TWI410419B - 嘧啶基吲哚化合物 - Google Patents

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Description

嘧啶基吲哚化合物
本發明係有關嘧啶基吲哚化合物、調配物及其治療用途，尤其用於治療癌症及發炎疾病之用途。
IKKβ為調節發炎及壓力相關路徑之關鍵激酶，因此與在癌症至發炎疾病範圍內之各種人類疾病之發展相關聯。
適用作激酶抑制劑之嘧啶基吲哚化合物已為此項技術中所知。參見WO 04089913(IKKβ抑制劑)、WO 06038001及WO 06075152。另外，適用作IKKβ抑制劑之嘧啶基苯并噻吩化合物亦為此項技術中所知。參見WO 07092095。
需要適用於治療癌症或發炎疾病之有效IKKβ抑制劑。亦需要與TNFa或長春新鹼(vincristine，VCR)組合時具有協同作用之此等化合物。
本發明提供新穎嘧啶基吲哚化合物，其具有藉由抑制IKKβ來治療癌症及發炎疾病之臨床用途。更特定而言，本發明提供下式之新穎嘧啶基吲哚化合物：
或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明亦提供一種治療哺乳動物的選自由多發性骨髓瘤、結腸癌、大細胞肺癌、神經膠母細胞瘤、胰臟癌及卵巢癌組成之群之癌症的方法，其包含向需要此治療之哺乳動物投與有效量之本發明之化合物或鹽。
本發明亦提供一種治療哺乳動物的選自由類風濕性關節炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、多發性硬化症及發炎性腸道疾病組成之群之發炎疾病的方法，其包含向需要此治療之哺乳動物投與有效量之本發明之化合物或鹽。
本發明亦提供包含本發明之化合物或鹽與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑組合之醫藥組合物。在一特定實施例中，組合物進一步包含一或多種其他治療劑。在另一實施例中，其他治療劑為TNFα。在另一實施例中，其他治療劑為長春新鹼。
本發明亦提供用於療法中之本發明之化合物或鹽。本發明亦提供用於治療癌症之本發明之化合物或鹽。另外，本發明提供本發明之化合物或鹽之用途，其係用於製造供治療癌症之藥劑。詳言之，此等癌症係選自由多發性骨髓瘤、結腸癌、大細胞肺癌、神經膠母細胞瘤、胰臟癌及卵巢癌組成之群。一實施例為多發性骨髓瘤。另一實施例為結腸癌。另一實施例為大細胞肺癌。另一實施例為神經膠母細胞瘤。另一實施例為胰臟癌。另一實施例為卵巢癌。本發明亦提供用於治療發炎疾病之本發明之化合物或鹽。另外，本發明提供本發明之化合物或鹽之用途，其係用於製造供治療發炎疾病之藥劑。詳言之，發炎疾病係選自由類風濕性關節炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、多發性硬化症及發炎性腸道疾病組成之群。一實施例為類風濕性關節炎。另一實施例為慢性阻塞性肺病。另一實施例為哮喘。另一實施例為多發性硬化症。另一實施例為發炎性腸道疾病。此外，本發明提供一種用於治療選自由多發性骨髓瘤、結腸癌、大細胞肺癌、神經膠母細胞瘤、胰臟癌及卵巢癌組成之群之癌症的醫藥組合物，其包含本發明之化合物或鹽作為活性成份。另外，本發明提供一種用於治療選自由類風濕性關節炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、多發性硬化症及發炎性腸道疾病組成之群之發炎疾病的醫藥組合物，其包含本發明之化合物或鹽作為活性成份。
本發明之化合物及鹽基本上如流程及實例中所說明來製備。另外，歸因於環戊基環之取代，本發明之所有化合物及鹽均以非對映異構體或對映異構體之形式存在。因此，藉由使用特定非對映異構體作為反應物來引入光學純度。亦可藉由對相應於本發明之化合物或鹽之非對映異構體混合物或外消旋體混合物使用層析/對掌性層析來引入光學純度。
藉由在甲醇或乙醇中以HCl、三氟乙酸(TFA)或對甲苯磺酸(TsOH)處理，脫除經保護之前驅體(A)之保護基來製備本發明之化合物。
前驅體A藉由以上所說明之兩種方式製備。在上部反應中，在脫水劑(諸如六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基參(二甲基胺基)鏻(BOP)或二環己基碳化二亞胺)存在下吲哚-4-甲酸(B)與環丙胺偶合。熟習有機合成技術者應認識到，此等醯胺偶合反應亦可發生在產生式(I)化合物之合成順序中的任何適宜點。
在下部反應中，在高溫(70℃-130℃)下在鹼(諸如氫化鈉、二異丙基乙胺(DIPEA)或碳酸鉀)存在下，於諸如二甲亞碸(DMSO)或二甲基甲醯胺(DMF)之溶劑中，2-胺基環戊醇(D)置換氯嘧啶中間物(C)中之氯基。熟習有機合成技術者應認識到，此等氯置換反應亦可發生在產生本發明化合物之合成順序中的任何適宜點。
藉由類似於流程II之下部反應，以2-胺基環戊醇(D)置換嘧啶基酯(E)中之氯基，接著皂化中間物羧酸酯基來製備吲哚-4-甲酸(B)。
藉由吲哚-2-酸(F或其C1 -C3 烷基酸酯)與市售之三氯嘧啶(G)之鈀催化偶合反應來製備嘧啶基氯化物(C)及(E)。
催化劑為Pd(OAc)2 、Pd(PPh3 )4 或PdCl2 (dppf)，且偶合反應在高溫(50℃-110℃)下在例如四氫呋喃(THF)之極性非質子性溶劑中發生。
市售或藉由文獻方法製備之吲哚前驅體(H)首先在鹼存在下以氯甲基乙基醚、C1 -C3 三烷基矽烷基氯化物或二碳酸二第三丁酯進行N1-保護，接著在吲哚2-位進行鋰化，且以C1 -C3 三烷基酸酯處理以產生酸或酸酯(F)。
本發明包括各種立體異構體及其混合物。立體異構體包括對映異構體及非對映異構體以及對映異構體或非對映異構體之混合物。本發明化合物之個別立體異構體可自含有不對稱或對掌性中心之市售起始物質以合成方式製備，或藉由製備外消旋混合物，接著藉由一般技術者所熟知之方法解析來製備。此等解析方法例示如下：(1)將對映異構體之混合物附著至對掌性助劑，藉由再結晶或層析分離所得之非對映異構體混合物，且視情況自助劑釋放光學純產物，如Furniss,Hannaford,Smith,及Tatchell,「Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry」,第5版(1989),Longman Scientific & Technical,Essex CM20 2JE,England中所述；或(2)在對掌性層析管柱上直接分離光學對映異構體之混合物；或(3)分步再結晶方法。
使用ChemDraw Ultra 10.0命名以下化合物：
製備1 N -環丙基-2-(2,5-二氯嘧啶-4-基)-1-(乙氧基甲基)-1H -吲哚-4-甲醯胺 (A)　製備1-(乙氧基甲基)-1H -吲哚-4-甲酸甲酯
