TWI425950B - 豬胸膜肺炎放線桿菌重組毒素ＡｐｘＩＶ蛋白在動物疫苗及佐劑之應用 - Google Patents

Description

豬胸膜肺炎放線桿菌重組毒素ApxIV蛋白在動物疫苗及佐劑之應用

本發明係關於一種豬胸膜肺炎放線桿菌重組毒素ApxIV蛋白，其係用於製成一種動物疫苗，豬胸膜肺炎放線桿菌血清型第一型不活化全菌疫苗之抗原或佐劑，防治豬隻感染疾病，特別是針對豬胸膜肺炎放線桿菌所引起的疾病。

豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,A.p. )是屬於溶血性革蘭氏陰性菌，共有15種血清型，會引起豬隻出血性、纖維性和壞死性胸膜肺炎，造成豬場嚴重之經濟損失。由於豬胸膜肺炎放線桿菌會造成感染的動物迅速地死亡，且A.pleuropneumoniae 的血清型眾多，不同血清型之A.pleuropneumoniae 對宿主具有不同的專一性和毒性，因此很難藉著使用不活化菌苗，達到交叉保護不同血清型的目的。對於本病的防治目前仍無較有效的方法，雖然市面上有許多疫苗商品，但大都僅能減少豬群的死亡率，使疾病變成慢性感染的症狀。抗生素的使用也可延遲本病的發生和降低感染豬的死亡率，但一旦停止用藥則會再度爆發並造成豬隻死亡。就一般而言，感染豬放線桿菌胸膜肺炎會造成豬隻飼料換肉率下降，嚴重時甚至造成豬隻死亡，但是目前的疫苗價格較高，加上抗生素治療亦會大幅增加飼養成本，所以在現場上也有採取淘汰的方式來控制，台灣地區發生率逐年提高，造成極大之經濟損失，本病的控制亟待解決。在1981-1990年所作的生長肥育豬調查發現，流行於本省的菌株為第1(80.03%)、2(3.2%)、5(12.6%)、7(3.2%)、和第8(0.8%)等血清型之情況，並以第1型盛行率最高。

豬胸膜肺炎放線桿菌的致病因子主要來自莢膜、脂多糖(LPS)、外膜蛋白(OMP)、轉鐵結合蛋白(TBP)、和外毒素(Actinobacillus pleuropneumoniae -toxin，Apx)等，其中又以屬於RTX(repeat in the structural toxins)家族之外毒素Apx為最重要致病因子，因其具有免疫原特性可作為疫苗之用；目前市面上的疫苗大多仍是以不活化菌疫苗型態為主，但在不同的血清型間因無足夠的交叉免疫保護性，且所誘發之抗體對不同毒素中和能力的差異性，導致傳統疫苗在現場保護效力上仍有其限制性；另外，以豬胸膜肺炎放線桿菌致病因子為目標的有化學突變、基因突變、基因缺損的弱毒株的疫苗，均可提供有效的免疫反應和保護，但弱毒株的疫苗隨著毒力降低，其免疫原性也會有所降低，且有可能會有毒力回歸的可能性發生。因此，應以次單位疫苗的研究開發較為理想，本發明ApxIV重組毒素蛋白有良好交叉保護效果，可作為次單位疫苗減少抗生素的使用，以保護台灣養豬產業，免於豬胸膜肺炎放線桿菌病的威脅。

是以，本案發明人鑑於上述習用豬胸膜肺炎放線桿菌疫苗所衍生的各項缺點，以及該ApxIV重組蛋白在動物疫苗上的應用，乃亟思加以改良創新，並經多年苦心孤詣潛心研究後，終於成功研發完成本件應用於動物疫苗之豬胸膜肺炎放線桿菌重組毒素ApxIV蛋白。

本說明書中所述之所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同瞭解的意義。

本發明為提供一種選殖的ApxIV 基因及其重組蛋白，包含帶有該ApxIV 基因之生物功能性質體、含有該ApxIV 重組基因載體、經含有該ApxIV 重組基因之載體所轉染之適當宿主細胞，以及免疫生成性多胜肽表現產物，其中該重組毒素蛋白ApxIV 基因具有陳述於SEQ ID NO:1之胺基酸序列。其生物學活性變異體進一步包含在本發明中，因為熟習此技藝中之通常技藝者不需過度的努力即可能知道如何自多胜肽序列來修飾、置換、刪除等，並產生保有如本專利申請序列之相同或實質上相同之生物學活性變異種。其中該重組毒素蛋白係對動物無毒性，具有高抗原性，利用西方墨點法分析其抗原性可被感染過不同血清型豬胸膜肺炎放線桿菌之豬隻血清所辨識。

