TWI445696B - 標靶人類胸線核苷酸激酶誘導惡性腫瘤中的ｄｎａ修復毒性 - Google Patents

標靶人類胸線核苷酸激酶誘導惡性腫瘤中的ｄｎａ修復毒性 Download PDF

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TWI445696B
TWI445696B TW100143060A TW100143060A TWI445696B TW I445696 B TWI445696 B TW I445696B TW 100143060 A TW100143060 A TW 100143060A TW 100143060 A TW100143060 A TW 100143060A TW I445696 B TWI445696 B TW I445696B
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Jim Min Fang
Chun Mei Hu
Ming Tyng Yeh
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Description

標靶人類胸腺核苷酸激酶誘導惡性腫瘤中的DNA修復毒性
本發明係關於新穎的TMPK抑制劑組成物，及其使用方法。尤其，本發明係關於新穎的TMPK抑制劑組成物，合成方法，及其伴隨核醣核苷酸還原酶活性增高而造成惡性腫瘤細胞中dUTP-介導之DNA修復的治療製劑。此類新穎的TMPK抑制劑組成物及治療製劑，可作用做為一種新穎的化療增敏劑，可用於治療或預防癌症之方法中。
有關癌症化療的主要問題在於，正常組織中腫瘤細胞與快速分裂細胞之間欠缺差異化。此會造成實質上的副作用，而可能在長期治療下導致由該項治療所誘發之繼發性癌症。化學治療劑常會造成一般性細胞毒性，且由於有數種DNA修復途徑之存在，能使腫瘤細胞藉由移除損傷而得以存活(Helleday等人,2008)。
已鑑定出針對檢查點途徑或DNA修復機制之小分子抑制劑，且已使用於臨床試驗做為細胞之放射治療-或化學治療的增敏作用化合物(Bolderson等人,2009)。基於在腫瘤生成期間檢查點與DNA修復變化之間的差異，可發現此等策略會隨著腫瘤的檢查點脈絡種類不同(Jackson與Bartek,2009；Jiang等人,2009)，而使得治療效果不同。
再者，DNA損壞反應之亂序排列會在治療期間造成DNA錯誤不斷累積，而可能誘發繼發性腫瘤發展(Mimeault等人,2008)。於是，研發一種不會中斷檢查點網路，而能以低副作用專一性誘導癌症細胞死亡之化療增敏療程，是重要的。
於DNA修復過程中的一項重要程序為，供給平衡且足夠量之四種dNTPs(Niida等人,2010b)。由核醣核苷酸還原酶(RNR)-介導之還原作用，不僅可直接從對應之NDPs產生dADP、dGDP與dCDP，亦會產生dUDP(Nordlund與Reichard,2006)。RNR係由R1與R2次單位所組成，其中R2的量是受細胞週期調控(Bjorklund等人,1992；Engstrom等人,1985)，且往往在腫瘤細胞中被增高(Jensen等人,1994；Zhang等人,2009)。已有報導指出，R2過量表現會產生致癌可能性(Fan等人,1998)。有一種R2類似物(p53R2)可取代R2來形成RNR酵素，且其功能對於靜止態細胞之DNA修復是很重要的(Hakansson等人,2006；Pontarin等人,2011)。核苷酸二磷酸激酶會將所有此等dNDPs轉化成dNTPs，包括dUTP(Mathews,2006；Reichard,1988)。由dUTPase進行之dUTP的焦磷酸分解作用，或dCMP之脫胺作用會形成dUMP，其再由胸腺核苷酸合成酶(TS)轉化成dTMP(Mathews,2006;Reichard,1988)。胸腺嘧啶核苷激酶(TK)之作用也會從胸腺嘧啶核苷產生dTMP(Arner與Eriksson,1995)。胸腺核苷酸激酶(TMPK)接著催化dTDP之形成(Ostermann等人,2000；Reichard,1988)。因此，dTDP是唯一的dNDP，其形成不能直接從RNR反應衍生出來。
習知的抗癌療法常會直接誘發基因毒性(Garg等人,2010)。舉例而言，胸腺核苷酸合成酶(TS)抑制劑(5-FU或5-FdUrd)會阻斷dUMP轉化成dTMP，而造成dUTP累積以及5-FdUTP形成(Longley等人,2003)。因為DNA聚合酶無法辨別dUTP和dTTP(Bessman等人,1958；Mosbaugh,1988)，所以過量的dUTP與5FdUTP會被錯誤嵌入DNA中，而引發因DNA損壞所誘導的細胞死亡(Ahmad等人,1998)。結果，此類抗-代謝物會由於錯誤的核苷酸嵌入，而產生過度的DNA損壞並造成癌細胞死亡，然而同時對正在生長的正常細胞而言，亦具有高毒性(Ahmad等人,1998)。
已知，增生細胞中之雙股斷裂(DSBs)主要是經由同源重組作用(HR)進行修復，其中單一DSB就需要1萬個以上新的dNTPs嵌入(Robert等人,2011；San Filippo等人,2008)。因此，在供給dNTPs方面之功能對於HR修復係必要的(Burkhalter等人,2009)。報告指出，獨立地阻斷RNR會誘導產生DNA損壞訊號及複製逆境(Helleday等人,2008)。因為dTDP形成特別需要TMPK功能，故吾等推測阻斷TMPK可能會減少DSBs修復的效能，而使腫瘤細胞對基因毒性損傷敏感。
於是，有需要研發出能誘導癌細胞死亡之治療製劑，當單獨或與其他抗癌療法組合使用時，亦能同時減低由此類治療所造成之毒性作用。
本發明係提供新穎的組成物，其合成方法及其使用方法。更特別地，本發明已鑑定得到包含TMPK抑制劑之新穎組成物與治療製劑，及其用於治療或預防癌症的方法。
本發明係提供一種用於抑制胸腺核苷酸激酶(TMPK)之組成物，其包含一治療上有效量之式(I)化合物：
其中X=CR5 及N，其中R5 為選自氫、一直鏈、支鏈或環狀烷基、一直鏈、支鏈或環狀烯基、一直鏈、支鏈或環狀烷氧基、氟化烷基、過氟化烷基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、雜芳烷基、雜芳烯基、雜芳炔基、芳基、雜芳基之取代基，視需要經一或多個諸如鹵素、烷基、羥基、烷氧基、胺基、硝基、氰基及羰基之取代基取代；Y=S、O、C=O、NR6 ，其中R6 為選自氫、一直鏈、支鏈或環狀烷基、芳烷基、雜芳烷基、雜芳烯基、芳基、雜芳基之取代基，視需要經一或多個諸如鹵素、烷基、羥基、烷氧基、胺基、硝基、氰基及羰基之取代基取代；R1 、R2 、R3 及R4 為獨立地選自氫、一直鏈、支鏈或環狀烷基、一直鏈、支鏈或環狀烯基、一直鏈、支鏈或環狀烷氧基、氟化烷基、過氟化烷基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、雜芳烷基、雜芳烯基、雜芳炔基、芳基、雜芳基之取代基，視需要經一或多個諸如鹵素、烷基、羥基、烷氧基、胺基、硝基、氰基及羰基之取代基取代；或其醫藥上可接受之鹽類、水合物或溶劑合物。
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含至少一種下列結構：
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含下列結構：
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含至少一種下列結構：
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含至少一種下列結構：
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含下列結構：
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含至少一種下列結構：
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含下列結構：
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含至少一種下列結構：
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含至少一種下列結構：
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含下列結構：
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含下列結構：
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含至少一種下列結構：
於有些具體實施例，本發明之組成物能夠抑制TMPK活性。於其他具體實施例，本發明之組成物能夠抑制細胞中的dTTP含量。於有些具體實施例，本發明之組成物能夠抑制腫瘤生長、DNA損壞檢查點、DNA錯配修復、核苷酸切割修復、雙股斷裂修復、DNA解螺旋酶功能、訊號傳遞、細胞週期調控或細胞凋亡。
於有些具體實施例，該雙股斷裂修復可能與放射療法、化學療法或免疫調制療法關連。於有些具體實施例，該化學療法包含以亞德里亞黴素進行之治療。
於有些具體實施例，本發明之組成物係選擇性地將毒性標靶至帶有DNA損傷的癌細胞。
於有些具體實施例，本發明之組成物能夠使癌細胞對放射療法、化學療法或免疫調制療法敏感。於有些具體實施例，該化學療法包含以亞德里亞黴素進行之治療。
於有些具體實施例，本發明之組成物不會導致基因毒性副作用。
於有些具體實施例，本發明之組成物具有IC50 值為約10 μM或以下。於有些具體實施例，其具有IC50 值為約5 μM或以下。於有些具體實施例，該組成物具有IC50 值為約1 μM或以下。於有些具體實施例，該組成物具有IC50 值為約0.5 μM或以下。又於其他具體實施例，該組成物具有IC50 值為約0.25 μM或以下。於其他具體實施例，該組成物具有IC50 值為約0.1 μM或以下。
於有些具體實施例，本發明之組成物係每日投藥一次，連續投藥3天。於有些具體實施例，本發明之組成物係每日投藥一至二次。於有些具體實施例，本發明之組成物係以約5 mg/kg至約30 mg/kg之劑量投藥。
本發明進一步提供一種包含本發明所述組成物與醫藥上可接受之載體的醫藥組成物。
本發明進一步提供一種製造本發明所述組成物之方法，其包含如圖1所示之步驟a-u。
本發明進一步提供一種使癌細胞對放射療法、化學療法或免疫調制療法增敏之方法，其包含將該癌細胞曝露於一治療上有效量之本發明組成物。
本發明亦提供一種使癌細胞對放射療法、化學療法或免疫調制療法增敏之方法，其包含將該癌細胞曝露於一治療上有效量之抑制TMPK活性的藥劑。於有些具體實施例，該藥劑為本發明之組成物。
本發明進一步提供一種防止癌細胞進行雙股斷裂修復之方法，其包含將該癌細胞曝露於一治療上有效量之本發明組成物。
本發明亦提供一種選擇性地將毒性標靶至帶有DNA損傷的癌細胞之方法，其包含將該癌細胞曝露於一治療上有效量之本發明組成物。
於有些具體實施例，該癌細胞係選自乳癌細胞、肝腫瘤細胞、大腸癌細胞、胰臟癌細胞、食道癌細胞、膀胱癌細胞、卵巢癌細胞、皮膚癌細胞、肝癌細胞、胃癌細胞、前列腺癌細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、直腸癌細胞、腎臟癌細胞、甲狀腺癌細胞、腦癌細胞、黑色素瘤、肉瘤、白血病、骨癌細胞及子宮內膜癌細胞。
於有些具體實施例，該方法進一步包含將該癌細胞曝露於至少一種選自抗癌劑、抗病毒劑、消炎藥及免疫抑制劑之額外治療劑。
本發明亦提供一種於有需要之個體中治療或預防癌症之方法，其包含將一治療上有效量之本發明組成物投藥予該個體。
於有些具體實施例，該組成物係經由吸入、鼻液劑、氣溶膠噴霧、口服、靜脈內、腹膜內、皮下，經由持續釋放系統或其組合形式進行投藥。
於有些具體實施例，該方法進一步包含施予至少一種選自放射療法、化學療法或免疫調制療法之額外抗癌治療法。
於有些具體實施例，該抗癌治療法係於投藥該組成物之前進行。於有些具體實施例，該抗癌治療法係與該組成物之投藥同時進行。
於有些具體實施例，該癌症係選自乳癌、肝腫瘤、大腸癌、胰臟癌、食道癌、膀胱癌、卵巢癌、皮膚癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、結腸癌、肺癌、直腸癌、腎臟癌、甲狀腺癌、腦癌、黑色素瘤、肉瘤、白血病、骨癌及子宮內膜癌。
於有些具體實施例，該個體為哺乳動物。
參酌以下描述之詳細說明、實施例及從屬之申請專利範圍，將可更加了解本發明的其他特徵、目的與優點。
在本發明所使用的特殊術語有其原本的意義，如下所用的某些特殊術語是提供熟悉該技藝者能更進一步了解本發明內容。為了方便起見一些特殊術語將會使用斜體字或引號標示出來，但這些被標示出來的部分並不會影響到特殊術語本身的範圍或意義，就如同在本文中未被標示的文字一樣，也就是說同樣的事情會有一個以上的說法。本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。
除非另有規定，本發明所使用的科技術語具有和習於本發明所屬技藝，具有通常知識者所共通了解的相同之定義。
為有助於了解本專利申請案及容易引述之目的，以下就本發明所使用的一些術語和縮寫做出定義。
本發明所使用的術語“治療”及“處理”意指，將一治療劑投藥或施用予個體，或是對個體進行一種治療程序或形態，以達到能獲得對某一疾病或健康狀態之治療助益的目的。
本發明所使用的術語“防止”、“抑制”、“減低”或此等術語之任意變化，包括為達到所希望結果的任何可測量到之減少或完全抑制。例如，相較於一般正常活性或徵狀，可能減少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或以上，或其任何可衍生之範圍。
本發明所使用的術語“投藥”及“遞送”係用來描述，藉其可將本發明之組成物投藥或遞送予個體、標靶細胞或與該標靶細胞直接並列之位置的過程。術語“被投藥”與“被遞送”可互相交替使用。
本發明所使用的術語“患者”、“治療對象”與“個體”可於本文互相交替使用，且意指欲接受治療及/或從其取得生物樣本之哺乳動物(例如人類)。
本發明所使用的術語“有效的”意指，足夠達成所希望、所預期或所想要之結果的。例如，“有效量”可為某一化合物足以產生治療助益之量。
本發明所使用的術語“治療上有效的”或“治療上有助益的”意指，任何可促進或增強個體有關醫藥治療或狀況之好處的事物。此包括(但不限定於)減少疾病之病徵或症狀的發生、頻數、持續時間或嚴重性。
本發明所使用的術語“治療上有效量”意指，本發明之組成物可有效產生所希望的治療助益之量。
本發明所使用的術語“診斷的”、“診斷”及“經過診斷的”意指，鑑定出某種致病性狀態之存在或特性。
本發明所使用的術語“安全且有效的量”意指，一組成物其足以產生所希望之治療反應，且相應於本發明所使用的合理助益/危險比例時，無不適當的有害副作用(例如，毒性、刺激性或過敏反應)之量。
特定之安全且有效的量或治療上有效的量，將隨著諸如欲受治療之特殊病況、患者之身體狀況、欲受治療之哺乳動物或動物種類、治療時間、目前接受(若有的話)之療法性質與所使用的特別配方，及該等化合物或其衍生物之結構等因素而有所差異。
本發明所使用的術語“烷基”(單獨或與其他術語結合)意指一飽和脂族烴基，包括具有1至20個碳原子之直鍵及支鏈基團(於本文中每逢一數值範圍，例如在此所列之"1-20"，則意指該基團(在此情況為烷基)可含有1個碳原子，2個碳原子，3個碳原子，等等，至多且包括20個碳原子)。含有1至4個碳原子之烷基稱做低級烷基。當所述之低級烷基不帶有取代基時，將彼等稱做未經取代之低級烷基。更佳地，烷基為一具有1至10個碳原子之中等大小的烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、戊基等類。最佳地，其為一具有1至4個碳原子之低級烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、異丁基或第三丁基等類。該烷基可為經取代或未經取代的。當其為經取代，所述之取代基較佳係一或多個(更佳地一至三個，甚至更佳地一或二個)獨立選自由鹵基、羥基、未經取代之低級烷氧基、視需要經取代一或多個(較佳地一、二或三個)各別獨立為鹵基、羥基、未經取代之低級烷基或未經取代之低級烷氧基之基團取代的芳基、視需要經取代一或多個(較佳地一、二或三個)各別獨立為鹵基、羥基、未經取代之低級烷基或未經取代之低級烷氧基之基團取代的芳氧基、環內具有1至3個氮原子，環內之碳視需要地經一或多個(較佳地一、二或三個)各別獨立為鹵基、羥基、未經取代之低級烷基或未經取代之低級烷氧基之基團取代的6-員雜芳基、具有1至3個選自氮、氧及硫之雜原子，而該基團中之碳與氮原子係視需要地經一或多個(較佳地一、二或三個)各別獨立為鹵基、羥基、未經取代之低級烷基或未經取代之低級烷氧基之基團取代的5-員雜芳基、具有1至3個選自氮、氧及硫之雜原子，而該基團中之碳與氮(若存在)原子係視需要地經取代一或多個(較佳地一、二或三個)各別獨立為鹵基、羥基、未經取代之低級烷基或未經取代之低級烷氧基之基團取代的5-或6-員雜環基、巰基、(未經取代之低級烷基)硫基、視需要經取代一或多個(較佳地一、二或三個)各別獨立為鹵基、羥基、未經取代之低級烷基或烷氧基之基團取代的芳基硫基、氰基、醯基、硫代醯基、O-胺甲醯基、N-胺甲醯基、O-硫代胺甲醯基、N-硫代胺甲醯基、C-醯胺基、N-醯胺基、硝基、N-磺醯胺基、S-磺醯胺基、RS(O)--、RS(O)2 --、--C(O)OR、RC(O)O--、及-NR13 R14 所組成之組群的取代基，其中R13 及R14 係獨立地選自由氫、未經取代之低級烷基、三鹵甲基、環烷基、雜環基及視需要經取代一或多個(較佳地一、二或三個)各別獨立為鹵基、羥基、未經取代之低級烷基或烷氧基之基團取代的芳基所組成之組群。
較佳地，所述之烷基係經一或二個獨立選自由羥基、具有1至3個選自氮、氧及硫之雜原子，而該基團中之碳與氮(若存在)原子係視需要地經一或多個(較佳地一、二或三個)各別獨立為鹵基、羥基、未經取代之低級烷基或未經取代之低級烷氧基之基團取代的5-或6-員雜環基、具有1至3個選自氮、氧及硫之雜原子，而該基團中之碳與氮原子係視需要地經一或多個(較佳地一、二或三個)各別獨立為鹵基、羥基、未經取代之低級烷基或未經取代之低級烷氧基之基團取代的5-員雜芳基、環內具有1至3個氮原子，環內之碳係視需要地經一或多個(較佳地一、二或三個)各別獨立為鹵基、羥基、未經取代之低級烷基或未經取代之低級烷氧基之基團取代的6-員雜芳基、或--NR13 R14 所組成之組群的取代基取代，其中R13 及R14 係獨立地選自由氫及烷基。甚至更佳地，所述之烷基係經一或二個各別獨立地為羥基、二甲胺基、乙胺基、二乙胺基、二丙胺基、吡咯啶基、N-六氫吡啶基、嗎啉基、六氫吡嗪基、4-低級烷基六氫吡嗪基、苯基、咪唑基、吡啶基、嗒嗪基、嘧啶基、噁唑基、三嗪基等類的取代基取代。
本發明所使用的術語“芳香族”、“芳族”或“芳基”(單獨或與其他術語結合)意指，其含有6至約14個碳原子之芳香族環基，例如6員單環、10員雙環或14員三環之環系。芳香族環之實例包括苯基、萘基、聯苯基、茚基及蒽。
本發明所使用的術語“鹵素”(單獨或與其他術語結合)意指，氟取代基(“氟基”，可書寫成--F)、氯取代基(“氯基”，可書寫成--Cl)、溴取代基(“溴基”，可書寫成--Br)、或碘取代基(“碘基”，可書寫成--I)。
本發明所使用的術語“環烷基”意指一3至8員全碳之單環、全碳之5-員/6-員或6-員/6-員稠合的雙環、或多環稠合的環(稠合環系意指該系統中之各環與該系統中之另一環共用一對相鄰的碳原子)基團，其中一或多個環可含有一或多個雙鍵，但各環皆不具有完全共軛的pi-電子系統。
環烷基之實例為(但不限制於)環丙烷、環丁烷、環戊烷、環戊烯、環己烷、環己二烯、金剛烷、環庚烷、環庚三烯等類。環烷基可為經取代或未經取代的。當其為經取代時，所述之取代基較佳係一或多個(更佳地一或二個)獨立選自，由未經取代之低級烷基、三鹵烷基、鹵基、羥基、未經取代之低級烷氧基、視需要經取代一或多個(較佳地一、二或三個)各別獨立為鹵基、羥基、未經取代之低級烷基或未經取代之低級烷氧基之基團取代的芳基、視需要經取代一或多個(較佳地一、二或三個)各別獨立為鹵基、羥基、未經取代之低級烷基或未經取代之低級烷氧基之基團取代的芳氧基、環內具有1至3個氮原子，環內之碳視需要地經一或多個(較佳地一、二或三個)各別獨立為鹵基、羥基、未經取代之低級烷基或未經取代之低級烷氧基之基團取代的6-員雜芳基、具有1至3個選自氮、氧及硫之雜原子，而該基團中之碳與氮原子係視需要地經一或多個(較佳地一、二或三個)各別獨立為鹵基、羥基、未經取代之低級烷基或未經取代之低級烷氧基之基團取代的5-員雜芳基、具有1至3個選自氮、氧及硫之雜原子，而該基團中之碳與氮(若存在)原子係視需要地經取代一或多個(較佳地一、二或三個)各別獨立為鹵基、羥基、未經取代之低級烷基或未經取代之低級烷氧基之基團取代的5-或6-員雜環基、巰基、(未經取代之低級烷基)硫基、視需要經取代一或多個(較佳地一、二或三個)各別獨立為鹵基、羥基、未經取代之低級烷基或烷氧基之基團取代的芳基硫基、氰基、醯基、硫代醯基、O-胺甲醯基、N-胺甲醯基、O-硫代胺甲醯基、N-硫代胺甲醯基、C-醯胺基、N-醯胺基、硝基、N-磺醯胺基、S-磺醯胺基、RS(O)--、RS(O)2 --、--C(O)OR、RC(O)O--、及-NR13 R14 (其中R13 及R14 係如前述所定義)所組成之組群的取代基。
本發明所使用的術語“烯基”(單獨或與其他術語結合)意指，由至少兩個碳原子與至少一個碳-碳雙鍵所組成之低級烷基(如本文所定義)。代表性實例包括(但不限定於)乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-、2-或3-丁烯基等類。
本發明所使用的術語“炔基”(單獨或與其他術語結合)意指，由至少兩個碳原子與至少一個碳-碳參鍵所組成之低級烷基(如本文所定義)。代表性實例包括(但不限定於)乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-、2-或3-丁炔基等類。
本發明所使用的術語“芳基”意指，一群含5至12個具有完全共軛的pi-電子系統之碳原子的全碳單環或稠合多環(亦即，彼等共用相鄰的碳原子對之環)。芳基基團之實例為(但不限定於)苯基、萘基及蒽基。芳基可為經取代或未經取代的。當其為經取代時，所述之取代基較佳係一或多個(更佳地一、二或三個，甚至更佳地一或二個)獨立選自，由未經取代之低級烷基、三鹵烷基、鹵基、羥基、未經取代之低級烷氧基、巰基、(未經取代之低級烷基)硫基、氰基、醯基、硫代醯基、O-胺甲醯基、N-胺甲醯基、O-硫代胺甲醯基、N-硫代胺甲醯基、C-醯胺基、N-醯胺基、硝基、N-磺醯胺基、S-磺醯胺基、RS(O)--、RS(O)2 --、--C(O)OR、RC(O)O--、及-NR13 R14 (其中R13 及R14 係如前述所定義)所組成之組群的取代基。較佳地，所述之芳基係視需要經一或二個獨立選自鹵基、未經取代之低級烷基、三鹵烷基、羥基、巰基、氰基、N-醯胺基、單或二烷基胺基、羧基或N-磺醯胺基之取代基取代。