在氮氣下於0℃下將六甲基二矽烷胺基鉀(1 M於THF中，550 mL，0.55 mol)逐滴添加至1H -吲哚-4-甲酸甲酯(80 g，0.46 mol)於THF(700 mL)中之溶液中。在0℃下攪拌混合物30分鐘(min)，接著在0℃-5℃下添加氯甲基乙基醚(51 mL，0.55 mol)。添加後，在環境溫度下再攪拌反應混合物3小時(h)，以300 mL水小心淬滅，且以乙酸乙酯(EA，3×300 mL)萃取。以飽和氯化鈉水溶液(2×400 mL)洗滌經合併之萃取物，接著經Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠層析純化殘餘物，得到標題化合物(80 g，75%)。MS(m/z): 234(M+H)+ 。
(B)　製備1-(乙氧基甲基)-1H -吲哚-4-甲酸
將氫氧化鈉水溶液(68 g，1.74 mol於340 mL H2 O中)添加至1-(乙氧基甲基)-1H -吲哚-4-甲酸甲酯(135 g，0.58 mol)於甲醇(2 L)中之溶液中。在50℃下攪拌反應混合物3小時。在真空中移除揮發物。以HCl(2 M)酸化殘餘物，直至pH=3-4，接著以EA(2×700 mL)萃取。以飽和氯化鈉水溶液(2×250 mL)洗滌經合併之萃取物，經無水Na2 SO4 乾燥，且濃縮，產生標題化合物(123 g，96%)。MS(m/z): 220(M+H)+ 。
(C)　製備N -環丙基-1-(乙氧基甲基)-1H -吲哚-4-甲醯胺
在0℃下向1-(乙氧基甲基)-1H -吲哚-4-甲酸(123 g，0.56 mol)於THF(1.5 L)中之溶液中添加環丙胺(58 mL，0.84 mol)及三乙胺(TEA，167 mL，1.12 mol)，接著添加六氟磷酸O -(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N',N' -四甲(240 g，0.62 mol)。在環境溫度下攪拌反應混合物隔夜。在真空中移除揮發物。在EA(1.5 L)及HCl(0.5%，1 L)中攪拌殘餘物10分鐘。分離有機層，以飽和氯化鈉水溶液(3×100 mL)洗滌，經無水Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠層析純化殘餘物，得到標題化合物(110 g，77%)。MS(m/z): 259(M+H)+ 。
(D)　製備N -環丙基-2-(2,5-二氯嘧啶-4-基)-1-(乙氧基甲基)-1H -吲哚-4-甲醯胺
在-50℃下將n -BuLi(2.5 M於己烷中，420 mL，1.04 mol)添加至二異丙胺(DIPA，147 mL，1.04 mol)於無水THF(600 mL)中之溶液中。添加後，在-20℃下攪拌混合物30分鐘，接著冷卻至-70℃。添加N -環丙基-1-(乙氧基甲基)-1H -吲哚-4-甲醯胺(60 g，0.23 mol)及硼酸三(異丙基)酯(56.4 mL，0.25 mol)於無水THF(300 mL)中之溶液。在-70℃下攪拌反應混合物30分鐘。反應物緩慢升溫至環境溫度，攪拌1小時，接著以K3 PO4 ‧3H2 O水溶液(195 g，0.74 mol，於700 mL水中)淬滅。將粗反應混合物脫氣，且以N2 淨化三次。添加2,4,5-三氯嘧啶(51 g，0.27 mol)及二苯基膦基二茂鐵二氯化鈀(PdCl2 (dppf)‧CH2 Cl2 ，19.2 g，0.023 mol)，且在氮氣下於回流溫度下攪拌1.5小時。在真空中移除揮發物。以二氟甲烷(DCM，3×500 mL)萃取殘餘物。以飽和氯化鈉水溶液(3×100 mL)洗滌經合併之萃取物，經無水Na2 SO4 乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠層析純化殘餘物，得到標題化合物(30 g，32%)。MS(m/z): 405[(M+1)+ ,35 Cl,35 Cl],407[(M+1)+ ,35 Cl,37 Cl]及409[(M+1)+ ,37 Cl,37 Cl]。
實例1 2-{5-氯-2-[(1R ,2S )-2-羥基環戊基胺基]嘧啶-4-基}-N-環丙基-1H -吲哚-4-甲醯胺鹽酸鹽
在100℃下攪拌N -環丙基-2-(2,5-二氯嘧啶-4-基)-1-(乙氧基甲基)-1H -吲哚-4-甲醯胺(10 g，25 mmol)、(1S ,2R )-2-胺基環戊醇鹽酸鹽(4.1 g，30 mmol)及DIPEA(5 mL，30 mmol)於DMSO(70 mL)中之混合物3小時，接著倒入水中，且以EA萃取。以飽和氯化鈉水溶液洗滌經合併之萃取物，經Na2 SO4 乾燥，且在真空中濃縮。藉由矽膠層析純化殘餘物，得到2-{5-氯-2-[(1R ,2S )-2-羥基環戊基胺基]嘧啶-4-基}-N -環丙基-1-(乙氧基甲基)-1H -吲哚-4-甲醯胺(7 g，60.3%)。MS(m/z): 470(35 Cl)及472(37 Cl)(M+H)+ 。
在45℃下將以上產物(7 g，14.9 mmol)與氯化氫(6 M於甲醇中，210 mL，1.26 mol)一起攪拌12小時。藉由過濾收集沈澱物，以甲醇洗滌，且在真空中乾燥，得到標題化合物(4.7 g，70%)。MS(m/z): 412(35 Cl)及414(37 Cl)(M+H)+ 。
實例2 2-{5-氯-2-[(1R ,2R )-2-羥基環戊基胺基]嘧啶-4-基}-N -環丙基-1H -吲哚-4-甲醯胺鹽酸鹽
在80℃下攪拌N -環丙基-2-(2,5-二氯嘧啶-4-基)-1-(乙氧基甲基)-1H -吲哚-4-甲醯胺(30 g，75 mmol)、(1R ,2R )-2-胺基環戊醇鹽酸鹽(12.3 g，90 mmol)及DIPEA(37.5 mL，225 mmol)於DMSO(150 mL)中之混合物16小時，接著倒入水(1 L)中，且以EA(2×500 mL)萃取。以飽和氯化鈉水溶液(500 mL)洗滌經合併之萃取物，經Na2 SO4 乾燥，且在真空中濃縮。藉由矽膠層析純化殘餘物，得到2-{5-氯-2-[(1R ,2R )-2-羥基環戊基胺基]嘧啶-4-基}-N -環丙基-1-(乙氧基甲基)-1H -吲哚-4-甲醯胺(33 g，93%)。MS(m/z): 470(35 Cl)及472(37 Cl)(M+H)+ 。
在45℃下將以上產物(33 g，70 mmol)與氯化氫(6 M於甲醇中，1 L，6 mol)一起攪拌16小時。藉由過濾收集沈澱物，以甲醇(2×300 mL)洗滌，且在真空中乾燥，得到標題化合物(26.8 g，85%)。MS(m/z): 412(35 Cl)及414(37 Cl)(M+H)+ 。
