TWI422380B

TWI422380B - 以家禽提煉抗氧化、細胞增生及抑制黑色素製劑的方法

Info

Publication number: TWI422380B
Application number: TW100101545A
Authority: TW
Inventors: Liang Chuan Lin; I Chun Lai; Yu Tse Liu
Original assignee: Nat Univ Chung Hsing
Priority date: 2011-01-14
Filing date: 2011-01-14
Publication date: 2014-01-11
Also published as: TW201228669A

Description

以家禽提煉抗氧化、細胞增生及抑制黑色素製劑的方法

本發明係有關於一種將家禽屠宰後所放出之血液提煉成抗氧化、細胞增生及抑制黑色素製劑的方法。

近年來，國人因生活壓力、飲食不均、外在環境、作息不正常及伴隨年齡增長之因，導致身體代謝變慢、皮膚老化與慢性疾病等問題逐漸產生。老化乃為人生命成長過程中必然定律，並以皮膚較明顯改變，隨年齡增加之老化是由於自由基之副作用引起，其會使纖維母細胞損傷、膠原蛋白變性與含量減少及彈性纖維組織之退化而導致皮膚老化與皺紋產生，亦會造成細胞及蛋白質的損傷及對核酸與染色體之氧化傷害。而含抗氧化物質之產品，可對抗自由基與活性氧，減緩皮膚老化現象，尤以天然抗氧化物質為最佳來源，以達抗老化之目標。

目前國內雞隻經屠宰後所放出之血液大部分被廢棄並排至廢水處理池作處理，導致增加屠宰廠處理成本，而若無妥善處理，會造成環境污染。根據行政院農委會統計目前台灣烏骨雞與白肉雞每年飼養量分別約450萬隻與一億多隻，屠宰後所排放之血液相當可觀，故如可增加其利用性，即能減少廢棄雞血對環境影響與處理費用之負擔，並可提高雞血之附加價值。

有許多文獻及本研究室過去之研究中皆指出動物血液富含蛋白質，並發現血液經酵素水解後有一定之抗氧化效果。現今化妝品之成分已朝向功能多元化發展，標榜具各種功能之產品遂應運而生，如保濕、美白、抗老化、皮膚修復等功效，天然原料之選擇為未來化妝品之趨勢，亦較大眾所接受。

本發明人有鑑於此，是以乃思及發明創作的意念，遂本著鍥而不捨的精神，積極不斷地加以研究改良，並經多方探討與試作樣品試驗，及多次修正改良，乃推出本發明。

本發明提供一種以家禽提煉抗氧化、細胞增生及抑制黑色素製劑的方法，其係取家禽血液經離心機進行分離，將血液分為血漿(上層)與血球(下層)，該血球部分加入去離子水並充分混勻，經沸水浴加熱，及流水冷卻後，與血漿分別以Alcalase酵素進行水解，接著將水解液以沸水浴加熱終止酵素反應，及流水冷卻後，調整至pH7.0，再經離心機進行分離，及過濾後乾燥成粉末或直接為液體狀，即為成品。

本發明之主要目的，在於其利用家禽血液分離為血漿與血球，加以水解，而可製造成天然抗老化、美白化妝品之添加物與機能性產品，藉此提高雞血之價值，使畜牧產業收益增加，並達到兼具環保與廢棄物再利用之效益。

餘下，茲配合圖式將本發明較佳實施例詳細說明如后：

如第一圖本發明之方塊流程圖所示，本發明以家禽提煉抗氧化、細胞增生及抑制黑色素製劑的方法，包含以下步驟：

一、血液前處理：取白肉雞與烏骨雞屠宰後所放出之血液，經離心機進行分離，將血液分離為血漿(上層)與血球(下層)，儲存在4℃環境下；

二、酵素進行水解：將血漿與血球分別進行酵素水解，血球部分加入三倍重量之去離子水並充分混勻，以100℃沸水浴加熱5分鐘，流水冷卻後將血漿與血球以Alcalase酵素進行水解，酵素基質比為1: 50，pH值8.0，水解溫度為50℃，時間以四小時為較佳，酵素水解後其pH值介於6.67-6.76之間；

