、異喹啉、喹啉、酞、啶、喹喏啉、喹唑啉、啉、喋啶、咔唑、咔啉、三唑、四唑、噁唑、異噁唑、噻唑、異噻唑、啡啶、吖啶、嘧啶、啡啉、吩、啡砷、啡噻、呋呫、啡噁、吡咯啶、氧雜環戊烷、硫雜環戊烷、噁唑、噁、哌啶、高哌啶(六亞甲基亞胺)、哌(例如N-甲基哌)、嗎啉、內酯、內醯胺(諸如氮雜環丁酮及吡咯啶酮)、磺內醯胺、磺內酯、其其 他飽和及/或不飽和衍生物及其類似物。雜環可視情況在一或多個位置經如本文所述之取代基取代。在一些情況下，雜環可經雜原子環原子(例如氮)鍵結於化合物。在一些情況下，雜環可經由碳環原子鍵結於化合物。在一些情況下，雜環為吡啶、咪唑、吡、嘧啶、噠、吖啶、吖啶-9-胺、聯吡啶、啶、喹啉、苯并喹啉、苯并異喹啉、啡啶-1,9-二胺或其類似物。

如本文所用，術語「鹵基」及「鹵素」係指選自氟、氯、溴及碘之原子。

術語「鹵烷基」表示連接有1、2或3個鹵素原子的如上定義之烷基且實例為諸如氯甲基、溴乙基、三氟甲基及其類似基團之基團。

如本文所用，術語「胺基」係指一級胺(-NH₂ )、二級胺(-NHR_x )、三級胺(-NR_x R_y )或四級胺(-N⁺ R_x R_y R_z )，其中R_x 、R_y 及R_z 獨立地為如本文所定義之脂族、脂環、雜脂族、雜環、芳基或雜芳基部分。胺基之實例包括(但不限於)甲胺基、二甲胺基、乙胺基、二乙胺基、甲基乙胺基、異丙胺基、N-哌啶基、三甲胺基及丙胺基。

術語「炔烴」具有其在此項技術中之一般含義且係指含有至少一個參鍵之分支鏈或未分支不飽和烴基。炔烴之非限制性實例包括乙炔、丙炔、1-丁炔、2-丁炔及其類似物。炔烴基團可經取代及/或具有一或多個氫原子經諸如羥基、鹵素、烷氧基及/或芳基之官能基置換。

如本文所用，術語「烷氧基」(或「烷基氧基」)或「硫 烷基」係指經由氧原子或經由硫原子連接至如先前定義之烷基的母分子部分。在某些實施例中，烷基含有1-20個脂族碳原子。在某些其他實施例中，烷基含有1-10個脂族碳原子。在其他實施例中，本發明中所用之烷基、烯基及炔基含有1-8個脂族碳原子。在其他實施例中，烷基含有1-6個脂族碳原子。在其他實施例中，烷基含有1-4個脂族碳原子。烷氧基之實例包括(但不限於)甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、第三丁氧基、新戊氧基及正己氧基。硫烷基之實例包括(但不限於)甲硫基、乙硫基、丙硫基、異丙硫基、正丁硫基及其類似基團。

術語「芳氧基」係指基團-O-芳基。術語「醯氧基」係指基團-O-醯基。

術語「烷氧基烷基」係指經至少一個烷氧基(例如1、2、3個或3個以上烷氧基)取代之烷基。舉例而言，烷氧基烷基可為視情況經取代之-(C_1-6 烷基)-O-(C_1-6 烷基)。在一些情況下，烷氧基烷基可視情況經另一視情況經取代之烷氧基烷基(例如-(C_1-6 烷基)-O-(C_1-6 烷基)-O-(C_1-6 烷基))取代。

應瞭解，如本文所述之上述基團及/或化合物可視情況經任何數目之取代基或官能部分取代。亦即，任何上述基團均可視情況經取代。如本文所用，術語「經取代」意欲包括有機化合物之所有許可取代基，「許可」係在一般技術者已知之化合價的化學規則之情況下。一般而言，術語「經取代」無論之前是否有術語「視情況」，及本發明各 式中所含之取代基，均指既定結構中之氫基經特定取代基置換。當任何既定結構中一個以上位置可經一個以上選自特定群組之取代基取代時，在每一位置之取代基可相同或不同。應理解，「經取代」亦包括產生穩定化合物，例如不自發地發生諸如重排、環化、移除等轉化的取代。在一些情況下，「經取代」一般可指氫經如本文所述之取代基置換。然而，如本文所用，「經取代」不涵蓋藉以鑑別分子之關鍵官能基的置換及/或改變，例如使得「經取代」之官能基經由取代變成不同官能基。舉例而言，「經取代之苯基」必需仍包含苯基部分且不能經取代而改質，在此定義中，改質成例如吡啶環。在一廣泛態樣中，許可的取代基包括有機化合物之非環狀及環狀、分支鏈及未分支、碳環及雜環、芳族及非芳族取代基。代表性取代基包括例如本文所述者。對於適當有機化合物而言，許可的取代基可為一或多個且相同或不同。對本發明而言，諸如氮之雜原子可具有氫取代基及/或滿足雜原子化合價的本文所述之有機化合物的任何許可取代基。此外，本發明決不意欲受限於有機化合物之許可取代基。本發明預想之取代基及變數之組合較佳為可形成適用於形成顯影劑或顯影劑前驅物之穩定化合物的組合。如本文所用，術語「穩定」較佳係指化合物具有足夠穩定性以允許製造且維持化合物完整性持續足夠時段以供偵測且較佳持續足夠時段以適用於本文詳述之目的。

取代基之實例包括(但不限於)鹵素、疊氮基、烷基、芳 烷基、烯基、炔基、環烷基、羥基、烷氧基、胺基、硝基、巰基、亞胺基、醯胺基、膦酸酯基、亞膦酸酯基、羰基、羧基、矽烷基、醚基、烷硫基、磺醯基、磺醯胺基、酮基、醛基、酯基、雜環基、芳族或雜芳族部分、-CF₃ 、-CN、芳基、芳氧基、全鹵烷氧基、芳烷氧基、雜芳基、雜芳氧基、雜芳基烷基、雜芳烷氧基、疊氮基、胺基、鹵、烷硫基、側氧基、醯基烷基、羧基酯基、-羧醯胺基、醯氧基、胺基烷基、烷基胺基芳基、烷基芳基、烷基胺基烷基、烷氧基芳基、芳基胺基、芳烷基胺基、烷基磺醯基、-羧醯胺基烷基芳基、-羧醯胺基芳基、羥基烷基、鹵烷基、烷基胺基烷基羧基-、胺基羧醯胺基烷基-、氰基、烷氧基烷基、全鹵烷基、芳基烷氧基烷基及其類似基團。

本文所述之任何化合物均可呈多種形式，諸如(但不限於)鹽、溶劑合物、水合物、互變異構體及異構體。

如本文所用，術語「醫藥學上可接受之鹽」係指在正確醫學判斷之範疇內，適於與人類及低等動物之組織接觸使用而無不當毒性、刺激、過敏反應及其類似反應，且與合理收益/風險比相稱之彼等鹽。醫藥學上可接受之鹽在此項技術中係熟知者。舉例而言，Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences ,1977,66 ,1-19(以引用的方式併入本文中)中詳細描述醫藥學上可接受之鹽。本發明化合物之醫藥學上可接受之鹽包括衍生自適合無機及有機酸及鹼之鹽。醫藥學上可接受之無毒酸加成鹽之實例為胺基與 無機酸(諸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸及高氯酸)或有機酸(諸如乙酸、乙二酸、順丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、丁二酸或丙二酸)形成之鹽，或藉由使用此項技術中所用的諸如離子交換之其他方法形成之鹽。其他醫藥學上可接受之鹽包括己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、甲酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡糖庚酸鹽、甘油磷酸鹽、葡糖酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙烷磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、乙二酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽及其類似鹽。源自適當鹼之鹽包括鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽、銨鹽及N⁺ (C_1-4 烷基)₄ 鹽。代表性鹼金屬或鹼土金屬鹽包括鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽及其類似鹽。其他醫藥學上可接受之鹽適當時包括無毒銨、四級銨及使用相對離子形成之胺陽離子，該等相對離子諸如鹵離子、氫氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低碳烷基磺酸根及芳基磺酸根。

在某些實施例中，化合物呈水合物或溶劑合物形式。如 本文所用，術語「水合物」係指與一或多個水分子非共價締合之化合物。同樣地，術語「溶劑合物」係指與一或多個有機溶劑分子非共價締合之化合物。

在某些實施例中，本文所述之化合物可以各種互變異構形式存在。如本文所用，術語「互變異構體」包括兩種或兩種以上因至少一次氫原子形式遷移及至少一次化合價變化(例如單鍵至雙鍵、參鍵至單鍵，或反之亦然)而可相互轉化之化合物。互變異構體之確切比率視若干因素而定，包括溫度、溶劑及pH值。互變異構化(亦即提供互變異構對之反應)可由酸或鹼催化。例示性互變異構化包括酮至烯醇；醯胺至醯亞胺；內醯胺至內醯亞胺；烯胺至亞胺；及烯胺至(不同)烯胺互變異構化。

在某些實施例中，本文所述之化合物可以各種異構形式存在。如本文所用，術語「異構體」包括任何及所有幾何異構體及立體異構體(例如對映異構體、非對映異構體等)。舉例而言，「異構體」包括在本發明範疇內之順式異構體及反式異構體、E -異構體及Z -異構體、R -對映異構體及S -對映異構體、非對映異構體、(D)-異構體、(L)-異構體、其外消旋混合物，及其其他混合物。舉例而言，異構體/對映異構體在一些實施例中可以實質上無相應對映異構體之形式提供，且亦可稱作「光學增濃(optically-enriched)」。如本文所用，「光學增濃」意謂化合物由顯著較大比例之一種對映異構體構成。在某些實施例中，本發明化合物係由至少約90重量%之較佳對映異構體組成。在 其他實施例中，化合物係由至少約95重量%、98重量%或99重量%之較佳對映異構體組成。較佳對映異構體可藉由熟習此項技術者已知之任何方法，包括對掌性高壓液相層析(HPLC)，及形成及結晶對掌性鹽而自外消旋混合物分離，或藉由不對稱合成來製備。參看例如Jacques等人，Enantiomers,Racemates and Resolutions (Wiley Interscience,New York,1981)；Wilen,S.H.等人，Tetrahedron 33：2725(1977)；Eliel,E.L.Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill,NY,1962)；Wilen,S.H.Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions 第268頁(E.L.Eliel編，Univ.of Notre Dame Press,Notre Dame,IN 1972)。

本發明提供在用於治療性投藥之多種調配物中之內源胚胎/胎兒血球蛋白鏈誘導劑。在一個態樣中，藥劑藉由與適當醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑組合而調配成醫藥組合物，且調配成固態、半固態、液態或氣態形式之製劑，諸如錠劑、膠囊、散劑、顆粒、軟膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球體及氣溶膠形式。因而，投藥以多種方式實現。在一些調配物中，誘導劑在投與後為全身性的；在其他調配物中，抑制劑藉助於調配物定位，諸如使用用於將活性劑量保留在植入部位之植入物。

在進一步描述本發明之前，應理解本發明不限於所述之特定實施例，因而當然會改變。亦應理解本文中所用之術語僅出於描述特定實施例之目的，且不欲具有限制性，因 為本發明之範疇將僅受隨附申請專利範圍限制。

當提供值範圍時，應理解除非上下文明確指出，否則在彼範圍之上限與下限之間的各個中間值(至下限之單位的十分之一)及在彼規定範圍內之任何其他指定值或中間值均涵蓋於本發明內。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包括於較小範圍內，且亦涵蓋於本發明中，受規定範圍內任何特別排除之界限所限。當規定範圍包括一或兩個界限時，排除彼等所包括界限之任一者或兩者的範圍亦包括於本發明中。

除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解之含義相同的含義。儘管與本文中所描述之方法及材料類似或等同的任何方法及材料均可用於實踐或測試本發明，但現描述較佳方法及材料。下文提及之所有公開案均以引用的方式併入本文中。除非另外提及，否則本文採用之技術為一般技術者熟知之標準方法。