本發明所使用的術語“雜芳基”意指，一群由5至12個含有一、二或三個選自N、O或S之環雜原子，而剩餘之環原子為C，且又具有完全共軛的pi-電子系統之碳原子的單環或稠合多環(亦即，彼等共用相鄰的碳原子對之環)。未經取代的雜芳基基團之實例為(但不限定於)吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、異喹啉、嘌呤及咔唑。雜芳基可為經取代或未經取代的。當其為經取代時，所述之取代基較佳係一或多個(更佳地一、二或三個，甚至更佳地一或二個)獨立選自，由未經取代之低級烷基、三鹵烷基、鹵基、羥基、未經取代之低級烷氧基、巰基、(未經取代之低級烷基)硫基、氰基、醯基、硫代醯基、O-胺甲醯基、N-胺甲醯基、O-硫代胺甲醯基、N-硫代胺甲醯基、C-醯胺基、N-醯胺基、硝基、N-磺醯胺基、S-磺醯胺基、RS(O)--、RS(O)2 --、--C(O)OR、RC(O)O--、及-NR13 R14 (其中R13 及R14 係如前述所定義)所組成之組群的取代基。較佳地，所述之雜芳基係視需要經一或二個獨立選自鹵基、未經取代之低級烷基、三鹵烷基、羥基、巰基、氰基、N-醯胺基、單或二烷基胺基、羧基或N-磺醯胺基之取代基取代。
本發明所使用的術語“雜環”意指，其環中具有5至9個環原子，而其中一或二個環原子為選自N、O或S(O)n(其中n為0至2之整數)之環雜原子，而剩餘之環原子為C。所述之環亦可具有一或多個雙鍵。然而，該等環不具有完全共軛的pi-電子系統。未經取代的雜環基團之實例為(但不限定於)吡咯啶基、N-六氫吡啶基、六氫吡嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基、高六氫吡嗪基等類。雜環可為經取代或未經取代的。當其為經取代時，所述之取代基較佳係一或多個(更佳地一、二或三個，甚至更佳地一或二個)獨立選自，由未經取代之低級烷基、三鹵烷基、鹵基、羥基、未經取代之低級烷氧基、巰基、(未經取代之低級烷基)硫基、氰基、醯基、硫代醯基、O-胺甲醯基、N-胺甲醯基、O-硫代胺甲醯基、N-硫代胺甲醯基、C-醯胺基、N-醯胺基、硝基、N-磺醯胺基、S-磺醯胺基、RS(O)--、RS(O)2 --、--C(O)OR、RC(O)O--、及-NR13 R14 (其中R13 及R14 係如前述所 定義)所組成之組群的取代基。較佳地，所述之雜環基係視需要經一或二個獨立選自鹵基、未經取代之低級烷基、三鹵烷基、羥基、巰基、氰基、N-醯胺基、單或二烷基胺基、羧基或N-磺醯胺基之取代基取代。
較佳地，所述之雜環基係視需要經一或二個獨立選自鹵基、未經取代之低級烷基、三鹵烷基、羥基、巰基、氰基、N-醯胺基、單或二烷基胺基、羧基或N-磺醯胺基之取代基取代。
本發明所使用的術語“羥基”係指--OH基團。
本發明所使用的術語“烷氧基”係指--O-(未經取代之烷基)及--O-(未經取代之環烷基)基團。代表性實例包括(但不限定於)甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基等類。
本發明所使用的術語“芳氧基”係指--O-芳基及--O-雜芳基基團，如前述所定義。代表性實例包括(但不限定於)苯氧基、吡啶氧基、呋喃氧基、噻吩氧基、嘧啶氧基、吡嗪氧基等類，及其衍生物。
術語“雜環”、“雜環族”或“雜環基”(單獨或與其他術語結合)係指，完全飽和(亦即“雜環烷基”)、非芳香族部分飽和(亦即“雜環烯基”)或雜環芳香族(亦即“雜芳基”)的環結構，代表性地具有3至約20個碳原子，更代表性地具有3至約14個碳原子。例如，所述之雜環可為4至約7員單環環系、7至約11員雙環環系或10至約15員三環環系，具有至少一個雜原子位於至少一個含碳原子之環中。含有雜原子之雜環基團的每一環可含有1、2、3或4個選自氮原子、氧原子及/或硫原子之雜原子，其中該氮及硫雜原子可視需要地被氧化，且氮雜原子可視需要地被四級化。所述之雜環基團可於該環或環系中任何雜原子或碳原子處接上取代基。
雜環基可為一單環，代表性地具有3至7個環原子，更代表性地具有3至6個環原子，且甚至代表性地具有5至6個環原子。單環雜環基之實例包括呋喃基、噻吩基(亦已知稱為“硫 代苯基”與“硫代呋喃基”)、噁唑基、異噁唑基、噻唑基、異噻唑基、噻噁唑基、噁二唑基(包括1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基(亦已知稱為"azoximyl")、1,2,5-噁二唑基(亦已知稱為“呋呫基”)及1,3,4-噁二唑基)、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基、四唑基、噁噻唑基、噁三唑基(包括1,2,3,4-噁三唑基及1,2,3,5-噁三唑基)、吡啶基、二嗪基(包括嗒嗪基(亦已知稱為“1,2-二嗪基”)、嘧啶基(亦已知稱為“1,3-二嗪基”)及吡嗪基(亦已知稱為“1,4-二嗪基”))、三嗪基(包括s-三嗪基(亦已知稱為“1,3,5-三嗪基”)、as-三嗪基(亦已知稱為“1,2,4-三嗪基”)及v-三嗪基(亦已知稱為“1,2,3-三嗪基”)、噁噻嗪基(包括1,2,5-噁噻嗪基及1,2,6-噁噻嗪基)、氧呯基、硫呯基、二氫呋喃基、四氫呋喃基、二氫噻吩基(亦已知稱為“二氫硫代苯基”)、四氫噻吩基(亦已知稱為“四氫硫代苯基”)、異吡咯基、吡咯啉基、異咪唑基、咪唑啉基、吡唑啉基、吡唑啶基、二硫雜環己基、氧硫雜環己基、氧硫雜環戊基、噁唑啶基、異噁唑啶基、噻唑啉基、異噻唑啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、二噁唑基(包括1,2,3-二噁唑基、1,2,4-二噁唑基、1,3,2-二噁唑基及1,3,4-二噁唑基)、哌喃基(包括1,2-哌喃基及1,4-哌喃基)、二氫哌喃基、四氫哌喃基、六氫吡啶基、六氫吡嗪基、噁嗪基(包括1,2,3-噁嗪基、1,3,2-噁嗪基、1,3,6-噁嗪基(亦已知稱為“五噁嗪基”)、1,2,6-噁嗪基及1,4-噁嗪基)、異噁嗪基(包括o-異噁嗪基及p-異噁嗪基)、噁二嗪基(包括1,4,2-噁二嗪基及1,3,5,2-噁二嗪基)、嗎啉基、氮呯基及異氮呯基。
單環雜環基之實例包括吡咯啶基、吡咯基、吡唑基、氧雜環丁基、吡唑啉基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑啶基、噁唑基、噁唑啶基、異噁唑啉基、異噁唑基、噻唑基、噻二唑基、噻唑啶基、異噻唑基、異噻唑啶基、呋喃基、四氫呋喃基、噻吩基、噁二唑基、六氫吡啶基、六氫吡嗪基、2-氧六氫吡嗪基、2-氧六氫吡啶基、2-氧吡咯啶基、2-氧氮呯基、4-六氫吡啶酮基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、嗒嗪基、四氫哌喃基、嗎啉基、硫 嗎啉基、硫嗎啉基碸、硫嗎啉基磺胺、1,3-二噁烷及四氫-1,1-二氧噻吩基、噻唑基、噻嗪基等類。
另供選擇地，雜環基可為2至5(更具代表地2或3)個環稠合在一起，例如，吲嗪基、哌喃并吡咯基、嘌呤基、咪唑并哌嗪基、咪唑并嗒嗪基、吡啶并吡啶基(包括吡啶并[3,4-b]-吡啶基、吡啶并[3,2-b]-吡啶基、吡啶并[4,3-b]-吡啶基及奈啶基)、喋啶基、嗒嗪并四嗪基、吡嗪并四嗪基、嘧啶并四嗪基、吡啶基、吡唑并嘧啶基、吡唑并吡嗪基、吡唑并嗒嗪基或4H-喹嗪基。於有些具體實施例，所述之多環雜環為吲嗪基、哌喃并吡咯基、嘌呤基、吡啶并吡啶基、吡啶基及4H-喹嗪基。
雙環雜環基之實例包括吲哚基、苯并噻唑基、苯并二氧雜環戊基、苯并噻吩基、昆啶基、喹啉基、四氫異喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、苯并哌喃基、吲嗪基、苯并呋喃基、色酮基、薰草基、苯并哌喃基、[口辛]喏啉基、喹嗒啉基、吲唑基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基(例如呋喃并[2,3-c]吡啶基、呋喃并[3,2-b]吡啶基或呋喃并[2,3-b]吡啶基)、二氫異吲哚基、二氫喹啉基(例如3,4-二氫-4-氧-喹啉基)、四氫喹啉基等類。
三環雜環基之實例包括咔唑基、苯并吲哚基、啡啉基、吖啶基、啡啶基、[口山]基等類。
其他稠環雜環基之實例包括苯并-稠合雜環，例如苯并呋喃基(亦已知稱為“薰草基”)、異苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并異噁唑基(亦已知稱為“氧雜吲嗪基”)、蒽啉基、苯并噻吩基(亦已知稱為“苯并硫代苯基”、“硫代萘基”與“苯并硫代呋喃基”)、異苯并噻吩基(亦已知稱為“異苯并硫代苯基”、“異硫代萘基”與“異苯并硫代呋喃基”)、苯并噻唑基、苯并異噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噁二唑基、吲哚基、吲唑基(亦已知稱為“苯并吡唑基”)、苯并咪唑基、苯并三唑基、聯苯胺基(包括喹啉基(亦已知稱為“1-聯苯胺基”)與異喹啉基(亦已知稱為“2-聯苯胺基”))、呔嗪基、喹喏啉基、苯并二嗪基(包括[口辛]啉基(亦已知稱為“1,2-苯并二嗪基”)與 喹唑啉基(亦已知稱為“1,3-苯并二嗪基”))、苯并咪唑并噻唑基、、咔唑基、吖啶基、異吲哚基、吲哚啉基(亦已知稱為“偽吲哚基”)、苯并二噁唑基、克基、異克基、硫代克基、異硫代克基、克烯基、異克烯基、硫代克烯基、異硫代克烯基、苯并二氧雜環己基、四氫異喹啉基、苯并噁嗪基(包括1,3,2-苯并噁嗪基、1,4,2-苯并噁嗪基、2,3,1-苯并噁嗪基與3,1,4-苯并噁嗪基)、苯并異噁嗪基(包括1,2-苯并異噁嗪基與1,4-苯并異噁嗪基)、苯并噁二嗪基及[口山]基等類。於有些具體實施例，所述之苯并-稠合雜環為苯并呋喃基、異苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并異噁唑基、蒽啉基、苯并噻吩基、異苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噁二唑基、吲哚基、異吲哚基、苯并咪唑基、苯并三唑基、聯苯胺基、呔嗪基、喹喏啉基、苯并二嗪基、咔唑基、吖啶基、異吲哚基、吲哚啉基、苯并二噁唑基、克基、異克基、硫代克基、苯并二氧雜環己基、四氫異喹啉基、苯并噁嗪基及[口山]基等類。
本發明所使用的術語“雜芳基”(單獨或與其他術語結合)係指，代表性含有5至14個環原子之芳香族雜環基。雜芳基可為單環或多數(代表性地2或3個)稠合環。此部分包括(例如)5-員環如呋喃基、噻吩基、噁唑基、異噁唑基、噻唑基、異噻唑基、噻二唑基、噁二唑基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基、四唑基、氧噻唑基及氧三唑基；6-員環如吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、嗒嗪基、三嗪基及氧噻嗪基；7-員環如氧呯基及硫呯基；6/5-員稠合環系如苯并呋喃基、異苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并異噁唑基、蒽啉基、苯并噻吩基、異苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并異噻唑基、苯并噻二唑基、吲嗪基、哌喃并吡咯基、苯并噁二唑基、吲哚基、異吲唑基、苯并咪唑基、苯并三唑基、嘌呤基、咪唑并吡嗪基及咪唑并嗒嗪基；及6/6-員稠合環系如喹啉基、異喹啉基、吡啶并吡啶基、呔嗪基、喹喏啉基、苯并二嗪基、咔唑基及吖啶基。於有些具體實施例，所述之5-員環包括呋喃基、噻吩基、噁唑基、異噁唑基、噻唑 基、異噻唑基、噁二唑基、吡唑基及咪唑基；6-員環包括吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、嗒嗪基及三嗪基；6/5-員稠合環系包括苯并噁唑基、苯并異噁唑基、蒽啉基、苯并噻吩基、異苯并噻吩基、及嘌呤基；且6/6-員稠合環系包括喹啉基、異喹啉基及苯并二嗪基。
雜芳基基團之實例包括吡咯基、吡唑基、咪唑基、噁唑基、異噁唑基、噻唑基、噻二唑基、異噻唑基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、嗒嗪基、三唑基、三嗪基等類。
本發明所使用的術語“氫”(單獨或與其他術語結合)係指氫取代基，且可書寫成-H。
本發明所使用的術語“羥基”(單獨或與其他術語結合)係指-OH。
本發明所使用的術語“硝基”(單獨或與其他術語結合)係指-NO2 。
本發明所使用的術語“取代”係指化合物具有一個包含至少一個鍵結到一或多個氫原子上的碳、氮、氧或硫原子之取代基。若敘述一取代基係經取代的，則有一非氫取代基取代了原位於該取代基之碳、氮、氧或硫上的氫原子。因此(例如)，經取代的烷基取代基為其中有至少一個非氫取代基，取代了位於該烷基取代基的氫原子。舉例而言，單氟烷基為經一個氟基取代之烷基，而二氟烷基為經兩個氟基取代之烷基。應了解，一取代基若有一個以上取代，則各別非氫取代基可為相同或相異(除非有另外指定)。
本發明所使用的術語“接觸”與“暴露”當應用於細胞時，係用來描述一種藉其將本發明之化合物投藥或遞送至標靶細胞，或是將其置入與該標靶細胞直接並列之位置的過程。術語術語“投藥”及“遞送”可與“接觸”及“暴露”互相交替使用。
若敘述一取代基“視需要經取代的”，則該取代基為(1)經取代的或(2)未經取代的。當一群取代基之成員一般性被敘述成視需要經取代的，此群之各成員中任何能夠取代之原子可為(1)經取代的或(2)未經取代的。此特徵描述預期，該群中有些成員是不可取代的。能夠取代之原子包括(例如)與至少一個氫結合之碳，與至少一個氫結合之氧，與至少一個氫結合之硫，或與至少一個氫結合之氮。另一方面，單獨之氫、鹵素、氧基及氰基並不屬於能夠取代之定義中。
雖然該等與本發明所述類似或相等之方法及組成物可用於實施或測試本發明，以下仍敘述適合的方法及組成物。
應特別理解，關於本發明一項具體實施例所討論之任何限制，可應用於本發明之任何其他具體實施例。此外，本發明之任何組成物可用於本發明之任何方法中，而本發明之任何方法可用於製造或使用本發明之任何組成物。
以下所論述的特別實施例僅為說明之目的，而無意限制本發明的範圍。
TMPK及TMPK抑制劑
本發明係關於包含TMPK抑制劑之新穎組成物與治療劑，以及其用於治療或預防癌症的方法。特別地，本發明揭示胸腺核苷酸激酶(TMPK)對於dTDP形成很重要，而dADP、dGDP、dCDP及dUDP能直接在，由核醣核苷酸還原酶(RNR)催化之反應中產生。本發明報導TMPK與RNR會在DNA損壞部位結合，且於腫瘤細胞中干預TMPK之功能，會經由造成dUTP嵌入而影響DNA雙股斷裂的修復。於腫瘤細胞中，可經由破壞RNR損壞部位之補充，或減少RNR的R2次單位表現量來防止此等dUTP-介導之損傷，表示提升DNA損壞部位之RNR功能，會助長在損傷DNA之修復過程中嵌入dUTP，而造成有毒的修復。
利用RNA干擾，本發明提出抑制TMPK表現會顯著增加，HCT-116結腸癌細胞對亞德里亞黴素(一種誘導DNA(DSBs)的拓撲異構酶II抑制劑)之敏感性，而與p53狀態無關(Hu與Chang,2008)。比較上，因為有TK-介導dTMP之形成的補充，抑制TS表現在使p53-缺陷細胞對亞德里亞黴素增敏之功效上比較有限。重要地，本發明提出抑制TMPK表現(本身)不會活化DNA損壞反應。因此其與習知抗癌療法中所使用之抗代謝物(直接誘發基因毒性)，有相當不一樣的執行功能方式(Garg等人,2010)。
不像阻斷RNR，會隨著DNA損壞反應而導致複製逆境(Helleday等人,2008)，TMPK表現受抑制之細胞仍然能增生且存活(Hu與Chang,2008)。TMPK在dTDP形成中提供基本必要的功能，因此，人類腫瘤細胞可能含有同工型之原因，造成特定TMPK已消損的細胞仍具有生長能力。然而，很難了解為何抑制TMPK表現(如同阻斷RNR)，會深深地影響腫瘤細胞的DNA修復。最近一篇報告證明，經由R1次單位之C-端區域與Tip60相互反應，可使RNR轉移至DNA損壞部位(Niida等人,2010a)。破壞RNR補充至DNA損壞部位，會影響細胞中的DSBs修復，此係由於在G0/G1期dNTP庫之含量低，使得在此等細胞中特別需要由RNR製造dNTPs以供DNA修復(Hakansson等人,2006)。本發明例舉說明，TMPK與DNA損壞部位之關聯，且RNR之R2在DNA損壞部位的高度表現，若無結合TMPK之功能，則於增生的腫瘤細胞中，會因dUTP嵌入而導致有毒的修復。因此本發明提出，腫瘤細胞R2含量增加，會使TMPK成為增強亞德里亞黴素作用的標靶。
本發明提供鑑定新穎TMPK抑制劑，其可於活體外籍活體內使腫瘤細胞對亞德里亞黴素敏感，但不會在細胞或小鼠中產生基因毒性作用。因此，本發明所述之新穎抑制劑，可使溫和劑量之亞德里亞黴素治療，引發腫瘤產生反應而致死，同時在正常不斷生長性細胞中有最低副作用，對於溫和抗癌療法方面提供一個新的契機。
於是，本發明提供可用於治療或預防癌症之新穎TMPK抑制劑。
於本發明之一項具體實施例係提供一種抑制胸腺核苷酸激酶(TMPK)之組成物，其包含治療上有效量之式(I)化合物：
其中X=CR5 及N，其中R5 為選自氫、一直鏈、支鏈或環狀烷基、一直鏈、支鏈或環狀烯基、一直鏈、支鏈或環狀烷氧基、氟化烷基、過氟化烷基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、雜芳烷基、雜芳烯基、雜芳炔基、芳基、雜芳基之取代基，視需要經一或多個諸如鹵素、烷基、羥基、烷氧基、胺基、硝基、氰基及羰基之取代基取代；Y=S、O、C=O、NR6 ，其中R6 為選自氫、一直鏈、支鏈或環狀烷基、芳烷基、雜芳烷基、雜芳烯基、芳基、雜芳基之取代基，視需要經一或多個諸如鹵素、烷基、羥基、烷氧基、胺基、硝基、氰基及羰基之取代基取代；R1 、R2 、R3 及R4 為獨立地選自氫、一直鏈、支鏈或環狀烷基、一直鏈、支鏈或環狀烯基、一直鏈、支鏈或環狀烷氧基、氟化烷基、過氟化烷基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、雜芳烷基、雜芳烯基、雜芳炔基、芳基、雜芳基之取代基，視需要經一或多個諸如鹵素、烷基、羥基、烷氧基、胺基、硝基、氰基及羰基之取代基取代；或其醫藥上可接受之鹽類、水合物或溶劑合物。
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含至少一種下列結構：
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含下列結構：
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含至少一種下列結構：
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含至少一種下列結構：
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含下列結構：
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含至少一種下列結構：
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含下列結構：
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含至少一種下列結構：
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含至少一種下列結構：
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含下列結構：
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含下列結構：
於本發明之有些具體實施例，該組成物包含至少一種下列結構：
於有些具體實施例，本發明之組成物能夠抑制TMPK活性。於其他具體實施例，本發明之組成物能夠抑制細胞中的dTTP含量。於有些具體實施例，本發明之組成物能夠抑制腫瘤生長、DNA損壞檢查點、DNA錯配修復、核苷酸切割修復、雙股斷裂修復、DNA解螺旋酶功能、訊號傳遞、細胞週期調控或細胞凋亡。
於有些具體實施例，該雙股斷裂修復可能與放射療法、化學療法或免疫調制療法關連。於有些具體實施例，該化學療法包含以亞德里亞黴素進行之治療。
於有些具體實施例，本發明之組成物係選擇性地將毒性標靶至帶有DNA損傷的癌細胞。
於有些具體實施例，本發明之組成物能夠使癌細胞對放射療法、化學療法或免疫調制療法敏感。於有些具體實施例，該化學療法包含以亞德里亞黴素進行之治療。
於有些具體實施例，本發明之組成物不會導致基因毒性副作用。
於有些具體實施例，本發明之組成物具有IC50 值為約10μM或以下。於有些具體實施例，其具有IC50 值為約5μM或以下。於有些具體實施例，該組成物具有IC50 值為約1μM或以下。於有些具體實施例，該組成物具有IC50 值為約0.5μM或以下。又於其他具體實施例，該組成物具有IC50 值為約0.25μM或以下。於其他具體實施例，該組成物具有IC50 值為約0.1μM或以下。
本發明亦提供用於製造所述組成物之方法，特別是如圖1所述之新穎TMPK抑制劑衍生物化合物，該方法包含下列步驟：(a)將2-氯-6-甲基菸鹼腈(或2-氯-4,6-二甲基菸鹼腈)以硫脲處理，而得中間物2-巰基-6-甲基菸鹼腈(或2-巰基-4,6-二甲基菸鹼腈)；(b)將2-巰基-6-甲基菸鹼腈及2-巰基-4,6-二甲基菸鹼腈置於濃H2 SO4 中於100℃下處理，而分別得化合物3 (R1 =H,R2 =Me)及4 (R1 =R2 =Me)。
(c)將六氫吡嗪-1-碳酸酯以4-硝基苯基氯甲酸酯及三乙胺(Et3 N)處理，而得活化的胺甲酸酯之中間化合物。
