KR20070089739A

KR20070089739A - 지방족 생분해성 연결자를 기초로 한 방출가능한 고분자접합체

Info

Publication number: KR20070089739A
Application number: KR1020077015937A
Authority: KR
Inventors: 홍 짜오; 리차드 비. 그린왈드
Original assignee: 엔존 파마슈티컬즈, 인코포레이티드
Priority date: 2004-12-14
Filing date: 2005-12-13
Publication date: 2007-08-31
Also published as: RU2007126802A; MX2007007034A; US20050197290A1; US8192743B2; US20080305070A1; CA2589975A1; CA2589975C; US7413738B2; IL183582A0; CN101076353A; EP1827497A4; TW200635576A; WO2006066020A2; AU2005316520A1; EP1827497A2; CN101076353B; AU2005316520B2; JP2008523239A; JP5405746B2; WO2006066020A3

Abstract

활성 고분자 바이신 유도체, 예컨대

뿐만 아니라 이를 이용하여 제조된 접합체가 개시되어 있다. 또한 상기 바이신 유도체를 제조하고 사용하는 방법도 개시되어 있다.

Description

지방족 생분해성 연결자를 기초로 한 방출가능한 고분자 접합체{RELEASABLE POLYMERIC CONJUGATES BASED ON ALIPHATIC BIODEGRADABLE LINKERS}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2002년 8월 13일에 출원된 미국특허출원 제10/218,167호 및 2003년 5월 30일에 출원된 미국특허출원 제10/449,849호의 일부계속출원이며, 각 내용들은 본 명세서에 참조문헌으로 통합된다.

본 발명은 생물학적 활성 물질들의 생체 내 순환 수명(in vivo circulating life)을 연장시키는 데 유용한 방출가능한 고분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 고분자로 이루어진 접합체에 관한 것이다.

폴리(에틸렌 글리콜) PEG 및 유사 수용성 폴리(알킬렌옥사이드)에 펩타이드류 또는 폴리펩타이드류를 커플링하는 초기의 개념은 미국 등록특허 제4,179,337호에 개시되어 있으며, 본 명세서에 참조문헌으로 통합된다. 이들 고분자로 변형된 폴리펩타이드는 감소된 면역원성/항원성(immunogenicity/antigenicity)을 나타내 며, 변형 전보다 더 오랫동안 혈류 내에서 순환한다.

폴리(알킬렌옥사이드)를 접합시키기 위하여, 하이드록실 말단기 중 하나는 반응성 있는 치환기로 변환된다. 이 과정을 "활성"이라고 하고, 생성물을 "활성화된 폴리(알킬렌옥사이드)"라고 한다. 다른 실질적으로 비항원성 고분자(non-antigenic polymers)는 유사하게 "활성화" 또는 기능화된다.

상기 활성화된 고분자는 부착 자리(attachment sites)를 제공하는 친핵성 관능기를 갖는 치료제와 반응된다. 부착 자리로서 일반적으로 사용되는 친핵성 관능기는 리신의 ε-아미노기가 있다. 유리 카복실산기, 적절하게 활성화된 카보닐기, 산화된 탄수화물 부위(moieties) 및 머캅토기 역시 부착 자리로서 사용되고 있다.

인슐린 및 헤모글로빈은 최초의 접합된 치료제 중의 하나이다. 이런 비교적 큰 폴리펩타이드류는 여러 유리 ε-아미노 부착 자리를 포함한다. 많은 고분자는 생물학적 활성의 상당한 손실 없이 면역원성을 감소시키고 순환 수명(circulating life)을 증가시키기 위해 부착될 수 있다.

그러나, 과도한 고분자 접합(conjugation) 및/또는 생체활성과 관련된 그룹들이 발견되는 치료 부위의 활성 자리를 포함하는 접합은 종종 활성의 감소 및 그 결과 치료 유용성의 감소를 초래한다. 이는 종종 생체활성과 관련 없는 부착자리를 거의 가지지 않는 저분자량의 펩타이드에 해당하는 경우이다. 많은 비펩타이드 치료제들 또한 고분자 변형의 효과를 얻을 수 있는 부착 자리의 수가 충분하지 않다.

이상에서 논의된 문제를 극복하기 위한 제안은 더 길고 더 큰 분자량의 고분 자를 사용하는 것이다. 그러나, 요구되는 분자량에 따르면, 이러한 물질을 제조하는 데 어려움이 있고, 사용하기에 고가일 수 있다. 게다가, 이들은 때때로 즉시 이용할 수 있는 고분자들에 비해 개선점을 제공하지도 않는다

제안된 다른 대안은 고분자 두 가닥을 트리아진 고리를 통해 단백질의 아미노기에 부착하는 것이다(Enzyme, 26, 49-53 (1981) 및 Proc. Soc. Exper. Biol. Med., 188, 364-9 (1988) 참조). 그러나 트리아진은 접합 후 허용 가능한 수준을 감소시키기 어려운 독성 물질이다. 게다가, 트리아진은 평면기이고 단지 이중-고분자로만 치환될 수 있다. 상기 평면 구조는 제자리에 두 고분자를 견고하게 고정시킨다. 이는 고분자 사슬의 길이를 증가시킴으로써 얻어지는 이점과 같은 고분자 접합의 이점을 제한한다. 따라서, 비-트리아진계 활성 고분자가 본 기술에 상당한 효과를 제공할 수 있다.

그러나 상술한 경우에 있어서, 생물학적 활성 고분자 접합체는 상기 고분자 및 모 생물학적 활성 부위(parent biologically-active moiety) 사이에 실질적으로 가수분해-저항 결합(연결)을 갖도록 형성된다. 따라서 프로드럭 그 자체(생체 내에서 결국에는 유리되는 모분자)보다는 오히려 영구적으로 연결된 오래 지속되는 접합체들이 제조되었다.

공동으로 양도된 미국 등록특허 제5,643,575호, 제5,919,455호 및 제6,113,906호는 지방족 연결자를 통해 친핵체에 공통의 부착 지점을 공유하는 PEG의 다중 가닥에 관한 부가적인 개선을 개시한다. 종래의 트리아진계 분지 고분자 접합체들과는 달리, 상기 지방족 연결자는 당업자에게 트리아진의 독성을 피할 수 있 게 할 뿐만 아니라 다른 유용한 이점을 제공한다.

게다가, 수년 동안 프로드럭을 제조하는 여러 방법들이 제안되어 왔다. 프로드럭은 투여시 생체 내에서 결국에는 활성 모화합물(parent compound)을 유리시키는 생물학적-활성 모화합물의 화학적 유도체를 포함한다. 프로드럭의 사용은 당업자가 생체 내 생물학적-활성 화합물의 발생(onset) 및/또는 지속(duration)을 변경할 수 있도록 한다. 프로드럭은 종종 모화합물 또는 활성 화합물의 생물학적으로 불활성(inert)이거나 실질적으로 비활성(inactive) 형태로 존재한다. 활성 약물의 방출 속도는 생물학적 활성 화합물의 모화합물을 프로드럭 운반체에 연결시키는 연결자의 가수분해 속도를 포함하는 여러 인자들에 의해 영향을 받는다.

에스테르 또는 인산염 연결을 기초로 하는 프로드럭들이 보고되어 있다. 대부분의 경우, 프로드럭을 형성하는 데 사용되는 특수 유형의 에스테르 연결은 수용성 환경에서 수 일정도의 가수분해를 위한 t₁ _/2를 제공한다. 그러나 프로드럭이 형성되는 것을 예상하더라도, 대부분의 접합체는 생체 내에서 충분한 가수분해가 성취되기 전에 제거된다. 그러므로 모 약물 화합물을 더욱 빠르게 생성시키기 위하여 생체 내에서 고분자-약물 연결의 가수분해가 더 빠르게 일어나는 연결을 갖는 프로드럭을 제공하는 것이 바람직하다.

아마이드 또는 탄산염 연결을 기초로 한 프로드럭 역시 보고되어 있다. 일반적으로, 아마이드 결합은 가수분해에 매우 저항성이 큰 것으로 알려져 있다. 그러나 N-말단이 1 또는 2개의 하이드록시에틸기로 N-하이드록시에틸화될 때, ε-아 미노산의 C-말단 아마이드가 25 ℃ 및 pH 7.4에서 즉시 가수분해됨이 최근에 밝혀졌다. 비스 N-2-하이드록시에틸 글리신(바이신)형 분자는 이러한 가수분해 반응의 열쇠(key)이다. 이러한 바이신형 기는 최근 프로드럭의 합성에 사용되고 있다( 미국 특허 출원 제10/218,167호 및 제10/449,849호 참조).

프로드럭 디자인 분야에 있어서, 여전히 개선의 여지가 있다. 본 발명은 이러한 개선을 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 화학식 (Ⅰ)의 화합물이 제공된다:

상기 화학식에서,

R₁은 실질적으로 비항원 고분자 잔기, C₁ _-6 알킬, C₂ _-6 알케닐, C₂ _-6 알키닐, 아랄킬 및 말단 분지기(terminal branching groups)로 이루어지는 군으로부터 선택되고;

Z 및 Z′는 동일 또는 상이하고, 독립적으로 표적 세포 내부로 활발하게 운반되는 부위, 소수성 부위, 이중기능성(bifunctional) 연결 부위 및 이의 조합으로부터 선택되고;

Y₁ _-3은 동일 또는 상이하고, O, S 또는 NR₁₁중에서 선택되고;

L₁ 및 L₃은 독립적으로 이중기능성 연결자이고;

R₃-R₁₁ _,R₂₄ 및 R₂₅는 동일 또는 상이하고, 수소, C₁ _-6 알킬, C₂ _-6 알케닐, C₂ _-6 알키닐, C₃ _-19 분지 알킬, C₃ _-8 사이클로알킬, C₁ _-6 치환된 알킬, C₂ _-6 치환된 알케닐, C_2-6 치환된 알키닐, C₃ _-8 치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬, C₁ _-6 헤테로알킬, 치환된 C₁ _-6 헤테로알킬, C₁ _-6 알콕시, 페녹시 및 C₁ _-6 헤테로알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되고;

L₂는 -C(O)(CR₃₀R₃₁)Y₁₅(CR₃₂R₃₃)C(O)NR₃₅- 또는 -C(O)(CR₃₀R₃₁)(CR₃₂R₃₃)C(O)NR₃₅-이고:

이때, Y₁₅는 O, S, NR₃₄ 또는 CH₂로부터 선택되고,

R₃₀ _-35는동일 또는 상이하고, 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬 또는 아릴로부터 선택되고;

A 및 A′는 동일 또는 상이하고, 독립적으로 알킬기, 이탈기(leaving groups), 관능기, 진단제(diagnostic agents), 표적 부위(targeting moieties), 생물학적 활성 부위(biologically active moieties) 및 OH 중에서 선택되고;

a, g, e는 동일 또는 상이하고, 독립적으로 0 또는 1 내지 5의 양의 정수, 바람직하게는 0 또는 1이고;

만약 (a+e)가 1 이상이라면

b, c, d 및 d′는 동일 또는 상이하고, 독립적으로 0 또는 1이고,

m, n, o 및 p는 동일 또는 상이하고, 독립적으로 1 내지 6의 양의 정수이다.

본 발명의 다른 측면은 R₁이 알파 및 오메가 말단 연결기를 둘다 포함하는 고분자 잔기일 경우 형성되는 이중기능성 화합물을 포함한다. 이러한 본 발명의 측면에 있어서, 당업자는 2 당량의 생물학적 활성제 약물, 단백질, 폴리펩타이드, 올리고뉴클레오티드, 진단제 등을 고분자(바람직하게는 PEG) 바이신 시스템에 부착시킬 수 있다. 이중기능성 고분자 접합체의 일례는 하기 화학식 (Ⅱ)와 같이 예시된다.

상기 화학식에서, Z 및 Z′는 독립적으로 이중기능성 연결기 또는

이고;

이때, Y₄는 O, S 또는 NR₁₁이고, L₅은 이중기능성 연결자이며, 다른 모든 변수들은 상술한 바와 같다.

본 발명의 화합물을 제조하는 방법 및 이를 이용하여 치료하는 방법도 역시 제공된다.

본 발명의 목적을 위하여, "잔기(residue)"는 고분자 프로드럭 운반체 일부분이 부착되는 치환 반응 후 남아있는 화합물의 일부분을 의미하는 것을 이해될 수있다.

본 발명의 목적을 위하여, "고분자 잔기" 또는 "PEG 잔기"는 각각 생물학적 활성 화합물과의 반응 후 남아있는 고분자 또는 PEG의 일부분을 의미하는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명의 목적을 위하여, "알킬"은 선형, 분지, 예를 들면 할로-, 알콕시-, 니트로-로 치환된 C₁ _-12알킬, C₃ _-8 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬 등을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명의 목적을 위하여, "치환된(substituted)"은 1 이상의 다른 원자들로 치환기 또는 화합물 내에 함유하는 1 이상의 원자들을 대체 또는 부가하는 것을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명의 목적을 위하여, 치환된 알킬은 카복시알킬, 아미노알킬, 디알킬아미노, 하이드록시알킬 및 머캅토알킬을 포함하고; 치환된 알케닐은 카복시알케닐, 아미노알케닐, 디알케닐아미노, 하이드록시알케닐 및 머캅토알케닐을 포함하고; 치환된 알키닐은 카복시알키닐, 아미노알키닐, 디알키닐아미노, 하이드록시알키닐 및 머캅토알키닐을 포함하고; 치환된 사이클로알킬은 4-클로로사이클로헥실과 같은 부위를 포함하고; 아릴은 나프틸과 같은 부위를 포함하고; 치환된 아릴은 3-브로모-페닐과 같은 부위를 포함하고; 아랄킬은 톨루일과 같은 부위를 포함하고; 헤테로알킬은 에틸티오펜과 같은 부위를 포함하고; 치환된 헤테로알킬은 3-메톡시-티오펜과 같은 부위를 포함하고; 알콕시는 메톡시와 같은 부위를 포함하며; 페녹시는 3-니트로페녹시와 같은 부위를 포함한다. 할로- 는 플루오로, 클로로, 요오도 및 브로모를 포함하는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명의 목적을 위하여, "충분량(sufficient amounts)"은 당업자가 납득할 정도로 치료 효과를 달성하는 양을 의미한다.

