KR100839985B1

KR100839985B1 - 플라보노이드 유사체를 유효성분으로 함유하는 화학감작제

Info

Publication number: KR100839985B1
Application number: KR1020020047171A
Authority: KR
Inventors: 최철희; 유진철; 송재경; 함경수; 이인화
Original assignee: 조선대학교산학협력단
Priority date: 2002-08-09
Filing date: 2002-08-09
Publication date: 2008-06-19
Also published as: KR20040014007A

Abstract

본 발명은 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본, 3,5,7-트리하이드록시 3',4',5'-트리메톡시플라본, 5,7,3',4'-테트라메톡시플라본, 3,6,3',4'-테트라메톡시플라본 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 화학감작제(chemosensitizer)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 높은 화학감작 효과를 나타내는 상기 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 화학감작제 또는 P-당단백질에 의해 매개되는 다약물내성 억제제에 관한 것이다. 본 발명의 화학감작제는 항암제의 활성을 향상시킬 수 있기 때문에 항암제의 용량을 줄일 수 있고, 부작용이 적기 때문에 항암 화학요법과 병용하여 유용하게 사용할 수 있다.

Description

플라보노이드 유사체를 유효성분으로 함유하는 화학감작제{Chemosensitizer containing flavonoid derivatives as an effective ingredient}

도 1은 P-당단백질 과발현 AML-2/D100 세포에서 화학식 1의 화합물의 세포독성 및 화학감작 효과를 나타낸 것이고,

●: AML-2/D100 세포(빈크리스틴 -), △: : AML-2/D100 세포(빈크리스틴 +),

A : 쿼세틴 B: 3,7-디하이드록시-3',4'-디메톡시플라본,

C : 3,5,7,-트리하이드록시-3',4',5'-트리메톡시플라본,

D : 5,7,3',4'-테트라메톡시플라본, E : 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본,

F : 3,6,3',4',-테트라메톡시플라본,

도 2는 화학식 1의 화합물에 의한 용혈 활성을 비교한 그래프이고,

●: 3,6,3',4',-테트라메톡시플라본,

■: 3,7-디하이드록시-3',4'-디메톡시플라본,

▲: 3,5,7,-트리하이드록시-3',4',5'-트리메톡시플라본,

◆: 5,7,3',4'-테트라메톡시플라본,

▽: 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본,

도 3은 P-당단백질 과발현 AML-2/D100 세포에서 화학식 1의 화합물의 약물 축적 효과를 비교한 그래프이고,

CTL : 대조군, VP : 베라파밀(5 uM) , CSA : 사이클로스포린 A(5 uM),

1 : 쿼세틴, 2 : 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본,

3 : 5,7,3',4'-테트라메톡시플라본, 4 : 3,6,3',4',-테트라메톡시플라본,

5 : 3,5,7,-트리하이드록시-3',4',5'-트리메톡시플라본,

도 4는 AML-2/D100 세포에서 농도 의존적인 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본(sinensetin)-유도 약물 축적을 나타낸 그래프이고,

CTL : 대조군, VP : 베라파밀(5 uM) , CSA : 사이클로스포린 A(5 uM),

도 5의 A는 20 uM 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본 및 5 uM 베라파밀 처리 후 로다민-123의 축적 속도를 나타낸 그래프이고,

도 5의 B는 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본 및 베라파밀로 처리한지 1시간 후 로다민-123의 회복 속도를 나타낸 그래프이고,

VP : 베라파밀(5 uM),

시넨세틴 : 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본(20 uM),

도 6의 A는 다우노루비신 또는 빈크리스틴의 존재하의 AML-2/D100 세포에서 10 uM 베라파밀의 세포독성을 나타낸 그래프이고,

CTL : 대조군, DNR : 다우노루비신, VP : 베라파밀, VCR : 빈크리스틴,

도 6의 B는 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본 또는 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본과 베라파밀 존재하에서 세포독성을 나타낸 그래프이고,

시넨세틴 : 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본, VP : 베라파밀,

도 7은 여러 화학감작제가 P-당단백질의 발현 수준에 미치는 영향을 웨스턴 블럿 분석으로 분석한 사진이고,

CTL : 대조군, CSA : 사이클로스포린 A, VP : 베라파밀,

1 : 쿼세틴(25 uM), 2 : 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본(25 uM),

3 : 5,7,3',4'-테트라메톡시플라본(45 uM),

4 : 3,6,3',4',-테트라메톡시플라본(8 uM),

5 : 3,5,7,-트리하이드록시-3',4',5'-트리메톡시플라본(2 uM),

도 8은 화학감작제가 P-당단백질의 [³H] 아지도핀 광표지에 미치는 영향을 나타낸 사진이다.

