TWI382045B - An immobilized metal affinity film and a preparation method thereof, a metal-mismatched film prepared therefrom and an immobilized enzyme film - Google Patents

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固定化金屬親和薄膜及其製備方法、由其製得之金屬錯合膜以及固定化酵素膜
本發明是有關於一種固定化金屬親和薄膜(immobilized metal affinity membrane,IMAM)，特別是一種固定化金屬親和薄膜及其製備方法、由其製得之金屬錯合膜以及固定化酵素膜。
酵素通常是水溶性蛋白質，容易因保存、操作等條件造成失活，使用後之回收困難，於是發展出以物理或化學方法將酵素結合於載體(carrier)上，使得酵素經固定化後對熱、pH值等的穩定性提高，並能增加反覆和連續使用性，可提高使用效率、降低使用成本。其中，固定化金屬親和層析(immobilized metal affinity chromatography,IMAC)技術是利用固定於固體載體上的金屬離子(通常為第一列的過渡金屬元素)，與酵素結構中的特定胺基酸(如組胺酸(histidine)、半光胺酸(cysteine)、色胺酸(tryptophan)等)產生親和吸附，藉此以單一步驟將所需之酵素純化出來，並可同時達到酵素固定化之目的。但其缺點為價格貴、機械強度低、填充管柱會有高壓降等，故逐漸發展出可改進上述缺點的固定化金屬親和薄膜分離程序，此程序具備操作與維護容易、設備簡單、所需能源小和擴充容易等優點，為一相當受矚目的技術。
Arica等人於Journal of Molecular Catalysis 2004,27,p.255揭示將酪胺酸酶(tyrosinase)固定於poly(HEMA-co-GMA)-PEI-Cu(II)[即甲基丙烯酸-2-羥基乙酯(2-hydroxyethyl methacrylate,HEMA)與甲基丙烯酸環氧丙酯(glycidyl methacrylate,GMA)之共聚物表面接上聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)後再螯合銅離子(Cu2+ )]之金屬親和薄膜上而得到一固定化酵素膜，在經過120小時後固定的酵素活性可維持原來活性的85%，而在3個月後則僅保有原來活性的46%(即固定的酵素之穩定性不佳)。另外，Mateo等人於期刊Enzyme and Microbial Technology 2000,26,p.509揭示酵素與金屬離子以產生共價鍵結的方式可使得固定的酵素具有較佳的穩定性和保存性，但其形成的固定化酵素膜則須於鹼性(pH=10)環境下進行培育(incubation)，並且耗時(於18℃下培育76小時)。
本案發明人致力於發展應用IMAM進行酵素固定化之技術，如其於期刊Journal of Chromatography B ,2003,794,p.67、Journal of membrane Science 2007,298,p.24發表以再生纖維素薄膜(regenerated cellulose-based membrane,RC膜)為固體載體，並使用環氧氯丙烷(epichlorohydrin,EPI)及亞胺二乙酸(Iminodiacetic acid,IDA)改質薄膜可得到一固定化金屬親和薄膜，接著以此薄膜螯合銅離子並用以純化醱酵液中的青黴素G醯化酶(penicillin G acylase,PGA)，其中PGA酵素為一重要性之生物觸媒，其功能為進行青黴素G水解以生產抗生素原料藥之六青黴素酸(6-aminopenicillanic acid,6-APA)，雖然此薄膜可用來螯合銅離子及固定PGA酵素，但其螯合量及固定量都不高。