本發明之另一目的為提供一種含有重組毒素蛋白ApxIV之疫苗，用於保護動物抵抗豬胸膜肺炎放線桿菌之感染。其中該重組毒素蛋白ApxIV，係用於引起動物體內良好之免疫反應，包括體液性及細胞性免疫反應，保護動物抵抗豬胸膜肺炎放線桿菌之感染，尤其用於交叉保護不同血清型；本發明之另一目的為提供一種輔助疫苗的方法，其係將ApxIV重組毒素蛋白與抗原疫苗混合，其中抗原疫苗可為豬胸膜肺炎放線桿菌血清型第一型不活化菌疫苗或多胜肽抗原製劑，增進該疫苗之免疫原性，有效引起動物體內之免疫反應，包括體液性及細胞性免疫反應，保護動物抵抗豬胸膜肺炎放線桿菌之感染，尤其用於交叉保護不同血清型之感染；本發明之另一目的為提供一種用於偵測豬隻是否受豬胸膜肺炎放線桿菌感染之診斷試劑，其中包含上述之重組毒素蛋白ApxIV。

本發明之另一目的為提供一種豬用次單位疫苗，其中包含上述之重組毒素蛋白ApxIV及獸醫學上可接受之佐劑或賦形劑。

為達成上述發明目的，本發明於第一部分中提供一種選殖的ApxIV 基因及其重組蛋白，該選殖之重組蛋白係構築於pET-32a表現載體中，並轉形於大腸桿菌E. coli BL21(DE3)中，且於中華民國99年11月12日寄存於新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 940599。

利用西方墨點法分析抗原性，該ApxIV重組毒素蛋白可被接種過豬胸膜肺炎放線桿菌之豬隻血清所辨識。

本發明於第二部分中提供一種含有重組毒素蛋白ApxIV之疫苗，包含選自下列一種如SEQ ID NO:1所述之重組毒素基因ApxIV 核酸分子、含有該重組毒素基因ApxIV 基因之質體或寄主細胞等，結合生理學上可接受之載劑，且可選擇一種或多種佐劑製備而成的混合疫苗。

本發明之疫苗包括但不限於不活化疫苗、多胜肽疫苗或次單位疫苗等。上述疫苗以此項技藝中已知的標準方法來製備。

以該疫苗進行小鼠免疫試驗，以ELISA檢測抗體均可以提昇較高力價，分別以A.p 血清型第一型和第五型攻毒後，免疫組的存活率均達80%以上，顯示具有交叉保護效果，在豬隻解剖後發現可以減輕症狀67.3%。

其中該生理學上可接受之載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、界面活性劑(surfactant)、佐劑(adjuvant)，及其他類似或適用本發明之載劑。

其中該佐劑為一種可增加動物對此疫苗產生免疫反應的物質，佐劑可與疫苗在相同時間及相同位置上被給與，或者在不同時間給與，例如作為加強劑。佐劑亦可被有利地以同一種方法或不同於給與疫苗之方法或位置來給與豬隻。該佐劑可包含但不限於：油質佐劑(如：礦物油、植物油、動物油、佛氏完全佐劑、佛氏不完全佐劑等)、水質佐劑(如：氫氧化鋁)、雙相油質佐劑(如：脂質體(Liposome)、水包油包水劑型(w/o/w))、生物型佐劑(如：細胞激素、CpG寡核苷酸、細菌類毒素toxoid)等。其中該雙相油質佐劑係包含一界面活性劑以及一油相物質；該界面活性劑係包括一或多種下列所選之群組者：山梨醇(sorbitol)脂肪酸酯；山梨醇脂肪酸酯與環氧乙烷(ethylene oxide)或環氧丙烷(propylene oxide)濃縮物；甘露醇(mannitol)脂肪酸酯；甘露醇脂肪酸酯與環氧乙烷或環氧丙烷濃縮物；甘露醇脂肪酸酯與下列所選之親水基：羧酸(carboxylic acid)、胺基(amine)、醯胺(amide)、醇類(alcohol)、聚酯多元醇(polyol)、醚類(ether)、氧基(oxide)之接合物；無水甘露醇(anhydromannitol)脂肪酸酯；無水甘露醇脂肪酸酯與下列所選之親水基：羧酸、胺基、醯胺、醇類、聚酯多元醇、醚類、氧基之接合物；蔗糖(saccharose)脂肪酸酯；蔗糖脂肪酸酯與環氧乙烷或環氧丙烷濃縮物；甘油脂肪酸酯；甘油脂肪酸酯與環氧乙烷或環氧丙烷濃縮物；脂肪酸與環氧乙烷或環氧丙烷濃縮物；脂肪醇與環氧乙烷或環氧丙烷濃縮物；以及甘油磷脂(glycerophospholipid)。該油相物質包括一或多種下列所選之群組者：礦物油、植物油以及動物油。

