TWI375556B

TWI375556B - Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers

Info

Publication number: TWI375556B
Application number: TW094141400A
Authority: TW
Inventors: Zhao Hong; B Greenwald Richard; Adler Susan
Original assignee: Enzon Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2004-12-14
Filing date: 2005-11-29
Publication date: 2012-11-01
Also published as: RU2007126802A; MX2007007034A; US20050197290A1; KR20070089739A; US8192743B2; US20080305070A1; CA2589975A1; CA2589975C; US7413738B2; IL183582A0; CN101076353A; EP1827497A4; TW200635576A; WO2006066020A2; AU2005316520A1; EP1827497A2; CN101076353B; AU2005316520B2; JP2008523239A; JP5405746B2

Description

1375556 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】 ' 本發明有關有助於延長生物活性材料在生物體内循環生命期 .* 之可釋放聚合物。本發明亦有關使用該等聚合物製成之共軛物。 . 本發明為2〇〇3年5月30曰提出申請之美國專利申請案第 10/449, 849號及2002年8月13曰提出申請之美國專利申請案第 10/218,167號之部份延續案，該二申請案之内容以參照方式於茲 φ 併入本案。【先前技術】美國專利第4，179,337號揭示一些將縮氨酸(peptides)或縮多氨酸(polypeptides) Μ合至聚乙二醇(polyethylene glyc〇1， PEG)及類似水溶性聚（聚亞烴化氧）(P〇lyalkyleneoxides)之初始 Π\ 概念。於茲以參照方式併入該案之揭示内容。使用這些聚合物改性（modified)的縮多氨酸，呈現降低的免疫原性鲁（^unogenicity)/抗原性(antigenicity)，且比未改性之縮多氨酸在金流中循環更久的時間。要共軛聚亞烴化氧時，其中之一羥基端基團（hydr〇xyl end-groups)被轉換成一反應官能基團（reactive functi〇nal group)。此一過程經常被稱為「活化」，而其生成物稱為「活性聚亞經化氧」。其他實質上為非抗原的聚合物同樣為「活化的」或官能化的（functionalized)。此等活性聚合物可與一種具有親核官能基團（nucle〇phiHc 5 % I375556 functional groups)的治療劑（藥物）起反應。這些親核官能基團係作為附著位點（attachment sites)。通常被用作附著位點的一種親核官能基團是賴氨酸（lysines)2e-氨基團。此外，自由羧酸基團（free carboxylic acid groups)、適當活化之羰基團 (carbonyl group) '氧化的糖類分子部份(m〇ieties)、及巯基團 (mercapto gmips) ’也曾被用作附著位點。胰島素與血紅素都是名列共輛的首要治療劑。這些相當大的縮多氨酸包含數個自由ε-氨基附著位點。可以附加充分數量的聚 s物來降低免疫原性與增加循環生命期而不顯著喪失生物活性。然而，我們發現，過度的聚合物共軛及/或涉及治療性分子部份活性位點（出現生物活性關聯基團之位置）之共軛，經常導致活性喪失，因此變成無治療效用。在較低分子量之縮氨酸中，因為少有不與生物活性關聯之附著位點，所以經常有這種情況。許多非縮氨酸類治療法也欠缺充分數量的附著位點，而無法獲得聚合改性的效益。為了克服上述問題，建議方法之一是使用更長、更高分子量的聚合物。然而，依照所需分子量而定，這些材料可能不易備製且使用成本昂貴。此外，它們提供的改進有時比其他隨時可用的聚合物更少。另種建議是，經由三氮雜苯環(triazine ring)將二股聚合物附著在蛋白質之氨基團上。例如，請參閱1981年之Enzyme(酵 6 ® 1375556 素期刊）26 期 49-53 頁，及瀬年之 Proe. Soc· Exper. Biol. Med. ’ 188期364-9頁。然而，三氮雜苯是一種毒性物質，經過共軛後很難降低其毒性至可接受之程度。此外，三氮雜苯是一種平面基團（planargroup)，只能用雙聚合物(d〇ubie-p〇iymer)替代。此種平面結構將兩個聚合物鏈牢鎖定位。如此使聚合物共軛的效扭爻到限制，只大約與增加聚合物鏈長度所獲得的效益相同。因此，非二氮雜苯基的活性聚合物將對現有技術提供實質的效益。而，在上述情況時，所形成的生物活性聚合物共輛物在聚合物與母生物活性分子部份間，有實質上抗水解化合(鏈接）。因此，須備製永久鏈接而本㈣藥物碰的長效雜物。（絲藥物前體時，母分子最後會在生物體内釋出。）共同轉讓之美國專利第5, 643, 575、5, 919, 455及6,113, 9〇6 號中揭示其他改進，皆與多股PEG(聚乙二醇)相關。此等多股pEG 共用共_附著點，經由-脂族鏈接劑(ali細ie linker)而附著到-親核試劑(nuGleQphile)。麟鏈制與早期三氮雜苯基的支化聚合物共祕Μ ’它允許專技人士避免三氮雜苯的毒性，並提供其他有用的優點。此外，過去多年來’亦曾有人建議多種備製藥物前體的方法。藥物前體包括一種生物活性母化合物之多種化學衍生物。於投予藥物前體時，它們最後會在生物體内釋出活性的母化合物。使用藥物前體可讓專技人士改進生物活性化合物在生物動的作用開 ⑧ 7 1375556 始時間及/__。_體_現母化糾_性化合物 & h m式或大致無活㈣式。活性藥物之㈣率受數種因 '、e l括鏈接劑的水解速率。鏈接劑係結合生物活性母化合物與藥物前體载體。目别已有人報告某些以g旨鏈接或磷酸鹽鏈接為主的藥物前體。在大部份情財，絲形成藥驗體的特定騎接類型，提供在Jcitw中夕達數天之水解雖然人們預期藥物前體的形成’但是大部份餘物在生物體_到充分水解前，已先被排除。因此所提供的藥倾體，其顯最好能允許聚合物-藥物鍵接在生物體内更快地水解，以更快產生母藥物化合物。、也f有人報告以Si胺(amide)或氨基甲酸脂(carba_)鍵接為主的樂物前ϋ。通常’—般咸知_鍵具有高度抗水解性。然而，近來發現，當ε-氨基酸之N末端與H經乙基團 (_〇xyethyUroups)產生N經乙基化時，卜氨基酸之c末端醯胺在财與pH?· 4時會立即水解成N_2(紅基)甘氨酸⑽㈣類型分子是此齡解反應_鍵。此細，N_馳乙基)甘氨酸類型基團近來已被朗在藥物前體的合成，請參閱共同轉讓之美國專利申請案第10/218,167與10/449, 849號。在藥物前體ί辑領域中尚有改進的空間。本發明即是提供此種改進。【發明内容】在本發明之-層面中，提供以下化學式⑴所示的化合物· 1375556

^-(Li)i-iU2)r〇—(CR3R4)n—(CRsRe)

z)rA

\c7—o—(CR7R8)0——(CR9R10)F (I) 其中：

Ri係選自包括實質上非抗原性聚合物殘基、Cl_6烷基（Ci 6

alkyls)、C2-6烯烴基(C2-6 alkenyl)、C2-6炔基(C2-6alkynyl)、芳香族烧基(aralkyls)、及末端分支基團（terminal branching groups) 之群組； Z及Z’可為相同或不同’並各自選自活性輸送至目標細胞之分子部份'疏水性分子部份、雙官能鏈接分子部份、及以上各項之不同組合； Υι-3可為相同或不同，並係選自〇、S、或NRn ;

Li及b為彼此獨立之雙官能鏈接劑；

Rs-Ru、&及&可為相同或不同，並係選自包括氫氣、Cl_6烷基、G-6烯烴基、Q-6炔基、C3-19支化烷基、C3-8環烷基（C3-8 cycloalkyls)、Ci-6取代烧基(C1-6 substituted alkyls)、C2-6取代烯煙基(C2-6 subst i t u t ed a 1 keny 1 s )、C2-6 取代炔基(C2-6 subs t i tut ed alkynyls)、C3-8 取代環烧基(c3-8 substituted cycloalkyls)、芳香基（aryls)、取代芳香基（substituted aryls)、芳香族院基 (aralkyls)、Ci-6 異烧基（C卜6 heteroalkyls)、取代 C卜6 異烧基 9 ⑧ 1375556 (substituted Ci-6 heteroalkyls)、Ci-6院氧基(Ci-ealkoxy)、苯氧基(phenoxy)、及 Ci—6 異烧氧基(Cuheteroalkoxy)之群組； L«2係選自： ~ C(〇)(CR3〇R31)Yl5(CR32R33)C(0)NR35-或 ~C ( 0) (CR30R31) (CR32R33) C ( 0) NR35- 其中： Υΐ5係選自ο、s、NR34或ch2 ;以及 R3〇-35可為相同或不同，並係選自H、烷基、烯烴基、炔基、異烷基或芳香基； Α及Α’可為相同或不同，並各自選自烷基團、離去基團、 s月t*基團' §爹斷劑、乾標分子部份（targeting m〇ieties)、生物活性分子部份、及OH ; a、 g、e可為相同或不同，並各自為〇或大約1至5的正整數，較佳為0或1 ; b、 c、d及d’可為相同或不同’並各自為〇或丨；以及 m、n、〇及p可為相同或不同，並各自為大約1至6的正整數；但以（a+e)等於或大於1為條件。本發明另一層面包括雙官能化合物。當Rl為一聚合物殘基時 (包括α及Ω末端鏈接劑），即形成此等雙官能化合物。在本發明此一層面中，專技人士可以將二當量之生物活性劑藥物、蛋白質、縮多氨酸、寡核苷酸、診斷劑等，附著到聚合物（較佳是pEG) 1375556 N，N-2(羥乙基)甘氨酸(bicine)系統。以下化學式（π)顯示此種雙官能聚合物共軛物之一實例：

II Z及Z各自為雙官能鍵接劑或 l5 - c—; 其中’ Y4為0、S或NR" ’ Ls為一雙官能鏈接劑，其他所有變數則如上述。本發明亦提供多種備製本發明化合物的方法，及使用本發明化合物的治療方法。就本發明而言，「殘基」一詞係表示本發明所述之化合物在進 '行取代反應而有聚合物藥物前體載體部份附著之後，其中留下的部份。就本發明而言，「聚合物殘基」或「PEG殘基」一詞係表示該聚合物或PEG與一生物活性化合物起反應後，其中留下的部份。就本發明而言，「院基」一詞係包括純(straight)院基、支化 (branched)烧基、取代（substituted)烧基（例如函代（halo-)貌基）、烷氧基烷基、硝基(nitro)烷基' Cm烷基、G-8環烷基、或 1375556 取代環烷基等。就本發明而言，「取代」一詞係包括增加、或用一或多個不同的原子置換一官能基團或化合物内包含的一或多個原子。就本發明而言，取代烧基包括敌基烧基(carboxyalkyls)、氛基燒基(aminoalkyls)、二烧基氨基(dialkylaminos)、經基烧基 (hydroxyalkyls)、及疏基院基(mercaptoalkyls);取代烯烴基包括綾基烯烴基（carboxyalkenyls)、氨基烯烴基 (aminoalkenyls)、二稀烴基氨基(dialkenylaminos)、經基烯烴基(hydroxyalkenyls)、及巯基烯烴基(mercaptoalkenyls);取代炔基包括幾基炔基（carboxyalkynyls)、氨基炔基 (aminoalkynyls)、二炔基氨基(dialkynylaminos)、羥基炔基 (hydroxyalkynyls)及巯基炔基(mercaptoalkynyls);取代環烧基包括諸如4-氯環己基(4-chlorocyclohexyl)之分子部份；芳香基包括諸如萘基(napthyl)之分子部份；取代芳香基包括諸如3-漠苯基(3-bromo-phenyl)之分子部份；芳香族烷基包括諸如甲苯甲醯 (toluyl)之分子部份；異烷基包括諸如乙基噻吩 (ethylthiophene)之分子部份；取代異烷基包括諸如3-甲氧基-噻吩(3-methoxy-thiophene)之分子部份；烷氧基包括諸如曱氧基(methoxy)之分子部份；以及，苯氧基包括諸如3-硝苯氧基 (3-nitrophenoxy)之分子部份。函代應包括氟代（fiuoro)、氣 (chloro)、碘代（iodo)及溴代(bromo)。 ⑧ 1375556 就本發明而言，「充分份量I係矣+ 7 ^ ^ 糸表不可以達到此類技術之專技人士熟知療效的份量。就本發明而言，「實際上非抗原性」及「實質上非抗原性」應包括在此紐射熟知騎質無雜且不會在魏義體内引起明顯免疫反應之所有聚合物材料。就本發明而言，「正整數」係表示正值之全數(wholenumber)，較佳約為1到6，更佳為1或2。本發明首要優點之-是，N，卜2(經乙基）甘氨酸鍵接劑 (bicine linker)允許操控藥物前體之水解速率’藉此在生物體内及在試管内都可以不同的速率釋出天然實體(native entities)。例如，可以加入不同的雙官能分子部份，包括氨基酸或短縮氨酸殘基，作為Li-3任一者的一部份，來調節在生物體内及在試管内之藥物前體水解率及/或細胞攝入率等。本發明另一優點是’聚合物分子部份只附著到N，N-2(羥乙基）甘氨酸系統的一個臂，所以共軛過程更乾淨更快速。本發明再一優點是’由於水解期間少有或沒有雜質或副產物形成，所以代謝分佈（metabolic profile)有所改進。此種無雜質形成的情況，也使純化較易達成。本發明再一優點是，使人們可以將輕標分子部份及生物活性分子部份（亦即藥物）都附著到同一聚合物平台（polymer platform)，藉此增加增強療效的潛力。 j 13 1375556 本發明再一優點是，經由此種新穎聚合物輸送系統遞送的目標化合物，經常顯示在生物體内的水溶性及循環生命期都有可測的增加’尤其在小分子的情況時。【實施方式】 A.化學式Π) 在本發明一具體實施例中，提供如化學式（丨）之化合物