三、水浴加熱停止酵素反應：將水解液以100℃沸水浴加熱10分鐘終止酵素反應；

四、流水冷卻：再以25℃流水冷卻5分鐘，使其溫度降至大約35℃；

五、調整pH值：以0.1 N HCl或0.1 N NaOH調整至pH值7.0；

六、離心機分離：以離心機10000×g進行離心10分鐘；

七、過濾：以濾紙進行過濾動作，分離濾液與雜質；

八、乾燥或液體狀：過濾後之濾液以乾燥機乾燥收集乾燥粉末，或不需乾燥直接以液體狀經高溫滅菌，即得到抗氧化、細胞增生及抑制黑色素製劑成品。

上述水浴加熱亦可以烘箱加熱或其他加熱方式取代，以及上述過濾除利用濾紙外亦可採用其他過濾方式。

如第二圖本發明血漿與血球水解物對促進人類皮膚纖維母細胞增生作用圖表所示，將白肉雞血漿水解物(BP組)、白肉雞血球水解物(BC組)與烏骨雞水解物(SFP組)、烏骨雞水解物(SFC組)分別添加於培養基中(濃度為5mg/mL)，將細胞置於含5%CO2之37℃恆溫培養箱內培養3天，經MTT法處理後，以分光光度分析儀(於750nm下)偵測含水解物之培養基對促進人類皮膚纖維母細胞增生之作用。結果發現，於試驗第一天BP及SFP組之纖維母細胞增生較BC與SFC組多，但與BC、SFC組與未添加水解物之Control組無顯著差異(p>0.05)；試驗第三天以BC與SFC組之細胞增生較高，且與Control組有顯著差異(p<0.05)；於試驗第五天則以BC與SFC組有較高之細胞增生，且SFC組較BC組高，白肉雞與烏骨雞之各處理組間並無顯著差異(p>0.05)，但各處理組均顯著高於未添加水解物之Control組(p<0.05)。

如第三圖本發明血漿與血球水解物對過氧化氫誘導下人類纖維母細胞存活率之影響圖表所示，將含微量濃度之過氧化氫(10^-4 M)之培養液培養細胞，以誘導細胞損傷，且添加含白肉雞血漿水解物(BP組)、白肉雞血球水解物(BC組)與烏骨雞水解物(SFP組)、烏骨雞水解物(SFC組)之培養液觀察其對纖維母細胞存活率之影響，並以250units/mL Catalase(CAT)作為對照組，其可使H₂ O₂ 迅速分解為水與氧。結果發現，細胞於過氧化氫誘導3小時後存活率降至55%，但添加水解物之處理組卻有效提高纖維母細胞之存活率，且血漿組(BP與SFP)較血球組(BC與SFC)有較高細胞存活率，但並無顯著差異(p>0.05)，白肉雞組與烏骨雞組之間亦無顯著差異(p>0.05)；血漿組與血球組之細胞存活率分別為72.2-73.6%及70.7-70.8%，且發現各處理組均顯著高於未添加水解物之Control組(p<0.05)，表示各組水解物皆具清除H202之能力，其有效清除自由基之特性，可保護並減少細胞免於過氧化氫誘導下產生之氧化傷害。

如第四圖本發明血漿與血球水解物對纖維母細胞分泌膠原蛋白量之影響圖表所示，將白肉雞血漿水解物(BP組)、白肉雞血球水解物(BC組)與烏骨雞水解物(SFP組)、烏骨雞水解物(SFC組)加入纖維母細胞之培養基中，觀察其對細胞膠原蛋白分泌之情形。結果發現，各處理組皆顯著高於未添加水解物之Control組(p<0.05)，而白肉雞組(BP與BC)比烏骨雞組(SFP與SFC)有顯著較高之膠原蛋白含量(p<0.05)，且BC之膠原蛋白分泌量較BP高，BC與BP分別達到132.25%與127.25%，血球組則皆較血漿組有較高之膠原蛋白含量，但無顯著差異(p>0.05)。各組水解物均能有效提升纖維母細胞分泌膠原蛋白，達到增加細胞活性以促進膠原蛋白分泌之效果。

