TWI425092B - 內部包埋有膠球之細菌纖維素複合材及其製備方法 - Google Patents

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Description

內部包埋有膠球之細菌纖維素複合材及其製備方法
本發明是關於一種內部包埋有膠球之細菌纖維素複合材及其製備方法，尤其有關一種包覆有機能性成份的褐藻膠膠球被分散包埋於一醋酸菌(Gluconacetobacter xylinus )纖維素基體(matrix)內的複合材，該機能性成份可以為藥物、益生菌、或營養素，例如真菌多醣。
醋酸菌(Gluconacetobacter xylinus， 舊稱Acetobacter xylinum )發酵所形成之白色膠狀細菌纖維素(Bacterial cellulose，BC)，俗稱那塔(Nata)、椰果，具有高純度的纖維素、奈米級結構及高機械強度。在食品上的應用又可分為休閒性食品、機能性食品及食品添加物三個部分。於休閒性食品方面，椰果具有高咀嚼性，口感滑爽；外觀晶瑩剔透，色澤潔白，可被賦予各種色彩和風味，具有良好的可塑性，可搭配在果凍、罐頭、飲料等產品上。食品添加物方面，將細菌纖維素破碎均質後，發現其具有高保水性、低黏性及耐酸、耐熱等特性，可作為食品添加物之增稠劑、安定劑、填充劑及質地改良劑等。可添加於冰淇淋抗融化劑、調味醬、人造奶油增稠劑、素肉或香腸貢丸成型劑等產品。在機能性食品方面，椰果食用後不被人體消化吸收並具有飽食感，在生理上可增加腸道的蠕動預防便秘、大腸癌等疾病，因此被當作膳食纖維使用，可開發為低熱量的減肥、保健食品等。
包膠(encapsulation)係指將活性成分包覆於聚合物材料之化學或物理過程，其可對活性成分提供保護及控制釋放，並可方便地遞送該成分。包膠的各種應用、材料及技術均已廣泛揭示。微生物的聚合物基質包膠是一項十分新穎的技術。最常用於包膠生物性物質的羥基聚合物為褐藻膠、聚丙烯醯胺、鹿角菜膠、瓊脂或瓊脂糖。其中，僅有褐藻膠及鹿角菜膠可簡易地與被包膠物質一同製做成球形。這是藉由離子移變成膠(ionotropic gelling)而達成，亦即，將褐藻膠滴入鈣鹽溶液及將鹿角菜膠滴入鉀鹽溶液中。
作為包膠材料而言，褐藻酸鈣的簡易性、無毒性、生物可相容性及低成本使其成為較佳選擇(Sheu及Marshall，1993，J. Food Sci. 54：557－561)。褐藻膠係由各種藻類萃取而得之D－甘露糖醛酸及L－葡萄糖醛酸(guluronic acid)之直鏈異多醣。褐藻膠作為支撐材料的功能性質主要是與L－葡萄糖醛酸及D－甘露糖醛酸的組成及順序有關。二價陽離子如Ca2+ 傾向於與L－葡萄糖醛酸之聚合物結合(Krasaekoopt等人，2003，Int. Dairy J. 13：3－13)。褐藻酸鈣的另一項優點則為鈣離子溶出致使褐藻膠溶解，而在消化道中釋放出內包之微生物。
中國專利CN100460020 C揭示了一種相互黏結的多層醋酸菌纖維素膜的製備方法，包含將醋酸菌在液體培養基靜置培養6-10天，待表面形成一層薄膜，於薄膜上以滴管緩慢添加培養液，每隔5-6天重複滴管緩慢添加培養液，直到薄膜均勻深度為3-8 mm。此多層細菌纖維素膜可作為醫用敷材。
一般包膠的材質如褐藻酸鈉、鹿角菜膠及瓊脂等，雖然對機能性成分具有良好包覆效果，但其質地較軟，容易在後續處理受損，而使得產品品質及產量受損。另外，包膠產品容易因咀嚼或消化過程使囊壁受破壞，使得被包覆其中的機能性成分提早漏出。
據本案發明人所知至目前為此尚無一種由纖維素與膠球結合所構成的複合材被開發出，本案發明人首先製備出一種內部包埋有膠球之細菌纖維素複合材，以減少膠球囊壁受到外力破壞。
本發明的目的在提供一種內部包埋有膠球之細菌纖維素複合材，包含一細菌纖維素基體(matrix)及分散包埋於該細菌纖維素基體的複數個膠球，其中該膠球包含核心的機能性成份及包覆該機能性成份的生物可分解聚合物外殻。