본 발명의 목적을 위하여, "효과적으로 비항원(effectively non-antigenic)" 및 "실질적으로 비항원(substantially non-antigenic)"은 포유동물 내에서 실질적으로 무독하고 감지할 수 있을 정도의 면역반응(immune response)을 유발시키지 않는 것으로서 당업계에 공지된 모든 고분자 물질을 포함한다.

본 발명의 목적을 위하여, "양의 정수"는 전체 양수를 의미하며, 바람직하게는 1 내지 6, 더 바람직하게는 1 또는 2를 의미한다.

본 발명의 주요 장점 중 하나는 바이신 연결자가 프로드럭의 가수분해 속도를 조절하고, 이에 의해 생체 외(in vitro) 뿐만 아니라 생체 내에서 다양한 속도로 고유 엔티티(native entities)를 방출시킨다. 예를 들면, 아미노산 또는 짧은 펩타이드 잔기들을 포함하는 다양한 이중기능성 부위는 생체 외 및 생체 내에서 프로드럭 및/또는 세포 내 흡수(cellular uptake) 등의 가수분해 속도를 조절하기 위하여 L₁ _-3의 어느 부분으로서 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 이점은 상기 고분자 부위를 바이신 시스템의 한쪽 팔(arm)에만 부착시킴으로써, 접합 과정이 더 깔끔하고(cleaner) 더 신속하다는 것이다.

본 발명의 또 다른 이점은 가수분해 동안 불순물 또는 부산물의 형성이 거의 없거나 형성되지 않기 때문에 물질대사 프로파일(metabolic profile)이 향상된다는 것이다. 이러한 불순물 형성 결여는 또한 정제를 더 용이하게 한다.

또한, 본 발명의 다른 이점은 생물학적 활성 부위, 즉 약물뿐만 아니라 표적 부위 모두를 동일 고분자 플랫폼(platform)에 부착할 수 있는 능력을 가지고 있어, 이로써 향상된 치료 효능 구비의 가능성을 증가시킨다는 것이다.

본 발명의 또 다른 이점은 특히 저분자들인 경우 이러한 신규 고분자 운반 시스템(polymeric trasport system)을 통해 전달되는 표적 화합물은 수용해성 및 생체 내 순환 수명에 있어서 종종 상당한 증가를 나타낸다는 것이다.

A. 화학식 (I)

본 발명의 일실시형태에 있어서, 화학식(I)의 화합물이 제공된다:

상기 화학식에서,

R₁은 실질적으로 비항원 고분자 잔기, C₁ _-6 알킬, C₂ _-6 알케닐, C₂ _-6 알키닐, 아랄킬 및 말단 분지기로 이루어지는 군으로부터 선택되고;

Z 및 Z′는 동일 또는 상이하고, 독립적으로 표적 세포 내부로 활발하게 운반되는 부위, 소수성 부위, 이중기능성 연결 부위 및 이의 조합으로부터 선택되고;

L₁ 및 L₃은 독립적으로 이중기능성 연결자이고;

이때, Y₁₅는 O, S, NR₃₄ 또는 CH₂로부터 선택되고,

A 및 A′는 동일 또는 상이하고, 독립적으로 알킬기, 이탈기, 관능기, 진단제, 표적 부위, 생물학적 활성 부위 및 OH 중에서 선택되고;

만약 (a+e)가 1 이상이라면

본 발명의 바람직한 측면에 있어서, R₁은 폴리에틸렌글리콜(PEG)기와 같은 실질적으로 비항원 고분자 잔기를 포함한다. 선택적으로, R₁은 여기에 J로써 표시된 캡핑(capping)기를 포함한다. 고분자 캡핑에 사용되는 바람직한 J기는 OH, NH₂, SH, CO₂H와 같은 부위, CH₃와 같은 C₁ _-6알킬 부위, 및 화학식 (Ⅲ)의 화합물을 포함한다:

상기 화학식에서, 모든 변수들은 앞에서 정의된 바와 같다.

본 발명의 일측면에 있어서, 본 발명의 화학식을 포함하는 다른 변수들에 관하여는 하기의 내용이 바람직하다:

일측면에 있어서, R₁은 폴리알킬렌옥사이드 잔기이고, 더욱 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜 잔기이며;

다른 측면에 있어서, R₁은 다중 고분자 가닥 로딩(loading)을 가능하게 하도록 하기에 자세히 설명되는 바이신계 말단 분지기이고;

또 다른 측면에 있어서, A는 바람직하게는 관능기 또는 생물학적 활성 부위이고, A´는 관능기, 표적 부위 또는 진단제이고;

R₃-R₁₁, 및 R₂₄ _-25는 각각 수소이며,

a, b, c, e, m, n, o 및 p는 각각 바람직하게 1이다.

바람직하게는, Z 및 Z´는 상기 정의된 바와 같이

이거나, 대안적으로 생물학적 활성 A기와 결합하는 경우, 화학식 (I) 및 (Ⅱ)의 바이신 고분자 부분으로부터 방출하는 프로드럭이 형성되는 아미노산 잔기, 펩타이드 잔기, 표적 세포 내부로 활발하게 운반되는 기, 소수성기 또는 이런 성질들의 조합인 기를 포함한다(본 명세서에서 참조문헌으로 통합되는 공동으로 양도되는 USSN 09/758,993 참조).

B. 실질적으로 비항원 고분자( SUBSTANTIALLY NON - ANTIGENIC POLYMERS )

상술한 바와 같이, R₁은 바람직하게는 폴리알킬렌옥사이드(PAO)와 같은 실질적으로 비항원이고, 더욱 바람직하게는 mPEG와 같은 폴리에틸렌글리콜인 수용성 고분자 잔기인 것이 바람직하다. 설명 및 비제한적 목적을 위해 R₁의폴리에틸렌글리콜(PEG) 잔기의 부분은 다음 중에서 선택될 수 있다:

J- O-(CH₂CH₂O)_x-,

J-O-(CH₂CH₂O)_x-CH₂C(O)-O-,

J-O-(CH₂CH₂O)_x-CH₂CH₂ NR₁₂- ,

J-O-(CH₂CH₂O)_x-CH₂CH₂ S-,

-OC(O)CH₂-O-(CH₂CH₂O)_X-CH₂C(O)-O-,

-NR₁₂CH₂CH₂-O-(CH₂CH₂O)_X-CH₂CH₂NR₁₂- 및

-SCH₂CH₂-O-(CH₂CH₂O)_X- CH₂CH₂S-

이때, x는 중합도이고;

R₁₂은 수소, C₁ _-6알킬, C₂ _-6알케닐, C₂ _-6 알키닐, C₃ _-12 분지 알킬, C₃ _-8 사이클로알킬, C₁ _-6 치환된 알킬, C₂ _-6 치환된 알케닐, C₂ _-6 치환된 알키닐, C₃ _-8 치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬, C₁ _-6 헤테로알킬, 치환된 C₁ _-6 헤테로알킬, C_1-6 알콕시, 페녹시 및 C₁ _-6 헤테로알콕시 중에서 선택되고,

J는 상기 화학식 Ⅱ에 관하여 설명한 바와 같이 캡핑기이다.

특히 바람직한 일실시형태에 있어서, R₁은

CH₃- O-(CH₂CH₂O)_x-, CH₃-O-(CH₂CH₂O)_x-CH₂C(O)-O-,

CH₃-O-(CH₂CH₂O)_x-CH₂CH₂ NH- 및 CH₃-O-(CH₂CH₂O)_x-CH₂CH₂ S-

중에서 선택되고,

이때, x는 양의 정수이고, 바람직하게 약 2,000 내지 약 40,000 Da의 중량 평균 분자량이 선택된다. 본 발명의 대안적인 측면에 있어서, 당업자의 필요에 따라 상기 고분자의 분자량의 범위는 수백 내지 40,000의 범위 또는 그 이상이다.

또한, 본 발명의 범위 내에서 고려하면, R₁은 공동으로 양도되는 미국등록특허 제5,605,976호, 제643,575호, 제5,919,455호 및 제6,113,906호에서 개시된 분지 고분자 잔기 중에서 선택되고, 각각의 개시 내용은 본 명세서에서 참조문헌으로 통합된다. 이들 일반 화학식 중에서, 하기의 화학식이 바람직하다:

및

상기 화학식에서,

(q)는 1 내지 5의 정수이고;

Z″는 O, NR₁₃, S, SO 또는 SO₂이고; 이때 R₁₃은 H, C₁ _-8 알킬, C₁ _-8 분지 알킬, C_1-8 치환된 알킬, 아릴 또는 아랄킬이고;

(h)는 0 또는 1이고;

(k)는 양의 정수, 바람직하게는 1 내지 6의 양의 정수이다.

본 발명의 범위 내에서 고려된 다른 분지 활성 고분자는 바람직하게는 공동으로 양도된 PCT 출원번호 WO02/065988 및 WO02/066066에 개시된 고분자 화합물 중에서 선택되고, 본 명세서에 참조문헌으로 통합된다. 이들 일반 화학식 중에서, 하기의 화학식이 바람직하다:

이때, R₁ _′는 PEG와 같은 고분자 잔기이다.

또 다른 바람직한 일실시형태에 있어서, R₁은 하기 화학식의 고분자 잔기이다:

이때, R₁ _´은 PEG와 같은 고분자 잔기이고;

W는 O, 아미노산,

, -(CH₂)_y, 및 -NH(CH₂CH₂O)₂-와 같은 이중기능성 연결자이고;

z는 0, 1, 2, 3 또는 4이고;

n은 양의 정수, 바람직하게는 1 내지 500, 더 바람직하게는 1 내지 200이며,

y는 양의 정수, 바람직하게는 1 내지 6이다.

PEG는 일반적으로 하기 구조로 표시되며:

R₁ _´은 바람직하게 상기 화학식의 잔기를 포함한다.

고분자의 중합도(x)는 약 10 내지 약 2,300일 수 있다. 이는 고분자 사슬 내에서 반복 단위체의 수를 나타내고, 상기 고분자의 분자량에 의존한다. 바람직하게는, x는 양의 정수이고, 중량 평균 분자량은 바람직하게 약 2,000 내지 약 40,000 Da에서 선택된다. (J) 부위는 여기에 정의된 바와 같은 캡핑기, 즉 상기 고분자 말단에서 발견되는 기이고, 어떤 측면에서는 NH₂,OH, SH, CO₂H, C₁ _-6알킬 또는 다른 PEG 말단 활성기 중 어느 하나로부터 선택되고, 이런 기들은 당업자에게 알려져 있다.

또한 공동으로 양도된 미국 등록특허 제5,643,575호('575 특허)에 개시된 폴리프로필렌글리콜, 분지 PEG 유도체, 쉐어워터 코포레이션(Shearwater Corportion)의 2001년 카탈로그 "Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Application"에 개시된 "star-PEG's" 및 다중 팔 PEG(multi-armed PEG's)이 유용하다. 상술한 각각의 개시 내용은 참조문헌으로 본 명세서에 통합된다. '575 특허에서 제공되는 분지는 단일 부착 지점(single point of attachment)에서 생물학적 활성 분자 또는 효소에 고분자 로딩을 증가시키는 방법으로서 바이신기로부터 2차 또는 3차 가지를 허용한다. 만일, 필요이상의 실험이 요구되지 않는다면, 수용성 고분자는 이중기능성 연결기에 부착되도록 기능화될 것이다.

본 발명의 대부분의 측면에 있어서, 비록 PAO(PAO's) 및 PEG(PEG's)가 중량 평균 분자량을 실질적으로 변화시킬 수 있다 하더라도, 바람직하게 R₁ 및 R₁ _´는 약 2,000 내지 약 40,000 Da의 중량 평균 분자량을 가질 수 있다.

여기 포함되는 고분자 물질은 상온에서 수용성인 것이 바람직하다. 비제한적인 이러한 고분자는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌화된 폴리올(polyoxyethylenated polyols)과 같은 폴리알킬렌옥사이드 단일고분자(homopolymer), 이의 공중합체(copolymer) 및 만약, 블록 공중합체의 수용해도가 일정하게 유지된다면 이의 블록 공중합체를 포함한다.

다른 일실시형태 및 PAO계 고분자에 대한 대안으로서, R₁ 및 R₁ _′은 1 이상의 효과적인 비항원 물질, 예컨대 덱스트란(dextran), 폴리비닐알코올, 탄수화물계 고분자, 하이드록시프로필메타크릴아마이드(HPMA), 폴리알킬렌옥사이드 및/또는 이의 공중합체 중에서 선택적으로 선택된다(본 명세서에 통합되는 공동으로 양도된 미국 등록특허 제6,153,655호 참조). PEG와 같은 PAO에 대하여 여기에 설명된 대로 동일 유형의 활성이 사용된다. 상술한 종류는 단지 실시예이며 여기 설명된 성질을 갖는 모든 고분자 물질이 고려되고, 폴리프로필렌글리콜 등과 같은 다른 폴리알킬렌옥사이드 유도체도 당업자에게 고려된다.

본 발명의 고분자는 또한 투과성 콘텍트 렌즈, 상처치료용 드레싱, 약물 전달 장치 등의 용도로 적절한 상호침투(interpenetrating) 고분자 망상조직(network)을 형성하기 위하여 폴리(알킬렌글리콜)디아민과 같은 이중기능성 물질과 공중합될 수 있다. 이러한 분지의 입체적 한계(steric limitation) 및 수용해도는 당업자에 의해 쉽게 인지될 것이다. 그러나, 바람직하게는 다중 분지 고분자의 분자량은 80,000 달톤을 초과해서는 안된다.