(d)將該活化的胺甲酸酯以苯并噻唑酮(化合物1 )，於4-二甲基胺基吡啶(DMAP)與二異丙基乙胺(DIEA)中處理，而得化合物5 ；(e)將苯并噻唑酮1 (或吡啶并噻唑酮4 )於DIEA及碳酸銫(Cs2 CO3 )存在下，以2-溴乙酸甲酯處理，而分別得化合物6 及7 ； (f)將化合物6 及7 置於濃鹽酸中於100℃下處理，而分別得化合物8 及9 ；(g)將苯并噻唑酮1 (或吡啶并噻唑酮4 )於Et3 N與Cs2 CO3 存在下，以適當的鹵化物處理，而得化合物11 、12 ,、19 、21 及22 ；(h)將胺甲酸第三-丁酯12 及22 以三氟乙酸(TFA)處理，而分別得化合物10 及20 ；(i)將化合物10 於DIEA存在下，以氯甲酸苯甲酯處理而得化合物13 ；(j)將化合物10 於DMAP存在下，以4-硝基苯基氯甲酸酯處理，而得化合物14 ；(k)將化合物10 於DIEA存在下，以溴化丙烯基處理，而得化合物15 ；(l)將4-(2-氯乙醯基)六氫吡嗪-1-碳酸第三-丁酯以碘化鈉於丙酮中處理，而得相對應之碘基化合物，4-(2-碘乙醯基)六氫吡嗪-1-碳酸第三-丁酯；(m)將糖精(化合物2 )於DIEA存在下，以前述製備得之碘基化合物處理而得化合物17 ；(n)將胺甲酸第三-丁酯17 以TFA處理，而得化合物16 ；(o)將酞醯亞胺於碘化第三丁銨(TBAI)與DIEA存在下，以4-(2-氯乙醯基)六氫吡嗪-1-碳酸第三-丁酯處理，而得化合物18 ；(p)將化合物9 於1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)羰二亞醯胺(EDCI)、DMAP與DIEA存在下，以六氫吡嗪-1-碳酸乙酯處理，而得化合物21 (YMU1)；(q)將苯并噻唑酮1 於DIEA存在下，以4-(4-碘丁醯基)六氫吡嗪-1-碳酸酯處理而得化合物23 ；(r)將苯并噻唑酮1於DIEA存在下，以1,1'-(六氫吡嗪-1,4-二基)-雙(2-碘乙酮)處理而得化合物24 ；(s)將吡啶并噻唑酮4 於DIEA及Cs2 CO3 存在下，以2- 溴乙酸甲酯處理而得N -烷基化化合物7 及O -烷基化化合物25 ；(t)將化合物25 置於濃鹽酸中於100℃下處理，而得化合物26 ；將化合物26 於EDCI、DMAP與DIEA存在下，以嗎啉(或六氫吡嗪-1-碳酸乙酯)處理，而分別得化合物27 及28 ；如於實施例段落中所述，本發明創新探究TMPK對於腫瘤細胞DNA修復之功能上的需求。此需求特別涉及到R2表現提高及RNR補充至DNA損壞部位。本文所示之數據顯示，DNA損壞部位之RNR可引起部位專一性dUTP的製造。理論上，dUTPase對dUMP形成之作用以及由TS介導將dUMP轉化成dTMP之反應，會限制細胞內dUTP的量。然而，阻斷TMPK功能造成在DNA修復時之dUTP嵌入，而其取決於腫瘤細胞中RNR在損壞部位的補充，表示從RNR之部位專一性製造dUTP，具有其生理複雜性。
於是，本發明提出阻斷TMPK可減低DNA損壞部位之dTTP形成率，然後增加修復程序中dUTP嵌入之可能性，而導致永存的傷害。此係因在修復每一DSB時有超過10,000個dNTPs嵌入，且腫瘤細胞中RNR之功能增高會使dUTP在損壞部位占優勢，造成有毒的修復。由於腫瘤細胞含有被提高之RNR功能，故阻斷TMPK功能可專一性地使腫瘤細胞對亞德里亞黴素增敏。
有趣地，在MDA-MB231及MCF-7細胞中，R2和dUTPase之表現量同時被提高。推測上，此細胞狀態可保護DNA修復不發生dUTP嵌入。於是，此等腫瘤細胞能夠修復因低劑量亞德里亞黴素處理所引發的損傷。於此細胞狀態，直到抑制TMPK之表現，才會在DNA修復時發生dUTP嵌入。RNR次單位R2及dUTPase之表現係受細胞週期調控，在S與G2/M期達到高峰(Ladner與Caradonna,1997；Nordlund與Reichard,2006)。已知惡性腫瘤細胞具有細胞週期檢查點缺陷(Kastan與Bartek,2004)。因此，此等細胞在從DNA損壞恢復的期間，有較多處於S與G2/M期之族群分佈。相反地，在正常具不斷生長性H184B5F5/M10細胞，從DNA損壞恢復期間之S期族群減少，這可能係由於存在著完整的檢查點所致。結果，此等正常具不斷生長性細胞甚至表現較少量R2，其可進一步限制dUDP形成。然而，應注意正常具不斷生長性細胞之p53R2次單位量增加，其仍然能夠在DNA損壞部位形成具有功能的RNR。所以，為何在正常具不斷生長性細胞，DNA修復不會受TMPK表現抑制影響?一種合理的解釋為，R2對於R1具有較p53R2高出4.7-倍之結合親和力(Shao等人,2004)。可能p53R2對於R1次單位之低親和力使得RNR功能較差，使正常細胞中的DNA損壞部位的dUTP形成量並不多，因此在DNA修復時，較不需TMPK之功能性配合。的確，藉由過量表現來強迫提高R2量，會促使正常具不斷生長性細胞對抑制TMPK產生敏感，在暴露至低劑量亞德里亞黴素處理後，造成持續性DNA損壞，此支持本案所述經由提高RNR功能製造dUTP。已發現在許多類型之患者癌細胞中，R2與p53R2表現量受調節增加(Jensen等人,1994；Okumura等人,2005；Yanamoto等人,2003；Zhang等人,2009)。過量表現R2或p53R2之轉殖基因小鼠肺中產生腫瘤(Xu等人,2008)。於DNA損壞部位RNR造成dUTP形成之副作用，是否與其致癌潛能有關仍有待研究。儘管如此，須注意p53R2預後大腸癌較佳的存活率，而R2表現度則與較差的結果有關聯(Liu等人,2011)。於酵母菌表現在dATP回饋抑制作用上有缺陷之RNR突變型，造成dNTP量增高，伴隨著細胞週期行進及DNA損壞檢查點受抑制(Chabes與Stillman,2007)。此現象是否涉及dUTP形成亦值得研究。
本發明合理化說明，腫瘤細胞內R2表現量增加，會使TMPK成為增強亞德里亞黴素作用的標靶弱點。為達成此目的，鑑定得一種新穎的TMPK抑制劑，YMU1。本發明提出，YMU1在細胞或小鼠中不會產生基因毒性作用。5-FU及5-FdUrd(最常用之化學治療劑)會抑制TS(其在新合成途徑中將dUMP轉化成dTMP)，並進一步透過將錯誤的核苷酸嵌入RNA及DNA中而損害細胞功能(Longley等人,2003)。雖然已有TS抑制劑及其他核苷酸代謝物阻斷劑使用作為化學增敏劑(Garg等人,2010)，仍應強調此等抗癌劑對於正常的不斷生長性細胞之基因DNA具有毒性。彼等之治療功效僅僅來自其可造成廣泛的DNA損壞之能力，如此使其產生非專一的毒性。吾等則提出本發明TMPK抑制劑超越此等習知化合物之治療優點，在於彼等係針對帶有DNA損傷之惡性腫瘤細胞產生專一毒性。
治療用途
本發明提供一種使癌細胞對放射療法、化學療法或免疫調制療法增敏之方法，其包含將該癌細胞曝露於一治療上有效量之本發明之TMPK抑制劑組成物。於有些具體實施例，該TMPK抑制劑選擇性將毒性標靶至帶有DNA損傷的癌細胞。於有些具體實施例，本發明之TMPK抑制劑組成物不會造成基因毒性副作用。
本發明亦提供一種使癌細胞對放射療法、化學療法或免疫調制療法增敏之方法，其包含將該癌細胞曝露於一治療上有效量之抑制TMPK活性的藥劑。於有些具體實施例，該藥劑為本發明之組成物。
本發明亦提供一種防止癌細胞進行雙股斷裂修復之方法，其包含將該癌細胞曝露於一治療上有效量之本發明之TMPK抑制劑組成物。
本發明亦提供一種選擇性將毒性標靶至帶有DNA損傷的癌細胞之方法，其包含將該癌細胞曝露於一治療上有效量之本發明之TMPK抑制劑組成物。
於有些具體實施例，該癌細胞係選自乳癌細胞、肝腫瘤細胞、大腸癌細胞、胰臟癌細胞、食道癌細胞、膀胱癌細胞、卵巢癌細胞、皮膚癌細胞、肝癌細胞、胃癌細胞、前列腺癌細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、直腸癌細胞、腎臟癌細胞、甲狀腺癌細胞、腦癌細胞、黑色素瘤、肉瘤、白血病、骨癌細胞及子宮內膜癌細胞。
於有些具體實施例，該方法進一步包含將該癌細胞曝露於至少一種選自抗癌劑、抗病毒劑、消炎藥及免疫抑制劑之額外治療劑。
預期用於本發明之抗癌劑包括(但不限定於)微管干擾劑、拓撲異構酶抑制劑、烷化劑、胸腺核苷酸合成酶抑制劑、抗代謝物、嘧啶拮抗劑、嘌呤拮抗劑、核醣核苷酸還原酶抑制劑、及激酶抑制劑。於有些具體實施例，微管干擾劑為該等會誘導微管形成混亂，破壞有絲分裂與DNA合成之藥劑，且包括紫杉烷類例如紅豆杉醇與多西他賽；長春花生物鹼類例如長春鹼、長春新鹼與長春地新。於有些具體實施例，藉由打斷DNA而作用之拓撲異構酶抑制劑包括兩類，即拓撲異構酶I與拓撲異構酶II抑制劑。拓撲異構酶I抑制劑包括(但不限定於)伊立替康(CPT-11)。拓撲異構酶II抑制劑包括(例如)多柔比星與表柔比星。其他可用於本發明之拓撲異構酶抑制劑包括(但不限定於)依托泊苷、替諾泊苷、伊達比星及柔紅黴素。於有些具體實施例，藉由損壞DNA而作用之烷化劑，例如苯丁酸氮芥、美法侖、環磷醯胺、異環磷醯胺、替莫羅醯胺、塞替派、絲裂黴素C、白消安、卡莫司汀(BCNU)與洛莫司汀(CCUN)，已顯示為有用的化療劑。烷化劑亦包括白金例如卡鉑與順鉑，彼等已顯示為有用的化療劑，雖然不屬於烷化劑但亦藉由與DNA共價結合而作用。於有些具體實施例，胸腺核苷酸合成酶抑制劑(其係藉由代謝成假的DNA和RNA鹼基而干擾轉錄作用)包括(例如)5-氟尿嘧啶與卡培他濱。於有些具體實施例，抗代謝物例如葉酸拮抗劑，胺基甲基葉酸與三甲曲沙已發現可用作為化療劑。於有些具體實施例，嘧啶拮抗劑例如氟尿嘧啶、氟去氧尿嘧啶核苷與氮雜胞嘧啶核苷已發現可用作為化療劑。於有些具體實施例，嘌呤拮抗劑已發現可用作為化療劑，且包括巰基嘌呤、硫鳥嘌呤與噴司他丁。亦可用作為化療劑之含醣類修飾類似物包括，阿糖胞苷與氟達拉濱。於有些具體實施例，核醣核苷酸還原酶抑制劑已發現可用作為化療劑，且包括諸如羥基尿素等藥劑。
本發明亦提供一種於有需要之個體中治療或預防癌症之方法，其包含將一治療上有效量之本發明之TMPK抑制劑衍生物投藥予該個體。於有些具體實施例，本發明之TMPK抑制劑衍生物選擇性將毒性標靶至帶有DNA損傷的癌細胞。於有些具體實施例，本發明之TMPK抑制劑衍生物不會造成基因毒性副作用。
於有些具體實施例，該癌症係選自乳癌、肝腫瘤、大腸癌、胰臟癌、食道癌、膀胱癌、卵巢癌、皮膚癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、結腸癌、肺癌、直腸癌、腎臟癌、甲狀腺癌、腦癌、黑色素瘤、肉瘤、白血病、骨癌及子宮內膜癌。
投藥及醫藥組成物
所述方法包含將本發明之TMPK抑制劑衍生物，單獨或與另一治療方法例如放射療法、化學療法或免疫調制療法結合投藥予個體。
可使用一或多種生理上可接受之載劑，包含有助於將活性化合物加工成可被醫藥上使用之製劑的賦形劑與輔助劑，以習之方法調配得根據本發明使用之醫藥組成物。適當的調配物係依所選擇之投藥途徑而定。
用於注射，可將本發明之組成物調配於水溶液，較佳地調配於生理學上可相容之緩衝液，例如漢克氏液、林格氏液或生理食鹽水中。用於經黏膜投藥，係將適於欲通過屏障之滲透劑用於調配物。此類滲透劑為該項技藝一般已知者。
用於口服投藥，可藉由將活性化合物與該項技藝已熟知的醫藥上可接受之載劑組合，而調配成組成物。此類載劑能使本發明之組成物調配呈錠劑、丸劑、菱刻錠劑、糖衣錠、膠囊、液體、膠體、糖漿、漿劑、懸浮液等類，以供或者以口服攝入。用於口服之醫藥製劑可使用固體賦形劑製得，視需要可將所成之混合物研磨，及在加入其他若希望之適宜輔助劑後，將顆粒混合物加工而獲得錠劑或糖衣錠核心。可用之賦形劑為(特別是)填充劑例如糖類，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇，纖維素製劑例如玉米澱粉、小麥澱粉、米澱粉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉及/或聚乙烯-吡咯啶酮(PVP)。若希望，可添加崩解劑例如交聯聚乙烯吡咯啶酮、瓊脂或藻酸。以可使用諸如藻酸鈉之鹽類。
用於藉由吸入方式投藥，係方便地將根據本發明使用之組成物，以使用加壓包裝或噴霧器與適宜的推進劑，例如(不限定於)二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳之氣溶膠噴霧形式進行遞送。舉加壓器溶膠為例，可藉由提供用於遞送一預定量之閥，來調控所述之劑量單位。由明膠製成用於吸入器或吹藥器之膠囊與匣筒，可經調配而含有所述組成物與適宜粉末基質例如乳糖或澱粉之粉末混合物。
所述組成物亦可經調配用於非經腸道投藥，例如藉由團劑注射或連續灌流。用於注射之調配物可以單位劑量形式呈現，例如存放於安瓿或多次劑量容器中，有添加防腐劑。所述組成物可採用諸如溶於油性或水性載劑中之懸浮液、溶液或乳液等形式，且可含有調配用物質例如懸浮劑、安定劑與/或分散劑。
用於非經腸道投藥之醫藥組成物包括，所述活性化合物之水溶性形式例如(不限定於)鹽類的水溶液。此外，可於親脂性載劑中製備得活性化合物之懸浮液。適宜之親脂性載劑包括脂肪族油類例如芝麻油，合成型脂肪酸酯例如油酸乙酯與三酸甘油酯，或諸如脂質體之材料。水性注射懸浮液可含有增加所述懸浮液黏稠度之物質，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡萄聚醣。視需要地，所述懸浮液亦可含有適宜安定劑，及/或可增加該組成物溶解度，以使能製備高濃縮溶液之試劑。
另供選擇地，所述之活性成分可呈粉末形式，用以於使用前與適合的載劑例如無菌、無熱源水重建該組成物。
除了前述之調配物，所述組成物亦可調配呈補給製劑。此類長作用型調配物可藉由植入(例如經皮下或肌肉內)，或藉由肌肉內注射方式投藥。本發明之組成物可與適合的聚合物或厭水性物質(例如，與醫藥上可接受之油類形成乳液)，與離子交換樹脂調配，或呈一種難溶的衍生物例如(不限定於)難溶性鹽類，而用於此途徑投藥。
另供選擇地，可利用其他用於厭水性醫藥組成物之遞送系統。脂質體與乳液為用於厭水性藥物之已熟知的遞送載劑或載體實例。此外，可使用特定有機溶劑例如二甲亞碸，雖然常造成較大的毒性。
又，所述組成物可使用持續釋放系統，例如由含有治療劑之固體厭水性聚合物所成之半通透性基材進行遞送。已知有各類型持續釋放材料，且為習於該項技藝者所熟知。持續釋放型膠囊(視其化學本質而定)可持續釋出所述化合物達數星期或100天以上。視治療劑之化學本質與生物穩定性而定，可使用額外的蛋白質穩定化策略。
本發明之醫藥組成物可包含適合的固體或凝膠態載體或賦形劑。此類載體或賦形劑之實例包括(但不限定於)碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖類、澱粉、纖維素衍生物、明膠及聚合物例如聚乙二醇。
適用於本發明之醫藥組成物包括，其中含有其量足以達到所希望目的，例如治療癌症患者之活性成分的組成物。
更特別地，“治療上有效量”意指化合物可有效預防、減輕或改善受治療個體的癌症症狀，或延長該個體存活之用量。
習於該項技藝者可容易地，特別是依照本發明所提供之詳細揭示，決定治療上有效的量。
對於任何用於本發明方法之化合物，最初可從細胞培養分析來估計其治療上有效量或劑量。然後，可調配所述之劑量用於動物模式，以達到一循環濃度範圍，包括於細胞培養所測得之IC50 值(亦即，測試化合物可達到最大TMPK抑制作用之一半的濃度)。接著可將此類資訊用於更精確測定可用於人類之劑量。
可藉由於細胞培養或實驗動物進行之標準製藥學程序，例如藉由藉由測定標的化合物之IC50 及值LD50 ，其中LD50 為測試化合物可達到最大致死性抑制作用之一半的濃度，而決定本發明所述組成物之毒性與治療功效。從這些細胞培養分析及實驗研究獲得之數據，可用來調配出一用於人類之劑量範圍。該劑量可依所使用的劑型及所利用之投藥途徑而有所變化。可由個別醫師參照患者之病況選擇正確的配方、投藥途徑與劑量。
可各別調整劑量與投藥間隔，以提供足以維持所希望調節功效之活體血漿濃度。此等血漿濃度稱為最低有效濃度(MECs)。對於各別化合物之MEC會有所差異，但可從活體外估計得，例如可使用本文所述之分析，確認欲達到50-90%激酶抑制作用所需的濃度。欲達到MEC所需之劑量將取決於個體的特徵與投藥途徑。分析或生物分析可用於測定血漿濃度。
使用MEC值亦可測定劑量間隔。化合物應使用可使血漿濃度在治療時程的10-90%，較佳地30-90%，且最佳地50-90%時仍維持高於MEC之療程進行投藥。
所投藥之組合物量(當然)將視欲受治療之個體、疾病嚴重性、投藥方式及執業醫師之判斷等等而定。
據此，本發明提供所述之TMPK抑制劑組成物可每日投藥一次，連續投藥3天。於有些具體實施例，本發明提供所述之TMPK抑制劑組成物可每日投藥一至二次。於有些具體實施例，本發明提供所述之TMPK抑制劑組成物可以約5 mg/kg至約30 mg/kg之劑量投藥。
雖然本發明已描述目前被認為最實際且最佳的實施態樣，應了解本發明無需受限於所揭示之具體實施例。反之，本發明欲涵蓋各種包括在所附申請專利範圍之精神與範圍內之修改及類似的排列，其係根據最廣義概念以致包含所有此類修改與相似的結構。
本發明進一步舉例下列特別的實施範例。該等實施範例僅作為輔助說明，而不應構成限制本發明之範圍。
實施例 實施例1：TMPK藉由防止dUTP嵌入而在雙股斷裂之修復中占有重要性
為分析TMPK在DSBs修復中扮演之角色，本實驗藉由干擾來耗盡表現，並於帶有DR-GFP報告基因之U2OS細胞進行HR分析(Pierce等人,1999)。隨著I-SceI核酸內切酶表現，發生HR修復而產生完整的GFP，可讀取到螢光數值。經由流動式細胞計數分析，抑制TMPK表現會顯著降低修復效率，由GFP陽性部分偵測到(圖2A )。本實驗亦測試，在MDA-MB231乳癌細胞中抑制TMPK表現對於修復亞德里亞黴素所誘導之DNA損傷的影響。將對照組及TMPK抑制表現細胞以低劑量(0.1 μM)亞德里亞黴素處理4小時，然後以新鮮培養基充分沖洗而使其復原。起初，此等細胞之DNA損傷程度(藉由γH2AX foci染色(Mah等人,2010)標示)很相似(圖2B )。經過復原24小時後，亞德里亞黴素所誘導之DNA損傷在對照組細胞中已消除，表示細胞能夠修復由低劑量亞德里亞黴素處理所誘導之DNA損傷程度。相反地，在TMPK抑制表現細胞中仍保有γH2AX foci。結果顯示，抑制TMPK表現顯著減低具有亞德里亞黴素處理之細胞存活(圖3 )。因此，TMPK對於在低劑量亞德里亞黴素處理之反應的DNA修復是必要的。
亞德里亞黴素處理誘導DNA雙股斷裂，其可經由HR過程來修復(Nitiss,2009)。已知HR過程包含，其中可發生股侵入而進行修復之Rad 51 foci(Holthausen等人,2010)。本實驗測試於經亞德里亞黴素處理之細胞中抑制TMPK表現對Rad 51 foci形成與消退的影響。結果顯示，抑制TMPK表現起初不會影Rad 51 foci形成。經過24小時後，對照組細胞中之Rad 51 foci數量顯著減少，而在TMPK抑制表現細胞中仍保持不變(圖2C )。此表示抑制TMPK表現可持續該等結構重組的損傷。吾等亦檢測已知做為單股斷裂修復(SSBR)標記之XRCC1 foci(Caldecott,2008)。如預期，在亞德里亞黴素處理時，於對照組及TMPK抑制表現細胞中偵測到非常少量的XRCC1 foci，證明TMPK缺陷起初並不會在亞德里亞黴素處理時誘導DNA單股斷裂修復(SSBR)。於24-48小時復原期間，抑制TMPK表現可使XRCC1 foci數量明顯增(圖2D )，暗示在HR程序中阻斷TMPK會促進SSBs。
已相當了解係藉由在去掉鹼基部位，以DNA糖苷酶與去嘌呤/去嘧啶核酸內切酶(APE)介導之裂解移除錯誤的鹼基而產生SSBs(Caldecott,2008；Nazarkina等人,2007)。尿嘧啶DNA糖苷酶例如尿嘧啶N-糖苷酶(UNG)可將尿嘧啶從DNA移除(Krokan等人,2002；Nilsen等人,1997)。為測試是否可由因尿嘧啶錯誤嵌入產生之XRCC1 foci顯示SSBs，遂將TMPK抑制表現細胞以慢病毒UNG之shRNA感染。待從亞德里亞黴素處理復原後，觀察到XRCC1 foci數量因抑制UNG表現而顯著減少(圖2E )。因此，阻斷TMPK會在修復亞德里亞黴素所誘導之DSBs時，促進基因組中的尿嘧啶量。
接著測試基因組中尿嘧啶量增加是否為dUTP嵌入之結果。細胞中dUTP濃度主要係由dUTPase(一種負責將dUTP水解成dUMP與焦磷酸鹽之酵素)進行調控(McIntosh等人,1992)。將野生型GFP-dUTPase與缺乏催化活性GFP-dUTPase之突變形式(圖4 )，於缺乏TMPK之MDA-MB231細胞中進行表現。待從亞德里亞黴素處理復原後，野生型GFP-dUTPase顯著減少TMPK抑制表現細胞中的XRCC1 foci數量，而表現不具催化活性dUTPase之細胞仍維持XRCC1 foci(圖2F )。一致地，γH2AX foci可由野生型之過量表現消除，但缺乏催化活性的dUTPaSe則否(圖5 )。結論，TMPK對於防止在修復DSBs時嵌入dUTP是必要的。
實施例2：DNA損壞處之RNR需要TMPK之功能性調節以進行修復
已估計細胞中之dUTP/dTTP比例係介於0.3-3%的範圍內(Traut,1994)。TMPK抑制表現細胞仍維持大於60%之dTTP庫，且此等細胞持續增生(圖7 )。或許，細胞含有其他TMPK之功能類似物來補償此特別耗盡。推測，此等細胞內之dTTP濃度仍較dUTP高出許多。此訴諸一個問題：為何此特定抑制TMPK表現會導致在DNA修復嵌入dUTP。
為分析TMPK在DNA修復中之功能性需求，遂將MDA-MB231乳癌細胞以pEGFP-TMPK(D15R)(一種不具催化能力之突變株)轉感染(圖8 )。注意，TMPK(D15R)在具有高轉感染效率之HeLa細胞中的過量表現，並不影響總體dTTP庫(圖9 )。經過亞德里亞黴素處理及復原後，發現在未經轉感染之細胞，或過量表現野生型GFP-TMPK之細胞中γH2AX foci被消除，而反觀在GFP-TMPK(D15R)-陽性細胞中仍保有γH2AX foci(圖6A )。已知TMPK之內源性功能不會受TMPK(D15R)表現影響，故TMPK(D15R)表現對於DNA修復之影響，似乎不是和dTTP量有關。
RNR介導之反應可製造出dUDP，其被NDP激酶轉化成dUTP(Mathews,2006)。我們假設抑制TMPK表現會導致在DNA損壞部位的dTTP形成減少，而在DNA修復時嵌入dUTP。為說明此假說，遂過量表現一段YFP-融合至R1次單位之90-胺基酸C-端片段(R1C-NLS-YFP)，干擾內源性RNR與Tip60之相互作用，以此破壞RNR補給至DNA受損壞部位(Niida等人,2010a)。顯然，此R1C-NLS-YFP融合片段之過量表現會消除在MDA-MB231細胞中抑制TMPK表現，對於在從亞德里亞黴素處理復原期間使γH2AX foci數量增加的影響(圖6B )。TMPK(D15R)過量表現之影響，也會被R1C-NLS-YFP的共同表現逆轉(圖6C )。因此，DNA損壞部位之RNR需要功能性TMPK配合，以防止dUTP-介入之永久性損害。
為了解TMPK及RNR是否為DNA損壞部位所必需的，遂將細胞表現I-PpoI，這是一個特定DNA裂解酵素，可將DSB導入染色體1上的特定序列(Flick等人,1998)。此系統可以在DNA受損區進行HR修復期間，偵測修復蛋白(例如ATM)是否補給至特定DNA損壞部位(Berkovich等人,2007)。染色絲免疫沉澱(ChIP)分析顯示，隨著I-PpoI表現，TMPK佔據在染色體1上的I-PpoI裂解部位(而非GAPDH基因部位)，ATM與RNR之R2次單位亦是如此(圖6D )。進一步分析細胞中DNA損壞部位上的TMPK與R2。使用激光顯微照射破壞DNA，偵測到TMPK及R2與γH2AX共同定位在沿著受顯微照射之線上(圖6E )。結論，TMPK與RNR在DNA損壞部位處有功能性結合以進行修復。
