CN102858764B - 嘧啶基吲哚化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了作为新的激酶抑制剂用于治疗癌症和炎性疾病的嘧啶基吲哚化合物。

Description

嘧啶基吲哚化合物
本发明涉及嘧啶基吲哚化合物、其制剂和治疗用途，特别是在治疗癌症和炎性疾病中的用途。
IKKβ是一种调节炎症和应激相关通路的关键激酶，因此已经被与从癌症到炎性疾病等多种人类疾病的发生发展相关联。
可用作激酶抑制剂的嘧啶基吲哚化合物在本领域中已经是已知的。参见WO04089913(IKKβ抑制剂)、WO06038001和WO06075152。此外，可用作IKKβ抑制剂的嘧啶基苯并噻吩化合物在本领域中也是已知的。参见WO07092095。
需要可用于治疗癌症或炎性疾病的强效IKKβ抑制剂。还需要当与TNFα或长春新碱(VCR)组合使用时具有协同作用的这类化合物。
本发明提供了新的嘧啶基吲哚化合物，其通过抑制IKKβ而具有用于治疗癌症和炎性疾病的临床用途。更具体而言，本发明提供了下式的新的嘧啶基吲哚化合物：
或其可药用盐。
本发明还提供了治疗哺乳动物的癌症的方法，所述癌症选自多发性骨髓瘤、结肠癌、大细胞肺癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌和卵巢癌，该方法包括给需要这类治疗的哺乳动物施用有效量的本发明的化合物或盐。
本发明还提供了治疗哺乳动物的炎性疾病的方法，所述炎性疾病选自类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、多发性硬化和炎症性肠病，该方法包括给需要这类治疗的哺乳动物施用有效量的本发明的化合物或盐。
本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的化合物或盐以及与之组合的一种或多种可药用的载体、稀释剂或赋形剂。在一个特定的实施方案中，所述组合物进一步包含一种或多种其它治疗剂。在另一个实施方案中，所述其它治疗剂是TNFα。在另一个实施方案中，所述其它治疗剂是长春新碱。
本发明还提供了用于治疗的本发明的化合物或盐。本发明还提供了用于治疗癌症的本发明的化合物或盐。此外，本发明还提供了本发明的化合物或盐在制备用于治疗癌症的药剂中的用途。特定地，这些癌症选自多发性骨髓瘤、结肠癌、大细胞肺癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌和卵巢癌。一个实施方案是多发性骨髓瘤。另一个实施方案是结肠癌。另一个实施方案是大细胞肺癌。另一个实施方案是成胶质细胞瘤。另一个实施方案是胰腺癌。另一个实施方案是卵巢癌。本发明还提供了用于治疗炎性疾病的本发明的化合物或盐。此外，本发明还提供了本发明的化合物或盐在制备用于治疗炎性疾病的药剂中的用途。特定地，所述炎性疾病选自类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、多发性硬化和炎症性肠病。一个实施方案是类风湿性关节炎。另一个实施方案是慢性阻塞性肺疾病。另一个实施方案是哮喘。另一个实施方案是多发性硬化。另一个实施方案是炎症性肠病。此外，本发明还提供了用于治疗癌症的药物组合物，所述癌症选自多发性骨髓瘤、结肠癌、大细胞肺癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌和卵巢癌，该药物组合物包含作为活性成分的本发明的化合物或盐。此外，本发明还提供了用于治疗炎性疾病的药物组合物，所述炎性疾病选自类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、多发性硬化和炎症性肠病，该药物组合物包含作为活性成份的本发明的化合物或盐。
本发明的化合物和盐基本上如流程图和实施例中所述进行制备。另外，由于环戊基环取代，本发明的所有化合物和盐以非对映异构体或对映异构体的形式存在。因此，通过使用特定的非对映异构体作为反应物引入了光学纯度。也可以通过对对应于本发明的化合物或盐的非对映异构体混合物或外消旋物使用色谱/手性色谱来引入光学纯度。
流程图I
本发明的化合物的合成
本发明的化合物是通过在甲醇或乙醇中用HCl、三氟乙酸(TFA)或对甲苯磺酸(TsOH)处理而将它们的被保护的前体(A)进行脱保护来制备的。
流程图II
前体(A)的合成
如上所述前体A是以两种方式制备的。在上端的反应中，吲哚-4-甲酸(B)与环丙胺在脱水剂如六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)(BOP)或二环己基碳二亚胺存在下偶联。有机合成领域的技术人员将认识到，这些酰胺偶联反应也可以在合成式(I)化合物的合成序列中的任何一个方便的点进行。
在下端的反应中，在溶剂如二甲亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)中、在高温(70℃-130℃)下、在碱如氢化钠、二异丙基乙基胺(DIPEA)或碳酸钾存在下，2-氨基环戊醇(D)置换氯嘧啶中间体(C)中的氯基团。有机合成领域的技术人员将认识到，这些氯置换反应也可以在合成本发明的化合物的合成序列中的任何一个方便的点进行。
流程图III
羧酸(B)的合成
吲哚-4-甲酸(B)是通过类似于流程图II的下端的反应用2-氨基环戊醇(D)置换嘧啶基酯(E)中的氯基团、然后皂化中间体羧酸酯基来制备的。
流程图IV
嘧啶基氯化物(C)和(E)的合成
通过吲哚-2-硼酸(F或它们的C1-C3烷基硼酸酯)与可商购获得的三氯嘧啶(G)的钯催化的偶联反应制备了嘧啶基氯化物(C)和(E)。催化剂是Pd(OAc)2、Pd(PPh3)4或PdCl2(dppf)，偶联反应在高温(50℃-110℃)下在极性非质子溶剂例如四氢呋喃(THF)中进行。
将可商购获得的或通过文献方法制备的吲哚前体(H)首先在碱存在下用氯甲基乙基醚或C1-C3三烷基硅烷基氯化物或二碳酸二叔丁酯进行N1保护，然后在吲哚2位进行锂化并用C1-C3三烷基硼酸酯处理，得到烃代硼酸(boronic acid)或烃代硼酸酯(F)。