關節內投與顯性負性IKKβ可顯著降低大鼠之佐劑誘發之關節炎的嚴重性(Tak PP等人,Arthritis Rheum. (2001) 44(8)1897-1907)。IKKβ剔除之細胞在表現TNFα誘發之細胞激素、趨化激素或黏著分子方面具有顯著缺陷。經由IKKβ之條件性或組織特異性剔除，發現此激酶為外周B-細胞存活及增殖以及防止由TNFα介導之細胞凋亡所需要(Li Z-W,Omori AS,Labuda T,Karin M,Rickert RC,「IKKβ is required for peripheral B cell survival and proliferation」,The J. Immunol., (2003),170:4630-4637；Maeda S,Chang L等人,「IKKβ is required for prevention of apoptosis mediated by cell-bound but not by circulating TNFα 」,Immunity, (2003),19:725-737)。此外，骨髓細胞中IKKβ缺失亦可減少與結腸炎相關之癌症之生長(Greten FR等人,Cell ,(2004),118:285-296)。此外，若干團體已證明，IKKβ激酶抑制劑可在不同癌細胞株中誘發細胞生長抑制及/或增加TNFα或TRAIL誘發之細胞死亡(Takaomi等人,Clinical Cancer Res .,(2005),第11卷：1974-82；Hideshima等人,JBC ，(2002) 277:16639-47；Lam等人,Clinical Cancer Res .,(2005),第11卷：28-40)。
另外，WO 07092095揭示適用於治療多發性骨髓瘤、結腸癌、大細胞肺癌、神經膠母細胞瘤及卵巢癌之IKKβ抑制劑。
評估生物特性
本發明化合物之生物特性可藉由以下檢定來確定。藉由量測各別激酶對IκBα受質之磷酸化的酶法IKKβ-激酶檢定及量測化合物在各種腫瘤細胞株(包括BxPC-3及Skov3-luc)中抑制細胞生長之能力的細胞生存力檢定來評估本發明化合物對IKKβ之抑制活性。本發明化合物之抗腫瘤作用藉由量測U87MG異種移植物中化合物抑制TNFα基因表現之作用的IVTI(活體內標靶抑制)U87MG模型與若干異種移植物功效模型(包括裸小鼠中單獨化合物對人類卵巢癌SKOV-3x-FF-luci腫瘤生長之作用，以及測試化合物與長春新鹼(VCR)在人類卵巢癌SKOV-3x-FF-luci異種移植物中或與CPT-11在人類結腸癌HT-29異種移植物中之組合研究)來確定。本發明化合物之消炎活性藉由脂多醣(LPS)IVTI(活體內標靶抑制)模型來確定，該模型評估化合物抑制小鼠內LPS誘發之血漿細胞激素產生之能力。
在IVTI(活體內標靶抑制)與IVEF(活體內功效)模型中均研究本發明化合物之消炎活性。小鼠與大鼠之脂多醣(LPS)IVTI模型均用以評估化合物抑制LPS誘發之血漿細胞激素產生之能力。小鼠及大鼠之膠原蛋白誘發之關節炎(CIA)模型用以評估消炎及抗細胞激素作用。小鼠及大鼠之卵白蛋白(OVA)誘發之肺部發炎模型用以評估化合物對OVA誘發之氣管發炎之作用。亦使用小鼠之實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE)模型、多發性硬化症之動物模型及大鼠之二硝基苯磺酸(DNBS)誘發之結腸炎模型來評估消炎及抗細胞激素作用。
此等檢定證明實例1及實例2為有效IKKβ抑制劑，且該等化合物中之至少一者具有消炎或抗癌活性。
IKKβ激酶檢定
使用IKKβ激酶檢定來評估本發明化合物對IKKβ激酶之酶活性之作用。使用IKKβ-抑制劑篩檢套組(Calbiochem.，目錄號CBA044)在活體外進行IKKβ激酶檢定。藉由添加10 μL激酶緩衝液(套組組份，編號JA9130)、10 μL GST-IKBa受質(IKKb受質，套組組份，編號JA9127)、10 μL IKKβ(每孔2.5 ng，套組組份，編號481404)、10 μL測試化合物(DMSO溶液)或H2 O及10 μL ATP/MgCl2 (套組組份，編號JA7914)開始所有反應(50 μL)，接著在30℃下培育30分鐘。接著丟棄孔中之內含物。以200 μL 1x洗滌緩衝液(套組組份，編號JA1617，1:20稀釋)洗滌各孔3次。將100 μL抗磷酸化IκBα(Ser32 /Ser36 )抗體結合物(套組組份，編號JA9126)添加至各孔中，且在室溫下培育1小時。接著以1x洗滌緩衝液(套組組份，編號JA1617，1:20稀釋)洗滌該等孔3次，將200毫升/孔及100 μL HRP-結合物(套組組份，編號JA7643)添加至各孔中，且在室溫下培育1小時。接著以200 μL 1x洗滌緩衝液(套組組份，編號JA1617，1:20稀釋)洗滌該等孔3次，且將100 μL TMB受質結合物(套組組份，編號JA1608)添加至各孔中。在室溫下培育此盤，直至顏色改變。接著將100 μL ELISA終止溶液(套組組份，編號JA1616)添加至各孔中。以MultiScan(Thermo Labsystems)在450 nm下收集資料，其中參考波長在570 nm下。在使用1:3連續稀釋機制之8種濃度(10 μM至0.003 μM)下測試所有化合物。本發明之所有例示性化合物均顯示IC50 <0.1 μM。舉例而言，實例1具有0.015 μM之IC50 ，此指示該化合物為有效IKKβ抑制劑。
或者，使用Z'-LYTETM 檢定套組-Ser/Thr 5肽(Invitrogen，目錄號PV3178)在活體外進行IKKβ激酶檢定。藉由添加0.8 μL測試化合物於DMSO中之溶液、10 μL激酶/肽混合物或磷酸化肽溶液(Invitrogen，目錄號PV3219，以1.33x激酶緩衝液稀釋)、5 μL 1.33x激酶緩衝液(Invitrogen，目錄號PV3189，以蒸餾水稀釋5倍)或ATP溶液(5 μM)及4.2 μL蒸餾水開始所有反應(20 μL)。混合384孔檢定盤(Corning，目錄號3575)，且在室溫下培育1小時。接著將10 μL顯色溶液[顯色試劑B(Invitrogen，目錄號PV3296)/顯色緩衝液(Invitrogen，目錄號PV3127)=1:128]添加至各孔中，混合且在室溫下再培育1小時。接著藉由添加10 μL終止試劑(Invitrogen，目錄號PV3094)終止激酶反應，且以Wallac 1420 VICTOR3 多標籤計數器(PERKIN ELMERTM )在445 nm及520 nm螢光下讀取盤。檢定具有2.14之MSR。在使用1:3連續稀釋機制之8種濃度(10 μM至0.003 μM)下初始測試化合物。實例2具有0.058 μM之IC50 。此結果顯示實例2亦為有效IKKβ抑制劑。
細胞生存力測試
應用細胞生存力測試以評估化合物在活體外之生物活性，其中，IKKβ受體在細胞存活及增殖中發揮重要作用。一旦IKKβ路徑被抑制劑阻斷，則細胞可經歷細胞凋亡或死亡。細胞生存力測試提供關於以IKKβ抑制劑處理後細胞存活的資訊。
BxPC-3細胞(ATCC #CRL-1687；人類胰臟癌細胞株)在補充有10%胎牛血清(FBS)(Gibco #10099-141)之Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培養基(Gibco #A10491-01)中生長。Skov3-luc細胞(ATCC，人類卵巢癌細胞株)在補充有10% FBS(Gibco #10099-141)之McCoy's 5a培養基(Gibco #16600)中生長。為測試化合物，在處理之前20小時，將BxPc-3及Skov3-Luc細胞於100 μL以上針對各細胞株說明之相應培養基中分別以2000個細胞/孔及5000個細胞/孔接種於96孔盤中。在0.5% DMSO存在下以8種不同濃度之測試化合物處理細胞72小時。藉由添加20 μL單溶液試劑(CELLTITER 96AQueous單溶液細胞增殖檢定，Promega #G3580)確定各孔中之細胞死亡。在37℃下培育2-4小時後，以微定量盤式讀數器量測492 nm下之光學密度。藉由與在不存在測試化合物下處理之對照細胞比較來確定對細胞生存力之抑制。
