JP5597427B2 - 抗がん剤 - Google Patents
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パルミチン酸 (2.6 g, 10 mmol、和光純薬工業社) を塩化チオニル (5mL、和光純薬工業社)と2時間還流した後、過剰の塩化チオニルを留去し(減圧下)、この中に、4-ピペリジノピペリジン (1.7 g, 10 mmol、和光純薬工業社) を含むテトラヒドロフラン溶液を加え、3時間還流した。反応液は炭酸水素ナトリウム溶液に滴下し、酢酸エチルで分液した。酢酸エチル層は濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒:クロロホルム−メタノール 10:1)で精製した。化合物1は、淡褐色の結晶となって固化した(融点:低すぎて測定不能)。
パルミチン酸 (2.6 g, 10 mmol、和光純薬工業社) と1-ヒドロキシベンゾトリアゾール (1.4 g, 11 mmol、和光純薬工業社) をジメチルホルムアミド40 mlに溶解し、4-ピペリジノピペリジン (1.7 g, 11 mmol、和光純薬工業社) を加え、氷浴上で15分間撹拌した(A液)。別に縮合剤である1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド(和光純薬工業社)を20 mlのジメチルホルムアミドに溶解した (B液)。A液を氷浴上で撹拌しながらB液を滴下した。氷浴上で2時間、次いで室温にて12時間撹拌を続け、下記の処理を行った。
(処理法)
反応生成物にクロロホルム50 mlを加え、次の (1)および(2) の溶液と分液操作を行った。
(1) 1.0%塩酸溶液(2回)、(2) 飽和食塩水(2回)
得られたクロロホルム層は濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒:ヘキサン−酢酸エチル混合液)にて精製し、化合物2を得た。
1.試薬の調製
化合物2は、実施例2で製造したものを蒸留水に溶かし、抗がん活性の測定に使用した。ギムザ染色液(Sigma社: Cat. No. S128-4L)の25 mLを蒸留水475 mLにて希釈して使用した。大腸がん治療に使用される代表的な抗がん剤の5-フルオロウラシル(5-fluorouracil)(以下、「5-FU」ということがある)を抗がん活性の比較対象とする薬剤とした。5-FUは、ジメチルスルホキシド(DMSO)(Sigma 社: Cat. No. D8418-250ML)に溶かして使用した。
2.ヒトがん細胞株の培養
ヒト大腸がん細胞株HT29(American Type Culture Collection(ATCC))とヒト大腸正常細胞株FHC(American Type Culture Collection(ATCC))をそれぞれ10 %ウシ胎児血清(FBS) (BioWest社: Cat. No. S1500)添加DMEM培地 (和光純薬工業社: Cat. No. 041-29775)中で37℃、5%CO2条件下にて培養した。培養装置は、Napco 5400 CO2インキュベーター(Napco社)を使用した。
ヒト大腸がん細胞株HT29を6ウエル・プレート(日本ベクトン・デイッキンソン社、BD
Falcon(TM): Cat. No. 353046)に500細胞/ウエルの濃度で蒔いて一晩培養した後、化合物2と5-FUをそれぞれ0、0.3、0.7、1.5、3.0、6.0、12.0、25.0μMの濃度でがん細胞に暴露し、5日間培養した(0μMの培地には、化合物2は蒸留水を、5-FUはDMSOを0.1%になるようにそれぞれ添加した)。培養後、各ウエルをリン酸緩衝生理食塩水(phosphate buffered saline 、以下「PBS」と略す)で2回洗浄し、各ウエル当たり2mLの100%メタノールで10分間、がん細胞を固定した。風乾し、各ウエル当たり2mLのギムザ染色液で30分間染色した後水道水で洗浄した。風乾後、染色されたがん細胞のコロニー数を目視にて計測した。
化合物2のヒト大腸正常細胞株FHCとヒト大腸がん細胞株HT29に対する毒性を検討した。各細胞株をそれぞれ6cmディッシュ (Nalge Nunc International社: Cat. No. 150288)に2x104細胞/ディッシュの濃度で蒔き一晩培養した後、各細胞株に対して化合物2を0、0.25、1.0μMの濃度で暴露し、3日間培養した(0μMの培地には、蒸留水を0.1%になるように添加した)。培養後、培地を除去し0.25%トリプシン-EDTA溶液(Sigma 社:Cat. No. T4049)1 mLを加え10分間37℃でインキュベーションした後、細胞をディッシュから剥がした。剥がした細胞に3mLの1xPBSを添加し細胞をよくほぐした後Coulter Counter Z1 (Becton Dickinson社)にて細胞数を測定した。
(%)とし、横軸は化合物2の濃度(μM)とした。図2のグラフは、化合物2の濃度が0μMのときの細胞生存率を100%として、化合物2の各濃度の細胞生存率を換算した。その結果、ヒト大腸がん細胞株HT29の細胞が60%死滅した時の化合物2の濃度は1μMであり、この濃度における大腸正常細胞株FHCの細胞生存率は85%であった。このことにより、化合物2は、1μMまでの抗がん活性を呈する濃度において正常細胞に対する毒性は極めて少ないことが示唆された。
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