R

(Ll)i~(L2)^〇_(CR3R4)n—(CR5R6)m Ν- 、24 ^25 Α’一 (Z_)d.—(Ι3%~\Cf—Ο—(CR7R8)0-(CR9R10)p ⑴ 其中： R!係選自包括實質上非抗原性聚合物殘基、C16烷基(Cw alkyls)、C2-6稀煙基(C2-6 alkenyl)、C2-6快基(C2-6alkynyl)、芳香族烧基(aralkyls)、及末端分支基團（terminal branching groups) 之群組； Z及Z’可為相同或不同，並各自選自活性輸送至目標細胞之分子部份、疏水性分子部份、雙官能鏈接分子部份、及以上各項之不同組合； Υι_3可為相同或不同，並係選自0、S、或NRn ;

Li及L3各自為雙官能鏈接劑； 1375556

Ra-Rn、心及R25可為相同或不同，並係選自包括氫氣、Cm烷基、C2-6烯烴基、C2-6炔基、C3-I9支化烷基、C3-8環烷基（C3-8 cycloalkyls)、Ci-6取代烧基(Ci-6 substituted alkyls)、C2-6取代烯烴基(C2-6substituted alkenyls)、C2-6取代炔基(C2-6substituted alkynyls)、C3-8 取代環烷基(C3-8 substituted cycloalkyls)、芳香基（aryls)、取代芳香基（substituted aryls)、芳香族烧基 (aralkyls) ' Ci-6 異烧基（Ci-6 heteroalkyls)、取代 Ci-6 異烧基 (kibstituted Cm heteroalkyls)、Cw烷氧基(Cwalkoxy)、笨氧基(phenoxy)、及匕-6異烷氧基(Cwheteroalkoxy)之群組； L«2係選自： _ C(〇)(CR3〇R31)Yl5(CR32R33)C(0)NR35-或 -C(0) (CR30R31) (CR32R33)C(0)NR35- 其中：係選自 0、s、NR34或 CH2; R30-35可為相同或不同，並係選自H、烷基、烯烴基、炔基、異燒基或芳香基； A及A’可為相同或不同，並各自選自烷基團、離去基團、 B月包基團、診斷劑' 乾標分子部份(targeting moiety)、生物活性分子部份、及; a、g、e可為相同或不同，並各自為〇或大約1至5的正整數，較佳為0或1 ; 1375556 b c、d及d各自為〇或i;以及 ra、π、〇及ρ各自為正整數；但以（a+e)等於或大於1為條件。在本發明某些較佳層面中，Rl包括一實質上非抗原性聚合物殘基，諸如聚乙二醇(p〇lyethylene glyc〇1，pEG)基團。或者， Ri包括一封端基團（capping gr〇up)，如本說明書中標號為j者。用於聚合物封端的較佳j基團包括多種分子部份，諸如〇H、NH2、 SU、αΜ、Cm烷基分子部份(諸如CH3)、及化學式（π丨）之化合物：

(III) 其中所有變數均如先前所定義。關於構成本發明各化學式之其他變數，在本發明某些層面中，較佳為以下所列者：在某些層面中，R!為一種聚亞烴化氧(polyalkylene oxide) 殘基’更佳為一種聚乙二醇殘基；在其他層面中，仏為一種以N，N- 2(羥乙基)甘氨酸為主要成份的末端分支基團（以下會更詳細說明），以允許多重聚合物股加 1375556 載（multiple polymer strand loading); ，在另-層面中，A較佳為-種官能基團或生物活性分子部份， A’則為一種生物基團、靶標分子部份、或診斷劑；

Ra-Ru及R24-25皆為氫；以及

較佳是，Z及Z，都是一L5~4—，如上所定義，或者可包括氨基酸殘基’縮氨酸殘基，可活性輸送人目標細胞、疏水性、或具有不同組合㈣之細，以於結合生物活性A顧時，可形成藥物前體’錄化學式⑴及（11)之„_2(紅基)魏酸聚合物部份釋出。亦請參同轉讓之美國專利巾請案第，58 993 號，其内容以i照方式併入本說明書内。 B.皇置上非抗原性聚厶物

如上所述，R,較佳是一種水溶性聚合物殘基，此種水溶性聚合物殘基錄為實質上非抗雜，諸如聚亞烴化氧⑽），更佳是聚乙二醇’諸如mPEG。舉例而言（並非限制之意），聚乙二醇(pEG) 殘基部份Ri可選自以下各項之中： J- 〇~(CH2CH20)x-J-0-(CH2CH20)x-CH2C(0)-0-, J-〇-(CH2CH20)x-CH2CH2 NR.2-, J-0-(CH2CH20)x-CH2CH2 S-, -oc ⑻ CH2-0-(ch2CH20)x-CH2C(0)-0-， 1375556 ~NR12CH2CH2-0-(CH2CH2〇>-CH2CMR12-,以及 -SCH2CH2-0-(CH2CH2〇)x- CH2CH2S- ° :其中： X是聚合度； _ 心係選自氫、C,—6烷基、C2-6烯烴基、C2-6炔基、C3-l2支化烷基、 C3-8壤炫•基、Ci·6取代烧基、Q-6取代稀煙基、C2-6取代快基、C3-8取代環烷基、芳香基、取代芳香基、芳香族烷基(aralkyls)、Ci-6異 • 烧基、取代Cl_6異烷基、Ci-6院氧基、苯氧基、及〇-6異烷氧基，以及J是一種封端基團，如前有關化學式（11)之說明。在一特佳實施例中，R1係選自 CHa- 〇-(CH2CH2〇)x- CH3-0-(CH2CH20)x-CH2C(0)-0-'CH3_〇-(CH2CH2〇)，CH2CH2 .及 CH3-0-(CH2CH2〇)x-CH2CH2 v 其中x是一正整數，選取此值時，較佳可使重均分子量約為 2, 000至40’000原子質量單位(Da)。在本發明另一層面中，聚合物之/刀子里範圍從數百至4〇，咖或更大，視專技人員的需要而定。在本毛明考慮之範圍巾，Rl亦可選自共同轉讓之美國專利案第 ’605,976 5, 643, 575、5, 919, 455、及 6,113, 906 號中說明的支化聚σ物殘基，該等專利案之揭示内容以參照方式併入本說明書内。在這些通式式中，以下歧佳者： ⑧ 1375556 ο

m-PEG-Ν—C nvPEG-0 C h CH—(Z"CH2)hC(0)- m-PEG· (CH2)4 ,CH—(ZMCH2)hC(0)- 0 m-PEG-O-CIIo o o

m-PEG-O-C-NH m-PEG-O-C- (CH2)q ^-(CH2)jkC(0)- (CH2)q

,(CH2)q HC ——(Z"CH2>hC(0)_ ^(CH2)q m-PEG-O-C-NII Ho n>PEG-0一C-II 0 and

O m-PEG C· "CH2)hC(0)- 飞 H2)q m-PEG-C- II 0 HC—(Z 〉CH2)q

其中： (q)為大約1至5之整數； Z” 為 0、NRn、S、SO、或 S〇2 ;其中 R13為 Η、0-8烷基、G-8 支化烷基、G-8取代烷基、芳香基、或芳香族烷基； (h)為0或1 ; (k)較佳為大約1至6之正整數。在本發明範圍内也考慮的其他支化活性聚合物，較佳係選自 1375556 =rcT公告案第職/G65988號及第___號說明書。，此等PCT公告案之揭示内容以參照方式併入本說明在这些通式中，以下係較佳者： RV、〇 ο 其中：〇〇 »Λαλ ο

R“cA ο

CT Υ。' Λ ,0 及 ο

Rr為諸如PEG之聚合物殘基。在另一較佳實施例中’ Rl為以下化學式中之聚合物殘基： 0 〇 /ch2ch2o^—c-\ ^0^00Η20Η2^Χ^0Η20Η20^-0-| N~(〇CH2CH2y ° 0 n κ/\Λ

o=c rJ

αν 0=C ^ΑΛ I I R^i C==〇 rJ

HoJi' _1. o=c v/V>

:0 and 0 o 卜 C-W_Rr—W-C-賢其中：

Ri·為諸如PEG之聚合物殘基； W為一雙官能鏈接劑’諸如〇、氨基酸、一c—〇, -(CH2)y 20 ⑧ 1375556 及-N_2CH2〇V ; • z 為0、1、2、3、或4; . · 11為一正整數，較佳為大約！至5〇〇 ,更佳是2⑽左右以及 ’ • y為一正整數，較佳為大約1至6。 • PEG通常用以下結構表示： • 一〇~(ch2ch2o^- 籲鲁且R1’較佳包括一種此化學式之殘基。聚合物ω的聚合度可為10到2, 300左右。這表示聚合物鏈中重覆單元的數目，並依聚合物分子量而定。較佳是X為—正整數’選取時應使重均分子量約為2, 000至4〇, 〇〇〇原子質量單位 (DaV (J)分子部份為一封端基團，諸如本說明書内定義者；亦即， • 它是在聚合物末端所見的基團；而且，在某些層面中，可選自顺2、 OH、SH、_、Cw烷基、或其他pEG末端活化基團中之任—者， B 如熟悉此類技術之人士所了解的各種基團。 • 同樣有用的還有聚丙二醇(PolypropyleneglyC〇ls)、支，諸如共同轉讓之美國專利第5,643,575號中所述的支化聚乙二醇 (PEG)衍生物，以及諸如shearwater公司2001年產品目錄 “Polyethylene glyC〇i and Derivatives for Biomedical

Application”（生物醫學用途之聚乙二醇及衍生物）中說明的星狀PEG s及多臂peg, s。前述各項資料之内容以參照方式 ⑧ 1375556 加入本說明書。美專第5, 643, 575號提供的分支，允許從〇-2(經土）甘氨I基團產生二次或三次分支，作為從單一附著點增加生物活性分子或酶上聚合物加細方法。酿地，水雜聚合物可以^化，崎必要時畴於雙官能鏈懸而不需過度的實驗。 # 雖然聚亞烴化氧(PA0)與PEG在重均分子量可能有實質上的差異’但較佳是’在本發明大多數層面中，RARi.之重均分子里可為大約2, _至4〇, _原子質量單位(Da)。本考X明包括的聚合物最好在室溫下為水溶性。此類聚合物包括但不限於各種聚亞烴化氧均聚物，諸如聚乙二醇(pEG)或聚丙一醇、聚氧乙烯化多元醇(polyoxyethylenated polys)、其共聚物及其成塊共聚物(bl〇ck cop〇iymers)，但以成塊共聚物維持水 >谷縣條件。本發明尚另—實施例可替代以刚為主要成份之聚合物，其中，亿及私.可選擇性地選自一或多種實際上非抗原性的材料诸如葡I糖(dextran)、聚乙稀醇(polyvinyl alcohols)、乂糖類為主成伤之聚合物、經丙基甲基丙稀酿胺(hydroxypropyl meth-acrylamide，HPMA)、聚亞烴化氧、及/或其共聚物。亦請參閱共同轉讓之美國專利第6,153, 655號，其内容以參照方式加入本說明書。專技人士顯然可以理解，依照本說明書所述，可將相同類型的活化作用使用於多種PA0，諸如peg。此類技術之專技人士可以進—步理解，前述所列項目僅為舉例說明之用，其實，舉凡具有本說明書說明之性質的聚合物材料都在考慮之中，此外， 22 ⑧ 1375556 其他聚亞烴化氧衍生物，諸如聚丙二醇等，也都在考慮之内。 • ·本發明之共聚物也可與諸如聚（烷撐二醇）聯氨 .(P〇ly(alkylene咖。1) diamines)之雙官能材料共聚，以形成 :適用於可滲透隱形眼鏡、創傷敷料、藥物傳遞器件等的互滲透(全滲透）聚合物雛結構。此麵術之專技人士可立即看出此類分支 • 的㈣關（stei*ie limitations)及水雜。然而，多重支化聚合物之分子量較佳應不超過80, 000原子質量單位(dalt〇ns)。 • C.雙官能鍵接剖基團：在本發明許多詹面中，尤其在化學式⑴中，Li.及L3是幫助 N，N-2 (經乙基）甘藏酸衍生物附著於聚合物股或其他分子部份(例如吣及^ )的鏈接劑。其所提供的鏈接可為直接的或透過專技人 ' 士習知的其他耦合基團。本發明書中也提及其他的L基團，而且 - 這些基團顯然係選自與Li相同的基團。雖然以下進一步定義]^2及 L5，但在本發明之一層面中，Li及L3係各自選自以下各項中：鲁 -NR19(CR14Ri5)t〇- -NRj 9(CR14Ri 5)t(CRi 6CRi7〇)sNR] 9--0(CR 14R] 5)tNR 19--0(CRj4R15)t0-NRi 9(CR] 4Rj 5)tNRi 9- -NRi 9(CR j 4R( 5)t(CR! 6CR! 70)s- -NR ] 9(CR! 6CR17〇)t- -NR] 9(CRj 6CRj 70)t(CR] 4R! 5)sNR] 9- -NR1 9(CRj gCR 17〇)t- -0(CR14R15)rNR19- 23 1375556 -0(CR|4Rl5)tN^I9" -0(CR|4Ri5)t〇- -0(CR16CR170)tNR19- -0(CRi4R]5)s