實施例3：在需要TMPK進行修復之腫瘤細胞中R2的高度表現是一項決定性因素
本實驗進一步測試在另一乳癌細胞系(MCF-7)及非腫瘤不斷生長性哺乳動物細胞系H184B5F5/M10與MCF10A中，TMPK對於DNA修復之需求性。類似於MDA-MB231細胞，抑制TMPK表現會造成由亞德里亞黴素處理誘導之γH2AX foci永存在MCF-7細胞中。相反地，在H184B5F5/M10與MCF10A細胞中DNA修復不受影響(圖10A )。本實驗比較在從DNA損壞復原期間，於MDA-MB231、MCF-7、H184B5F5/M10與MCF10A細胞中，R2、p53R2、TMPK及dUTPase之表現程度(圖10B )。於MDA-MB231及MCF-7細胞中RNR之R2次單位與dUTPase的表現量，較於H184B5F5/M10及MCF-10A細胞中的高出甚多。於MDA-MB231細胞中，在亞德里亞黴素處理後之12至48小時復原期間，R2與dUTPase含量相伴地增加。在MDA-MB231細胞，因為p53之功能有缺陷，以致p53R2的表現量非常低。於MCF-7、H184B5F5/M10及MCF10A細胞，p53R2的表現量在亞德里亞黴素處理後之24-48小時復原期間有增加。流動式細胞計數分析證明，在從DNA損壞復原期間，於H184B5F5/M10及MCF-10A細胞之G0/G1期細胞族群，較於MDA-MB231及MCF-7細胞中的高2-3-倍。在復原期間MDA-MB231及MCF-7細胞具有較多S與G2/M族群，表示彼等對於基因組損傷之反應的檢查點調控教不嚴苛(圖10C )。亦比較此四種細胞系之細胞生長速率(圖10D )。於所設定之實驗條件下，H184B5F5/M10c或MCF-10A細胞之增生速率的確較MDA-MB231及MCF-7細胞快(圖10D )。考慮到HR修復係發生在S與G2期，遂進一步將H184B5F5/M10細胞以諾考達唑處理過夜以阻斷有絲分裂進行，並藉此增加S/G2細胞(由流動式細胞計數分析顯示)(圖10E )。將此等細胞暴露至亞德里亞黴素處理，並於復原後進行γH2AX foci染色。類似於非同步培養，於諾考達唑處理後其S/G2族群量增加20%之H184B5F5/M10細胞，在DNA修復方面仍然不會對抑制TMPK表現敏感(圖10F )。因此，在修復時對於抑制TMPK表現之差別反應，似乎並非由細胞週期分布上的差異來決定。此等數據指出，在DNA修復時對於抑制TMPK表現之敏感性差異，與此等細胞系之增生速率無關。先前已有報導指出，R2/R1複合體之酵素活性較p53R2/R1的高出5-倍(Qiu等人,2006；Shao等人,2004)。具有低R2表現量之H184B5F5/M10細胞中的DNA修復，並不受抑制TMPK表現影響。
考量到於帶有TMPK抑制表現之MDA-MB231細胞中，DNA損壞處之RNR會引起dUTP嵌入，遂接著測試腫瘤細胞中R2含量增高，是否為決定TMPK對於DNA修復之需求的主要因素。MCF-7細胞表現大量R2，而其p53R2表現量與H184B5F5/M10細胞所觀察到的類似。於是藉由siRNA轉感染來降低MCF-7細胞的R2表現量，以測試之R2貢獻(圖11A )。流動式細胞計數分析顯示，藉由siRNA轉感染減少R2表現量，或結合抑制TMPK表現並不會增加族群(圖11B )。於復原後24小時，經單獨R2 siRNA或R2/TMPK siRNA轉感染之細胞中有偵測到γH2AX foci。然而，於復原後36小時，發現減少R2表現可補救因抑制TMPK表現之MCF-7細胞的DNA修復(圖11C,D )。因此，似乎並非由細胞週期之分布決定DNA修復對於抑制TMPK表現之反應。而R2的量才是關鍵因素。
本實驗進一步藉由慢病毒感染，來提高MCF-10A細胞中R2的量，並測定DNA修復對於抑制TMPK表現之反應。結果顯示，強迫R2表現會在TMPK表現受抑制之細胞造成永存的γH2AX染色，而對於細胞週期分布僅有少量影響(圖11E )。因此，提高R2表現會使MCF10A之DNA修復轉向對抑制TMPK表現敏感。總而言之，本實驗之證據證明增加R2的表現量以及將RNR補給到DNA損壞處，是使TMPK成為腫瘤細胞DNA修復之決定性組成的關鍵要素。
實施例4：篩選及鑑定YMU1為人類TMPK抑制劑
基於腫瘤細胞R2表現量很高，在DNA受損後之修復上於TMPK的功能上需求，本實驗探究hTMPK抑制劑可否用於使腫瘤細胞選擇性對亞德里亞黴素增敏之可能性。藉由使用結合螢光素酶之TMPK分析(Hu與Chang,2010)，其中TMPK之抑制可使更多ATP用於由螢光素酶產生冷光(圖12A )，對21,120個小分子之集庫進行篩選，鑑定出一個高度有效的化合物YMU1，其結構列示於圖12B 。YMU1(化合物21 )之合成方法及結構說明，敘述於發明說明之方法段落中。
酵素分析確定YMU1為hTMPK抑制劑，具有IC50 為0.61±0.02 μM(圖12C )，而對純化的胸腺嘧啶核苷激酶1(TK1)活性無抑制作用(圖12D )。為研究結構與活性關係，遂合成兩種片段化合物(D3(化合物4 )與D6(4-(2-氯乙醯基)六氫吡嗪-1-羧酸乙酯))，一種O -烷基化異構物D7(化合物28 )與苯異噻唑酮衍生物D8(化合物10 )(圖12B )。D6(做為YMU1之六氫吡嗪片段)或D7(做為YMU1之O-烷基化異構物)皆未顯示對hTMPK之抑制作用，而D3(做為YMU1之吡啶并異噻唑酮片段)呈現弱的抑制活性。有趣地，苯異噻唑酮衍生物D8亦呈現相當的抑制功能。
藉由將不同濃度之YMU1與純化的hTMPK蛋白進行預反應，並使用習知TMPK分析測量初速度而測定YMU1之抑制方式。使用非線性回歸分析測定Km 與Vmax 值，列示於表1。
對於Ki 值之測定，係將所指定濃度之YMU1與0.5 μg純化的hTMPK蛋白進行預反應10分鐘，並於ATP(1 mM)與不同濃度之TMP(2~200 μM)存在下，或於TMP(200 μM)與不同濃度之ATP(5~1000 μM)存在下，使用結合NADH的TMPK分析(如發明說明之方法段落中所述)測量TMPK反應之初速度。數據以平均值±s.d.表示，n=4。計算得自非線性回歸分析之數據用於測定Km 與Vmax 值。從方程式：Ki =[I]/(Vmax /Vmax’ -1)計算得YMU 1化合物對於hTMPK之Ki 值，其中[I]與Vmax’ 分別是，YMU1化合物濃度及有YMU1存在下之最大速率。Ki 值代表從三種不同YMU1濃度獲得的平均。
與YMU1進行預反應會減低hTMPK之Vmax(以濃度-依賴性的方式)，且會增加對於ATP之Km而不影響對於TMP之Km 。抑制常數(Ki )經由動力學分析測定為0.22±0.03 μM(表1)。
進行分子對接研究以分析TMPK受YMU1抑制之機制。動力學研究暗示，YMU1可能作用在TMPK之ATP結合凹穴。利用TMPK與ATP和Mg+2 之共結晶結構，將YMU1對接入ATP凹穴中。以此對接狀態，YMU1阻止一個Mg+2 離子與催化功能域中的Asp15殘基反應(圖12E )。因為將Asp15突變成Arg會促使TMPK之催化功能喪失，故有可能TMPK與YMU1之預反應會阻礙指向ATP凹穴中Asp15之催化功能的Mg+2 結合，而藉此減低催化效率。將D3(化合物4 )、D6(4-(2-氯乙醯基)六氫吡嗪-1-羧酸乙酯)及D7(化合物28 )對接入此等部位，並不能阻斷Asp15與Mg+2 結合，因此，彼等不會抑制TMPK。
進行其他實驗以測定YMU1處理對於細胞內dTTP濃度之影響。細胞經YMU1處理3天後，其中的dTTP庫減少約30-40%(圖13 )。將此等細胞以siRNA轉感染而抑制TMPK表現，會使dTTP庫之大小減少相似的幅度。YMU1處理在此等TMPK抑制表現之細胞並不會造成進一步的減少(圖13 )，表示YMU1降低dTTP含量之能力係取決於細胞中是否存在TMPK。
實施例5：YMU1不具基因組毒性且類似TMPK緘默會損害DSBs修復 .
TMPK與TS為dTTP合成中之關鍵酵素，且TS已知為一種主要的化療標靶(Garg等人,2010)。由FdUrd對TS之抑制作用會造成基因組毒性(Longley等人,2003)。已知TMPK與TS在dTTP合成中扮演相同角色，本實驗接著比較，藉由shRNA干擾或抑制劑處理來阻斷TMPK及TS，對於誘導DNA損壞的影響。如γH2AX染色之結果所示(Mah等人,2010)，干擾TS表現或FdUrd處理會誘導嚴重的DNA損壞，而TMPK緘默與YMU1處理則不會(圖14A )。
本實驗亦比較YMU1及FdUrd對於非腫瘤哺乳動物循環細胞H184B5F5/M10與MCF-10A，及腫瘤細胞系MCF-7與HCT-116p53 -/- 細胞之存活率的影響。由群落與分析指出，FdUrd會引起此等細胞死亡而YMU1不會(圖14B )。因此，不像阻斷TS，標靶TMPK(本身)不會對正常不斷生長細胞造成基因組毒性或細胞毒性。接著檢測對於MDA-MB231與H184B5F5/M10細胞中在從低劑量亞德里亞黴素處理復原後，修復由亞德里亞黴素所誘導之DNA損傷的影響。
應注意，YMU1處理並不影響DNA損傷形成之數量，此由γH2AX焦點染色進行測定。類似抑制TMPK表現，以YMU1前處理會促使70%以上的MDA-MB231細胞，在從亞德里亞黴素處理復原48小時後仍為γH2AX-陽性(圖14C )，且在復原期間不影響細胞週期進行(數據未示)。
彗星分析進一步確認YMU1處理會在受亞德里亞黴素處理之細胞中，導致DNA修復被破壞(圖15 )。GFP-TMPK之過量表現會使MDA-MB231細胞對YMU1造成的持續DNA損傷產生抗性，此支持YMU1係藉由標靶TMPK而作用(圖14D )。類似於以siRNA抑制表現，YMU1亦造成永久性Rad51 foci及增加XRCC1 foci形成(其可藉由干擾UNG表現而消除)(圖14 E-G )。可藉由過量表現dUTPase或R1次單位之C-端90個胺基酸，逆轉YMU1對於破壞DNA修復之影響(圖14 H-I )，確認YMU1不影響修復過程。
實施例6：於活體外及活體內YMU1使惡性腫瘤細胞對亞德里亞黴素增敏
接著，將各種不同細胞系以YMU1、D6或D7處理72小時，以測試TMPK抑制劑用於增敏作用之可能性。待暴露至不同濃度的亞德里亞黴素處理4小時後，細胞在正常生長培養液中培養兩天之後進行存活分析，並測定各細胞系對於亞德里亞黴素之IC50 值(圖16A 及表2)。
在HT-29、U2OS、CL-1-0、HCT-116 p53+/+、HCT-116 p53-/-、H1299、MDA-MB468、MDA-MB231及SaoS2惡性腫瘤細胞中，YMU1處理增加之敏感度範圍從3-至35-倍。YMU1使非腫瘤乳房不斷生長性H184B5F5/M10、MCF10A細胞、初生人類乳房上皮細胞(HMEC)與初生腎上皮細胞(HREC)及IMR-90胚胎肺成纖維細胞對亞德里亞黴素增敏的能力較弱許多。兩株在同源重組修復上有缺陷之BRCA 1/2缺陷型腫瘤細胞，在亞德里亞黴素增敏方面對YMU1沒有反應。不活化的D6(4-(2-氯乙醯基)六氫吡嗪-1-羧酸乙酯)及D7(化合物28 )在此等細胞中不具有亞德里亞黴素增敏功效。
群落分析進一步顯示，YMU1在不同癌細胞系中顯著增強亞德里亞黴素(0.1 μM)之致死效用(圖16B )。抑制TMPK表現不能再進一步使經YMU1處理之MDA-MB231細胞對亞德里亞黴素增敏(圖17 )，表示YMU1在亞德里亞黴素增敏作用之專一性是藉由標靶TMPK。過量表現野生型dUTPase能夠防止YMU1/亞德里亞黴素誘發之細胞凋亡，由Annexin V的染色減少所呈現(圖18 )。而且，YMU1能抑制dUTPase(圖19 )。
亦使用活體內異種移植模式來檢測，做為佐劑對低劑量亞德里亞黴素處理增敏的功效。將HCT-116p53 -/- 細胞接種入裸鼠中。經四天後，使小鼠開始接受每週分別三次及兩次YMU1與亞德里亞黴素的i.p.注射。以YMU1與亞德里亞黴素之處理持續進行4星期。於經單獨亞德里亞黴素或YMU1處理之小鼠中的腫瘤成長速率，與對照組中的類似。反之，在以YMU1/亞德里亞黴素雙重處理之小鼠中的腫瘤成長顯得緩慢許多(圖16C )。在施予最後一次注射後兩星期，將小鼠犧牲並測量腫瘤重量。在經YMU1/亞德里亞黴素雙重處理之小鼠中，觀察到良好的腫瘤抑制效果，其平均腫瘤大小為對照組小鼠的25%(圖16D )。於此等實驗條件下，以單獨亞德里亞黴素或YMU1處理之小鼠中的腫瘤大小很類似。符合腫瘤成長之數據，在以YMU1與亞德里亞黴素組合處理之裸鼠中，腫瘤增生指數(藉由測量Ki 67免疫染色指示)有明顯降低(圖16E )。
為分析YMU1之活體內毒性，遂將Balb/c小鼠以YMU1處理4週，於腫瘤異種移植研究中使用2-倍較高的劑量療程。歷經4週時程，YMU1處理不會改變小鼠體重。此外，在對照組與處理小鼠之不同器官(心臟、肝臟、脾臟、肺臟與腎臟)重量，及血液學分析結果很相似(表3)。總和上述，YMU1(本身)不會對正常小鼠產生毒性作用。結合低劑量亞德里亞黴素，YMU1可抑制小鼠之腫瘤生長。
實施例7：TMPK抑制劑衍生物之活體外及活體內活性
以下列示用於測試活體外TMPK抑制活性，及活體內(於MDA-MB231細胞)亞德里亞黴素增敏活性之不同TMPK抑制劑衍生物的化學結構。
於一項具體實例，係指定化合物21 (YMU1)為標準物，於2 μM之濃度下具有100%抑制效益。據此，其他TMPK抑制劑衍生物化合物的抑制效益經正常化如下(n=3或6)：化合物1 (74.0%)，化合物2 (7.0%)，化合物3 (76.5%)，化合物4 (28.0%)，化合物5 (92.9%)，化合物6 (96.0%)，化合物7 (98.3%)，化合物8 (29.1%)，化合物9 (47.0%)，化合物10 (96.8%)，化合物11 (100.4%)，化合物12 (124.5%)，化合物13 (127.2%)，化合物14(129.4%)，化合物15 (102.3%)，化合物16 (11.8%)，化合物17 (10.1%)，化合物18 (51.4%)，化合物19 (100.5%)，化合物20 (99.5%)，化合物21 (YMU1，100%)，化合物22 (111.6%)，化合物23 (0%)，化合物24 (117.7%)，化合物25 (7.8%)，化合物26 (16.4%)，化合物27 (16.0%)及化合物28 (14.7%)。
基於此等結果，該雙環核心結構似乎對於TMPK抑制劑之活性是重要的。如以化YMU1(合物21 )及相關化合物所例舉說明的，位於噻唑酮環上之N-烷基化結構，似乎為所觀察到的活性所必需，而六氫吡嗪環之C-端部分是活體內亞德里亞黴素增敏作用所必需的。
本發明之方法 抗體
抗-hTMPK與抗-hTK1多株抗體係如先前技藝所述製備(Chang等人,1994；Ke等人,2005)。抗-R2(sc-10844)、抗-p53R2及抗-ATM(sc-23921)抗體係購自Santa Cruz。藉由以純化的GST-hdUTPase(不透明形式)蛋白免疫兔子，而製造並收集對抗hdUTPase之抗血清，之後再以親和性純化得多株抗體。經由RNAi實驗確定hTMPK、R2及hdUTPase抗體之專一性(圖20 )。抗-GFP抗體(632375)購自BD生物科學公司(BD Biosciences)。抗-hTS抗體(純株4H4B1)購自Zymed Laboratories inc.。抗-Rad-51抗體(PC130)購自Calbiochem。抗-γH2AX(Ser139)及抗-XRCC1(純株33-2-5)抗體係分別購自Upstate與Thermo Fisher Scientific Inc.。抗-β-微管蛋白、抗-β-肌動蛋白、抗兔子IgG-FITC、抗小鼠IgG-FITC及抗小鼠IgG-TRITC抗體係購自Sigma。
試劑
G418與轉感染試劑nanofectin分別購自Invitrogen及PAA laboratories Inc.。ATP、TMP、NADH、磷酸烯醇丙酮酸、5,5’-二硫-雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、螢光素、螢火蟲(Photinus pyralis )螢光素酶、人類凝血酶、牛血清白蛋白(BSA)、亞德里亞黴素及H33342係購自Sigma。乳酸脫氫酶與丙酮酸激酶購自Roche。麩胱甘肽4B珠粒購自Amersham Pharmacia，而Annexin V-PE細胞凋亡套組(CBA-060)與MTS試劑係分別購自Calbiochem及Promega。hTMPK siRNA得自Dharmacon siGenome SMART庫(MQ-006720)，R2 siRNA之合成及Lipofectamin 2000則來自。已透析血清購自GIBCOTM，pLKO-UNG shRNA與pLKO-dUTPase shRNA係購自台灣國家RNAi核心機構。
細胞培養及穩定細胞系之建立
HCT-116 p53+/+與p53-/-細胞是由約翰霍普金大學醫學系之Bert Vogelstein慷慨提供(Bunz等人,1998)。U2OS-DR-GFP細胞係由Sheau-Yen Shieh(Sinica學院)提供。已補充10% FBS之生長培養基使用如下：McCoy’s 5A用於HCT-116及U2OS，RPMI用於HT-29，DMEM用於MDA-MB231、MDA-MB468、HeLa及HEK-293T，MEM-α用於得自生物資源收藏與研究中心(新竹，台灣)的H184B5F5/M10細胞(楊等人,1996)。對於穩定表現TMPK shRNA之MDA-MB231細胞及穩定表現TMPK shRNA之HCT-116 p53-/-細胞的建立，係將細胞以慢病毒TMPK shRNA感染，之後將細胞以2 μg/ml殺稻瘟素(blasticidine)進行揀選。
用於化合物化學合成之一般材料
所有試劑與溶劑皆為試劑等級且無經進一步純化，除非另外特別指示。所有試劑為無水等，除非另外特別指示。二氯甲烷(CH2 Cl2 )經CaH2 蒸餾得。所有空氣或濕度敏感實驗皆於氮氣下進行。反應是藉由薄層色層分析術(TLC)，於E. Merck 0.25 mm矽膠60 F254 玻璃板上進行偵測。化合物由UV呈像，或使用對甲氧苯甲醛、寧海得林(Ninhydrin)及磷鉬酸(PMA)做為顯影劑。E. Merck矽膠60(粒徑0.040-0.063 mm)係用於急驟層析術。
儀器操作
於Yanaco微設備記錄熔點。以PerkinElmer Lamda 35 UV-Vis分光光度計測量吸收光譜。核磁共振(NMR)光譜係於Varian Unity Plus-400(400 MHz)取得，並相對於之(三峰之中央線)、CHCl3 /CDCl3 之δH 7.24/δC 77.0、CH3 OH/CD3 OD之δH 3.31/δC 49.0及(CH3 )2 SO/(CD3 )2 SO之δH 2.50(m)/δC 39.5(m)，記錄化學位移(δ)，以每百萬分之一(ppm)為單位。分裂型式記錄為s(單峰)、d(雙峰)、t(三峰)、q(四峰)、m(多峰)及br(分散)。偶合常數(J)單位為Hz。於Bruker Daltonics BioTOF III高解析質譜儀進行ESI-MS實驗。高效能液態層析術(HPLC)係於裝備有除氣機(Quat幫浦)與UV偵測器之Agilent 1100系列儀器上進行。
化合物純度測定
經由HPLC，於流速為1 mL/min之HC-C18管柱(Agilent,4.6×250mm,5 μM)，以20-90%、30-90%或40-90%CH3 CN水溶液梯度溶析15或20分鐘而測定化合物之純度。
6-甲基異噻唑并[5,4- b ]吡啶-3(2 H )-酮(化合物3) 。將2-氯-6-甲基菸鹼腈(220 mg，1.45 mmol)與硫脲(348 mg，4.57 mmol)置於n -丁醇中於迴流(118℃)下加熱4小時。冷卻至室溫後，該黃色溶液轉變成含有黃色固體之懸浮液。藉由過濾將固體收集，以n -丁醇清洗並於真空中乾燥而得2-巰基-6-甲基菸鹼腈(218 mg，產率100%)。C7 H6 N2 S；黃色粉末，1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 7.97(1 H,dt,J =8,0.8 Hz),7.79(1H,dt,J =8,0.8 Hz),7.70(1H,td,J =8,1.2 Hz),7.46(1H,td,J =8,1.2 Hz),4.64(2 H,s)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 177.39,154.77,144.83,117.1,113.3,112.7,19.2；ESI-HRMS(負電模式)C7 H5 N2 S之計算值：149.0173,實驗值：m/z 149.0172[M-H]- 。
將上述製備得之化合物(120 mg，0.80 mmol)加至濃H2 SO4 (1 mL)中。將混合物浸泡於預熱之100℃油浴中4小時。然後將混合物冷卻，並藉由添加飽和NaHCO3 調整到pH 5-6，產生內含不溶物質的懸浮液。藉由過濾將固體收集，並於真空中乾燥而得所述之標題化合物(86 mg，產率65%%)。C7 H6 N2 S；黃色粉末；mp 187-190℃；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 8.16(1 H,d,J =7.8 Hz),7.21(1 H,d,J =7.8 Hz),2.70(3 H,s)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 167,0,165.5,164.1,134.1,120.2,116.1,24.1；ESI-HRMS(負電模式)C7 H5 N2 OS之計算值：150.9966,實驗值：m/z 150.9965[M-H]- 。
4,6-二甲基異噻唑并[5,4- b ]吡啶-3(2 H )-酮(4)。 將2-氯-4,6-二甲基菸鹼腈(800 mg，4.83 mmol)與硫脲(1.2 kg，15.76 mmol)置於n -丁醇中於迴流(118℃)下加熱4小時。冷卻至室溫後，該黃色溶液轉變成含有黃色固體之懸浮液。藉由過濾將固體收集，以n -丁醇清洗並於真空中乾燥而得2-巰基-4,6-二甲基菸鹼腈(778 mg，產率98%)。C8 H8 N2 S；淺黃色粉末；mp 219-221℃；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 6,40(1 H,s),2.45(3 H,s),2.43(3 H,s)；ESI-HRMS(負電模式)C8 H7 N2 S之計算值：163.0330,實驗值：m/z 163.0332[M-H]- 。