本发明包括各种立体异构体及其混合物。立体异构体包括对映异构体和非对映异构体以及对映异构体或非对映异构体的混合物。本发明的化合物的单个立体异构体可以由含有不对称中心或手性中心的可商购获得的起始材料来合成制备，或者通过制备外消旋混合物、然后用本领域普通技术人员公知的方法拆分来制备。这些拆分方法是例如：(1)将对映异构体的混合物附加到手性辅剂上，通过重结晶或色谱法分离所得到的非对映异构体混合物，任选从辅剂中释放出光学纯的产物，如Furniss,Hannaford,Smith和Tatchell,“Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry”,第5版(1989),Longman Scientific&Technical,Essex CM202JE,England中所述；或者(2)用手性色谱柱直接分离旋光对映异构体的混合物；或者(3)分级重结晶方法。
利用ChemDraw Ultra10.0命名以下化合物：
制备例1
N-环丙基-2-(2,5-二氯嘧啶-4-基)-1-(乙氧基甲基)-1H-吲哚-4-甲酰胺(A)1-(乙氧基甲基)-1H-吲哚-4-甲酸甲酯的制备
在氮气下，于0℃向1H-吲哚-4-甲酸甲酯(80g,0.46mol)在THF(700mL)中的溶液中滴加六甲基二硅基胺基钾(potassiumhexamethyldisilazide)(1M,在THF中,550mL,0.55mol)。将混合物于0℃搅拌30分钟(min)，然后于0℃-5℃加入氯甲基乙基醚(51mL,0.55mol)。加完后，将反应混合物于环境温度再搅拌3小时(h)，用300mL水小心淬灭，用乙酸乙酯(EA,3×300mL)萃取。将合并的萃取液用饱和氯化钠水溶液(2×400mL)洗涤，然后用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱法纯化残余物，得到标题化合物(80g,75%)。MS(m/z):234(M+H)+。
(B)1-(乙氧基甲基)-1H-吲哚-4-甲酸的制备
向1-(乙氧基甲基)-1H-吲哚-4-甲酸甲酯(135g,0.58mol)在甲醇(2L)中的溶液中加入氢氧化钠水溶液(68g,1.74mol,在340mL水中)。将反应混合物于50℃搅拌3小时。真空除去挥发物。将残余物用HCl(2M)酸化至pH=3-4，然后用EA(2×700mL)萃取。将合并的萃取液用饱和氯化钠水溶液(2×250mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，浓缩，得到标题化合物(123g,96%)。MS(m/z):220(M+H)+。
(C)N-环丙基-1-(乙氧基甲基)-1H-吲哚-4-甲酰胺的制备
于0℃，向1-(乙氧基甲基)-1H-吲哚-4-甲酸(123g,0.56mol)在THF(1.5L)中的溶液中加入环丙胺(58mL,0.84mol)和三乙胺(TEA,167mL,1.12mol)，然后加入六氟磷酸O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲(240g,0.62mol)。将反应混合物于环境温度搅拌过夜。真空除去挥发物。将残余物在EA(1.5L)和HCl(0.5%,1L)中搅拌10分钟。分离有机层，用饱和氯化钠水溶液(3×100mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱法纯化残余物，得到标题化合物(110g,77%)。MS(m/z):259(M+H)+。
(D)N-环丙基-2-(2,5-二氯嘧啶-4-基)-1-(乙氧基甲基)-1H-吲哚-4-甲酰胺的制备
于-50℃向二异丙胺(DIPA,147mL,1.04mol)在无水THF(600mL)中的溶液中加入正丁基锂(2.5M,在己烷中,420mL,1.04mol)。加完后，将混合物于-20℃搅拌30分钟，然后冷却到-70℃。加入N-环丙基-1-(乙氧基甲基)-1H-吲哚-4-甲酰胺(60g,0.23mol)和硼酸三异丙基酯(56.4mL,0.25mol)在无水THF(300mL)中的溶液。将反应混合物于-70℃搅拌30分钟。将反应缓慢升温到环境温度，搅拌1小时，然后用K3PO4·3H2O水溶液(195g,0.74mol,在700mL水中)淬灭。将粗反应混合物脱气并用氮气净化三次。加入2,4,5-三氯嘧啶(51g,0.27mol)和二苯基膦基二茂铁二氯化钯(PdCl2(dppf)·CH2Cl2,19.2g,0.023mol)，在氮气下于回流温度搅拌1.5小时。真空除去挥发物。用二氯甲烷(DCM,3×500mL)萃取残余物。将合并的萃取液用饱和氯化钠水溶液(3×100mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱法纯化残余物，得到标题化合物(30g,32%)。MS(m/z):405[(M+1)+,35Cl,35Cl],407[(M+1)+,35Cl,37Cl]及409[(M+1)+,37Cl,37Cl]。
实施例1
2-{5-氯-2-[(1R,2S)-2-羟基环戊基氨基]嘧啶-4-基}-N-环丙基-1H-吲哚-4-甲酰胺盐酸盐
将N-环丙基-2-(2,5-二氯嘧啶-4-基)-1-(乙氧基甲基)-1H-吲哚-4-甲酰胺(10g,25mmol)、(1S,2R)-2-氨基环戊醇盐酸盐(4.1g,30mmol)和DIPEA(5mL,30mmol)在DMSO(70mL)中的混合物于100℃搅拌3小时，然后倒入水中，用EA萃取。将合并的萃取液用饱和氯化钠水溶液洗涤，用Na2SO4干燥，真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化残余物，得到2-{5-氯-2-[(1R,2S)-2-羟基环戊基氨基]嘧啶-4-基}-N-环丙基-1-(乙氧基甲基)-1H-吲哚-4-甲酰胺(7g,60.3%)。MS(m/z):470(35Cl)及472(37Cl)(M+H)+。
将以上产物(7g,14.9mmol)与氯化氢(6M,在甲醇中,210mL,1.26mol)一起于45℃搅拌12小时。通过过滤收集沉淀物，用甲醇洗涤，真空干燥，得到标题化合物(4.7g,70%)。MS(m/z):412(35Cl)及414(37Cl)(M+H)+。
实施例2
2-{5-氯-2-[(1R,2R)-2-羟基环戊基氨基]嘧啶-4-基}-N-环丙基-1H-吲哚-4-甲酰胺盐酸盐
将N-环丙基-2-(2,5-二氯嘧啶-4-基)-1-(乙氧基甲基)-1H-吲哚-4-甲酰胺(30g,75mmol)、(1R,2R)-2-氨基环戊醇盐酸盐(12.3g,90mmol)和DIPEA(37.5mL,225mmol)在DMSO(150mL)中的混合物于80℃搅拌16小时，然后倒入水(1L)中，用EA(2×500mL)萃取。将合并的萃取液用饱和氯化钠水溶液(500mL)洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化残余物，得到2-{5-氯-2-[(1R,2R)-2-羟基环戊基氨基]嘧啶-4-基}-N-环丙基-1-(乙氧基甲基)-1H-吲哚-4-甲酰胺(33g,93%)。MS(m/z):470(35Cl)及472(37Cl)(M+H)+。