本發明於第三部分中提供一種輔助疫苗的方法，其係將該ApxIV重組毒素蛋白與抗原疫苗混合，其中抗原疫苗可為豬胸膜肺炎放線桿菌血清型第一型不活化菌疫苗或多胜肽抗原製劑，增進該疫苗之免疫原性。其中製備不活化菌疫苗的方法包含但不限於：去活化劑處理、熱處理等習知適用之不活化方法。其中去活化劑包含但不限於：福馬林處理、2-溴乙胺(binary ethyleneimine,BEI)等。

術語“預防、保護” 意謂，相較於未使用本發明之疫苗者，使用本發明之疫苗者，將可有效增強動物對抗豬胸膜肺炎放線桿菌，可預防及保護動物免於感染豬胸膜肺炎放線桿菌及其衍生之相關疾病。

本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。

實施例一　重組蛋白ApxIV基因之選殖與定序 1.1　菌株：

豬胸膜肺炎放線桿菌，菌株為生物型第一型之血清型第一型和第五型。

1.2　豬胸膜肺炎放線桿菌基因體之製備

將豬胸膜肺炎放線桿菌血清型第一型培養於NAD(100 μg/mL)的BHI培養基(BHI/NAD)或10%雞血清和酵母抽出物的BHI培養基，放置於37℃細菌培養箱中培養18小時；挑選單一菌落至10 mL之BHI/NAD培養液或10%雞血清和酵母抽出物的BHI培養液中，置於37℃恆溫培養箱中以200 rpm震盪培養隔夜，將1500 μL菌液於4℃下以7500 rpm離心10分鐘，去除上清液。利用Blood & Tissue Genomic DNA Extraction Miniprep System(Viogene,CA,USA)試劑套組抽取豬胸膜肺炎放線桿菌之基因體DNA，最後加入30 μL滅菌水溶解該DNA，保存於-20℃備用。

1.3聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction) ApxIV 基因之選殖

根據豬胸膜肺炎放線桿菌ApxIV 之全長基因(GenBank: AF 021919.1)，設計一對具有特異性之引子對，分別為

ApxIV-F: GCCGAATTC CGCGCCTATATCTGGAAT SEQ ID NO:2

ApxIV-R:TGCAAGCTT ATTTCCCTTCGAATTGATTC SEQ ID NO:3

其中GAATTC 為限制酶EcoRI 切位，AAGCTT 為限制酶HindIII 切位；利用這一對引子及第一血清型豬胸膜肺炎放線桿菌基因體DNA為模板進行PCR反應，PCR反應條件為94℃、5分鐘，54℃、1分，72℃、10分鐘，共35個循環。經PCR增幅反應得到大小為2588 bp的DNA產物(圖1)。

實施例二　以原核表現系統表現ApxIV重組蛋白質 2.1　構築重組蛋白質體與轉形作用(transformation)

使用pET-32a(Novagen,Darmatadt,Germany)為表現載體，此載體具有6個histidine(His)作為標籤蛋白、multiple cloning site(MCS)供不同限制酶切割，且具有抗ampicillin供篩選之。將上述PCR產物分別以限制酶處理後，在黏結到用相同限制酶處理並去磷過的表現載體pET-32a，所得之重組質體命名為pET-32a/ApxIV 。