將上述製備得之化合物(750 mg，4.57 mmol)加至濃H2 SO4 (5 mL)中。將混合物浸泡於預熱之100℃油浴中4小時。然後將混合物冷卻，並藉由添加飽和NaHCO3 調整到pH 5-6，產生內含不溶物質的懸浮液。藉由過濾將固體收集，並於真空中乾燥而得所述之標題化合物(743 mg，產率84%)。C7 H6 N2 S；黃色粉末；mp 190-193℃；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 6.93(1 H,s),2.74(3 H,s),2.60(3H,s)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 167.5,165.8,162.6,149.2,122.0,114.5,25.0,18.2；ESI-HRMS(負電模式)C8 H7 N2 OS之計算值：179.0279,實驗值：m/z 179.0281[M-H]- 。
4-(1-氧異吲哚啉-2-羰基)六氫吡嗪-1-碳酸乙酯(5)。 將六氫吡嗪-1-碳酸酯(300 mg，1.90 mmol)、4-硝基苯基氯甲酸酯(460 mg，2.28 mmol)與Et3 N(576 mg，5.69 mmol)溶於無水CH2 Cl2 (7 mL)之混合物於室溫下攪拌24小時，然後該反應混合物轉為黃色溶液。以NaHCO3(aq.) 萃取直到有機層轉為透明溶液。然後將有機層通過MgSO4 乾燥，經過濾、濃縮，及藉由於使用EtOAc/己烷(1:1.5)溶析之矽膠管柱上進行的急驟層析術純化，得到4-(4-硝基苯基)六氫吡嗪-1,4-二碳酸1-乙酯(172 mg，產率45%)。C14 H17 N3 O6 ；淡黃色固體；mp 125-128℃；IRv max (neat)3512,3082,2983,2930,2867,1730,1701,1594,1523,1459,1425,1348,1288,1209,1163,1085,1055,996,957 cm-1 ；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 8.23(1H,d,J =8.8 Hz),7.28(1H,t,J =8.8 Hz),4.17(2H,q,J =6.8 Hz),3.66(2H,br s),3.56(6H,br s),1.28(3H,t,J =7.2 Hz)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )δ155.7,155.1,151.9,144.7,124.9(2×),122.1(2×),61.8,44.5,43.8,43.4(2×),14.8。
將上述製備得之p -硝基苯基胺甲酸酯(100 mg，0.31 mmol)、苯并噻唑酮(化合物1 ，56 mg，0.37 mmol)、4-二甲基胺基吡啶(DMAP，113 mg，0.92 mmol)與二異丙基乙胺(DIEA，120 mg，0.93 mmol),溶於CH2 Cl2 (3 mL)之混合物於室溫下攪拌。將混合物攪拌48小時，接著依序以1 M HCl(aq) 及飽和NaHCO3(aq .) 萃洗。將有機層通過MgSO4乾燥，經過濾、濃縮，及於使用CH2 Cl2 /MeOH(9:1)做為延展溶液之薄層矽膠平板(20 cm×20 cm×2 mm)上進行純化，而得標題化合物。C15 H17 N3 O4S；白色油體；IRv max(neat)2923,2853,1689,1423,1259,1229,995,749 cm-1 ；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ7.96(1 H,d,J =8.0 Hz),7.66(1H,d,J =8.0 Hz),7.52(1H,d,J =8.0 Hz),7.40(1H,d,J =8.0 Hz),4.16(2H,q,J =8.0 Hz),3.63(8H,m),1.28(3H,t,J =6.8 Hz)；ESI-HRMS C15 H17 N3 O4 NaS之計算值：358.0837，實驗值：m/z 358.0827[M+Na]+ 。
2-(3-氧苯并[ d ]異噻唑-2(3 H )-基)乙酸甲酯(6) 。將苯并噻唑酮1(500 mg，3.31 mmol)懸浮於含有DIEA(1.28 kg，9.93 mmol)及CS2 CO3 (1.75 kg，3.30 mmol)之CH2 Cl2 (25 mL)中。然後於室溫下將2-溴乙酸甲酯(800 mg，5.26 mmol)加入。將混合物攪拌5小時，於減壓下濃縮，及藉由於使用EtOAc/己烷(1:2)溶析之矽膠管柱上進行的急驟層析術純化，而得到標題化合物(495 mg，產率67%)。C10 H9 NO3 S；白色固體；mp 89-91℃；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 8.15(1H,dt,J =8,0.8 Hz),7.59(1 H,td,J =7.2,1.2 Hz)7.52(1 H,dt,J =8,0.8 Hz)7.37(1 H,td,J =7.2,1.2 Hz),4.59(2 H,s),3.76(3H,s)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 167.8,165.4,140.6,132.0,126.7,125.4,123.2,120.2,52.6,44.5；ESI-HRMS C10 H9 NO3 S之計算值：224.0381，實驗值：m/z 224.0390[M+H]+ 。
2-(4,6-二甲基-3-氧異噻唑并[5,4- b ]吡啶-2(3 H )-基)乙酸甲 酯(7) 。為增加N -烷基化超越O -烷基化之選擇性，將吡啶并噻唑酮4 (500 mg，2.77 mmol)懸浮於含有二異丙基乙胺(DIEA，1.5 mL，8.61 mmol)及Cs2 CO3 (700 mg，3.07 mmol)之CH2 Cl2 (20 mL)中。然後於室溫下將2-溴乙酸甲酯(900 mg，5.88 mmol)加入。將混合物攪拌5小時，於減壓下濃縮，及藉由於使用EtOAc/己烷(1:4)溶析之矽膠管柱上進行的急驟層析術純化，而得到標題化合物7 (360 mg，產率55%)，伴隨有O -烷基化副產物產生(7%)。化合物7 ：C11 H12 N2 O3 S；白色固體；mp 89-91 ℃；IR vmax (neat) 2928,1766,1728,1664,1561,1523,1435,1375,1324,1210 cm-1 ；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 6.92(1 H,s),4.54(2 H,s),3.76(3 H,s),2.70(3 H,s),2.57(3 H,s)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 167.4,164.3,162.6,162.3,149.6,122.4,113.8,52.8,44.2,24.9,17.8；ESI-HRMS C11 H13 N2 O3 S之計算值：253.0647，實驗值m/z 253.0657[M+H]+ 。
2-(3-氧苯并[ d ]異噻唑-2(3 H )-基)乙酸(8)。 將酯6 (500 mg，2.24 mmol)懸浮於濃HCl(8 mL)中，並伴隨攪拌於100℃下加熱6小時直到水解完成。將混合物冷卻至室溫，以水(500 mL)稀釋，並收集沉澱而得標題化合物(460 mg，產率98%)。C9 H7 NO3 S；白色固體；mp 241-243℃；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 7.97(1 H,dt,J =8,0.8 Hz),7.79(1 H,dt,J =8,0.8 Hz),7.70(1 H,td,J =8,1.2 Hz),7.46(1 H,td,J =8,1.2 Hz),4.64(2 H,s)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 169.4,166.4,141.8,132.3,125.8,125.5,123.4,121.0,44.4；ESI-HRMS(負電模式)C9 H7 NO3 S之計算值：208.0068，實驗值：m/z 208.0064[M-H]- 。
2-(4,6-二甲基-3-氧異噻唑并[5,4- b ]吡啶-2(3 H )-基)乙酸 (9) 。將酯7 (160 mg，0.63 mmol)懸浮於濃HCl(4 mL)中，並伴隨攪拌於100℃下加熱6小時直到水解完成。將混合物冷卻至室溫，以水(500 mL)稀釋，並收集沉澱而得標題化合物(151 mg，產率100%)。C10 H10 N2 O3 S；白色固體；mp 355℃(分解)；1 H NMR(400 MHz,CD3 OD) δ 7.13(1 H,s),4.60(2 H,s),2.71(3 H,s),2.59(3 H,s)；13 C NMR(100 MHz,CD3 OD) δ 170.2,165.7,164.2,163.3,151.3,123.3,115.1,45.2,24.7,17.9；ESI-HRMS(負電模式)。C10 H9 N2 O3 S之計算值：237.0334，實驗值：m/z 237.0329[M-H]- 。
2-(2-氧-2-(六氫吡嗪-1-基)乙基)苯并[ d ]異噻唑-2(3 H )-酮 (10) 。將胺甲酸第三-丁酯12 (50 mg，0.13 mmol)與三氟乙酸(TFA，2 mL，26.1 mmol)溶解於無水CH2 Cl2 (15 mL)中，然後於27℃下攪拌2小時。將TFA於減壓下移除；將殘餘物以胺溶液(35%)及CH2 Cl2 萃取。將有機層通過MgSO4 乾燥、過濾、及濃縮，而得標題化合物(32 mg，產率87%)。以於HC-C18管柱(Agilent,4.6×250mm,5 μM)上，t R =7.52 min(15分鐘內之梯度為20-90% CH3 CN水溶液)進行的HPLC顯示化合物純度為98.4%。C13 H15 N3 O2 S；泡沫；IR νmax (neat) 3449,2924,2852,1639,1448,1356,1243,1202,1134,1031,929,744 cm-1 ；1 H NMR(400 MHz,CD3 OD) δ 7.97(1 H,dt,J =8.0,0.8 Hz),7.79(1 H,dt,J =8.0,0.8 Hz),7.70(1 H,m),7.38(1 H,m),4.82(2 H,s),3.58(4 H,m),2.90(2 H,t,J =5.2 Hz),2.84(2 H,t,J =5.2 Hz)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 165.5,164.7,141.3,131.9,126.6,125.3,123.3,120.2,46.5,46.2,45.7,44.8,43.3；ESI-HRMS C13 H16 N3 O2 S之計算值：278.0963，實驗值：m/z 278.0962[M+H]+ 。
4-(2-(3-氧苯并[ d ]異噻唑-2(3 H )-基)乙醯基)六氫吡嗪-1-碳 酸乙酯(11)。 於室溫下將4-(2-碘乙醯基)六氫吡嗪-1-碳酸乙酯(200 mg，0.61 mmol)加入含苯并噻唑酮1 (102 mg，0.67 mmol)、Et3 N(233 mg，1.83 mmol)及CS2 CO3 (198 mg，0.61 mmol)懸浮於CH2 Cl2 (8 mL)之懸浮液中。將混合物攪26小時，並以1 M HCl(aq) 萃洗。將有機相通過MgSO4 乾燥、過濾、濃縮，及藉由於使用EtOAc/己烷(1:2)溶析之矽膠管柱上進行的急驟層析術純化，而得到標題化合物(134 mg，產率63%)。以於HC-C18管柱(Agilent,4.6×250mm,5 μM)上，t R =11.87 min(20分鐘內之梯度為20-90% CH3 CN水溶液)進行的HPLC顯示化合物純度為99.3%。C16 H19 N3 O4 S；白色固體；mp 158-160℃；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 8.09(1 H,dd,J =7.2 Hz,0.8 Hz),7.59(1 H,m),7.53(1 H,dd,J =7.2,0.8 Hz),7.38(1 H,m),4.69(2 H,s),4.13(2 H,q,J =7.2 Hz),3.60(2 H,m),3.55(2 H,m),3.48(4 H,m),1.25(3 H,t,J =7.2 Hz)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 164.6,154.6,140.8,131.8,130.0,126.4,125.1,122.9,120.0,61.9,45.3,45.0,43.5(2×),42.2,15.0；ESI-HRMS C16 H19 N3 O4 S之計算值：372.0994，實驗值：m/z 372.0992[M+H]+ 。
4-(2-(3-氧苯并[ d ]異噻唑-2(3 H )-基)乙醯基)六氫吡嗪-1-碳 酸第三丁酯(12)。 將六氫吡嗪(1.10 g，12.8 mmol)與DIEA(1.65 g，12.8 mmol)混合於無水CH2 Cl2 (60 mL)之混合物於27℃下攪拌，並將二碳酸二第三丁酯(1.39 g，6.39 mmol)溶於無水CH2 Cl2 (80 mL)之溶液緩慢地經由分液漏斗加入，歷時20小時。將混合物以水分層；將有機相分離，通過MgSO4 乾燥、過濾及濃縮，而得六氫吡嗪-1-碳酸第三丁酯(2.01 g，產率85%)。C9 H18 N2 O2 ；白色固體；mp 45-46℃；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 3.38(4 H,t,J =4.8 Hz),2.80(4 H,t,J =4.8 Hz),1.73(1 H,s),1.45(9 H,s)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 154.1,79.5,45.9(2×),44.8(2×),28.7(3×)；ESI-HRMS C9 H19 N2 O2 之計算值：187.1447，實驗值：m/z 187.1451[M+H]+ 。
將上述製備得之六氫吡嗪-1-碳酸第三丁酯(500 mg，2.68 mmol)，於DIEA(1.04 g，8.05 mmol)存在下以氯化氯乙醯基(360 mg，2.95 mmol)處理，經由於矽膠管柱(EtOAc/己烷=1:2)上進行的急驟層析術純化，而得4-(2-氯乙醯基)六氫吡嗪-1-碳酸第三丁酯(571 mg，產率81%)。C11 H19 ClN2 O3 ；白色固體；mp68-70℃；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 4.06(2 H,s),3.58(2 H,m),3.49(4 H,s),3.44(2 H,m) 1.47(9 H,s)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 164.5,153.7,80.2,46.2,43.3(2×),42.1,40.9,28.5；ESI-HRMS C11 H20 ClN2 O3 之計算值：285.0982，實驗值：m/z 285.0985[M+H]+ 。
於室溫下，將上述製備得之含氯基化合物(52 mg，0.34 mmol)加入含苯并噻唑酮1 (90 mg，0.34 mmol)、Et3 N(175 mg，1.73 mmol)及Cs2 CO3 (167 mg，0.51 mmol)懸浮於無水CH2 Cl2 (20 mL)之懸浮液中。將混合物攪22小時，並於減壓下濃縮。將殘餘物以CH2 Cl2 及H2 O萃洗。將有機相通過MgSO4 乾燥、過濾、濃縮，及藉由於以EtOAc/己烷(3:1)溶析之矽膠管柱上進行的急驟層析術純化，而得到標題化合物(87 mg，產率67%)。以於HC-C18管柱(Agilent,4.6×250mm,5 μM)上，t R =16.6 min(20分鐘內之梯度為20-90% CH3 CN水溶液)進行的HPLC顯示化合物純度為96.9%。C18 H23 N3 O4 S；白色固體；mp 120-122℃；IR vmax (neat) 2974,2925,1655,1460,1418,1364,1339,1285,1171,1128,1068,1028 740 cm-1 ；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 8.00(1 H,d,J =8.0 Hz),7.58(1 H,td,J =8.0,0.8 Hz),7.52(1 H,d,J =8.0 Hz),7.38(1 H,td,J =8.0,0.8 Hz),4.68(2H,s),3.59(2 H,m),3.53(2 H,m),3.41(4 H,m),1.44(9 H,s)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 165.0,164.6,153.8,140.8,131.8,126.4,125.1,122.9,120.0,80.4,45.3,45.0,43.4(2×),42.2,28.7(3×)；ESI-HRMS C18 H24 N3 O4 S之計算值：400.1307，實驗值：m/z 400.1301[M+H]+ 。
4-(2-(3-氧苯并[ d ]異噻唑-2(3 H )-基)乙醯基)六氫吡嗪-1-碳 酸苯甲酯(13)。 於室溫下，將化合物10 (100 mg，0.36 mmol)與氯甲酸苯甲酯(75 mg，0.44 mmol)及DIEA(140 mg，1.10 mmol)，於無水CH2 Cl2 (5 mL)與DMF(1 mL)中反應4小時。將CH2 Cl2 及DMF於減壓下去除。將混合物依序以1 M HCl(aq) 及飽和NaHCO3(aq.) 萃洗。將有機層通過MgSO4 乾燥，經過濾、濃縮，及於使用CH2 Cl2 /MeOH(9:1)做為延展溶液之薄層矽膠平板(20 cm×20 cm×2 mm)上進行純化，而得標題化合物。C21 H21 N3 O4 S；白色固體；mp 138-142℃；IR νmax (neat) 2923,2854,1700,1655,1428,1354,1286,1227,1125,1075,1027,984,861,741 cm-1 ；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 8.01(1 H,d,J =8.0 Hz),7.60(1 H,t,J =7.2 Hz),7.53(1 H,d,J =8.0 Hz),7.36(6 H,m),5.12(2 H,s),4.69(2 H,s),3.62(8 H,m)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 165.1,154.8,141.1,136.1,132.1,128.5,128.1,127.9,126.7(2×),126.3(2×),125.4,123.2,120.2,67.6,45.2,44.9,43.6(2×),42.0；ESI-HRMS C21 H21 N3 O4 NaS之計算值：434.1150,實驗值：m/z 434.1149[M+H]+ 。
4-硝基苯基4-(2-(3-氧苯并[ d ]異噻唑-2(3 H )-基)乙醯基)六 氫吡嗪-1-碳酸酯(14)。 於室溫下，將化合物10 (81.5 mg，0.29 mmol)與4-硝基苯基氯甲酸酯(213 mg，1.06 mmol)及DMAP(108 mg，0.88 mmol)，於無水CH2 Cl2 (4 mL)中反應16小時。將混合物依序以飽和NaHCO3(aq.) 及1 M HCl(aq) 萃洗，直到溶液變為透明。將有機相通過MgSO4 乾燥、過濾、濃縮，及經由於以CH2 Cl2 /MeOH(100:0.5至9:1)溶析之矽膠管柱上進行的急驟層析術純化，而得到標題化合物(70 mg，產率56%)。C20 H18 N4 O6 S；淡黃色固體；mp 114-118℃；IR νmax (neat) 2923,2854,1725,1655,1520,1346,1259,1163,1111,1056,1024,862,748 cm-1 ；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 8.22(2 H,d,J =10.2 Hz),8.02(1 H,d,J =8.0 Hz),7.62(2 H,t,J =8.0 Hz),7.55(1 H,d,J =8.0 Hz),7.40(1 H,t,J =8.0 Hz),7.27(1 H,d,J =10.2 Hz),4.73(2 H,s),3.70(6 H,br s),3.62(2 H,br s)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 165.4,165.1,155.5,151.7,144.7,141.0,132.1,126.5,125.4,124.9(2×),123.0,122.0(2×),120.2,44.7,44.5,44.2,43.8,43.6；ESI-HRMS C20 H19 N4 O6 S之計算值：443.1025，實驗值：m/z 443.1042[M+H]+ 。
2-(2-(4-丙烯基六氫吡嗪-1-)-2-氧乙基)苯并[ d ]異噻唑-2(3 H )-酮(15)。 於室溫下，將化合物10 (30 mg，0.11 mmol)與溴化丙烯基(16 mg，0.13 mmol)及DIEA(40 mg，0.31 mmol)，於無水CH2 Cl2 (2 mL)中反應6小時。然後藉由減壓將溴化丙烯基去除，並將殘餘物以H2 O清洗，在於使用CH2 Cl2 /MeOH(9:1)做為延展溶液之薄層矽膠平板(20 cm×20 cm×2 mm)上進行純化後，得到標題化合物。C16 H19 N3 O2 S；白色固體；mp 119-120 ℃；IR νmax (neat) 3072,2920,2857,2801,1717,1653,1448,1339,1262,1234,1136,1038,1000,924,748 cm-1 ；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 8.02(1 H,d,J =8.0 Hz),7.58(1 H,t,J =7.6 Hz),7.53(1 H,d,J =8.0 Hz),7.37(1 H,t,J =7.6 Hz),5.80(1 H,m),5.16(2 H,m),4.69(2 H,s),3.65(2 H,t,J =5.2 Hz),3.57(2 H,t,J =5.2 Hz),2.99(2 H,d,J =6.8 Hz),2.45(4 H,m)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 165.5,164.7,134.1,132.0,126.7,125.3,120.2,118.5,61.5,52.9,52.5,45.3,44.8(2×),42.2,29.8；ESI-HRMS C16 H20 N3 O2 S之計算值：318.1274,實驗值：m/z 318.1274[M+H]+ 。