現行製備固定化金屬親和薄膜的方法，大多為單步驟於固體載體(即薄膜)表面上同時進行活化與改質，以形成高反應性的活化官能基(如環氧基)，之後再與螯合劑反應以形成螯合基，使得IMAM表面可螯合金屬離子。該固體載體可藉由螯合之金屬離子與酵素之蛋白質結構上的特定胺基酸產生配位鍵結，並吸附酵素於其表面上。但因活化反應物於固體載體上之作用形式為一兩相反應(即固、液兩相)，其活化反應效率往往不高，若要提高表面上螯合基的含量以增進吸附酵素的密度與穩定性，則相對地需提高活化反應物的量與反應時間，此將造成製備成本的負擔，因此，如何有效改善前述問題，以製備高酵素吸附力的固定化金屬親和薄膜，以應用於工業上之酵素固定化上，將可大大提昇此薄膜於工業上的應用性。
因此，本發明之第一目的，為提供一種固定化金屬親和薄膜之製備方法，包含之步驟為：
(a)令一表面具有羥基之薄膜與一鹼液於一相轉移催化劑存在下進行反應，以取得一活化膜；
(b)在一兩性溶劑的存在下，令該活化膜與一環氧化物相反應，使該活化膜的表面具有多個環氧基；以及
(c)令該具有多個環氧基之活化膜與一含有螯合劑且pH值範圍介於10~14之間的水溶液相反應，進而製得一表面具有多個可螯合金屬離子的螯合基之固定化金屬親和薄膜。
本案發明人將薄膜表面活化官能基的改質反應以二步驟方式進行，先使用一鹼液於一相轉移催化劑存在下活化一表面具有羥基之薄膜以形成表面具有-O- 活化基的活化膜，其活化效果佳，之後使該活化膜與一環氧化物於一兩性溶劑中進行反應，該兩性溶劑的作用可促使相較之下分別為親水性的薄膜表面-O- 活化基與溶劑中的疏水性環氧化物進行反應，以提高其反應率；另一方面，亦能避免習知單步驟進行活化與改質時，形成於膜表面上的環氧基易遭到鹼液破壞而成為醇基的問題，因此，以此二步驟方式可以提高膜表面活化基的密度並顯著地減少活化反應物的使用量。該等環氧基接著再與具有活性氫及可螯合金屬離子之孤電子對的螯合劑進行開環接枝反應，其中，該螯合劑的活性氫會促使該等環氧基開環並與該螯合劑形成共價鍵結，而形成多個螯合基於薄膜表面，進而製得一固定化金屬親和薄膜。
本發明之第二目的，為提供一種固定化金屬親和薄膜，係由上述之方法所製得，且以該薄膜的單位面積計算，該等螯合基可螯合銅離子的量是介於4.0~4.6μmole/cm2 之間。
本發明之第三目的，為提供一種金屬錯合膜，係由上述之固定化金屬親和薄膜螯合金屬離子後所製得，且當被螯合在該固定化金屬親和薄膜之金屬離子為銅離子時，以該金屬錯合膜的單位面積計算，其膜表面具有的銅離子螯合量是介於4.0~4.6μmole/cm2 之間。
本發明之第四目的，為提供一種固定化酵素膜，係由上述之金屬錯合膜固定酵素後所製得，且當被固定在該金屬錯合膜上的酵素為青黴素G醯化酶時，以該固定化酵素膜的單位面積計算，其膜表面具有的青黴素G醯化酶的酵素活性是介於0.1~1.04IU/cm2 之間。
該固定化金屬親和薄膜(IMAM)藉著表面上具有多個可螯合金屬離子的螯合基，經螯合金屬離子後所形成的金屬錯合膜可進一步螯合多個酵素分子以進行酵素的固定化，並可得一酵素分子的固定量顯著提高的固定化酵素膜。
本發明固定化金屬親和薄膜及其製備方法、由其製得之金屬錯合膜及固定化酵素膜的功效在於：藉由本發明之製備方法可提昇環氧化物與螯合劑於薄膜表面之反應率，具有極優異的接枝效果，以該方法所製得之固定化金屬親和薄膜可螯合的金屬離子量較傳統之IMAM多且密度高，亦使得由其製得之金屬錯合膜及固定化酵素膜具有較高的金屬離子螯合量及酵素固定量，且經固定的酵素之活性隨時間及使用次數的增加可維持一定，以增加固定酵素的穩定性，並擴展此固定化金屬親和薄膜的用途及其使用效能。