C. 이중기능성 연결기 ( BIFUNCTIONAL LINKER GROUPS ): L ₁ , L ₂ , L ₃ 및 L ₅

본 발명의 많은 측면, 특히 화학식 (I)에 있어서, L₁ 및 L₃은 고분자 가닥 또는 다른 부위, 예를 들면 R₁ 및 A′에 바이신 유도체의 부착을 용이하게 하는 연결기이다. 상기 제공된 연결은 직접 이루어질 수 있거나 당업자에게 공지된 커플링기를 통하여 이루어질 수 있다. 다른 L기들이 본 명세서에 언급되고, 이들은 L₁과동일한 기 중에서 선택되는 것으로 이해된다. 본 발명의 일측면에 있어서, L₂ 및 L₅은 하기에서 더 정의되는 반면,L₁ 및L₃은 독립적으로 다음 중에서 선택된다:

이때, R₁₄-R₁₇ 및 R₁₉는 독립적으로 수소, C₁ _-6알킬, C₂ _-6알케닐, C₂ _-6알키닐, C_3-19 분지 알킬, C₃ _-8사이클로알킬, C₁ _-6 치환된 알킬, C₂ _-6치환된 알케닐, C₂ _-6치환된 알키닐, C₃ _-8치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬, C₁ _-6헤테로알킬, 치환된 C₁ _-6헤테로알킬, C₁ _-6알콕시, 페녹시 및 C₁ _-6헤테로알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되고;

R₁₈은 수소, C₁ _-6 알킬, C₂ _-6 알케닐, C₂ _-6 알키닐, C₃ _-19 분지 알킬, C₃ _-8 사이클로알킬, C₁ _-6 치환된 알킬, C₂ _-6 치환된 알케닐, C₂ _-6 치환된 알키닐, C₃ _-8 치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬, C₁ _-6 헤테로알킬, 치환된 C₁ _-6 헤테로알킬, C_1-6 알콕시, 페녹시 및 C₁ _-6 헤테로알콕시, NO₂, 할로알킬 및 할로겐으로 이루어지는 군으로부터 선택되며;

t 및 s는 양의 정수, 바람직하게는 1 내지 4에서 독립적으로 선택된다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, L₁ 및 L₃은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 아미노산은 알려진 자연발생한 L-아미노산, 예를 들면, 알라닌(alanine), 발린(valine), 루신(leucine), 이소루신(isoleucine), 글리신(glycine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 메티오닌(methionine), 시스테인(cysteine), 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine), 트립토판(tryptophan), 아스파르트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid), 리신(lysine), 알지닌(arginine), 히스티딘(histidine), 프롤린(proline) 및/또는 이의 조합으로부터 선택될 수 있다. L₁이 펩타이드를 포함할 때, 상기 펩타이드는 크기에 있어서 예를 들면 2 내지 10개의 아미노산 잔기를 갖는다. 바람직한 일실시형태에 있어서, 상기 펩타이드는 Gly-Phe-Leu-Gly이다.

상기 아미노산 잔기는 하기 화학식인 것이 바람직하다.

이때, X′는 O, S 또는 NR₂₆이고, Y₅ 은 O, S 또는 NR₂₇이며_, R₂₆, R₂₇ 및 R₂₈은 R₃을 정의하는 기와 동일한 기로부터 독립적으로 선택되나, 각각 H 또는 저분자 알킬(즉, C_1-6알킬)인 것이 바람직하며; f는 1 내지 10의 양의 정수이고, 바람직하게는 1이다.

소수성 또는 비소수성의, 자연발생한 아미노산뿐만 아니라 여러가지 당업계에 공지된 비자연발생적 아미노산(D 또는 L)의 유도체 및 유사체 역시 본 발명의 범위 내에 고려된다. 간단히 말하면 아미노산 유사체 및 유도체는 2-아미노아디프산(2-aminoadipic acid), 3-아미노아디프산(3-amino-adipic acid), 베타알라닌(beta-alanine), 베타아미노프로피온산(beta-aminopropionic acid), 2-아미노부티르산(2-aminobutyric acid), 4-아미노부티르산(4-amino-butyric acid), 피페리딘산(piperidinic acid), 6-아미노카프론산(6-aminocaproic acid), 2-아미노헵탄산(2-aminoheptanoic acid), 2-아미노이소부티르산(2-aminoisobutyric acid), 3-아미노이소부티르산(3-aminoisobutyric acid), 2-아미노피메린산(2-aminopimelic acid), 2,4-아미노부티르산(2,4-aminobutyric acid), 데스모신(desmosine), 2,2-디아미노피멜산(2,2-diaminopimelic acid), 2,3-아미노프로피온산(2,3-diaminopropionic acid), n-에틸글리신(n-ethyl-glycine), N-에틸아스파라긴(N-ethylasparagine), 3-하이드록시프롤린(3-hydroxyproline), 4-하이드록시프롤린(4-hydroxyproline), 이소데스모신(isodesmosine), 알로-이소루신(allo-isoleucine), N-메틸글리신(N-methylglycine), 사르코신(sarcosine), N-메틸이소루신(N-methylisoleucine), 6-N-메틸리신(6-N-methyl-lysine), N-메틸발린(N-methylvaline), 노르발린(norvaline), 노르루신(norleucine), 오르니틴(ornithine), 및 언급하기에 너무 많은 다른 것을 포함하며, 이는 본 명세서에서 참조문헌으로 통합되는 63 Fed. Reg., 29620, 29622에 열거되어 있다.

상술한 바와 같이, 짧은 펩타이드는, 예를 들면, 2 내지 10개, 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드이다.

더욱 바람직하게는, L₁ 및 L₃은독립적으로 하기로부터 선택된다:

본 발명의 다른 일실시형태에 있어서, L₂는 하기로부터 선택된다:

이때, R₃₀ _-35는 독립적으로 H, C₁ _-6 알킬, C₂ _-6 알케닐, C₂ _-6 알키닐, C₁ _-6 헤테로알킬 또는 아릴로부터 선택되고,

n은 바람직하게 1 내지 3의 양의 정수이다.

바람직하게는, L₂ 은 하기로부터 선택된다:

본 발명의 주요 이점은 당업자가 고분자 바이신 플랫폼(polymeric bicine platform)으로부터 약물 또는 생물학적 활성 부위의 방출 또는 가수분해 속도를 조절할 수 있다는 것이다. 선택된 특정의 연결자에 따라, 당업자는 가수분해 속도를 조절하기 위해 화합물을 변형시킬 수 있다. 이러한 본 발명의 바람직한 측면은 당업자가 의도된 표적에 전달되는 생물학적 활성 부위에서의 속도를 조절가능하게 한다. 생물학적 활성 부위 또는 약물의 빠른 방출을 갖게 하는 것이 바람직한 상황에서 L₂ 연결자의 결합은 가수분해의 속도를 증진시킨다. 더 이전의 공동으로 양도된 미국특허출원 제10/218,167호에 개시된 바이신계 고분자 플랫폼에 있어서, 상기 플랫폼으로부터 상기 부위 또는 약물의 방출은 종종 효소의 존재 또는 pH 조건에 의존하는데, 이와 대조적으로 연결자 L₂는 분자 내 이웃도움(anchimeric assistance)에 의해 pH 조건 또는 효소의 존재 또는 부재에 관계없이 독립적으로 고분자 플랫폼으로부터 방출되는 생물학적 활성 부위 또는 약물의 속도를 실질적으로 증가시킬 수 있다. 그러나, 효소의 존재에서 적절한 때의 분자 내 이웃도움 또는 효소반응 중 어느 쪽이든 빠른 것에 의해 가수분해의 속도가 조절될 수 있다. 따라서, 가수분해의 속도는 바이신 부위 자체 및 PEG 부분 사이에 사용되는 연결자의 형태에 크게 의존한다.

D. Z 및 Z´부위 및 이들의 기능(Z and Z′ MOIETIES AND THEIR FUNCTION )

본 발명의 일측면에 있어서, Z 및 Z′는 L₅-C(=Y₄)이고, 상기 L₅은 이중기능성 연결자이고 L₁과 동일한 기 중에서선택되며, Y₄는 Y₁ _-3에서 정의된 바와 같은 기 중에서 선택된다. 본 발명의 이런 측면에서, 상기 Z 및 Z′기는 A 기와 바이신 전달 형태의 잔류물 사이의 연결 역할을 한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, Z 및 Z′는 표적 세포 내부로 활발하게 전달되는 부위, 소수성 부위 및 이의 조합이다. Z 및 Z′는 1가인 것이 바람직하지만, 하나 이상의 A기를 바이신계 고분자에 부착시키기 위해 선택적으로 2가 또는 다가일 수 있다. 활발한 전달을 달성하기 위하여, Z 및 Z′는 L₁에 관하여 상술한 바와 같은 아미노산, 펩타이드 잔기 또는 폴리아민 잔기, 당 잔기, 지방산 잔기, C₆ _-18 알킬, 치환된 아릴, 헤테로아릴, -C(=O), -C(=S) 또는 -C(=NR₂₉)을 포함하며, 이때, R₂₉은 H, 저급 알킬 등이다.

본 발명의 이런 측면은 대체로 바이신-고분자계 프로드럭 접합체 내로의 결합(incorporation)에 적절한 생물학적 활성 물질은 그들 스스로 바이신에 연결된 조성으로부터 가수분해 방출 후 비활성인 물질/화합물로 될 수 있으나, 이들은 화학 공정/반응을 더 거친 후에는 활성화되는 원리를 기초로 한다. 이러한 실시형태로, 바이신계 고분자 시스템에 의해 혈류로 전달되는 치료제 또는 진단제, 펩타이드, 폴리펩타이드 등은 관심 표적 세포 내로 활발하게 운반되거나 들어갈 때까지 비활성상태로 지속할 것이며, 그 후에 세포 내 화학(intracellular chemistry), 예를 들면 조직 또는 세포 내 존재하는 효소 또는 효소시스템에 의해 활성화된다.

이러한 본 발명의 측면의 프로드럭은 Z 또는 Z′부위에 여전히 연결되어 있는 동안 세포 외 유체내로 생물학적 활성 물질(여기에 A로 기재됨)을 방출시키도록 생체 내에서 바이신-고분자계 접합체의 가수분해가 접합체를 분해시키도록 제조된다. 이런 본 발명의 측면에서 상기 생물학적 활성 물질은 저분자 치료제 및/또는 진단제인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면 하나의 가능한 Z-A 조합으로는 루신-독소루바이신(leucine-doxorubacin)이 있고, 다른 것으로는 아미노산이 결합된 캄포테신(camptothecin) 또는 파클리탁셀(paclitaxel)이 있고, 치료될 조직으로는 종양 조직이 있다.

본 발명이 작용하는 방법에 대하여 어떤 이론 또는 가설에 의한 구속되는 의도 없이, 운반 증강 인자(tranport enhancer)로서 선택된 부가적인 부위에 따라, 종양 세포 내부로의 상기 생물학적 활성 물질의 운반 속도는 보호 및/또는 운반이 증강된 형태에서 예를 들면 EPR 효과를 나타내는 조직의 세포 외 공간부위 내부로의 생물학적 활성 물질의 전달로 생각된다.

나아가, 선택적으로 상기 운반 증강 인자(Z 또는 Z′)는 세포막 운반 시스템을 위한 공지의 물질 중에서 선택된다. 간단하게 예를 들면, 세포는 일정한 영양소 및 내분비 인자(endocrine factors) 등을 활발하게 전달하는 것으로 알려져 있으며, 상기 영양소, 또는 이들의 유사체는 표적 세포 내부로 생물학적으로 유효한 물질의 활발한 운반을 증강시키기 위하여 즉시 사용된다. 이들 영양소의 예로는 아미노산 잔기, 펩타이드, 예컨대 크기가 2 내지 10개의 잔기 또는 그 이상인 짧은 펩타이드, 단순당(simple sugars) 및 지방산, 내분비 인자 등이 있다.

상술한 바와 같이 짧은 펩타이드는 예를 들면 2 내지 약 10 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드류이다. 본 발명의 일실시형태에 있어서, 이러한 펩타이드 운반 증강 인자는 소수성일 필요는 없으나, 흡수를 증강시키기 위하여 다른 방식으로 기능을 하거나 및/또는 일반 혈류 내에서 시기 상조의 가수분해로부터 연결된 저분자 제제들을 보호하는 것으로 판단된다. 예를 들면, 펩타이드 운반 증강 인자, 예를 들면 폴리알지닌, 및 유사한 분자량의 범위를 갖는 다른 운반 증강 인자는 플라즈마계 가수분해 효소에 의해 생물학적 활성제로부터의 분해를 입체적으로 방해하는 것으로 여겨지나, 이후 다양한 펩타이드 및/또는 카텝신(cathepsin)과 같은 단백질 분해효소에 의해 표적 세포 내부에서 분해된다.

본 발명의 바람직한 측면에 있어서, Z 및 Z′는 소수성 부위이다. 소수성이 약효효능에 얼마나 영향을 주는지에 대하여 어떤 이론 또는 가설에 의한 구속됨을 의미함 없이 소수성 부위는 예를 들면 플라즈마와 같은 세포 외 조직 공간부위에서 존재하는 가수분해 효소 등의 공격을 저해함으로써, 활성 생물학적 제제로부터 떨어져 운반 증강 인자의 세포 외 분해를 저해한다. 따라서 바람직한 운반 증강 인자는 예를 들면, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판과 같은 소수성 아미노산, 뿐만 아니라 앞에서 언급한 γ-아미노산과 같은 비자연발생적 유도체, 이의 유사체를 포함한다.

나아가, 선택적으로 상기 운반 증강 인자는 소수성 유기 부위이다. 간단하게 예를 들면, 상기 유기 부위는 C₆ _-18 또는 그 이상의 알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이 치환 또는 비치환된 부위이다. 상기 유기 부위 운반 증강 인자는 또한 예를 들면, -C(=S) 및/또는 -C(=O)를 포함하는 유기치환기를 포함하도록 고려된다.