將上述重組質體pET-32a/ApxIV 轉形到大腸桿菌BL-21(DE3)，利用限制酶切割後確認產物大小，將選殖成功之菌株送至成功大學核酸定序中心進行定序，利用軟體將定序結果與GenBank登載的序列進行比對，ApxIV和AF021919.1序列相比較其相似度為98%。

選取經基因定序後之單一菌落，培養於3 mL含200 μg/ml ampicillin(MDBio,Taipei,Taiwan)之Luria-Bertani(LB)(Difco,MD,USA)培養液中，以37℃震盪培養一夜，將隔夜培養之菌液加入含200 μg/mL ampicillin新鮮的LB培養液中，再以37℃震盪培養。待其吸光值OD_600nm 達0.6時收取部分菌液為0小時對照，其餘菌液則加入Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)(Amresco,NE,USA)使其最終濃度為1 mM，繼續以37℃震盪分別培養2小時、4小時和6小時後，離心收集菌體。

2.2重組蛋白樣本之定量

各取10μL已製備之rApxIV及濃度500 μg/mL、250 μg/mL及125 μg/mL之牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)(KPL,MD,USA)樣本加入凹槽內，以90伏特電力進行0.8% SDS-PAGE電泳後，以含0.1% coomassie brilliant blue R -250(Merck,KGaA,Germany)染色10分鐘後，以脫色液destain(methanol 150 mL，acetic acid 50 mL，glycerol 7.5 mL，Add D.D.W to 300 mL)脫色，待膠片背景完全透明時以去離子水浸泡30分鐘。以Uvitec影像分析軟體(Uvitec,Cambridge,UK)進行蛋白表現量之分析，先以標準品BSA作回歸曲線計算其濃度，再藉由此值計算重組蛋白rApxIV之濃度(圖2)。

將經選殖成功之重組質體pET-32a經轉形作用後送入大腸桿菌菌株BL21(DE3)進行蛋白質表現。於SDS-PAGE顯示ApxIV蛋白質之分子量為130 kDa；利用西方墨點分析法分析其表現量，以1mM IPTG誘導重組蛋白4小時後，其表現量分別可達143 μg/mL(圖2)。ApxIV毒素蛋白在15種血清型中都有存在，並且會在動物體內誘導而表現的一種毒素，該毒素能刺激體內較高的抗體，因此該ApxIV具有免疫原性。由西方墨點法利用免疫過後之仔豬血清確認其抗原性(圖3)，證明該ApxIV可作為疫苗之重要抗原。

實施例三　疫苗之製備 3.1　豬胸膜肺炎放線桿菌( A.pleuropneumoniae )之定量與不活化

培養A.pleuropneumoniae 之菌液，取1 mL菌液，以1:10方式稀釋菌液(10^-1 至10^-10 )，最後各取50 μL之菌液塗抹於(BHI/NAD)(Difco,MD,USA)培養基上，於37℃恆溫培養箱中培養16小時後計數菌落數(colony formation unit;CFU)。以10,000 xg離心(Sorvall Lengend Mach 1.6R. Thermo,NH,USA)收集菌體，將菌液調整為1×10⁹ CFU/mL，並加入0.2%中性福馬林，於37℃下震盪不活化作用18小時。

3.2　重組蛋白之培養與熱不活化

選取帶有重組質體pET-32a/ApxIV 之大腸桿菌BL-21(DE3)單一菌落，培養於3 mL含200 μg/mL ampicillin(MDBio,Taipei,Taiwan)之Luria-Bertani(LB)(Difco,MD,USA)培養液中，以37℃震盪培養一夜，以1:100之稀釋倍數將隔夜培養之菌液加入含200 μg/mL ampicillin新鮮的LB培養液中，再以37℃震盪培養。待其吸光值OD_600nm 達0.6時加入Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)(Amresco,NE,USA)使其最終濃度為1 mM，繼續以37℃震盪培養4小時後，離心收集菌體，將rApxIV蛋白質濃度調整為150 μg/mL，並於60℃水浴中不活化作用80分鐘。

3.3疫苗之調配

試製菌苗分為全菌添加rApx protein重組蛋白(A.P +rApx+rOMP)及對照組(PBS)。添加佐劑依內層之抗原：油層：外層之抗原為1：1：2之比例，乳化調配成水包油包水(w/o/w)油質疫苗；或添加氫氧化鋁調配成水質佐劑。