R, (CRi6R|7)tNR19-

-NR19(CRi4Ri5),

(CR16R17)tO- 其中

Rh-Rh及Rig係各自選自包括氫氣、C,—6烷基、C2-6烯烴基、c2-6 炔基、G-w支化烷基、Cw環烷基、Cw取代烷基、C2-6取代烯烴基、

Cm取代块基、G-8取代環烷基、芳香基、取代芳香基、芳香族烷基、

Cm異烷基、取代Ch異烷基、Cl_e烷氧基、笨氧基、及Ci_6異烷氧基之群組；以及心係選自包括氫氣乂㈠烷基七^烯烴基七乂炔基士^支化烷基、Cw環烷基、G—6取代烷基、c2_e取代烯烴基、G-6取代炔基、 cw取代環絲、料基、取代㈣基、料族减、Ci6異院基、取代U異烧基、cM烷氧基、苯氧基及G 6異烷氧基、脳、鹵代烧基、及齒素之群組；以及 t與S係各自選自正整數’較佳為大約}到4。 1375556 在本發明其他層面中，L及L3可包括氨基酸殘基。可選自任何已知天然存在L-氨基酸的氨基酸有，例如丙氨酸(aianine)、纈氨酸(valine)、亮氨酸（ieucine)、異亮氨酸（is〇leucine)、甘氨酸(glycine)、絲氨酸(serine)、蘇氨酸⑽re〇nine)、蛋氨酸 (methionine)、半胱氨酸（CyStejne)、苯丙氨酸 (phenylalanine)、酪氨酸（tyrosine)、色氦酸（tryptophan)、天冬氨酸（aspartic acid)、榖氨酸（glutamic acid)、賴氨酸

(lysine)、精氨酸（arginine)、組氨酸（histidine)、脯氨酸 (proline)、及/或以上各項之某一組合’以上僅列舉少數。當Li 包括一種縮氨酸時，此種縮氨酸的大小範圍例如約在2至1〇個氨基酸殘基。在一較佳實施例中，縮氨酸為Gly_phe_Leu_Gly(甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸）。各種氨基酸殘基較佳為以下化學式所示者： ^28 Υδ X，一f-CH^-C- R27 ' R28 其中X’為0、s或NR26 ; γ5為ο、s或NR27;以及R26 係各自選自與定義Ra的相同群組’但較佳為H或低級烷基（亦即 Cl-6烷基）；以及f為一大約1至1〇的正整數，較佳是卜天然存在氨基酸之衍生物及類似物，以及技術界已知的各種非天然氨基酸(D或L) ’不論是疏水性或非疏水性，也都視為在本發明範圍内。舉例而言，氨基酸類似物及衍生物包括：2_氨基肥酸（2-aminoadipic acid)、3-氨基肥酸（3-amino-adipic acid)、 25 ⑧ 1375556 β-丙氨酸（beta-alanine)、β-氨基丙酸（beta-aminopropionic acid)、2-氨基丁酸（2-aminobutyric acid)、4-氨基丁酸 (4-amino-butyric acid)、γ-氨基丁酸(piperidinic acid)、6-氨基己酸（6-aminocaproic acid)、2-氨基庚酸(2-aminoheptanoic acid)、2-氨基異丁酸(2-aminoisobutyric acid)、3-氨基異丁酸 (3-aminoisobutyric acid) ' 2-氨基庚二酸（2-aminopimelic 8(^(1)、2,4-氨基丁酸（2,4-3111丨11〇1)1^714〇3(^(1)、鎖鏈賴氨素 (<1€8111031116)、2,2-二氨基庚二酸(2,2-(11311^11(^111614 3(^(1)、 2,3-二氨基丙酸（2,3-(^31^11〇01'〇^〇111〇8(^(1)、11-乙基甘氨酸- (n-ethyl-glycine)、N-乙基天門冬素（N-ethylasparagine)、3-羥基脯氨酸（3-hydroxyproline)、4-羥基脯氨酸 (4-hydroxyproline)、異鎖鏈素（is〇desmosine)、別異亮氨酸 (allo-isoleucine)、N-曱基甘氨酸（N-methylglycine)、肌氨酸 (sarcosine)、N-曱基異 ^^^(N-niethylisoleucine)、6-N 甲基賴氨酸(6-N-methy卜lysine)、N-甲基纈氨酸(N—methylvaline)、戊氣S义（norvaline)、正亮氨酸（n〇rieucine)、鳥氨酸 (ormthine)，及其他不勝牧舉。63 Fed Reg.，2962〇，29622 中有明細列出，在此以參照方式併入本說明書。例如’短縮氨酸係指大約從2到1〇或更多個氨基酸殘基的縮義酸，如前所述。更佳是’ Li及係各自選自以下各項： 26 1375556 -nh(ch2ch2)2o- . -nh(ch2ch2)(ch2ch2o)nh- -0(CH2CH2)NH- -0(CH2CH2)0- , -NH(CH2CH2)NH- -NH(CH2CH2)(CH2CH20)- -NH(CH2CH2〇)- ' -NH(CH2CH2〇)(CH2)NH- -NH(CH2CH20)2- -0(CH2)3NH- -0(CH2)30- -0(CH2CH20)2NH- 在本發明另一實施例中，L2係選自以下各項： • _C(0)CR30R3l0CR32R33C(0)NR35- ; -C(0)CR3〇R3lNR34CR32R33C(0)NR35-; _C(0)CR3〇R3lSCR32R33C(0)NR35-;或 -C(0)(CR3〇R3.)„C(0)NR35-；其中： • 匕。-35係各自選自Η、Cl-6烷基、C2-6烯烴基；C2-6炔基、C丨-6異烷 • 基或芳香基；以及 η為一正整數，較佳約為1到3。 .較佳是，俾選自以下各項： -C(0)CH2〇CH2C(0)NH-； -C(0)CH2NHCH2C(0)NH-； -C(0)CH2SCH2C(0)NH-； -C(0)CH2CH£H2C(0)NH-，或 -C(0)CH2CH2C(0)NH-；本發明首要優點之一是專技人士可以控制生物活性分子部份 27 1375556 二樂物從聚合氣卜顺乙基)甘氨酸平台水解或釋㈣速率。依 _ =選擇的特定鏈制而定，專技者可·合物改性來操控水解 -值/本發·—健層社料技人士調節生物雜分子部份 :==所躲標之速度。料輕縫雜分询份_物較快 .·=時’可併人㈣制，喊生增進的水鱗。姆於丘同轉讓，國專利申請案第蘭8’ 167號較早揭示的以N，N—2(經乙基） =喊粒成份㈣合物平Μ，其分子部份或祕從平台的釋 ’經常視諸如pH或酵素之存在與料條件而定，本發明中之鏈接劑l2藉由鄰位促進(anchimericassist纖)之助，可實質上增進生物活性分子部份或藥物從聚合平台釋出的速率，而不受pH條 2酵素存在與否的影響。然而，若有酵素存在時，水解速率將又卻位促進(若適用時）或受酵素反應二者中較快發生者之控制。因此水解速率與N，N-2(經乙基)甘氨酸分子部份本身及pEG部份 B 間所使用的鏈接劑類型，有高度相依性。 D* 子部份及其官能在本發明之-層面中，z、Z，為L5-C(=Y4)，其中L5為-雙官月b鏈接劑’且係選自與L丨相同的基團中，而％係選自與定義γ丨3 的相同群組中。在本發明此—層面中，z、z，基團係作為A基團與N’N-2(經乙基)甘氨酸輸送形式殘餘物之間的鏈接。、在本發明其他層面中，z、z，是活性輸送入目標細胞、疏水分子部份及其不同組合中的分子部份。雖然z、z，較佳為一價，

28 1375556 但它們亦可選擇性地為二價或多價，以允許一個以上的A基團附著到以N，N-2(羥乙基）甘氨酸為主成份的聚合物上。為了達成活性輸送，Z、Z’可包括氨基酸、縮氨酸殘基、或聚醯胺殘基(諸如以上有關L·所說明的任一項），糖殘基、脂肪酸殘基、G i8烧基、取代芳香基、異芳香基(heteroaryl)、一C(=0)、-C(=S)或-C〇服29); 其中R29為Η、低級烷基等。本發明此一層面廣義根據的原理是，適於併入以(羥乙基）甘氨酸聚合物為主成份之藥物前體共軛物的生物活性材料它們本身所為之物質/化合物，從Ν，ν-2(經乙基)甘氨酸鏈接的合成物水解釋出後不具活性，但經過進-步化學處理/反應後會變成活性。根據此實施例，被Ν，Ν-2(羥乙基）甘氨酸為主的聚合物系統遞送到血流的治療劑或診斷劑、縮氨酸、縮多氨酸等，在進入或活性輸送入重要的目標細胞前會保持無活性’然後被細胞内化學作用活化，例如被組織或細胞内存在的酵素或酵素系統活化。備製本發明此一層面之藥物前體時，係使以Ν，Ν_2(羥乙基）甘氨酸聚合物為主的共軛物在生物體内的水解可拆分共軛物，以使/舌}·生生物材料(說明書内標號為Α者)釋人細胞外液，同時仍鍵接於Z或Z’分子部如在本發明此_層面巾的生物活性材料較佳疋’但非絕對的，小分子治療劑及/或診斷劑。例如，具潛力的Z_A 組合之一是亮氨酸一阿黴素（leucine-doxorubicin)，另-種是與氨基酸鏈接的喜樹驗(amino acid_linked campt〇thecin)或紫杉

29 1375556 醇(paclitaxel)，而欲治療的組織是腫瘤組織。在此並不希望以任何理論或假設限制本發明可能的作用方 • 式’但依照選作輸送增強劑的額外分子部份而定，生物活性材料 . 輸送入腫瘤細胞的速率，顯然因為生物活性材料是遞送入細胞外組織空間（例如呈現EPR效應的組織）’而為防護的及/或輸送增強的形式。在另一選擇中，輸送增強劑(Z或Z’）係選自已知的可作為細 • 胞膜輸送系統的基質。舉例而言，大家都知道細胞係活性輸送某些S養與内为/必要素專，而此專營養或其類似物可立即用來增強 /舌性輸送生物有效材科進入目標細胞β這些營養之實例包括氨其酸殘基、縮氨酸(例如大小範圍約在2至10或更多個殘基之短縮 * 氨酸）、單糖及脂肪酸、内分泌要素等等。 - 如上所述，短縮氨酸是例如大小範圍約在2至10或更多個氨基酸殘基之縮氨酸。在本發明此一實施例中，這些縮氨酸輸送增釀強劑顯然不必要為疏水性，而是以其他作用方式來增強攝入率及/ 或保護與之鏈接的小分子藥劑免於在一般血流中過早水解。例如，縮氨酸輸送增強劑（例如聚精氨酸)及其他類似分子量範圍之輸送增強劑，咸被認為是因為以血漿為主的水解酵素而在空間上阻礙從生物活性劑分裂出，但隨後則因各種不同縮氨酸及/或蛋白酶(諸如組織蛋白酶）而在一目標細胞内分裂出。在某些較佳層面中，ζ及Ζ，為疏水性分子部份。在此並不希 30 1375556 望以任何理4或假設_本㈣巾疏水性促進藥效的方式，但可確〜藉由抑制細胞外組織空間内（例如，在血聚中）出現水解酵素等的化學反應，疏水性分子部份會抑織送增賴在細胞外從活性生物劑分裂出》因此，較佳的輸送增強劑，例如可包括多種疏水性氨級(諸如丙紐、峨酸、亮滅、異亮紐、蛋氨酸、脯氨酸、苯喊酸、路_及色級），錢乡_天然衍生物(諸如γ-氣基酸）’及其類似物，如前所述。在再一可選範圍中，輸送增強劑可為一種疏水性的有機分子部份。舉例而言，此有機分子部份可為Gis或更大的烷基、芳香基或異芳香基，包括取代或非取代的。有機分子部份輸送增強劑也可涵蓋與包括多種有機官能基團，例如包括-cos)及/或 -C(=0) 。 E.也學式（I) A、A’及Ϊ)其S) 1.離去或活化基圃在本發明某些層面中，A、A，為離去（leaving)或活化 (activating)基團時，適合的分子部份包括但不限於諸如N_羥基苯並三唑基0-1^(11'(^匕6112〇1：1^2〇171)、鹵素(^1(^11)、1^-經基苯並[C] °比疼嗣基（N-hydroxyphthal imidy 1)、硝基苯氧基 (p-nitrophenoxyl)、咪吐基（imidazolyl)、N-羥基丁二酿亞胺基 (N-hydroxysuccinimidyl)、噻唑烷基硫羰（thiazolidinyl thione)、0-醯基脲（〇-acyl ureas)、五氟苯氧基 ⑧ 1375556 (pentaf1uorophenoxy1) 、 2,4,6-三氣苯氧其 (2’4’6-trichlorophenoxyi)或專技人士都熟知的其他適合的離去基團。就本發明而言，離去基團係指可與正確目標上所見親核試劑起反應之基團。正確目標亦即生物活性分子部份、診斷劑乾標分子部份、雙官㈣隔基(spaeer)、巾間生成物（intermediate) 等。因此’此等目標包含置換(r^lacement)用基團，諸如蛋白質、縮氨酸、酵素、天然或化學合成治療分子(諸如阿黴素）、間隔基(諸如單一防護聯氨）上所見之NH2基團。如有需要’本發明之化合物亦可在N，N-2(羥乙基）甘氨酸基團與離去基團或附著目標（藥物）間包括一間隔基團（spacer group)。間隔基分子部份可為包含18個碳原子以内的異烴基烷氧基、烧基，甚或為一額外聚合物鏈。間隔基分子部份可使用標準合成技術加入之。應可理解的是，選作A、A’的分子部份亦可與生物活性親核試劑之外的其他分子部份起反應。 2.官能某圍 A、A亦可為官能基團。舉例而言’這些官能基團包括馬來醯亞胺基(maleimidyl)、乙稀基、颯(sulfone)殘基、經基、氨基、緩基、疏基(mercapto)、醢肼(hydrazide)、carbazate 等等，這些基團都是可以經由一種含胺間隔基附著到N，N_2(羥乙基）甘氨酸部份。一旦附著到N, N-2(羥乙基）甘氨酸部份後，官能基團（例