E. 화학식 (I) A, A′및 D기

1. 이탈기 또는 활성기( Leaving or activating Groups )

상기 A 및 A´는 이탈기 또는 활성기인 측면에서, 제한 없이 적절한 부위, 예컨대 N-하이드록시벤조트리아졸릴, 할로겐, N-하이드록시프탈이미딜, p-니트로페녹실, 이미다졸릴, N-하이드록시숙신이미딜; 티아졸리디닐 티온, O-아실 우레아, 펜타플루오로페녹실, 2,4,6-트리클로로페녹실 또는 당업자에게 명백한 다른 적절한 이탈기를 포함한다.

본 발명의 목적을 위하여, 이탈기는 바람직한 표적 즉, 생물학적 활성 부위, 진단제, 표적 부위, 이중기능성 간격자(bifunctional spacer), 중간체 등에서 발견되는 친핵체와 반응할 수 있는 기로 이해되어야 한다. 상기 표적은 따라서 단백질, 펩타이드, 효소, 독소루비신(doxorubicin)과 같은 자연적으로 또는 화학적으로 합성되는 치료 분자, 단일-보호되는 디아민과 같은 간격자에서 발견되는 NH₂기와 같은 치환기를 함유한다.

본 발명의 화합물은 또한 바이신기와 이탈기 또는 필요에 따라 부착 표적(약물) 사이에 간격자 기(spacer group)를 포함할 수 있다. 상기 간격자 부위는 18개까지의 탄소 원자 또는 심지어 추가적인 고분자 사슬을 함유하는 헤테로알킬, 알콕시, 알킬일 수 있다. 상기 간격자 부위는 표준 합성 기술을 사용하여 부가될 수 있다. A 및 A′용으로 선택되는 부위들은 생물학적 활성 친핵체에 더하여 다른 부위들과 반응할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

2. 관능기( Functional Groups )

A 및 A′ 또한 관능기일 수 있다. 이러한 비제한적 관능기의 예로는 아민을 포함하는 간격자를 통해 바이신 부분에 부착될 수 있는 말레이미딜(maleimidyl), 비닐, 술폰 잔기(residues of sulfone), 하이드록시, 아미노, 카복시, 머캅토, 하이드라지드, 카바제이트(carbazate) 등을 포함한다. 상기 바이신 부분에 일단 부착하면, 상기 관능기(예를 들면 말레이미드)는 표적, 예컨대 폴리펩타이드의 시스테인 잔기, 아미노산 또는 펩타이드 간격자 등에 바이신-고분자를 부착하는 데 사용될 수 있다.

3. 생물학적 활성 부위( Biologically Active Moieties )

화학식 (I)에 있어서, 상기 A 및 A′는 아민- 또는 하이드록실- 함유 화합물의 잔기이다. 이러한 비제한적 목록의 적절한 화합물은 유기 화합물 잔기, 효소, 단백질, 폴리펩타이드 등을 포함한다. 유기 화합물은 제한 없이 예컨대 다우노루비신(daunorubicin), 독소루신을 포함하는 안트라사이클린(anthracycline) 화합물과 같은 부위; p-아미노아닐린 머스타드(p-aminoaniline mustard), 멜팔란(melphalan), 시토신 아리비노시드(Ara-C) 및 관련된 항 대사체 화합물(anti-metabolite compounds), 예를 들면, 젬시타빈(gemcitabine) 등을 포함한다. 대안적으로, 상기 부위는 아민- 또는 하이드록실- 함유 심혈관제(cardiovascular agent), 캄포테신 및 파클리탁셀과 같은 항종양제(anti-neoplastic agent), 항감염제, 니스타틴(nystatin), 플루코나졸(fluconazole) 및 암포테리신 B(amphotericin B)와 같은 항진균제, 항불안제(anti-anxiety agent), 위장약(gastrointestinal agent), 중추신경계 활성제(central nervous system-activating agent), 진통제(analgesic), 배란 유발제(fertility agent), 피임제(contraceptive agent), 소염제(anti-inflammatory agent), 스테로이드제(steroidal agent) 등의 잔기일 수 있다.

게다가 상술한 생물학적 활성 부위는 또한 효소, 단백질, 폴리펩타이드의 잔기일 수 있으며, 단일 클론 항체, SS1P와 같은 면역접합체, CC49와 같은 단일 사슬 항원 결합 단백질(SCA) 및 이의 단편(fragments) 역시 고려될 수 있다. 적절한 단백질은 제한되지 않으며, 생리적 또는 약학적 활성뿐만 아니라 유기 용매 내에서 촉매 반응할 수 있는 활성을 갖는 물질을 포함하는 적어도 하나의 고분자 부착이 가능한 기, 예를 들면 ε-아미노, 시스티닐티오, N-말단 아미노를 갖는 폴리펩타이드, 효소, 펩타이드 등을 포함한다.

관심 있는 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드로는 헤모글로빈, Ⅶ, Ⅷ 및 Ⅸ 인자를 포함하는 혈액 인자와 같은 혈청 단백질; 면역글로블린(immunoglobulins), 인터루킨 즉, IL-1부터 IL-13 등의 사이토카인(cytokines), 알파, 베타 및 감마 인터페론, 과립구 집락형성인자(granulocyte colony stimulating factor)를 포함하는 집락형성인자, 혈소판 유래 성장 인자(platelet derived growth factors) 및 포스포리파제 활성 단백질(PLAP) 뿐만 아니라 티모신 알파 1 (Thymosin alpha 1) 및 세크테린(Secretin)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일반적인 생체적 또는 치료상 관심 있는 다른 단백질은 인슐린, 렉틴(lectins) 및 리신(ricins)과 같은 식물 단백질, 종양 괴사 인자 및 관련 단백질, TGF 알파 또는 TGF 베타와 같은 형질전환성장인자(transforming growth factors)와 표피성장인자(epidermal growth factors)와 같은 성장인자, 호르몬, 소마토메딘(somatomedins), 에리트로포이에틴(erythropoietin), 색소성 호르몬(pigmentary hormones), 시상하부 호르몬 방출 인자(hypothalamic releasing factors), 항이뇨 호르몬(antidiuretic hormones), 프로락틴(prolactin), 융모막 성 생식선 자극 호르몬(chorionic gonadotropin), 여포 자극 호르몬(follicle-stimulating hormone), 갑상선 자극 호르몬(thyroid-stimulating hormone), 조직 플라스미노젠 활성제(tissue plasminogen activator) 등을 포함한다 . 관심 있는 면역 글로불린(Immunoglobulins)은 IgG, IgE, IgM, IgA, IgD 및 이의 단편을 포함한다.

인터루킨, 인터페론 및 집락형성인자와 같은 일부 단백질은 통상 재조합 기술 사용의 결과 비글리코실화된 형태(non-glycosylated form)로 존재한다. 상기 비글리코실화된 형태 또한 본 발명의 단백질에 속한다.

관심 있는 단백질로 탄수화물 선택적 효소(carbohydrate-specific enzymes), 단백질 가수분해 효소(proteolytic enzymes), 산화환원효소(oxidoreductases), 전이효소(ansferases), 가수분해효소(hydrolases), 리아제(lyases), 이성화효소(isomerases) 및 리가아제(ligases)를 포함한다. 특별한 효소에 제한됨이 없이, 관심 있는 단백질의 예로는 아스파라기나아제(asparaginase), 아르기나아제(arginase), 아르기닌 탈아미노효소(arginine deaminase), 아데노신 탈아미노효소(denosine deaminase), 항산화효소(superoxide dismutase, SOD), 엔도톡시나아제(endotoxinases), 카탈라아제(catalases), 키모트립신(chymotrypsin), 리파아제(lipases), 유리카아제(uricases), 아데노신 디포스파타아제(adenosine diphosphatase), 티로시나아제(tyrosinases) 및 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase)를 포함한다. 관심 있는 탄수화물 특이적 효소로는 글루코오스 산화효소(glucose oxidases), 글루코다아제(glucodases), 갈락토시다아제(galactosidases), 글루코세레브로시다아제(glucocerebrosidases), 글루코우로니다아제(glucouronidases) 등을 포함한다.

또한, 생체 내 생체활성을 나타내는 생물학적 고분자 중 어느 일부분도 여기에 포함된다. 이는 아미노산 서열, 핵산(DNA, RNA), 펩타이드 핵산(PNA), 항체 단편, 단일 사슬 결합 고분자(미국등록특허 제4,946,778호 참조), 항체 또는 단편들, 다클론성 항체(polyclonal antibodies), 단일클론성 항체(monoclonal antibodies) 및 촉매 항체(catalytic antibodies)의 융합(fusion)을 포함하는 결합 분자를 포함한다.

상기 단백질 또는 이의 일부분은 조직 배양, 동물 기원의 추출과 같이 당업자들에게 알려진 기술을 사용함으로써 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조 또는 분리될 수 있다. 단백질, 폴리펩타이드, 아미노산 서열 등의 이식유전자원(transgenic source) 역시 고려된다. 이 물질은 이식유전자 도입 동물(transgenic animal), 즉 쥐, 돼지, 젖소 등으로부터 수득되며, 상기 단백질은 우유, 혈액 또는 조직에서 발현된다. 이식유전자 곤충 및 바쿨로바이러스(baculovirus) 발현 시스템도 또한 소스로서 고려된다. 게다가 돌연변이 인터페론과 같은 단백질의 돌연변이 이형(version) 역시 본 발명의 범위 내에 있다.

관심 있는 다른 단백질은 알레르겐(allergen) 단백질, 예컨대 두드러기쑥(ragweed), 항원 E, 꿀벌 독, 진드기 알레르겐 등이 있다. 상술한 것은 본 발명에 알맞은 단백질을 나타낸다. 여기 정의된 바와 같이, 또한 이 단백질들은 구체적으로 언급되지 않으나 이용가능한 아미노기를 갖는 것을 의도하며, 본 발명의 범위 내에 있다.

본 발명의 바람직한 측면에 있어서, 상기 아미노- 또는 하이드록실- 함유 화합물은 치료를 요하는 조건에서 동물 즉, 사람을 포함하는 포유동물 치료에 약학적 또는 진단적인 용도로 적절한 생물학적 활성 화합물이다. 상기 목록은 설명되고 변형될 수 있는 화합물에 대해 제한되지 않음을 의미한다. 당업자는 다른 이 화합물/조성물은 과도한 실험의 수행 없이 유사하게 변형될 수 있음을 인지할 것이다. 또한 특별히 언급되지는 않으나 적절한 부착기를 갖는 생물학적 활성 물질들 또한 가리키며 본 발명의 범위 내에 있다.

여기에 포함되는 적절한 분자류를 함유하는 아미노- 또는 하이드록실- 함유 분자의 형태에 있어서, 유일하게 제한되는 것은 고분자 접합체와 반응 및 연결시킬 수 있는 이용가능한 최소 하나의(1차 또는 2차) 아민- 또는 하이드록실- 이 있는 것, 및 프로드럭 시스템이 모화합물(parent compound)을 재생 및 방출시킨 후, 생체활성의 상당한 손실이 없는 것이다.

4. 알킬기( Alkyl Groups )

화학식 (I)의 A 및 A′은 알킬기인 측면에서, 적절한 기의 비제한적인 목록은 C₁ _-6 알킬, C₂ _-6 알케닐, C₂ _-6 알키닐, C₃ _-19 분지 알킬, C₃ _-8 사이클로알킬, C₁ _-6 치환된 알킬, C₂ _-6 치환된 알케닐, C₂ _-6 치환된 알키닐, C₃ _-8 치환된 사이클로알킬, 아랄킬, C₁ _-6 헤테로알킬 및 치환된 C₁ _-6 헤테로알킬로 이루어진다.

5. 진단제( Diagnostic Agents )

화학식 (I)의 A 및 A′은 진단제인 측면에서, 적절한 제제의 비제한적인 목록은 염료, 킬레이트제, 및 동위원소 표지된 화합물 및 녹색형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)과 같은 다른 표지 화합물을 포함한다.

6. 표적 부위( Tageting Moieties )

화학식 (I)의 A 및 A′은 표적 부위인 측면에서, 적절한 제제의 비제한적인 목록은 TAT 펩타이드 및 U-7 펩타이드와 같은 펩타이드, CC49과 같은 단일 사슬 항체 및 타우린 및 바이오틴과 같은 저분자를 포함한다.

F. 바이신이 연결된 고분자의 합성

구체적인 바이신계 고분자 화합물의 합성은 실시예에서 설명된다. 상세한 설명을 위해 도 1을 참조하면 바람직한 방법은

1) 약 1 당량의 확장 봉쇄된 이중기능성 연결자, 예컨대

를 약 1 당량의 산보호된 바이신 부위(도 1에서 1 로 표시됨)와 반응시켜 하기와 같은 중간체를 형성시키는 단계:

이때, tBu는 보호기이다;

2) 상기 단계 1)의 중간체를 염화아세틸과 같은 아실화제와 반응시켜 하기와 같은 중간체를 형성시키는 단계:

3) 상기 결과로 생성된 중간체를 탈보호시키고, 이를 PNP-PEG 또는 SC-PEG와 같은 활성 고분자와 염기 커플링 조건하에서 반응시키는 단계,

4) 상기 바이신 산을 탈보호시키고 그 후 상기 산을 티아졸리디닐 티온(thiazolidinyl thione) 또는 N-하이드록실 숙신이미드(N-hydroxylsuccinimide)와 같은 적절한 활성기와 커플링 조건하에서 활성화시키는 단계를 포함한다.