本發明的另一目的在提供一種內部包埋有膠球之細菌纖維素複合材的製備方法，包含下列步驟：提供複數個膠球，其中該膠球包含核心的機能性成份及包覆該機能性成份的生物可分解聚合物外殻；提供一反應槽，及位於該反應槽內的一片狀細菌纖維素，其中該片狀細菌纖維素具有2-10 mm的厚度；將該複數個膠球分散置於該片狀細菌纖維素的頂面上，並將一已接種細菌之液態培養基添加於該頂面上，或者將一已接種細菌之液態培養基添加於該頂面上，再將該複數個膠球分散置於該片狀細菌纖維素的頂面上，其中該已接種細菌之液態培養基淹過該片狀細菌纖維素，且其液面高於該片狀細菌纖維素的頂面0.2-0.8 mm；在實質上靜止及大氣狀態下進行細菌培養一段時間，於是在該液態培養基液面與大氣的界面處形成新的細菌纖維素，並且此新形成的細菌纖維素黏結於該片狀細菌纖維素的頂面；於該新形成的細菌纖維素上添加一液態培養基，在實質上靜止及大氣狀態下進行細菌培養一段時間，於是在該液態培養基液面與大氣的界面處形成新的細菌纖維素，並且此新形成的細菌纖維素黏結於其底下的片狀細菌纖維素的頂面，重覆此步驟直到該複數個膠球被包埋於一由該片狀細菌纖維素與新形成的細菌纖維素所構成的細菌纖維素基體(matrix)內。
較佳的，該細菌纖維素為醋酸菌(Gluconacetobacter xylinus )纖維素。
較佳的，該生物可分解聚合物為褐藻膠、鹿角菜膠、瓊脂、瓊脂糖、或聚丙烯醯胺。更佳的，該生物可分解聚合物為褐藻膠。
較佳的，該機能性成份為藥物、益生菌、或營養素。
更佳的，該機能性成份為真菌多醣，例如靈芝多醣、樟芝多醣、雲芝多醣或其混合。
較佳的，該膠球具有1-10 mm的直徑。
於本發明的製備方法，較佳的，該片狀細菌纖維素具有3-5 mm的厚度，該膠球具有2-3 mm的直徑，及該已接種細菌之液態培養基的液面高於該片狀細菌纖維素的頂面0.5 mm。
於本發明的製備方法中，較佳的，該提供複數個膠球包含下列步驟：將褐藻酸鈉溶液與一真菌多醣液混合獲得一混合液，其中真菌多醣與褐藻酸鈉於該混合液中之濃度分別為0.06~0.15%及1.0~2.5%；將上述混合液以定量方式逐漸加入氯化鈣溶液中，其中氯化鈣溶液之濃度為2.0~5.0%，並持續攪拌一定時間，獲得一真菌多醣膠球。
於本發明的製備方法中，較佳的，於該新形成的細菌纖維素上添加液態培養基的量為為2.1×10-3 至5.4×10-3 mL/cm2 ‧hr。
雖然在本發明之前使用褐藻膠包覆機能性成份的技術及靜置培養醋酸菌纖維素的技術都已經為工業界所熟知，但在本發明之前並沒有人成功的製備出兩者的複合材。以下將配合實施例及對照例來說明本案發明人在嘗試製備出一種內部包埋有膠球之細菌纖維素複合材時所遭遇的難題及解決手段。
製備例1：膠球的製備
多醣液、褐藻酸鈉及CaCl2 水溶液先經過滅菌釜滅菌，再於無菌狀態下依以下步驟進行膠球的製備。
將多醣液(濃度0.9%)與褐藻酸鈉(濃度5%)水溶液混合後攪拌均勻，避免氣泡產生。以針筒或滴管將混合液逐滴加入攪拌中之100 mL濃度5% CaCl2 水溶液，加完後持續緩慢攪拌約5 min，使其硬化。製備成型後的膠球(直徑約2-3 mm)，以無菌水洗滌後備用。
製備例2：醋酸菌的培養及片狀醋酸菌纖維素的製備
將-80℃冷凍甘油管保存的醋酸菌株(Gluconacetobacter xylinus )於30℃下進行活化及液態培養，得到含活化醋酸菌之菌液。
再將已活化醋酸菌之菌液以無菌吸量管轉移5%至YE液態培養基(YE medium)，於室溫下進行靜置培養數天直到得到厚度3-5 mm的片狀醋酸菌纖維素。將培養後含有培養基的細菌纖維素利用濾網將固形物與液態培養基分離，以去離子水浸泡攪拌離心後，更換去離子水直到無培養基顏色滲出，離心脫水後以1.0% NaOH浸泡煮沸30分鐘去除醋酸菌菌體，冷卻後離心去除鹼液，再重複以去離子水洗滌細菌纖維素直到pH呈現中性，待備用(Georgeet al .,2005)。上述之片狀細菌纖維素除自行培養外，也可自市售廠商購得。