32 1375556 如馬來醯亞胺基）即可用來將N，羥乙基)甘氨酸聚合物附著到一目標，諸如縮多氨酸、氨基酸、或縮氨酸間隔基等之半胱氨酸殘基。 3.生物活性分早部份在化學式（I)某些層面中，A，A，為含胺或羥基之化合物。此類適合的化合物，舉例而言，包括多種有機化合物、酶、蛋白質、縮多氨酸等之殘基。有機化合物包括但不限於多種分子部份，諸

如anthracycHne(抗癌藥）化合物，包括正定黴素、阿黴素卞氫基苯胺芥末、苯丙氨酸氮芥、阿糖胞#、及相關之抗代謝物化合物，例如吉西他濱(gemcitabine，治癌藥）等。或者，該分子部伤可為-種合胺或含經基心血管劑、抗腔瘤劑(諸如喜樹驗及紫杉醇）、抗感賴、抗真_(諸如制真自素、氟㈣m咖咖⑹、及兩性黴素B)、抗焦慮藥、胃腸藥、中樞神經系統促進劑、細劑、致育因素、避孕藥、抗炎症藥、祕藥劑等之殘基。前述之外，生物活性分子部份亦可為一種酶、蛋白質、縮多氨酸、單無性繁殖系抗體 '免疫共輛物(諸如ssip) 祕合蛋白質⑽’s;諸如C⑽之殘基及其碎片，都屬本發= 細内。適合之蛋白質包括但不限於縮多氨酸、酵素、縮氨酸等，具有至少一個可供聚合物附著的基團，例如ε_氨美、 =nyUhiG、末軌基，_有生理㈣觀性之 =以及可在有機溶劑中催化反應之材料。 ⑧ 1375556 重要的蛋白#、縮錢_縮氨酸，包括但秘於血紅素、、^漿蛋白（諸如血液因子，包括因子VII、刖及IX)、免疫球蛋 '、細胞質（諸如白細胞間質，亦即IL-1到IK-3等）、α，β，γ .干擾素、群落刺激因子（包括粒性血球群落刺激因子）、血小板衍 •生之生長因子及碟脂酶活化蛋白質(PLAP)、以及胸腺素α1與腸促騰液素。-般生物或治療重要性之其它蛋白質包括胰島素、植物蛋白質（諸如植物凝血素及祕毒蛋白）、腫瘤壞死因子及相關蛋白質、生長因子（諸如轉化生長因子，諸如TGFoc或TGFP及表皮生長因子）、激素、促生長因子（s〇mat〇medins)、促紅灰球生成素 (erythropoietin)、促黑激素hormones)、下丘腦釋放因子、抗利尿素、促乳激素、絨毛膜促性腺激素、促卵泡激素、 . 促甲狀腺激素、組織胞漿素原活化劑等等。重要的免疫球蛋白包 ' 括 IgG、IgE、IgM、IgA、IgD 及其碎片。有些蛋白質，諸如白細胞間質、干擾素、及群落刺激·因子， ® 也以非糖基化(non-glycosylated)形式存在，通常是使用重組技術的結果。本發明之各種蛋白質中，也有非糖基化形式。重要的酶（酵素）包括各種與糖類相關的酶、蛋白質分解酶、氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂解酶（lyases)、異構酶、及配位酶（ligases)。重要的酶，舉例而言，包括天門冬素酶 (asparaginase)、精氨酸酶(arginase)、精氨酸脫氨酶(arginine deaminase)、腺苷脫氨酶(adenosine deaminase)、過氧化物歧化

34 1375556 酶（superoxide dismutase)、内毒素酶(endotoxinases)、催化酶 (catalases)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、脂肪酶（lipases)、尿酸分解酶（uricases)、二磷酸腺苷酶（adenosine diphosphatase)、酷·氨酸酶（tyrosinases)、及膽紅素氧化酶 (bilirubin oxidase)» 重要的糖類相關酶包括葡糖氧化酶 (glucose oxidases) 、 glucodases 、半乳糖苷酶 (galactosidases)、葡糖腦苷脂酶(giuc〇cerebrosidases)、葡糖苷酸酶(glucouronidases)等。本發明中亦包括在生物體内顯示生物活性之生物聚合物的任何部份。這包括氨基酸順序、核酸(DNa、RNA)、肽核酸(PNA)、抗體碎片、單鏈接合蛋白質（例如請參閱美國專利第4, 946, 778號，其揭示内容以參照方式併入本說明書）、結合分子（bindi叩 molecules，包括抗體或碎片融合）、多無性繁殖系抗體、單無性繁殖抗體、及催化抗體。蛋白質或其部份可料技人員所知的技術，諸如組織培養、動物源抽出，或用重組DNA方法來備製或隔離出。蛋白f、縮多氨酸、氨基酸順序等之基因轉植源(transgenic ，也在考慮範_。此類材料係取自基_植動物，亦即老鼠、褚、牛等，其中’蛋白質係表現在牛奶、血液或組織内。基因轉植昆蟲與桿狀病毒(baCulovirus)表現系統也在本發明考慮的來源中。此外’突變型(mutant versions)蛋白質，諸如突變干擾素，也在本 ⑧ 1375556 發明範圍内。其他重要有職妓⑽，糾 X '應5亥了解的是，依本說明書定義，雖未特別提及但具=用氛基图的各種蛋白質，也包括在本發明範圍内。在本發明一較佳層面中，含胺或含誠之化合物為-種生物活性化合物，適合作為醫療鱗_途，在動物治療中例如哺礼類動物，包括人類，用⑽療需要雜雜之情況。前述列舉各項僅為舉__以_本發明之化合物，料包括内容可力以修改。專技人S應可轉，其他此類化合物/合成_樣二以改° 性而不須過度實驗。可以理解岐，本·#中未_提及但具有適當附著基®之生物活性材料，也都包括在本發明範圍内。適合包括於本發日·之含胺或含祕分子，有關其類型上的僅有限制是’其中至少有-個胺基或絲(可為_/倾基或仲胺/仲經基），可與聚合物共輛物反應與鏈接；同時，在藥物前體系統釋出與再生母化合物後，不會實質失去生物活性。 4.烷基團當化學式（I)中的A、A’為烷基團時，適合的基團，舉例而士，包括Ci·6烧基、C2-6烯烴基、C2-6炔基、G-ig支化烷基、&環产美、 Cw取代烷基、G-6取代烯烴基' G-6取代炔基、CM取代環燒美、芳香族烷基、Ci-6異烷基、取代Ci-6異烷基。 36 1375556 5. 診斷劑

當化學式（I)中的A、A’為診斷劑時’適合的用劑，舉例而言，包括著色劑(dyes)、螯合劑（chelating agents)、及同位素標記化合物（isotope labeled compounds)與其他標記（示蹤)化合物，諸如綠色螢光蛋白質（Green Fluorescent Protein, GFP)。 6. 靶標分子部份

當化學式（I)中的A、A’為靶標分子部份時，適合的用劑，舉例而言，包括縮氨酸，諸如TAT縮氨酸及U-7縮氨酸；單鏈抗體，諸如CC49，及小分子，諸如牛續酸(taurine)及生物素(biotin)。 F· &N-2(羥乙基)甘氨酸键接聚合物之合命以下用實例說明如何合成特定的、以N，N_2(羥乙基)甘氨酸為主要成份的聚合物化合物。請參閱圖1，其中舉例顯示一較佳之合成方法，其包括的步驟有：

(1)使大約一當量的伸直的、受保護的雙官能鏈接劑 (extended blocked bifunctional linker) ’ 諸如：

Boc、n 〇-γΟΗ 與大約一當量的酸防護(acid protected)N，N_2(羥乙基）甘氨酸分子部份(如圖1中定義為標號丨者)起反應，以形成一中間生成物 (intermediate)，諸如： 37 ⑧ I375556 Η Ο II 〇

” Boc_N\^〇^^o^\NX_〇^c-o II

. Η N-^C、CHBU , 〆

• HO .· 其中，tBu為一防護基團； -· (2)使步驟（1)之中間生成物與一酿化劑(acylating agent，諸如乙醯氣(acetyl chloride)起反應，以形成諸如以下之中間生成物： • 〇〇〜o^\nA_oJ-〇 °\ H ^N_/C-〇tBu - (3)解除以上所生中間生成物之保護，並在基本的耦合條件下’使之與一活性聚合物起反應，諸如PNP_PEG或SC PEG; (4)解除N，N-2(羥乙基）甘氨酸之酸防護，然後在耦合條件 • 下，用一適合的活化基團（諸如噻唑烷基硫羰（thiazolidinyl thione)或 N-羥基丁二醯亞胺（IHiydroxylsuccinimide)使酸活化。製作N，N-2(經乙基）甘氨酸衍生物的另一方法包括以下步驟： (1)使大約一當量的伸直的、受保護的雙官能鏈接劑與大約一當量的酸防護N，N-2(羥乙基)甘氨酸分子部份起反應，以形成一中間生成物（intermediate)，諸如：

38

Boc—N

O o

Jl^〇> ,c-

oII N- 'OtBu 其中，tBu為一防護基團； ⑵使步驟⑴之中間生成物‘ 化基團起反應， —如以下經適當改性之活

以形成諸如以下之中間生成物：

⑷解除N’N-2(經乙基)甘氨酸之酸防護，然後在輕合條件下，用一適合的活化基團（諸如噻唑烷基硫羰或N_羥基丁二醯亞胺)使酸活化。顯然地，亦可使用此類技術界中所知的其他防護基團置換 t-Bu。現在’活化的PEG(聚乙二醇）或聚合物N，N-2(羥乙基）甘氨 ⑧ 39 1375556 酸衍生物可與一種藥物、縮氨酸、間隔基等起反應與共軛。適合的耦合劑，舉例而言，包括1，3-二異丙基碳化二亞胺 (l，3-diisopropyl-carbodiimide，（DIPC))、任何適合的二烧基碳化二亞胺(dialkyl carbodiimide)、2-鹵代-1-统基-石比咬基鹵化物（2-halo-卜alkyl-pyridinium halides，Mukaiyama 試劑）' 1-(3-二曱氨丙基）-3-乙基碳化二亞胺， (1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl carbodiimide » (EDC)) ' 丙基膦酸環酐（propane phosphonic acid cyclic anhydride， (PPACA))、及二氯墙酸苯脂（phenyl dichlorophosphates)等。這些材料可從許多商業來源取得，諸如Sigma-Aldrich化學公司，或使用已知技術合成。較佳是，各種取代物是在一種惰性溶劑中反應，諸如四曱樓氧（tetrahydrofuran，（THF))、乙腈(acetonitrile，（CH3CN))、二氯曱烧(methylenechloride，（DC1))、三氣曱烧(chloroform， (CHCh))、二曱基甲酿胺(dimethyl formamide，（DMF))或其各種不同混合物。適合的鹽基包括二甲氨基础咬 (dimethylaminopyridine，（DMAP))、二異丙基乙基胺 (diisopropylethylamine)、石比咬（pyridine)、三乙胺 (triethylamine)、K0H、t-丁氧鉀（potassium t-bqtoxide)、及

NaOH等。反應通常是在約〇°C到最高22。(：（室溫)之溫度下進行。不論所選擇的手段如何，以下是一部份從本說明書所述合成 40 0 1375556 技術產生的較佳化合物中： mPEG^^ 0-C-N、 Ο II.c> °=c 、〇

Ia) ο mPEG^^ 〇-C-N^n^〇's^Vx〇^Ss^〇v 0 ,-lL〇 ν丫’ Ο

mPEG>^\ II Η Λ 、0'

C

II 〇

〇 ιι Ρ r ο

41 1375556 ο ?Η；} ο、人〇 ο (ig)

mPEG—〇^LH γ。， Q Ο 、〇w'N， Η "〇ν 〇 ν~^ν^〇η (Ih) Η Ο mPEG-O—^—ΝΗ ί>Λ (，°

PEG I 0 mPEG-〇-li-NHNiL〇〇 I N^)n^s'a1 (Ij) 〇 ο ϋ (Ik)

，义㈣

42 1375556 O- N〇2

o

and

削〜

o 或其他離去或活化基團，諸如以上所述者。 N,N-2(羥乙基)甘氨酸活化聚合物與適合目標起反應時，會使活化的聚合物轉變成共輛物，使Al轉變成A2，其中A2為一生物活性分子部份、間隔基等之殘基。從本說明書上述技術產生的較佳化合物，舉例而言，有如下所示者：

NH-thymosin-alpha 1 43 ⑧ 1375556

NH-DOX 及 1375556 其中：

G· i重聚合物加__ 在本發明再一層面中，提供多種以N N_2(經乙基)甘氨要成份的多重支化聚合物化合物。尤其，#主要之N，N_2(經乙基) 甘氨酸衍生物經進-步改性來包括—或多個末端分支基團。較土佳這些末端分支基團如以下化學式所示：