必須注意的是，如本文及隨附申請專利範圍中所用，除非上下文另外明確指出，否則單數形式「一」及「該」包括複數個指示物。因此，舉例而言，提及「生物標記」包括複數個該等生物標記且提及「樣品」包括提及一或多個樣品及熟習此項技術者已知的其等效物等。另外應注意，申請專利範圍可經草擬成排除任何視情況存在之要素。因而，此陳述意欲充當與申請專利範圍請求項要素之敍述結合使用諸如「獨自地」、「僅」及其類似術語之排他性術語 或使用「否定」限制的前提基礎。此外，本發明之任何肯定敍述之要素為自申請專利範圍排除彼要素之否定限制提供基礎。

本說明書中所引用之所有公開案及專利均以引用的方式併入本文中，如同每一個別公開案或專利特定且個別地指出以引用的方式併入一般，且以引用的方式併入本文中以揭示並描述引用該等公開案所相關的方法及/或材料。對任何公開案之引用係出於其在本申請之申請日期之前揭示且不應解釋為承認本發明無權因為先前發明而先於此類公開案。此外，所提供之公開案之日期可能不同於可能需要獨立確認之實際公開日期。

本發明之其他目標、特徵及優勢將自以下[實施方式]變得顯而易見。然而，應理解儘管[實施方式]及特定實例指示本發明之較佳實施例，但其僅以說明方式提供，因而熟習此項技術者自此[實施方式]將顯而易見本發明精神及範疇內之各種改變及修正。

本發明之部分係鑑別出可誘導γ血球蛋白基因表現之小分子。本文鑑別之化合物適用於經由誘導內源胚胎/胎兒血球蛋白鏈治療β-地中海型貧血或鐮刀型貧血症。

所關注化合物為伸萘甲醯基苯并咪唑，例如包括經一或多個取代基取代之伸萘甲醯基苯并咪唑骨架的化合物。式(I)之伸萘甲醯基苯并咪唑骨架之位置1、2、3、4、5、6、7、8、9及/或10之任何處可經取代：

在某些實施例中，伸萘甲醯基苯并咪唑骨架之位置3及位置4經取代。

在某些實施例中，取代基可造成化合物之光學異構現象及/或立體異構現象。亦關注化合物之鹽、溶劑合物、水合物及前藥形式。本發明涵蓋所有該等形式。因此，本文所述之化合物包括其鹽、溶劑合物、水合物、前藥及異構體形式，包括其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、水合物、前藥及異構體。在某些實施例中，化合物可代謝成醫藥活性衍生物。

在某些實施例中，本發明採用式(I-a)化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物，其中：R¹ 、R² 、R³ 、R⁴ 、R^6a 及R^6b 各自獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、雜環基、芳基、-OR^A 、-OC(O)R^A 、-SR^A 、-N(R^B )₂ 、-N(R^A )C(O)R^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、 -CN、-NO₂ 、-C(O)R^A 、-C(O)OR^A 、-S(O)R^A 、-SO₂ R^A 、-SO₂ N(R^B )₂ 及-NHSO₂ R^B ；各R⁵ 獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、雜環基、芳基、-OR^A 、-OC(O)R^A 、-SR^A 、-N(R^B )₂ 、-N(R^A )C(O)R^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-CN、-NO₂ 、-C(O)R^A 、-C(O)OR^A 、-S(O)R^A 、-SO₂ R^A 、-SO₂ N(R^B )₂ 及-NHSO₂ R^B ；各R^A 獨立地選自由以下組成之群：氫、烷基、烯基、炔基、雜環基及芳基；各R^B 獨立地選自由以下組成之群：氫、烷基、烯基、炔基、雜環基及芳基，或兩個R^B 與介於其間之氮一起形成雜環；n為0、1、2、3或4。

在一些實施例中，R^6a 及R^6b 各自為氫。在某些實施例中，本發明採用式(II)化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物，其中R¹ 、R² 、R³ 、R⁴ 及R⁵ 如本文所述。

如上文一般所述，R¹ 為氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、雜環基、芳基、-OR^A 、-OC(O)R^A 、-SR^A 、-N(R^B )₂ 、 -N(R^A )C(O)R^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-CN、-NO₂ 、-C(O)R^A 、-C(O)OR^A 、-S(O)R^A 、-SO₂ R^A 、-SO₂ N(R^B )₂ 或-NHSO₂ R^B 。在某些實施例中，R¹ 係選自-H、-OH、-Cl、-Br、-F、C_1-6 烷基、C_1-6 烷氧基、炔基、芳基、-NO₂ 、-N(R^B )₂ 、-C(O)CH₃ 、-CO₂ H、-C(O)OR^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-CN、雜環基、-SO₂ -烷基及-SO₂ -芳基。在某些實施例中，R¹ 係選自-H、-OH、-Cl、-Br、-F、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、-C≡C-芳基、苯基、萘基、-NO₂ 、-NH-C_1-6 烷基、-C(O)CH₃ 、-CO₂ H、-CO₂ Et、-CONH-芳基、-CN、N-嗎啉基、-SO₂ -烷基及-SO₂ -芳基。在某些實施例中，R¹ 為氫。在一些實施例中，R¹ 為C_1-6 烷基。在某些實施例中，R¹ 為-C(O)OR^A 。在某些實施例中，R¹ 為-CO₂ H。在某些實施例中，R¹ 為-C(O)N(R^B )₂ 或-N(R^A )C(O)R^A 。在一些實施例中，R¹ 為鹵素。在某些實施例中，R¹ 為氟。在某些實施例中，R¹ 為氯。在一些實施例中，R¹ 為-N(R^B )₂ 。在一些實施例中，R¹ 為-NH-C_1-6 烷基。在某些實施例中，R¹ 為-NHCH₃ 。在某些實施例中，R¹ 為-NO₂ 。在一些實施例中，R¹ 為視情況經取代之萘基。

如上文一般所述，R² 為氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、雜環基、芳基、-OR^A 、-OC(O)R^A 、-SR^A 、-N(R^B )₂ 、-N(R^A )C(O)R^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-CN、-NO₂ 、-C(O)R^A 、-C(O)OR^A 、-S(O)R^A 、-SO₂ R^A 、-SO₂ N(R^B )₂ 或-NHSO₂ R^B 。在某些實施例中，R² 係選自-H、-OH、-Cl、-Br、-F、C_1-6 烷基、C_1-6 烷氧基、炔基、芳基、-NO₂ 、-N(R^B )₂ 、-C(O)CH₃ 、 -CO₂ H、-C(O)OR^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-CN、雜環基、-SO₂ -烷基及-SO₂ -芳基。在某些實施例中，R² 係選自-H、-OH、-Cl、-Br、-F、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、-C≡C-芳基、苯基、萘基、-NO₂ 、-NH-C_1-6 烷基、-C(O)CH₃ 、-CO₂ H、-CO₂ Et、-CONH-芳基、-CN、N-嗎啉基、-SO₂ -烷基及-SO₂ -芳基。在某些實施例中，R² 為氫。在一些實施例中，R² 為C_1-6 烷基。在某些實施例中，R² 為-C(O)OR^A 。在某些實施例中，R² 為-CO₂ H。在某些實施例中，R² 為-C(O)N(R^B )₂ 或-N(R^A )C(O)R^A 。在一些實施例中，R² 為鹵素。在某些實施例中，R² 為氟。在某些實施例中，R² 為氯。在一些實施例中，R² 為-N(R^B )₂ 。在一些實施例中，R² 為-NH-C_1-6 烷基。在某些實施例中，R² 為-NHCH₃ 。在某些實施例中，R² 為-NO₂ 。在一些實施例中，R² 為視情況經取代之萘基。

如上文一般所述，R³ 為氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、雜環基、芳基、-OR^A 、-OC(O)R^A 、-SR^A 、-N(R^B )₂ 、-N(R^A )C(O)R^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-CN、-NO₂ 、-C(O)R^A 、-C(O)OR^A 、-S(O)R^A 、-SO₂ R^A 、-SO₂ N(R^B )₂ 或-NHSO₂ R^B 。在某些實施例中，R³ 係選自-H、-OH、-Cl、-Br、-F、C_1-6 烷基、C_1-6 烷氧基、炔基、芳基、-NO₂ 、-N(R^B )₂ 、-C(O)CH₃ 、-CO₂ H、-C(O)OR^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-CN、雜環基、-SO₂ -烷基及-SO₂ -芳基。在某些實施例中，R³ 係選自-H、-OH、-Cl、-Br、-F、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、-C≡C-芳基、苯基、萘基、-NO₂ 、-NH-C_1-6 烷基、-C(O)CH₃ 、-CO₂ H、 -CO₂ Et、-CONH-芳基、-CN、N-嗎啉基、-SO₂ -烷基及-SO₂ -芳基。在某些實施例中，R³ 為氫。在一些實施例中，R³ 為C_1-6 烷基。在某些實施例中，R³ 為-C(O)OR^A 。在某些實施例中，R³ 為-CO₂ H。在某些實施例中，R³ 為-C(O)N(R^B )₂ 或-N(R^A )C(O)R^A 。在一些實施例中，R³ 為鹵素。在某些實施例中，R³ 為氟。在某些實施例中，R³ 為氯。在一些實施例中，R³ 為-N(R^B )₂ 。在一些實施例中，R³ 為-NH-C_1-6 烷基。在某些實施例中，R³ 為-NHCH₃ 。在某些實施例中，R³ 為-NO₂ 。在一些實施例中，R³ 為視情況經取代之萘基。

如上文一般所述，R⁴ 為氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、雜環基、芳基、-OR^A 、-OC(O)R^A 、-SR^A 、-N(R^B )₂ 、-N(R^A )C(O)R^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-CN、-NO₂ 、-C(O)R^A 、-C(O)OR^A 、-S(O)R^A 、-SO₂ R^A 、-SO₂ N(R^B )₂ 或-NHSO₂ R^B 。在某些實施例中，R⁴ 係選自-H、-OH、-Cl、-Br、-F、C_1-6 烷基、C_1-6 烷氧基、炔基、芳基、-NO₂ 、-N(R^B )₂ 、-C(O)CH₃ 、-CO₂ H、-C(O)OR^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-CN、雜環基、-SO₂ -烷基及-SO₂ -芳基。在某些實施例中，R⁴ 係選自-H、-OH、-Cl、-Br、-F、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、-C≡C-芳基、苯基、萘基、-NO₂ 、-NH-C_1-6 烷基、-C(O)CH₃ 、-CO₂ H、-CO₂ Et、-CONH-芳基、-CN、N-嗎啉基、-SO₂ -烷基及-SO₂ -芳基。在某些實施例中，R⁴ 為氫。在一些實施例中，R⁴ 為C_1-6 烷基。在某些實施例中，R⁴ 為-C(O)OR^A 。在某些實施例中，R⁴ 為-CO₂ H。在某些實施例中，R⁴ 為 -C(O)N(R^B )₂ 或-N(R^A )C(O)R^A 。在一些實施例中，R⁴ 為鹵素。在某些實施例中，R⁴ 為氟。在某些實施例中，R⁴ 為氯。在一些實施例中，R⁴ 為-N(R^B )₂ 。在一些實施例中，R⁴ 為-NH-C_1-6 烷基。在某些實施例中，R⁴ 為-NHCH₃ 。在某些實施例中，R⁴ 為-NO₂ 。在一些實施例中，R⁴ 為視情況經取代之萘基。