将以上产物(33g,70mmol)与氯化氢(6M,在甲醇中,1L，6mol)一起于45℃搅拌16小时。通过过滤收集沉淀物，用甲醇(2×300mL)洗涤，真空干燥，得到标题化合物(26.8g,85%)。MS(m/z):412(35Cl)及414(37Cl)(M+H)+。
关节内施用显性负性IKKβ显著减轻大鼠的佐剂诱导的关节炎的严重程度(Tak PP等人,Arthritis Rheum.(2001)44(8)1897-1907)。IKKβ敲除细胞在表达TNFα诱导的细胞因子、趋化因子或黏附分子方面具有严重缺陷。通过条件性或组织特异性敲除IKKβ，发现该激酶对于外周B细胞的存活和增殖以及防止TNFα介导的细胞凋亡而言是必需的(Li Z-W,Omori AS,Labuda T,Karin M,Rickert RC,“外周B细胞的存活和增殖需要IKKβ(IKKβ is required for peripheral B cell survival and proliferation)”The J.Immunol.,(2003),170:4630-4637;Maeda S,Chang L等人“防止细胞结合的而非循环的TNFα介导的细胞凋亡需要IKKβ(IKKβis required forprevention of apoptosis mediated by cell-bound but not by circulatingTNFa)”Immunity,(2003),19:725-737)。另外，敲除髓样细胞中的IKKβ也减少结肠炎相关肿瘤的生长(Greten FR等人,Cell,(2004),118:285-296)。此外，几个组已经证明IKKβ激酶抑制剂能在不同肿瘤细胞系中诱导细胞生长抑制和/或增加TNF-α或TRAIL诱导的细胞死亡(Takaomi等人ClinicalCancer Res.,(2005),Vol11:1974-82;Hideshima等人,JBC,(2002)277:16639-47;Lam等人Clinical Cancer Res.,(2005)Vol11:28-40)。
此外，WO07092095公开了可用于治疗多发性骨髓瘤、结肠癌、大细胞肺癌、成胶质细胞瘤和卵巢癌的IKKβ抑制剂。
生物学性质的评价
本发明的化合物的生物学性质可以通过以下测定法来测定。通过酶法IKKβ-激酶测定法(其测量IκBα底物被各个激酶的磷酸化)和细胞生存力测定法(其测量化合物抑制包括BxPC-3和Skov3-luc在内的各种肿瘤细胞系的细胞生长的能力)来评价本发明的化合物的IKKβ抑制活性。通过IVTI(体内靶标抑制)U87MG模型(其测量化合物对U87MG异种移植物中TNFα基因表达的抑制作用)和几种异种移植物功效模型(包括单独使用的化合物对裸小鼠中人卵巢癌SKOV-3x-FF-luci肿瘤生长的作用，以及测试化合物与长春新碱(VCR)一起在人卵巢癌SKOV-3x-FF-luci异种移植物中的组合研究或测试化合物与CPT-11一起在人结肠癌HT-29异种移植物中的组合研究)来评价本发明的化合物的抗肿瘤作用。通过脂多糖(LPS)IVTI(体内靶标抑制)模型(其评估化合物抑制小鼠中LPS诱导的血浆细胞因子产生的能力)来测定本发明的化合物的抗炎活性。
在IVTI(体内靶标抑制)模型和IVEF(体内功效)模型中均研究了本发明的化合物的抗炎活性。在小鼠和大鼠中均用脂多糖(LPS)IVTI模型评估了所述化合物抑制LPS诱导的血浆细胞因子产生的能力。在小鼠和大鼠中用胶原诱导的关节炎(CIA)模型评价了抗炎和抗细胞因子作用。在小鼠和大鼠中用卵清蛋白(OVA)诱导的肺部炎症模型评价了所述化合物对OVA诱导的气道炎症的作用。还用小鼠的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型、多发性硬化的动物模型和大鼠的二硝基苯磺酸(DNBS)诱导的结肠炎模型评估了抗炎和抗细胞因子作用。
这些测定法证明，实施例1和实施例2是强效IKKβ抑制剂，并且所述化合物中至少一个具有抗炎或抗癌活性。
IKKβ激酶测定法
用IKKβ激酶测定法来评估本发明的化合物对IKKβ激酶的酶活性的作用。使用IKKβ抑制剂筛选试剂盒(Calbiochem.,Cat.No.CBA044)在体外进行IKKβ激酶测定法。所有反应(50μL)均是通过加入10μL激酶缓冲液(试剂盒组份,No.JA9130)、10μL GST-IKBα底物(IKKβ底物，试剂盒组份，No.JA9127)、10μL IKKβ(每孔2.5ng,试剂盒组份，No.481404)、10μL测试化合物(DMSO溶液)或水和10μL ATP/MgCl2(试剂盒组份，No.JA7914)、然后于30℃孵育30分钟来开始的。然后去除孔中的内含物。用200μL1×洗涤缓冲液(试剂盒组份，No.JA1617，1:20稀释)洗涤各孔3次。将100μL抗磷酸IκBα(Ser32/Ser36)抗体轭合物(试剂盒组份，No.JA9126)加至每个孔中，于室温孵育1小时。然后用200mL/孔1x洗涤缓冲液(试剂盒组份，No.JA1617，1:20稀释)洗涤孔3次，将100μL HRP-轭合物(试剂盒组份，No.JA7643)加至各孔中，且于室温孵育1小时。然后用200μL1x洗涤缓冲液(试剂盒组份，No.JA1617，1:20稀释)洗涤孔3次，将100μL TMB底物轭合物(试剂盒组份，No.JA1608)加至各孔中。将板于室温孵育，直至颜色改变。然后向各孔中加入100μL ELISA终止溶液(试剂盒组份，No.JA1616)。用MultiScan(Thermo Labsystems)于450nm采集数据，用570nm作为参比波长。所有化合物均使用1:3连续稀释方案在8个浓度(10μM至0.003μM)下测试。本发明的所有实施例化合物均显示IC50<0.1μM。例如，实施例1的IC50为0.015μM，这表示该化合物是强效IKKβ抑制剂。