2-(2-氧-2-(六氫吡嗪-1-基)-乙基)苯并[ d ]異噻唑-2(3 H )-酮 1,1-二氧化物(16)。 將化合物17 (39 mg，0.10 mmol)與三氟乙酸(TFA，1 mL，13.2 mmol)溶解於無水CH2 Cl2 (2 mL)中，然後於27℃下攪拌2小時。將TFA於減壓下去除，並將殘餘物以乙基醚清洗，而得產物37 (45.3 mg，產率100%)。C13 H15 N3 O4 S；白色油體；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 8.10(2 H,m),8.01(1 H,td,J =7.6,1.2 Hz),7.96(1 H,td,J =7.6,1.2 Hz),4.78(2 H,s),3.91(2 H,br s),3.84(2 H,br s),3.36(2 H,br s),3.27(2 H,br s)；13 C NMR(100 MHz,CD3 OD) δ 165.7,160.6,139.2,136.6,136.0,128.2,126.2,122.3,67.0,44.4,43.2(2×),40.5；ESI-HRMS C13 H16 N3 O4 S之計算值：310.0862，實驗值：m/z 310.0865[M+H]+ 。
4-(2-(3-氧苯并[ d ]異噻唑-2(3 H )-基)乙醯基)六氫吡嗪-1-碳 酸第三丁酯1,1-二氧化物(17)。 於室溫下，將糖精(化合物2 ，200 mg，1.09 mmol)加入4-(2-碘乙醯基)六氫吡嗪-1-碳酸第三-丁酯(343 mg，0.97 mmol)、DIEA(382 mg，2.98 mmol)於無水CH2 Cl2 (5 mL)之懸浮液中。將混合物攪拌23小時，並依序以1 M HCl(aq) 及飽和NaHCO3(aq.) 萃洗。將有機層通過MgSO4 乾燥，經過濾、濃縮，及於以EtOAc/己烷(1:1.5)溶析之矽膠管柱上進行的急驟層析術純化，而得到標題化合物(159 mg，產率40%)。C18 H23 N3 O6 S；白色固體；mp 178-181℃；TLC(EtOAc/己烷=1:1.5)R f =0.2；IR νmax (neat) 3193,2974,2929,2851,1743,1689,1663,1459,1428,1330,1238,1181,1126,1057,999,973,877 cm-1 ；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 8.05(1 H,d,J =7.6 Hz),7.91(1 H,d,J =8.0 Hz),7.83(2 H,m),4.51(2 H,s),3.58(2 H,m),3.51(2 H,s),3.49(2 H,s)3.44(2 H,m),2.24(2 H,m),1.54(9 H,s)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 162.5,159.0,154.2,137.6,134.8,134.2,127.1,125.3,121.0,80.4,44.8(2×),42.2(2×),39.8,28.4(3×)；ESI-HRMS C18 H24 N3 O6 S之計算值：410.1386，實驗值：m/z 410.1396[M+H]+ 。
4-[2-(1,3-二氧-1,3-二氫-吲哚-2-基)-乙醯基)六氫吡嗪-1-碳 酸第三丁酯1,1-二氧化物(18)。 於40℃下，將酞醯亞胺(33 mg，0.23 mmol)以4-(2-氯乙醯基)六氫吡嗪-1-碳酸第三-丁酯(80.5 mg，0.32 mmol)、碘化四丁銨(TBAI，84 mg，2.3 mmol)、二異丙基乙胺(DIEA，0.20 mg，1.14 mmol)於無水CH2 Cl2 (10 mL)中處理24小時。將混合物置於CH2 Cl2 與水之間分配。將有機相分離，通過MgSO4 乾燥，經過濾、濃縮，及於以EtOAc/己烷(1:1)溶析之矽膠管柱上進行的急驟層析術純化，而得到標題化合物(57.1 mg，產率67%)。C19 H23 N3 O5 ；白色固體；TLC(EtOAc/己烷=1:1)R f =0.2；1 H NMR(400 MHz，CDCl3 ) δ7.85-7.87(2 H,m),7.70-7.72(2 H,m),4.49(2 H,s),3.51-3.57(6 H,m),3.44(2 H,d,J=5.2 Hz),1.46(9 H,d,J=4.8 Hz)。
4,6-二甲基-2-(2-嗎啉基-2-氧乙基)異噻唑并[5,4- b ]吡啶-2(3 H )-酮(19)。 於0℃下,將氯化氯乙醯基(840 mg，6.89 mmol)加入嗎福啉(500 mg，5.74 mmol)溶於含有Et3 N(1.74 g，17.22 mmol)之無水CH2 Cl2 (25 mL)的溶液中。將該混合物攪拌並加溫至27℃達2小時。將混合物以1 M HCl(aq) 萃洗。將有機相通過MgSO4 乾燥並於減壓下濃縮，而得2-氯-1-嗎啉基乙酮(1.13 g,產率100%)。C6 H11 ClNO2 ；棕色油體；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 4.05(2 H,s),3.69(4 H,m),3.62(2 H,m),3.52(4 H,m)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 164.4,66.5,66.4,46.8,42.5,40.8；ESI-HRMS C6 H12 ClNO2 之計算值：164.0478,實驗值：m/z 164.0478[M+H]+ 。
將上述製備得之含氯基化合物(225 mg，0.34 mmol)加入含吡啶并噻唑酮4 (200 mg，1.22 mmol)、Et3 N(370 mg，3.66 mmol)懸浮於無水CH2 Cl2 (25 ml)加熱至迴流(40℃)之懸浮液中。將該混合物攪拌24小時，並以1 M HCl(aq) 萃洗。將有機相通過MgSO4 乾燥，經過濾、濃縮，及於以EtOAc/己烷(1:1)溶析之矽膠管柱上進行的急驟層析術純化，而得到標題化合物(211 mg,產率55%)。伴隨有O -烷基化副產物產生(9%)。以於HC-C18管柱(Agilent,4.6×250mm,5 μM)上，t R =11.9 min(20分鐘內之梯度為20-90% CH3 CN水溶液)進行的HPLC顯示產物19 之純度為97.3%。C14 H17 N3 O3 S；白色固體；mp 200-203℃；IR νmax (neat) 3490,2921,2851,1704,1651,1467,1275,1111,1036,750 cm-1 ；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 6.91(1 H,s),4.62(2 H,s),3.67(4 H,m),3.62(2 H,m),3.54(2 H,m),2.70(3 H,s),2.58(3 H,s)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 164.8,164.8,163.2,162.9,149.8,122.5,114.0,66.7,66.4,45.5,44.1,42.5,25.0,17.6；ESI-HRMS C14 H18 N3 O3 S之計算值：308.1069,實驗值：m/z 308.1071[M+H]+ 。
4,6-二甲基-2-(2-氧-2-(六氫吡嗪-1-基)乙基)異噻唑并[5,4- b ]吡啶-2(3 H )-酮(20)。 將化合物22 (20 mg，0.05 mmol)與TFA(4 mL，52.6 mmol)溶解於無水CH2 Cl2 (15 mL)中，然後於27℃下攪拌0.5小時。將TFA於減壓下移除，並將殘餘物以胺溶液(35%)及CH2 Cl2 萃取。將有機層通過MgSO4 乾燥、過濾、及濃縮，而得標題化合物(16 mg，產率100%)。以於HC-C18管柱(Agilent,4.6×250mm,5 μM)上，t R =16.6 min(20分鐘內之梯度為20-90% CH3 CN水溶液)進行的HPLC顯示化合物純度為95.2%。C14 H18 N4 O2 S；白色固體；mp 175-177℃；IR νmax (neat) 3475,3310,2925,1652,1565,1443,1337,1275,1033,750 cm-1 ；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 6.92(1 H,S),4.64(2 H,s),3.62(2 H,m),3.53(2 H,m),2.88(4 H,m),2.72(3 H,s),2.59(3 H,s),2.04(1 H,s)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 164.4,164.1,162.9,162.4,149.4,122.6,113.9,46.5,46.3,45.9,44.4,43.5,24.9,17.9；ESI-HRMS C14 H19 N4 O2 S之計算值：307.1229，實驗值：m/z 307.1227[M+H]+ 。
4-(2-(4,6-二甲基-3-氧-異噻唑并[5,4- b ]吡啶-2(3 H )-基)乙醯 基)六氫吡嗪-1-碳酸乙酯(21,YMU1)。 將含酸9 (420 mg，1.76 mmol)與六氫吡嗪-1-碳酸乙酯(279 mg，1.76 mmol)之混合物以1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)羰二亞醯胺(EDCI，370 mg，1.1 mmol)、4-二甲基胺基吡啶(DMAP，催化量)與二異丙基乙胺(DIEA，186 mg，5.28 mmol)，於無水CH2 Cl2 (50 mL)中處理。將混合物於氮大氣下，於27℃下攪拌16小時。將混合物置於H2 O與1 M HCl(aq) 之間分配。將有機相通過MgSO4 乾燥，過濾並於減壓下濃縮。將殘餘物經急驟層析術(溶析：EtOAc/己烷=1.5:1)，而得到430 mg(產率65%)之標題化合物(YMU1)，將其從EtOAc再結晶。經由於HC-C18管柱(Agilent,4.6×250mm,5 μM)上，t R =9.35 min(40分鐘內之梯度為30-90% CH3 CN水溶液)進行的HPLC顯示產物之純度為95.7%。
或者，於室溫下將吡啶并噻唑酮4 (300 mg，1.66 mmol)以4-(2-碘乙醯基)六氫吡嗪-1-碳酸乙酯(541 mg，1.66 mmol)、Et3 N(840 mg，8.30 mmol)及CS2 CO3 (500 mg，1.54 mmol)於無水CH2 Cl2 (25 mL)中處理24小時，然後以H2 O萃洗。將有機層通過MgSO4 乾燥，經過濾、濃縮，及以於矽膠管柱上進行之急驟層析術(EtOAc/己烷(1:1))純化，而得到標題化合物(產率60%)。伴隨有O -烷基化副產物28 產生(11%)。
化合物21 ：C17 H22 N4 O4 S；白色粉末；TLC(EtOAc/己烷=3:1)R f =0.45；1 H NMR(400 MHz,CD3 OD) δ 6.93(1 H,s),4.65(2 H,s),4.15(2 H,q,J =6.8 Hz),3.61(2 H,m),3.52(4 H,s),3.49(2 H,m),2.72(3 H,s),2.59(3 H,s),1.26(3 H,t,J =7.6 Hz)；13 C NMR(100 MHz,CD3 OD) δ 164.41,164.31,162.73,162.49,154.61,149.43,122.23,113.74,61.85,45.13,44.45,43.56(2×),42.15,24.90,17.85,14.90；ESI-HRMS C17 H23 N4 O4 S之計算值：279.1440，實驗值：m/z 279.1446[M+H]+ 。
4-(2-(4,6-二甲基-3-氧-異噻唑并[5,4- b ]吡啶-2(3 H )-基)乙醯 基)六氫吡嗪-1-碳酸第三丁酯(22)。 將4-(2-氯乙醯基)六氫吡嗪-1-碳酸第三丁酯(150 mg，0.57 mmol)與碘化鈉(260 mg，1.73 mmol)混於丙酮(6 mL)之混合物於室溫下攪拌21小時，然後反應混合物轉變成含有白色固體之懸浮液。藉由過濾將固體清除，並將濾液乾燥至真空，並以CH2 Cl2 與H2 O清洗。然後將有機層通過MgSO4 乾燥，經過濾、濃縮而得4-(2-碘乙醯基)六氫吡嗪-1-碳酸第三丁酯(164.4 mg，產率84.4%)。C11 H19 IN2 O3 ；棕色固體；mp 69-71℃；IR νmax (neat) 2976,2926,2861,1696,1650,1459,1419,1366,1258,1168,1028,996,750 cm-1 ；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 3.76(2 H,s),3.57(2 H,m),3.51(2 H,m),3.41(4 H,m)1.47(9 H,s)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 166.5,154.2,80.4,47.0,43.0(2×),41.9(2×),28.4(3×)。
於室溫下，將吡啶并噻唑酮4 (300 mg，1.66 mmol)加入上述製備得之含碘基化合物(578 mg，1.66 mmol)、Et3 N(840 mg，8.30 mmol)與Cs2 CO3 (500 mg，1.54 mmol)懸浮於無水CH2 Cl2 (25 mL)之懸浮液中。將混合物攪拌24小時，並於減壓下濃縮。將殘餘物以CH2 Cl2 及H2 O萃洗。將有機相通過MgSO4 乾燥、過濾、濃縮，及於以EtOAc/己烷(1:1)溶析之矽膠管柱上進行的急驟層析術純化，而得標題化合物(400 mg，產率59%)。以於HC-C18管柱(Agilent,4.6×250mm,5 μM)上，t R =8.1 min(15分鐘內之梯度為40-90% CH3 CN水溶液)進行的HPLC顯示產物之純度為98.4%。C19 H26 N4 O4 S；白色固體；mp 204-207℃；IR vmax (neat) 3473,2974,2924,1655,1588,1564,1460,1419,1365,1286,1238,1169,1127,1033,997,765 cm-1 ；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 6.89(1 H,s),4.62(2 H,s),3.56(2 H,m),3.47(2 H,m),3.41(4 H,m),2.67(3 H,s),2.55(3 H,s),1.42(9 H,s)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 164.8,164.7,163.1,162.9,154.1,149.7,122.4,113.9,80.35,45.0,44.3,43.1(2×),42.0,28.4(3×),24.6,17.5；ESI-HRMS C19 H26 N4 O4 S之計算值：407.1753，實驗值：m/z 407.1756[M+H]+ 。
4-(4-(3-氧苯并[ d ]異噻唑-2(3 H )-基)丁醯基)六氫吡嗪-1-碳 酸乙酯(23) 。於20℃下，將六氫吡嗪-1-碳酸乙酯(800 mg，5.06 mmol)以氯化4-氯丁醯基(856 mg，6.075 mmol)，於含有Et3 N(1.54 g，15.17 mmol)之無水CH2 Cl2 (25 mL)中處理2小時，然後以1 M HCl(aq) 萃洗。將有機相通過MgSO4 乾燥，並於減壓下濃縮，而得4-(4-氯丁醯基)六氫吡嗪-1-碳酸乙酯(1.315 kg，產率99%)。C11 H19 ClN2 O3 ；淡黃色油體；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 4.13(2 H,q,J =7.2 Hz),3.62(2 H,t,J =5.6 Hz),3.58(2 H,m),3.46(6 H,m)2.49(2 H,t,J =6.8 Hz),2.11(2 H,m),1.25(3 H,t,J =7.2 Hz)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 170.1,155.1,61.7,45.2,44.8,43.7(2×),41.4,29.8,27.8,14.7；ESI-HRMS C11 H20 ClN2 O3 之計算值：263.1162,實驗值：m/z 263.1175[M+H]+ 。
將上述製備得之含氯基化合物(664 mg，2.53 mmol)以碘化鈉(1.14 kg，7.59 mmol)於丙酮(8 mL)中處理。將混合物於室溫下攪拌21小時，得到含有白色固體之懸浮液。將固體藉由過濾清除，並將濾液於真空中乾燥。將殘餘物置於CH2 Cl2 與H2 O之間進行分配。將有機層通過MgSO4 乾燥、過濾、濃縮而得4-(4-碘乙醯基)六氫吡嗪-1-碳酸丁酯(654.5 mg，產率73%)。C11 H19 IN2 O3 ；黃色油體；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 4.14(2 H,q,J =7.2 Hz),3.61(2 H,t,J =5.2 Hz),3.59(2 H,m),3.45(6 H,m)2.51(2 H,t,J =7.0 Hz),2.11(2 H,m),1.26(3 H,t,J =6.8 Hz)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 170.1,155.1,61.7,45.2,44.8,43.6(2×),41.4,29.8,27.8,14.7。
於室溫下，將苯并噻唑酮1 (291 mg，1.92 mmol)以上述製備得之含碘基化合物(650 mg，1.83 mmol)與DIEA(712 mg，5.51 mmol)於無水CH2 Cl2 (25 mL)中處理。將混合物攪17小時，並依序以1 M HCl(aq) 及飽和NaHCO3(aq.) 萃洗。將有機相通過MgSO4 乾燥、過濾、濃縮，並於以EtOAc/己烷(1:1)溶析之矽膠管柱上進行的急驟層析術純化，而得標題化合物(350 mg，產率50%)。C18 H23 N3 O4 S；油體；TLC(EtOAc/己烷=2:1)R f =0.6；IR νmax (neat) 2987,2923,1698,1645,1509,1464,1428,1346,1260,1233,1021,750 cm-1 ；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 7.85(2 H,d,J =8.0 Hz),7,73(2 H,d,J =8.0 Hz),7.48(2 H,t,J =7.2 Hz),7.35(2 H,t,J =7.2 Hz),4.58(2 H,d,J =5.6 Hz),4.13(2 H,q,J =3.6 Hz),3.61(2 H,m),3.44(6 H,m) 2.54(2 H,t,J =7.6 Hz),2.24(2 H,m),1.50(3 H,t,J =6.4 Hz)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 170.5,162.7,155.1,151.4,128.5,125.1,124.2,122.7,120.0,67.9,61.7,45.2,43.6(2×),41.4,29.7,24.8,14.7；ESI-HRMS C18 H24 N3 O4 S之計算值：378.1488，實驗值：m/z 378.1493[M+H]+。
2,2'-(2,2'-(六氫吡嗪-1,4-二基)雙(2-氧乙烷-2,1-二基))二苯并[ d ]異噻唑-2(3 H )-酮(24)。 於0℃下，將氯化氯乙醯基(892 mg，7.31 mmol)加入六氫吡嗪(300 mg，3.48 mmol)溶於含有Et3 N(1.41 kg，13.93 mmol)之無水CH2 Cl2 (12 mL)的溶液中。將該混合物攪拌並加溫至27℃達1小時。將混合物以1 M HCl(aq) 萃洗。將有機相通過MgSO4 乾燥並於減壓下濃縮，而得1,1'-(六氫吡嗪-1,4-二基)-雙(2-氯乙酮)(750 mg，產率90%)。C8 H12 Cl2 N2 O2 ；白色固體；mp 104-107℃；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 4.08(4 H,s),3.69(2 H,m),3.62(4 H,d,J =8.0 Hz),3.55(2 H,m)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 165.2(2×),46.2,45.8,42.1,41.7,40.7(2×)。
將上述製備得之1,1'-(六氫吡嗪-1,4-二基)-雙(2-氯乙酮)(750 mg，3.14 mmol)與碘化鈉(1.88 kg，12.54 mmol)混於丙酮(10 mL)中之混合物於室溫下攪拌16小時，得到含有白色固體之懸浮液。將固體藉由過濾清除，並將濾液於真空中乾燥。將殘餘物置於CH2 Cl2 與H2 O之間進行分配。將有機層通過MgSO4 乾燥、過濾及濃縮，而得1,1'-(六氫吡嗪-1,4-二基)-雙(2-碘乙酮)(210 mg，產率16%)。C8 H12 I2 N2 O2 ；暗褐色固體；mp 105-109 ℃；IR vmax (neat) 3003,2922,2853,1708,1637,1439,1258,1225,1161,1092,1023,983,737 cm-1 ；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 3.76(4 H,s),3.73(2 H,m),3.62(2H,s),3.57(2H,s),3.46(2 H,m)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 166.6,166.4,46.5,46.3,41.5,41.4,29.7(2×)。