如上文一般所述，R⁵ 為氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、雜環基、芳基、-OR^A 、-OC(O)R^A 、-SR^A 、-N(R^B )₂ 、-N(R^A )C(O)R^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-CN、-NO₂ 、-C(O)R^A -C(O)OR^A 、-S(O)R^A 、-SO₂ R^A 、-SO₂ N(R^B )₂ 或-NHSO₂ R^B 。在某些實施例中，R⁵ 係選自-H、-OH、-Cl、-Br、-F、C_1-6 烷基、C_1-6 烷氧基、炔基、芳基、-NO₂ 、-N(R^B )₂ 、-C(O)CH₃ 、-CO₂ H、-C(O)OR^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-CN、雜環基、-SO₂ -烷基及-SO₂ -芳基。在某些實施例中，R⁵ 係選自-H、-OH、-Cl、-Br、-F、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、-C≡C-芳基、苯基、萘基、-NO₂ 、-NH-C_1-6 烷基、-C(O)CH₃ 、-CO₂ H、-CO₂ Et、-CONH-芳基、-CN、N-嗎啉基、-SO₂ -烷基及-SO₂ -芳基。在某些實施例中，R⁵ 為氫。在一些實施例中，R⁵ 為C_1-6 烷基。在某些實施例中，R⁵ 為-C(O)OR^A 。在某些實施例中，R⁵ 為-CO₂ H。在某些實施例中，R⁵ 為-C(O)N(R^B )₂ 或-N(R^A )C(O)R^A 。在一些實施例中，R⁵ 為鹵素。在某些實施例中，R⁵ 為氟。在某些實施例中，R⁵ 為氯。在一些實施例中，R⁵ 為-N(R^B )₂ 。在一些實施例中，R⁵ 為-NH-C_1-6 烷基。在某些實施例中，R⁵ 為-NHCH₃ 。在某些 實施例中，R⁵ 為-NO₂ 。在一些實施例中，R⁵ 為視情況經取代之萘基。

在一些實施例中，R¹ 、R² 、R³ 及R⁴ 中至少兩者為氫。在某些實施例中，R¹ 及R⁴ 為氫。在某些實施例中，R³ 及R⁴ 為氫。在某些實施例中，R¹ 及R² 為氫。在一些實施例中，R¹ 、R² 、R³ 及R⁴ 中至少兩者各自為氫且R⁵ 為氫。

在一些實施例中，化合物具有式(III)、(IV)或(V)： 或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物，其中R¹ 、R² 、R³ 、R⁴ 及R⁵ 如本文所定義。

在一些實施例中，R⁵ 為氫，獲得式(III-a)、(IV-a)或(V-a)： 或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物，其中R¹ 、R² 、R³ 及R⁴ 如本文所定義。

在某些實施例中，R² 或R³ 中之一者為氫，獲得式(III-b)或(III-c)：

在一些實施例中，R¹ 、R² 、R³ 及R⁴ 中之一者具有以下結構： 其中R¹² 及R¹³ 係獨立地選自氫、-CO₂ H、-C(O)OR^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-OH、-NO₂ 、-CN、鹵素、烷基、芳基及雜環基，或R¹² 及R¹³ 與介於其間之原子一起形成碳環或雜環；且R¹⁴ 係選自氫、-CO₂ H、-C(O)OR^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-OH、-NO₂ 、-CN、鹵素、烷基、芳基及雜環基。在某些實施例中，R¹² 及R¹³ 與介於其間之原子一起形成碳環或雜環。在某些實施例中，R¹² 及R¹³ 與介於其間之原子一起形成雜環(例如丁二醯亞胺)。

在某些實施例中，R¹² 為-CO₂ H。在某些實施例中，R¹³ 為-CO₂ H。在某些實施例中，R¹⁴ 為-CO₂ H。

在某些實施例中，R¹² 及R¹³ 各自為-CO₂ H。

在某些實施例中，R¹² 、R¹³ 及R¹⁴ 各自為-CO₂ H。

在某些實施例中，R¹ 、R² 、R³ 及R⁴ 中之一者具有以下結構： 其中R¹⁴ 為氫、-CO₂ H、-C(O)OR^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-OH、 -NO₂ 、-CN、鹵素、烷基、芳基及雜環基；且R¹⁵ 係選自氫、醯基、烷基、芳基及雜環基。在某些實施例中，R¹⁴ 為-CO₂ H。在某些實施例中，R¹⁴ 為氫。在某些實施例中，R¹⁵ 為氫。在某些實施例中，R¹⁵ 為烷基。在某些實施例中，R¹⁵ 為醯基。

在某些實施例中，化合物具有式(VI)或(VII)結構： 或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物，其中R¹² 、R¹³ 及R¹⁴ 各自獨立地選自氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、雜環基、芳基、-OR^A 、-OC(O)R^A 、-SR^A 、-N(R^B )₂ 、-N(R^A )C(O)R^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-CN、-NO₂ 、-C(O)R^A 、-C(O)OR^A 、-S(O)R^A 、-SO₂ R^A 、-SO₂ N(R^B )₂ 及-NHSO₂ R^B ；或R¹² 及R¹³ 與介於其間之原子一起形成碳環或雜環；各R^A 獨立地選自氫、烷基、烯基、炔基、雜環基及芳基；且各R^B 獨立地選自氫、烷基、烯基、炔基、雜環基及芳基，或兩個R^B 與介於其間之氮一起形成雜環。

在某些實施例中，對於式(VI)或(VII)，R¹ 、R³ 、R⁵ 、R¹² 、R¹³ 及R¹⁴ 各自獨立地選自-H、-OH、-Cl、-Br、-F、 C_1-6 烷基、C_1-6 烷氧基、炔基、芳基、-NO₂ 、-N(R^B )₂ 、-C(O)CH₃ 、-CO₂ H、-C(O)OR^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-CN、雜環基、-SO₂ -烷基及-SO₂ -芳基。在某些實施例中，R¹ 、R³ 、R⁵ 、R¹² 、R¹³ 及R¹⁴ 各自獨立地選自-H、-OH、-Cl、-Br、-F、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、-C≡C-芳基、苯基、萘基、-NO₂ 、-NH-C_1-6 烷基、-C(O)CH₃ 、-CO₂ H、-CO₂ Et、-CONH-芳基、-CN、N-嗎啉基、-SO₂ -烷基及-SO₂ -芳基。

在某些實施例中，R¹ 、R³ 、R⁵ 、R¹² 、R¹³ 及R¹⁴ 各自獨立地選自氫、-CO₂ H、-C(O)OR^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-OH、-NO₂ -CN、鹵素、烷基、芳基及雜環基。在某些實施例中，R¹² 及R¹³ 與介於其間之原子一起形成視情況經取代之雜環。在某些實施例中，R¹² 及R¹³ 與介於其間之原子一起形成丁二醯亞胺基環。

在某些實施例中，R¹² 及R¹³ 各自為-CO₂ H。在某些實施例中，R¹² 、R¹³ 及R¹⁴ 各自為-CO₂ H。在某些實施例中，R³ 、R¹² 、R¹³ 及R¹⁴ 各自為-CO₂ H。在某些實施例中，R¹ 、R¹² 及R¹³ 各自為-CO₂ H。在某些實施例中，R¹ 、R¹² 、R¹³ 及R¹⁴ 各自為-CO₂ H。在某些實施例中，R¹⁵ 為氫。

在某些實施例中，R¹² 及R¹³ 各自為-CO₂ H，且R¹⁵ 為氫。在某些實施例中，R¹² 、R¹³ 及R¹⁴ 各自為-CO₂ H，且R¹⁵ 為氫。在某些實施例中，R³ 、R¹² 、R¹³ 及R¹⁴ 各自為-CO₂ H，且R¹⁵ 為氫。在某些實施例中，R¹ 、R¹² 及R¹³ 各自為-CO₂ H，且R¹⁵ 為氫。在某些實施例中，R¹ 、R¹² 、R¹³ 及R¹⁴ 各自為-CO₂ H，且R¹⁵ 為氫。

在某些實施例中，本發明採用之化合物為式(I-a)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)化合物，其中R² 不為-C(O)R^A 。

在某些實施例中，本發明採用之化合物為式(I-a)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)化合物，其中R² 不為-C(O)CH₃ 。

在某些實施例中，本發明採用之化合物為式(I-a)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)化合物，其中R³ 不為-NH-烯丙基。

在某些實施例中，本發明採用之化合物為式(I-a)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)化合物，其中R² 不為-NHCH₂ CH₂ OH。

在某些實施例中，本發明採用之化合物為式(I-a)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)化合物，其中R¹ 及R⁴ 不為-NO₂ 。

在某些實施例中，本發明採用之化合物為式(I-a)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)化合物，其中當n為2時，各R⁵ 不同時為甲基。

在某些實施例中，本發明化合物為以下中之一者： 或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物。

醫藥組合物

本發明之醫藥組合物及根據本發明使用之醫藥組合物可包括醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」或「醫藥學上可接受之賦形劑」意謂任何類型之無毒惰性固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、囊封材料或調配助劑。Remington's Pharmaceutical Sciences ，第16版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.,Easton,PA,1980)揭示用於調配醫藥組合物之多種賦形劑及用於其製備之已知技術。可用作醫藥學上可接受之載劑之材料的一些實例為糖，諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及乙酸纖維素；粉末狀黃蓍；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，諸如可可脂及栓劑蠟；油，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油；二醇，諸如丙二醇；酯， 諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；瓊脂；清潔劑，諸如Tween 80；緩衝劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；海藻酸；無熱原質水；等張生理食鹽水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇；及磷酸鹽緩衝溶液，以及其他無毒相容潤滑劑，諸如月桂基硫酸鈉及硬脂酸鎂，以及著色劑、脫模劑、塗覆劑、甜味劑、調味劑及芳香劑、防腐劑及抗氧化劑亦可根據調配者之判斷存在於組合物中。本發明醫藥組合物可向人類及/或動物經口、經直腸、非經腸、腦池內、陰道內、鼻內、腹膜內、局部(藉由散劑、乳膏、軟膏或滴劑)、經頰投與，或以口噴霧或鼻噴霧形式投與。

用於經口投與之液體劑型包括醫藥學上可接受之乳液、微乳液、溶液、懸浮液、糖漿及酏劑。除活性成分(亦即微粒、奈米粒子、脂質體、微胞、聚核苷酸/脂質複合物)之外，液體劑型可含有此項技術中通常使用之惰性稀釋劑，諸如水或其他溶劑、增溶劑及乳化劑，諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油(詳言之棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油及芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇及脫水山梨糖醇之脂肪酸酯，及其混合物。除了惰性稀釋劑，口服組合物亦可包括佐劑，諸如濕潤劑、乳化劑及懸浮劑、甜味劑、調味劑及芳香劑。

可根據已知技術使用適合分散劑或濕潤劑及懸浮劑調配可注射製劑，例如無菌可注射水性或油性懸浮液。無菌可注射製劑亦可為於無毒非經腸可接受之稀釋劑或溶劑中之 無菌可注射溶液、懸浮液或乳液，例如於1,3-丁二醇中之溶液。可採用的可接受之媒劑及溶劑有水、林格氏溶液、U.S.P.及等張氯化鈉溶液。此外，無菌不揮發性油習知用作溶劑或懸浮介質。為此，可採用包括合成單甘油酯或二甘油酯之任何溫和不揮發性油。此外，諸如油酸之脂肪酸用於製備可注射製劑。在某些實施例中，粒子懸浮於包含1 w/v%羧甲基纖維素鈉及0.1體積% Tween 80之載劑流體中。

可注射調配物可例如藉由經細菌截留過濾器過濾或藉由併入呈無菌固體組合物形式之滅菌劑進行滅菌，該等組合物可在使用之前溶解或分散於無菌水或其他無菌可注射介質中。

為了延長藥物作用，通常需要減緩來自皮下或肌肉內注射之藥物的吸收。此可藉由使用具有不良水溶性之液體懸浮液或結晶或非晶形材料來達成。藥物之吸收速率則視其溶解速率而定，而溶解速率又可視晶體尺寸及結晶形式而定。或者，非經腸投與之藥物形式的延遲吸收可藉由將藥物溶解或懸浮於油媒劑中來達成。藉由在生物可降解之聚合物(諸如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成藥物之微膠囊基質來製得可注射之儲槽形式。視藥物與聚合物之比率及所用特定聚合物之性質而定，可控制藥物釋放速率。其他生物可降解之聚合物的實例包括聚(原酸酯)及聚(酸酐)。亦藉由將藥物覆埋於與身體組織相容之脂質體或微乳液中來製備儲槽式可注射調配物。

用於經直腸或經陰道投與之組合物較佳為栓劑，其可藉 由將粒子與適合非刺激性賦形劑或載劑(諸如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟)混合來製備，該等適合非刺激性賦形劑或載劑在環境溫度下為固體但在體溫下為液體且因此在直腸或陰道腔中熔融並釋放粒子。