其中： Y6及Y7各自為〇、S、或NR46， L6為一雙官能鏈接劑，選自與定義L·的相同群組； b為一雙官能鏈接劑，選自與定義L·的相同群組； R4〇-R«可為相同或不同，ϋ係選自包括氫氣、Ci-e院基、（^6稀 1375556 烴基、一C2-6块基、C3M9支化烧基、G 8環烧基、& 6取代燒基、^取、代烯基、C2-6取代快基 ' 匕8取代環絲、芳香基、取代芳香其、 .、芳香魏基、^異烧基、取代C,-6異絲、Cl禮氧基、笨驗、 . 及Ci_6異烧氧基之群組； j、i 、i、及i’各自為0或一正整數； 1及Γ各自為0或1 ; u'r、v、及w為各自選自正整數；

IM系選自包括實質上非抗原聚合物殘基、Ci禮基、匕6稀煙基、C2-6炔基、芳香族烷基、及以下物質之群組：

其中： L·為一雙官能鏈接劑，選自與定義Li的相同群組；為一雙官能鏈接劑，選自與定義L2的相同群組；仏〇係選自包括實質上非抗原聚合物殘基、Cl_e烷基、Q 6稀煙基、G-6炔基、芳香族烷基；以及其他所有變數都與以上定義者相同。所產生的支化N，N-2(經乙基）甘乱酸衍生物具有如下化學式 46 1375556 之結構： %»

〇4—(1^).—(Lg知—〇一 (CR^fR45) - (々2^43)γ A'—(z’)r-~\Cf^0-[CRA4^As)^—(CR42R43)v

Α.—(Ζ%.一 (l»3为、吹(LOriL七0—(CR3R4)n—(CR5R6)n

\ R24 II / . y^^C^C\Z}rA / ^25 0—(CR7R8)〇—(CR9R10)p

以及

其中’所有變數都與先前如上定義者相同。在前述說明及下述實例中，使用本發明方法形成# N，N_2(經乙基)甘緣合物系統’提供多重加載生物活性分子部份或其他基團之能力。本發明此種支化N，N-2(經乙基）甘紐祕的優點之 -是’專技人員可以使用雜高分子量聚合物，此外，並可根據需要以不同組合方式附著—或多種的生物活性分子部份、診斷劑 1375556 或乾標劑。 H·生物體內之洽辦在本發明另-層面中，係使用一種診斷標簽(diagn〇stic tag) 鏈接於前述輸送增強劑來選用性備製與提供本發明之共軛物。其中’選擇該標簽係供診斷或造影之用。因此，備製適合的標簽時，係將任何適當的分子部份(例如一氨基酸殘基)鍵接到任何技術界標準發射同«、傭不_#記（label)、磁振標記、或其他適於磁振造影之雜射性同位素標記、螢光型標記、在紫外線、紅外線或電化學刺激下可顯示可見顏色及/或可發營光之標記，以允許在外科手術程序等方面中顯示腫瘤組織之影像。或者，可將診斷標簽併人及/或鏈接到-共_治療性分子部份，以允許監看一治療性生物活性材料在動物或人_患_的分佈情況。在本發明再—層财，以技術界已知方法，使脉何適合的標記，例如姑胁_⑽標記，快速難_性之標示共輛物（tagged C〇njUgates)。舉例而言，這些標記包括碰^、碘既 ^(TC_99m)職銦1Π，_生峨疫_掃姆影)劑，被選擇性地吸人錄咖之_細胞。齡，目前有衫技術界已知的方法’可將縮氨酸鏈接到Tc，m，舉例而言，包括第 5,跳⑽；5, 888, 474 ; 5, 997, 844 及 5, 997, 845 號所揭示者，在此以參照方式併入本說明書。廣義而° $了解剖定位病患體内之腫瘤組織，須對疑有腫 48 I375556 瘤之病人或補，投預滅f _充分時間讓標記的免 Ιι

蛋白定位在腫雜紐，再關如目視、χ絲射照像術、電驗層攝影術、磁振造影術㈣）’儀ϋ制發光標簽照像掃打 (諸如伽瑪攝f彡機）’或其他任何適於所選標簽性質之方、、。:置器’偵測從該標記產生的信號。、法或儀然後’將侧到的信號轉換成影像’或解剖學及/或生理的腫瘤位置測定。藉由此影像可以粒生物體内的腫瘤，^ 適當的治絲略。在某些實施财，t縣分子部份本身即= 療劑時，所_到的信號可提供治療期間解剖定位之證據，= 提供追蹤診斷及治療介入的基線。 !·治療方法本發明另-層面中’提供哺乳動物體内各種不同健康醫療狀況的治療絲。這些方法，對料要此類絲之哺乳動物，給予有效份量讀物·，諸如—種隨錢N，N_2㈤乙基)甘氨酸鏈接PEG之共輛物(如本說明書前述備製者）。這種合成物尤其有助於治療_疾病、減碰瘤負擔、防錢_移(时她如 of neoplasms)、及防止哺乳動物體内腫瘤/賢瘤生長之復發。所投予的藥物前量魏其巾包括的母分子（例城氨酸、縮多氨酸、蛋白質、_)而定。通常，在各種絲方法中使用的藥物顏份量是，可在哺簡物體_效達紐料療結果的份量。當然，不_物前體化合物的劑量多少會視母化合物、 49 1375556 生物體内水解率、聚合物分子量等而不同。專技人員可根據臨床經驗及治療病徵來選擇最適宜的藥物前體劑量。專技人員可以了解實際劑量而無需過度實驗。本發明之合成物可加入一或多種適合的藥用合成物，用以投予哺乳動物服用。藥用合成物可根據技術界已知的方法備製並可為溶液、懸浮液、_、膠囊等形式。同時，此類合成物於給藥時，可為口服及/或腸外（非口服）方式，視專技人員的需要而疋。利用任何技術界已知方法注射或滲濾本合成物時例如利用靜脈注射、肌肉注射、皮下注射等方法時，可利用此合成物之溶液及/或懸浮液作為載體。此種合成物之給藥，亦可利用點滴方式輸入體内空間或體腔，亦可利用吸入及/或經鼻方式。然而，在本發明之較佳層面中，藥物前體是以腸外方式給予需要的哺乳動物。 ί___Μ 以下實例可用來進一步了解本發明，但絕非用以限制本發明之有效範圍。各實例中加底線及用粗體字表示的編號，對應圖i 至圖5中顯示的標號。化學過程與現象二Ami。所有反應都是在無水氮或氬保護氣氛下進行。其中使用市售試劑而未進一步純化。所有pEG化合物於使用前都先在真空下無水，或從曱苯以共沸蒸餾無水。除非另有指明，核磁 Ϊ375556 共掮XNMR)光譜係使用Varian Mercury® 300丽R光譜儀與使用氣化二氯甲烧(deuterated chloroform)作為溶劑取得的。所報告的化學位移（8)單位為從四甲基石夕烧(^1^11161:1^13丨13116,118)往弱場方向移動的百萬分之一（ppm)數。齡c法。監看反應混合物及中間生成物與最後產物之純度時’係用 Beckman Coulter System Gold® HPLC(高效能液相層析儀）（其中採用設有多波長UV檢波器之ZOBAX® 300SB C-8反相柱 (150x4.6mm)或 Phenomenex Jupiter® 300A C18 反相柱 (150x4. 6mm)) ’ 使用〇. 5%三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA) 含30-90%乙腈之梯度，流速為每分鐘i毫升（lmL/min)。實例1 化合物3之合成，將30ml無水二氯甲烷含2 (2.3克(g)，8· 7毫莫耳(mm〇i))、 1 U.9g，8.8mmol)、及二曱氨基砒啶(DMAP，16g，12 9mm〇1)之溶液置於冰浴中冷卻至〇cC，接著添加EDC氫氣化物（2.扣， 12. Ommol)。讓此混合物暖至室溫置放一夜，接著用〇· i Ν Ηα沖洗。讓有機層在無水硫酸鈉上方無水、過濾，並以旋轉汽化器 (rotovap)從過濾液中移除溶劑，以產生3 (3 6g，7 8麵〇1， 90%)。其中，13CNMR(75.4MHz，CDCL·) 5 170.04, 169.86, 155.54, 80.87, 78.66, 70.49, 69.95, 68.14, 62.71, 55.85, 52.59, 40. 02，28.15, 27. 9 卜 1375556 實例2 ^ 化合物4之各# • 在35ml之無水二氯甲烷含3 (1. 8g，3.9刪〇1)之溶液令，加 .入氣化乙醯(0.49g，6.2mm〇l)，接著加入二異丙基乙基胺(1歲 • i4mmo1)。在室溫下攪拌此混合物十分鐘，在此期間内，用薄層層析法(TLC)並未檢測到任何原始材料。用飽和重碳酸鈉沖洗此混合物’並讓它在無水硫咖上方無水、過濾，並赠槪化器從過馨遽液中移除溶劑，以產生1. 6 g之粗生成物。在石夕膠上使用柱層析（column chromatography)淨化此材料，並用含2. 5%乙猜之乙酸乙酯（ethyl acetate)溶離，以產生 4 (〇. 69g，丨.4刪〇1，35%)。其中，13CNMR(75.4MHz，CDCh) 5 170.60，170.27，170.02， • 155.68, 80.99, 78.88, 70.68, 70.13, 70.10, 68.34, 62.93, 62.74，56.11，52.81，52.76，40.21，28.29，28.08，20.88。實例3 • 化合物7之么占丨將20ml二氯甲烷及5ml三氟乙酸(〇 25g，〇. 5〇mm〇1) 之溶液，在室溫下攪拌15分鐘，接著用旋轉汽化器移除溶劑，以產生5。使化合物5與10ml無水二氣曱烧化合，接著添加diea，直到pH值在8· 0以上（〜〇· 2g)。將此n，N_2(羥乙基）甘氨酸溶液添加到40ml無水二氯甲院含6(5. 0g，〇. i2mmol)之溶液中，並在室溫下經過一夜攪拌。此時，用旋轉汽化器局部移除溶劑，將生成

52 1375556 物用醚（ether)沉澱、收集、再用醚沖洗。讓此粗生成物從12% DMF/IPA 再結晶，以產生 7 (4.6g，0. llmmol，90%)。其中，13CNMR (75. 4 MHz, CDCW (5 170.31，170.03, 169.76, 155.91, 80.74, 70. 64-70.19 (PEG), 69.78, 69.72, 69.23, 68.13, 63.52，62.73, 62.53，55.92，52.64，40.46，27.91, 20.69。實例4 化合物8之合成

將50ml二氣曱烷及25ml三氟乙酸含7 (4.8g, 0.12mmol)之溶液，在室溫下檀拌7小時，接著用旋轉汽化器局部移除溶劑，並用醚沉澱生成物。用過濾方式收集固體，並用醚沖洗數次，再無水之，以產生 8 (4. lg，0.10職〇1，85%)。其中，13c NMR (75 4 MHz, CDCla) 171.15, 170.25, 169.71, 155.96, 70.19-69.77 (PEG), 69.22，69.16, 63.51, .62.29, 61.94, 55.77，53ii 53.01，40.44，20.60。實例5 化合物9之合成將40ml無水二氣曱烷含8 (4 〇g，〇. lmm〇1)、2_毓基噻唑啉 (2-merCaptothiaz〇line，7〇mg，〇.59咖〇1)、及二曱氨基砒啶 (DMAP，0· lg，〇.79mm〇1)之溶液，置於冰浴中冷卻至〇〇c，接著添加EDC氫氣化物(〇 llg’ 〇. 59mm〇1)。讓此混合物暖至室溫置放一夜。此時，用旋轉汽化器局部移除溶劑，將生成物_沉殿、收 53 1375556 集、再用醚沖洗。讓此粗生成物從12% DMF/ΙΡΑ再結晶，以產生9 (3. 7g，〇. 〇9mmol，93%)。其中，l3C NMR (75. 4MHz, CDC13) ά 200. 96, 172.78，170.35，169.80, 155.93，70.70-70.21 (PEG), 69.81， 69.75，69.25，68.13，63.57，63.03，62.77，60.64，55.34, 52. 64，40· 49，28· 80，20. 72。實例6 化合物10之合成將 30ml 二氣曱烷及 30ml DMF 含 9 (3. 0g，0. 〇73mmol)、阿黴素（〇· 17g, 0· 29mmol)、及 DMAP (71mg，0. 59mmol)之溶液，在室溫下經過一夜攪拌。此時，用旋轉汽化器局部移除溶劑，將生成物用醚沉澱、收集、再用醚沖洗。讓此粗生成物從DMF/IpA再結晶三次，以產生仞（2. 9g，0. 069删〇1，94%)。其中，弋賺（75. 4 MHz’ CDCh) 5 211.24, 186.23, 185.89, 170.47, 169.82, 169.04, 161· 81，160.34，155. 78，155.14，135.20，134.79，133.84, 133.58, 120.16, 119.13, H8.01, 110.76, 110.60, l〇〇. 34, 72.19-67. 95 (PEG)，66.87, 63.31，61.75, 61.45, 58.97, 56.21， 53.83，44.44，40.29，36.03，34· 67，32.83，30.97，29.38, 24. 97，24.45，20. 54，16. 46。實例7 化合物13之合成將25ml二氣曱烷含12 (2.5g，lO.lmmol)、二甘醇脫水物 54 1375556 (diglycolic anhydride) 11 (1. lg，9. 5刪ol)、及 DMAP (i. 3g， 9· 5刪ol)之溶液，在室溫下經過一夜攪拌，接著用〇. 2 N HC1沖洗。讓有機層在無水硫酸鈉上方無水、過濾，並以旋轉汽化器從過濾液中移除溶劑，以產生13 (2. 9g，8. Ommol，84%)。核磁共振 (Nmr)顯示峰值加倍。其中，i3CNMR (75.4 MHz，CDC13) 6 172.犯 171.14, 169.92, 169.58, 157.50, 155.79, 80.86, 79.03, 71.34 70.69，70. 19，70.06，69.84，69.64，69.33，69. 15，68.85 68.40，53.29, 41.37，36.97，38.75，38.55，28.10。實例8 化合物14之合成將 30ml 無水二氣甲烷含 13 (2.8g，7.7mmol)、1 d.7g， 7. 7mmol)、及二甲氨基砒咬(MAP, 1. 3g，10. 8mm〇l)之溶液，置於冰浴中冷卻至G°C，接著添加EDC氫氯化物（1. 9g，1G. Gmmoi)。讓此混合物暖至室溫置放一夜，接著用0. 2 N HC1沖洗。讓有機層在無水硫_上方無水、猶，並赠轉汽化驗縣液中移除溶劑，以產生 14 (2. 3g，4. lmmol，53«。實例9 化合物15之合$ 在_無水二氣曱院含粗製14 (2.3g，4.1麵1)之溶液中，加入氣化乙_场，心―），接著加人二異丙基乙基胺、 8. 2麵〇1)。在室溫下攪拌此混合物十分鐘，在此期間内，用薄居