對於化合物與其他抗腫瘤劑之組合研究，在處理之前20小時，將BxPc-3及Skov3-Luc細胞於100 μL以上針對各細胞株說明之相應培養基中分別以2000個細胞/孔及5000個細胞/孔接種於96孔盤中。以多個濃度之測試化合物處理細胞30分鐘，接著再暴露於5 ng/mL TNFα或0.15-0.6 μM之VCR(硫酸長春新鹼)72小時。藉由添加20 μL單溶液試劑(CELLTITER 96AQueous單溶液細胞增殖檢定，Promega #G3580)確定各孔中之細胞死亡。在37℃下培育2-4小時後，以微定量盤式讀數器量測492 nm下之光學密度。藉由與在不存在測試化合物下處理之對照細胞比較來確定對細胞生存力之抑制。舉例而言，實例1之組合研究之結果特別詳述於表1中。實例1在與TNFα或VCR組合時在抑制Bxpc-3及Skov3腫瘤細胞生長方面顯示協同效應(實例1之作用獲得增強或放大，參見表1，在Bxpc-3細胞株中：單獨實例1(2.5 μM)，-16.48%抑制；單獨TNFα(5 ng/mL)，5.73%抑制；TNFα(5 ng/mL)+實例1(2.5 μM)，87.75%抑制；亦在Bxpc-3細胞株中：單獨實例1(25 μM)，11.5%抑制；單獨長春新鹼(0.15 μM)，5.73%抑制；長春新鹼(0.15 μM)+實例1(25 μM)，80.25%抑制)。此資料表明實例1與TNFα或VCR之組合在治療卵巢癌或胰臟癌方面之治療效用。
抑制U87MG異種移植物中之TNFα基因表現
TNFα刺激IKKβ信號傳導且觸發TNFα基因表現。為證實化合物在活體中靶向IKKβ，篩檢化合物抑制U87MG(人類神經膠母細胞瘤細胞株)異種移植物中TNFα誘發之TNFα基因表現之能力。將3×106 個U87MG腫瘤細胞皮下植入雌性Balb/c無胸腺裸小鼠(6-8週齡)之右側腹部。10-12天後，當腫瘤體積達到200-300 mm3 時，將動物隨機分成以下組：對照組(無TNFα刺激)、模型組(TNFα刺激)及測試化合物處理組：10毫克/公斤、30毫克/公斤、60毫克/公斤及100毫克/公斤(TNFα刺激)。在收穫腫瘤前2小時向裸小鼠經口投與測試化合物。在收穫腫瘤前1小時以8 μg/kg靜脈內注射TNFα(R&D，目錄：210-TA)。
使用RNEASY小量提取套組(QIAGEN，目錄：74126)提取全部RNA。使用高容量cDNA反轉錄套組(ABI，目錄：4368813)合成cDNA。使用人類GAPDH基因(ABI Hs99999905_ml)及人類TNFα基因(ABI Hs00174128_ml)之相應引子/探針以及ABgene Absolute QPCR ROX 2X母體混合物(AB-1139/B)在7500即時PCR系統(Applied Biosystems)中進行定量即時PCR。
將TNFα基因表現相對於β-肌動蛋白基因表現校正。自PCR機器讀取基因數。抑制(%)=(模型數-處理數)/(模型數-對照數)×100%。實例1特別詳述於表2中。實例1劑量依賴性地抑制U87MG異種移植物中TNFα誘發之TNFα基因表現。
實例2特別詳述於表3中。實例2劑量依賴性地抑制U87MG異種移植物中TNFα誘發之TNFα基因表現。
實例1及實例2顯示以劑量依賴性方式抑制U87MG異種移植物中TNFα誘發之TNFα基因表現。
人類卵巢癌SKOV-3x-FF-luci異種移植物中之抗腫瘤作用
在含有10%胎牛血清(FCS)之McCoy's 5a培養基中培養SKOV-3x-FF-luci人類卵巢癌細胞株(ATCC)。將0.2 mL含有2×106 個細胞之細胞懸浮液經腹膜注射至雌性Balb/c nu/nu小鼠(6-8週齡)。細胞植入六天後將小鼠分成五組。以每天兩次(bid)或每天三次(tid)之方案連續21天向動物經口投與60毫克/公斤、90毫克/公斤及150毫克/公斤劑量之測試化合物。向對照組中之小鼠投與媒劑(pH 2.1之10%阿拉伯膠，每天兩次)。在處理結束時，以CO2 對所有小鼠實施安樂死，且剝離腹腔、膈肌、腸系膜、肝臟、脾臟及卵巢中之腫瘤並收穫，且放在一起用於量測其合併重量。評估腫瘤重量及抑制率(IR)之結果。以下式計算抑制率：IR%=(對照組中之腫瘤重量-經藥物處理之組中之腫瘤重量)/對照組中之腫瘤重量×100%。實例1之結果特別詳述於表4中。在裸小鼠中實例1在60毫克/公斤(每天三次)之口服劑量下顯著抑制人類卵巢腫瘤生長，IR為76.31%(P<0.01，史都登氏T檢驗(Student's T test))。此資料表明實例1在治療卵巢癌中之治療效用。
或者，評估測試化合物在裸小鼠中對人類卵巢癌SKOV-3x-FF-luci之腫瘤生長的抗腫瘤作用。在含有10%胎牛血清之McCoy's 5a培養基中培養SKOV-3x-FF-luci細胞株(ATCC)。將0.2 mL含有2×106 個細胞之細胞懸浮液經腹膜注射至雌性Balb/c nu/nu小鼠(6-7週齡)。細胞植入六天後將小鼠隨機化且分成四組。連續23天每天兩次向動物經口投與30毫克/公斤及100毫克/公斤劑量之測試化合物。向對照組中之小鼠投與媒劑(10%阿拉伯膠)，每天兩次。陽性對照組中之小鼠經由尾部靜脈注射順鉑(Cisplatin)(4毫克/公斤)，每週一次。在處理結束時，以CO2 對所有小鼠實施安樂死，且剝離腹腔、膈肌、腸系膜、肝臟、脾臟及卵巢中之腫瘤，收穫，且合併用於量測重量。抑制率：IR%=(對照組中之腫瘤重量-經藥物處理之組中之腫瘤重量)/對照組中之腫瘤重量×100%。實例2顯示30毫克/公斤及100毫克/公斤劑量下分別59.3%及93.9%之腫瘤抑制率(IR)。藉由單藥療法，實例2亦抑制SKOV-3x-FF-luci腫瘤生長。此資料表明實例2在治療卵巢癌中之治療效用。
在人類結腸癌HT-29異種移植物中之抗腫瘤作用已報導IKKβ抑制劑與CPT-11組合時可壓制HT-29腫瘤生長(Lagadec P,Griessinger E,Nawrot MP等人,Br. J. Cancer(2008) 98,335-344)。接著檢驗化合物與CPT-11組合在人類結腸癌HT-29異種移植物中之抗腫瘤作用。基本上如文獻(Lagadec P,Griessinger E,Nawrot MP等人,Br. J. Cancer(2008) 98,335-344)中報導之方法中所描述，測試在共同投與/未共同投與CPT-11下化合物在人類結腸癌HT-29異種移植物中之抗腫瘤作用。