상기 바이신 유도체를 제조하기 위한 대안적인 방법은

1) 1 당량의 확장 봉쇄된 이중기능성 연결자(extended blocked bifunctional linker)를 1 당량의 산보호된 바이신 부위와 반응시켜 하기와 같은 중간체를 형성시키는 단계:

이때, tBu는 보호기이다;

2) 상기 단계 1)의 중간체를 하기와 같은 적절히 변형된 활성화기와 반응시켜

하기와 같은 중간체를 형성시키는 단계:

3) 상기 결과로 생성된 중간체를 탈보호시키고, 이를 PNP-PEG 또는 SC-PEG와 같은 활성 고분자와 염기 커플링 조건하에서 반응시키는 단계, 및

4) 상기 바이신 산을 탈보호시키고 그 후 상기 산을 티아졸리디닐 티온 또는 N-하이드록실 숙신이미드와 같은 적절한 활성기와 커플링 조건하에서 활성화시키는 단계를 포함한다.

t-Bu를 대신하여 당업계에 알려진 보호기들이 사용될 수 있다. 이제 상기 활성 PEG 또는 고분자 바이신 유도체는 약물, 펩타이드, 간격자 등과 반응 및 접합할 수 있다.

제한되지 않는 적절한 커플링제의 비제한적 목록으로는 1,3-디이소프로필-카보디이미드(DIPC), 적절한 디알킬 카보디이미드, 2-할로-1-알킬-피리디늄 할라이드(무카이야마(Mukaiyama) 반응시약), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸 카보디이미드(EDC), 프로판 포스폰산 사이클릭 무수물(PPACA) 및 페닐 디클로로포스페이트 등을 포함하며, 이들은 예를 들면 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich Chemical)와 같은 상업적 구입원으로부터 구입하거나 또는 알려진 기술을 사용하여 합성된 것을 이용할 수 있다.

바람직하게 상기 치환기는 테트라하이드로퓨란(THF), 아세토니트릴(CH₃CN), 메틸렌클로라이드(DCM), 클로로포름(CHCl₃), 디메틸포름아마이드(DMF) 또는 이들의 혼합물과 같은 비활성 용매에서 반응된다. 적절한 염기는 디메틸아미노피리딘(DMAP), 디이소프로필에틸아민, 피리딘, 트리에틸아민, KOH, 포타슘 t-부톡사이드 및 NaOH 등을 포함한다. 상기 반응은 보통 약 0 ℃에서 약 22 ℃(상온)의 온도에서 수행된다.

선택되는 경로와 상관없이, 본 명세서에 기재되는 합성 기술의 결과로 나타나는 바람직한 화합물은 하기를 포함한다:

이때, A₁은

이거나 또는 앞에서 언급된 다른 이탈기 또는 활성기이다.

상기 바이신-활성 고분자류와 적절한 표적의 반응은 접합체에서 A₁을 A₂로 변형시킴으로써 활성 고분자를 변형시키고, 상기 A₂는 생물학적 활성 부위, 간격자 등의 잔기이다.

본 명세서에서 설명된 상기 기술의 결과로 나타나는 바람직한 화합물의 비제한적인 목록은

및

을 포함하고,

이때,

및

이다.

G. 다중 고분자 로딩( Multiple Polymer Loading )

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 바이신계 다중 분지 고분자 화합물이 제공된다. 구체적으로 염기 바이신 유도체는 1 이상의 말단 분지기를 포함하기 위하여 더 변형된다. 바람직하게 상기 말단 분지기는 하기 화학식으로 표시된다:

상기 화학식에서,

Y₆ 및 Y₇은 독립적으로 O, S 또는 NR₄₆이고;

L₆은 L₁의 정의와 동일한 군으로부터 선택된이중기능성 연결자이고;

L₈은 L₂의 정의와 동일한 군으로부터 선택된이중기능성 연결자이고;

R₄₀-R₄₆은동일 또는 상이할 수 있고, 수소, C₁ _-6 알킬, C₂ _-6 알케닐, C₂ _-6 알키닐, C₃ _-19 분지 알킬, C₃ _-8 사이클로알킬, C₁ _-6 치환된 알킬, C₂ _-6 치환된 알케닐, C₂ _-6 치환된 알키닐, C₃ _-8치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬, C₁ _-6 헤테로알킬, 치환된 C₁ _-6 헤테로알킬, C₁ _-6 알콕시, 페녹시 및 C₁ _-6 헤테로알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되고;

j, j′, i 및 i′는 각각 독립적으로 0 또는 양의 정수이고;

l 및 l′는 독립적으로 0 또는 1이고;

u, r, v 및 w는 독립적으로 선택되는 양의 정수;

R₅₀은 실질적으로 비항원 고분자 잔기, C₁ _-6 알킬, C₂ _-6 알케닐, C₂ _-6 알키닐, 아랄킬 및

로 이루어지는 군으로부터 선택되고,

이때, L₇은 L₁의 정의와 동일한 군으로부터 선택된이중기능성 연결자이고;

L₉ 은 L₂의 정의와 동일한 군으로부터 선택된이중기능성 연결자이고;

R₆₀은 실질적으로 비항원 고분자 잔기, C₁ _-6 알킬, C₂ _-6 알케닐, C₂ _-6 알키닐, 아랄킬로부터 이루어지는 군으로부터 선택되며,

다른 모든 변수들은 앞에서 정의된 바와 같다.

얻어진 분지 바이신 유도체는 하기 구조식으로 표시된다:

이때, 모든 변수들은 상술한 바와 같다.

상기 및 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법을 사용하여 형성된 상기 바이신 고분자 시스템은 생물학적 활성 부위 또는 다른 A기들의 다중 로딩 능력을 제공한다. 본 발명의 이런 분지 바이신 시스템의 이점은 당업자가 선형의 고분자량 고분자를 사용할 수 있다는 것이며, 또한 당업자의 필요에 따라 1 이상의 생물학적 활성 부위, 진단제 또는 표적화제(targeting agents)를 여러 조합으로 부착할 수 있다는 것이다.

H. 생체 내 진단( IN VIVO DIAGNOSTICS )

본 발명의 다른 측면은 상술한 운반 증강 인자(transport enhancer)에 연결된 진단 태그(tag)를 사용하여 선택적으로 제조된 본 발명의 접합체를 제공하고, 이때 상기 태그는 진단 또는 영상화 목적으로 선택된다. 따라서 적절한 태그는 수술 진행 동안 종양 조직의 영상화가 가능하도록 당업계 표준 발광 동위원소, 방사능 비투과성 물질 표지(radio-opaque label), 자기공명 표지, 또는 자기공명 영상화에 알맞은 다른 비방사능활성 동위원소 표지, 형광형 표지, 가시색상 및/또는 자외선, 적외선 또는 전기화학적 자극 하에서 가능한 형광을 나타내는 표지에 적절한 부위, 예를 들면 아미노산 잔기를 연결함으로써 제조된다. 선택적으로 상기 진단 태그는 접합된 치료학적 부위의 내부로 통합되고/거나 연결되어 동물 또는 환자 내에 치료 생물학적으로 활성인 물질(therapeutic biologically active material)의 분포를 관찰할 수 있게 한다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 발명의 태그된 접합체는 예컨대 방사능 표지를 포함하는 적절한 표지와 함께 당업계에 알려진 방법에 의해 용이하게 제조된다.

간단하게 예를 들면, 생체 내 종양 세포 내부에서 선택적인 흡수를 위한 방사면역신티그람 제제(radioimmunoscintigraphic agent)를 생산하기 위하여 이들은 ¹³¹요오드, ¹²⁵요오드, ^99m테크네튬 및/또는 ¹¹¹인듐을 포함한다. 예를 들면 펩타이드를 Tc-99m에 연결하는 많은 당업계에 알려진 방법들(간단한 방법의 예로는 참조문헌으로 본 명세서에 통합된 미국등록특허 제5,328,679호; 제5,888,474호; 제5,997,844호; 및 제5,997,845호에 의해 나타난 방법들을 포함)이 있다.

대체로, 환자의 종양 조직의 해부 위치를 위해, 종양이 있음이 예상되는 환자 또는 동물에게 상기 접합 태그가 투여된다. 표지된 면역글로불린이 종양 자리에 배치되도록 충분한 시간이 지난 후, 표지에 의해 발생된 신호가 검출되는데, 예를 들면, 시각적으로, X선 촬영, 컴퓨터 단층 촬영, MRI에 의해, 형광 태그의 검출 장치에 의해, 감마 카메라와 같은 사진 스캐닝 장치에 의해, 또는 선택적인 태그의 성질에 따른 다른 방법 또는 적절한 장치에 의해 검출된다.

상기 검출된 신호는 이후 이미지나 종양 부위의 해부 및/또는 생리적 편향(determination)으로 변환된다. 상기 이미지는 상기 생체 내 종양의 위치를 알아내는 것과 적절한 치료 방법을 고안하는 것을 가능하게 한다. 상기 태그된 부위 자체가 치료제인 이 일실시형태에 있어서, 상기 검출된 신호는 진단 및 치료에 개입하여 추적 조사(follow-up)하기 위한 기준선을 제공하면서 치료하는 동안 해부 지점에 대한 증거를 제공한다.

I. 치료법

본 발명의 다른 측면에 있어서, 본 발명은 포유동물의 다양한 의학적 질병에 대한 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 이 치료를 필요로 하는 포유동물에게 유효량의 프로드럭, 예컨대 독소루비신-바이신 연결-PEG 접합체를 투여하는 단계를 포함하며, 이는 본 명세서에 설명된 대로 제조된다. 상기 조성물은 다른 것들 중에서 종양성 질환(neoplastic disease) 치료, 종양 적하(tumor burden) 감소, 종양(neoplasms)의 전이 억제 및 포유동물 내에서 종양의 재발/종양성 증식(neoplastic growth) 억제에 유용하다.

투여된 상기 유효량의 프로드럭은 예를 들면 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 효소 등 프로드럭 내부에에 포함된 모분자에 의존한다. 일반적으로, 상기 치료방법에 사용되는 프로드럭의 양은 포유동물의 바람직한 치료 결과를 효과적으로 성취하는 양이다. 본래, 여러 프로드럭 화합물의 복용량은 모화합물, 생체 내 가수분해 속도, 고분자의 분자량 등에 따라 다소 변경된다. 당업자들은 임상실험 및 치료 증상에 기초하여 선택된 프로드럭의 최적 복용량을 결정한다. 실제 복용량은 과도한 실험 없이 당업자에게 명백할 것이다.

본 발명의 조성물은 포유동물에 투여하기 위한 1 이상의 적절한 약학적 조성물이 포함될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 캡슐 등의 형태일 수 있으며, 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 또한 이 조성물의 투여는 당업자의 필요에 따라 경구 및/또는 비경구의 경로로 투여될 수 있다. 상기 조성물의 용액 및/또는 현탁액은 예를 들면 상기 조성물의 주입 또는 침투를 위해 당업계에 알려진 방법들, 예를 들면 정맥 주사, 근육 주사, 피하 주사 등에 의해 운반 기재로서 이용할 수 있다.

이 투여는 또한 신체 공간 또는 구멍 내에 주입함으로써 뿐만 아니라 흡입 및/또는 비강내 경로를 통로를 통해 이루어질 수 있다. 그러나, 본 발명의 바람직한 측면에 있어서, 상기 프로드럭은 이를 필요로 하는 포유동물에 비경구적으로 투여된다.

도 1~5는 상세한 설명 및 실시예에서 설명될 본 발명의 화합물을 형성하는 방법을 개략적으로 설명한다.

하기 실시예들은 본 발명을 더 상세히 설명하나, 본 발명의 효과적인 범위가 이로 인해 어느 것도 제한되는 것은 아니다. 실시예에 있는 밑줄 및 굵은 글씨의 숫자들은 도 1 내지 5에 나타낸 것들과 대응한다.

화학

일반적인 절차. 모든 반응물을 건조 질소 또는 아르곤 분위기 하에서 수행하였다. 시판되는 시약을 추가적인 정제 없이 사용하였다. 모든 PEG 화합물을 사용하기 이전에 진공 하에서 또는 톨루엔으로부터 공비증류(azeotropic distillation)함으로써 건조시켰다. NMR 스펙트럼을 베리안 머큘리^®300 NMR 스펙트로미터(Varian Mercury^®300 NMR spectrometer)를 사용하여 얻었고, 일일이 열거하지는 않았으나 용매로서 클로로포름을 중수소화시켰다. 화학적 이동(δ)은 테트라메틸실란(TMS)으로부터 다운필드(downfield)의 ppm으로 보고되었다.

HPLC 방법. 반응 혼합물, 및 중간체들과 최종 생성물의 정제물질을 ZOBAX^®300 SB C-8 역상 컬럼(150 × 4.6 mm) 또는 Phenomenex Jupiter^®300A C18 역상 컬럼(150 × 4.6 mm)과 다중파장 UV 검출기가 구비된 Beckman Coulter 시스템 Gold^®HPLC 장치를 1 mL/min의 유속 속도에서 0.5 % 트리플루오로아세트산(TFA)에 30~90 %의 아세토니트릴의 농도 구배를 사용하여 관찰하였다.

실시예 1

화합물 3의 합성

화합물 2(2.3 g, 8.7 mmol), 화합물 1(1.9 g, 8.8 mmol), 및 DMAP(1.6 g, 12.9 mmol)를 건조 메틸렌클로라이드 30 ml에 녹인 용액을 얼음조(ice bath)에 넣어 0 ℃까지 식히고, 이후 EDC 하이드로클로라이드(2.3 g, 12.0 mmol)를 첨가하였다. 이 혼합물을 밤새 상온까지 가열하고 0.1N HCl로 세척하였다. 상기 유기층을 황산나트륨 무수물로 건조, 여과하고 여과액으로부터 회전 증발기에 의해 용매를 제거하여 화합물 3을 수득하였다(3.6 g, 7.8 mmol, 90%).

¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 170.04, 169.86, 155.54, 80.87, 78.66, 70.49, 69.95, 68.14, 62.71, 55.85, 52.59, 40.02, 28.15, 27.91.