於室溫下，將苯并噻唑酮1 (160 mg，1.06 mmol)以上述製備得之含碘基化合物(200 mg，0.47 mmol)與DIEA(368 mg，2.85 mmol)於無水CH2 Cl2 (5 mL)中處理。將混合物攪26小時，並依序以1 M HCl(aq) 及飽和NaHCO3(aq.) 萃洗。將有機相通過MgSO4 乾燥、過濾、濃縮，並於以CH2 Cl2 /MeOH(100:2.5)溶析之矽膠管柱上進行的急驟層析術純化，而得標題化合物(225 mg，產率48%)。C22 H20 N4 O4 S2 ；白色固體；mp 269-271℃(已分解)；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 7.95(2 H,d,J =8.0 Hz),7.87(2 H,d,J =8.0 Hz),7.69(2 H,t,J =8.0 Hz),7.43(2 H,t,J =8.0 Hz),4.81(2 H,s),4.79(2 H,s),3.62(2 H,br s),3.55(4 H,br s)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 165.2(2×),165.1(2×),141.5(2×),132.1(2×),125.7(2×),125.5(2×),123.5(2×),121.8(2×),44.5(2×),43.8(2×),41.2(2×)；ESI-HRMS C22 H21 N2 O4 S2 之計算值：469.1004，實驗值：m/z 469.1004[M+H]+ 。
2-(4,6-二甲基異噻唑并[5,4- b ]吡啶-3-基氧基)乙酸甲酯(25)。 將吡啶并噻唑酮4 (500 mg，2.77 mmol)、溴乙酸甲酯(900 mg，5.88 mmol)、CS2 CO3 (700 mg，3.07 mmol)與DIEA(1.5 mL，8.61 mmol)於無水CH2 Cl2 (25 mL)之混合物於室溫下攪拌24小時，並於減壓下濃縮。除了主要的N -烷基化產物7 (55%)以外，經以於矽膠管柱上進行之急驟層析術(EtOAc/己烷(1:4))純化後，得到標題化合物(50 mg，產率7%)。C11 H12 N2 O3 S；白色固體；mp 89-91℃；IR vmax (neat) 3053,2958,2929,2851,1767,1592,1562,1504,1445,1398,1334,1228,1128,1039,961 cm-1 ；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 6.91(1 H,s),5.05(2 H,s),3.78(3 H,s),2.89(3 H,s),2.61(3 H,s)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 172.3,168.4,160.7,160.2,145.6,121.4,115.7,64.2,52.3,24.6,19.1；ESI-HRMS C11 H13 N2 O3 S之計算值：253.0647，實驗值：m/z 253.0647[M+H]+ 。
2-(4,6-二甲基異噻唑并[5,4- b ]吡啶-3-基氧基)乙酸(26)。 將酯25 (150 mg，0.59 mmol)懸浮於濃HCl(3 mL)中，並伴隨攪拌於100℃下加熱5小時直到水解完成。將混合物冷卻至室溫，以水(350 mL)稀釋，並收集沉澱而得標題化合物(138 mg，產率98%)。C10 H10 N2 O3 S；白色固體；mp 270℃(已分解)；IR vmax (neat) 3423,2928,1716,1591,1504,1440,1392,1363,1308,1204,1125,1038,985,862 cm-1 ；1 H NMR(400 MHz,DMSO-d 6 ) δ 7.20(1 H,s),5.03(2 H,s),2.66(3 H,s),2.58(3 H,s)；13 C NMR(100 MHz,DMSO-d 6 ) δ 171.0,169.0,160.9,160.6,145.3,121.7,115.1,64.4,24.1,14.4；ESI-HRMS(負電模式)C10 H9 N2 O3 S之計算值：237.0334，實驗值：m/z 237.0332[M-H]- 。
2-(4,6-二甲基異噻唑并[5,4- b ]吡啶-3-基氧基)-1-嗎福啉乙 酮(27)。 將吡啶并噻唑酮4 (200 mg，1.22 mmol)以2-氯-1-嗎福啉乙酮(225 mg，1.25 mmol)與Et3 N(370 mg，3.66 mmol)於無水CH2 Cl2 (25 mL)中，於迴流(40℃)下處理24小時，然後以1 M HCl(aq) 萃洗。將有機相通過MgSO4 乾燥、過濾、濃縮，並於以EtOAc/己烷(1:1)溶析之矽膠管柱上進行的急驟層析術純化，而得標題化合物(35 mg，產率9%)，外加主要的N -烷基化產物19 (55%)。
或者，將酸26 與嗎福啉在EDCI、DMAP及DIEA存在下，經由類似於化合物21 (YMU1)之製程進行偶合反應，而得到化合物27 (產率82%)。
化合物27 ：C14 H17 N3 O3 S；白色固體；mp 153-155℃；IR vmax (neat) 3488,2923,2853,1665,1591,1498,1443,1378,1333,1273,1239,1115,1018 cm-1 ；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ6.93(1 H,s),5.16(2 H,s),3.90(6 H,m),3.51(2 H,3),2.71(3 H,s),2.61(3 H,s)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )δ172.3,165.4,160.7,160.5,145.7,121.5,115.8,66.8,66.4,64.9,45.3,42.2,24.6,19.1；ESI-HRMS C14 H18 N3 O3 S之計算值：308.1069，實驗值：m/z 308.1070[M+H]+ 。
4-(2-(4,6-二甲基異噻唑并[5,4- b ]吡啶-3-基氧基)乙醯基)六氫吡嗪-1-碳酸乙酯(28)。 於0℃下，將六氫吡嗪-1-碳酸乙酯(200 mg，1.26 mmol)以氯化氯乙醯基(186 mg，1.65 mmol)於含有DIEA(490 mg，3.80 mmol)之無水CH2 Cl2 (10 mL)的溶液中處理。將該混合物攪拌並加溫至27℃達4小時。將混合物以1 M HCl(aq) 萃洗。將有機相通過MgSO4 乾燥，並於減壓下濃縮，而得4-(2-氯乙醯基)六氫吡嗪-1-碳酸乙酯(275 mg，產率93%)。C9 H15 ClN2 O3 ；透明油體；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ4.15(2 H,q,J =7.2 Hz)4.06(2 H,s),3.60(2 H,m),3.54(2 H,m),3.49(4 H,m),1.27(3 H,t,J =7.2 Hz)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )δ164.3,154.3,61.4,45.8,43.5,43.1,41.8,40.8,14.7；ESI-HRMS C9 H16 ClN2 O3 之計算值：235.0849，實驗值：m/z 235.0852[M+H]+ 。
將4-(2-氯乙醯基)六氫吡嗪-1-碳酸乙酯(2.36 g，10.06 mmol)與碘化鈉(3 g，20.11 mmol)混於丙酮(45 mL)之混合物，於室溫下攪拌24小時，而得含有白色固體之懸浮液。藉由過濾將固體清除，並將濾液於減壓下濃縮。將殘餘物以CH2 Cl2 與H2 O萃取。然後將有機層通過MgSO4 乾燥，經過濾及濃縮而得4-(2-碘乙醯基)六氫吡嗪-1-碳酸乙酯(2.47 g，產率75%)。C9 H15 IN2 O3 ；棕色油體；IR νmax (neat) 2981,2927,2864,1697,1642,1464,1434,1385,1286,1232,1133,1073,1030,989,767 cm-1 ；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 4.14(2 H,q,J =7.0 Hz),3.75(2 H,s),3.58(4 H,m),3.43(4 H,m),1.26(3 H,t,J =7.0 Hz)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 166.6,155.1,61.8,47.0,43.1(2×),42.0(2×),14.7；ESI-HRMSC9 H16 IN2 O3 之計算值：327.0206,實驗值：m/z 327.0215[M+H]+ 。
於室溫下，將吡啶并噻唑酮4 (300 mg，1.66 mmol)以4-(2-碘乙醯基)六氫吡嗪-1-碳酸乙酯(541 mg，1.66 mmol)、Et3 N(840 mg，8.30 mmol)與CS2 CO3 (500 mg，1.54 mmol)於無水CH2 Cl2 (25 mL)中處理24小時，然後以H2 O萃洗。將有機層通過MgSO4 乾燥，過濾、濃縮，並藉由於矽膠管柱上(EtOAc/己烷(1:1))之急驟層析術純化，而得標題化合物(68 mg，產率11%)，外加主要的N -烷基化產物21 (YMU1,60%)。以於HC-C18管柱(Agilent,4.6×250mm,5 μM)上，t R =4.9 min(15分鐘內之梯度為40-90% CH3 CN水溶液)進行的HPLC顯示化合物純度為99.5%。
化合物28 ：C19 H26 N4 O4 S；白色固體；mp 88-90℃；IR νmax (neat) 2981,2926,2868,1674,1591,1566,1498,1466,1431,1381,1286,1231,1200,1174,1127,1007 cm-1 ；1 H NMR(400 MHz,CDCl3 ) δ 6.93(1 H,s),5.18(2 H,s)4.15(2 H,q,J =7.2 Hz),3.62(2 H,m),3.51(4 H,m),2.71(3 H,s),2.62(3 H,s),1.26(3 H,t,J =7.2 Hz)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 ) δ 171.84,165.01,160.36,160.23,154.70,145.33,121.27,115.56,65.06,61.92,44.91,43.67(2×),41.98,24.88,19.46,15.06；ESI-HRMS C17 H22 N4 O4 S之計算值：401.1259，實驗值：m/z 401.1260[M+H]+ 。
慢病毒載體之構築
使用BLOCK-iTT M Lentiviral RNAi表現系統(Invitrogen)構築慢病毒為主之小髮夾RNA(shRNA)。選擇hTMPK開放讀框之核苷酸509至527，及hTS基因之3’UTR中的核苷酸1017至1036做為標靶序列。本發明合成一股含有該標靶序列，隨後接著一個7-核苷酸短環，及最初標靶序列之反向互補序列的寡核苷酸。將成對之寡核苷酸黏合，並插入pENTRTM/U6RNAi卡匣中而產生一進入構體。亦選殖該套組所提供之LacZ雙股對照組，做為非緘默性(陰性)對照組siRNA。然後藉由將U6 RNAi卡匣重組入pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST載體中，而各別選殖得慢病毒構體。
製造用於感染之慢病毒shRNA
將293 FT生產者細胞(6×106 個細胞)以9 μg之ViraPowerTM 包裝Mix(含有pLP1、pLP2與pLP/VSVG質體之混合物)，及3 μg之pLenti6 LacZshRNA 、TMPKshRNA 、TSshRNA 、pLKO-UNGshRNA 或pLKO-dUTPaseshRNA 質體，藉由lipofectamine 2000(Invitrogene)進行共-轉感染。於轉感染後72小時，收集10 ml含有慢病毒之上清液，並以Millipore濃縮管柱濃縮至最終體積為5 ml。使用存在1 ml含有8 μg/ml聚溴化季銨陽離子(polybrene)之培養基中的慢病毒LacZshRNA 、TMPKshRNA 、TSshRNA 、UNGshRNA 及dUTPaseshRNA 儲存液來感染2.5×105 個細胞，經隔夜培養後將上清液替換成用於後續分析之完全培養基。
結合螢光素酶之TMPK分析
於25℃下將溶於50 μl TMPK分析緩衝液(100 mM Tris-HCl,pH 7.5,100 mM KCl,10 mM MgCl2,50 μM ATP與100 μM dTMP)中之純化的hTMPK加入96孔平盤中開始進行TMPK反應10分鐘，並藉由加入200 μl of DTNB(100 μM)而終止反應，隨後將10 μl反應溶液轉移至含有90 μl螢光素酶分析緩衝液(50 mM Glycine,0.5 mM EDTA與5 mM EDTA，pH 7.0,0.1 μg螢光素酶,50 μM螢光素與0.1% BSA)之白色96-孔平盤。以冷光計數器(Packard)測量冷光。
結合螢光素酶之TK分析
於25℃下將溶於50 μl TK分析緩衝液(50 mM Tris-HCl,pH 7.5,1 MM CHAPS,3 mg/ml BSA,2.5 mM MgCl2,50 μM ATP與100 μM胸腺核苷)中之純化的hTMPK加入96孔平盤中開始進行TMPK反應10分鐘，並藉由加入200 μl of胸腺核苷(1.25 mM)而終止反應，隨後將10 μl反應溶液轉移至含有90 μl螢光素酶分析緩衝液(50 mM Glycine,0.5 mM EDTA與5 mM EDTA,pH 7.0,0.1 μg of螢光素酶,50 μM螢光素與0.1% BSA)之白色96-孔平盤。以冷光計數器(Packard)測量冷光。
結合NADH之TMPK分析
所有反應皆於96-孔平盤中進行，分析體積為100 μl。hTMPK之活性係於25℃下，使用經修改之已知結合NADH的比色分析進行測量(Agarwal等人,1978；Miyata等人,2003；Ostermann等人,2003)，其中係將純化的hTMPK加入含有100 mM Tris-HCl,pH 7.5、100 mM KCl、10 mM MgCl2 、0.5 mM磷酸烯醇丙酮酸、0.25 mM NADH、5單位乳酸脫氫酶、4單位丙酮酸激酶、1 mM ATP與200 μM dTMP之緩衝液中。經由讀取340 nm下之吸光值來測量NADH之變化量。一單位TMPK活性係定義為每分鐘將1 μmole TMP轉變成TDP。
酵素之表現及純化
將pGEX-2T-hTMPK(Ke等人,2005)、pGEX-2T-hTMPK D15R、pGEX-2T-dUTPase(WT)、pGEX-2T-dUTPase(KD-突變型)或pGEX-3X-hTK1(Chang等人,1998)轉形至大腸桿菌JM109株中，藉由於37℃下以0.1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖呱喃醣苷(IPTG)進行誘導4小時，來製造GST-hTMPK及GST-dUTPase融合蛋白。將細菌經由超音波震盪溶解，並將已澄清之上清液與麩胱甘肽4B珠粒(Amersham Pharmacia)反應。經過以磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)充分清洗後，藉由於4℃下進行凝血酶(Sigma)分解過夜，將hTMPK蛋白從結合在麩胱甘肽珠粒之GST-融合蛋白分解出。純化的GST-dUTPase(WT)及GST-dUTPase(KD-突變型)融合蛋白係於親和層析術後，使用將其從麩胱甘肽-sepharose溶析出。
dUTPase活性分析
為偵測dUTPase活性，係使用EnzChek磷酸鹽分析套組(Invitrogen)，依照製造商之指示來測量dUTPase活性。簡述之，將0.25 μg GST-dUTPase(WT)或GST-dUTPase(KD-突變型)蛋白加入200 μl含有0.3 mM dUTP之反應緩衝液[34 mM Tris-HCl pH 8.3,10 mM MgCl2 ,0.5 mM EDTA,0.25 mg/ml牛血清白蛋白(BSA,Sigma)]中。將反應混合物靜置於37℃下3分鐘。將樣本(各15 μl)加入反應混合物[715 μl dH2O,50 μl 20X反應緩衝液,200 μl MESG受質,1U嘌呤核苷磷酸化酶,0.03 U無機焦磷酸水解酶]中，並於22℃下反應45分鐘。使用ELISA平盤計讀機測量360 nm下之吸光值。
彗星分析
使用Trevigen’s彗星分析套組(4250-050-k)，依照製造商之指示進行鹼性彗星分析。將DNA以SYBR Green染色，並將玻片數位照相(Olympus BX51顯微鏡與Olympus相機)。使用Scoin Image軟體分析尾部力矩。
整體細胞dTTP萃取及定量
將106 個細胞以1ml冰凍之60%甲醇於-20℃下萃取過夜，隨後於16,000xg離心30分鐘。將上清液浸於100℃乾浴中3分鐘，並於真空下乾燥。將乾燥之殘餘物溶解於80 μl不含核酸酶之水中，並根據Ferraro等人所述之方法(Ferraro等人,2010)，將其用於測量細胞的dNTP。
蛋白質萃取及西方墨點分析
如先前技藝所述製備細胞萃取物(Chang等人,1998)。將等量蛋白質於SDS-PAGE(11%(w/v)凝膠)上進行解析，隨後以電泳術轉移至PVDF膜(Millipore)。經過5%(w/v)脫脂奶粉封阻後，將該膜與不同的抗體於4℃下反應過夜，再以辣根過氧化酶共軛之山羊抗-兔子IgG、山羊抗-小鼠及驢子抗-山羊抗體(Santa Cruz)處理。依照製造商之指示(PerkinElmer生命科學)，進行對於辣根過氧化酶反應之ECL偵測。藉由UVP BioSpectrum 500顯像系統測定蛋白質訊號。以GEL-PRO軟體決定蛋白表現程度。
RNA分離及RT-PCR
於指定時間點，藉由使用TRIzol試劑(Invitrogene)而從細胞分離出總體RNA。使用ImProm-II反轉錄酶(Promega)合成cDNA。以RT-PCR評估UNG、TMPK及GAPDH之mRNA含量。使用GAPDH基因做為內在對照組基因。引子係基於如表4所列示之人類UNG、hTMPK及GAPDH的核苷酸序列設計。PCR混合物含有1 μl之cDNA樣本(50 ng)、1 μM前向與反向引子、及12.5 μl之GoTaq Green Master Mix,2x(Promega)，總體積為25 μl。PCR之進行模式：於95℃下5分鐘，及25次包含95℃下30秒、55℃下30秒與72℃下30秒之擴增循環，接著於72℃下5分鐘及於4℃下10分鐘。將產物於2%瓊脂糖凝膠上分析，並經由溴化乙錠染色呈像。
即時PCR與RT-PCR 引子
表現質體之構築及定點突變
將hTMPK cDNA插入pEGFP-N1(Clontect)之HindIII切位而構築得pEGFP-hTMPK。使用QuickChange XL定點突變套組(Stratagene)來產生pEGFP-hTMPK(D15R)突變株。mCherry-R2之表現載體係藉由將R2之cDNA插入mCherry質體的Bg1 II切位中而產生。將呈核形式之dUTPase cDNA以符合讀框的方式，插入pEGFP-C1(Clontech)之EcoRI-BamHI切位而產生pEGFP-dUTPase(WT)。pEGFP-dUTPase之催化致死(KD)突變型係藉由導入D102N突變(Harris等人,1999)而產生。將涵蓋之R1次單位之C-端701-792胺基酸的cDNA，插入質體pCMV2-YFP-Nuc之BamHI切位，而構築得pCMV2-YFP-Nuc-R1C。將mCherry或mChery-R2之cDNA插入pLKO AS3w質體的NheI切位，而產生mChery與mCherry R2之慢病毒表現載體。
同源重組分析
將帶有整合入之同源重組報告子DR-GFP(Pierce等人,1999)的U2OS DR-GFP細胞以TMPK siRNA轉感染，隨後進行I-SceI表現載體(pCBA-I-SceI)表現達48小時。以流動式細胞計數分析測量GFP+頻率來檢測重組效率。
免疫螢光染色分析
對於γH2AX、Rad51及XRCC1染色，係將細胞以4%三聚甲醛於室溫下固定30分鐘，並與TBS(50 mM Tris-HCl,pH 7.4,150 mM NaCl)加0.3% Triton X-100反應5分鐘。將蓋玻片以MAXblockTM (Active Motif)於37℃下進行封阻1小時，隨後以下列一次抗體：抗-γH2AX單株抗體(1:1000)、抗-Rad51多株抗體(1:500)或抗-XRCC1單株抗體(1:500)，於4℃下染色過夜。經充分清洗後，將細胞以二次抗體及Hoechst 33342於室溫下染色1小時。於包埋後，將細胞以裝備有AxioCam數位相機與Axio Vision Rel.4.8成像軟體之Carl Zeiss螢光顯微鏡進行分析及照相。
定量型染色絲免疫沉澱分析
將HEK293T細胞(1 x 107 )以pEGFP-I-PpoI表現載體轉感染。經轉感染18小時後，於室溫下將細胞與終濃度為1%之甲醛進行交聯10分鐘，並如先前技藝所述進行ChIP(Berkovich等人,2007)。將沉澱之DNA再懸浮於50 μl TE緩衝液中，並藉由以ABI StepOne系統，使用Fast SYBR Green PCR Master Mix(應用生物系統)之定量型即時PCR進行分析。於染色體I中接近I-PpoI部位及GAPDH的引子序列，經列示於表4中。
DNA損壞部位之激光顯微照射及蛋白質定位
將細胞以適當密度接種於玻璃底之培養盤上。細胞以2 μg/ml Hochest 33342染色10分鐘。使用FluoView 1000共聚焦顯微鏡(Olympus)及405 nm雷射二極管(快速模式，SIM掃描器，250 msec)完成激光顯微照射。對於γH2AX、內源性TMPK與R2共染色，係將細胞以含有0.1 % of Triton X-100之CSK緩衝液(100mM NaCl,300 mM蔗糖,10 mM PIPES pH 7.0,3 mM MgCl2 )清洗5分鐘，然後以2%三聚甲醛於室溫下固定15分鐘。
TMPK抑制劑篩檢