시넨세틴 : 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본,

CSA : 사이클로스포린 A, VP : 베라파밀

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본, 하기 화학식 2로 표시되는 3,5,7-트리하이드록시 3',4',5'-트리메톡시플라본, 하기 화학식 3으로 표시되는 5,7,3',4'-테트라메톡시플라본, 하기 화학식 4로 표시되는 3,6,3',4'-테트라메톡시플라본 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 화학감작제로, 보다 상세하게는 높은 화학감작 효과를 나타내는 상기 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 화학감작제 또는 P-당단백질에 의해 매개되는 다약물내성 억제제에 관한 것이다.
<화학식 1>

<화학식 2>

<화학식 3>

<화학식 4>

삭제

다약물내성(multidrug resistance, MDR)은 항암화학요법에 의한 종양 치료를 어렵게 하는 주요한 원인 중의 하나이다. 다약물 내성에 대한 많은 기전이 보고되고 있는데, 가장 집중적으로 연구되고 있는 기전은 다약물내성 유전자 (MDR1)산물인 P-당단백질 또는 P-170의 발현에 의한 것이다.

다약물내성과 관련된 다약물내성 유전자(MDR1)의 산물인 P-당단백질(P-glycoprotein, Pgp), 다약물내성-관련 단백질(MRP1) 및 유방암 내성 단백질/미토잔트론 내성/태반-특이 ATP 결합 카세트(BCRP/MCR/ABCP)와 같은 단백질은 막 전달자(transporter)의 ATP-결합 카세트(ABC) 수퍼패밀리(superfamily)의 일종이다(Riordan et al.,1985 Nature 316(6031):817-819; Cole et al., Science, 1992, 258:1650-1654; Maliepaard et al., Cancer Res. 1999, 59(18):4559-4563). 상기 단백질들은 다양한 구조를 갖는 화학치료제의 에너지-의존적 배출 펌프로 작용하고, 따라서 세포내 약물 축적을 감소시킨다. 그 결과, 종양세포는 약물의 세포독성의 영향을 피할 수 있다.

P-당단백질이 과발현되면 종양세포가 다양한 약물에 대해서 내성을 가지게 된다. 이러한 단백질은 독소루비신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 파크리탁셀, 콜히친, 액티노마이신 D 및 마이토마이신 C와 같은 통상적으로 사용되는 세포독성 제제에 대한 배출 펌프로 작용한다(Endicott and Ling., Annu. Rev. Biochem. 1989, 58:137-171; Gottesman and Pastan., Annu. Rev. Biochem. 1993, 62:385-427). 한편, 칼슘 채널 길항제(verapamil; Tsuruo et al., Cancer Res. 1983, 43(2):808-813), 칼모듈린 저해제(phenothiazine; Ford et al., Mol. Pharmacol. 1989, 35:105-115) 및 면역저해제(cyclosporin A)등의 화합물이 P-당단백질에 의해 매개되는 다약물내성을 억제하는 것으로 알려져 있다.

다약물내성 세포에서 화학감작제로 알려진 P-당단백질 저해제를 항암제와 동시에 처리하면 항암제의 효과가 증대된다. 그러나, 다약물내성을 억제하기 위해서 많은 양의 화학감작제를 투여하였을 경우 나타나는 독성 부작용으로 인하여 상기와 같은 1세대 화학감작제의 임상에서 사용이 제한되어 왔다(Raderer and Scheithauer., Cancer, 1993, 72:3553-3563). 따라서, 화학감작 효능을 주 목적으로 높은 선택성 및 효능을 갖는 2세대 화학감작제 개발의 필요성이 시급한 실정이다.

현재 2세대 화학감작제에 대한 많은 연구가 진행되어 오고 있다. P-당단백질-매개 다약물내성을 역전하는 2세대 화학감작제로는 PSC833(Boesch et al., Cancer Res. 1991, 51(16):4226-4233), VX710(Germann et al., Anticancer Drugs, 1997, 8(2):125-140; Rowinsky et al., J. Clin. Oncol. 1998, 16(9):2964-2976; Yanagisawa et al., J. Cancer, 1999, 80(8):1190-1196), LY335979(Dantzig et al., Cancer Res. 1996, 56(18):4171-4179; Dantizig et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1999, 290(2):854-862), CR9051(Dale et al., Br.J. Cancer, 1998, 78(7):885-892; Mistry et al., Br. J. Cancer, 1999, 79(11-12):1672-1678), XR9576(Mistry et al., Cancer Res. 2001, 61(2):749-758) 및 SCH66336(Wang et al., Cancer Res. 2001, 61(20):7525-7529)이 있다. 2세대 화학감작제의 일부는 현재 임상시험 중에 있다.

베라파밀(verapamil), 사이클로스포린 A, FK506을 포함하는 대다수의 화학감작제는 P-당단백질에 의해 운반되어지는 것을 알려져 있다. 즉, 이들은 실질적인 P-당단백질 저해제가 아니고, 경쟁적인 방법에 의해 항암제의 배출 속도를 감소시키는 의사기질(pseudosubstrates)로 작용하는 것으로 보고되었다(Sikic, Semin. Hematol. 1997, 34(4 Suppl5):40-47).