HT-29人類結腸直腸腺癌細胞株自ATCC獲得，且在含有10%胎牛血清之McCoy's 5a培養基中培養。以0.1 mL含有3.0×106 個細胞之細胞懸浮液皮下注射於雄性Balb/c nu/nu小鼠(6-7週齡)之右側腹部。細胞植入七天後，將小鼠分成六組。以60毫克/公斤及20毫克/公斤經口投與測試化合物，每天兩次。以20毫克/公斤經腹膜投與CPT-11，每週兩次。在組合處理中，投與測試化合物1小時後給與CPT-11。向對照組中之小鼠經口投與媒劑(pH 2.1之10%阿拉伯膠)，每天兩次；且經腹膜給與鹽水，每週兩次。以數位游標測徑規量測腫瘤之兩個正交直徑，每週三次。量測腫瘤體積(TV )，且在處理期間藉由下式記錄：TV =長度 ×寬度 2 /2 。藉由以下方程式計算絕對腫瘤體積之腫瘤生長抑制(TGI )，其中V 0 為第0天(分組當天)之腫瘤體積，且V t 為量測日t之腫瘤體積：TGI =[1-(V t -V 0 ) 經藥物處理 /(V t -V 0 ) 媒劑對照 ] ×100% 。在以下情況下對小鼠實施安樂死：1)在研究結束時(第66天)；2)個別TV >4000 mm3 ；3)個別腫瘤潰爛。雖然實例1作為單一藥劑在60毫克/公斤或20毫克/公斤(經口)下未抑制HT-29腫瘤生長，但在與CPT-11(20毫克/公斤，腹膜內)組合時，其增強CPT-11在此等劑量下之抗腫瘤作用(P<0.05，史都登氏T檢驗)。
與CPT-11組合時，實例1顯示在人類結腸癌HT-29異種移植模型中之抗腫瘤作用，指示實例1在腫瘤壓制中發揮作用。此資料表明實例1與CPT-11之組合在治療結腸癌中之治療效用。
在長春新鹼(VCR)下在SKOV-3x-FF-luci異種移植物中之抗腫瘤作用
探索更多組合測試以擴大抗腫瘤範圍。基於實例1與VCR之活體外協同效應，測試化合物在存在/不存在VCR下在SKOV-3x-FF-luci異種移植物中之抗腫瘤作用。在含有10% FCS之McCoy's 5a培養基中培養SKOV-3x-FF-luci人類卵巢癌細胞株(ATCC)。將0.2 mL含有2×106 個細胞之細胞懸浮液經腹膜注射至雌性Balb/c nu/nu小鼠(6-7週齡)。細胞植入六天後將小鼠分成九組。一天兩次經口投與測試化合物，在60毫克/公斤劑量下連續20天，或在90毫克/公斤劑量下以給藥2天停藥5天之給藥時程進行。經由尾部靜脈注射來投與1毫克/公斤或0.3毫克/公斤之VCR，每週一次。在組合之組中，投與測試化合物1小時後給與VCR。向對照組中之小鼠投與口服媒劑(pH 2.1之10%阿拉伯膠)，且腹膜內注射鹽水。在處理結束時，以CO2 對所有小鼠實施安樂死，且以手術剪刀收穫腹腔、膈肌、腸系膜、肝臟、脾臟及卵巢中之腫瘤，且稱重。在次最佳劑量下，VCR抑制腫瘤生長38%；實例1在60毫克/公斤及90毫克/公斤下分別抑制腫瘤生長42%及36%。在組合之組中，腫瘤生長被抑制76%及74%。與單藥療法相比，發現組合與單藥療法之間的統計顯著性。因此，實例1證明與VCR組合時之協同效應，表明實例1與不同化學治療劑組合時具有相對廣泛之抗腫瘤範圍。此資料亦特定表明實例1與VCR之組合在治療卵巢癌中之治療效用。
脂多醣(LPS)誘發之血漿小鼠細胞激素產生模型
篩檢化合物抑制LPS誘發之血漿細胞激素產生之能力以評估化合物對活體內發炎之抑制作用。
在此等實驗中使用Balb/c小鼠(雌性，體重18 g至20 g)。在以LPS(0.4毫克/公斤)處理之小鼠中進行測試化合物之劑量依賴性、時程研究及藥物動力學/藥效學關係研究。在腹膜內注射0.4毫克/公斤LPS前1小時，藉由經口管飼法向每組八隻小鼠投與1毫克/公斤至100毫克/公斤測試化合物(於10%阿拉伯膠中之懸浮液)或媒劑。投與LPS 90分鐘後，將血液樣品收集於含有用於抗凝血之肝素之管中。以稀釋緩衝液(R&D，目錄號Part 895206，校正稀釋液RD5Z)稀釋血漿樣品3倍。使用ELISA套組(R&D，目錄號MTA00)，基於製造商之方案，量測TNFα含量。使用SPECTRAMAXM2e Plus盤式讀數器獲得資料，且藉由標準曲線擬合來分析。10毫克/公斤之實例1顯著抑制TNFα之產生，使其自2346.2 pg/mL之基線降至1474.9 pg/mL(p<0.01)，抑制率為37.1%。
或者，根據文獻(Ziegelbauer K,Gantner F,Lukacs NW等人,Br J. Pharmacol. 2005,145(2):178-92)中報導之方法，篩檢化合物抑制大鼠血漿內LPS誘發之細胞激素產生之能力。簡言之，在實驗中使用路易斯大鼠(Lewis rat)(雄性，體重140 g-180 g)。在腹膜內投與0.4毫克/公斤LPS前1小時，藉由經口管飼法給與動物(8隻/組)1毫克/公斤至100毫克/公斤測試化合物(於35% solutol及60% PEG400及5% PG中之懸浮液)或媒劑。腹膜內投與LPS九十分鐘後，將血液收集於肝素抗凝管中以使用R&D System ELISA套組，基於一般套組方案量測TNFα。以稀釋緩衝液稀釋血漿樣品100倍，且在各量測中使用50 μL經稀釋之樣品。在SPECTRAMAXM2e Plus盤式讀數器上讀取盤，且基於標準曲線分析TNFα含量。以LC-MS-MS量測血漿中之藥物含量。實例2劑量依賴性地抑制血漿TNFα產生，其中ED50 值為19.8±10.9毫克/公斤且EC50 值為4.042±1.28 μg/mL。
或者，篩檢化合物抑制小鼠血漿中LPS誘發之細胞激素產生之能力。在實驗中使用Balb/c小鼠(雌性，體重18 g至20 g)。在腹膜內(i.p.)投與LPS(0.4毫克/公斤)前1小時，藉由經口管飼法向小鼠(8隻/組)投與1毫克/公斤至100毫克/公斤測試化合物(於10%阿拉伯膠中之懸浮液)或媒劑。投與LPS九十分鐘後，用肝素抗凝管收集血液以基於一般套組方案，量測TNFα含量(R&D，目錄號MTA00)、IL-6(R&D，目錄號M6000B)及IL-1β(R&D，目錄號MLB00B)。在各量測中使用50 μL經稀釋或未經稀釋之血漿樣品。為量測TNFα，以稀釋緩衝液(R&D，目錄號Part 895206，校正稀釋液RD5Z)稀釋血漿樣品3倍；為量測IL-6，以稀釋緩衝液(R&D，目錄號Part 895175，校正稀釋液RD5T)稀釋血漿樣品25倍，且使用未經稀釋之血漿樣品量測IL-1β。在SPECTRAMAXM2e Plus盤式讀數器上讀取盤，且使用標準曲線分析資料。實例2劑量依賴性地抑制血漿中TNFα及IL-6產生，其中ED50 分別為4.84毫克/公斤(EC50 在2420 ng/mL範圍內)及15.1毫克/公斤，但即使在100毫克/公斤劑量下亦未觀察到對IL-1β產生之作用。
證實實例1及實例2均為活體外有效IKKβ抑制劑，且其均在活體內LPS誘發之細胞激素釋放之小鼠模型中顯示顯著活性。
大鼠之LPS誘發之急性關節發炎