有關本發明之前述及其他技術內容、特點與功效，在以下將進一步於實施方式與其等之實施例的詳細說明中，將可清楚的呈現。
較佳地，本發明之固定化金屬親和薄膜之製備方法中，該步驟(a)的相轉移催化劑是擇自於溴化四丁銨(tetrabutylammonium bromide,TBAB)、甲基三辛基氯化銨(methyl trioctyl ammonium chloride)、苄基三乙基氯化銨(benzyltriethylammonium chloride,BTEAC)，或此等之一組合。
較佳地，以該表面具有羥基之薄膜之單位面積計，該相轉移催化劑之用量是介於0.01~0.05g/cm2 之間。
較佳地，該步驟(a)之鹼液是擇自於氫氧化鈉水溶液、氫氧化鉀水溶液、氫氧化鋰水溶液，或此等之一組合。
較佳地，該步驟(a)的反應溫度是介於25~80℃之間。更佳地，該反應溫度是40℃。
較佳地，該步驟(b)的環氧化物是由下式(I)所示，
於式(I)中，R1 表示經取代或未經取代之C1 ~C3 伸烷基；Y表示鹵素。
更佳地，該環氧化物是環氧氯丙烷。
較佳地，以該表面具有羥基之薄膜之單位面積計，該環氧化物之用量是介於1.1~2.2mole/cm2 之間。
較佳地，該步驟(b)的兩性溶劑是選自於四氫呋喃(tetrahydrofuran,THF)、二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide,DMSO)、經取代或未經取代之C3 ~C6 醚類(ether)、C3 ~C6 亞碸(sulfoxide)，或此等之一組合。
較佳地，該步驟(b)的反應溫度是介於25~60℃之間。更佳地，該反應溫度是40℃。
較佳地，該步驟(c)的螯合劑是擇自於亞胺二乙酸、氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid,NTA)、三羧甲基乙二胺(N,N,N-tri(carboxymethyl)ethylene diamine,TED)、四伸乙五胺(tetraethylenepentamine,TEPA)、羧甲基天冬氨酸(carboxymethylaspartic acid,CM-Asp)、三嗪(triazine)類染料如下式所示之活性紅(C32 H19 ClN8 Na4 O14 S4 ,Cibacron Brilliant Red 3B-A)、如下式所示之活性藍(C29 H20 ClN7 O11 S3 ,Cibacron Blue F 3GA)，或此等之一組合。
更佳地，該螯合劑是亞胺二乙酸。
該固定化金屬親和薄膜之製備方法的步驟(a)之薄膜材質可擇自於纖維素、葡萄聚糖、瓊脂糖、幾丁質、幾丁聚醣、聚醯胺、聚碳酸酯、聚羥乙基甲基丙烯酸酯、聚碸、聚乙烯醇、聚丙烯酸環氧烷、樹脂、矽膠、玻璃、、此等之衍生物、此等之摻合物或此等之共聚物。較佳地，該薄膜材質是再生纖維素。
較佳地，該薄膜為一多孔洞性薄膜，且具有之孔洞的平均直徑範圍是介於10nm~10μm之間。更佳地，該多孔洞性薄膜之孔洞平均直徑是450nm。
較佳地，本發明之金屬錯合膜表面具有之螯合的金屬離子種類是擇自於Cu2+ 、Ni2+ 、Zn2+ 、Co2+ 、Mn2+ 、Ca2+ 、Fe3+ 、Al3+ 、Yb3+ ，或此等之一組合。
較佳地，本發明之固定化酵素膜表面具有之固定的酵素種類是擇自於氧化還原酶、轉移酶、裂解酶、異構酶、連接酶、脫羧酶、羧化酶、醯化酶、縮醛酶、硫解酶或合成酶。更佳地，該固定的酵素是青黴素G醯化酶或溶菌酶(lysozyme)。
實施例
本發明將就以下實施例來作進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為本發明實施之限制。