P-당단백질에 의해 운반되어지지 않는 화학감작제를 찾기 위하여 소수성 스테로이드 및 플라보노이드에 대한 연구가 집중되고 있는데, 소수성 스테로이드 화학감작제에는 프로제스테론(Barnes et al., Biochemistry, 1996, 35(15):4820- 4827) 및 메드로시프로제스테론 아세테이트(Zibera et al., Anticancer Res. 1995, 15(3):745-749)가 있다. 플라보노이드는 새로운 종류의 화학감작제로 여겨지고 있으며, P-당단백질의 세포질 도메인 및 그의 ATP 결합 부위와 상호작용한다고 알려져 있다(Conseil et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 1998, 95(17):9831-9836).

플라보노이드들은 암세포에서 세포독성 약물의 방출에 작용하는 기전이 서로 다르다고 알려져 있다. 갈라닌(galanin), 캐프페롤(kaepferol) 및 쿼세틴(quercetin)과 같은 수산화 화합물은 아드리아마이신 방출을 증가시키는 것으로 밝혀졌고(Critchfield et al., Biochem. Pharmacol. 1994, 48(7):1437-1445), 쿼세틴 및 소수성 유도체는 로다민-123 및 Hoechst 33345 배출을 저해하는 것으로 보고되었다(Scambia et al., Cancer Chemother Pharmacol. 1994, 34(6):459-464; Shapiro and Ling, Eur. J. Biochem. 1997, 250(1):130-137; Shapiro and Ling, Biochem. Pharmacol., 1997, 53(4):587-596). 그러나 이러한 1세대 플라보노이드 화학감작제는 P-당단백질-매개 다약물내성 세포에서 약한 효능을 나타내는 것으로 보고되었다. 또한, 현재까지 화학감작제를 개발하기 위한 목적으로 식물로부터 화학감작제 활성을 갖는 신규 플라보노이드 화학감작제를 스크리닝하는 연구는 진행되지 않고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 P-당단백질-매개 다약물내성 세포에 대한 화학감작제를 개발하기 위하여, 감귤 추출물 중에서 화학감작 효과를 나타내는 플라보노이드 화합물을 분리, 정제하여 이들의 화학적 구조를 밝히고, 화학감작 효과 및 독성을 결 정하여 기존의 화학감작제 보다 효과가 뛰어나고 독성이 없는 플라보노이드 화학감작제임을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 화학감작제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본, 하기 화학식 2로 표시되는 3,5,7-트리하이드록시 3',4',5'-트리메톡시플라본, 하기 화학식 3으로 표시되는 5,7,3',4'-테트라메톡시플라본, 하기 화학식 4로 표시되는 3,6,3',4'-테트라메톡시플라본 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 화학감작제 또는 P-당단백질에 의해 매개되는 다약물내성 억제제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 화학감작제는 상기 화합물 중에서 5,7,3',4'-테트라메톡시플라본(시넨세틴), 3,6,3',4'-테트라메톡시플라본 및 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본 또는 약학적으로 허용되는 그들의 염을 유효성분으로 함유하는 것이 바람직하고, 화학식 1로 표시되는 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본인 것이 가장 바람직하다.

[화학식 1]

본 발명은 상기 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물 및 약학적으로 허용되는 그의 염 뿐만 아니라 그로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물 및 수화물을 모두 포함한다.

본 발명의 화학식 1 내지 4의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카르본산, 바닐린산, 요오드산 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그의 염은 화학감작제(chemosensitizer) 또는 강화제이며, 또한 내성 개선제로서 유용하다. 또한, P-당단백질에 의해 매개되는 다약물내성 세포에서의 초기 화학요법 및 반복 투여로 인한 획득 내성을 보일 경우 항암제와 동시에 투여하여 항암제의 활성을 향상시킬 수 있다.

상기 발명의 화학식 1 내지 4의 화합물은 치료 유효량, 예를 들면 질병상태에 대한 치료를 제공하기에 충분한 투여량으로, 암 화학요법제와 동시에 투여할 수 있다. P-당단백질에 의해 매개되는 내성 암세포의 경우 투여할 수 있는 항암제에는 빈카 알칼로이드(빈크리스틴), 안트라사이클린류(다오노루비신, 독소루비신 및 아드리아마이신), 에토포사이드, 테니포사이드 및 파크리탁셀(택솔) 등이 있으며, 항대사물 및 알킬화제에 대해서는 화학감작 효과가 덜 관찰된다.