關節內投與顯性負性IKKβ可顯著降低大鼠之佐劑誘發之關節炎的嚴重性(Tak PP等人,Arthritis Rheum. (2001) 44(8)1897-1907)。為進一步研究IKKβ抑制劑對機制相關之關節發炎的作用，基本上如文獻(Matsukawa A,Yoshimura T,Miyamoto K,Ohkawara S,Yoshinaga M. Lab Invest. 1997,76(5):629-38)中報導之方法所描述，篩檢化合物抑制大鼠之LPS誘發之關節急性發炎的能力。簡言之，在實驗中使用韋斯大鼠(Wistar rat)(雌性，體重150 g-170 g)。在使用26規格針向各大鼠之左後腿膝蓋關節內(i.a.)投與於10 μL鹽水中之10 μg LPS前1小時，藉由經口管飼法給與動物(8隻/組)1毫克/公斤至100毫克/公斤測試化合物[於35% Solutol(聚乙二醇15羥硬脂酸酯)及60% PEG400及5% PG(丙二醇)中之懸浮液]或媒劑。向各大鼠之右後腿膝蓋注射10 μL鹽水作為對照。LPS注射兩小時後，以100 μL鹽水灌洗大鼠之各足踝。收集滑液且儲存於-80℃下。以稀釋緩衝液稀釋血漿2倍，且使用50 μL經稀釋之樣品，使用R&D System ELISA套組，基於一般套組方案來量測TNFα含量。在SPECTRAMAXM2e Plus盤式讀數器上讀取盤，且使用標準曲線分析TNFα含量。亦藉由液相層析-串聯質譜分析(LC-MS-MS)量測藥物含量。實例2劑量依賴性地抑制關節TNFα產生，其中ED50 為23.4毫克/公斤。資料亦顯示對TNFα產生之抑制與藥物血漿濃度及關節濃度有關。此等資料共同指示實例2之化合物抑制關節發炎。
小鼠之膠原蛋白誘發之關節炎(CIA)模型方案
先前研究顯示在小鼠CIA模型中IKKβ之小分子抑制劑為有效的(Podolin,PL等人,J. Pharm. Exp. Ther.,2005,312: 373-381)。另外，具有表現IkBa之顯性-負性形式之T細胞的小鼠經保護未發展CIA(Seetharaman R.等人,J. Immunol. 1999: 163,1577-1583)。此等觀察結果暗示IKKβ抑制劑在治療類風濕性關節炎方面可能有效。因此，基本上如文獻(Rosloniec EF,Cremer M,Kang A,Myers LK. Current Protocols in Immunology. 1996,15.5.1-15.5.24)中報導之方法中所描述，在小鼠之膠原蛋白誘發之關節炎(CIA)模型中測試本發明之化合物。
簡言之，在第0天及第21天以經弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant，CFA，Sigma，US)乳化之雞膠原蛋白II(200微克/小鼠)皮內免疫DBA/1小鼠以引起關節炎。使用可視計分系統評估關節炎之嚴重性，其中將各爪評為0至4分(0分=正常，4分=整個爪嚴重腫脹)。以測微器量測後腿關節厚度。出於預防或治療之目的，經口投與測試化合物。為進行預防研究，自第1天至第42天每天兩次經口投與測試化合物。為進行治療研究，在關節炎發作之後開始進行藥物處理，關節炎發作通常在第二次免疫後一週內發生。用藥物處理小鼠21天。
使用每天一次(q.d.)10毫克/公斤/天之免疫抑制劑來氟米特(lefunomide)作為陽性對照。使用未接受任何處理之正常動物作為陰性對照。每天兩次經口投與3毫克/公斤、10毫克/公斤及30毫克/公斤之藥物42天。觀察到每天兩次10毫克/公斤及30毫克/公斤(20毫克/公斤/天及60毫克/公斤/天)之實例2統計顯著抑制關節腫脹且使關節炎分數降低，其中ED50 為4.3毫克/公斤。
此資料表明實例2在治療類風濕性關節炎中之治療效用。
大鼠膠原蛋白II誘發之關節炎(CIA)模型
為證實在小鼠CIA模型中獲得之結果，亦基本上如文獻(Rosloniec EF,Cremer M,Kang A,Myers LK. Current Protocols in Immunology. 1996,15.5.1-15.5.24)中報導之方法中所描述，在大鼠之CIA模型中測試化合物。簡言之，在第0天以200 μg經弗氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant，IFA，Sigma，US)乳化之牛膠原蛋白II及在第7天以100 μg經IFA(弗氏不完全佐劑)乳化之膠原蛋白II皮內免疫韋斯大鼠。在免疫前及免疫後量測後爪體積。以關節炎分數定量四個爪之疾病發展。以媒劑或藥物(處理組)處理正常組及模型組中之大鼠。第一次免疫後，自第1天至第21天以3毫克/公斤、10毫克/公斤、30毫克/公斤(每天兩次)之劑量向處理組中之大鼠經口投與測試化合物。在LEF組中，以每天一次10毫克/公斤之劑量向大鼠經口投與LEF作為陽性對照。30毫克/公斤之實例2顯著減弱膠原蛋白誘發之關節炎，如關節炎分數及後爪體積降低所顯示。此資料表明實例2在治療類風濕性關節炎中之治療效用。
小鼠之卵白蛋白(OVA)誘發之肺部發炎
先前研究已顯示IKKβ之小分子抑制劑可在小鼠中抑制過敏原誘發之氣管發炎及超反應性(Birrell MA等人,Am J Respir Crit Care Med,2005,172: 962-971)。此研究之目的為研究IKKβ抑制劑對抗原驅動之氣管發炎之活體內模型的作用。
基本上如文獻(Muriel Pichavant,Sho Goya,Eckard Hamelmann,Erwin W. Gelfand,及Dale T. Umetsu. Animal Models of Airway Sensitization. Current Protocols in Immunology.(1999) 15.18.1-15.18.13)中報導之方法中所描述，在小鼠之OVA誘發之肺部發炎模型中測試本發明之化合物。簡言之，藉由在第1天及第14天向重18 g至20 g之雌性Balb/c小鼠腹膜內注射100 μL含有20 μg OVA及2 mg氫氧化鋁之鹽水，使其敏感。在第28、29及30天，藉由以Buxco Mass Dosing系統霧化於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之1%卵白蛋白(OVA)來攻擊各小鼠一次，持續20分鐘。自第1天至第31天向小鼠經口投與作為陽性對照之1毫克/公斤(每天一次)劑量之地塞米松(dexamethasone)及1毫克/公斤、3毫克/公斤、10毫克/公斤及30毫克/公斤(每天一次)劑量之測試化合物。在第32天，以1%之戊巴比妥鈉(pentobarbital sodium)麻醉各組中之動物。打開胸腔及腹腔，且自經離心之樣品收集血漿。接著剝離且橫切氣管。經由將18規格導管插入氣管中，以總量為1.5 mL之無菌PBS灌洗肺，接著置放於樣品容器中。藉由離心BAL流體獲得無細胞BAL上清液。所有血清及BAL清液均儲存於-80℃下，直至使用。對BAL細胞之細胞離心塗片機製劑進行細胞分類計數，以進行細胞計數及細胞激素測定。收集BAL上清液後，移除接受小鼠之整個肺，且藉由氣管內滴入10%緩衝福馬林(formalin)(於PBS中)固定。自接受肺之門周區域獲得三至六個石蠟切片，以蘇木素及伊紅染色，且在光學顯微鏡法下檢查以用於病理研究。