或者，使用Z'-LYTETM测定试剂盒-Ser/Thr5肽(Invitrogen,Cat.No.PV3178)在体外进行IKKβ激酶测定法。所有反应(20μl)均是通过加入0.8μL在DMSO中的测试化合物溶液、10μL激酶/肽混合物或磷酸-肽溶液(Invitrogen,Cat.No.PV3219，用1.33x激酶缓冲液稀释)、5μL1.33x激酶缓冲液(Invitrogen,Cat.No.PV3189，用蒸馏水稀释5倍)或ATP溶液(5μM)和4.2μL蒸馏水开始的。将384孔板(Corning,Cat.No.3575)混合并于室温孵育1小时。然后将10μL显影溶液[显影试剂B(Invitrogen,Cat.No.PV3296)/显影缓冲液(Invitrogen,Cat.No.PV3127)=1:128]加至各孔中，混合并于室温再孵育1小时。然后通过加入10μL终止试剂(Invitrogen,Cat.No.PV3094)停止激酶反应，用Wallac1420VICTOR3Multilabel计数仪(PERKIN ELMERTM)于445nm和520nm荧光下对板进行读数。本测定法的MSR为2.14。化合物是使用1:3连续稀释方案在8个浓度(10μM至0.003μM)下测试的。实施例2的IC50为0.058μM。此结果证明实施例2也是强效IKKβ抑制剂。
细胞生存力试验
为了体外评价化合物的生物学活性，使用细胞生存力试验，其中IKKβ受体在细胞存活和增殖中发挥重要作用。一旦IKKβ通路被抑制剂阻断，则细胞会经历细胞凋亡或死亡。细胞生存力试验提供关于用IKKβ抑制剂处理后细胞存活的信息。
BxPC-3细胞(ATCC#CRL-1687;人胰腺癌细胞系)在补充有10%胎牛血清(FBS)(Gibco#10099-141)的罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI)1640培养基(Gibco#A10491-01)中生长。Skov3-luc细胞(ATCC,人卵巢癌细胞系)在补充有10%FBS(Gibco#10099-141)的McCoy's5a培养基(Gibco#16600)中生长。为了测试化合物，在处理前20小时，将BxPc-3和Skov3-Luc细胞在100μL上述针对每种细胞系规定的相应培养基中分别以2000个细胞/孔和5000个细胞/孔接种于96孔板中。在0.5%DMSO存在下以8种不同浓度的测试化合物处理细胞72小时。通过加入20μL单溶液试剂(CELLTITERAqueous One Solution Cell Proliferation Assay,Promega#G3580)测定各孔中的细胞死亡。于37℃孵育2-4小时后，用微孔板读数器测量492nm下的光学密度。测试化合物对细胞生存力的抑制作用通过与在没有测试化合物存在下处理的对照细胞相比较来确定。
对于化合物与其它抗肿瘤药的组合研究，在处理前20小时，将BxPc-3和Skov3-Luc细胞在100μL上述针对每种细胞系规定的相应培养基中分别以2000个细胞/孔和5000个细胞/孔接种于96孔板中。以多个浓度的测试化合物处理细胞30分钟，然后再与5ng/mL TNFα或0.15-0.6μM VCR(硫酸长春新碱)接触72小时。通过加入20μL单溶液试剂(CELLTITERAqueousOne Solution Cell Proliferation Assay,Promega#G3580)测定各孔中的细胞死亡。于37℃孵育2-4小时后，用微孔板读数器测量492nm下的光学密度。测试化合物对细胞生存力的抑制作用通过与在没有测试化合物存在下处理的对照细胞相比较来确定。例如，具有实施例1的组合研究的结果详细记述在表2中。当实施例1与TNFα或VCR组合时在抑制Bxpc-3和Skov3肿瘤细胞生长方面显示出协同作用(实施例1的作用被增强或放大，参见表2—在Bxpc-3细胞系中：单独的实施例1(2.5μM)，-16.48%抑制；单独的TNFα(5ng/mL)，5.73%抑制；TNFα(5ng/mL)+实施例1(2.5μM)，87.75%抑制，还是在Bxpc-3细胞株中：单独的实施例1(25μM)，11.5%抑制；单独的长春新碱(0.15μM)，5.73%抑制；长春新碱(0.15μM)+实施例1(25μM)，80.25%抑制)。该数据证明了实施例1与TNFα或VCR组合在治疗卵巢癌或胰腺癌中的疗效。
表2.实施例1与其它抗癌药的组合使用
U87MG异种移植物中TNFα基因表达的抑制
TNFα刺激IKKβ信号发送并引发TNFα基因表达。为了确证化合物在体内靶向于IKKβ，我们针对其抑制U87MG(人成胶质细胞瘤细胞系)异种移植物中TNFα诱导的TNFα基因表达的能力对化合物进行了筛选。将3×106个U87MG肿瘤细胞皮下植入雌性Balb/c无胸腺裸小鼠(6-8周龄)的右侧胁腹。10-12天后，当肿瘤体积达到200-300mm3时，将动物随机分为下面的组：对照组(非-TNFα刺激)；模型组(TNFα刺激)；测试化合物处理组：10、30、60和100mg/kg(具有TNFα刺激)。在收集肿瘤前2小时给裸小鼠口服施用测试化合物。在收集肿瘤前1小时以8μg/kg静脉内注射TNFα(R&D,Cat：210-TA)。
用mini KitCat:74126)提取总RNA。用HighCapacity cDNA逆转录试剂盒(ABI,Cat:4368813)合成cDNA。在7500实时PCR系统(Applied Biosystems)中使用相应的用于人GAPDH基因(ABIHs99999905_m1)和人TNFα基因(ABI Hs00174128_m1)的引物/探针以及ABgene Absolute QPCR ROX2X Master Mix(AB-1139/B)进行定量实时PCR。
将TNFα基因表达相对于β-肌动蛋白基因表达归一化。从PCR机器上读取基因计数。抑制(%)=(模型组计数-处理组计数)/(模型组计数-对照组计数)×100%。实施例1的结果详细记述在表3中。实施例1剂量依赖性地抑制U87MG异种移植物中TNFα诱导的TNFα基因表达。
表3.实施例1对U87MG异种移植物模型中TNFα诱导的TNFα基因表达的作用
组别 抑制率(%)
对照组(无TNFα) -
模型组(具有TNFα) -
实施例1—10mg/kg—2h 49.1
实施例1—30mg/kg—2h 68.5
实施例1—60mg/kg—2h 86.2
实施例1—100mg/kg—2h 94.9
实施例2的结果详细记述在表4中，实施例2剂量依赖性地抑制U87MG异种移植物中TNFα诱导的TNFα基因表达。
表4.实施例2对U87MG异种移植物模型中TNFα诱导的TNFα基因表达的作用
组别 抑制率(%)
对照组 -
模型组 -