5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본(시넨세틴)은 P-당단백질에 의해 매개되는 내성을 역전하는 효능과 P-당단백질 억제 효능의 응용 이외에도 여러 가지 효능이 있다. 특히, P-당단백질의 기질이 되는 약물(항암제 또는 중추신경계제제)들은 장과 뇌혈관 장벽에 존재하는 P-당단백질에 의해 생체이용율이 낮아질 수 있다(Britten CD et al., 2000 Clin. Cancer Res. 6(9):3459-3468; Schellens JH et al., 2000 Eur. J. Pharm. Sci. 12(2):103-110; Sparreboom A, et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(5):2031-2035; Schinkel AH et al., Cell 1994 77(4):491-502). 따라서, P-당단백질의 기질이 되는 약물을 경구로 투여할 경우 생체 이용률이 낮기 때문에, 본 발명의 P-당단백질 억제물질과 동시에 투여하면 생체 이용률을 높일 수 있다. 구체적으로, P-당단백질의 기질로서 임상적으로 문제가 되고 있는 약물(택솔 등)과 시넨세틴을 동시에 투여함으로써 경구투여 약물의 생물학적 이용률을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 중추신경계로의 전달에 문제가 있는 P-당단백질의 기질이 되는 약물(항바이러스제제 등)의 전달에 응용될 수 있다. 또한, 상기 플라보노이드는 돌연변이 억제효능(Miyazawa M et al., 1999 J. Agric. Food Chem. 47(12):5239-5244), 싸이토크롬 P-450 억제효능(Zhang H et al., 2000 Drug Metabol. Drug Interact. 17(1-4):351-363), 항산화효능(van Acker FA et al., 2001 Clin. Cancer Res. 7(5):1378-84; Sekher Pannala A et al., B 2001 Biochem. Biophys. Res Commun. 282(5):1161-1168), 혈소판 응집 억제효능(Robbins RC et al., 1988 Int. J. Vitam. Nutr. Res. 58(4):418-421) 및 매트릭스 메탈로프로티나제(matrix metalloproteinase) 억제효능(Ishiwa J, et al., 2000 J. Rheumatol. 27(1):20-55) 등의 효능을 가질 가능성이 높으므로, 상기 효능과 관련된 질병인 암, 노화, 혈전증 또는 류마티즘 등의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

화학식 1 내지 4의 화합물의 세포독성 및 화학감작 효과를 알아보기 위하여 MTT 분석을 수행하여 보면, 화학식 1 내지 4의 화합물은 항암제에 의한 내성을 감소시킨다(도 1 참조). 화학식 1 내지 4의 화합물의 화학감작 효과는 다음의 순서와 같다. 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본 > 3,5,7-트리하이드록시 3',4',5'-트리메톡시플라본 > 5,7,3',4'-테트라메톡시플라본 > 3,6,3',4'-테트라메톡시플라본 > 3,7-디하이드록시-3',4'-디메톡시플라본. 또한, 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본은 상대적으로 낮은 세포독성을 나타내고, 베라파밀 및 사이클로스포린 A와 같은 기존의 P-당단백질 저해제에 비하여 높은 화학감작 효과를 나타낸다(표 1 참조). 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본의 화학감작 효과는 헤스페리딘(hesperidine), 플라본, 쿼세틴 및 페룰산(ferulic acid)과 같은 다른 플라보노이드 보다 적어도 10 내지 100 배 이상 높다. 또한, 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본은 적혈구에 미치는 용혈효과에서 다른 플라보노이드와 비교해보면 세포막 독성이 매우 낮다(도 2 참조).

5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본 및 3,6,3',4'-테트라메톡시플라본은 로다민-123 축적을 증가시키고, 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본은 농도-의존적인 방법으로 로다민-123 축적을 증가시킨다(도 4 참조). 또한, 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본에 의한 로다민-123 축적의 속도 및 축적 양은 베라파밀에 의해 유도되는 것에 비하여 낮은 반면 로다민-123 축적에 대한 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본의 효과의 회복은 베라파밀보다 빠르다(도 5 참조).

1세대 화학감작제의 문제 중 하나는 P-당단백질 저해제 자체가 P-당단백질에 대한 기질이라는 것이다(Mistry et al., Cancer Res. 2001, 61(2):749-758). 하지만, P-당단백질의 기능을 완전히 억제하였을 때도 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본의 독성이 증가하지 않는 것으로 봐서 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본은 P-당단백질의 기질은 아닌 것으로 보인다(도 6 참조).

화학감작제에 대한 또 다른 문제는 트랜스포터의 함량을 증가시키는 효과이다. 화학식 1 내지 4의 화합물은 최대 비세포독성 농도에 의해 P-당단백질의 함량을 다양하게 변화시켰다. 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본은 P-당단백질의 함량을 오히려 감소시켰으며, 이는 베라파밀 및 사이클로스포린 A와는 상반되는 것이다(도 7 참조).

본 발명의 화학식 1 내지 4의 화합물은 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화학식 1 내지 4의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘(Calcium carbonate), 자당(Sucrose) 또는 유당(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 적절히 양을 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<제제예 1> 시럽제의 제조방법

본 발명의 화학식 1 내지 4의 화합물 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분 2% (중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조한다.