與正常對照相比，OVA顯著增加BALF中之嗜伊紅白血球(p<0.01)及IL-13(p<0.05)含量。作為陽性對照之1毫克/公斤(每天一次)劑量之地塞米松完全抑制嗜伊紅白血球數之增加，且使IL-13減少77%。1毫克/公斤、3毫克/公斤、10毫克/公斤及30毫克/公斤(每天兩次)劑量之實例2使嗜伊紅白血球數分別減少58.6%、49.3%、94.1%(p<0.05)及90.2%(p<0.05)。10毫克/公斤及30毫克/公斤劑量之實例2亦使IL-13產生顯著減少73.0%(p<0.05)及85.1%(p<0.01)。另外，蘇木素及伊紅染色顯示在經1毫克/公斤至30毫克/公斤組劑量之實例2及1毫克/公斤劑量之地塞米松處理的小鼠中肺部發炎獲得改良。
此研究進一步表明實例2在治療哮喘中之治療效用。
棕色-挪威(BN)大鼠之OVA誘發之肺部發炎
為評估IKKβ抑制劑對活體內抗原驅動之氣管發炎之作用，亦基本上如文獻(Yamamoto N,Takeshita K,Shichijo M,Kokubo T,Sato M,Nakashima K,Ishimori M,Nagai H,Li YF,Yura T,Bacon KB. J Pharm. Exp Ther. 2003;306(3):1174-81)中報導之方法中所描述，在大鼠之OVA誘發之肺部發炎模型中測試化合物。簡言之，藉由在第1、2及3天向重240 g至260 g之雄性BN大鼠腹膜內注射1 mL含有1 mg OVA及13 mg氫氧化鋁之鹽水，使其敏感。作為正常對照之大鼠接受1 mL鹽水代替OVA。在第20天及第21天，向大鼠經口投與0.3毫克/公斤、1毫克/公斤、3毫克/公斤及30毫克/公斤(每天兩次)劑量之測試化合物。在第21天，藉由Buxco Mass Dosing系統以1% OVA攻擊大鼠15分鐘。在第22天，以1%之戊巴比妥鈉麻醉大鼠。打開胸腔及腹腔。自經離心之樣品收集血漿。剝離且橫切氣管。經由將18規格導管插入氣管中，以總量為15 mL之無菌PBS灌洗肺，接著置放於樣品容器中。藉由離心BAL流體獲得無細胞BAL上清液。所有血清及BAL清液均儲存於-80℃下，直至使用。對BAL細胞之細胞離心塗片機製劑進行細胞分類計數，以進行細胞計數及細胞激素測定。與正常對照相比，OVA顯著增加BAL流體中之總細胞數及嗜伊紅白血球數(p<0.01)。0.3毫克/公斤至30毫克/公斤之實例2以劑量依賴性方式顯著抑制總細胞及嗜伊紅白血球增加(p<0.05)，其中ED50 為0.49毫克/公斤。此研究進一步表明實例2在治療哮喘中之治療效用。
小鼠實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE)模型
NEMO或IKK2(IKKβ)而非IKK1之CNS有限切除可改善多發性硬化症之小鼠模型中之疾病病理(Nature Immunology,2006;7(9),954-61)。此等研究暗示IKKβ抑制劑在小鼠EAE模型中應為有效的。
基本上如文獻(Miller SD,Karpus WJ. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 1996,15.1.1-15.1.13)中報導之方法中所描述，在小鼠之PLP-139-151誘發之EAE模型中測試本發明之化合物。簡言之，以經於CFA(完全弗氏佐劑)中之H37Ra(結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)菌株)(300 μg H37Ra)乳化之PLP 139-151(200微克/小鼠)皮內免疫雌性SJL/J小鼠。自免疫後第1天起，每天兩次經口投與3毫克/公斤、10毫克/公斤、30毫克/公斤劑量之測試化合物或媒劑以進行預防研究，或在EAE復發之日起給藥，且在整個疾病過程中持續給藥以進行治療研究。使用地塞米松(1毫克/公斤，經口投與，每天一次)作為陽性對照。每天進行稱重及EAE臨床評估。疾病計分遵循以下準則：0，無明顯疾病徵象；1，尾巴無力或後肢無力，但非兩者均具有；2，尾巴無力及後肢無力；3，部分後肢麻痺；4，完全後肢麻痺；5，垂死狀態或死亡。經PLP 139-151免疫之小鼠出現與EAE相關之臨床症狀及自第11天起體重下降。EAE分數迅速升高且在第15天達到最大程度。在大約第20天出現EAE分數下降。接著其後出現自發性復發(模型組)。在實例2之藥物組中，升高之與EAE相關之臨床分數以劑量依賴性方式下降。10毫克/公斤及30毫克/公斤劑量之實例2改善體重損失。3毫克/公斤、10毫克/公斤及30毫克/公斤劑量之實例2降低EAE臨床分數，其中ED50 為3.7毫克/公斤。此研究表明實例2在治療多發性硬化症中之治療效用。
大鼠之二硝基苯磺酸(DNBS)誘發之結腸炎
IKKβ激酶參與調節對發炎性腸道疾病(IBD)之發病原理為關鍵之各種促炎性蛋白質的表現。因此，IKKβ激酶代表用於開發治療IBD之新穎藥劑之有前途的目標。
基本上如文獻(Gut. 2002;50(3):440-1)中報導之方法中所描述，在大鼠之DNBS誘發之結腸炎模型中測試化合物。簡言之，在實驗中使用韋斯大鼠。藉由結腸內滴入DNBS引入末梢結腸炎後，向大鼠經口投與3毫克/公斤、10毫克/公斤、30毫克/公斤、60毫克/公斤(兩天一次)劑量之測試化合物，持續6天。不滴入DNBS，以單獨媒劑處理陰性對照組。媒劑對照組大鼠經DNBS誘發且以媒劑處理。在陽性對照組中，連續6天每天以300毫克/公斤向大鼠經口投與柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)。在最終處理後24小時，對動物實施安樂死。計算各動物之結腸：體重比及結腸損害分數。對大鼠之媒劑處理導致臨床症狀進行性惡化，在滴入後第7天達到6.1±0.6之最大結腸損害分數及0.96±0.10之結腸體重比-結腸長度。在此DNBS誘發之發炎性腸道疾病模型中，以3毫克/公斤、10毫克/公斤、30毫克/公斤及60毫克/公斤劑量之實例2處理之大鼠顯示結腸損害分數、結腸體重比-結腸長度之比率顯著降低，降低30%以上。3毫克/公斤/天至60毫克/公斤/天劑量之實例2之作用與300毫克/公斤/天劑量之柳氮磺胺吡啶之作用類似。
此研究表明實例2在治療發炎性腸道疾病中之治療效用。
本發明之化合物較佳調配為藉由多種途徑投與之醫藥組合物。此等組合物最佳用於經口投與或靜脈內投與。此等醫藥組合物及其製備方法為此項技術中所熟知。參見例如REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY(D. Troy等人編，第21版,Lippincott Williams & Wilkins,2005)。
本發明之化合物一般在寬劑量範圍內有效。舉例而言，每天之劑量通常在每公斤體重約0.05毫克至約500毫克範圍內。在某些情況下，在上述範圍之下界以下的劑量可多於足夠量，而在其他情況下可使用更大劑量而不引起任何有害副作用，因此上述劑量範圍不欲以任何方式限制本發明之範疇。應瞭解實際投與之化合物之量將由醫師根據相關狀況確定，該等狀況包括待治療之病狀、所選投與途徑、實際化合物或所投化合物、個體患者之年齡、重量及反應以及患者症狀之嚴重性。