實施例四　動物實驗 4.1.1　小鼠半致死劑量(50% Lethal Dose;LD ₅₀ )試驗

將A. pleuropneumoniae 以上述方法培養後，以不同菌數對ICR小白鼠(威信行，台灣)進行LD₅₀ 之測定。分為4組，每組5隻，第1組至第4組分別於腹腔注射0.2 mL之菌液，菌數為每1 mL含1×10⁸ 、1×10⁷ 、1×10⁶ 及1×10⁵ 。注射後觀察10天並紀錄小鼠死亡時間，最後再以Reed & Muench計算LD₅₀ 。

Proportionate distance(PD)=[(高於50%上一個稀釋之感染百分比)-50%]/[(高於50%上一個稀釋之感染百分比)-(低於50%下一個稀釋之感染百分比)]。

以A. pleuropneumoniae 血清型第一型進行LD₅₀ 之試驗。試驗結果顯示，以菌數1×10⁸ CFU/mL攻毒之小鼠5隻死亡；以1×10⁷ CFU/mL攻毒之小鼠4隻死亡，以1×10⁶ CFU/mL攻毒之小鼠為1隻存活，而以1×10⁵ CFU/mL攻毒之小鼠為全部存活。最後利用Reed & Muench計算LD₅₀ 其結果為3×10⁶ CFU/mL(表1)。

以A. pleuropneumoniae 血清型第五型進行LD₅₀ 之試驗。試驗結果顯示，以菌數1×10⁸ CFU/mL攻毒之小鼠5隻死亡；以1×10⁷ CFU/mL攻毒之小鼠為5隻死亡，以1×10⁶ CFU/mL攻毒之小鼠全部存活，而以1×10⁵ CFU/mL攻毒之小鼠也全部存活。最後利用Reed & Muench計算LD₅₀ 其結果為3×10⁶ CFU/mL(表2)。

4.1.2　不同血清型之小鼠效力試驗

選3週齡ICR小鼠共15隻(威信行，台灣)，隨機分為3組，每組5隻，每隻肌肉注射0.2 ml，免疫後一週以A.pleuropneumoniae 血清型第一型1×10⁷ CFU/mL進行腹腔注射攻擊試驗，結果顯示存活率A組(rApxIV)為80%、B組(rApxI+II)為60%，C組(對照組)為40%(表3)。

以A.pleuropneumoniae 血清型第五型1×10⁷ CFU/mL進行腹腔注射攻擊試驗，結果顯示存活率A組添加rApxIV為100%，B組(rApxI+II)為80%，而C組(對照組)則全部發病死亡(表4)。

綜上所述，添加rApxIV之小鼠存活率最高，並可達到交叉保護不同血清型之目的。

由於在台灣最常發生的是第一型和第五型，故選用這兩型作為不同血清型攻毒試驗組，所以可以證明我們所表現的重組蛋白ApxIV，是有保護效果的，並可以交叉保護不同血清型。

4.1.3　小鼠攻毒試驗

每隻小鼠腹腔注射疫苗0.2 ml，每組6隻，免疫後一週以A. pleuropneumoniae 血清型第一型(5×10⁷ CFU/mL)進行腹腔注射攻擊試驗，並觀察1週。結果顯示各組之存活率分別為，A組(A. p serotype 1+rApxI+II+IV+rOMP)添加rApxIV為100%，B組(商業用疫苗)為50%，而C組為對照組則全部發病死亡(表5)。

動物注射含有ApxIV重組毒素蛋白的全菌A.pleuropneumoniae 不活化疫苗後，存活率最高，亦即保護力最強，因此該ApxIV重組毒素蛋白可用於輔助全菌A.pleuropneumoniae 不活化疫苗，加強其免疫作用，與一般商業用疫苗具有顯著性差異。

4.2.1仔豬安全及效力試驗

安全試驗參考動物用藥品管理手冊中第58節豬嗜血桿菌不活化菌苗檢驗標準。選嗜血桿菌抗體陰性(6-8週齡)小豬二頭，依用法各接種五劑量，觀察二週，須無任何不良反應而健存。