55 1375556 層析法並未檢酬任何原始材料。祕和重碳_沖洗此混合物，並讓它在無水硫酸鈉上方無水、過遽，並以旋轉汽化器從過濾液中移除溶劑’以產生2. ig之粗生成物。树膠上使用柱層析 (column chromatography)淨化此材料，並用含5%曱醇之乙酸乙酉曰（ethyl acetate)溶離，以產生一乙醯化生成物（〇. 2知， 0.40mmol，10%)。其中，13C _ (75 4 MHz，CDCh) 5 17〇犯， 170.02, 169.17, 168.44, 155.47, 80.78, 78.64, 70.64, 69.81, 69.26, 68.07, 63.01, 62.48, 55.92, 52.57, 40.00, 38.31, 28.10，27.87, 20.65。將此-乙酿化生成物(0.23g，0.38咖〇1)在2〇1111二氣曱烧及 5ml TFA形成之溶液中攪拌15分鐘，接著用旋轉汽化器移除溶劑。將此一 N，N-2(羥乙基)甘氨酸殘基與1〇ml的無水二氯甲烷化合，接著添加DIEA，直到PH值達8. G以上2g)。將此Ν，Ν·2(經乙基）甘氨酸溶液添加到30ml無水二氣甲烷含6(4.〇g，〇. 1〇mm〇I) 之溶液中，並在室溫下經過一夜攪拌。此時，用旋轉汽化器局部移除溶劑’將生成物賴職、收集、再_沖洗。讓此粗生成物從12% DMF/IPA再結晶’以產& pEGylated生成物（3 8g， 0.02mmol，95%)。其中，13CNMR(75. 4MHz，CDC13) (5 170. 29, 169. 97, 169.13, 168.37, 155.90, 80.80, 70.68-69.67 (PEG), 69.20, 68.09, 63.52, 63.02, 62.47, 55.94, 52.59, 40.49, 38.31, 27.91, 1375556 20. 69。將40ml二氯甲烷與20ml TFA含此PEGylated生成物（3. 8g， • 0. lOmmol)之溶液，在室溫下攪拌15小時’接著用旋轉汽化器局；部移除溶劑，並用醚沉澱生成物。用過濾方式收集固體，並用醚沖洗數次，再無水之，以產生酸（3. 4g，〇. 〇8mmol，89%)。其中， 13C NMR (75.4 MHz, CDCh) 5 170.96, 169.93, 168.89, 168.23, 155.78, 72. 45-66. 94 (PEG), 63.23, 62.38, 61.63, 54.82, 52.47, • 40.23，38.03，20.39。將40ml無水二氯曱烧含此酸(3· 4g，〇. 〇8_ol)、2-魏基》塞唾啉（59mg，0. 50mmol)、及二曱氨基石比啶(DMAP，81mg，0. 66mmol) 之溶液，置於冰浴中冷卻至0°C，接著添加EDC氬氯化物（〇. Ug， • 〇. 59mmol)。讓此混合物暖至室溫置放一夜。此時，用旋轉汽化器局部移除溶劑，將生成物用醚沉澱、收集、再用醚沖洗。讓此粗生成物從20% DMF/IPA再結晶，以產生15 (3. 2g，0. 〇78mmol， • 94%)。其中，13CNMR (75. 4 MHz，CDCh) (5 200.96, 172.64, 170.28, 168.13，168.34，155.85，75.76-69.15 (PEG)，68.07, 63.48, 63.20，62.62，60.56，55.31, 52.53，4(U4，38.26, 28.74, 20. 66。實例10 化合物16之合成將 30ml 二氣甲烷及 30ml DMF 含 15 (3. 2g，0. 〇783mmol)、阿 57 ⑧ 1375556 黴素0K18g’（Ul9mm〇i)、及 MAp(77mg，〇.62mm〇〇之溶液，在至溫下經過-_拌。此時，用旋轉汽化器局部移除溶劑，將生成物用醚/儿;&、收集、再用趟沖洗。讓此粗生成物從施勝以以再、’ΉΒΒ四-人以產生16 (2也q· Q67mmc>i，繼）。其中，$眶 (75.4 MHz, CDCh) ^ 212.98, 186.21, 185.86, 170.34, 169.33, 168.98, 168.29, 160.32, 155.79, 155.58, 154.94, 135.22, 134.70, 133.23, 133.05, 120.09, 119.14, 118.03, 110.79, 110.61, 100.29, 75.90-68.44 (PEG), 67.80, 66.91, 64.90, 63.31, 62.06, 61； 36, 58.79, 56.18, 53.86, 53.60, 44.37, 40.26，38.12, 35.25，33.27，29.33，20.47，16.48。實例11 jb合物17之合成於室溫下，在2Gml二氣甲烧含12 (i.Gg，UmmQi)之溶液中，加入二光氣（triphosgene，0.4g，1.3mmol)及二異丙基乙基胺（1. 0g，8. lmmol)。在室溫下攪拌此混合物一小時，接著添加i (〇. 88g，4. Orninol)與 DMAP (〇. 5g，4. Ommol)。讓此混合物在室溫下授拌一整仪，接著用0· 1 N HC1沖洗。讓有機層在無水硫酸鈉上方無水、過濾，並以旋轉汽化器從過濾液中移除溶劑，以產生 2. 2g之粗生成物。在矽膠上使用柱層析（㈤觀chr〇mat〇graphy) 淨化此材料’並用含6%曱醇之乙酸乙酯溶離，以產生17 (丨.3g， 2.6mmol，65°/〇4*’13CNMR(75.4MHz，CDCl3)6 17〇.86，156.23,

58 1375556 155.69, 81.10, 78.94, 62.60, 59.03, 56.81, 56.09, 53.17, • 40.68, 40.18, 28.28, 28.00。 . 實例12 化合物18之合成在2ml無水二氣曱烷含17 (0. lg，〇.2mmol)之溶液中，加入氣化乙酿（32mg，〇.4mm〇i)，接著加入二異丙基乙基胺（87mg， B 0. 67mmol)。在室溫下攪拌此混合物1〇分鐘，在此期間内，用薄層層析法並未檢測到任何原始材料。用飽和重碳酸鈉沖洗此混合物，並讓它在無水硫酸鈉上方無水、過濾，沖洗。讓有機層在無水硫酸納上方無水、過濾，並以旋轉汽化器從過濾液中移除溶劑，以產生18(〇.1&02麵〇11〇〇%)。其中，丨3(：臓(；75.4丽2：，（：1)(：13) 占 170.59，170.33，156.16，155.64，80_ 99，79.13，70.21, 70.05, 63.08, 62.97, 56.48, 53.46, 52.92, 40.87, 40.39, > 28.49，28. 27，21.04, 20. 69。實例13 化合物20之厶# 將8ml —氣甲烧及2ml TFA含18 (0. lg，0. 2mmol)之溶液授摔15勿知’接著用旋轉汽化器移除溶劑。將此一 N，N-2(經乙基）甘氨酸殘基與5ml無水二氯甲就合，接著添加腑，直到pH 值達8.0以上㈠6g)。將此N，N 2(羥乙基）甘氨酸溶液添加到 15ΐ〇1 ’"、水—氣甲烧含W (2. 0g，〇. 〇5mmol)之溶液中，並在室溫

59 下經過-戏拌。此時，麟轉汽化器局部移除溶劑，用酸沉彡殿、1½•隹 =n ’ 市 '再用醚沖洗。讓此粗生成物從12% DMF/ΙΡα再結晶’以產生 2Q (1n G4_l，90%)。其中，|3C NMR (75 4 ， CDCh) 5 170.50, 17〇 18j 156 4〇j 156 37) 156 〇8> 155 80.74, 71. 57-65. 23 (PEG), 63.72, 63.29, 62.62, 58.68, 56.10, 53.13，52.53, 40.93，40.51，27.94，20.74。實例14 化合物21之合成將20ml之二氣曱烷及1〇ml三氟乙酸(TFA)含2〇 (丨骀，〇· 04_1)之溶液’在室溫下攪拌7小時，接著用旋轉汽化器局部移除溶劑，並用醚沉澱生成物。用過濾方式收集固體，並用醚沖洗數次，再無水之，以產生酸（1.4g，0.03mmol，78%)。其中，l3c NMR (75.4 MHz, CDCh) d 172.11, 170.34, 156.39, 156.16, 155.41, 72. 80-67. 82 (PEG), 63.75, 63.35, 62.30, 61.89, 58.71, 56.15，53. 66，53. 25, 40. 93，40. 55, 20. 65。將10ml無水二氣曱烷含此酸(ug，o.oSmmoD、2-毓基噻唑琳(O.Olg，0.09晒〇1)、及二甲氨基砒啶(DMAP，0.014g，0.12imol) 之溶液’置於冰浴中冷卻至〇χ，接著添加EDC氫氯化物（0. 017g，〇· 09mmol)。讓此混合物暖至室溫置放一夜。此時，用旋轉汽化器局部移除溶劑，將生成物用醚沉澱、收集、再用醚沖洗。讓此粗生成物從12% DMF/IPA再結晶，以產生21 (l.lg，0. 03mmol， 1375556 92»。其中，l3CMR(75.4MHz，CDCh) (5 170.76, 170.46, 156.33, 155. 99，155. 30，71. 54-69.12 (PEG)，63.69，63. 32, 62.84, . 62.62, 60.70, 58.67, 55.36, 53.05, 52.49, 40.92, 40.49, . 28· 78，20. Ή。實例15 化合物22之合成將 10ml —氣甲烧及 10ml DMF 含 21 (1. 〇g，〇. 〇25mmol)、阿 _ 黴素（28mg，〇.〇5mmol)、及 DMAP (12mg，〇. 1腿〇1)之溶液，在室溫下經過一夜攪拌。此時，用旋轉汽化器局部移除溶劑，將生成物用醚沉澱、收集、再用醚沖洗。讓此粗生成物從12% DMF/IPA 再結晶三次’以產生 22(0. 6g，0.015mmol，60°/〇。實例16 : 化合物24之合成將 230ml 二氣曱烷及 23ml DMF 含 23 (23g，0. 575mmol)及丁 ® 二醢亞胺基石炭酸鹽(disuccinimidyl carbonate, 2. 36g, 9. 2mmol) 之溶液’冷卻至〇°C，接著添加>5比咬（0. 75ml, 9. 2mmol)。讓此混合物暖至室溫置放一夜，隨後用Celite®過濾，再用旋轉汽化器局部移除溶劑，將粗生成物用醚沉澱，並用過濾法收集之。從2〇〇/fl DMF/IPA 再結晶產生 24 (20. lg，0. 50mmol，86%)。其中，13C NMR (75.4 MHz, CDC13) (5 168.15, 151.14, 70. 76-69. 67 (PEG), 67.99, 45. 24，25. 20。 1375556 實例17 •t J匕合物25之合成使18 (0·51& 0.9刪〇1)之溶液與l〇ml無水二氣甲烷化合，〆接著添加臟，直到PH值達8· 0以上(~〇. 6g)。將此N，N一^乙基)甘氨酸溶液加入40ml無水二氯枚含24 (5.0g，〇.ι2_υ 之溶液，並在室溫下娜—整夜H職轉汽化器局部移除溶劑，將生成物_沉澱、收集、再細沖洗。讓此粗生成物從 * 12%DMF/IPA 再結曰曰曰，以產生 25 (4.9g，0.12mm〇l，94%)。其中， C 臓（75. 4 MHz, CDCh) 5 17G· 38, 170.12, 155.90(d)，80. 65, 72.16-69.20 (PEG), 63.51, 62.79, 62.62, 61.28, 56.12, 53.10, 52.53，45.19, 40.46，27.91，20.72。 ’ 實例18 化合物26之合成將 55ml 二氯甲烷與 28ml TFA 含 25 (5. 5g，0.13mmol)之溶鲁液，在室溫下攪拌7小時，接著用旋轉汽化器局部移除溶劑，並用醚沉澱生成物。用過濾方式收集固體，並用醚沖洗數次，再無水之’以產生酸(5· lg，〇. i2mmol，93%)。其中，l3C MR (75. 4 MHz, CDCb) (5 170.49, 170.20, 156.01, 155.68, 70. 70-69. 22 (PEG), 67.80, 66.68, 63.54, 62.64, 61.65, 61.22, 55.45, 53.57, 53. Π，45.21，40.52，20.56。將50ml無水二氣曱烷含此酸(5. 0g，〇. l2mm〇l)、2_酼基噻唑 62 1375556 淋（〇. Hg，1.4mmol)、及二曱氨基砒咬(DMAP，〇 23g，1.9mm〇l) - 之溶液，置於冰浴中冷卻至〇〇C，接著添加EDC氫氯化物（0. 28g, . L5mmo1)。讓此混合物暖至室溫置放一夜。此時，用旋轉汽化器局部移除溶劑，將生成物用醚沉澱、收集、再用醚沖洗。讓此粗生成物從12% DMF/IPA再結晶，以產生26 (4.6g，0. llmmol， 92%)<^r^’13cNMR(75.4MHz，CDCl3)5 200.88，172.83，170.38, 155· 91，72. 15-69. 20 (PEG), 63.51，63.03, 62.82, 62. 62, 61.26 60.70，55.34，53.07，52.52，45.19，40.47，28.78，20.71。實例19 化合物27之合成將 20ml 二氣曱烷及 20ml DMF 含 26 (2. 3g，0. 055mmol)、阿黴素（0. 25g，0.44mmol)、及 DMAP (0· llg，0. 88_〇1)之溶液，在 1 室溫下經過一夜攪拌。此時，用旋轉汽化器局部移除溶劑，將生成物用醚沉澱、收集、再用醚沖洗。讓此粗生成物從12% DMF/IPA > 再結晶二次，以產生 27 (1. 7g，0. 039mmol，71%)。實例20 jJJ，N-2C羥乙基）甘氨酸-12K-溶菌酶與單N，N-2C羥乙基）甘氨酴 -20K-溶菌酶共聚物之備製將PEG與蛋白質之反應莫耳比設為1 ·· 1. 5-2，以快速攪拌方式將PEG粉末加進含6ml之5mg/ml溶菌酶(Sigma, M0出品）之0. 05M 磷酸鈉（pH 7. 6)。在反應溫度25°C及N2環境下進行反應60分鐘 63 1375556 後’用10mM磷酸鈉(PH5.1)稀釋樣本，使其傳導率低於2ms, pH〜5 (較低之pH會抑制反應並穩定可釋出的pEG與蛋白質共軛物）。在一陽離子交換柱(porosHS，Applied Biosystems, CA 出品）上離析出單PEG-溶菌酶，使用的溶劑系統是2〇mM磷酸鈉 (ρΗ5· 1) ’使用的梯度緩衝劑是2〇mM磷酸鈉(pH5.1)含1M NaCl。從柱上溶離出的化合物順序，首先顯示的是多PEG_溶菌酶，然後是單PEG-溶菌酶’接著是天然溶菌酶。使用設有5k NMWL膜片的 Ultrafree 離心過濾裝置(Miliip〇re Corp.，Bedford, ΜΑ 出品）收集與濃縮在SDS-PAGE (Invitrogen，CA出品，預製之4-20% SDS 非還原性凝膠體）上辨識的單PEG-溶菌酶峰值。實例21