修改結合螢光素酶之TMPK分析(Hu與Chang,2010)，並用於從ChemDiv集庫(San Deigo,USA)選出的21,120個結構上不同之化合物進行篩檢。將此等化合物溶解於DMSO中，並各別取10 μM轉移到含有0.25 μg最終體積為4 μl之純化的hTMPK蛋白之1536-孔平盤。使用終濃度為10 μM之5,5-二硫-雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)做為TMPK抑制作用的陽性對照組(黃等人,1994)。經預先培養30分鐘後，藉由將含有100 mM Tris-HCl,pH 7.5、100 mM KCl、10 mM MgCl2 、5 μM ATP與20 μM dTMP之TMPK反應緩衝液加至各孔，而開始進行TMPK反應10分鐘，隨後加入4 μl含有50 mM甘胺酸與0.5 mM EDTA,pH 7.0、0.1 μg螢光素酶及25 μM螢光素與0.1% BSA之螢光素酶分析緩衝液。由ViewLux偵測器(PerkinElmer)取得螢光值，並藉由與所述之陽性對照組比較，而判讀出TMPK抑制活性。
分子對接
從PDB 1E2D取得TMPK之原始結構並進行能量最小化。建構YMU1並使用Gaussian03包裝組訂出電荷。使用AutoDock程式鑑定結合位置，並研究YMU1與TMPK之相互作用。在此，藉由NAMD程式與CHARMM27力場進行MD模擬。最後，接著將該系統進行MD模擬以分析結合親和力。評估TMPK與YMU1之間的非結合作用，以搜尋出最適化的位置。
活體內化學療法
使用6-8週齡之雌性BALB/c AnN.Cg-Foxnlnu /Crl Nurl小鼠(國家實驗室動物中心，台灣)為腫瘤異種移植模式。將HCT-116 p53-/-細胞(1×106 )經皮下植入每隻小鼠的之右腹脇部。待腫瘤直徑達約0.5~1 mm時開始進行治療。將小鼠(n=32)隨機分成四組：載劑，15% TEG；亞德里亞黴素(1.25 mg/kg一週兩次)；YMU1(15 mg/kg一週三次)；YMU1(15 mg/kg一週三次)結合亞德里亞黴素(1.25 mg/kg一週兩次)。小鼠以所指定的治療，經由腹膜內進行投藥4週，之後再使小鼠生長於無藥劑之條件下2星期。於最初藥物治療之後，每天以電子測徑規測量腫瘤大小。使用下列方程式估算腫瘤體積：腫瘤體積=長度(mm)×寬度2 (mm2 )/2。
細胞毒性、細胞凋亡分析及細胞週期分析
將植入孔平盤之細胞(103 細胞/孔)處理，並藉由MTS分析(Promega)測量細胞存活率(Cory等人,1991)。使用膜聯蛋白V-螢光素異硫氰酸酯(FITC)細胞凋亡套組(Calbiochem)來偵測細胞凋亡。將細胞以碘化丙啶(PI)染色，用於以CellQuest軟體進行螢光活化細胞選別(FACS)分析，而完成細胞週期分析。
免疫組織化學分析
單株Ki 67抗體(B56)係從BD PharMingen購得。將經石蠟包埋之腫瘤切片與一次抗體反應，以LSABTM套組(DakoCytomation)根據製造商之指示偵測，並使用蘇木素進行對比染色。
群落形成分析
將細胞以每盤5,000個細胞之密度植入100 mm-培養皿。於天後，將細胞群落固定並以結晶紫染色及計算群落數。
統計分析
進行雙尾Student’s t-測試來定量同源重組效率，每顆細胞具有γH2AX foci>10、Rad51 foci>20或XRCC1 foci>5之細胞百分比值(%)，qChIP分析，腫瘤大小與腫瘤重量；*指示p<0.05，而**指示p<0.01。數據以平均值±s.d.表示。
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圖1.　本發明之TMPK抑制劑衍生物化合物的合成流程。
圖2.　抑制TMPK表現會造成具有dUTP嵌入之DSB修復。(A)在以siRNA進行TMPK緘默達24小時後，將U2OS-DR-GFP細胞以pCBA-I-SceI質體轉感染。經過48小時後，藉由流動式細胞計數分析測量GFP+頻數。數據是以平均值±s.d.表示，n=3。收取一部分細胞進行分析。(B-D)將無及具有TMPK shRNA穩定表現之MDA-MB231細胞暴露至亞德里亞黴素(0.1 μM)處理4小時，並藉由以新鮮培養基沖洗而使其復原，以供進行(B) γH2AX foci染色(圖中尺標為5 μm)。(C) Rad51 foci染色(圖中尺標為20 μm)。(D) XRCC1 foci染色(圖中尺標為5 μm)。對每一實驗，計數超過100個細胞(n=3)。由西方墨點分析結果顯示TMPK之表現量。(E)將細胞以慢病毒LacZ或UNG shRNA感染8 hr小時。經過24小時後，使細胞從亞德里亞黴素處理後復原，將其固定後進行XRCC1 foci染色(圖中尺標為5 μm)。插圖顯示以RT-PCR表示UNG與TMPK RNA轉錄產物的量。對每一實驗，計數超過100個細胞(n=3)。(F)將細胞依照指示以pEGFP-C1、野生型pEGFP-dUTPase(wt)及催化-失效之pEGFP-dUTPase(KD)轉感染，隨後以亞德里亞黴素處理24小時並使其復原。將細胞經由XRCC1 foci染色(圖中尺標為10 μm)分析。對於每一實驗，計數70~100個GFP-陽性細胞(n=3)。插圖顯示以西方墨點法表示TMPK的量。
圖3.　抑制TMPK表現對於DNA損壞反應中存活率之影響。(A)將親本MDA-MB231及表現TMPK shRNA之穩定選殖純系，以每孔1,000個細胞之密度植入96孔平盤中，以藉由MTS分析進行細胞生長分析。(B)將這兩種細胞之隔夜培養物暴露至亞德里亞黴素(0.1 μM)處理達4小時，之後藉由以新鮮培養基沖洗將藥物去除，經過48小時後，藉由MTS分析測定細胞存活率。數據是以4次實驗之平均值±s.d.表示。
圖4.　重組人類dUTPase活性之測量。(A)重組人類GST-dUTPase融合蛋白係通過親和性層析術後，使用麩胱甘肽將其從麩胱甘肽-sepharose溶析出。將蛋白質於10% SDS PAGE上進行分離，並以考瑪斯藍染色。(B)經由測量於各別含有0.25 μg dUTPase之反應中的PPi濃度，計算出酵素比活性(數據以平均值±s.d.表示，n=3)。
圖5.　野生型dUTPase之過量表現會減低XRCC1 foci形成並復原持續的損壞訊號。將親本MDA-MB231及穩定表現TMPK shRNA之選殖細胞，以所指示的質體進行轉感染。經隔夜培養後，將細胞暴露至亞德里亞黴素(0.1 μM)處理達4小時並使其復原。經過24小時復原後，將細胞以XRCC1及H2AX foci染色進行分析。以XRCC1 foci>5、γH2AX foci>10對於GFP-陽性細胞數目之定量結果，顯示於上圖。代表的影像顯示於下圖。數據以平均值±s.d.表示，n=3；***，P<0.001基於雙尾Student’s之t-測試。對於每一實驗，計數70~100個GFP細胞。圖中尺標為10 μm。
圖6.　TMPK與RNR於DNA損壞處對於修復作用之功能協調。(A)將MDA-MB231細胞以pEGFP-TMPK(WT or D15R)轉感染，隨後暴露至亞德里亞黴素處理，並依照圖2B之說明使其復原。將細胞固定以進行γH2AX foci染色。圖中尺標為20 μm。對每一實驗，計數超過100個GFP-陽性細胞(n=3)。(B)將無及具有TMPK shRNA穩定表現之MDA-MB231細胞以pCMV2-YFP-Nuc(載體)或pCMV2-YFP-Nuc-R1C(R1C)質體進行轉感染。(C)依照指示將MDA-MB231細胞以pEGFP-TMPK(D15R)與pCMV2-YFP-Nuc-R1C(R1C)質體組合進行轉感染。將細胞暴露至亞德里亞黴素處理並使其復原24小時之後，藉由γH2AX foci染色進行分析(圖中尺標為5 μm(B) ，而於(C) 為10 μm)。對於每一實驗，計數超過100個YFP或GFP陽性細胞(n=3)。(D)將HEK293T細胞以pEGFP-C1或pEGFP-I-PpoI進行轉感染。經過18小時後，收集細胞並用於以所指定之抗體，使用鄰接於單一染色體1上I-PpoI裂解部位(280 bp 5’至I-PpoI切位)之引子對進行qChIP分析。GAPDH係做為基因DNA組對照組，因為其不含I-PpoI切位。數據以IgG對照組正常化。數據以平均值±s.d.表示，n=3。(E)將細胞平佈於類玻璃培養盤進行微波照射。待復原5分鐘後，將細胞固定以進行γH2AX、TMPK及R2染色，並以FluoView 1000共聚焦顯微鏡(Olympus)觀察。圖中尺標為10 μm。
圖7.　抑制TMPK之表現對於細胞之dTTP含量及細胞生長的影響。(A)將穩定表現TMPK shRNA之HCT-116p53 -/- 進行萃取供測定dTTP含量。(B)取一定比例之細胞植入96-孔平盤中。以MTS分析測量於指定時間之細胞生長，數據係以相對於第0天之數值(任意設定為1)表示(平均值±s.d.表示，n=3；每項分析進行四重複)。插圖表示以WB分析所得之TMPK含量。
圖8.　已純化之hTMPK活性分析。使用習知的分析測定GST-TMPK(WT)及GST-TMPK(D15R)突變型蛋白質之活性。
圖9. GFP-TMPK之催化性失效對於係包含量的影響。於以GFP或GFP-TMPK(D15R)轉感染72小時後，收取細胞進行WB分析(A)及dTTP含量測定(B)(數據以平均值±s.d.表示，n=3)。
圖10.　細胞之R2含量與DNA修復時之TMPK需求成正比。(A)將MCF-7、H184B5F5/M10及MCF-10A細胞以TMPK siRNA轉感染，並依照圖2B之說明暴露至亞德里亞黴素處理，及使其復原以進行γH2AX foci染色(圖中尺標為20 μm)。對於每一實驗，計數超過100個細胞(n=3)。(B-C)依上述將MDA-MB231、MCF-7、H184B5F5/M10及MCF-10A細胞暴露至亞德里亞黴素處理並使其復原。於指定的時間點收取細胞，進行西方墨點分析(B)及流動式細胞計數分析(C)。(D)將細胞以每孔1,000個細胞之密度植入96孔平盤中，以MTS分析細胞生長。於TMPK siRNA轉感染36小時後，將H184B5F5/M10細胞以500 ng/ml諾考達唑處理過夜，以增加S/G2細胞。收取一定比例之細胞進行西方墨點及FACS分析(E)。將細胞暴露至亞德里亞黴素(0.2 μM)處理2小時，並藉由補滿新鮮培養基而使其復原。於指定之時間點將細胞固定，以進行γH2AX foci染色及FACS分析(F)。對於每一實驗，計數超過200個細胞(n=3)。
圖11. R2表現量對於因抑制TMPK表現所誘導之DNA修復傷害的助益。將MCF-7細胞以TMPK、R2或TMPK/R2之SiRNA進行轉感染。於轉感染後36小時，收取一定比例之細胞進行(A)西方墨點法及(B) FACS分析。(C)將剩餘細胞暴露至亞德里亞黴素(0.1 μM)處理4小時。於指定之時間點，將細胞以γH2AX foci染色進行分析(圖中尺標為20 μm)。(D)對於每一實驗，計數超過200個細胞(n=3)。(E)將經由慢病毒感染穩定表現mCherry或mCherry-R2之MCF-10A細胞以TMPKsiRNA轉感染，接著進行亞德里亞黴素處理並使其復原。經過24小時復原後，將細胞固定以進行γH2AX foci染色(圖中尺標為20 μm)，並收取細胞進行西方墨點及FACS分析。對於每一實驗，計數超過150個細胞(n=3)。
圖12.　新穎hTMPK抑制劑之鑑定。(A)藉由結合螢光素酶之分析篩選TMPK抑制劑。(B) YMU1(化合物21)及相關分子之化學結構。(C) YMU1與衍生物化合物對於hTMPK之抑制作用，使用純化的hTMPK蛋白(0.5 μg)於反應前先經10分鐘前培養，利用結合螢光素酶之TMPK分析進行測定。(D) YMU1對於純化TMPK(0.5 μg)及GST-hTK1蛋白(5 μg)之活性的影響，於反應前先經10分鐘前培養。數據以平均值±s.d.表示(n=4)。(E) TMPK-YMU1複合體之分子模型。左圖組：TMPK/ATP/Mg+2 ；右圖組：TMPK/YMU1。TMPK以表面靜電位(上圖)及結構彩帶(下圖)呈現。ATP與YMU1分別以帶有彩色原子(O，紅色；S，黃色；P，橙色)之綠色及藍色棒表示。TMP係以白色骨架而Mg+2 以紫色顯示。箭號表示Asp15的位置。
圖13. YMU1對於細胞dTTP含量之影響。將HCT-116 p53-/-細胞有或無以TMPK siRNA轉感染2天，並以載體或YMU1處理。經過小時後，收取細胞進行西方墨點分析及含量測定(平均值±s.d.，n=3；**，P<0.01基於雙尾Student’s t-測試)。
圖14. YMU1對於基因組毒性及DNA修復之影響。(A)將HCT-116 p53-/-細胞以TMPK或TS之慢病毒shRNA感染。平行地，將細胞係以YMU1(2 μM)處理2天，或是以5-氟-2’去氧尿核苷(FdUrd,2 μM)處理1天。將此等細胞固定，以進行γH2AX foci染色及西方墨點分析。(B)將H184B5F5/M10細胞以5,000細胞/盤之密度接種於100 mm-培養盤上。將MCF-10A、MCF-7及HCT-116p 53-/- 細胞以600細胞/孔之密度接種於6孔平盤中。於隔夜培養後，將細胞以各種濃度之YMU1或FdUrd處理，每週三次。經過14天後，將細胞群落固定，以結晶紫染色。(C)將細胞以載體或YMU1(2 μM)前處理72小時，之後以亞德里亞黴素(0.1 μM)處理。從亞德里亞黴素處理解放後，於指定之時間點將細胞固定，以進行γH2AX foci染色。對於每一實驗，計數超過100個細胞(n=3)。(D) MDA-MB231細胞於載體或YMU1(2 μM)處理48小時後，以pEGFP-N1或pEGFP-TMPK質體進行轉感染。經過夜培養後，將細胞暴露至亞德里亞黴素處理並使其復原。於24小時，將細胞以γH2AX foci染色進行分析。對於每一實驗，計數70~100個GFP陽性細胞(n=3)。(E-F)將以載體或YMU1(2 μM)前處理72小時之MDA-MB231細胞暴露至亞德里亞黴素處理並使其復原，以供進行(E) Rad51 foci(F) XRCC1 foci染色。對於每一實驗，計數超過100個細胞(n=3)。(G)將細胞以慢病毒之LacZ或UNG shRNA感染8小時。經過暴露至亞德里亞黴素處理，並使其復原24小時後，將細胞固定以進行XRCC1 foci染色。插圖係顯示經由RT-PCR所測得之UNG RNA轉譯產物含量。對於每一實驗，計數超過100個細胞(n=3)。(H-I)將以YMU1(2 μM)前處理48小時之MDA-MB231細胞，以所指定的質體或shRNA進行轉感染。經過夜培養後，將細胞暴露至亞德里亞黴素處理並使其復原。經過24小時後，將細胞以γH2AX foci染色進行分析。對於每一實驗，計數70~100個GFP或YFP陽性細胞(n=3)。
圖15.　於MDA-MB231細胞中因YMU1處理造成之DNA修復效率受減損。於移除亞德里亞黴素(0.1 μM)後，在所指定的時間藉由彗星分析(comet assay)測量MDA-MB231細胞內之DNA修復效率。藉由使用用於測定尾面力矩之接穗(scion)影像軟體，獲取DNA彗星的影像。數據以平均值±s.d.表示，其係藉由在3次獨立實驗中，於每一樣本計數至少70個彗星而得。**，P<0.01基於雙尾Student’s t-測試。
圖16.　YMU1對於亞德里亞黴素增敏作用之活體外及活體內功效。(A)將一組平行進行之細胞株以載體、YMU1(化合物)、D6(4-(2-氯乙醯基)六氫吡嗪-1-羧酸乙酯)或D7(化合物28)前處理3天，並暴露至不同濃度之亞德里亞黴素處理達4小時。從亞德里亞黴素處理復原48小時後，將細胞以新鮮培養基清洗供進行MTS分析，並測定亞德里亞黴素之IC50 值。計算出於各細胞株中亞德里亞黴素敏感度之增強(倍數)。數據以平均值±s.d.表示，n=3；每一項實驗進行四重複。插圖顯示亞德里亞黴素於各種細胞株之IC50 值。(B)以載體或YMU1處理72小時後，將細胞暴露至0.1 μM亞德里亞黴素處理4小時，然後以5,000細胞/盤之密度，接種於100 mm-培養盤上。經過夜培養後，將細胞以生長培養基再生。培養天14後，將細胞群落固定，以結晶紫染色並計算群落數目。(C)將HCT-116p53 -/- 細胞經皮下植入Balb/c裸鼠之右腹脇部(每一實驗組n=8)。箭號指示終止藥物處理之時間。依本發明說明中方法段落中所述估計腫瘤體積。(D)從該處理復原2星期後，將小鼠犧牲以測量腫瘤重量。數據以平均值±s.e.m表示；**，P<0.01基於雙尾Student’s t-測試。(E)左圖組顯示腫瘤之Ki 67增生標記染色結果。圖中尺標為50 μm。(F)於惡性癌細胞中由YMU1引起之亞德里亞黴素增敏作用的模式。R2/R1與TMPK皆被補充到誘導之雙股斷裂部位，其中dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP係在特定位置被合成。抑制TMPK會減低於DNA損壞部位之dTTP形成，而造成因dUTP嵌入所致的無效DNA修復。
圖17.　由YMU1引起之亞德里亞黴素增敏作用是透過TMPK抑制。以TMPK siRNA轉感染2天後，將MDA-MB231細胞以載體或YMU1(2 μM)前處理72小時，之後以0.1 μM亞德里亞黴素處理，並在與新鮮培養基培育48小時後進行細胞存活分析(平均值±s.d.，n=3；每一項實驗進行四重複)。收集一部分細胞用於西方墨點法分析。
圖18.　經由dUTPase之過量表現而對以YMU1處理產生之亞德里亞黴素增敏作用造成逆轉作用。從亞德里亞黴素處理復原48小時後，將MDA-MB231細胞以Annexin V-PE染色以進行細胞凋亡分析。顯示於Annexin V-PE染色中呈現陽性之GFP細胞的百分比(平均值±s.d.，n=3；*，P<0.05，雙尾Student’s t-測試，每項實驗計數>50個GFP陽性細胞)。
圖19.　YMU1對dUTPase活性沒有影響。將0.1 μg純化的GST-dUTPase蛋白與所指定濃度之YMU1反應10分鐘，然後使用dUTPase活性分析作用。
圖20.　抗體專一性之確認。將細胞以慢病毒TMPK shRNA、dUTPase shRNA感染，或以R2 siRNA轉感染。進行感染或轉感染72小時後收取細胞，使用所指定的抗體進行WB分析。

Claims (32)

  1. 一種用於抑制胸腺核苷酸激酶(TMPK)之組成物，其包含一治療上有效量之：
  2. 一種用於抑制胸腺核苷酸激酶(TMPK)之組成物，其包含一治療上有效量之選自至少下列一者：
  3. 一種用於抑制胸腺核苷酸激酶(TMPK)之組成物，其包含一治療上有效量之：
  4. 一種用於抑制胸腺核苷酸激酶(TMPK)之組成物，其包含一治療上有效量之選自至少下列一者：
  5. 一種用於抑制胸腺核苷酸激酶(TMPK)之組成物，其包含一治療上有效量之：
  6. 一種用於抑制胸腺核苷酸激酶(TMPK)之組成物，其包含一治療上有效量之選自至少下列一者：
  7. 一種用於抑制胸腺核苷酸激酶(TMPK)之組成物，其包含一治療上有效量之選自至少下列一者：
  8. 一種用於抑制胸腺核苷酸激酶(TMPK)之組成物，其包含一治療上有效量之：
  9. 一種用於抑制胸腺核苷酸激酶(TMPK)之組成物，其包含一治療上有效量之：
  10. 一種用於抑制胸腺核苷酸激酶(TMPK)之組成物，其包含一治療上有效量之選自至少下列一者：
  11. 如申請專利範圍第1-10項中任一項所述之組成物，其中該組成物能夠抑制胸腺核苷酸激酶活性。
  12. 如申請專利範圍第1-10項中任一項所述之組成物，其中該組成物能夠抑制細胞中的dTTP含量。
  13. 如申請專利範圍第1-10項中任一項所述之組成物，其中該組成物能夠抑制腫瘤生長、DNA損壞檢查點、DNA錯配修復、核苷酸切割修復、雙股斷裂修復、DNA解螺旋酶功能、訊號傳遞、細胞週期調控或細胞凋亡。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之組成物，其中該雙股斷裂修復係與放射療法、化學療法或免疫調制療法關連。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之組成物，其中該化學療法包含以亞德里亞黴素進行之治療。
  16. 如申請專利範圍第1-10項中任一項所述之組成物，其中該組成物係選擇性地將毒性標靶至帶有DNA損傷的癌細胞。
  17. 如申請專利範圍第1-10項中任一項所述之組成物，其中該組成物能夠使癌細胞對放射療法、化學療法或免疫調制療法敏感。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之組成物，其中該化學療法包含以亞德里亞黴素進行之治療。
  19. 如申請專利範圍第1-10項中任一項所述之組成物，其中該組成物不會導致基因毒性副作用。
  20. 如申請專利範圍第1-10項中任一項所述之組成物，其中該組成物呈現一IC50 值為10μM或以下。
  21. 如申請專利範圍第1-10項中任一項所述之組成物，其中該組成物呈現一IC50 值為5μM或以下。
  22. 如申請專利範圍第1-10項中任一項所述之組成物，其中該組成物呈現一IC50 值為1μM或以下。
  23. 如申請專利範圍第1-10項中任一項所述之組成物，其中該組成物之投藥劑量係為5mg/kg至30mg/kg。
  24. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1-10項中任一項所述之組成物與醫藥上可接受之載體。
  25. 一種使癌細胞對放射療法、化學療法或免疫調制療法增敏之醫藥組成物，其包含一治療上有效量之如申請專利範圍第1-10項中任一項所述之組成物。
  26. 如申請專利範圍第25項之醫藥組成物，其中該組成物係選擇性地將毒性標靶至帶有DNA損傷的癌細胞。
  27. 如申請專利範圍第25項之醫藥組成物，其中該組成物不會導致基因毒性副作用。
  28. 如申請專利範圍第25項之醫藥組成物，其中該化學療法包含以亞德里亞黴素進行之治療。
  29. 一種防止癌細胞進行雙股斷裂修復之醫藥組成物，其包含一治療上有效量之如申請專利範圍第1-10項中任一項所述之組成物。
  30. 一種選擇性地將毒性標靶至帶有DNA損傷的癌細胞之醫藥組成物，其包含一治療上有效量之如申請專利範圍第1-10項中任一項所述之組成物。
  31. 如申請專利範圍第25-30項中任一項所述之醫藥組成物，其中該癌細胞係選自乳癌細胞、肝腫瘤細胞、大腸癌細胞、胰臟癌細胞、食道癌細胞、膀胱癌細胞、卵巢癌細胞、皮膚癌細胞、肝癌細胞、胃癌細胞、前列腺癌細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、直腸癌細胞、腎臟癌細胞、甲狀腺癌細胞、腦癌細胞、黑色素瘤、肉瘤、白血病、骨癌細胞及子宮內膜癌細胞。
  32. 一種組成物之用途，其係用於製備抑制胸腺核苷酸激酶(TMPK)之藥物，其中該組成物係選自如申請專利範圍第1-10項中任一項所述之組成物。
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