实施例2—3mg/kg 10.7
实施例2—10mg/kg 25.3
实施例2—30mg/kg 69.7
实施例2—60mg/kg 87.8
实施例1和实施例2的结果证明U87MG异种移植物中TNFα诱导的TNFα基因表达的抑制是剂量依赖性方式。
在人卵巢癌SKOV-3x-FF-luci异种移植物中的抗肿瘤作用
将SKOV-3x-FF-luci人卵巢癌细胞系(ATCC)在含有10%胎牛血清(FCS)的McCoy's5a培养基中进行培养。给雌性Balb/c nu/nu小鼠(6-8周龄)腹膜注射0.2mL含有2×106个细胞的细胞混悬液。细胞植入后6天将小鼠分为五组。给动物口服施用剂量为60、90和150mg/kg的测试化合物，连续施用21天，施用方案是每天两次(bid)或每天三次(tid)。给对照组的小鼠施用溶媒(pH2.1的10%阿拉伯胶,bid)。在处理结束时，将所有小鼠用CO2安乐死，剥离并收集腹腔、膈肌、肠系膜、肝、脾和卵巢中的肿瘤，将其放在一起，测量它们合并后的重量。估算肿瘤重量和抑制率(IR)的结果。抑制率用下式计算：IR(%)=(对照组的肿瘤重量–药物处理组的肿瘤重量)/对照组的肿瘤重量×100%。实施例1的结果详细记述在表5中。在60mg/kg(tid)的口服剂量下实施例1在裸小鼠中显著抑制人卵巢肿瘤生长(P<0.01,Student T检验)，IR为76.31%。该数据证明了实施例1在治疗卵巢癌中的疗效。
表5.在裸小鼠中实施例1对SKOV-3x-FF-luci肿瘤生长的作用
或者，在裸小鼠中就其对人卵巢癌SKOV-3x-FF-luci的肿瘤生长的抗肿瘤作用评估测试化合物。将SKOV-3x-FF-luci细胞系(ATCC)在含有10%胎牛血清的McCoy's5a培养基中进行培养。给雌性Balb/c nu/nu小鼠(6-7周龄)腹膜注射0.2mL含有2×106个细胞的细胞混悬液。细胞植入后6天将小鼠随机化并分为四组。给动物口服施用剂量为30和100mg/kg的测试化合物，每天两次，连续施用23天。给对照组的小鼠施用溶媒(10%阿拉伯胶)，每天两次。给阳性对照组的小鼠经尾静脉注射顺铂(4mg/kg)，每周一次。在处理结束时，将所有小鼠用CO2安乐死，剥离并收集腹腔、膈肌、肠系膜、肝、脾和卵巢中的肿瘤结节，将其合并以测量重量。抑制率：IR%=(对照组的肿瘤重量–药物处理组的肿瘤重量)/对照组的肿瘤重量×100%)。实施例2在30mg/kg和100mg/kg的剂量下分别显示出59.3%和93.9%的肿瘤抑制率(IR)。在单一药物疗法中，实施例2也抑制了SKOV-3x-FF-luci肿瘤生长。该数据证明了实施例2在治疗卵巢癌中的疗效。
在人结肠癌HT-29异种移植物中的抗肿瘤作用
已经报道IKKβ抑制剂与CPT-11组合时抑制HT-29肿瘤生长(LagadecP,Griessinger E,Nawrot MP等人.Br.J.Cancer(2008)98,335–344)。然后检查了所述化合物与CPT-11组合在人结肠癌HT-29异种移植物中的抗肿瘤作用。基本如文献(Lagadec P,Griessinger E,Nawrot MP等人.Br.J.Cancer(2008)98,335–344)中报道的方法所述测试所述化合物在共同施用/不共同施用CPT-11的情况下在人结肠癌HT-29异种移植物中的抗肿瘤作用。
HT-29人结肠直肠腺癌细胞系是由ATCC获得的，将其在含有10%胎牛血清(FCS)的McCoy's5a培养基中进行培养。给雄性Balb/c nu/nu小鼠(6-7周龄)在右侧胁腹皮下注射0.1mL含有3×106个细胞的细胞混悬液。细胞植入后7天，将小鼠随机分为六组。以60和20mg/kg的剂量每天两次口服施用测试化合物。每周两次腹膜施用20mg/kg的CPT-11。在组合处理中，在施用测试化合物后1h给予CPT-11。给对照组的小鼠每天两次口服施用溶媒(pH2.1的10%阿拉伯胶)；和每周两次腹膜给予盐水。用数字游标卡尺每周三次测量肿瘤的两个正交直径。在处理期间用下式测量和记录肿瘤体积(TV)：TV=长×宽2/2。通过下面的方程计算绝对肿瘤体积的肿瘤生长抑制(TGI)：TGI=[1-(Vt-V0)药物处理组/(Vt-V0)溶媒对照组]×100%，其中V0是第0天(分组的那天)的肿瘤体积，Vt是测量第t天的肿瘤体积。在下列条件下将小鼠安乐死：1)研究结束时(第66天)；2)个别TV>4000mm3；3)个别肿瘤破溃。作为单一药物的实施例1在60或20mg/kg,p.o.下不抑制HT-29肿瘤的生长，但是当与CPT-11(20mg/kg,i.p.)组合时，实施例1在这些剂量下增强CPT-11的抗肿瘤作用(P<0.05，Student T检验)。
与CPT-11组合的实施例1在人结肠癌HT-29异种移植物模型中显示出了抗肿瘤作用，这表明实施例1在肿瘤抑制中发挥作用。该数据证明了实施例1与CPT-11组合在治疗结肠癌中的疗效。
与长春新碱(VCR)一起在SKOV-3x-FF-luci异种移植物中的抗肿瘤作用
为了扩展抗肿瘤谱，探索了更多的组合测试。基于实施例1与VCR的体外协同作用，在存在/不存在VCR的情况下在SKOV-3x-FF-luci异种移植物中测试了化合物的抗肿瘤作用。将SKOV-3x-FF-luci人卵巢癌细胞系(ATCC)在含有10%FCS的McCoy's5a培养基中进行培养。给雌性Balb/cnu/nu小鼠(6-7周龄)腹膜注射0.2mL含有2×106个细胞的细胞混悬液。细胞植入后6天，将小鼠随机分为九组。以60mg/kg(连续施用20天)或90mg/kg(施用2天、停止5天的给药方案)的剂量每天两次口服施用测试化合物。每周一次经尾静脉注射施用1或0.3mg/kg的VCR。在组合组中，施用测试化合物后1h给予VCR。给对照组的小鼠施用口服溶媒(pH2.1的10%阿拉伯胶)和腹膜内注射盐水。在处理结束时，将所有小鼠用CO2安乐死，用手术剪刀收集腹腔、膈肌、肠系膜、肝、脾和卵巢中的肿瘤并称重。在次最佳剂量下，VCR抑制肿瘤生长38%；实施例1在60mg/kg和90mg/kg下分别抑制肿瘤生长42%和36%。在组合组中，肿瘤生长被抑制76%和74%。与单一药物治疗相比，发现在组合治疗和单一药物治疗之间存在统计学显著性差异。因此，实施例1与VCR组合时显示出了协同作用，这表明当与不同的化疗药组合时实施例1具有较宽的抗肿瘤谱。该数据还特定地证明了实施例1与VCR组合在治疗卵巢癌中的疗效。
脂多醣(LPS)诱导的血浆小鼠细胞因子产生模型
为了评价化合物对炎症的体内抑制作用，就其抑制LPS诱导的血浆细胞因子产生的能力对化合物进行了筛选。