5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본의 산부가염, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해 시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다. 상기 부가염은 실시예에 의한 다른 염으로 대치시킬 수 있다.

상기 시럽제의 구성성분은 다음과 같다.

5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본·염산염 ········ 2 g

사카린 ······················· 0.8 g

당 ························ 25.4 g

글리세린······················ 8.0 g

향미료 ······················ 0.04 g

에탄올 ·······················4.0 g

소르브산 ······················0.4 g

증류수 ·······················정량

<제제예 2> 정제의 제조방법

유효성분 15 mg이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다.

5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본·염산염 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전 분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

상기 정제의 구성성분은 다음과 같다.

5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본·염산염 ·········250 g

락토오스 ······················175.9 g

감자전분 ·······················180 g

콜로이드성 규산 ··················· 32 g

10% 젤라틴 용액

감자전분 ·······················160 g

활석 ························· 50 g

스테아르산 마그네슘 ·················· 5 g

<제제예 3> 주사액제의 제조방법

유효성분 10 mg을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본·염산염 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20 ℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.

상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.

5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본·염산염··········1 g

염화나트륨······················0.6 g

아스코르브산·····················0.1 g

증류수························정량

<실시예 1> 화학식 1 내지 4의 화합물의 세포독성 및 화학감작 효과 분석

본 발명자들은 AML-2/D100에서 화학식 1의 화합물(Indofine Chemical회사, USA)의 세포독성 및 화학감작 효과를 알아보기 위하여 MTT 분석을 수행하였다. 구체적으로, OCI-AML-2 세포주는 캐나다의 온타리오 암 연구소에서 구입하여 사용하였다. 다우노루비신-내성 AML-2(AML-2/D100) 및 독소루비신-내성 AML-2(AML-2DX100)은 각각 P-당단백질 및 MRP를 발현하는 양성 세포주로 사용하였다(Choi and Ling., Mol. Cells, 1997, 7:170-177; Choi et al., Mol. Cells, 1999, 9:314-319). 모든 세포는 10% 열 불활성 FBS(fetal bovine serum)이 포함된 α-MEM 배지(Gibco)를 사용하여 37℃에서 5% CO₂ 환경에서 배양하였다. 세포들은 현탁(suspension) 배양으로 유지하고, 컨플루언스(confluence) 상태로 종속 배양하였다.

약물의 시험관내(in vitro) 세포독성은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide, Sigma) 분석(Pieters et al., Cancer Lett. 1988, 41:323-332)을 사용하여 결정하였다. 특정 제제에 대한 50% 저해 농도(IC₅₀)는 처리하지 않은 대조군에 비하여 세포수가 50% 감소하였을 때의 약물 농도로 정 의하였다. IC₅₀ 값은 반로그 약물-반응 곡선으로부터 직접 결정하였다. P-당단백질을 과발현하는 내성세포주 AML-2/D100은 P-당단백의 적합한 기질인 빈크리스틴 120 ng/㎖농도에서도 잘 자란다. 그러므로 화학감작 효과는 빈크리스틴 120 ng/㎖의 존재하에서 관찰하였다(Choi et al., Mol. Cells, 1999, 9:314-319).

그 결과, AML-2/WT 세포에서 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본에 대한 평균 IC₁₀ 값(세포 성장의 10% 저해를 나타내는 농도)은 20 uM 이상인 것으로 밝혀졌고, 반면 빈크리스틴의 존재하에서 P-당단백질 발현 세포(AML-2/D100)에서 IC₉₀ 값은 2 uM 이하이다(도 1의 E). 이는 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본이 약물 내성을 완전히 바꾸기 위해 필요한 농도에서 최소 독성을 갖는다는 것을 나타낸다. 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본의 화학감작 효과는 헤스페리딘(hesperidine), 플라본, 쿼세틴 및 페룰산(ferulic acid)과 같은 다른 플라보노이드 보다 적어도 10 내지 100 배 이상 높은 것으로 나타났다.

화학식 1 내지 4의 화합물은 빈크리스틴이 존재하지 않을 때(IC₅₀=10-200 uM) AML2/D100 세포주에서 세포독성을 나타낼 뿐만 아니라 빈크리스틴이 존재할 때(IC₅₀=1-18 uM)에 AML2/D100 세포주의 내성이 없어졌다(도 1). 테스트한 플라보노이드 중에서, 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본이 가장 강력한 화학감작 효과를 나타냈고, 이는 베라파밀 또는 사이클로스포린 A와 거의 같은 효과를 내었다(표 1). 화학식 1 내지 4의 화합물의 화학감작 효과는 다음과 같은 순서대로 효과가 높다. 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본 > 3,5,7-트리하이드록시 3',4',5'-트리메톡시플라본 > 5,7,3',4'-테트라메톡시플라본 > 3,6,3',4'-테트라메톡시플라본 > 3,7-디하이드록시-3',4'-디메톡시플라본.