用於經口投與之固體劑型包括膠囊、錠劑、丸劑、散劑及顆粒。在該等固體劑型中，粒子與至少一種諸如檸檬酸鈉或磷酸二鈣之醫藥學上可接受之惰性賦形劑或載劑及/或以下各者混合：a)填充劑或增量劑，諸如澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇及矽酸；b)黏合劑，諸如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯啶酮、蔗糖及阿拉伯膠(acacia)；c)保濕劑，諸如甘油；d)崩解劑，諸如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯澱粉、海藻酸、某些矽酸鹽及碳酸鈉；e)溶解延遲劑，諸如石蠟；f)吸收促進劑，諸如四級銨化合物；g)濕潤劑，諸如十六醇及單硬脂酸甘油酯；h)吸附劑，諸如高嶺土及膨潤土；及i)潤滑劑，諸如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉及其混合物。在膠囊、錠劑及丸劑情況下，劑型亦可包含緩衝劑。

亦可使用相似類型之固體組合物作為軟填充及硬填充明膠膠囊中之填充劑，該等膠囊使用諸如乳糖以及高分子量聚乙二醇及其類似物之賦形劑。

錠劑、糖衣藥丸、膠囊、丸劑及顆粒的固體劑型可製備成具有包衣及外殼(諸如腸溶衣及醫藥調配技術中熟知之其他包衣)。其可視情況含有遮光劑，且亦可為僅在或優先在腸道之某一部分視情況以延遲方式釋放活性成分的組 合物。可使用之包埋組合物的實例包括聚合物質及蠟。

亦可使用相似類型之固體組合物作為軟填充及硬填充明膠膠囊中之填充劑，該等膠囊使用諸如乳糖以及高分子量聚乙二醇及其類似物之賦形劑。

用於局部或經皮投與本發明醫藥組合物之劑型包括軟膏、糊劑、乳膏、洗液、凝膠、散劑、溶液、噴霧、吸入劑或貼片。粒子在無菌條件下與醫藥學上可接受之載劑及可能需要的任何所需防腐劑或緩衝劑混雜。眼用調配物、滴耳劑及滴眼劑亦涵蓋於本發明之範疇內。

在某些實施例中，本發明之醫藥學上可接受之局部調配物包含至少一種本發明化合物及穿透增強劑。局部調配物之選擇將視若干因素而定，包括待治療病狀、本發明化合物及存在之其他賦形劑的物理化學特徵、其在調配物中之穩定性、可用製造儀器及成本約束。如本文所用，術語「穿透增強劑」意謂能夠輸送藥理學活性化合物穿過角質層且進入表皮或真皮，較佳存在極少或無全身性吸收的藥劑。已評估多種化合物提高藥物穿過皮膚之穿透速率的效用。參看例如Percutaneous Penetration Enhancers ,Maibach H.I.及Smith H.E.(編),CRC Press,Inc.,Boca Raton,Fla.(1995)，其調查多種皮膚穿透增強劑之用途及測試，及Buyuktimkin等人，Chemical Means of Transdermal Drug Permeation Enhancement in Transdermal and Topical Drug Delivery Systems ,Gosh T.K.,Pfister W.R.,Yum S.I.(編),Interpharm Press Inc.,Buffalo Grove,Ill.(1997)，在某些例示性實施例中，用於本發明之穿透劑包括(但不限 於)三酸甘油酯(例如大豆油)、蘆薈組合物(例如真蘆薈凝膠)、乙醇、異丙醇、辛基苯基聚乙二醇、油酸、聚乙二醇400、丙二醇、N-癸基甲基亞碸、脂肪酸酯(例如十四酸異丙酯、月桂酸甲酯、單油酸甘油酯及丙二醇單油酸酯)及N-甲基吡咯啶酮。

經皮貼片具有提供化合物至身體之控制傳遞的額外優勢。該等劑型可藉由將微粒或奈米粒子溶解或分散於適當介質中來製造。亦可使用吸收增強劑來增加化合物的透皮量。速率可藉由提供速率控制膜或將粒子分散於聚合物基質或凝膠中來控制。

在某些實施例中，組合物可為軟膏、糊劑、乳膏、洗液、凝膠、散劑、溶液、噴霧、吸入劑或貼片形式。在某些例示性實施例中，本發明組合物之調配物為乳膏，其可另外含有飽和或不飽和脂肪酸，諸如硬脂酸、棕櫚酸、油酸、棕櫚基-油酸、十六醇或油醇，硬脂酸尤其較佳。本發明之乳膏亦可含有非離子界面活性劑，例如聚氧-40-硬脂酸酯。在某些實施例中，活性組分在無菌條件下與醫藥學上可接受之賦形劑及可能需要的任何所需防腐劑或緩衝劑混雜。眼用調配物、滴耳劑及滴眼劑亦涵蓋於本發明之範疇內。此外，本發明涵蓋使用經皮貼片，其具有提供本發明化合物至身體之控制傳遞的額外優勢。該等劑型藉由將化合物溶解或分散於適當介質中來製造。如上文所述，亦可使用穿透增強劑來增加化合物之透皮量。速率可藉由提供速率控制膜或將化合物分散於聚合物基質(例如PLGA)或凝膠中來控制。

軟膏、糊劑、乳膏及凝膠可含有賦形劑，諸如動物及植物脂肪、油、蠟、石蠟、澱粉、黃蓍、纖維素衍生物、聚乙二醇、聚矽氧、膨潤土、矽酸、滑石及氧化鋅，或其混合物。

散劑及噴霧可含有賦形劑，諸如乳糖、滑石、矽酸、氫氧化鋁、矽酸鈣及聚醯胺粉末，或此等物質之混合物。噴霧可另外含有慣用推進劑，諸如氯氟烴。

亦應瞭解，本發明之化合物及醫藥組合物可在組合療法中調配及採用，亦即該等化合物及醫藥組合物可與一或多種其他所要治療或醫學程序一起調配或與一或多種其他所要治療或醫學程序同時、在其之前或之後投與。欲用於組合方案中之特定療法(治療劑或程序)組合將考慮所要治療劑及/或程序的相容性及欲實現之所要治療作用。亦應瞭解，所採用之療法可實現針對同一病症之所要作用(例如提供之化合物可與有效對抗β-地中海型貧血或鐮刀型貧血症之另一藥劑同時投與)，或其可實現不同作用(例如控制任何不良作用)。

亦應瞭解，本發明之特定化合物可以用於治療之游離形式存在，或適當時，以其醫藥學上可接受之衍生物形式存在。根據本發明，醫藥學上可接受之衍生物包括(但不限於)本發明化合物之醫藥學上可接受之鹽、酯、該等酯之鹽、或前藥或其他加合物或衍生物，其在向有需要之患者投與後能夠直接或間接提供本文另外描述之化合物，或其代謝物或殘基。

治療方法

本發明提供誘導γ血球蛋白且可產生有益治療作用之化合物。在某些實施例中，本文所述之化合物及組合物用於治療血紅素病，諸如鐮刀狀細胞型貧血或β-地中海型貧血。在某些實施例中，提供之化合物或組合物用於治療鐮刀狀細胞型貧血。在某些其他實施例中，提供之化合物或組合物用於治療β-地中海型貧血。

本發明方法刺激γ血球蛋白表現。在一個態樣中，本發明提供包含本發明化合物或其組合物用於刺激γ血球蛋白表現之方法，其包含：使個體與本發明之化合物或組合物在適於誘導個體中γ血球蛋白表現的條件下接觸。

在某些實施例中，本發明提供誘導γ血球蛋白之方法，其包含：使細胞與有效量之式(I-a)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)化合物接觸。在某些實施例中，本發明提供誘導γ血球蛋白之方法，其包含：向個體投與有效量之式(I-a)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)化合物。

在某些實施例中，本發明提供治療β-地中海型貧血之方法，其包含：向罹患β-地中海型貧血之患者投與有效量之所提供的化合物或組合物。

在某些實施例中，本發明提供治療鐮刀狀細胞型貧血之方法，其包含：向罹患鐮刀狀細胞型貧血之患者投與有效量之所提供的化合物或組合物。

在某些實施例中，所提供的化合物或組合物係經口投與。在某些實施例中，所提供的化合物或組合物係非經腸投與。在某些實施例中，所提供的化合物或組合物係與其他治療劑組合投與。

本發明化合物較佳調配為容易投與且劑量均勻的單位劑型。本文所用之表述「單位劑型」係指適於待治療患者之治療劑的物理個別單元。然而，應理解，本發明之化合物及組合物之每日總用量將由主治醫師在正確醫學判斷範疇內來確定。針對任何特定患者或有機體之特定治療有效劑量將視多種因素而定，該等因素包括所治療之病症及該病症之嚴重程度；所用特定化合物之活性；所用特定組合物；個體之年齡、體重、一般健康狀況、性別及飲食；投藥時間、投藥途徑(mute)及所用特定化合物之排出速率；治療持續時間；與所用特定化合物組合或同時使用之藥物；醫學技術中熟知之類似因素(參看例如Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics ，第10版，A.Gilman,J.Hardman及L.Limbird編，McGraw-Bill Press,155-173,2001，其全部內容以引用的方式併入本文中)。

篩選方法

在一個態樣中，本發明提供鑑別誘導γ血球蛋白表現之化合物的方法。在某些實施例中，本發明提供基於細胞之分析法，其包含將測試化合物與MEL細胞一起培育，MEL細胞含有連接於第一螢光報導體之人類γ血球蛋白啟動子及連接於第二螢光報導體之人類β血球蛋白啟動子；及測定相較於背景信號之螢光強度。在某些實施例中，雙重螢光報導體質體為pmLAR-Gp-DsRed-Bp-d2EGFP。在某些實施例中，本發明提供MEL細胞，其包含含有連接於第一螢光報導體之人類γ血球蛋白啟動子及連接於第二螢光報導 體之人類β血球蛋白啟動子之MEL細胞。在某些實施例中，第一螢光報導體為DsRed。在某些實施例中，第二螢光報導體為d2EGFP。在某些實施例中，第一螢光報導體為DsRed且第二螢光報導體為d2EGFP。在一些實施例中，在DsRed中量測螢光強度。

在某些實施例中，提供測定化合物誘導γ血球蛋白表現之能力的分析法。在其他實施例中，本發明化合物展現EC₅₀ 值100 μM。在其他實施例中，本發明化合物展現EC₅₀ 值50 μM。在其他實施例中，本發明化合物展現EC₅₀ 值40 μM。在其他實施例中，本發明化合物展現EC₅₀ 值30 μM。在其他實施例中，本發明化合物展現EC₅₀ 值20 μM。在其他實施例中，本發明化合物展現EC₅₀ 值10 μM。在其他實施例中，本發明化合物展現EC₅₀ 值7.5 μM。在某些實施例中，本發明化合物展現EC₅₀ 值5 μM。在其他實施例中，本發明化合物展現EC₅₀ 值2.5 μM。在某些實施例中，本發明化合物展現EC₅₀ 值1 μM。在某些實施例中，本發明化合物展現EC₅₀ 值0.75 μM。在某些實施例中，本發明化合物展現EC₅₀ 值0.5 μM。在某些實施例中，本發明化合物展現EC₅₀ 值0.25 μM。在某些實施例中，本發明化合物展現EC₅₀ 值0.1 μM。在其他實施例中，本發明化合物展現EC₅₀ 值75 nM。在其他實施例中，本發明化合物展現EC₅₀ 值50 nM。在其他實施例中，本發明化合物展現EC₅₀ 值25 nM。在其他實施例中，本發明化合物展現EC₅₀ 值10 nM。在其他實施例中，例示性化合物展現EC₅₀ 值5 nM。在其他實施例中，例示性化合物展現 EC₅₀ 值1 nM。

根據本發明，可在此項技術中已知可用於鑑別γ血球蛋白誘導劑之任一種可用分析法中分析化合物。舉例而言，分析法可為活體內或活體外，或高產量或低產量型式。

考慮以下實例將會進一步理解本發明之此等及其他態樣，該等實例意欲說明本發明之某些特定實施例，但不意欲限制其範疇，本發明之範疇由申請專利範圍界定。

實例

已建立篩選潛在HbF誘導劑的雙重螢光報導體分析系統。利用由螢光計偵測之螢光信號，可快速調查此等化合物來判斷哪些化合物接通胎兒γ血球蛋白啟動子。此雙重螢光報導體系統使得吾等可鑑別出具有共同核心結構(苯并[de]苯并[4,5]咪唑并[2,1-a]異喹啉-7-酮)且在誘導胚胎/胎兒血球蛋白鏈方面具有較高功效/特異性的若干雜環化合物。此等化合物可開發成用於治癒包括鐮刀型貧血症及β-地中海型貧血(例如重型β-地中海型貧血)之血紅素病的新一代治療藥物。