-gOK-溶菌酶共聚物之備製將PEG與蛋白質之反應莫耳比設為1:20-30 ’以快速攪拌方式

將PEG粉末加進含〇·5ιη1之5mg/ml溶菌酶的0.1M填酸鈉（pH 7· 6)。反應在室溫及A環境下進行60分鐘，然後將pH降低至6. 0 來停止反應’或在一尺寸篩析柱(size exciusi〇n c〇iumn)上立即純化。使用20mM磷酸鈉（pH6. 0)稀釋反應混合物至5m卜經過0. 45μιη 過據器過遽’並在 Hiload Superdex 200 柱（Amersham，NJ 出品）上分離出。柱子在140mM NaCl、20mM NaP、pH6. 0時達到平衡，

64 !375556 然後以lml/fraction/min(每分鐘每碎片iml)之速率溶離出共輛物。使用 Ultrafree 30K (Millipore Corp.，Bedford，MA 出品）將SDS-PAGE上辨識的峰片斷集中與濃縮。實例22 試管内之結果

蛋白質共軛材料與方法表1 : PEG-N，N-2(羥乙基）甘氨酸-阿黴素共軛物化合物 ti/2(rp) Mw %活性 h 10 4.8 41803 2.60 16 5.0 41554 2. 34 22 56 41204 0.73 27 247 43722 4.25 實例23 雞卵白溶菌麵（EC 3. 2.1.17)、溶菌酶基質菌 /ysa/e/h/oAs)、及 PBS 緩衝劑（l〇mM 磷酸鹽(PH7. 4)、138mMNaCl 及2. 7inM KC1)係從抵蘇里州聖路易士城之sigma Inc.靖買。預製三甘氨酸SDS電泳膠及凝膠流動緩衝劑係從加州之invitr〇gen公司購買。用來測量試管内共軛物水解之老鼠血漿，係在乙二胺四醋酸(EDTA)中處理並冷凍儲存^ IL-2係從紐澤西州普林斯敦之 ⑧ 1375556

PeproTech公司購貝，GFP係從加州帕婁奥都之Q〇ntech公司蹲買。所有生物體内之測定都做三次，試管内測定則有±5%之標準差存在。單PEG-溶菌酶共軛物之備製取自雞卵之溶菌酶，其分子量為14,5〇〇，並有6個賴氨酸殘基。將PEG與溶菌S#之反應莫耳比設為1:1，以快速授拌方式，將 /舌化的PEG粉末添加到0.1M碌酸鹽緩衝劑（pH7. 3)含5mg/inL溶菌酶之溶液中。在25°C下攪拌45分鐘後，用〇· 2M磷酸納(pH5.1) 處理反應，達到最後pH值6. 5。使用6, 000-8, 000MW截止膜片，在4°C下’用20mM磷酸鈉(ΡΗ5· 1)透析反應混合物。樣本在透析後的傳導性應該低於2mS。單PEG-溶菌酶之離析，是在一陽離子交換柱(Poros，HS出品）上執行，其中使用的溶劑系統是具有NaC1 梯度緩衝劑之20mM磷酸鈉(pH5.1)。收集與濃縮單PEG-溶菌酶峰時’係使用设有l〇k NMWL膜片的Ultrafree離心過遽裝置 (MilliporeCorp.，Bedford，MA‘出品）。純化的單 PEG-溶菌酶產出率約為20-30%。多PEG-溶菌酶共辆物之備@ 將PEG與溶菌酶之反應莫耳比設為30:1，以快速攪拌方式，將活化的PEG鏈接劑添加到〇. 1M磷酸鹽緩衝劑（pH7. 3)含5mg/mL 溶菌酶之溶液中。在室溫下攪拌45分鐘後，用〇·2Μ磷酸鈉(pH5.1) 處理反應，達到最後pH值6. 5。使用H2〇稀釋反應混合物’並以1 66 ⑧ 1375556 mL/分鐘之速率，在HilQad Superdex 柱上分離出。柱緩衝劑包含20mM猶鈉(ρΗ6· 8)與14謹.卜峰片斷之收集與濃縮，

係使用設有30kNMWL 膜片的U1 trafree離心過濾裝置(Mi i 1 ip〇re C〇rP.’ Bedford’ MA出品）。純化的多pEG_溶菌酶產出率約為 85%。使用螢光測定分析時，發現每一溶菌酶分子之_數目為 5-6。 " 濃度測定 PEG-溶菌酶共軛物之濃度是用紫外線測定的，其中，在構酸納（PH7.3)及28Gnm之條件下，使用之吸光係數是 2. 39mL/mg. cm。溶菌酶之酶活性測定在前述反應條件下，溶菌酶活性在僅與一單pEG共軛後即消失。在各種不㈤槪條件下再生之溶麟活性，顯示有溶菌酶釋出，並在SDS電泳膠上獲得確認。在一典型的溶菌酶活性測定中，係在一 96阱之滴定濃度皿内，將〇 2mL的〇. 〇2% (w/v) | （酶基質）添加到含於66mM麟酸鈉(pH6. 2，含0· 01%BSA)的0· 12-0. 24pg溶菌酶中。追蹤45〇nm時的吸收度，持續5分鐘。將吸收度之下降速率用作酶活性之度量。在及 450nm時，每一單位酶活性產生每分鐘〇咖吸收度單位之變化。圭鼠血漿内與化學緩衝劑内之溶菌酶釋出愔沉使構酸鈉緩衝劑(pH6. 5)中之peg-溶菌酶共輛物與PBS(pH7. 4)

67 1375556 交換緩衝劑，以監看老鼠血財釋出的情況。測量抓時在哪中的穩定性。也使該共㈣與Μ交換緩衝劑，以觀察三經甲基氨基甲烧緩衝劑(THs buffer)⑽.5)中的釋出情況。在單溶菌酶共扼物時’係使用CentriConlGK離心管(Miuip⑽c〇rp., Bedford, ΜΑ出品）；而在乡PEG-溶菌酶共輛物時係使用 CentriCon3GK°從單或彡PEG-溶g酶共細^釋丨溶自酶時，是在〇· 15mg/mL及仏環境的條件下進行。在指示之時間抽出—測定用量’用0·2Μ碟酸鹽(PH5.1)中和至PH6. 5，並在用於進-步分析前’儲存在-20°C之溫度下。【圖式簡單說明】圖1-5概要顯示形成本發明化合物的方法，其細節均詳述於實施方式及所舉實例中。【主要元件符號說明】

68

Claims

1375556 申請專利範圍：

a 曰修正>

種化合物，係由下列化學式（I)構咸： R1~\Cx-(Li)i~(L2)^0—(CR3R4)n—(CR5R6)n Y) 、25 A·—(z')d.—(l3^~\c4—〇—(CR7R8)0—(CR9R10)F (I) 其中= Ri係為聚亞烴化氧(polyalkylene oxide)或 A -(CR42R43)r R50~\^c/-(Le)j-(L8)j_—〇一(CR44R45)u- R 40 R. .41 A'—(Z，)r——(L6)|—VC7~〇一 (CR44R45)w——(CR42R43)v

其中： Y6及Y7各自為0、S或NR46 ; R50為一聚亞烴化氧或 69 1375556

其中Rbd為一聚亞烴化氧；

Z及Z’可為相同或不同，並各自選自由胺基酸(amin〇 acids)、胜肽(peptides)、聚胺殘基(polyamine residues)、Li、醣殘基(sugar residue)、脂肪酸殘基（fatty acid residue)、Ce-is 烧基、取代芳香基(substituted aryls)、異芳香基 γ4 (heteroaryls)、一L5-及其組合組成之群組，其中Ls為一雙官能鏈接劑（bifunctional linker)且 Y4為 0、S 或 NRii ; Y1-3可為相同或不同，並係選自由〇、S及NRn組成之群組； Li、L3、L6及Iy?為彼此獨立之雙官能鍵接劑；其中雙官能鏈接劑分別選自由下列各項組成之群組： _NRl9(CRl4Rl5)tO_， -NRi9(CRi4Ri5)t(CRi6CRi7〇)qNRi9-, -0(CRuRis)tNRi9-， -0(CRl4Rl5)t0_， _NRl9(CRl4Rl5)tNRl9-， -NRi9(CRi4Ri5)t(CRi6CRi7〇)q-, 1375556 -NRi9(CRi6CRi7〇)t-， -NRl9(CRl6CRl7〇)t(CRl4Rl5)ciNRl9-， -0(CRi6CRi7〇)tNRi9~ ,

D

-NR19(CR14R15)q (CR16R17)tO- R

其中： ' RifRn及R19係各自選自由下列各項組成之群組：Ci-6烷基、 C2-6烯烴基、C2-6炔基、C3-19支化(branched)烧基、C3-8環院基(C3-8 鲁 cycloalkyls)、Ci-6 取代烧基(Ci-6 substituted alkyls)、C2-6 取代烯烴基（C2-6 substituted alkenyls)、C2-6 取代炔基（C2-6 substituted alkynyls)、C3-8 取代環烷基（C3-8 substituted cycloalkyls)、芳香基（aryls)、取代芳香基（substituted aryls)、芳香族院基(aralkyls)、Ci-6異烧基(C1-6 heteroalkyls)、取代 C1-6異烷基(substituted C卜6heteroalkyls)、Ci-6烷氧基(C1-6 alkoxy)、苯氧基(phenoxy)及 Ci-6 異烷氧基(Cm heteroalkoxy); 且 71 1375556 R18係選自由下列各項組成之群組：Ch烷基、(：2-6烯烴基、c2_6 块基、G-19支化炫基、C3_s環烧基、Ci-e取代烧基、C2-6取代稀烴基、 . G-6取代炔基、C3·8取代環烧基、芳香基、取代芳香基、芳香族烧基、 Cl-6異烧基、取代Cl-6異烧基、Cl-6烧氧基、苯氧基及Cl-6異院氧基、 NOz、鹵烧基(haloalkyl)及鹵素(halogen);且 t及s係各自選自1至4的正整數； R3-R1I、R24及R25可為相同或不同，並係選自由下歹lj各項組成馨之群組：氫氣（hydrogen)、Ci-6烷基（alkyls)、C2—6烯烴基 (alkenyls)、C2-6炔基(alkynyls)、芳香基(aryls)、Cu異烷基(〇_6 heteroalkyls)、Ci-6烧氧基(Ci-salkoxy)、苯氧基(phenoxy)及C卜6 異烧氧基((^1-6 1^16]：〇&11«^7); * L2、Ls及L9各自為： * - C(〇)(CR3〇R31)Yl5(CR32R33)C(0)NR35-或 -C(0)(CR3〇R31)(CM33)C(0)NR35-其中： Yi5係選自由〇、S、NR34及CH2組成之群組；且匕〇-35可為相同或不同，並係選自由Η、烷基、烯烴基、炔基、異烧基及芳香基組成之群組； Α’可為相同或不同，並各自選自由烷基團、離去基團、官能基團、5乡斷劑、乾標分子部份(targeting moiety)、生物活性分子部份及0H組成之群組； A可為相同或不同’並各自選自由診斷劑、輕標分子部份及 72 1375556 生物活性分子部份組成之群組； a、 g、j及i可為相同或不同，並各自為0或1至5的正整 • 數； .- e及j’各自為1至5的正整數； b、 c、d、d’ 、卜Γ及i’可為相同或不同，並各自為0 或1 ;以及 m、n'o及p各自為1 ; • u、r、v及w可為相同或不同，並各自為1至6之正整數；但以（a + e)等於或大於1為條件。 2.如申請專利範圍第1項之化合物，其中，R3-R1。、R24-25及R3Q-34各為氮；且Yl5為0或NR34。 ' 3.如申請專利範圍第1項之化合物，其中，a、b、c及e各為1。 • 4.如申請專利範圍第1項之化合物，其中，d’及g均為0。 5. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中，沁包括一種聚乙二醇馨 (polyethylene glycol)。 6. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中，A為一種離去基團、靶標基團或生物活性分子部份；以及，A’為一種烷基團、離去基團、靶標基團或診斷劑。 7. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中，Ri進而包括一種封端基團（capping group) J，其係選自由 0H、腿、SH、CO2H、Ci-6烧基分子部份、及 73 1.375556