5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본의 화학감작 효과는 5,7,3',4'-테트라메톡시플라본 및 3,7-디하이드록시-3',4'-디메톡시플라본의 효과에 비하여 각각 10 배 및 18배 이상 높았다. 또한, 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본은 상대적으로 낮은 세포독성을 나타내고, 베라파밀 및 사이클로스포린 A와 같은 기존의 P-당단백질 저해제에 비하여 높은 화학감작 지표를 나타내었다(표 1).

화학감작제	IC₅₀(빈크리스틴-)	IC₅₀(빈크리스틴+)	CI^a
5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본	82.4 uM	1.14 uM	72.28
5,7,3',4'-테트라메톡시플라본	200 uM	4.95 uM	40.42
3,6,3',4'-테트라메톡시플라본	200 uM <	11.40 uM	17.5<
3,5,7-트리하이드록시-3',4',5'-트리메톡시플라본	9.8 uM	3.90 uM	2.51
3,7-디하이드록시-3',4'-디메톡시플라본	15.9 uM	18.14 uM	0.88
베라파밀	50.9 uM	1.07 uM	47.57
사이클로포린 A	14.53 uM	0.87 uM	16.70

a : CI(화학감작 지표) = IC₅₀(빈크리스틴 -)/IC₅₀(빈크리스틴 +)

<실시예 2> 화학식 1 내지 4의 화합물의 용혈활성 분석

본 발명자들은 화학식 1 내지 4의 화합물의 용혈 활성을 수바락스미의 방법(Subbalaksmi et al., 1996, FEBS Lett 395(1):48-52)을 사용하여 측정하였다. 화합물의 용혈 활성은 414 nm에서 신선한 인간 적혈구의 4% 현탁의 헤모글로빈 분비를 결정함으로써 측정하였다. 인간 적혈구 세포는 원심분리하고 PBS(phosphate-buffered saline; 35 mM Phosphate buffer/ 0.15 M NaCl, pH 7.0)을 가지고 3번 세척하였다. 인간 적혈구 세포 100 ㎖를 PBS로 8%(v/v) 현탁하여 96-웰 플레이트에 접종하였고, 플라보노이드를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 방치한 후 150 g로 5분 동안 원심분리하였다. 상층액 중 100 ㎕를 평면-바닥 96-마이크로타이터 플레이트로 옮겼다. 용혈은 414 nm에서 ELISA 플레이트 리더(Molecular Devices Emax, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다. 0% 및 100% 용혈속도는 각각 PBS 및 0.1% Triton-100에서 결정하였다. 용혈 퍼센트는 하기 수학식 1로 계산하였다.

용혈(%) = ((화합물 용액에서 Abs 414 nm - PBS에서 Abs 414 nm)/(0.1% Triton-100에서 Abs 414 nm - PBS에서 Abs 414 nm)) X 100

그 결과, 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본은 적혈구에 미치는 용혈효과에서 다른 플라보노이드와 비교해보면 독성이 낮은 것으로 나타났다(도 2). 그러나 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본은 MRP-과발현세포인 AML-2/DX100에 대해서는 화학감작 효과가 없는 것으로 나타났다.

<실시예 3> 로다민-123 축적에 대한 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본의 효과

다약물내성 표현형은 P-당단백질과 같은 트랜스포터에 의해 세포밖으로 항암제를 뿜어냄으로써 항암제의 새포내 축적이 감소되어 나타나는 경우가 많다. 이 같은 P-당단백의 효과는 억제제인 베라파밀 및 사이클로스포린에 의해 역전되어 항암제의 세포내 축적을 증가시킨다. 본 발명자들은 화학식 1 내지 4의 화합물의 로다민-123 축적에 대한 효과를 알아보았다. 구체적으로, PBS에서 세포 현탁(1X10⁶ 세포/㎖)을 베라파밀 또는 사이클로스포린 A와 함께 또는 없는 상태에서 로다민-123(5 uM)에 노출시켰다. 상기 세포는 유동세포분석기(Becton Dickinson, USA)에 의해 그들의 세포질 약물 형광을 분석하였고, 상기에서 촛점 아르곤 레이저 빔(485 nm)는 라미나 시스 플로우(laminar sheath flow)에서 세포를 흥분시키고, 그들의 형광 발산을 모아서 막대그래프로 나타내었다. P-당단백질에 의해 운반되는 약물인 로다민-123의 축적은 P-당단백질 과발현세포인 AML-2/D100 세포에서 유동세포분석기를 사용하여 결정하였다.