在这些实验中使用Balb/c小鼠(雌性，体重18-20g)。在用LPS(0.4mg/kg)处理的小鼠中进行了测试化合物的剂量依赖性、时程研究和药动学/药效学相关性研究。通过口服管饲法给8只小鼠/组施用1-100mg/kg测试化合物(在10%阿拉伯胶中的混悬液)或溶媒，1小时后腹膜内注射0.4mg/kgLPS。施用LPS后90分钟，在含有肝素以抗凝的试管中采集血液样品。将血浆样品用稀释缓冲液(R&D,Cat.No.Part895206,Calibrator DiluentRD5Z)稀释3倍。根据生产商的方案使用ELISA试剂盒(R&D,Cat.No.MTA00)测量TNFα水平。用M2e Plus酶标仪读取数据，通过标准曲线拟合对数据进行分析。实施例1在10mg/kg下显著抑制TNFα的产生，使其从基线2346.2pg/mL降至1474.9pg/mL(p<0.01)，抑制37.1%。
或者，根据文献(Ziegelbauer K,Gantner F,Lukacs NW等人,Br J.Pharmacol.2005,145(2):178-92)中报道的方法，就其抑制大鼠血浆中LPS诱导的细胞因子产生的能力对化合物进行筛选。简言之，在实验中使用Lewis大鼠(雄性，体重140g-180g)。通过口服管饲法对动物(8只/组)给予1-100mg/kg测试化合物(在35%Solutol&60%PEG400&5%PG中的混悬液)或溶媒，1小时后腹膜内施用LPS0.4mg/kg。腹膜内施用LPS后90分钟，在肝素抗凝的试管中采集血液以便用R&D System ELISA试剂盒根据该试剂盒的通用方案测量TNFα。将血浆样品用稀释缓冲液稀释100倍，在每次测量中使用50μL稀释的样品。用M2e Plus酶标仪对板进行读数，根据标准曲线对TNFα水平进行分析。用LC-MS-MS测量血浆中的药物水平。实施例2剂量依赖性地抑制血浆TNFα产生，其ED50值为19.8±10.9mg/kg，EC50值为4.042±1.28μg/mL。
或者，就其抑制小鼠血浆中LPS诱导的细胞因子产生的能力对化合物进行筛选。在实验中使用Balb/c小鼠(雌性，体重18-20g)。通过口服管饲法给小鼠(8只/组)施用1-100mg/kg测试化合物(在10%阿拉伯胶中的混悬液)或溶媒，1小时后腹膜内(i.p.)施用LPS(0.4mg/kg)。施用LPS后90分钟，在肝素抗凝的试管中采集血液以便根据试剂盒的通用方案测量TNFα水平(R&D,Cat.No.MTA00)、IL-6(R&D,Cat.No.M6000B)和IL-1β(R&D,Cat.No.MLB00B)。每次测量使用50μL经稀释的或未经稀释的血浆样品。对于TNFα的测量，将血浆样品用稀释缓冲液(R&D,Cat.No.Part895206,Calibrator Diluent RD5Z)稀释3倍；对于IL-6的测量，将血浆样品用稀释缓冲液(R&D,Cat.No.Part895175,Calibrator Diluent RD5T)稀释25倍，对于IL-1β的测量，使用未经稀释的血浆样品。用M2e Plus酶标仪对板进行读数，使用标准曲线对数据进行分析。实施例2剂量依赖性地抑制血浆中TNFα和IL-6的产生，其ED50分别为4.84mg/kg(EC50在2420ng/mL范围内)和15.1mg/kg，但是甚至在100mg/kg剂量下亦未观察到对IL-1β的产生有作用。
实施例1和实施例2被确证在体外均是强效IKKβ抑制剂，且在体内在LPS诱导的细胞因子释放小鼠模型中显示出了显著的活性。
大鼠的LPS诱导的急性关节炎症
关节内施用显性负性IKKβ显著降低大鼠的佐剂诱导的关节炎的严重性(Tak PP等人,Arthritis Rheum.(2001)44(8)1897-1907)。为了进一步研究IKKβ抑制剂对机制相关的关节炎症的作用，基本如文献(Matsukawa A,Yoshimura T,Miyamoto K,Ohkawara S,Yoshinaga M.Lab Invest.1997,76(5):629-38)中报道的方法所述就其抑制大鼠的LPS诱导的关节急性炎症的能力对化合物进行了筛选。简言之，在实验中使用Wistar大鼠(雌性，体重150g-170g)。通过口服管饲法对动物(8只/组)给予1-100mg/kg测试化合物[在35%Solutol(聚乙二醇15羟基硬脂酸酯(Macrogol15Hydroxystearate))&60%PEG400&5%PG(丙二醇)中的混悬液]或溶媒，1小时后用26号针头在每只大鼠的左后膝关节内(i.a.)施用在10μl盐水中的10μg LPS。作为对照，给每只大鼠的右后膝注射10μL盐水。LPS注射后2小时，用100μL盐水灌洗大鼠的各关节。收集滑膜液并于-80℃贮存。将血浆用稀释缓冲液稀释2倍，使用R&D System ELISA试剂盒根据该试剂盒的通用方案用50μL经稀释的样品测量TNFα水平。用M2e Plus酶标仪对板进行读数，使用标准曲线对TNFα水平进行分析。亦通过液相色谱-串联质谱(LC-MS-MS)测量药物水平。实施例2剂量依赖性地抑制关节TNFα产生，其ED50为23.4mg/kg。数据还显示对TNFα产生的抑制作用与药物血浆浓度和关节浓度具有相关性。总体而言，这些数据显示了实施例2的化合物抑制关节炎症。
胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)小鼠模型方案
先前的研究已经证明IKKβ的小分子抑制剂在小鼠CIA模型中有效(Podolin,PL等人,J.Pharm.Exp.Ther.,2005,312:373-381)。另外，具有表达IkBa的显性负性形式的T细胞的小鼠被保护免于发生CIA(Seetharaman R.等人,J.Immunol.1999:163,1577-1583)。这些观察结果提示IKKβ抑制剂在治疗类风湿性关节炎方面可能有效。因此，基本如文献(Rosloniec EF,Cremer M,Kang A,Myers LK.Current Protocols inImmunology.1996,15.5.1-15.5.24)中报道的方法所述在胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)小鼠模型中测试了本发明的化合物。