＜化學品及材料來源＞
1.再生纖維素薄膜：購自於Sartorius，型號為18406-47-N。
2.六青黴素酸：購自於Sigma。
3.青黴素G醯化酶：購自於MDBio。
4.環氧氯丙烷：購自於Tedia。
5.亞胺乙二酸：購自於Acros Organics。
6.伸乙二胺四乙酸：購自於Tedia。
＜測試方式＞以下為下列實施例或應用例中用以測試本發明之固定化金屬親和薄膜的各項特性之測試條件與步驟。
[銅離子螯合量]
將待測之固定化金屬親和薄膜置入濃度為25mM的25mL硫酸銅水溶液中，在18℃下靜置反應1小時，可得到一金屬(銅離子,Cu2+ )錯合膜，以載入緩衝液(loading buffer,即濃度10mM之磷酸鈉緩衝液,pH=6)沖洗三次，置入濃度為0.1M的10mL EDTA水溶液中靜置1小時，以將銅離子從薄膜上螯合下來而得一Cu2+ -EDTA水溶液，利用UV-VIS分光光譜儀(Metertek，型號為SP-830)在波長800nm下測其吸光值，並代入校正曲線中以計算出銅離子在待測薄膜上之螯合量。
[酵素固定量]
取待測之固定化金屬親和膜進行銅離子螯合所得到之金屬錯合膜置入玻璃瓶內再加入以載入緩衝液稀釋之25mL酵素液(濃度為4000μg/mL)，於25℃下進行酵素吸附反應1小時，再用4℃之去離子水清洗三次，每次約30秒，以洗去表面可能附著的不特定吸附(nonspecific adsorbed)酵素之後，接著使用10mL沖提液(elution buffer,含濃度2M氯化鉀之0.1M磷酸鉀緩衝液,pH=4.8)進行酵素脫附反應1小時，所得之溶液使用布拉福法(Bradford method)以分光光譜儀在波長595nm下測其吸光值，並以牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)為參考蛋白質作校正曲線測定之。
[固定酵素之活性]
取待測試之酵素膜加入9mL磷酸鹽緩衝溶液(pH=8)於37℃下培養，並取1mL之2%青黴素G液加入該培養溶液中進行批次反應，於反應0分鐘與10分鐘之時間點各取樣0.5mL之後，將待測液分別加入3mL之混合水溶液(體積比為2:1的20%醋酸與0.05M氫氧化鈉水溶液)與0.5mL之的甲醇溶液[含0.5%的對-二甲基胺基苯甲醛(p-dimethylamino benzaldehyde,DAB)]，於室溫下靜置15分鐘，之後利用UV-VIS分光光譜儀於波長415nm分別測其吸光值。當固定的酵素為PGA時，在37℃及pH=8.0之反應條件下，1單位活性(IU)的PGA每分鐘可與青黴素G反應生成1μmole之六青黴素酸[即PGA活性：1IU=1μmole 6-APA/min]，故將上述反應10分鐘之待測液的吸光值減去反應0分鐘之待測液的吸光值，再代入6-APA標準品之校正曲線中，可得到單位酵素液體積之固定PGA的活性(IU/mL)。
[固定酵素之穩定性]
將下述應用例製備所得之酵素膜保存並每天取出一次以量測膜上之酵素活性，經過前10天的測試後，接著每5天量測一次酵素活性，並記錄酵素膜因天數及測試次數的增加所造成的變化。
<實施例1>固定化金屬親和薄膜之製備
詳細的步驟為：
(1)取一多孔洞性的圓形再生纖維素薄膜(RC膜)放入一玻璃試瓶中，加入含有0.2g溴化四丁銨之10mL 1.4M氫氧化鈉水溶液並以150rpm之轉速震盪，於40℃下進行活化反應2小時，可得到一活化膜；其中，該再生纖維素薄膜每片(disc)之直徑為47mm(即面積為17.32cm2 )，厚度為160~200μm，孔洞平均直徑為450nm，乾重為153mg，即溴化四丁銨的用量相對於薄膜之面積比例為0.01g/cm2 (膜面積)。