그 결과, 5 uM의 베라파밀 또는 사이클로스포린 A 및 쿼세틴, 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본, 5,7,3',4'-테트라메톡시플라본(루테오린 테트라메톡시 에테르), 3,6,3',4'-테트라메톡시플라본 및 3,5,7-트리하이드록시 3',4',5'-트리메톡시플라본(메리세틴 트리메틸에테르)와 같은 각각의 플라보노이드 20 uM을 가지고 그들의 약물 축적 효과를 비교한 결과(도 3), 유동세포분석기에 의해 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본 및 3,6,3',4'-테트라메톡시플라본에서만 로다민-123 축적을 증가시키는 것으로 나타났다. 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본은 농도-의존적인 방법으로 로다민-123 축적을 증가시켰다(도 4). 그러나, AML-2/D100에서 약물 축적에 대한 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본의 효과는 같은 효과를 유도하게 하는 농도에서 비교하였을 때 베라파밀 및 사이클로스포린 A에 비해 각각 4배 및 16배 낮았다(도 3).

<실시예 4> 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본 및 베라파밀의 처리 및 제거 후에 로다민-123의 축적 및 회복

화학감작제의 처리 후에 로다민-123의 축적 및 회복을 AML-2/D100에서 20 uM 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본과 5 uM 베라파밀을 비교하였다. 로다민-123의 세포내 수준은 유동세포분석기로 분석하였다.

그 결과, 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본에 의한 로다민-123 축적의 속도 및 양은 베라파밀에 의해 유도되는 것에 비하여 낮았고 반면 로다민-123 축적에 대한 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본의 효과의 회복은 베라파밀보다 빨랐다(도 5).

<실시예 5> 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본 세포독성에 대한 P-당단백질 저해 효과

1세대 화학감작제의 문제 중 하나는 P-당단백질 저해제 자체가 P-당단백질에 대한 기질이라는 것이다(Mistry et al., Cancer Res. 2001, 61(2):749-758). 만일 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본이 P-당단백질에 대한 기질이라면, 다른 P-당단백질 저해제에 의해 P-당단백질의 저해는 P-당단백질 세포에서 세포내 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본 축적의 양을 증가시킬 수 있고, 따라서 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본 세포독성을 증가시킬 것이다. AML-2/D100에서 P-당단백질 기능을 완전히 막을 수 있는 최대 비세포독성 농도 10 uM 베라파밀을 처치하여 MTT 방법을 시행하여 세포독성을 측정한 결과 AML-2/D100 세포에 대해 세포독성을 유도하지 않지만, 다우노루비신 또는 빈크리스틴을 함께 처리하였을 때는 AML-2/D100 세포는 생존할 수 없었다(도 6의 A). 이 같은 결과는 이들 항암제가 P-당단백의 기질임을 보여 준 것이다. 같은 근거로 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본이 P-당단백질의 기질인지를 알아보기 위하여 같은 실험을 시행한 결과 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본에 의한 AML-2/D100 세포독성은 10 uM 베라파밀에 의해 변하지 않았다(도 6의 B). 상기 결과로부터 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본은 P-당단백질의 기질이 아니라는 것을 간접적으로 알 수 있다.

<실시예 6> P-당단백질 수준에 대한 화학감작제의 효과

화학감작제에 대한 또 다른 관심은 목적 트랜스포터 발현 수준의 증가이다. 플라보노이드 화학감작제가 AML-2/D100 세포에서 P-당단백질의 발현 수준을 증가시킬 수 있는지 알아보기 위하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다.

구체적으로 AML2/D100 세포에 화학감작제의 최대 비세포독성 농도(90% 이상 생존)를 72시간 동안 처리하였다. 약물-민감 및 약물-내성 세포로부터 원형질막 단백질의 분리는 기존의 방법에 따라 수행하였다(Riordan et al., J. Biol. Chem. 1979, 254:12701-705). 막 단백질을 녹이고 SDS-PAGE에서 분획화하였다. 웨스턴 블럿팅은 토우빈의 방법을 조금 변형하여 수행하였다(Towbin et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1979, 76:4350-4354). 단백질을 60 V의 전류를 갖고 전기럿팅에 의해 하룻밤 동안 니트로셀룰로스 막으로 이동시켰다. 상기 막은 블록킹 용액(5% 탈지유)에 상온에서 1시간 동안 방치하고 세척한 후 1:1,000으로 희석한 P-당단백질에 대한 1차 항체인 C219(Signet)를 첨가하였다. 상기 막을 세척하고, 1:2,000으로 희석한 호세라디쉬 퍼옥시다제-접합 토끼-항생쥐 IgG(Sigma)로 1시간 동안 방치하였다. 마지막으로, ECL 검출 킷트(Amersham)의 검출 시약을 사용하여 막을 염색하였다. 단백질 농도는 단백질 분석 킷트(Bio-Rad)를 사용하여 결정하였고, BSA(Bovine serum albumin)을 기준으로 하였다.