材料及方法

化合物 包括化合物A(8-(3-羧基-7-側氧基-7H-苯并[de]苯并[4,5]咪唑并[2,1-a]異喹啉-4-基)-萘-1,4,5-三甲酸)、化合物B(苯并[de]苯并[4,5]咪唑并[2,1-a]異喹啉-7-酮)、化合物C(3-氯-苯并[de]苯并[4,5]咪唑并[2,1-a]異喹啉-7-酮)、化合物D(4-硝基-苯并[de]苯并[4,5]咪唑并[2,1-a]異喹啉-7-酮)、化合物E(4-甲基胺基-苯并[de]苯并[4,5]咪唑并[2,1-a]異喹啉-7-酮)及化合物F(7-側氧基-7H-苯并[de]苯 并[4,5]咪唑并[2,1-a]異喹啉-3,4-二甲酸)在內的所篩選之所有雜環化合物均係購自ChemDiv Co。選擇性CaMKK抑制劑STO-609(7-側氧基-7H-苯并咪唑并[2,1-a]苯并[de]異喹啉-3-甲酸乙酸鹽)係購自Sigma-Aldrich。

報導體構築體。 報導體質體pmLAR-Gp-DsRed-Bp-d2EGFP係藉由多個步驟之次選殖製程建構。簡言之，將自pLAR-β切取之mini-LAR的8,003 bp片段(mLAR；含有用於調控人類β樣血球蛋白基因表現之HS4-HS3-HS2-HS1順式作用元件的最小基因座活化區)插入至pd2EGFP-1的XhoI及EcoRI位點。接著，藉由PCR擴增產生1,622 bp β血球蛋白啟動子(Bp)片段且將其選殖至pd2EGFP-1的AgeI位點產生pmLAR-Bp-d2EGFP。亦將1,377 bp γ血球蛋白啟動子(Gp)片段次選殖至pDsRed-Monomer-C1載體的AgeI位點，產生pGp-DsRed-C1。接著自pGp-DsRed-C1質體切取Gp-DsRed片段且再插入pmLAR-Bp-d2EGFP的mLAR與Bp-d2EGFP之間的SalI位點。接著使用所得報導體pmLAR-Gp-DsRed-Bp-d2EGFP以藉由轉染至MEL細胞中來形成穩定細胞株。

細胞培養物及穩定細胞株形成 小鼠紅白血病(MEL)細胞及成人紅血球系細胞株(Friend等人，(1971)Proc Natl Acad Sci USA 68：378-82)保持於補充有10% FBS及1%青黴素(penicillin)-鏈黴素(streptomycin)的DMEM培養基(Gibco)中(於37℃、5% CO₂ 且潮濕氛圍之腔室中)。為了形成穩定細胞株，使用Neon^TM 轉染系統(Invitrogen)將報導體pmLAR-Gp-DsRed-Bp-d2EGFP轉染至MEL細胞中。以5 μg 質體轉染2×10⁶ 個MEL細胞。在微穿孔後，將MEL細胞接種於10 ml無抗生素DMEM中持續24小時，且以700 mg/ml新黴素(neomycin)篩選1個月。藉由將經純化之單核細胞保持於具有1× cc100細胞激素混合物之SFEM培養基(StemSpan)中7天，開始初級人類紅血球系培養。接著將細胞以0.1-1×10⁶ 個細胞/毫升之密度再保持於分化培養基(具有20 ng/ml SCF、1 U/ml EPO、5 ng/ml IL-3、2 μmol地塞米松(dexamethasone)的SFEM)中7天。在分化後第7天以化合物處理細胞，接著在化合物處理3天後採集用於進一步分析。

機器自動篩選化合物。 在光學Packard 96孔可視培養盤上接種5×10⁴ 個攜帶雙重螢光報導體之MEL細胞，以10 mM個別化合物處理3天，且使用Wallac Victor3 1420多標籤計數器(Ex：550/9；Em：620)針對其DsRed強度進行初次篩選。使用數位影像偵測器、Cellomics Arrayscan 3.0系統進行二級篩選，此雙重確認化合物處理誘導之胞內DsRed螢光。隨後藉由即時RT-PCR分析鑑別初級篩選及二級篩選陽性MEL細胞以及經化合物處理之初級人類紅血球系培養物中之內源血球蛋白基因表現模式。

即時RT-PCR分析 使用RNAspin Mini套組(GE Healthcare)分離總RNA。使用SuperScript II逆轉錄酶(Invitrogen)進行cDNA合成。使用SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)及ABI 7500即時系統進行定量RT-PCR。針對小鼠或人類β肌動蛋白(actin)基因之表現量校正後分析所有資料。

結果

形成調查胚胎/胎兒血球蛋白基因誘導化合物之高產量篩選系統。

出於高產量篩選誘導胚胎/胎兒血球蛋白基因表現之化學品之目的，已建構內置有人類γ血球蛋白啟動子及β血球蛋白啟動子的雙重螢光報導體。在重組基因座控制區(mLAR)下游，γ血球蛋白啟動子及β血球蛋白啟動子之次序根據其在染色體β樣血球蛋白基因座中之親本排列組織。人類β血球蛋白基因座之NCBI GenBank ID為NG_000007。質體pmLAR-Gp-DsRed-Bp-d2EGFP攜帶DsRed及d2EGFP螢光基因，分別作為其用於監測γ及β血球蛋白基因表現之報導體(圖2A)。已比較來自處於不同發育階段之紅血球系細胞中的內源血球蛋白表現模式的報導體之螢光信號。螢光信號之表現確實反映了MEL及K562細胞中相應內源血球蛋白基因之表現模式的狀態。

隨後，使用雙重螢光報導體質體來高產量篩選化合物(圖2B)。簡言之，選擇10,000種化合物來測試其在10 μM工作濃度下提高胚胎/胎兒血球蛋白啟動子的能力。藉由螢光讀取器及數位影像偵測器偵測提高之螢光表現。篩選結果顯示於圖2C中之點陣圖中。10,000種化合物中有8種化合物顯示紅色螢光強度相較於背景信號增加至少1.5倍。藉由即時RT-PCR分析進一步驗證此等化合物誘導之內源胚胎/胎兒血球蛋白鏈之活化。資料顯示僅一種化合物(化合物A；圖2C中之箭頭)誘導MEL細胞中超過10倍的小鼠胚胎(εγ)血球蛋白mRNA表現。

mLAR、γ血球蛋白啟動子及β血球蛋白啟動子之序列如下：mLAR(8003 bp，SEQ ID NO：1)：tcgactctagaggatcaattcgagctcttggggaccccagtacacaagaggggacgcagggtatatgtagacatctcattctttttcttagtgtgagaataagaatagccatgacctgagtttatagacaatgagcccttttctctctcccactcagcagctatgagatggcttgccctgcctctctactaggctgactcactccaaggcccagcaatgggcagggctctgtcagggctttgatagcactatctgcagagccagggccgagaaggggtggactccagagactctccctcccattcccgagcagggtttgcttatttatgcatttaaatgatatatttattttaaaagaaataacaggagactgcccagccctggctgtgacatggaaactatgtagaatattttgggttccatttttttttccttctttcagttagaggaaaaggggctcactgcacatacactagacagaaagtcaggagctttgaatccaagcctgatcatttccatgtcatactgagaaagtccccacccttctctgagcctcagtttctctttttataagtaggagtctggagtaaatgatttccaatggctctcatttcaatacaaaatttccgtttattaaatgcatgagcttctgttactccaagactgagaaggaaattgaacctgagactcattgactggcaagatgtccccagaggctctcattcagcaataaaattctcaccttcacccaggcccactgagtgtcagatttgcatgcactagttcacgtgtgtaaaaaggaggatgcttctttcctttgtattctcacatacctttaggaaagaacttagcacccttcccacacagccatcccaataactcatttcagtgactcaacccttgactttataaaagtcttgggcagtatagagcagagattaagagtacagatgctggagccagaccacctgagtgattagtgactcagtttctcttagtaattgtatgactcagtttcttcatctgtaaaatggagggttttttaattagtttgtttttgagaaagggtctcactctgtcacccaaatgggagtgtagtggcaaaatctcggctcactgcaacttgcacttcccaggctcaagcggtcctcccacctcaacatcctgagtagctggaaccacaggtacacaccaccatacctcgctaattttttgtatttttggtagagatggggtttcacatgttacacaggatggtctcagactccggagctcagaagagtcaagcatttgcctaaggtcggacatgtcagaggcagtgccagacctatgtgagactctgcagctactgctcatgggccctgtgctgcactgatgaggaggatcagatggatggggcaatgaagcaaaggaatcattctgtggataaaggagacagccatgaagaagtctatgactgtaaatttgggagcaggagtctctaaggacttggatttcaaggaattttgactcagcaaacacaagaccctcacggtgactttgcgagctggtgtgccagatgtgtctatcagaggttccagggagggtggggtggggtcagggctggccaccagctatcagggcccagatgggttataggctggcaggctcagataggtggttaggtcaggttggtggtgctgggtggagtccatgactcccaggagccaggagagatagaccatgagtagagggcagacatgggaaaggtgggggaggcacagcatagcagcatttttcattctactactacatgggactgctcccctatacccccagctaggggcaagtgccttgactcctatgttttcaggatcatcatctataaagtaagagtaataattgtgtctatctcatagggttattatgaggatcaaaggagatgcacactctctggaccagtggcctaacagttcaggacagagctatgggcttcctatgtatgggtcagtggtctcaatgtagcaggcaagttccagaagatagcatcaaccactgttagagatatactgccagtctcagagcctgatgttaatttagcaatgggctgggaccctcctccagtagaaccttctaaccaggatccagtggggcctctaagactaagtcactctgtctcactgtgtcttagccagttccttacagcttgccctgatgggagatagagaatgggtatcctccaacaaaaaaataaattttcatttctcaaggtccaacttatgttttcttaatttttaaaaaaatcttgaccattctccactctctaaaataatccacagtgagagaaacattcttttcccccatcccataaatacctctattaaatatggaaaatctgggcatggtgtctcacacctgtaatcccagcactttgggaggctgaggtgggtggactgcttggagctcaggagttcaagaccatcttggacaacatggtgataccctgcctctacaaaaagtacaaaaattagcctggcatggtggtgtgcacctgtaatcccagctattagggtggctgaggcaggagaattgcttgaacccgggaggcggaggttgcagtgagctgagatcgtgccactgcactccag 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gatgataatcacatatttgtaaacacaacacacacacacacacacacacacatatatatatataaaacatatatatacataaacacacataacatatttatcgggcatttctgagcaactaactcatgcaggactctcaaacactaacctatagccttttctatgtatctacttgtgtagaaaccaagcgtggggactgagaaggcaatagcaggagcattctgactctcactgcctttggctaggtccctccctcatcacagctcagcatagtccgagctcttatctatatccacacacagtttctgacgctgcccagctatcaccatcccaagtctaaagaaaaaaataatgggtttgcccatctctgttgattagaaaacaaaacaaaataaaataagcccctaagctcccagaaaacatgactaaaccagcaagaagaagaaaatacaataggtatatgaggagactggtgacactagtgtctgaatgaggcttgagtacagaaaagaggctctagcagcatagtggtttagaggagatgtttctttccttcacagatgccttagcctcaataagcttgcggttgtggaagtttactttcagaacaaactcctgtggggctagaattattgatggctaaaagaagcccgggggagggaaaaatcattcagcatcctcacccttagtgacacaaaacagagggggcctggttttccatatttcctcatgatggatgatctcgttaatgaaggtggtctgacgagatcattgcttcttccatttaagccttgctcacttgccaatcctcagttttaaccttctccagagaaatacacattttttattcaggaaacatactatgttatagtttcaatactaaataatcaaagtactgaagatagcatgcataggcaagaaaaagtccttagctttatgttgctgttgtttcagaatttaaaaaagatcaccaagtcaaggacttctcagttctagcactagaggtggaatcttagcatataatcagaggtttttcaaaatttctagacatgagattcaaagccctgcacttaaaatagtctcatttgaattaactctttatataaattgaaagcacattctgaactacttcagagtattgttttatttctatgttcttagttcataaatacattaggcaatgcaatttaattaaaaaaacccaagaatttcttagaattttaatcatgaaaataaatgaaggcatctttacttactcaaggtcccaaaaggtcaaagaaaccaggaaagtaaagctatatttcagcggaaaatgggatatttatgagttttctaagttgacagactcaagttttaaccttcagtgcccatgatgtaggaaagtgtggcataactggctgattctggctttctactcctttttcccattaaagatccctcctgcttaattaacattcacaagtaactctggttgtactttaggcacagtggctcccgaggtcagtcacacaataggatgtctgtgctccaagttgccagagagagagattactcttgagaatgagcctcagccctggctcaaactcacctgcaaacttcgtgagagatgaggcagaggtacactacgaaagcaacagttagaagctaaatgatgagaacacatggactcatagagggaaacaacgcatactggggcctatcagagggtggagggtgagagaaggagaggatcaggaaaaatcactaatggatgctaagcgtaatacctgagtgatgagatcatctatacaacaaacccccttgacattcatttatctatgtaacaaacctgcacatcctgtacacgtacccctgaacttaaaataaaagttgaaaacaagaaagcaacagtttgaacacttgttatggtctattctctcattctttacaattacactagaaaatagccacaggctcctgcaaggcagccacagaatttatgacttgtgatgatctaatgctttcataaagaagcaaatataataaatactataccacaaatgtaatgtttgatgtctgataatgatatttcagtgtaattaaacttagcactcctatgtatattatttgatgcaataaaaacatattttttttagcacttacagtctgccaaactggcctgtgacacaaaaaaagtttag