简言之，在第0天和第21天用经弗氏完全佐剂(Freund's completeadjuvant)(CFA,Sigma,US)乳化的鸡胶原蛋白II(200μg/小鼠)皮内免疫DBA/1小鼠以引发关节炎。使用肉眼评分系统评估关节炎的严重性，其中将各爪被分级为0至4(0=正常，4=整个爪严重肿胀)。用千分尺测量后肢关节厚度。出于预防目的或治疗目的，口服施用测试化合物。对于预防研究，自第1天至第42天每天两次口服施用测试化合物。对于治疗研究，在关节炎发作后开始药物处理，所述关节炎发作通常在第二次免疫后的一周内发生。将小鼠用药物处理21天。
作为阳性对照，每天一次(q.d.)使用10mg/kg/天的来氟米特(LEF)—一种免疫抑制剂。用未接受任何处理的正常动物作为阴性对照。口服施用3、10和30mg/kg bid药物42天。观察到在10和30mg/kg bid(20和60mg/kg/天)下实施例2统计学上显著性地抑制关节肿胀和降低关节炎评分，其ED50为4.3mg/kg。
该数据证明了实施例2在治疗类风湿性关节炎中的疗效。
胶原蛋白II诱导的关节炎(CIA)大鼠模型
为了确证在小鼠CIA模型中获得的结果，还基本如文献(Rosloniec EF,Cremer M,Kang A,Myers LK.Current Protocols in Immunology.1996,15.5.1-15.5.24)中报道的方法所述在大鼠CIA模型中对化合物进行了测试。简言之，将Wistar大鼠在第0天用200μg经弗氏不完全佐剂(IFA,Sigma,US)乳化的牛胶原蛋白II进行皮内免疫，并且在第7天用100μg经IFA(弗氏不完全佐剂)乳化的胶原蛋白II进行皮内免疫。在免疫前和免疫后测量后爪体积。以关节炎评分对四个爪的疾病发展进行定量。用溶媒或药物(处理组)处理正常组和模型组中的大鼠。在第一次免疫后自第1天至第21天给处理组的大鼠口服施用剂量为3、10、30mg/kg(bid)的测试化合物。在LEF组中，作为阳性对照，给大鼠口服施用剂量为10mg/kg,q.d.的LEF。由降低的关节炎评分和后爪体积证明，实施例2在30mg/kg下显著减轻胶原蛋白诱导的关节炎。该数据证明了实施例2在治疗类风湿性关节炎中的疗效。
卵清蛋白(OVA)诱导的小鼠肺部炎症
先前的研究已经证明IKKβ的小分子抑制剂能抑制变应原诱导的小鼠气道炎症和超敏反应(Birrell MA等人,Am J Respir Crit Care Med,2005,172:962-971)。本研究的目的是研究IKKβ抑制剂对变应原诱导的气道炎症的体内模型的作用。
基本如文献(Muriel Pichavant,Sho Goya,Eckard Hamelmann,ErwinW.Gelfand和Dale T.Umetsu.气道致敏动物模型(Animal Models ofAirway Sensitization).Current Protocols in Immunology.(1999)15.18.1-15.18.13)中报道的方法所述在OVA诱导的小鼠肺部炎症模型中测试了本发明的化合物。简言之，通过在第1天和第14天腹膜内注射100μL含有20μg OVA和2mg氢氧化铝的盐水将重量为18-20g的雌性Balb/c小鼠致敏。在第28、29和30天，每天各一次通过用Buxco Mass给药系统雾化1%在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的卵清蛋白(OVA)攻击小鼠20分钟。自第1天至第31天给小鼠口服施用剂量为1mg/kg(qd)的作为阳性对照的地塞米松以及剂量为1、3、10和30mg/kg(qd)的测试化合物。在第32天，用1%的戊巴比妥钠麻醉各组的动物。打开胸腔及腹腔，从离心的样本中收集血浆。然后剥离并横切气管。通过向气管中插入18号导管，将肺用总量为1.5mL的无菌PBS灌洗，然后放入样本容器中。通过离心BAL液获得无细胞的BAL上清液。将所有血清和BAL上清液贮存于-80℃备用。为了进行细胞计数和细胞因子测定，对BAL细胞的细胞离心涂片(cytospin preparation)进行细胞分类计数。采集BAL上清液后，将受体大鼠的肺整体取出，通过气管内注入10%缓冲的福尔马林(在PBS中)将其固定。从受体肺的肺门周区获取3-6个石蜡切片，用苏木素和曙红染色，在光学显微镜下检查以进行病理学研究。
与正常对照相比，OVA显著增加BALF中嗜酸性粒细胞水平(p<0.01)和IL-13水平(p<0.05)。用作阳性对照的剂量为1mg/kg(qd)的地塞米松完全抑制嗜酸性粒细胞数的增加并且使IL-13降低77%。剂量为1、3、10和30mg/kg(bid)的实施例2分别使嗜酸性粒细胞数量降低58.6%、49.3%、94.1%(p<0.05)和90.2%(p<0.05)。剂量为10和30mg/kg的实施例2还使IL-13的产生显著降低73.0%(p<0.05)和85.1%(p<0.01)。另外，苏木素和曙红染色显示用剂量为1-30mg/kg的实施例2和剂量为1mg/kg的地塞米松处理的小鼠的肺部炎症得到改善。
本研究进一步证明了实施例2在治疗哮喘中的疗效。
OVA诱导的Brown-Norway BN大鼠的肺部炎症
为了体内评价IKKβ抑制剂对抗原诱导的气道炎症的作用，还基本如文献(Yamamoto N,Takeshita K,Shichijo M,Kokubo T,Sato M,NakashimaK,Ishimori M,Nagai H,Li YF,Yura T,Bacon KB.J Pharm.Exp Ther.2003;306(3):1174-81)中报道的方法所述在OVA诱导的大鼠肺部炎症模型中对化合物进行了测试。简言之，通过在第1天、第2天和第3天腹膜内注射1mL含有1mg OVA和13mg氢氧化铝的盐水将重量为240-260g的雄性BN大鼠致敏。作为正常对照的大鼠接受1mL盐水，而非OVA。在第20天和第21天给大鼠口服施用剂量为0.3、1、3和30mg/kg(bid)的测试化合物。在第21天，通过Buxco Mass给药系统以1%OVA攻击大鼠15分钟。在第22天，用1%的戊巴比妥钠麻醉大鼠。打开胸腔和腹腔。从离心的样本中收集血浆。剥离并横切气管。通过向气管中插入18号导管，将肺用总量为1.5mL的无菌PBS灌洗，然后放入样本容器中。通过离心BAL液获得无细胞的BAL上清液。将所有血清和BAL上清液贮存于-80℃备用。为了进行细胞计数和细胞因子测定，对BAL细胞的细胞离心涂片进行细胞分类计数。与正常对照相比，OVA显著增加BAL液中的总细胞数和嗜酸性粒细胞数(p<0.01)。实施例2在0.3-30mg/kg下以剂量依赖性方式显著抑制总细胞和嗜酸性粒细胞的增加(p<0.05)，其ED50为0.49mg/kg。本研究进一步证明了实施例2在治疗哮喘中的疗效。