組成之群組。 8.如申請專利範圍第7項之化合物，其化學式為：

9.如申請專利範圍第1項之化合物，其中，Rl係選自由下列各項組成之群組： J- 0-(CH2CH20)x-J-0-(CH2CH20)x-CH2C(0)-0-， J-0-(CH2CH20)x-CH2CH2 NR12- » J-0-(CH2CH20)x-CH2CH2 s-， -OC(0)CH2-0-(CH2CH2〇)x-CH2C(0)-0-， -NR12CH2CH2-0-(CH2CH2〇)x-CH2CH2腸2-，以及 -SCH2CH2-〇-(CH2CH2〇)x- CH2CH2S- 其中： x 是聚合度（degree of polymerization); 74 1375556 心係選自由氫、G-6烷基、c2_6烯烴基、c2-6炔基、C3-19支化烷基、C3—8環烷基、G—6取代烷基、c2_6取代烯烴基、c2_6取代炔基、 Cm取代環烷基、芳香基、取代芳香基、芳香族烷基(aralkyls)、 / Cl-6異烷基、取代Ci-6異烧基、Cm烷氧基、苯氧基及G-6異烷氧基 - 組成之群組；以及J是一種封端基團。 10. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中，Ri係選自由下列各項 Φ 組成之群組： CH3- 0-(CH2CH2〇)X- ’ CH3-0-(CH2CH2〇)x-CH2C(0)-0-， CH3-0-(CH2CH2〇)x-CH2CH2 NH_ 及 _ CH3-〇-(CH2CH2〇)x-CH2CH2 S- 其中，x是聚合度。 11. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中，Rl包括如下化學式之 ^ 聚合物殘基： —o^ch2ch2o^— 其中： X是聚合度。 12. 如申晴專利範圍第1項之化合物，其中，L2係選自由下列各項組成之群組： -C(0)CR3〇R31〇CR32R33C(0)NR35-； -C ( 0) CR30R31NR34CR32R33C (0) NR35-； 75 1375556 -C(0)CR3〇R3lSCR32R33C(0)NR35-;或 -C(0)(CR3〇R3l)nC(0)NR35-；其中： R3〇-34係各自選自Η、G-6烷基、C2-6烯烴基、C2-6炔基、Ci-6異烷基或芳香基；以及 η為一正整數，為1到3。

13.如申請專利範圍第1項之化合物，其中，R!係選自由下列各項組成之群組： m-PEG- -N—C m-PEG-〇- •C-N、 CH—(Z"CH2)hC(0)— (CH2)4 Η m-PEG N-—CII 0 CH—(ZnCH2)u〇(〇)— m-PEG-O —C—N 0 巾-PEG-0-C-NH m-PEG-0- •C-N (CH2)q

iCH2)q (CH2)q HC——(Z，_CH2)hC(0 卜 /(〇H2)q m-PEG-0-C*II 0 m-PEG-0—C- and 0 II m-PEG——C-NH \ (〇H2)q I HC——(ZnCH2)hC(0)— (CH2)q m-PEG—C-N II H 〇 76 1375556 其中： (q)為1至5之整數； Z為〇、NR!3、S、SO或Sa ;其中心為H、&8烷基、& 8支化烷基、G-8取代烷基、芳香基或芳香族院基； (h)為〇或1 ;以及 (k)為1至6之正整數。 14.如申請專利範圍第1項之化合物，係選自由下列各項組成之群〇 mPEG^^ II Η 〇_c_nn/>

(la)

mPEG^^\

77 1375556 mPEG 〜0! -NH Ό Λ°Λ ο Λ/ Ο Ν _Αδ ⑽ ο mPEG^\/0^C——ΝΗ 〇 Ο "〇/Ν^°\Α/°\Λ〇 Ο人〉·Λ⑼ ch3

mPEG. 、。-C-NH，〆，又 (ig) Y〇 mPEG、 O C-NH^/x 0 0Λ/S人 K 〇 n^^oh H mPEG-Ο^1—NH. y—0, 〇 J~( ^v〇/ \y 、N—^Ai (Π)

0 〇 mPEG-Ο-^—NH、/ 0、 0 (Ij) ^V(

78 1375556 及〇、

Ο -Ν Ο. ο Ν~^\ (Im) 其中么!為一離去基圑。 15.如申請專利範圍第丨項之化合物，其中，Αι為—離去基團，係選自由下列各項組成之群組：〇~ΧΙ}~ν〇2 _ό and 〇-Ν Ο Ο

16.如申請專利範圍第ι項之化合物，包括以下結構： iCy~(L6)r(L8)r〇-(CR44R45)u-(CR42R43)r ^40 A'-(2')i·—(L6lrVc/-〇-(CR44R45)w-(CR42R43), R4l r〇7(-(L1)a-(L2)r0"'(CR3R4)n-(CRsR6)m A'-(Z')d-(L31g-\C/-〇-(CR7R8)0-(c'R9R1〇) R25 17.如申請專利範圍第π項之化合物，包括以下結構： \ ^40 / ^41 C-ί—(L7)j一(Lg)j·-〇 - (CR44R45)U —(Cp42R43)i fY\ A’一(2').,-(|_7-)j--O 一 (。只44闩45)埘—(CR42R43)v 79 1375556

C/-(L6)j~(L8)r〇-(CR44R45)u'(CR42R43)r )¾ A*—(Z')}-—(|_0)pVc^O__(CR44R45)w_(CR42R43)v A,-(Z,)d.-(L3V^cr0~(CR7R8)〇'(CR9R1〇)p >fA 18.如申請專利範圍第1項之化合物，其係選自由下列各項組成之群組： 0 mPEG^\ U Η 7、〇-C-N、 Ο 〇

、。〜。0九。兮' J Η II Ν—Ν /C、〆 0mPEG^〇-I-N^ Η 众〇〇 o s -Q II 'N」C、N'

γ mPEG^\ 〇II o-c-Ν^^^σ H 〇 II ? s Ί〇认〇 <?

s Yc 义 mPEG^^o 人 H Y

〇 N 〇 Ύ〇/ 80 1375556

以及 ο .S N XI N S Ο 〇、

O -N 19.如申請專利範圍第1項之化合物，其係選自由下列各項組成之群組：

81 1375556

NH-DOX C-^CH2CH2〇)-nC 比n丨 ,Κ 0^/·^ 八 /NH-DOX T 0、、/〇其中：DOX 為 doxorubicin ; and PEG O mPEG H3C、〇>\ /〇、 20.如申請專利範圍第1項之化合物，其係選自由下列各項組成之群組： mPEG^〇.H Η Ο Ο II Ο A_〇^co II A、 ΗΝ、 COIIο ο ο II οX^〇^c-o II ~^ /C、 AV c-o II O Ο Ο o mPEG 一 ο.!},〜Ο/。〜Of 〇八J[〇 J y^o^i-o^ O ^ A'Y〇" 82 V 1375556

ο ο mPEG·^。、芒一 Ν〜〇/〇〜〇γ^〇4〇— p Η Ο —Ν~Ό、 Α\(Γ ο

、Α

以及

其中，Α及Α’各自為離去基團。 21. —種聚合物共軛物之備製方法，包括的步驟為’使具有如申請專利範圍第1項化學式之化合物： 83 1375556

(L-i)i~(L2)^-〇—(CR3R4)n—(CR5R6)m ；n^Lc-(z^-a1 A，一(Z，)d.—(L布：C-f-0—(CR7R8)〇-(CR9R10)p ^25 (I) 其中： Ai為一離去基團； A’為選自由烷基圑、離去基團、官能基團、診斷劑、靶標分子部分及0H組成之群組；吣係選自下列各項組成之群組：一種聚亞烴化氧或

〇/—(L6)j—(L8)j'—Ο一 (CR44R45)u——(CR42R43)r

R, N- 40 -、cr r41 A'-(Z')j'-(Lg)j T~Ct 0 (CR44R45XV (CR42R43)v 其中： Y6及Υτ各自為0、S或NR46 ; Rs〇為一聚亞烴化氧或 84 1375556

其中Rm為一聚亞烴化氧； 2及冗’可為相同或不同，並各自選自由胺基酸、胜肽、聚胺修殘基、Ll、醣殘基、脂肪酸殘基、Ch烷基、取代芳香基、異芳香 i -LJ4— 暴、5 及以上各項之不同組合組成之群組，其中Ls為一雙官能鏈接劑’以及Y4為0、S或NRu ; ,· Yl-3可為相同或不同，並係選自由0、S及NRu組成之群組； *. Ll、U、L·及為彼此獨立之雙官能鏈接劑； R3-Ru、R24、&及R4〇-R46可為相同或不同，並係選自由氫氣、 Ci_6烧基、C2-e；fcijj經基、C2-6快基、C3-i9支化烧基、C3-8環烧基(C3-8 cycloalkyls)、Ci-6取代烧基(Ci-6 substituted alkyls)、C2-8 取代坤經基(C2—6 subst i tuted a 1 keny 1 s)、C2-6 取代炔基(C2-6 subst i tuted alkynyls)、C3-8取代環院基(C3-8 substituted cycloalkyls)、芳香基(aryls)、取代芳香基(substituted aryls)、芳香族烷基 (aralkyls)、Ci-6異烧基(Ci-6 heteroalkyls)、取代 Ci-6異烧基 (substituted Ci-6 heteroalkyls)、Ci-6烧氧基(Ci-ealkoxy)、苯氧基(phenoxy)及Ci-6異炫氧基(Ci-6 heteroalkoxy)組成之群組； 85 1375556 L<2及L/8-9各自為： -C(0)(CR3〇R31)Y15(CR32R33)C(0)NR35-或 -C(O)(CR30R31)(CR32R33)C(O)NR35- 其中： Yi5係選自由Ο、S、NR34及CH2組成之群組；以及 R3〇-35可為相同或不同，並係選自由Η、院基、烯烴基、炔基、異燒基及芳香基組成之群組； a、g、j及i可為相同或不同，並各自為〇或大約1至5的正整數； e及Γ分別為大約1至5的正整數； b、c、d、d’ 、卜1’及i，係各自為〇或丨；以及 m、n、o及p各自為1 ; u、r、v及w可為相同或不同，且各自為j至6之正整數；但以（a + e)等於或大於1為條件；

在充分條件下與一生物活性劑起反應，以形成： J1 1 \ A (Ll)a~iL2t°—(CR3R4)n—(CR5R6)m

\ R24 || / v n^^c4z7Ta2 / R25 〇—(CR7R8)〇-(CR9R10)p 其中，A2為一生物活性劑之殘基。 22.種以O 2(¾乙基)甘氨酸為主要成份之聚合物運送系統之 86 ^75556 備製方法，包括以下步驟： 1)使大約一當量的伸直的、受保護的(extende(j blocked). 雙官能鏈接劑與大約一當量的酸防護(acid pr〇tected) N N_2(羥乙基)甘氨酸分子部份起反應，以形成具有下列化學式之中間生成物（intermediate): 〇 Boc-N 0 || Η Ο Ν- 、0tBu

HO 其中’伸直的、受保護的雙官能鏈接劑為

Η

B〇c 為第三丁氧幾基(t-Butyloxy carbonyl); 且tBu為一防護基團；

2)使步驟(1)之中間生成物與一酿化劑(acyiating agent) 起反應，以形成以下中間生成物： Boc -Μ 〇 II Η / 0^° οII zC、 OtBu 3) 解除以上所生中間生成物之保護，並使之在基本的耦合條件下，與一活性聚合物起反應； 4) 解除Ν，Ν-2(羥乙基)甘氨酸之酸防護，然後在耦合條件 87 1.375556 下，用一適合的活化基團使酸活化。 23. —種藥物組合物，包括如申請專利範圍第1項所述化合物，其中，A’為一燒基圑，A為一生物活性劑之殘基。

88