γ血球蛋白啟動子(1377 bp，SEQ ID NO：2)：tacacaggatcatgaaggatgaaagaacttcaccaatattataataatttcaatcaacctgatagcttaggggataaactaatttgaagatacagcttgcctccgataagccagaattccagagcttctggcattataatctagcaaggttagagatcatggatcactttcagagaaaaacaaaaacaaactaaccaaaagcaaaacagaaccaaaaaaccaccataaatacttcctaccctgttaatggtccaatatgtcagaaacagcgctgtgttagaaataaagctgtctaaagtacactaatattcgagttataatagtgtgtggactattagtcaataaaaacaacccttgcctctttagagttgttttccatgtacacgcacatcttatgtcttagagtaagattccctgagaagtgaacctagcatttatacaagataattaattctaatccacagtacctgccaaagaacattctaccatcatctttactgagcatagaaggctacgccaaaaccctgggtcatcagccagcacacacacttatccagtggtaaatacacatcatctggtgtatacatacatacctgaatatggaatcaaatatttttctaagatgaaacagtcatgatttatttcaaataggtacggataagtagatattgaggtaagcattaggtcttatattatgtaacactaatctattactgcgctgaaactgtggcttt atagaaattgttttcactgcactattgagaaattaagagataatggcaaaagtcacaaagagtatattcaaaaagaagtatagcactttttccttagaaaccactgctaactgaaagagactaagatttgtcccgtcaaaaatcctggacctatgcctaaaacacatttcacaatccctgaacttttcaaaaattggtacatgctttagctttaaactacaggcctcactggagctagagacaagaaggtaaaaaacggctgacaaaagaagtcctggtatcctctatgatgggagaaggaaactagctaaagggaagaataaattagagaaaaactggaatgactgaatcggaacaaggcaaaggctataaaaaaaattaagcagcagtatcctcttgggggccccttccccacactatctcaatgcaaatatctgtctgaaacggtccctggctaaactccacccatgggttggccagccttgccttgaccaatagccttgacaaggcaaacttgaccaatagtcttagagtatccagtgaggccaggggccggcggctggctagggatgaagaataaaaggaagcacccttcagcagttccacacactcgcttctggaacgtctgaggttatcaataagc

β血球蛋白啟動子(1622 bp，SEQ ID NO：3)：gtcgactctagaggatctctatttatttagcaataatagagaaagcatttaagagaataaagcaatggaaataagaaatttgtaaatttccttctgataactagaaatagaggatccagtttcttttggttaacctaaattttatttcattttattgttttattttattttattttattttattttgtgtaatcgtagtttcagagtgttagagctgaaaggaagaagtaggagaaacatgcaaagtaaaagtataacactttccttactaaaccgactgggtttccaggtaggggcaggattcaggatgactgacagggcccttagggaacactgagaccctacgctgacctcataaatgcttgctacctttgctgttttaattacatcttttaatagcaggaagcagaactctgcacttcaaaagtttttcctcacctgaggagttaatttagtacaaggggaaaaagtacagggggatgggagaaaggcgatcacgttgggaagctatagagaaagaagagtaaattttagtaaaggaggtttaaacaaacaaaatataaagagaaataggaacttgaatcaaggaaatgattttaaaacgcagtattcttagtggactagaggaaaaaaataatctgagccaagtagaagaccttttcccctcctacccctactttctaagtcacagaggctttttgttcccccagacactcttgcagattagtccaggcagaaacagttagatgtccccagttaacctcctatttgacaccactgattaccccattgatagtcacactttgggttgtaagtgactttttatttatttgtatttttgactgcattaagaggtctctagttttttatctcttgtttcccaaaacctaataagtaactaatgcacagagcacattgatttgtatttattctatttttagacataatttattagcatgcatgagcaaattaagaaaaacaacaacaaatgaatgcatatatatgtatatgtatgtgtgtatatatacacatatatatatatattttttttcttttcttaccagaaggttttaatccaaataaggagaagatatgcttagaactgaggtagagttttcatccattctgtcctgtaagtattttgcatattctggagacgcaggaagagatccatctacatatcccaaagctgaattatggtagacaaagctcttccacttttagtgcatcaatttcttatttgtgtaataagaaaattgggaaaacgatcttcaatatgcttaccaagctgtgattccaaatattacgtaaatacacttgcaaaggaggatgtttttagtagcaatttgtactgatggtatggggccaagagatatatcttagagggagggctgagggtttgaagtccaactcctaagccagtgccagaagagccaaggacaggtacggctgtcatcacttagacctcaccctgtggagccacaccctagggttggccaatctactcccaggagcagggagggcaggagccagggctgggcataaaagtcagggcagagccatctattgcttacatttgcttctgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacacc

鑑別以較高功效及特異性提高人類胚胎/胎兒血球蛋白基因表現之化合物。

接著，檢驗人類紅血球系祖細胞培養物中化合物A對內源血球蛋白基因之誘導。自供體之周邊血液分離初級培養 細胞，在培養基中擴增並分化總共14天，且以不同濃度之化合物A再處理3天。儘管細胞之增殖速率與化合物A之濃度成相反關係，但γ(而非β)血球蛋白基因之相對表現量隨化合物A之濃度增加而顯著增加(圖3A)。

為了進一步研究化合物A允許在初級紅血球系培養物中誘導人類胚胎/胎兒血球蛋白基因之獨特特徵，首先比較在初級紅血球系培養細胞中以不同胎兒血球蛋白誘導劑處理後的β樣血球蛋白表現模式。有趣的是，以化合物A處理之細胞相較於經TSA、羥基脲(HU)及丁酸鈉(NaB)處理之細胞顯示最高γ-血球蛋白誘導倍數，而相較於HU及TSA觀測到化合物A對成人β血球蛋白基因表現僅為最輕微的誘導(圖3B)。

鑑別化合物A處理誘導胎兒血球蛋白基因中涉及之轉錄調控子。

已鑑別出包括GATA1(18)、NF-E2(3)、EKLF(2)、YY1(22)、TR2/TR4(29)、NF-E4(7)、RREB1(4)及BCL11A(23)在內之若干轉錄因子用作血球蛋白基因表現之活化子或抑制子。為了揭露化合物A用以特異性誘導胎兒γ血球蛋白基因表現的分子機制，對已知會影響血球蛋白基因轉錄之若干轉錄因子的相對表現量進行分析(圖4)。可見在經化合物A處理之初級人類紅血球系培養物中γ血球蛋白基因活化子NF-E4(7)之表現量得以上調。同時，γ血球蛋白基因抑制子Bcl11a(23)之表現量降低。化合物A處理未顯著改變其他血球蛋白基因調控子(諸如EKLF、GATA1、 NF-E2、RREB1、CP2、TR2/TR4、YY1)之表現量。NF-E4之升高及Bcl11a之降低可能皆造成此等經化合物A處理之紅血球系細胞中γ血球蛋白基因表現之活化。

具有與化合物A相同之雜環核心結構的化合物提高胎兒γ血球蛋白表現

隨後，已調查具有與化合物A類似之雜環結構的18種化合物。鑑別出此18種雜環化合物中有5種雜環化合物能夠誘導胎兒γ血球蛋白表現(圖5，化合物B-F)。有趣的是，所有6種化合物(包括化合物A)共有相同核心結構(苯并[de]苯并[4,5]咪唑并[2,1-a]異喹啉-7-酮)且γ血球蛋白誘導能力相當。圖5中顯示此等雜環化合物在活化γ血球蛋白基因表現及抑制細胞增殖中之劑量作用。

已藉由定量RT-PCR分析估算化合物B、C及F在其IC₅₀ 濃度下對內源β及γ血球蛋白基因的相對誘導倍數且與化合物A、HU及NaB之誘導倍數比較(圖6)。為獲得此等雜環化合物關於其對個別血球蛋白鏈之誘導能力的完整實況，亦已藉由絕對定量RT-PCR分析估算以HU、NaB或化合物A/B/C/F在IC₅₀ 下處理之人類紅血球系細胞中編碼各血球蛋白的mRNA之絕對量。如圖9中所見，在雜環化合物處理後，γ血球蛋白mRNA之比例自8%顯著增加至10.7-19.6%。同時，在雜環化合物處理後，β血球蛋白mRNA之比例自87.2%降至73.8-81.4%。總而言之，已鑑別出之此等雜環化合物優先誘導胚胎ε及胎兒γ血球蛋白基因表現，但不誘導成人β血球蛋白(圖6及圖9)。

雜環化合物與丁酸或羥基脲對胎兒γ血球蛋白之誘導能力的比較

為了評估此等雜環化合物相較於NaB及HU對胎兒血球蛋白基因之誘導能力，已計算此等γ血球蛋白誘導劑之IC₅₀ 值(半最大抑制濃度)及EC值(有效濃度)(圖10)。此兩者中，IC₅₀ 為使細胞增殖降低50%之化合物濃度。EC定義為誘導γ血球蛋白mRNA含量達1.88倍(即在三組實驗中HU在IC₅₀ 下誘導之γ血球蛋白基因之平均倍數)的化合物濃度。在不同分支鏈的情況下，此等雜環化合物顯示相當不同之細胞毒性(IC₅₀ )以及其有效劑量(EC)。接著以各別IC₅₀ 及EC之比率(IC₅₀ /EC)計算治療窗，其可用於評估此等雜環化合物彼此之間及相較於HU及NaB之益處(從左開始第4行，圖10)。考慮到治療優勢(治療窗)，鑑別出的化合物中至少3者(化合物B、C及E)顯示優於HU或NaB之治療潛力。此外，如圖10中表格的最右一行中所見，所有6種化合物顯示相較於HU及NaB在IC₅₀ 下誘導γ血球蛋白基因表現的能力類似或較佳。在某些實施例中，本發明組合物展現比羥基脲大的治療窗。在某些實施例中，本發明組合物展現比丁酸鈉大的治療窗。