(2)取出該活化膜並放入另一玻璃試瓶中，加入含有環氧氯丙烷(EPI,3mL)的10mL四氫呋喃(THF)，以150rpm之轉速震盪，於40℃下反應2小時，可得到一帶環氧基薄膜，其表面形成之官能基表示為RC-EPI；其中，環氧氯丙烷的用量相對於薄膜之面積比例為1.1mol/cm2 。
(3)將此具有多個環氧基之薄膜以4℃之去離子水清洗三次(每次約30秒)，置入含有1M亞胺乙二酸(IDA)、1M碳酸鈉的25ml水溶液中(pH=11)，以120rpm之轉速震盪，於24℃下反應12小時。
(4)反應完後之薄膜，利用4℃去離子水及5vol.%之醋酸水溶液交互清洗兩次(每次約30秒)，即可製得一固定化金屬親和薄膜，其表面形成之可供螯合金屬離子的官能基表示為RC-EPI-IDA。
將上述實施例1於各步驟反應所得之薄膜表面以元素分析儀(elemental analyzer,EA,購自於HORIBA ATS，型號為EMGA-920)、X光能量散譜儀(X-ray energy dispersive spectrometer,EDS,OXFORD INCA ENERGY 350)進行表面之元素組成分析並各步驟之官能基接枝率[%,即接枝官能基測得量(μmole/disc)除以反應前之總官能基量(μmole/disc)所得的百分率]，之後並進行銅離子螯合量測試與螯合率(%)，與依習知之論文所揭示的IMAM研究結果的測試結果作一比較並計算其倍率，如下表1所示。可看出以本發明之製備方法進行薄膜之改質，可改進習知技術未能達到之表面官能基接枝量與反應的接枝率，其中，步驟(2)階段形成之官能基RC-EPI雖然相較於習知增加的倍率不明顯(1.2倍)，但接著進行的步驟(4)階段形成之官能基RC-EPI-IDA卻相較於習知有大幅的提高(4.2倍)，亦證明本發明之製備方法之二步驟活化與改質能避免形成於膜表面上的環氧基(RC-EPI)遭到鹼液破壞而成為醇基，其作用不僅提高了活化、接枝的反應效率，相對地也可以降低活化反應物的消耗量與時間、提高表面上螯合基的接枝量。此結果並進一步由銅離子的螯合量證明以本發明之製備方法所得的IMAM螯合的金屬離子的量，相較於習知技術更有極顯著及優異的提昇(28倍)。
將上述實施例1所得之固定化金屬親和薄膜經螯合銅離子後，進行溶菌醄之酵素固定量測試，其銅離子鍵結量及酵素固定量與依習知之論文所揭示的IMAM研究結果、商品化之固定化金屬親和層析樹脂(IMAC resin)的測試結果等作一比較，如下表2所示，可看出本發明之IMAM無論在銅離子螯合量或是固定酵素量，並再次證明該IMAM具有較高的表面官能基接枝量亦隨之提昇了螯合金屬離子與固定酵素的量，且相較於習知技術與商業化產品都有非常顯著的提昇。
< 實施例2>
實施例2是以與實施例1相同的步驟製備本發明固定化金屬親和薄膜，不同之處在於：步驟(1)為於60℃下進行活化反應，以及步驟(2)中的環氧氯丙烷為溶於水中。
<實施例3>
實施例3是以與實施例1相同的步驟製備本發明固定化金屬親和薄膜，不同之處在於：步驟(1)為於80℃下進行活化反應，以及步驟(2)中的環氧氯丙烷為溶於體積比為1：1的四氫呋喃與水的混合溶劑中。
上述實施例1~3所得之固定化金屬親和薄膜各進行三次銅離子鍵結量之量測並計算其平均值與偏差值(deviance)，可得如下表3之結果。
< 實施例4~7>
實施例4~7為以與實施例1相同的步驟製備一系列本發明固定化金屬親和薄膜，不同之處在於：步驟(3)之IDA濃度各為0.1M(實施例4)、0.4M(實施例5)、0.7M(實施例6)以及1.5M(實施例7)。
將上述實施例1、4~7所得之固定化金屬親和薄膜之銅離子螯合量(μmole/disc)以及螯合銅離子後之金屬錯合膜所固定的PGA活性(IU/disc)進行量測(各3次)，並將其平均值與偏差值之量測結果表示於圖1中。