Claims (34)

  1. 一種下式之化合物， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  2. 如請求項1之化合物或鹽，其為2-{5-氯-2-[(1R ,2R )-2-羥基環戊基胺基]嘧啶-4-基}-N -環丙基-1H -吲哚-4-甲醯胺。
  3. 如請求項1之化合物或鹽，其為2-{5-氯-2-[(1R ,2S)-2-羥基環戊基胺基]嘧啶-4-基}-N -環丙基-1H -吲哚-4-甲醯胺。
  4. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至3中任一項之化合物或鹽與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑組合。
  5. 如請求項4之醫藥組合物，其進一步包含一或多種其他治療劑。
  6. 如請求項5之醫藥組合物，其中該治療劑為TNFα。
  7. 如請求項5之醫藥組合物，其中該治療劑為長春新鹼(vincristine)。
  8. 一種如請求項1至3中任一項之化合物或鹽之用途，其係用於製造供治療哺乳動物之選自由以下組成之群之發炎疾病的藥劑：類風濕性關節炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、多發性硬化症及發炎性腸道疾病。
  9. 如請求項8之用途，其中該發炎疾病為類風濕性關節炎。
  10. 如請求項8之用途，其中該發炎疾病為慢性阻塞性肺病。
  11. 如請求項8之用途，其中該發炎疾病為哮喘。
  12. 如請求項8之用途，其中該發炎疾病為多發性硬化症。
  13. 如請求項8之用途，其中該發炎疾病為發炎性腸道疾病。
  14. 一種如請求項1至3中任一項之化合物或鹽之用途，其係用於製造供治療哺乳動物之選自由以下組成之群之癌症的藥劑：多發性骨髓瘤、結腸癌、大細胞肺癌、神經膠母細胞瘤、胰臟癌及卵巢癌。
  15. 如請求項14之用途，其中該癌症為多發性骨髓瘤。
  16. 如請求項14之用途，其中該癌症為結腸癌。
  17. 如請求項14之用途，其中該癌症為大細胞肺癌。
  18. 如請求項14之用途，其中該癌症為神經膠母細胞瘤。
  19. 如請求項14之用途，其中該癌症為胰臟癌。
  20. 如請求項14之用途，其中該癌症為卵巢癌。
  21. 如請求項1至3中任一項之化合物或鹽，其係用於療法中。
  22. 如請求項1至3中任一項之化合物或鹽，其係用於治療發炎疾病。
  23. 如請求項22之化合物或鹽，其中該發炎疾病為類風濕性關節炎。
  24. 如請求項22之化合物或鹽，其中該發炎疾病為慢性阻塞性肺病。
  25. 如請求項22之化合物或鹽，其中該發炎疾病為哮喘。
  26. 如請求項22之化合物或鹽，其中該發炎疾病為多發性硬化症。
  27. 如請求項22之化合物或鹽，其中該發炎疾病為發炎性腸道疾病。
  28. 如請求項1至3中任一項之化合物或鹽，其係用於治療癌症。
  29. 如請求項28之化合物或鹽，其中該癌症為多發性骨髓瘤。
  30. 如請求項28之化合物或鹽，其中該癌症為結腸癌。
  31. 如請求項28之化合物或鹽，其中該癌症為大細胞肺癌。
  32. 如請求項28之化合物或鹽，其中該癌症為神經膠母細胞瘤。
  33. 如請求項28之化合物或鹽，其中該癌症為胰臟癌。
  34. 如請求項28之化合物或鹽，其中該癌症為卵巢癌。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111303125A (zh) * 2020-04-10 2020-06-19 天津法莫西医药科技有限公司 一种甲氧基取代吲哚-嘧啶类化合物及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005113544A1 (en) * 2004-05-12 2005-12-01 Aventis Pharmaceuticals Inc. Substantially pure 2-{[2-(2-methylamino-pyrimidin-4-yl)-1h-indole-5-carbonyl]-amino}-3-(phenylpyridin-2-yl-amino)-propionic acid as an ikb kinase inhibitor

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10237722A1 (de) * 2002-08-17 2004-08-19 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Indol- oder Benzimidazolderivate zur Modulation der IKappaB-Kinase
RU2333203C2 (ru) * 2002-12-25 2008-09-10 Дайити Фармасьютикал Ко., Лтд. Диаминовые производные
GB0308466D0 (en) 2003-04-11 2003-05-21 Novartis Ag Organic compounds
WO2006038001A1 (en) * 2004-10-06 2006-04-13 Celltech R & D Limited Aminopyrimidine derivatives as jnk inhibitors
GB0500492D0 (en) * 2005-01-11 2005-02-16 Cyclacel Ltd Compound
AR053114A1 (es) 2005-01-12 2007-04-25 Aventis Pharma Inc Sal monopotasica del acido 2-{[2-(-2-metilamino-pirimidin-4-il)-1h-indol-5-carbonil]-amino}-3-(fenilpiridin-2-il-amino)-propionico,inhibidora de ikk-2 quinasa
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005113544A1 (en) * 2004-05-12 2005-12-01 Aventis Pharmaceuticals Inc. Substantially pure 2-{[2-(2-methylamino-pyrimidin-4-yl)-1h-indole-5-carbonyl]-amino}-3-(phenylpyridin-2-yl-amino)-propionic acid as an ikb kinase inhibitor

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