對照例1：直接在含有膠球的培養基生產醋酸菌纖維素
將濃度0.9%多醣液與濃度5%褐藻酸鈉溶液以不同比例(v/v)充分混合後製備成膠球，取5 g膠球置於含有10 mL YE液態培養基的錐形瓶中，接菌量為10%，溫度30℃下靜置培養，多醣的添加並不影響醋酸菌生成細菌纖維素，培養7天後膠球表面已被一層細菌纖維素膜覆蓋，但是YE液態培養基與空氣界面處所產生的細菌纖維素膜並未良好地接著於該膠球表面上，很容易分離。測定其樣品濕重及粗多醣含量(Duboiset al .,1956)，結果發現，以1：1~1：4比例混合多醣與5%褐藻膠製備之多醣膠球進行醋酸菌培養，乾燥樣品中分別含有0.4403、0.3514、0.2727及0.2696 g/L的粗多醣含量。相較於直接添加多醣液於YE液態培養基靜置培養之細菌纖維素，可明顯提升細菌纖維素中所含多醣含量。
對照例2：在具有醋酸菌纖維素膜的液態培養基製備含有膠球的細菌纖維素複合材
在10 mL YE液態培養基接菌培養3-5天後，表面會生成一層纖維薄膜(約1 mm)，將膠球放入並添加新的YE液態培養基進行培養；但是，由於添加膠球時的重量，會使表層纖維薄膜沉入液面下，後續添加的培養液又會在氣液界面生成新的纖維薄膜，使纖維薄膜間產生分層，無法有效增加纖維與膠球的接著性。
實施例1：在片狀醋酸菌纖維素上製備含有膠球的細菌纖維素複合材
先於錐形瓶底層放置片狀細菌纖維素(厚度5 mm，面積38.5 cm2 )，並添加已接種醋酸菌的YE液態培養基，其液面高於片狀細菌纖維素的頂面0.5 mm，再將5 g膠球均勻平鋪於上方。置於30℃下靜置培養，醋酸菌會於氣液界面形成新生長的細菌纖維素並且接著於底層的片狀細菌纖維素，再以分批定量添加培養液的方式，每間隔24小時滴入2 mL的YE液態培養基，靜置培養，向下逐漸形成新生長的細菌纖維素，約培養7日細菌纖維素可完整地包覆多醣膠球，細菌纖維素複合材總厚度增至約10-12 mm，細菌纖維素複合材中多醣含量可達6.92%。
實施例2：滅菌處理對細菌纖維素複合材成品熱穩定性之影響
以實施例1的成品進行滅菌處理，採蒸汽滅菌釜在121℃下加熱滅菌15分鐘，探討不同之細菌纖維素基材厚度及多醣膠球起始添加量，經滅菌處理後機能性成分損失效率。結果顯示，若使用片狀細菌纖維素厚度為3 mm進行製備，所得到的細菌纖維素複合材產品其滅菌後總多醣含量損失3.70%。若使用片狀細菌纖維素厚度約為8 mm進行製備，所得到的細菌纖維素複合材產品其滅菌後總多醣損失率為0.02%。在外觀上，細菌纖維素複合材產品滅菌後僅在表面有培養基釋出，細菌纖維素複合材產品顏色變淡，多醣膠球在經過高溫高壓滅菌後整體型態無太大的變化。另外，以厚度3 mm的片狀醋酸菌纖維素，及10 g之多醣膠球，依實施例1步驟製備細菌纖維素複合材，其複合材成品於相同的滅菌條件(121℃，15分鐘)下，總多醣的損失率為1.23%。
本實施例顯示本發明的包埋方式可有效提升多醣膠球與細菌纖維素間的結合，外層細菌纖維素的奈米纖維結構可作為多醣膠球的保護材料，降低後續處理對多醣膠球可能造成的破壞，使細菌纖維素複合材產品可有效保留機能性成分含量。
本案發明人於其它實驗中亦證明前述實施例1方法製備的多醣膠球細菌纖維素複合材產品對α-葡苷酶(glucosidase)的活性具有影響，其抑制α-葡苷酶活性與它們的總多醣類含量呈正相關性，例如細菌纖維素複合材產品的總多醣濃度為2.70%時，其抑制活性效果達17.8%；總多醣濃度為4.40%時，其抑制活性效果可達41.4%，若總多醣濃度提升至6.49%，其抑制活性效果可達61.9%。類似的效果也可藉由使用總多醣濃度固定的單一細菌纖維素複合材產品，但變化其用量來調整其抑制α-葡苷酶活性的能力。
雖然本發明已利用上述實施例說明，但是本發明並不被所揭露的實施例所限制，熟悉本項技藝之人士仍可作出不脫離本發明範圍之修飾及變化。