<應用例>固定化酵素膜之製備
將上述實施例1、4~7所得之固定化金屬親和膜置入濃度為25mM的25mL硫酸銅水溶液中，在18℃下靜置反應1小時以得到一銅離子錯合膜，經水洗後置入玻璃瓶內再加入以載入緩衝液稀釋之25mL PGA酵素液(活性為0.1±0.05IU/mL)，放入恆溫培養箱中以100rpm之轉速震盪，於18℃下進行蛋白質吸附反應12小時，可得一固定化之PGA酵素膜。
將上述應用例所得之固定化酵素膜經與青黴素G反覆進行批次反應後，量測其膜上PGA之活性(IU/disc)，所得結果為3次的平均值與偏差值，並表示於圖2中。
取上述應用例中所製得之固定化酵素膜保存於4℃之磷酸鹽緩衝溶液(pH=8,含0.1% NaN3 )中，並進行固定化酵素活性之穩定性測試，其結果如圖2所示，可發現反覆測試次數達16次及長達40天之保存，PGA活性均維持非常穩定，並可續持膜上固定酵素之活性長達3個月亦不下降(結果未示於該圖中)。
綜上所述，本發明製備方法之活化步驟簡單有效，形成之活化膜在兩性溶劑的存在下與環氧化物的反應效率增加，亦降低環氧化物的使用量，由實施例之測試結果，顯示本發明所製得之IMAM可螯合銅離子的量與習知技術相比皆有顯著的提昇，雖然本發明以螯合銅離子作為一例示以便於與習知技術做一比較，但可合理推知以該方法所製得之IMAM因膜表面具有較高的表面官能基接枝量，可螯合的其他種可選擇的金屬離子的量亦會較習知技術有明顯的增加。由上述應用例之測試結果亦顯示本發明之金屬錯合膜經固定PGA或溶菌酶後所製得之固定化酵素膜，相較於習知技術及商業化產品之酵素固定量亦有顯著的提昇，且使用上可精簡傳統之固定化酵素膜耗時的培育時間與步驟，其酵素膜上所固定的酵素活性更不易隨著使用時間及次數而下降，此即提昇了膜上固定酵素的穩定性。因此，本技術有利於工業上酵素或蛋白質之固定化應用，以開發連續式酵素反應之製程，極具產業利用價值與前景。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利範圍及發明說明內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
圖1是一實驗數據圖，說明固定化金屬親和薄膜之銅離子螯合量(μmole/disc)以及螯合銅離子後之金屬錯合膜所固定的PGA活性(IU/disc)之量測結果；及
圖2是一實驗數據圖，說明固定化之PGA酵素膜經反覆進行批次反應後，其膜上PGA之活性(IU/disc)的量測結果。

Claims (23)

  1. 一種固定化金屬親和薄膜之製備方法，包含之步驟為：(a)令一表面具有羥基之薄膜與一鹼液於一相轉移催化劑存在下進行反應，以取得一活化膜；(b)在一兩性溶劑的存在下，令該活化膜與一環氧化物相反應，使該活化膜的表面具有多個環氧基；以及(c)令該具有多個環氧基之活化膜與一含有螯合劑且pH值範圍介於10~14之間的水溶液相反應，進而製得一表面具有多個可螯合金屬離子的螯合基之固定化金屬親和薄膜。
  2. 依據申請專利範圍第1項所述的製備方法，其中，該步驟(a)的相轉移催化劑是擇自於溴化四丁銨、甲基三辛基氯化銨、苄基三乙基氯化銨，或此等之一組合。
  3. 依據申請專利範圍第1項所述的製備方法，其中，以該表面具有羥基之薄膜之單位面積計，該步驟(a)的相轉移催化劑之用量是介於0.01~0.05g/cm2 之間。
  4. 依據申請專利範圍第1項所述的製備方法，其中，該步驟(a)之鹼液是擇自於氫氧化鈉水溶液、氫氧化鉀水溶液、氫氧化鋰水溶液，或此等之一組合。
  5. 依據申請專利範圍第1項所述的製備方法，其中，該步驟(a)的反應溫度是介於25~80℃之間。
  6. 依據申請專利範圍第5項所述的製備方法，其中，該步驟(a)的反應溫度是40℃。