실시예 2

화합물 4의 합성

건조 메틸렌클로라이드 35 ml에 화합물 3(1.8 g, 3.9 mmol)을 녹인 용액에 아세틸 클로라이드(0.49 g, 6.2 mmol), 그 다음에 디이소프로필에틸아민(1.82 g, 14 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 상온에서 TLC를 통해 출발 물질이 검출되지 않도록 10분 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 포화 탄산수소나트륨으로 세척하고 무수 황산 나트륨으로 건조한 후, 여과하고, 여과액으로부터 회전 증발기에 의해 용매를 제거하여 조생성물(clude product)을 수득하였다. 상기 물질을 실리카겔에서 에틸 아세테이트 내 2.5% 아세토니트릴 혼합용매로 용리되는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 4를 수득하였다(0.69 g, 1.4 mmol, 35%).

¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 170.60, 170.27, 170.02, 155.68, 80.99, 78.88, 70.68, 70.13, 70.10, 68.34, 62.93, 62.74, 56.11, 52.81, 52.76, 40.21, 28.29, 28.08, 20.88.

실시예 3

화합물 7의 합성

20 ml의 메틸렌클로라이드 및 5 ml의 TFA에 화합물 4(0.25 g, 0.50 mmol)를 녹인 용액을 상온에서 15분 동안 교반한 후, 회전증발기로 용매를 제거하여 화합물 5를 수득하였다. 화합물 5를 10 ml의 건조 메틸렌클로라이드와 결합한 후, pH가 8.0 이상이 되도록 DIEA를 첨가하였다(~0.2 g). 40 ml의 건조 메틸렌클로라이드에 화합물 6(5.0 g, 0.12 mmol)을 녹인 용액에 바이신 용액을 첨가하고 상온에서 밤새 교반하였다. 이후 용매를 회전증발기로 부분적으로 제거하고, 생성물을 에테르로 침전시키고 모아서 에테르로 세척하였다. 이 조생성물을 12% DMF/IPA로부터 재결정하여 화합물 7을 수득하였다(4.6 g, 0.11mmol, 90%).

¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 170.31, 170.03, 169.76, 155.91, 80.74, 70.64-70.19 (PEG), 69.78, 69.72, 69.23, 68.13, 63.52, 62.73, 62.53, 55.92, 52.64, 40.46, 27.91, 20.69.

실시예 4

화합물 8의 합성

50 ml의 메틸렌클로라이드 및 25 ml의 TFA에 화합물 7(4.8 g, 0.12 mmol)을 녹인 용액을 상온에서 7시간 동안 교반하였다. 이후 회전증발기에 의해 용매를 부분적으로 제거하고 에테르로 생성물을 농축하였다. 고체 잔사를 여과하여 모아 에테르로 수 회 세척한 후 건조하여 화합물 8(4.1 g, 0.10 mmol, 85%)을 수득하였다.

¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 171.15, 170.25, 169.71, 155.96, 70.19-69.77 (PEG), 69.22, 69.16, 63.51, 62.29, 61.94, 55.77, 53.11, 53.01, 40.44, 20.60.

실시예 5

화합물 9의 합성

화합물 8(4.0 g, 0.1 mmol), 2-머캅토티아졸린(70 mg, 0.59 mmol), 및 DMAP(0.1 g, 0.79 mmol)을 40 ml의 건조 메틸렌클로라이드에 녹인 용액을 얼음조에서 0 ℃까지 냉각시켰다. 이후 EDC 하이드로클로라이드(0.11 g, 0.59 mmol)를 첨가하였다. 이 혼합물을 밤새 상온까지 가열하였다. 이후 용매를 회전증발기에 의해 부분적으로 제거하고, 생성물을 에테르로 침전시키고 모아 에테르로 세척하였다. 이 조생성물을 12% DMF/IPA로부터 재결정하여 화합물 9를 수득하였다(3.7 g, 0.09 mmol, 93%).

¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 200.96, 172.78, 170.35, 169.80, 155.93, 70.70-70.21 (PEG), 69.81, 69.75, 69.25, 68.13, 63.57, 63.03, 62.77, 60.64, 55.34, 52.64, 40.49, 28.80, 20.72.

실시예 6

화합물 10의 합성

화합물 9(3.0 g, 0.073 mmol), 독소루비신(0.17 g, 0.29 mmol) 및 DMAP(71 mg, 0.59 mmol)을 30 ml의 메틸렌클로라이드 및 30 ml의 DMF에 녹인 용액을 상온에서 밤새 교반하였다. 이후, 회전증발기에 의해 용매를 부분적으로 제거시키고, 에테르로 생성물을 침전시키고, 모아 에테르로 세척하였다. 이 조생성물을 DMF/IPA로부터 3번 재결정하여 화합물 10을 수득하였다(2.9 g, 0.069 mmol, 94%).

¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 211.24, 186.23, 185.89, 170.47, 169.82, 169.04, 161.81, 160.34, 155.78, 155.14, 135.20, 134.79, 133.84, 133.58, 120.16, 119.13, 118.01, 110.76, 110.60, 100.34, 72.19-67.95 (PEG), 66.87, 63.31, 61.75, 61.45, 58.97, 56.21, 53.83, 44.44, 40.29, 36.03, 34.67, 32.83, 30.97, 29.38, 24.97, 24.45, 20.54, 16.46.

실시예 7

화합물 13의 합성

화합물 12(2.5 g, 10.1 mmol), 디글리콜무수물(diglycolic anhydride) 11(1.1 g, 9.5 mmol) 및 DMAP (1.3 g, 9.5 mmol)을 25 ml의 메틸렌클로라이드에 녹인 용액을 상온에서 밤새 교반하였다. 이후 0.2 N HCl로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 여과액으로부터 회전증발기에 의해 용매를 제거하여 화합물 13을 수득하였다(2.9 g, 8.0 mmol, 84%).

NMR은 이중 피크를 나타낸다.

¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 172.92, 171.14, 169.92, 169.58, 157.50, 155.79, 80.86, 79.03, 71.34, 70.69, 70.19, 70.06, 69.84, 69.64, 69.33, 69.15, 68.85, 68.40, 53.29, 41.37, 36.97, 38.75, 38.55, 28.10.

실시예 8

화합물 14의 합성

화합물 13(2.8 g, 7.7 mmol), 화합물 1(1.7 g, 7.7 mmol) 및 DMAP(1.3 g, 10.8 mmol)을 30 ml의 건조 메틸렌클로라이드에 녹인 용액을 얼음조에서 0℃까지 냉각시켰다. 이후 1.9 g(10.0 mmol)의 EDC 하이드로클로라이드를 첨가하였다. 이 혼합물을 상온까지 밤새 가열하였다, 이후 0.2 N HCl로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 여과액으로부터 회전증발기에 의해 용매를 제거하여 화합물 14를 수득하였다(2.3 g, 4.1 mmol, 53%).

실시예 9

화합물 15의 합성

조화합물 14(2.3 g, 4.1 mmol)를 20 ml의 건조 메틸렌클로라이드에 녹인 용액에 아세틸 클로라이드(0.64 g, 8.2 mmol), 이후 디이소프로필에틸 아민(1.1 g, 8.2 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 상온에서 TLC를 통해 출발 물질이 검출되지 않도록 10분 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 포화 탄산수소나트륨으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 여과액으로부터 회전증발기에 의해 용매를 제거하여 2.1g의 조생성물을 수득하였다. 상기 물질을 실리카겔 상에서 에틸 아세테이트에 5% 메탄올을 혼합한 혼합용매를 용리한 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 수득하였다(0.24 g, 0.40 mmol, 10%).

¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 170.33, 170.02, 169.17, 168.44, 155.47, 80.78, 78.64, 70.64, 69.81, 69.26, 68.07, 63.01, 62.48, 55.92, 52.57, 40.00, 38.31, 28.10, 27.87, 20.65.

이 아세틸화 생성물(0.23 g, 0.38 mmol)을 20 ml의 메틸렌클로라이드 및 5 ml의 TFA를 혼합한 용액에 넣고 15분 동안 교반하였다. 이후 회전증발기에 의해 용매를 제거하였다. 이 바이신 잔기에 10 ml의 건조 메틸렌클로라이드를 넣고 이후 pH가 8.0 이상이 될 때까지 DIEA를 첨가하였다(~0.2g). 이 바이신 용액을 화합물 6(4.0 g, 0.10 mmol)이 30 ml의 건조 메틸렌클로라이드에 용해된 용액에 넣고 상온에서 밤새 교반하였다. 이후, 회전증발기에 의해 용매를 부분적으로 제거시키고, 에테르로 생성물을 침전시키고, 모아 에테르로 세척하였다. 이 조생성물을 12% DMF/IPA로부터 재결정하여 목적생성물을 수득하였다(3.8 g, 0.02 mmol, 95%).

¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 170.29, 169.97, 169.13, 168.37, 155.90, 80.80, 70.68-69.67 (PEG), 69.20, 68.09, 63.52, 63.02, 62.47, 55.94, 52.59, 40.49, 38.31, 27.91, 20.69.

이 PEG화 생성물(3.8 g, 0.10 mmol)을 40 ml의 메틸렌클로라이드 및 20 ml의 TFA에 넣고 상온에서 15시간 동안 교반하였다. 이후 회전증발기에 의해 용매를 부분적으로 제거하고, 에테르로 생성물을 농축하였다. 여과하여 고체 잔사를 모아, 에테르로 수 회 세척하고 건조하여 산을 수득하였다(3.4 g, 0.08 mmol, 89%).

¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 170.96, 169.93, 168.89, 168.23, 155.78, 72.45-66.94 (PEG), 63.23, 62.38, 61.63, 54.82, 52.47, 40.23, 38.03, 20.39.

상기 산(3.4 g, 0.08 mmole), 2-머캅토티아졸린( 59 mg, 0.50 mmol), 및 DMAP(81 mg, 0.66 mmol)를 40 ml의 건조 메틸렌클로라이드에 용해시킨 용액을 얼음조에서 0℃까지 냉각시킨 후, EDC 하이드로클로라이드(0.11 g, 0.59 mmol)를 첨가하였다. 이 혼합물을 상온까지 밤새 가열하였다. 이후, 회전증발기에 의해 용매를 부분적으로 제거시키고, 에테르로 생성물을 침전시키고, 모아 에테르로 세척하였다. 이 조생성물을 20% DMF/IPA로부터 재결정하여 화합물 15를 수득하였다(3.2 g, 0.078 mmol, 94%).

¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 200.96, 172.64, 170.28, 168.13, 168.34, 155.85, 75.76-69.15 (PEG), 68.07, 63.48, 63.20, 62.62, 60.56, 55.31, 52.53, 40.44, 38.26, 28.74, 20.66.

실시예 10

화합물 16의 합성

화합물 15(3.2 g, 0.0783 mmol), 독소루비신(0.18 g, 0.319 mmol) 및 DMAP(77 mg, 0.62 mmol)를 30 ml의 메틸렌클로라이드 및 30 ml의 DMF에 녹인 용액을 상온에서 밤새 교반하였다. 이후, 회전증발기에 의해 용매를 부분적으로 제거시키고, 에테르로 생성물을 침전시키고, 모아 에테르로 세척하였다. 이 조생성물을 20 % DMF/IPA로부터 4회 재결정하여 화합물 16을 수득하였다(2.8g, 0.067 mmol, 88%).

¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 212.98, 186.21, 185.86, 170.34, 169.33, 168.98, 168.29, 160.32, 155.79, 155.58, 154.94, 135.22, 134.70, 133.23, 133.05, 120.09, 119.14, 118.03, 110.79, 110.61, 100.29, 75.90-68.44 (PEG), 67.80, 66.91, 64.90, 63.31, 62.06, 61.36, 58.79, 56.18, 53.86, 53.60, 44.37, 40.26, 38.12, 35.25, 33.27, 29.33, 20.47, 16.48.

실시예 11

화합물 17의 합성

화합물 12(1.0 g, 4.0 mmol)를 20 ml의 메틸렌클로라이드에 녹인 용액에 상온에서 트리포스겐(0.4 g, 1.3 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(1.0 g, 8.1 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 상온에서 1시간 동안 교반한 후, 화합물 1(0.88 g, 4.0 mmol) 및 DMAP(0.5 g, 4.0 mmol)를 첨가하였다. 이 혼합물을 상온에서 밤새 교반 한 후, 0.1 N HCl로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 여과액으로부터 회전증발기에 의해 용매를 제거하여 2.2 g의 조생성물을 수득하였다. 상기 물질을 실리카겔 상에서 에틸 아세테이트에 6% 메탄올을 넣은 혼합용매로 용리한 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 17을 수득하였다(1.3 g, 2.6 mmol, 65%).

¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 170.86, 156.23, 155.69, 81.10, 78.94, 62.60, 59.03, 56.81, 56.09, 53.17, 40.68, 40.18, 28.28, 28.00.

실시예 12

화합물 18의 합성

화합물 17(0.1 g, 0.2 mmol)을 2 ml의 건조 메틸렌클로라이드에 녹인 용액에 아세틸 클로라이드(32 mg, 0.4 mmol), 그 다음에 디이소프로필에틸 아민(87 mg, 0.67 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 상온에서 TLC를 통해 출발 물질이 검출되지 않을 정도로 10분 동안 교반하였다. 이 혼합물을 포화 탄산수소나트륨으로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한 후, 여과하고, 여과액으로부터 회전증발기에 의해 용매를 제거하여 화합물 18을 수득하였다(0.1 g, 0.2 mmol, 100%).

¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 170.59, 170.33, 156.16, 155.64, 80.99, 79.13, 70.21, 70.05, 63.08, 62.97, 56.48, 53.46, 52.92, 40.87, 40.39, 28.49, 28.27, 21.04, 20.69.

실시예 13

화합물 20의 합성

화합물 18(0.1 g, 0.2 mmol)을 8 ml의 메틸렌클로라이드 및 2 ml의 TFA에 넣고 15분 동안 교반한 후, 회전증발기에 의해 용매를 제거하였다. 이 바이신 잔기를 5 ml의 건조 메틸렌 클로라이와 화합시킨 후, pH가 8.0 이상이 될 때까지 DMAP를 첨가하였다(~0.6 g). 이 바이신 용액을 화합물 19(2.0 g, 0.05 mmol)을 15 ml의 건조 메틸렌클로라이드에 녹인 용매에 넣고, 상온에서 밤새 교반하였다. 이후, 회전증발기에 의해 용매를 부분적으로 제거시키고, 에테르로 생성물을 침전시키고, 모아 에테르로 세척하였다. 이 조생성물을 12% DMF/IPA로부터 재결정하여 화합물 20을 수득하였다(1.8 g, 0.04 mmol, 90%).

¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 170.50, 170.18, 156.40, 156.37, 156.08, 155.32, 80.74, 71.57-65.23 (PEG), 63.72, 63.29, 62.62, 58.68, 56.10, 53.13, 52.53, 40.93, 40.51, 27.94, 20.74.

실시예 14

화합물 21의 합성

화합물 20(1.8 g, 0.04 mmol)을 20 ml의 메틸렌클로라이드 및 10 ml의 TFA에 넣고 상온에서 7시간 동안 교반하였다. 이후 회전증발기에 의해 용매를 부분적으로 제거하고, 에테르로 생성물을 농축하였다. 여과하여 고체 잔사를 모아, 에테르로 수 회 세척하고 건조하여 목적화합물(산)을 수득하였다(1.4 g, 0.03 mmol, 78%).

¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 172.11, 170.34, 156.39, 156.16, 155.41, 72.80-67.82 (PEG), 63.75, 63.35, 62.30, 61.89, 58.71, 56.15, 53.66, 53.25, 40.93, 40.55, 20.65.

이러한 산(1.2 g, 0.03 mmol), 2-머캅토티아졸린(0.01 g, 0.09 mmol) 및 DMAP(0.014 g, 0.12 mmol)을 10 ml의 건조 메틸렌클로라이드에 녹인 용액을 얼음조에서 0℃까지 냉각시킨 후, EDC 하이드로클로라이드(0.017 g, 0.09 mmol)를 첨가하였다. 이 혼합물을 상온까지 밤새 가열하였다. 이후, 회전증발기에 의해 용매를 부분적으로 제거시키고, 에테르로 생성물을 침전시키고, 모아 에테르로 세척하였다. 이 조생성물을 12% DMF/IPA로부터 재결정하여 화합물 21을 수득하였다 (1.1 g, 0.03 mmol, 92%).

¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 170.76, 170.46, 156.33, 155.99, 155.30, 71.54-69.12 (PEG), 63.69, 63.32, 62.84, 62.62, 60.70, 58.67, 55.36, 53.05, 52.49, 40.92, 40.49, 28.78, 20.71.

실시예 15

화합물 22의 합성

화합물 21(1.0 g, 0.025 mmol), 독소루비신(28 mg, 0.05 mmol) 및 DMAP(12 mg, 0.1 mmol)를 10 ml의 메틸렌클로라이드 및 10 ml의 DMF에 녹인 용액을 상온에서 밤새 교반하였다. 이후, 회전증발기에 의해 용매를 부분적으로 제거시키고, 에테르로 생성물을 침전시키고, 모아 에테르로 세척하였다. 이 조생성물을 12% DMF/IPA로부터 3회 재결정하여 화합물 22를 수득하였다(0.6 g, 0.015 mmol, 60%).

실시예 16

화합물 24의 합성

화합물 23(23 g, 0.575 mmol) 및 디숙신이미딜 탄산염(disuccinimidyl carbonate)(2.36 g, 9.2 mmol)을 230 ml의 메틸렌클로라이드 및 23 ml의 DMF에 녹인 용액을 0 ℃까지 냉각시킨 후, 피리딘(0.75 ml, 9.2 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 상온까지 밤새 가열한 후, Celite^®를 통해 여과하고, 회전 증발기를 이용하여 여과액으로부터 용매를 부분적으로 제거하였다. 조생성물을 에테르로 침전시킨 후 모아 여과하여, 20% DMF/IPA로부터 재결정시켜 화합물 24를 수득하였다(20.1 g, 0.50mmol, 86%).

¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 168.15, 151.14, 70.76-69.67 (PEG), 67.99, 45.24, 25.20.

실시예 17

화합물 25의 합성

화합물 18(0.51 g, 0.9 mmol)을 10 ml의 건조 메틸렌클로라이드에 넣은 후, pH가 8.0 이상이 될 때까지 DIEA를 첨가하였다(~0.6g). 이 바이신 용액을 화합물 24(5.0 g, 0.12 mmol)을 40 ml의 건조 메틸렌클로라이드에 녹인 용액에 첨가한 후 상온에서 밤새 교반하였다. 이후, 회전증발기에 의해 용매를 부분적으로 제거시키고, 에테르로 생성물을 침전시키고, 모아 에테르로 세척하였다. 이 조생성물을 12% DMF/IPA로부터 재결정하여 화합물 25를 수득하였다(4.9 g, 0.12 mmol, 94%).

¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 170.38, 170.12, 155.90(d), 80.65, 72.16-69.20 (PEG), 63.51, 62.79, 62.62, 61.28, 56.12, 53.10, 52.53, 45.19, 40.46, 27.91, 20.72.

실시예 18

화합물 26의 합성

화합물 25(5.5 g, 0.13 mmol)를 55 ml의 메틸렌클로라이드 및 28 ml의 TFA에 녹인 용액을 상온에서 7시간 동안 교반하였다. 이후 회전증발기에 의해 용매를 부분적으로 제거하고, 에테르로 생성물을 농축하였다. 여과하여 고체 잔사를 모아, 에테르로 수 회 세척하고 건조하여 산을 수득하였다(5.1 g, 0.12 mmol, 93%).

¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 170.49, 170.20, 156.01, 155.68, 70.70-69.22 (PEG), 67.80, 66.68, 63.54, 62.64, 61.65, 61.22, 55.45, 53.57, 53.17, 45.21, 40.52, 20.56.

상기 산(5.0 g, 0.12 mmol), 2-머캅토티아졸린(0.17 g, 1.4 mmol) 및 DMAP(0.23 g, 1.9 mmol)를 50 ml의 건조 메틸렌클로라이드에 녹인 용액을 얼음조에서 0℃까지 냉각시킨 후 EDC 하이드로클로라이드(0.28 g, 1.5 mmol)를 첨가하였다. 이 혼합물을 상온까지 밤새 가열하였다. 이후, 회전증발기에 의해 용매를 부분적으로 제거시키고, 에테르로 생성물을 침전시키고, 모아 에테르로 세척하였다. 이 조생성물을 12% DMF/IPA로부터 재결정하여 화합물 26을 수득하였다(4.6 g, 0.11 mmol, 92%).

¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 200.88, 172.83, 170.38, 155.91, 72.15-69.20 (PEG), 63.51, 63.03, 62.82, 62.62, 61.26, 60.70, 55.34, 53.07, 52.52, 45.19, 40.47, 28.78, 20.71.

실시예 19

화합물 27의 합성

화합물 26(2.3 g, 0.055 mmol), 독소루비신(0.25 g, 0.44 mmol) 및 DMAP(0.11 g, 0.88 mmol)을 20 ml의 메틸렌클로라이드 및 20 ml의 DMF에 녹인 용액 을 상온에서 밤새 교반하였다. 이후, 회전증발기에 의해 용매를 부분적으로 제거시키고, 에테르로 생성물을 침전시키고, 모아 에테르로 세척하였다. 이 조생성물을 12% DMF/IPA로부터 2회 재결정하여 화합물 27을 수득하였다(1.7 g, 0.039 mmol, 71%).

실시예 20

단일 바이신-12K- 리소자임 및 단일 바이신-20K- 리소자임 접합체의 제조방법

PEG 분말을 빠르게 교반시키면서 PEG와 단백질을 1:1.5~2의 몰비로 반응시킨 후, pH 7.6인 0.05 M 황산나트륨에 6 ml의 5 mg/ml 리소자임(Sigma, MO)을 녹인 용액에 첨가하였다. 60분 후, 25 ℃의 반응온도와 N₂ 하에서시료를 전기전도도가 2 ms 미만, pH가 5 이하가 되도록 pH 5.1인 10 mM의 황산나트륨에 희석시켰다.

단일 PEG-리소자임을 양이온교환 컬럼(Poros HS, Applied Biosystems, CA) pH 5.1인 20 mM의 황산나트륨 및 pH 5.1인 20 mM 황산나트륨에 1 M NaCl을 혼합한 농도 구배 완충용액(gradient buffer)의 용매 시스템을 사용하여 분리하였다. 상기 컬럼으로부터 용리되어 나오는 화합물의 순서는 다중 PEG-리소자임이 첫번째, 다음으로 단일 PEG-리소자임, 그리고 다음으로 본래(native) 리소자임으로 나타났다. SDS-PAGE (미리제조한(precast) 4-20 % SDS 비환원 겔(non-reducing gel), Invitrogen, CA)에 나타난 피크의 단일 PEG-리소자임을 모아 울트라프리 원심여과장치(Ultrafree centrifugal filter device)에서 5k NMWL 멤브레인(Millipore Corp., Bedford, MA)을 사용하여 농축하였다.

실시예 21

다중 바이신-12K- 리소자임 및 다중 바이신-20K- 리소자임 접합체의 제조방법

PEG 분말을 빠르게 교반시키면서 PEG와 단백질을 1:20~30의 몰비로 반응시킨 후, pH 7.6인 0.1 M 황산나트륨에 0.5 ml의 5 mg/ml 리소자임(Sigma, MO)을 녹인 용액에 첨가하였다. 상기 반응은 상온, N₂ 하에서 60분 동안 수행되었으며, pH가 6.0 미만 또는 크기배제컬럼으로 정제된 즉시 반응을 종결하였다.

상기 반응혼합물을 pH 6.0인 20 mM의 황산나트륨에 5 ml가 되도록 희석시키고, 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하고, HiLoad Superdex 200 컬럼(Amersham, NJ)으로 분리하였다. 상기 컬럼을 140 mM NaCl, 20 mM NaP, pH 6.0으로 평형을 유지시키고 1 ml/분획/분의 속도로 접합체를 용리 배출시켰다. SDS-PAGE에 나타난 피크의 분획물은 울트라프리 30K(Millipore Corp., Bedford, MA)를 사용하여 모으고 농축하였다.

실시예 22

생체 외 활성 결과

표 1. PEG -바이신-독소루비신 접합체의 성질

화합물	t ₁ _/2 ( rp ) 시간	분자량	%활성도
10	4.8	41803	2.60
16	5.0	41554	2.34
22	56	41204	0.73
27	247	43722	4.25

실시예 23

단백질 접합

물질 및 방법

리소자임(Chicken egg white lysozyme)(EC 3.2.1.17), 리소자임 기질 박테리아(Micrococcus lysodeikticus) 및 PBS 완충용액(10 mM 인산염, pH 7.4, 138 mM NaCl, 및 2.7 mM KCl)을 시그마사(Sigma Inc.(St. Louis, MO))로부터 구입하였다. 미리제조된 트리스-글리신 SDS 전기영동 겔(Tris-glycine SDS electrophoresis gel) 및 전기영동용 완충용액(gel running buffer)은 인비트로겐사(Invitrogen(Carlsbad, CA))로부터 얻었다. 생체 내 접합체의 가수분해 활성 측정에 사용되는 쥐 혈장(Rat plasma)은 EDTA 내에서 진행되고 냉동보관되었다. IL-2는 페프로테크사(PeproTech(Princeton, NJ))에서 구입되었고, GFP는 클론테크사 (Clontech(Palo Alto, CA))로부터 얻었다. 모든 생체 내 측정은 3회 및 생체 외 측정에 대하여 ±5%의 표준편차로 수행되었다.

단일 PEG - 리소자임 접합체의 제조방법

달걀 유래 리소자임은 14,500의 분자량과 6개의 리신 잔기를 갖는다. 활성 PEG 분말을 빠르게 교반시키면서 PEG와 리소자임을 1:1의 몰비로 반응시킨 후, pH 7.3인 0.1 M 인산염 완충용액 내 5 mg/mL 리소자임 용액에 첨가하였다. 25 ℃, 45분 후, 상기 반응에 0.2 M 황산나트륨(pH 5.1) 처리를 하여 최종 pH가 6.5가 되게 하였다. 상기 반응 혼합물을 6,000-8,000 MW 분획막(cutoff membrane)을 사용하여 4 ℃에서 pH 5.1인 20 mM 황산나트륨에 대하여 투석시켰다. 투석 후 시료 전기전도도는 2 mS 미만이 되어야 한다. 단일 PEG-리소자임의 분리는 양이온교환 컬럼(Poros HS, Applied Biosystems, CA)에서 pH 5.1인 20 mM 황산나트륨에 NaCl을 혼합한 농도 구배의 용매 시스템을 사용하여 수행되었다. 단일 PEG-리소자임의 피크는 모아 울트라프리 원심분리장치에서 10k NMWL 멤브레인(Millipore Corp., Bedford, MA)을 사용하여 농축하였다.

정제된 단일 PEG-리소자임의 수득률은 약 20~30%였다.

다중 PEG - 리소자임 접합체의 제조방법

활성 PEG 연결자를 빠르게 교반시키면서 PEG와 리소자임을 30:1의 몰비로 반응시킨 후, pH 7.3인 0.1 M 인산염 완충용액 내 5 mg/mL 리소자임 용액에 첨가하였다. 25 ℃, 45분 후, 상기 반응에 0.2 M 황산나트륨(pH 5.1) 처리를 하여 최종 pH가 6.5가 되게 하였다. 상기 반응혼합물을 H₂O로 희석시키고, HiLoad Superdex 200 컬럼(Amersham, NJ)에서 1 mL/min의 속도로 분리하였다. 상기 컬럼 완충용액은 (pH 6.8) 및 140 mM NaCl를 포함한다. 상기 피크의 분획물을 울트라프리 원심 여과장치에서 30k NMWL 멤브레인(Millipore Corp., Bedford, MA)을 사용하여 모으고 농축하였다. 정제된 다중 PEG-리소자임의 수득률은 약 85 %이고 형광 분석(fluormetric assay)에 의해 분석된 리소자임 분자당 PEG 수는 5~6으로 나타났다.