Claims (19)

  1. 一種內部包埋有膠球之細菌纖維素複合材，包含一細菌纖維素基體(matrix)及分散包埋於該細菌纖維素基體的複數個膠球，其中該膠球包含核心的機能性成份及包覆該機能性成份的生物可分解聚合物外殻。
  2. 如申請專利範圍第1項的複合材，其中該細菌纖維素為醋酸菌(Gluconacetobacter xylinus )纖維素。
  3. 如申請專利範圍第1項的複合材，其中該生物可分解聚合物為褐藻膠、鹿角菜膠、瓊脂、瓊脂糖、或聚丙烯醯胺。
  4. 如申請專利範圍第3項的複合材，其中該生物可分解聚合物為褐藻膠。
  5. 如申請專利範圍第1項的複合材，其中該機能性成份為藥物、益生菌、或營養素。
  6. 如申請專利範圍第5項的複合材，其中該機能性成份為真菌多醣。
  7. 如申請專利範圍第6項的複合材，其中該真菌多醣為靈芝多醣、樟芝多醣、雲芝多醣或其混合。
  8. 如申請專利範圍第1項的複合材，其中該膠球具有1-10 mm的直徑。
  9. 一種內部包埋有膠球之細菌纖維素複合材的製備方法，包含下列步驟：提供複數個膠球，其中該膠球包含核心的機能性成份及包覆該機能性成份的生物可分解聚合物外殻；提供一反應槽，及位於該反應槽內的一片狀細菌纖維素，其中該片狀細菌纖維素具有2-10 mm的厚度；將該複數個膠球分散置於該片狀細菌纖維素的頂面上，並將一已接種細菌之液態培養基添加於該頂面上，或者將一已接種細菌之液態培養基添加於該頂面上，再將該複數個膠球分散置於該片狀細菌纖維素的頂面上，其中該已接種細菌之液態培養基淹過該片狀細菌纖維素，且其液面高於該片狀細菌纖維素的頂面0.2-0.8 mm；在實質上靜止及大氣狀態下進行細菌培養一段時間，於是在該液態培養基液面與大氣的界面處形成新的細菌纖維素，並且此新形成的細菌纖維素黏結於該片狀細菌纖維素的頂面；於該新形成的細菌纖維素上添加一液態培養基，在實質上靜止及大氣狀態下進行細菌培養一段時間，於是在該液態培養基液面與大氣的界面處形成新的細菌纖維素，並且此新形成的細菌纖維素黏結於其底下的片狀細菌纖維素的頂面，重覆此步驟直到該複數個膠球被包埋於一由該片狀細菌纖維素與新形成的細菌纖維素所構成的細菌纖維素基體(matrix)內。
  10. 如申請專利範圍第9項的製備方法，其中該細菌纖維素為醋酸菌(Gluconacetobacter xylinus )纖維素。
  11. 如申請專利範圍第9項的製備方法，其中該生物可分解聚合物為褐藻膠、鹿角菜膠、瓊脂、瓊脂糖、或聚丙烯醯胺。
  12. 如申請專利範圍第11項的製備方法，其中該生物可分解聚合物為褐藻膠。
  13. 如申請專利範圍第9項的製備方法，其中該機能性成份為藥物、益生菌、或營養素。
  14. 如申請專利範圍第13項的製備方法，其中該機能性成份為真菌多醣。
  15. 如申請專利範圍第14項的製備方法，其中該真菌多醣為.靈芝多醣、樟芝多醣、雲芝多醣或其混合。
  16. 如申請專利範圍第9項的製備方法，其中該膠球具有1-10 mm的直徑。
  17. 如申請專利範圍第9項的製備方法，其中該片狀細菌纖維素具有3-5 mm的厚度，該膠球具有2-3 mm的直徑，及該液態培養基的液面高於該片狀細菌纖維素的頂面0.5 mm。
  18. 如申請專利範圍第9項的製備方法，其中該提供複數個膠球包含下列步驟：將褐藻酸鈉溶液與一真菌多醣液混合獲得一混合液，其中真菌多醣與褐藻酸鈉於該混合液中之濃度分別為0.06~0.15%及1.0~2.5%；將上述混合液以定量方式逐漸加入氯化鈣溶液中，其中氯化鈣溶液之濃度為2.0~5.0%，並持續攪拌一定時間，獲得一真菌多醣膠球。
  19. 如申請專利範圍第9項的製備方法，其中於該新形成的細菌纖維素上添加液態培養基的量為為2.1×10-3 至5.4×10-3 mL/cm2 ‧hr。
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