그 결과, 플라보노이드를 포함하는 화학감작제의 최대 비세포독성 농도에 의해 여러 정도(단계)에서 P-당단백질의 발현 수준이 변하였다. 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본은 P-당단백질 수준을 감소시키는 것으로 나타났고, 이것은 베라파밀 및 사이클로스포린 A와는 상반되는 것이다(도 7).

<실시예 7> 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본에 의한 P-당단백질의 아지도핀 광표지의 영향 분석

디하이드로피리딘의 광활성 유사체인 아지도핀은 다약물내성 세포 형질막에 서 P-당단백질을 광표지한다. 이러한 표지는 빈블라스틴 및 몇몇 칼슘 채널 방해제에 의해 저해된다(Safa et al., J. Biol. Chem. 1987, 262:7884-7888; Safa, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1988, 85(19):7187-7191). 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본이 P-당백질의 [³H]-아지도핀 광표지를 저해하는지 알아보았다.

아지도핀 결합 분석은 구테일의 방법(Gutheil et al., 1994 J. Biol. Chem. ;269(11):7976-7981)을 조금 변형하여 수행하였다. AML-2/D1000 세포(Choi and Ling, 1997 Mol. Cells 7(2):170-177)의 원형질막을 이전의 방법과 같이 분리하였다(Riordan and Ling, J. Biol. Chem. 1979, 254:12701-12705). 막 소포(vesicles)(50 ㎍ 단백질)는 테스트 약물의 있을 때 또는 없을 때에 1 mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.4) 및 2 uM[³H]-아지도핀(50 Ci/mmol, Amersham Corp.)에서 최종 부피가 20 ㎕가 되게 광표지되었다. 아지도핀이 P-당단백질에 대한 결합의 저해에 대한 양성대조군으로 사이클로스포린 A 또는 베라파밀을 [³H] 아지도핀을 첨가하기 1시간 전에 최종 농도가 100 uM이 되게 대조군 플레이트에 첨가하였다. 얼음 위에 있는 상기 플레이트를 아지도핀이 P-당단백질과 교차-결합할 수 있게 직접 315 nm의 UV 램프에 30분 동안 놓았다. 배지를 제거하고, 막단백질을 용해 버퍼 용액(0.175 ㎎/㎖ 페닐메틸설포닐 플루오라이드(Phenylmethylsulfonyl fluoride), 0.012 ㎎/㎖ 아프로티닌(aprotinin), 10.3 mM H2PO4, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 15 mM sodium azide, 100 mM NaCl, 5 ㎎/㎖ 소듐 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate))에 녹였다. 녹지 않는 파편은 간단한 원심분리에 의해 제거하고, 상층액을 가열 없이 7% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 젤에 로딩하고, 200 V에서 35분 동안 전기영동하였다. 상기 젤은 고정 용액(이소프로판올 : 물 : 아세트산 = 25% : 65% : 10%)에 30분 동안 넣어 둔 후 앰플리파이 용액(Amersham Corp. USA)로 30분 동안 처리하였다. 3 ㎜ 와트만 필터 페이퍼에서 진공 건조기로 60-80 C로 건조한 후 젤을 필름(Kodak X-Omat film)에 14일 동안 노출하였다.

그 결과, [³H]-아지도핀은 100 uM 농도 이상에서 자외선에 의해 특이적으로 P-당단백질을 표지하였다. [³H]-아지도핀에 의한 P-당단백질의 광표지는 사이클로스포린 A 및 베라파밀에 의해 부분적으로 저해되나 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본에 의해서는 저해되지 않았다(도 8). 상기와 같은 결과는 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본이 아지도핀 결합 부위에서는 P-당단백질과 상호작용하지 않는다는 것을 나타낸다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물은 기존의 화학감작제에 비하여 화학감작 효과가 뛰어날 뿐만 아니라 1세대 화학감작제의 문제점인 P-당단백질에 대한 기질이 아니고 P-당단백질의 발현을 감소시키는 작용을 함으로써 이를 포함하는 화학감작제는 다약물내성의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 5,6,7,3',4'-펜타메톡시플라본, 하기 화학식 2로 표시되는 3,5,7-트리하이드록시 3',4',5'-트리메톡시플라본, 하기 화학식 3으로 표시되는 5,7,3',4'-테트라메톡시플라본, 하기 화학식 4로 표시되는 3,6,3',4'-테트라메톡시플라본 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 화학감작제.

<화학식 1>

<화학식 2>

<화학식 3>

<화학식 4>
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 화학감작제는 P-당단백질에 의해서 매개되는 다약물내성을 억제하는 것을 특징으로 하는 화학감작제.
제 1항에 있어서, 상기 화학감작제는 P-당단백질 또는 싸이토크롬 450의 기질이 되어 경구 생체이용율이 낮은 약물 또는 뇌혈관장벽에서 P-당단백질의 기질이 되어 배출되는 약물과 함께 투여하는 것을 특징으로 하는 화학감작제.
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