如第五圖本發明血漿與血球水解物對纖維母細胞遷移行為的影響圖所示，以Wound-healing assay評估細胞遷移之能力。當人類皮膚纖維母細胞(WS1)長滿時，利用pipette tip刮出一條直線，再將水解物添加於培養基中，以Wound-healing assay評估細胞於24小時後，含水解物之培養基對皮膚纖維母細胞遷移行為之影響。結果發現，於傷口形成後24小時後，無論有無添加水解物之組別皆可發現具細胞遷移之情形，且部分細胞已遷移至傷口之中央，而其纖維母細胞之型態則呈現散亂不規則的排列方式；另外，可看到白肉雞組與烏骨雞組之遷移量無明顯之差別，血漿組(BP與SFP)有較多的細胞遷移量，細胞經培養一天後血漿組比血漿組有較高之細胞增生，但無顯著差異(p>0.05)；血漿組於傷口中央之細胞數較多，且細胞排列稍較緊密，向傷口遷移的能力較強，並可促進細胞向傷口中央面積處遷移，使傷口之大小距離縮小程度較控制組多，對於皮膚傷口修復之作用有一定幫助。

如第六圖本發明血漿與血球水解物之酪胺酸酶抑制能力圖表所示，酪氨酸酵素是皮膚黑色素細胞在製造黑色素的過程中最具有關鍵性的酵素，而其主要參與了黑色素形成之幾個步驟，這包括酪胺酸酶刺激Dopa轉變成Dopaquinone並經由一連串的反應，最後轉變成黑色素。影響酪氨酸酵素活性之因子有許多，包含內分泌、化學與物理之影響等，而目前有關抑制酪胺酸酶之活性主要有酪胺酸酶失活與競爭性取代酪胺酸酶受質兩種方式，進而減少黑色素形成。試驗白肉雞血漿水解物(BP組)、白肉雞血球水解物(BC組)與烏骨雞水解物(SFP組)、烏骨雞水解物(SFC組)之酪胺酸酶抑制能力。發現水解物皆具有抑制酪胺酸酶之能力，而以血球組(BC與SFC)顯著較血漿組(BP與SFP)有較高之抑制能力(p<0.05)，血球組之BC與SFC分別為37.58%與38.36%；白肉雞組之抑制酪胺酸酶之能力較烏骨雞組佳，但並無顯著差異(p>0.05)。

如第七圖本發明血漿與血球水解物對人類黑色素細胞存活率之影響圖表所示，將白肉雞血漿水解物(BP組)、白肉雞血球水解物(BC組)與烏骨雞水解物(SFP組)、烏骨雞水解物(SFC組)分別添加於培養基中(濃度為5mg/mL)，將細胞置於恆溫培養箱內培養3天，經MTT法處理後，以分光光度分析儀於570nm下偵測含水解物之培養基對人類皮膚黑色素瘤細胞之存活率影響以評估細胞毒性。結果顯示，試驗第一天BC及SFC處理組之黑色素瘤細胞存活率較BP、SFP低，但各組間無顯著差異(p>0.05)；試驗第三天以各組細胞存活率皆降低，其中以SFC組為最低；而試驗第五天時BC與SFC有較低之細胞存活率，並以BC較具細胞毒性，白肉雞組與烏骨雞組之間並無顯著差異(p>0.05)，但各處理組均顯著低於未添加水解物之Control組(p<0.05)，整體而言，無論是白肉雞或烏骨雞之血漿或血球水解物皆未能促使黑色素瘤細胞之細胞增殖，且皆具降低細胞存活率之作用。