  7. 依據申請專利範圍第1項所述的製備方法，其中，該步驟(b)的環氧化物是由下式(I)所示， 於式(I)中，R1 表示經取代或未經取代之C1 ~C3 伸烷基；Y表示鹵素。
  8. 依據申請專利範圍第7項所述的製備方法，其中，該步驟(b)的環氧化物是環氧氯丙烷。
  9. 依據申請專利範圍第1項所述的製備方法，其中，以該表面具有羥基之薄膜之單位面積計，該步驟(b)的環氧化物之用量是介於1.1~2.2mole/cm2 之間。
  10. 依據申請專利範圍第1項所述的製備方法，其中，該步驟(b)的兩性溶劑是選自於四氫呋喃、二甲基亞碸、經取代或未經取代之C3 ~C6 醚類、C3 ~C6 亞碸，或此等之一組合。
  11. 依據申請專利範圍第1項所述的製備方法，其中，該步驟(b)的反應溫度是介於25~60℃之間。
  12. 依據申請專利範圍第11項所述的製備方法，其中，該步驟(b)的反應溫度是40℃。
  13. 依據申請專利範圍第1項所述的製備方法，其中，該步驟(c)的螯合劑是擇自於亞胺二乙酸、氮基三乙酸、三羧甲基乙二胺、四伸乙五胺、羧甲基天冬氨酸、三嗪類染料如活性紅、活性藍，或此等之一組合。
  14. 依據申請專利範圍第13項所述的製備方法，其中，該螯合劑是亞胺二乙酸。
  15. 依據申請專利範圍第1項所述的製備方法，其中，該步驟(a)的薄膜材質是再生纖維素。
  16. 依據申請專利範圍第1項所述的製備方法，其中，該步驟(a)的薄膜為一多孔洞性薄膜，且具有之孔洞的平均直徑範圍是介於10nm~10μm之間。
  17. 依據申請專利範圍第16項所述的製備方法，其中，該多孔洞性薄膜之孔洞直徑是450nm。
  18. 一種固定化金屬親和薄膜，係由申請專利範圍第1至17項中之任一項所述之方法所製得，且以該薄膜的單位面積計算，該等螯合基可螯合銅金屬離子的量是介於4.0~4.6μmole/cm2 之間。
  19. 一種金屬錯合膜，係由申請專利範圍第18項所述之固定化金屬親和薄膜螯合金屬離子後所製得，且當被螯合在該固定化金屬親和薄膜之金屬離子為銅離子時，以該金屬錯合膜的單位面積計算，其膜表面具有的銅離子螯合量是介於4.0~4.6μmole/cm2 之間。
  20. 依據申請專利範圍第19項所述的金屬錯合膜，其中，該被螯合之金屬離子的種類是擇自於Cu2+ 、Ni2+ 、Zn2+ 、Co2+ 、Mn2+ 、Ca2+ 、Fe3+ 、Al3+ 、Yb3+ ，或此等之一組合。
  21. 一種固定化酵素膜，係由申請專利範圍第19至20項中之任一項所述之金屬錯合膜固定酵素後所製得，且當被固定在該金屬錯合膜上的酵素為青黴素G醯化酶時，以該固定化酵素膜的單位面積計算，其膜表面具有的青黴素G醯化酶的酵素活性是介於0.1~1.04IU/cm2 之間。
  22. 依據申請專利範圍第21項所述的固定化酵素膜，其中，該被固定的酵素種類是擇自於氧化還原酶、轉移酶、裂解酶、異構酶、連接酶、脫羧酶、羧化酶、醯化酶、縮醛酶、硫解酶或合成酶。
  23. 依據申請專利範圍第22項所述的固定化酵素膜，其中，該被固定的酵素是青黴素G醯化酶或溶菌酶。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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吳俊逸，以再生纖維素為材質之固定化金屬親和薄膜的製備與性質之探討，中興大學化學工程學系碩士論文， 中華民國91年7月。 張簡志強，應用金屬親和薄膜分離純化盤尼西林醯胺酵素，中興大學化學工程學系碩士論文， 中華民國92年7月。 *

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