CaMKK抑制劑STO-609使胎兒γ血球蛋白表現升高

因為Ca(2+)/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶(CaMKK)之選擇性抑制劑STO-609(30)含有與上文所述之此等胎兒γ血球蛋白誘導化合物相同的雜環核心結構(苯并[de]苯并[4,5]咪唑并[2,1-a]異喹啉-7-酮)，所以接著檢驗其誘導人類初級紅血 球系細胞中胎兒γ血球蛋白表現的潛力(圖7)。如所預期，以50 mM或50 mM以上濃度之STO-609處理後，胎兒γ血球蛋白基因而非成人β血球蛋白之表現量升高(圖7A)。如同在γ血球蛋白誘導雜環化合物A-F的情況下，以STO-609處理亦引起γ血球蛋白基因活化子NF-E4之轉錄上調(圖7B)。同時，STO-609下調γ血球蛋白基因抑制子Bcl11a之表現量(圖7C)。此外，發現STO-609處理亦顯著減少另一γ血球蛋白基因抑制子c-Myb之轉錄物(10)(圖7D)。總之，資料顯示包括特異性CaMKK抑制劑STO-609在內的此等雜環化合物均可用作有效的γ血球蛋白誘導劑，該等化合物具有相同核心結構(苯并[de]苯并[4,5]咪唑并-[2,1-a]異喹啉-7-酮)。此等化合物對γ血球蛋白基因之活化似乎部分地藉由調節某些γ血球蛋白基因調控子(諸如NF-E4、Bcl11a及/或cMyb)之表現量來激發。下文論述此等雜環化合物(包括A-F及STO609)之可能作用及其與胎兒γ血球蛋白基因誘導程式之串擾。

論述

上文已描述使用雙重螢光報導體質體作為監測內源血球蛋白基因表現之指示劑的高產量篩選系統。已報導類似方法且亦充分表徵其評定內源血球蛋白基因之表現的用途(27)。在篩選HbF誘導劑過程中已證明該等分析法之特異性。利用此雙重螢光分析系統，能夠篩選可誘導γ血球蛋白基因在成人紅血球系細胞中表現之化合物。調查10,018種化合物後，已鑑別出6種雜環化合物，其均包括相同核 心結構(苯并[de]苯并[4,5]咪唑并[2,1-a]異喹啉-7-酮)，其IC₅₀ 濃度下展示與HU或NaB類似或較佳之γ血球蛋白誘導功效。儘管此等化合物展現不同程度之細胞毒性，但所有6種雜環化合物(包括化合物A在內)在IC₅₀ 下均能夠誘導γ血球蛋白基因之活化達1.9至3.4倍(圖10)。此外，此等雜環化合物均展現比羥基脲高的治療窗(IC₅₀ /EC)，例如化合物B高達約10倍。

胎兒γ血球蛋白鏈能夠在功能上替代缺陷型β血球蛋白鏈且幫助防止鐮刀型貧血症中形成HbS。胎兒γ血球蛋白鏈之存在亦平衡超載之血球蛋白鏈且防止其在β-地中海型貧血患者體內沈澱。因此，γ血球蛋白之量升高將會減輕血紅素病患者之溶血，且有效緩和貧血的嚴重程度。10%-20% HbF表現之臨限值視為有效調節血紅素病的臨床嚴重程度(21)。如圖9中所表明，化合物A、B、C及F誘導初級紅血球系細胞培養物中γ血球蛋白表現範圍高達10.7-19.6%，表明其HbF誘導功效與其他熟知胎兒血球蛋白誘導劑(諸如HU及NaB)相當。

因為已鑑別之6種雜環化合物以及特異性CaMKK抑制劑STO-609均共有共同核心結構，亦即化合物B之結構(苯并[de]苯并[4,5]咪唑并[2,1-a]異喹啉-7-酮)，預期伸萘甲醯基苯并咪唑骨架極有可能為上調/誘導γ血球蛋白基因表現的關鍵。此外，已觀測到此等化合物之分支側鏈位於雜環結構的位置3或位置4(如圖5B所示)且此等化合物之功效及細胞毒性存在變化。含有相同核心結構(苯并[de]苯并-[4,5] 咪唑并[2,1-a]異喹啉-7-酮)但在其他位置具有分支鏈改質的若干化合物未展示可偵測之γ血球蛋白基因誘導能力(表1)。此等資料表明某些位置(例如化合物B之位置3及4)之改質可使得能夠甚至較佳地醫藥開發化合物用於鐮刀型貧血症及嚴重的重型β-地中海型貧血療法。

有趣的是，具有與雜環化合物A-F相同之核心結構的特異性CaMKK抑制劑STO-609亦展示胎兒γ血球蛋白誘導能力。亦顯示抑制細胞MEK/Erk路徑會刺激人類初級紅血球系細胞中γ血球蛋白表現(14)。有趣的是，CaMKK信號傳導經由CaMKK之下游目標CaMKI連接至MEK/Erk路徑(25)。因此，咸信STO-609抑制CaMKK活化同樣會激發對MEK/Erk信號傳導之抑制，因此導致胎兒γ血球蛋白基因表現升高。在相同核心結構(苯并[de]苯并[4,5]咪唑并[2,1-a]異喹啉-7-酮)的情況下，已鑑別出之雜環化合物A-F展示與STO-609類似的能力，諸如胎兒γ血球蛋白誘導、NF-E4 mRNA上調及Bcl11a轉錄物(以及cMyb mRNA)下調。與 CAMKK抑制劑一樣，此等雜環化合物對胎兒γ血球蛋白表現之誘導可能部分地偶合於對MEK/Erk信號傳導之抑制。

總之，研究已揭示具有共同核心結構(苯并[de]苯并[4,5]咪唑并[2,1-a]異喹啉-7-酮)之一系列雜環化合物均可特異性誘導成人人類紅血球系細胞中之胎兒γ血球蛋白表現。此外，闡明若干γ血球蛋白調控子的表現模式且本文中提出描述此等雜環化合物(包括特異性CaMKK抑制劑STO-609在內)如何活化胎兒γ血球蛋白表現之機制的說明(圖8)。吾人提出此等雜環化合物藉由調控NF-E4、Bcl11a、c-Myb之表現量及/或干擾MEK/Erk信號傳導刺激胎兒γ血球蛋白鏈表現的模型。均已充分證明NF-E4之過度表現(32)、Bcl11a之下調(23)及MEK/Erk信號傳導路徑之抑制(14)會誘導內源胎兒γ血球蛋白表現。另一方面，表明異位c-Myb之過度表現會抑制胎兒γ血球蛋白基因表現(10)。因此，咸信此等化合物及其具有適當改質之衍生物對於開發治癒血紅素病，尤其鐮刀型貧血症及嚴重β-地中海型貧血的新一代藥品非常有價值。

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圖1 顯示人類α-樣及β-樣血球蛋白基因簇之物理圖譜。分別位於染色體16及11上的人類α-樣及β-樣血球蛋白之基因簇皆延伸超過50 kb基因組。各基因簇由上游基因座控制區(LCR)及下游平行同源(paralogic)血球蛋白基因組成。個別血球蛋白基因在紅血球系細胞中之表現，在稱為血色素轉換(hemoblobin switch)的發育期間受到臨時控制。血色素轉換會隨同胚胎/胎兒血球蛋白基因的相互沉默(reciprocal silencing)及胎兒/成人血球蛋白基因在各發育階段的同等活化來進行，其亦伴隨著紅血球生成部位移動。

圖2 顯示高產量篩選能夠誘導胚胎/胎兒血球蛋白基因之化合物的結果。(A)雙重螢光報導體質體之物理圖譜。(B)高產量篩選之實驗程序。(步驟1)將10,000種雜環化合物加入96孔培養板中，且測試其在10 μM之工作濃度下提高胚胎/胎兒血球蛋白啟動子的能力。(步驟2及步驟3)藉由螢光讀取器偵測DsRed螢光之高表現，且藉由數位影像偵測器進一步確認。(步驟4)接著藉由即時RT-PCR分析驗證化合物誘導之內源胚胎/胎兒血球蛋白基因的活化。(C)點陣圖中所顯示篩選資料。發現10,000種化合物中有大約8種化合物會使DsRed螢光強度提高1.5倍或1.5倍以上。即時RT-PCR分析顯示該8種化合物中僅有一種(化合物A；箭頭)會誘導MEL細胞使其中的內源小鼠胚胎εy血球蛋白 mRNA表現量超過10倍。

圖3 說明化合物A對人類紅血球系祖細胞之初級培養物中之內源血球蛋白基因的誘導。(A)化合物A於分化人類紅血球系祖細胞中之劑量作用。以不同濃度之化合物A處理分化初級培養細胞3天。抽取總mRNA，且藉由即時RT-PCR分析測定β及γ血球蛋白mRNA的相對誘導現象。使用阿爾瑪藍試劑(alamar Blue reagent)(作為100%之空白對照)測定細胞增殖能力。白條表示β-血球蛋白的相對表現量。灰條表示γ-血球蛋白mRNA的相對含量。(B)以不同胎兒血球蛋白誘導劑處理之初級紅血球系培養細胞中γ與β血球蛋白基因表現模式的比較。分別以化合物A(0.25 μM)、TSA(0.33 μM)、羥基脲(HU；100 μM)及丁酸鈉(NaB；0.5 mM)處理細胞3天。接著分離總RNA進行即時RT-PCR分析。接著測定對β血球蛋白基因(白條)及γ血球蛋白基因(灰條)之相對誘導現象。

圖4 顯示與血球蛋白基因調控有關之轉錄因子的相對表現量。以0.25 μM化合物A處理初級人類紅血球系培養物，接著藉由即時RT-PCR分析測定不同轉錄因子之相對表現量。白條表示設為1之空白對照的表現量。黑條為經化合物A處理之細胞中的相對表現量。

圖5 說明具有共同核心結構之6種雜環化合物對胎兒γ血球蛋白基因表現的誘導。(A)選擇具有共同伸萘甲醯基苯并咪唑核心結構之若干雜環化合物來檢驗其誘導於人類初級培養之紅血球系細胞中γ血球蛋白基因之表現的能力。 接著藉由即時RT-PCR分析此等化合物對γ血球蛋白基因之誘導(黑條)。使用阿爾瑪藍試劑(作為100%之空白對照)測定細胞增殖能力(曲線)(化合物A為8-(3-羧基-7-側氧基-7H-苯并[de]苯并[4,5]咪唑并[2,1-a]異喹啉-4-基)-萘-1,4,5-三甲酸、化合物B為苯并[de]苯并[4,5]咪唑并[2,1-a]異喹啉-7-酮)、化合物C為3-氯-苯并[de]苯并[4,5]咪唑并[2,1-a]異喹啉-7-酮、化合物D為4-硝基-苯并[de]苯并[4,5]咪唑并[2,1-a]異喹啉-7-酮、化合物E為4-甲基胺基-苯并[de]苯并[4,5]咪唑并[2,1-a]異喹啉-7-酮及化合物F為7-側氧基-7H-苯并[de]苯并[4,5]咪唑并[2,1-a]異喹啉-3,4-二甲酸)。(B)顯示共同核心結構(苯并[de]-苯并[4,5]咪唑[2,1-a]異喹啉-7-酮)及其可能經分支側鏈修飾之位置編號。

圖6 說明將初級紅血球系培養物以不同胎兒γ血球蛋白誘導劑(羥基脲(HU)、丁酸鈉(NaB)及所提供之伸萘甲醯基苯并咪唑化合物)在IC₅₀ 下處理3天後，其中內源血球蛋白基因的誘導現象。抽取總mRNA，且藉由即時RT-PCR分析測定β及γ血球蛋白mRNA的相對誘導。白條表示β-血球蛋白的相對表現量。灰條表示γ-血球蛋白mRNA的相對含量。

圖7 顯示特異性CaMKK抑制劑STO-609對人類紅血球系細胞之初級培養物中胎兒γ血球蛋白基因表現的誘導。依據針對化合物A-F所述之方法來分析STO-609對經分化人類紅血球系祖細胞之增殖及γ/β血球蛋白基因表現之劑量作用。以不同濃度之STO-609處理經分化初級培養紅血球系細胞3天。(A)藉由即時RT-PCR分析測定β(白條)及γ血 球蛋白mRNA(黑條)之相對誘導。以空白對照為100%顯示細胞之增殖曲線。(B)藉由即時RT-PCR分析測定NF-E4之相對表現量且由灰條顯示。(C)顯示Bcl11a回應以不同濃度之STO-609處理後的相對表現量(白條)。(D)顯示以不同濃度之STO-609處理之細胞中c-Myb的相對表現量(黑條)。空白對照設為1。