如第八圖本發明血漿與血球水解物對人類黑色素細胞黑色素生成量之影響圖表所示，將白肉雞血漿水解物(BP組)、白肉雞血球水解物(BC組)與烏骨雞水解物(SFP組)、烏骨雞水解物(SFC組)分別添加於培養基中(濃度為5mg/mL)，將細胞置於恆溫培養箱內培養3天後於400nm下測量含水解物之培養基對人類皮膚黑色素瘤細胞之黑色素生成量(Melanin production)變化。此試驗使用之正向對照組為N-Phenylthiourea(PTU)，其為銅螯合劑，可有效抑制酪胺酸酶之活性，抑制黑色素的形成。實驗結果顯示，含水解物之培養基(BP、BC、SFP、SFC)對人類皮膚黑色素瘤細胞之黑色素生成量有抑制效果，使黑色素瘤細胞之黑色素生成量降低，且BC與SFC之抑制率較BP與SFP佳，PTU有良好之抑制黑色素生成，並與處理組有顯著差異(p<0.05)，但白肉雞組與烏骨雞組之間及處理組與Control組之間皆無顯著差異(p>0.05)。

由上述可知，血漿經水解之水解物有較佳之抗氧化活性，並以白肉雞組比烏骨雞組具較高之Trolox當量抗氧化力，而血漿水解物可促進細胞增生及遷移，血球組有較佳刺激膠原蛋白分泌、酪胺酸酶抑制力與降低黑色素細胞存活率，白肉雞組較烏骨雞組有較高之抗氧化力及膠原蛋白分泌，其可對皮膚之抗老化、傷口修復與美白等具良好之效果，而可為天然抗老化與美白化妝品添加物之使用。

第一圖：係本發明之方塊流程圖。

第二圖：係本發明血漿與血球水解物對促進人類皮膚纖維母細胞增生作用圖表。

第三圖：係本發明血漿與血球水解物對過氧化氫誘導下人類纖維母細胞存活率之影響圖表。

第四圖：係本發明血漿與血球水解物對纖維母細胞分泌膠原蛋白量之影響圖表。

第五圖：係本發明血漿與血球水解物對纖維母細胞遷移行為的影響圖。

第六圖：係本發明血漿與血球水解物之酪胺酸酶抑制能力圖表。

第七圖：係本發明血漿與血球水解物對人類黑色素細胞存活率之影響圖表。

第八圖：係本發明血漿與血球水解物對人類黑色素細胞黑色素生成量之影響圖表。

Claims

一種以家禽提煉抗氧化、細胞增生及抑制黑色素製劑的方法，其包含下列程序：(a)血液前處理，取家禽血液經離心機進行分離，將血液分為血漿與血球；(b)酵素進行水解，將血漿與血球分別以Alcalase酵素進行水解，其中血球進行酵素水解前，加入三倍重量之去離子水並充分混勻，以100℃沸水浴加熱5分鐘，再經流水冷卻，酵素進行水解之酵素基質比為1：50，pH值8.0，水解溫度為50℃，酵素水解後其pH值介於6.67-6.76之間；(c)水浴加熱停止酵素反應；(d)流水冷卻；(e)調整pH值，以0.1N HCl或0.1N NaOH調整pH值至7.0；(f)離心機分離，以離心機10000×g進行離心10分鐘；(g)過濾，分離濾液與雜質；(h)乾燥或液體狀，過濾後之濾液進行乾燥，收集乾燥粉末，或不需乾燥直接以液體狀經高溫滅菌，即得到抗氧化、細胞增生及抑制黑色素製劑成品。
如申請專利範圍第1項所述之以家禽提煉抗氧化、細胞增生及抑制黑色素製劑的方法，其中血液前處理之血漿與血球，儲存在4℃環境下。
如申請專利範圍第1項所述之以家禽提煉抗氧化、細胞增生及抑制黑色素製劑的方法，其中酵素進行水解之時間為四小時。
如申請專利範圍第1項所述之以家禽提煉抗氧化、細胞增生及抑制黑色素製劑的方法，其中水浴加熱停止酵素反應係以100℃沸水浴加熱10分鐘。
如申請專利範圍第1項所述之以家禽提煉抗氧化、細胞增生及抑制黑色素製劑的方法，其中流水冷卻係以25℃流水冷卻5分鐘，使其溫度降至大約35℃。
如申請專利範圍第1項所述之以家禽提煉抗氧化、細胞增生及抑制黑色素製劑的方法，其中乾燥係以熱風或冷凍乾燥機乾燥。