自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠实验模型
在多发性硬化小鼠模型中，NEMO或IKK2(IKKβ)而非IKK1的CNS限制性除去改善疾病病理学(Nature Immunology,2006;7(9),954-61)。这些研究提示IKKβ抑制剂应当在小鼠EAE模型中有效。
基本如文献(Miller SD,Karpus WJ.小鼠的实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse).CurrentProtocols in Immunology.1996,15.1.1-15.1.13)中报道的方法所述，在PLP-139-151诱导的EAE小鼠模型中测试了本发明的化合物。简言之，将雌性SJL/J小鼠用被在CFA(弗氏完全佐剂)中的H37Ra(结核分枝杆菌菌株)(300μg H37Ra)乳化的PLP139-151(200μg/小鼠)皮内免疫。自免疫后第1天起每天两次口服施用剂量为3、10、30mg/kg的测试化合物或溶媒以进行预防研究，或自EAE复发的那天起给药并且在整个疾病过程中持续给药以进行治疗研究。使用地塞米松(1mg/kg,p.o.,q.d.)作为阳性对照。每天进行体重测量和EAE的临床评价。疾病评分遵循以下标准：0，无明显疾病征象；1，尾巴无力或后肢无力，但非两者兼具；2，尾巴无力且后肢无力；3，部分后肢麻痹；4，完全后肢麻痹；5，垂死状态或死亡。自第11天起，经PLP139-151免疫的小鼠出现与EAE相关的临床症状及体重下降。EAE评分迅速升高且在第15天达到最高水平。在大约第20天EAE评分出现下降。然后出现自发性复发(模型组)。在使用实施例2的药物组中，升高的与EAE相关的临床评分以剂量依赖性方式下降。使用剂量为10mg/kg和30mg/kg的实施例2体重下降得到改善。剂量为3、10和30mg/kg的实施例2降低EAE临床评分，其ED50为3.7mg/kg。本研究证明了实施例2在治疗多发性硬化中的疗效。
二硝基苯磺酸(DNBS)诱导的大鼠结肠炎
IKKβ参与调节多种对炎症性肠病(IBD)的发病很关键的促炎性蛋白质的表达。因此，IKKβ激酶是开发治疗IBD的新药的一个有前景的靶标。
基本如文献(Gut.2002;50(3):440-1)中报道的方法所述，在DNBS诱导的结肠炎大鼠模型中对化合物进行了测试。简言之，在实验中使用Wistar大鼠。通过结肠内滴注DNBS引起远端结肠炎后，给大鼠口服施用剂量为3、10、30、60mg/kg(bid)的测试化合物6天。阴性对照组不进行DNBS滴注，仅用溶媒处理。溶媒对照组大鼠经DNBS诱发且用溶媒处理。在阳性对照组中，给大鼠以每天300mg/kg口服施用柳氮磺吡啶，连续施用6天。在末次处理后24小时，对动物实施安乐死。计算各动物的结肠重量/体重比和结肠损害评分。用溶媒处理大鼠导致临床症状的进行性恶化，在滴注后第7天达到结肠损害评分的最大值(6.1±0.6)和结肠重量/体重比-结肠长度的最大值(0.96±0.10)。在本DNBS诱导的炎症性肠病模型中，用剂量为3、10、30和60mg/kg的实施例2处理的大鼠显示出结肠损害评分、结肠重量/体重/结肠长度比的大于30%降低的明显降低。3-60mg/kg/天的实施例2的作用与300mg/kg/天的柳氮磺吡啶的作用类似。
本研究证明了实施例2在治疗炎症性肠病中的疗效。
本发明的化合物优选被配制成通过各种途径施用的药物组合物。最优选地，这类组合物用于口服施用或静脉内施用。这类药物组合物及其制备方法在本领域中是公知的。参见例如REMINGTON:THE SCIENCE ANDPRACTICE OF PHARMACY(D.Troy等人编辑,第21版,LippincottWilliams & Wilkins,2005)。
一般而言，本发明的化合物在宽的剂量范围内有效。例如，每天的剂量通常在约0.05—约500mg/kg体重范围内。在一些情况下，低于上述范围下限的剂量水平可能已足够，而在另一些情况下还可使用更大剂量而不引起任何毒副作用，因此上述剂量范围不旨在以任何方式限制本发明的范围。应当理解的是，实际施用的化合物的量将由医师根据相关情况确定，所述情况包括待治疗的病症、所选择的施用途径、所施用的具体的一种或多种化合物、个体患者的年龄、体重和响应性，以及患者症状的严重程度。

Claims (18)

1.下式的化合物：
或其可药用盐。
2.权利要求1的化合物或其可药用盐，其是2-{5-氯-2-[(1R,2R)-2-羟基环戊基氨基]嘧啶-4-基}-N-环丙基-1H-吲哚-4-甲酰胺。
3.权利要求1的化合物或其可药用盐，其是2-{5-氯-2-[(1R,2S)-2-羟基环戊基氨基]嘧啶-4-基}-N-环丙基-1H-吲哚-4-甲酰胺。
4.药物组合物，其包含权利要求1-3中任意一项的化合物或其可药用盐以及与之组合的一种或多种可药用的载体、稀释剂或赋形剂。
5.权利要求4的药物组合物，其进一步包含一种或多种其它治疗剂，其中所述的治疗剂是TNFα或长春新碱。
6.权利要求1-3中任意一项的化合物或其可药用盐在制备药物中的用途，所述药物用于治疗哺乳动物的炎性疾病，所述的炎性疾病选自类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、多发性硬化和炎症性肠病。
7.权利要求6的用途，其中所述的炎性疾病是类风湿性关节炎。
8.权利要求6的用途，其中所述的炎性疾病是慢性阻塞性肺疾病。
9.权利要求6的用途，其中所述的炎性疾病是哮喘。
10.权利要求6的用途，其中所述的炎性疾病是多发性硬化。
11.权利要求6的用途，其中所述的炎性疾病是炎症性肠病。
12.权利要求1-3中任意一项的化合物或其可药用盐在制备药物中的用途，所述药物用于治疗哺乳动物的癌症，所述的癌症选自多发性骨髓瘤、结肠癌、大细胞肺癌、成胶质细胞瘤、胰腺癌和卵巢癌。
13.权利要求12的用途，其中所述的癌症是多发性骨髓瘤。
14.权利要求12的用途，其中所述的癌症是结肠癌。
15.权利要求12的用途，其中所述的癌症是大细胞肺癌。
16.权利要求12的用途，其中所述的癌症是成胶质细胞瘤。
17.权利要求12的用途，其中所述的癌症是胰腺癌。
18.权利要求12的用途，其中所述的癌症是卵巢癌。
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