圖8 顯示具有相同核心結構之雜環化合物如何活化胎兒γ血球蛋白基因表現之可能機制的草圖模型。吾人之研究已顯示此等雜環化合物對胎兒γ血球蛋白基因之誘導至少部分地藉由調節若干轉錄因子之表現量(包括上調NF-E4表現及下調Bcl11a以及c-Myb)來介導。此等雜環化合物(例如STO-609)可能亦經由CaMKK/CaMK1路徑干擾MEK/Erk信號傳導之活化。具有核心結構(苯并[de]苯并[4,5]咪唑并[2,1-a]異喹啉-7-酮)之雜環化合物的CaMKK抑制特徵可能造成對γ血球蛋白基因轉錄之誘導。

圖9 顯示初級紅血球系培養物中β-樣血球蛋白mRNA含量的絕對定量分析。以化合物A(0.2μM)、化合物B(21.8μM)、化合物C(75.2μM)、化合物F(103μM)、羥基脲(HU；146.5μM)或丁酸鈉(NaB；221.5μM)在IC₅₀ 下處理經分化人類初級紅血球系細胞3天，且藉由即時RT-PCR分析來分析mRNA之含量。估算且顯示每微克總mRNA中各血球蛋白mRNA的複本數。括號顯示總β-樣血球蛋白mRNA中個別血球蛋白鏈之相對比例(%)。

圖10 顯示6種雜環化合物、丁酸鈉及羥基脲之IC₅₀ 及γ 血球蛋白基因誘導能力的比較。藉由即時RT-PCR分析經或未經6種雜環化合物、丁酸及羥基脲處理之人類初級紅血球系培養物的mRNA，來測定其對γ血球蛋白基因表現之誘導倍數。a指IC₅₀ 值為使細胞增殖速率降低50%的個別化合物濃度。b指有效濃度(EC)定義為誘導γ血球蛋白基因表現達1.88倍(即羥基脲在其IC₅₀ 下誘導之γ血球蛋白基因之倍數)的化合物濃度。以IC₅₀ 與EC之比率(IC₅₀ /EC)計算治療窗，其反映雜環化合物相對於羥基脲之益處。

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Claims (43)

1. 一種誘導γ血球蛋白之活體外方法，其包含：使細胞與有效量之式(I-a)化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽接觸，其中：R¹ 、R² 、R³ 、R⁴ 、R^6a 及R^6b 各自獨立地選自氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、芳基、-OR^A 、-OC(O)R^A 、-SR^A 、-N(R^B )₂ 、-N(R^A )C(O)R^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-CN、-NO₂ 、-C(O)R^A 、-C(O)OR^A 、-S(O)R^A 、-SO₂ R^A 、-SO₂ N(R^B )₂ 及-NHSO₂ R^B ；各R⁵ 獨立地選自氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、雜環基、芳基、-OR^A 、-OC(O)R^A 、-SR^A 、-N(R^B )₂ 、-N(R^A )C(O)R^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-CN、-NO₂ 、-C(O)R^A 、-C(O)OR^A 、-S(O)R^A 、-SO₂ R^A 、-SO₂ N(R^B )₂ 及-NHSO₂ R^B ；各R^A 獨立地選自氫、烷基、烯基、炔基及芳基；各R^B 獨立地選自氫、烷基、烯基、炔基及芳基；n為0、1、2、3或4。
2. 一種醫藥組合物之用途，其用於製造用以治療β-地中海型貧血之藥物，其中該醫藥組合物包含式(I-a)化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物，其中：R¹ 、R² 、R³ 、R⁴ 、R^6a 及R^6b 各自獨立地選自氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、芳基、-OR^A 、-OC(O)R^A 、-SR^A 、-N(R^B )₂ 、-N(R^A )C(O)R^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-CN、-NO₂ 、-C(O)R^A 、-C(O)OR^A 、-S(O)R^A 、-SO₂ R^A 、-SO₂ N(R^B )₂ 及-NHSO₂ R^B ；各R⁵ 獨立地選自氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、芳基、-OR^A 、-OC(O)R^A 、-SR^A 、-N(R^B )₂ 、-N(R^A )C(O)R^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-CN、-NO₂ 、-C(O)R^A 、-C(O)OR^A 、-S(O)R^A 、-SO₂ R^A 、-SO₂ N(R^B )₂ 及-NHSO₂ R^B ；各R^A 獨立地選自氫、烷基、烯基、炔基及芳基；各R^B 獨立地選自氫、烷基、烯基、炔基及芳基；n為0、1、2、3或4；及醫藥學上可接受之賦形劑。
3. 一種醫藥組合物之用途，其用於製造用以治療鐮刀狀細胞型貧血之藥物，其中該醫藥組合物包含式(I-a)化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物，其中：R¹ 、R² 、R³ 、R⁴ 、R^6a 及R^6b 各自獨立地選自氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、芳基、-OR^A 、-OC(O)R^A 、-SR^A 、-N(R^B )₂ 、-N(R^A )C(O)R^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-CN、-NO₂ 、-C(O)R^A 、-C(O)OR^A 、-S(O)R^A 、-SO₂ R^A 、-SO₂ N(R^B )₂ 及-NHSO₂ R^B ；各R⁵ 獨立地選自氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、芳基、-OR^A 、-OC(O)R^A 、-SR^A 、-N(R^B )₂ 、-N(R^A )C(O)R^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-CN、-NO₂ 、-C(O)R^A 、-C(O)OR^A 、-S(O)R^A 、-SO₂ R^A 、-SO₂ N(R^B )₂ 及-NHSO₂ R^B ；各R^A 獨立地選自氫、烷基、烯基、炔基及芳基；各R^B 獨立地選自氫、烷基、烯基、炔基及芳基；n為0、1、2、3或4；及醫藥學上可接受之賦形劑。
4. 如請求項2或3之用途，其中該化合物具有式(II)， 或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物。
5. 如請求項2或3之用途，其中R¹ 、R² 、R³ 、R⁴ 及R⁵ 各自獨立地選自-H、-OH、-Cl、-Br、-F、C_1-6 烷基、C_1-6 烷氧基、炔基、芳基、-NO₂ 、-N(R^B )₂ 、-C(O)CH₃ 、-CO₂ H、-C(O)OR^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-CN、-SO₂ -烷基及-SO₂ -芳基。
6. 如請求項5之用途，其中R¹ 、R² 、R³ 、R⁴ 及R⁵ 各自獨立地選自-H、-OH、-Cl、-Br、-F、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、-C≡C-芳基、苯基、萘基、-NO₂ 、-NH-C_1-6 烷基、-C(O)CH₃ 、-CO₂ H、-CO₂ Et、-CONH-芳基、-CN、-SO₂ -烷基及-SO₂ -芳基。
7. 如請求項2或3之用途，其中R¹ 、R² 、R³ 及R⁴ 中至少兩者為氫。
8. 如請求項7之用途，其中R¹ 及R⁴ 為氫。
9. 如請求項7之用途，其中R³ 及R⁴ 為氫。
10. 如請求項7之用途，其中R¹ 及R² 為氫。
11. 如請求項2或3之用途，其中R¹ 、R² 、R³ 及R⁴ 中至少兩者為氫，且R⁵ 為氫。
12. 如請求項2或3之用途，其中該化合物具有式(III)、(IV)或(V)： 或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物。
13. 如請求項2或3之用途，其中R¹ 、R² 、R³ 及R⁴ 中之一者具有下式： 其中R¹² 及R¹³ 獨立地選自氫、-CO₂ H、-C(O)OR^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-OH、-NO₂ 、-CN、鹵素、烷基、芳基及雜環基，或R¹² 及R¹³ 與介於其間之原子一起形成碳環；且R¹⁴ 係選自氫、-CO₂ H、-C(O)OR^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-OH、-NO₂ 、-CN、鹵素、烷基及芳基。
14. 如請求項13之用途，其中R¹² 及R¹³ 各自為-CO₂ H。
15. 如請求項13之用途，其中R¹² 、R¹³ 及R¹⁴ 各自為-CO₂ H。
16. 如請求項2或3之用途，其中化合物具有式(VI)或(VII)： 或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物， 其中R¹² 、R¹³ 及R¹⁴ 各自獨立地選自氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、芳基、-OR^A 、-OC(O)R^A 、-SR^A 、-N(R^B )₂ 、-N(R^A )C(O)R^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-CN、-NO₂ 、-C(O)R^A 、-C(O)OR^A 、-S(O)R^A 、-SO₂ R^A 、-SO₂ N(R^B )₂ 及-NHSO₂ R^B ；或R¹² 及R¹³ 與介於其間之原子一起形成碳環；各R^A 獨立地選自氫、烷基、烯基、炔基及芳基；且各R^B 獨立地選自氫、烷基、烯基、炔基及芳基。
17. 如請求項16之用途，其中R¹ 、R³ 、R⁵ 、R¹² 、R¹³ 及R¹⁴ 各自獨立地選自-H、-OH、-Cl、-Br、-F、C_1-6 烷基、C_1-6 烷氧基、炔基、芳基、-NO₂ 、-N(R^B )₂ 、-C(O)CH₃ 、-CO₂ H、-C(O)OR^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-CN、-SO₂ -烷基及-SO₂ -芳基。
18. 如請求項17之用途，其中R¹ 、R³ 、R⁵ 、R¹² 、R¹³ 及R¹⁴ 各自獨立地選自-H、-OH、-Cl、-Br、-F、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、-C≡C-芳基、苯基、萘基、-NO₂ 、-NH-C_1-6 烷基、-C(O)CH₃ 、-CO₂ H、-CO₂ Et、-CONH-芳基、-CN、-SO₂ -烷基及-SO₂ -芳基。
19. 如請求項16之用途，其中R¹ 、R³ 、R⁵ 、R¹² 、R¹³ 及R¹⁴ 各自獨立地選自氫、-CO₂ H、-C(O)OR^A 、-C(O)N(R^B )₂ 、-OH、-NO₂ 、-CN、鹵素、烷基及芳基。
20. 如請求項16之用途，其中R¹² 及R¹³ 與介於其間之原子一起形成碳環。
21. 如請求項16之用途，其中R¹² 及R¹³ 各自為-CO₂ H。
22. 如請求項16之用途，其中R¹² 、R¹³ 及R¹⁴ 各自為-CO₂ H。
23. 如請求項16之用途，其中R³ 、R¹² 、R¹³ 及R¹⁴ 各自為-CO₂ H。
24. 如請求項16之用途，R¹ 、R¹² 及R¹³ 各自為-CO₂ H。
25. 如請求項16之用途，其中R¹ 、R¹² 、R¹³ 及R¹⁴ 各自為-CO₂ H。
26. 如請求項16之用途，其中R⁵ 為氫。
27. 如請求項2或3之用途，其中R² 不為-C(O)R^A 。
28. 如請求項2或3之用途，其中R² 不為-C(O)CH₃ 。
29. 如請求項2或3之用途，其中R³ 不為-NH-烯丙基。
30. 如請求項2或3之用途，其中R² 不為-NHCH₂ CH₂ OH。
31. 如請求項2或3之用途，其中R¹ 及R⁴ 不為-NO₂ 。
32. 如請求項2或3之用途，其中當n為2時，各R⁵ 不同時為甲基。
33. 如請求項2或3之用途，其中該化合物具有下式中之一者： 或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物或水合物。
34. 如請求項2或3之用途，其中該組合物經口投與。
35. 如請求項2或3之用途，其中該組合物非經腸投與。
36. 如請求項2或3之用途，其中該藥物與另一治療劑組合投與。
37. 如請求項2或3之用途，其中該組合物展現比羥基脲大的治療窗。
38. 如請求項2或3之用途，其中該組合物展現比丁酸鈉大的治療窗。
39. 一種鑑別γ血球蛋白之誘導劑之方法，其包含：(a)將測試化合物與MEL細胞一起培育，該MEL細胞含有連接於第一螢光啟動子之人類γ血球蛋白及連接於第二螢光報導體之人類β血球蛋白啟動子；及(b)測定相較於背景信號之螢光強度。
40. 如請求項39之方法，其中該螢光為DsRed。
41. 一種MEL細胞，其包含連接於第一螢光啟動子之人類γ血球蛋白及連接於第二螢光報導體之人類β血球蛋白啟動子。
42. 如請求項41之細胞，其中該第一螢光啟動子為DsRed。
43. 如請求項41或42之細胞，其中該第二螢光啟動子為d2EGFP。