效力試驗參考歐洲藥典01/2005:0963之豬胸膜肺炎放線桿菌菌苗檢驗標準。選擇6週齡健康豬隻共6頭，隨機分為2組，每組3頭，A組：不活化菌苗添加rApxI、II、IV+rOMP(150 μg/mL)組、及B組：陰性對照，於頸部肌肉接種1劑量(2 mL)，第一次免疫後，間隔2週後再補強接種劑量，隔2週後以A.pleuropneumoniae 第一型菌液鼻腔注射攻毒，觀察是否有體溫上升、呼吸急促困難、食慾不振等病症發生，死亡則立刻解剖紀錄肺部病變程度，觀察期為1週。免疫後豬隻並無異常症狀，而且進食正常，顯示疫苗不會對豬隻引起不良反應，安全性高。

4.2.2　仔豬的ELISA抗體力價

所有試驗豬隻分別在0週、1週、2週、4週進行採血，以間接ELISA測試抗體力價結果顯示，在免疫後一週抗體已有明顯上升，免疫組血清之抗體力價與對照組相較之下，於免疫後1、2、4週均有顯著差異(圖4)。結果顯示所配製之重組蛋白菌苗均能有效提升抗體力價。

4.2.3　攻毒後解剖病變之差異

免疫第五週後豬隻以鼻腔接種豬胸膜肺炎放線桿菌血清型第一型8×10⁷ CFU/ml，每隻接種5 ml。對照組於攻毒後出現厭食、活力降低和呼吸困難等並在36小時內死亡。攻毒後的7天試驗組送到本校病理解剖室進行解剖，並以病變程度給予評分，依照出血、水腫及纖維素粘連等病灶延伸範圍，低於5%得1分、5-25%得2分、25-50%得3分、50-75%得4分、大於75%得5分(表6)。剖檢時可見到肺臟呈現嚴重之出血及水腫(圖5)，於組織病理學檢查中，亦可見到大量血球及滲出液充塞於肺泡腔中。攻毒後對照組的症狀與小鼠毒力試驗的結果吻合，免疫組則減輕解剖症狀達67.3%(表6)，對照組的豬隻在攻毒後呈現嚴重的症狀，證實免疫本疫苗可保護豬隻抵抗豬胸膜肺炎放線桿菌之攻擊，且疫苗組攻毒後增重效率仍可保持正常狀況。

4.2.5　免疫細胞增生試驗 以流式細胞儀分析CD4 ⁺ /CD8 ⁺ 免疫細胞種類比例

分別抽取免疫前和補強免疫後兩週的豬隻血液，分離出周邊血液單核球細胞(peripheral blood mononuclear cell;PBMC) 以流式細胞細胞儀(FACS Flow cytometry,BD bioscience,USA)測定並分析帶螢光CD4⁺ 及CD8⁺ 細胞所佔之比例，結果CD4⁺ 並沒有增加，不過在CD8⁺ 的部份卻有增加的現象，接種後的免疫組平均值35.6%和對照組19%(圖6)，CD8⁺ 細胞被稱為殺手細胞或毒殺型T細胞，可以辨認MHC class I，並促進細胞激素之分泌，因此接種後會引起體液性及細胞性免疫反應，保護豬隻耐過強菌攻毒。

統計分析

將實驗數據以Microsoft Excel軟體進行分析，實驗數據以平均值±標準誤差(mean±standard deviation)方式表示，並以Pair-t test比較各組平均值差異，以p 小於0.05則表示組別間有顯著性差異。以S/P ratio計算表示法表示，公式為(實驗組OD值－陰性對照組OD值÷陽性對照組OD值－陰性對照組OD值)。

上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，例如：該重組毒素蛋白ApxIV應用於動物免疫及輔助疫苗等變化之等效性實施例，均應包含於本案之專利範圍中。

綜上所述，本案不但在方法型態上確屬創新，並能較習用物品增進上述多項功效，應已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請　貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。

<110>　朱純燕

<120>　豬胸膜肺炎放線桿菌重組毒素ApxIV蛋白在動物疫苗及佐劑之應用

<160>　3

<210>　1

<211>　2588

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　豬胸膜肺炎放線桿菌ApxIV 基因序列

<400>　1

<210>　2

<211>　27

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　豬胸膜肺炎放線桿菌ApxIV 基因之正向引子

<400>　2

<210>　3

<211>　29

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　豬胸膜肺炎放線桿菌ApxIV 基因之逆向引子

<400>　3

圖1、重組質體pET-32a/ApxIV 之限制酶(EcoRI 和XhoI )剪切電泳分析圖。其中ApxIV 基因大小為2588bp。

圖2、以IPTG誘導不同時間後，ApxIV重組蛋白表現量之SDS-PAGE分析圖。其中標記分別為M：標誌蛋白分子；1-4:分別為以IPTG誘導0、2、3、4小時後之蛋白質表現量；5:表現載體pET-32a；6:rOMP重組蛋白；其他3行：為標準BSA濃度，分別為125、250、500 μg/ml。

圖3、IPTG誘導4小時後，感染豬胸膜肺炎放線桿菌豬隻血清中重組蛋白ApxIV的西方墨點分析法。其中標記分別為M：標誌蛋白分子；1:以IPTG誘導4小時後之ApxIV蛋白質大小約130 kDa。

圖4、接種各組疫苗後，不同時間豬血清中抗體反應之比較圖。各組分別為(A)組：不活化菌苗添加rApxI+II+IV+rOMP、及B組：陰性對照，接種疫苗後分別於0、1、2、4週抽取豬隻血清，以ELISA分析其中抗體含量。

圖5、經豬胸膜肺炎放線桿菌血清型第一型攻毒後，各組豬隻肺部病變比較圖。各組分別為A組：不活化菌苗添加rApxI+II+IV+rOMP及B組：陰性對照。

圖6、以流式細胞儀分析CD8+免疫細胞種類。各組分別為A組：不活化菌苗添加rApxI+II+IV+rOMP及B組：陰性對照。

Claims (7)

1. 一種豬用疫苗組成物，其包含豬胸膜肺炎放線桿菌之一不活化菌疫苗以及一豬胸膜肺炎放線桿菌之重組毒素蛋白，該重組毒素蛋白係由重組毒素蛋白ApxI 、重組毒素蛋白ApxII 、重組毒素蛋白ApxIV 以及重組外膜蛋白(OMP)所組成，且該重組毒素蛋白ApxIV 如SEQ ID NO：1之核酸序列所編碼，藉此保護一動物體對抗該豬胸膜肺炎放線桿菌之至少二血清型的感染，且該至少二血清型為豬胸膜肺炎放線桿菌血清型第一型及豬胸膜肺炎放線桿菌血清型第五型。
2. 如申請專利範圍第1項所述之豬用疫苗組成物，其中該重組毒素蛋白ApxIV 係由一轉形株(寄存編號為BCRC 940599)表現而得。
3. 如申請專利範圍第1項所述之豬用疫苗組成物，其中該重組毒素蛋白ApxIV 為分子量130kDa之重組蛋白。
4. 如申請專利範圍第1項所述之豬用疫苗組成物，其中生理學上可接受之載劑係用於保護動物抵抗豬胸膜肺炎放線桿菌之感染；其中該載劑包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑、乳化劑、懸浮劑、分解劑、黏結劑、賦形劑、安定劑、螯合劑、稀釋劑、膠凝劑、防腐劑、潤滑劑、界面活性劑及佐劑；其中該佐劑包含一或多種選自於下列的試劑：油質佐劑，如：礦物油、植物油、動物油、佛氏完全佐劑、佛氏不完全佐劑等；水質佐劑，如：氫氧化鋁；雙相油質佐劑，如：脂質體(Liposome)、水包油包水劑型(w/o/w)；生物型佐劑，如：細胞激素、CpG寡核苷酸、細菌類毒素toxoid等；其中該雙相油質佐劑係包含一界面活性劑以及一油相物質。
5. 如申請專利範圍第1項所述之豬用疫苗組成物，其中該豬用次單位疫苗組成物係以肌肉注射、皮下注射、腹腔注射、噴霧吸入方式或口服方式給予。
6. 如申請專利範圍第1項所述之豬用疫苗組成物，更至少包含水包油包水劑型(w/o/w)之一雙相油質佐劑。
7. 如申請專利範圍第1項所述之豬用疫苗組成物，其中製備該豬胸膜肺炎放線桿菌不活化菌疫苗的方法包含去活化劑處理或熱處理不活化方法，且該去活化劑包含福馬林處理或2-溴乙胺。