농도 검출

PEG-리소자임 접합체 농도는 pH 7.3인 0.1 M 황산나트륨내에서, 280 nm, 2.39 mL/mg.cm의 소광계수에서 UV에 의해 검출되었다.

리소자임의 효소 활성 실험

상술한 반응 조건 하에서, 단일 PEG와 접합한 후 리소자임의 활성은 사라졌다. 상기 리소자임의 방출은 여러 방출 조건 하에서 리소자임의 재생에 의해 나타나며, SDS 전기영동 겔에서 확인되었다.

전형적인 리소자임 활성 실험에 있어서, 96-웰 적정 플레이트(titer plate)에서 0.2 ml의 0.02 % (w/v) M. lysodeikticus(기질)를 pH 6.2이고 0.01 % BSA를 함유하는 0.12-0.24 ㎍의 리소자임을 50 ㎕ 66 mM 인산 칼륨에 녹인 용액에 첨가하였다. 이후 450 nm에서 흡광도를 5분 동안 측정하였다. 흡광도의 감소율은 효소 활성을 측정하는 데 사용되었다. 효소 활성의 일단위(one unit)는 25 ℃, 450 nm에서 흡광도 0.001 units/min의 변화를 야기한다.

쥐 혈장 및 화학적 완충용액 내에서의 리소자임의 방출

쥐 혈장에서 리소자임의 방출을 관찰하기 위하여 pH 6.5인 인산염 완충용액 내의 PEG-리소자임 접합체를 pH 7.4인 PBS로 완충용액 교환을 수행하였다. 37 ℃에서 PBS 내의 안정도를 측정하였다. 또한 pH 8.5인 트리스 완충용액에서 방출을 위해 상기 접합체를 H₂O로 완충용액 교환을 수행하였다. 단일 PEG-리소자임 접합체에서는 CentriCon 10 K 원심분리 튜브(Millipore Corp., Bedford, MA)를 사용한 반면, 다중 PEG-리소자임 접합체에서는 CentriCon 30 K 원심분리 튜브(Millipore Corp., Bedford, MA)를 사용하였다. 단일 또는 다중 PEG-리소자임 접합체의 방출은 0.15 mg/mL, N₂ 분위기 하에서 수행되었다_. 지정된 시간에 분취액(aliquot)을 회수하여, 0.2 M 인산염(pH 5.1)으로 pH 6.5까지 중화하고, 다음 실험할 때까지 -20 ℃에서 저장하였다.

Claims

하기 화학식 (I)의 화합물:

상기 화학식에서,

R₁은 실질적으로 비항원 고분자 잔기, C₁ _-6 알킬, C₂ _-6 알케닐, C₂ _-6 알키닐, 아랄킬, 및 말단 분지기로 이루어지는 군으로부터 선택되고;

Z 및 Z′는 동일 또는 상이하고, 독립적으로 표적 세포 내부로 활발하게 운반되는 부위, 소수성 부위, 이중기능성 연결 부위 및 이의 조합으로부터 선택되고;

Y₁ _-3은 동일 또는 상이하고, O, S 또는 NR₁₁로부터 선택되고;

L₁ 및 L₃은 독립적으로 이중기능성 연결자이고;

R₃-R₁₁ _,R₂₄ 및 R₂₅는 동일 또는 상이하고, 수소, C₁ _-6 알킬, C₂ _-6 알케닐, C₂ _-6 알키닐, C₃ _-19 분지 알킬, C₃ _-8 사이클로알킬, C₁ _-6 치환된 알킬, C₂ _-6 치환된 알케닐, C_2-6 치환된 알키닐, C₃ _-8 치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬, C₁ _-6 헤테로알킬, 치환된 C₁ _-6 헤테로알킬, C₁ _-6 알콕시, 페녹시 및 C₁ _-6 헤테로알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되며;

L₂는 -C(O)(CR₃₀R₃₁)Y₁₅(CR₃₂R₃₃)C(O)NR₃₅- 또는 -C(O)(CR₃₀R₃₁)(CR₃₂R₃₃)C(O)NR₃₅-이고:

이때 Y₁₅는 O, S, NR₃₄ 또는 CH₂로부터 선택되고,

R₃₀ _-35는동일 또는 상이하고, 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬 또는 아릴로부터 선택되며;

A 및 A′는 동일 또는 상이하고, 독립적으로 알킬기, 이탈기, 치환기, 진단제, 표적 부위, 생물학적 활성 부위 및 OH로부터 선택되며;

a, g, e는 동일 또는 상이하고, 독립적으로 0 또는 1 내지 5의 양의 정수이며;

만약 (a+e)가 1 이상이라면

b, c, d 및 d′는 동일 또는 상이하고, 독립적으로 0 또는 1이고,

m, n, o, 및 p는 동일 또는 상이하고, 독립적으로 1 내지 6의 양의 정수이다.
제1항에 있어서, 상기 R₃-R₁₀, R₂₄ _-25 및 R₃₀ _-34는각각 수소이고; Y₁₅는 O 또는 NR₃₄인 화합물.
제1항에 있어서, 상기 a, b, c, d, d′, g, m, n, o 및 p는 각각 1인 화학식 (I)의 화합물.
제1항에 있어서, 상기 e는 0, a는 0, b는 0 및 c는 0인 화학식 (I)의 화합물.
제1항에 있어서, 상기 R₁은 폴리알킬렌옥사이드를 포함하는 화학식 (I)의 화합물.
제1항에 있어서, 상기 R₁은 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 화학식 (I)의 화합물.
제1항에 있어서, 상기 A는 활성기, 표적기 또는 생물학적 활성 부위이고, A′는 알킬기, 활성기, 표적기 또는 진단제인 화학식 (I)의 화합물.
제1항에 있어서, 상기 R₁은 H, NH₂, SH, CO₂H, C₁ _-6알킬 부위 및

로 이루어지는 군으로부터 선택되는 캡핑기 J를 더 포함하는 화학식 (I)의 화합물.
제8항에 있어서, 하기 화학식인 화학식 (I)의 화합물:

.
제1항에 있어서, 상기 R₁은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화학식 (I)의 화합물:

이때, 상기 x는 중합도이고;

R₁₂는수소, C₁ _-6알킬, C₂ _-6 알케닐, C₂ _-6 알키닐, C₃ _-19 분지 알킬, C₃ _-8 사이클로알킬, C₁ _-6 치환된 알킬, C₂ _-6 치환된 알케닐, C₂ _-6 치환된 알키닐, C₃ _-8 치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬, C₁ _-6 헤테로-알킬, 치환된 C₁ _-6 헤테로알킬, C_1-6 알콕시, 페녹시 및 C₁ _-6 헤테로알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되며;

J는 캡핑기이다.
제1항에 있어서, 상기 R₁은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화학식 (I)의 화합물:

이때, 상기 x는 중합도이다.
제1항에 있어서, 상기 R₁은 하기 화학식의 고분자 잔기를 포함하는 화학식 (I)의 화합물:

이때, 상기 x는 중합도이다.
제1항에 있어서, 상기 L₁ 및 L₃은독립적으로 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화학식 (I)의 화합물:

이때, R₁₄-R₁₇ 및 R₁₉는 독립적으로 수소, C₁ _-6 알킬, C₂ _-6 알케닐, C₂ _-6 알키닐, C_3-19 분지 알킬, C₃ _-8 사이클로알킬, C₁ _-6 치환된 알킬, C₂ _-6 치환된 알케닐, C₂ _-6 치환된 알키닐, C₃ _-8 치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬, C₁ _-6 헤테로알킬, 치환된 C₁ _-6헤테로알킬, C₁ _-6알콕시, 페녹시 및 C₁ _-6 헤테로알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되고;

R₁₈은 수소, C₁ _-6알킬, C₂ _-6 알케닐, C₂ _-6알키닐, C₃ _-19 분지 알킬, C₃ _-8 사이클로알킬, C₁ _-6 치환된 알킬, C₂ _-6 치환된 알케닐, C₂ _-6 치환된 알키닐, C₃ _-8 치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬, C₁ _-6 헤테로알킬, 치환된 C₁ _-6 헤테로알킬, C₁ _-6 알콕시, 페녹시 및 C₁ _-6 헤테로알콕시, NO₂, 할로알킬 및 할로겐으로 이루어지는 군으로부터 선택되며;

t 및 s는 1 내지 4의 양의 정수에서 독립적으로 선택된다.
제1항에 있어서, 상기 L₂는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화학식 (I)의 화합물:

이때, R₃₀ _-34는독립적으로 H, C₁ _-6알킬, C₂ _-6알케닐, C₂ _-6 알키닐, C₁ _-6 헤테로알킬 또는 아릴로부터 선택되며,

n은 1 내지 3의 양의 정수이다.
제1항에 있어서, 상기 R₁은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화학식 (I)의 화합물:

이때, (q)는 1 내지 5의 정수이고;

Z″는 O, NR₁₃, S, SO 또는 SO₂; 상기 R₁₃ _은 H, C₁ _-8 알킬, C₁ _-8 분지 알킬, C₁ _-8 치환된 알킬, 아릴 또는 아랄킬이고;

(h)는 0 또는 1이며;

(k)는 1 내지 6의 양의 정수이다.
제1항에 있어서, 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화학식 (I)의 화합물:

및

이때, A₁는이탈기이다.
제1항에 있어서, 상기 A₁는

로 이루어지는 군으로부터 선택되는 이탈기인 화학식 (I)의 화합물.
제1항에 있어서, 상기 말단 분지기는 하기 화학식을 포함하는 화학식 (I)의 화합물:

이때, Y₆ 및 Y₇은 독립적으로 O, S 또는 NR₄₆이고;

L₆은 L₁의 정의와 동일한 군으로부터 선택되는이중기능성 연결자이고;

L₈은 L₂의정의와 동일한 군으로부터 선택되는이중기능성 연결자이고;

R₄₀-R₄₆ 동일 또는 상이하고, 수소, C₁ _-6알킬, C₂ _-6 알케닐, C₂ _-6알키닐, C₃ _-19 분지 알킬, C₃ _-8 사이클로알킬, C₁ _-6 치환된 알킬, C₂ _-6 치환된 알케닐, C₂ _-6 치환된 알키닐, C₃ _-8 치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬, C₁ _-6 헤테로알킬, 치환된 C₁ _-6 헤테로알킬, C₁ _-6 알콕시, 페녹시 및 C₁ _-6 헤테로알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되고;

j, j′, i 및 i′는 각각 독립적으로 0 또는 양의 정수이고;

l 및 l′는 독립적으로 0 또는 1이고;

u, r, v 및 w는 독립적으로 선택되는 양의 정수이고;

R₅₀은 실질적으로 비항원 고분자 잔기, C₁ _-6 알킬, C₂ _-6 알케닐, C₂ _-6 알키닐, 아랄킬 및

로 이루어지는 군으로부터 선택된다;

이때, L₇은 L₁의 정의와 동일한 군으로부터 선택되는이중기능성 연결자이고;

L₉는 L₂의 정의와 동일한 군으로부터 선택되는이중기능성 연결자이고;

R₆₀은 실질적으로 비항원 고분자 잔기, C₁ _-6 알킬, C₂ _-6 알케닐, C₂ _-6 알키닐, 아랄킬로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
제18항에 있어서, 하기 화학식을 포함하는 화학식 (I)의 화합물:
제19항에 있어서, 하기 화학식을 포함하는 화학식 (I)의 화합물:
제1항에 있어서, 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화학식 (I)의 화합물:
제1항에 있어서, 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화학식 (I)의 화합물:

이때,

및

.
제1항에 있어서, 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화학식 (I)의 화합물:

이때, 상기 A 및 A′는 독립적으로 이탈기이다.
하기 화학식의 화합물:

(이때,

A₁은 이탈기이고;

A′는 알킬기, 이탈기, 치환기, 진단제, 표적 부위, 및 OH로 이루어지는 군으로부터 선택되고;

R₁은 실질적으로 비항원 고분자 잔기, C₁ _-6 알킬, C₂ _-6 알케닐, C₂ _-6알키닐, 아랄킬, 및 말단 분지기로 이루어지는 군으로부터 선택되고;

Z 및 Z′는 동일 또는 상이하고, 독립적으로 표적 세포 내부로 활발하게 운반되는 부위, 소수성 부위, 이중기능성 연결 부위 및 이의 조합으로부터 선택되며;

Y₁ _-3은 동일 또는 상이하고, O, S 또는 NR₁₁로부터 선택되며;

L₁ 및 L₃은 독립적으로 이중기능성 연결자이고;

R₃-R₁₁ _,R₂₄ 및 R₂₅는 동일 또는 상이하고, 수소, C₁ _-6 알킬, C₂ _-6 알케닐, C₂ _-6 알키닐, C₃ _-19 분지 알킬, C₃ _-8 사이클로알킬, C₁ _-6 치환된 알킬, C₂ _-6 치환된 알케닐, C_2-6 치환된 알키닐, C₃ _-8 치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬, C₁ _-6 헤테로알킬, 치환된 C₁ _-6 헤테로알킬, C₁ _-6 알콕시, 페녹시 및 C₁ _-6 헤테로알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되며;

L₂는 -C(O)(CR₃₀R₃₁)Y₁₅(CR₃₂R₃₃)C(O)NR₃₅- 또는 -C(O)(CR₃₀R₃₁)(CR₃₂R₃₃)C(O)NR₃₅-이고:

이때, Y₁₅는 O, S, NR₃₄ 또는 CH₂로부터 선택되고,

R₃₀ _-35는동일 또는 상이하고, 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬 또는 아릴로부터 선택되며;

a, g, e는 동일 또는 상이하고, 독립적으로 0 또는 1 내지 5의 양의 정수이며;

만약 (a+e)가 1 이상이라면

b, c, d 및 d′는 독립적으로 0 또는 1이고,

m, n, o, 및 p는 독립적으로 1 내지 6의 양의 정수이다);

을 충분한 조건하에서 생물학적 활성제와 반응시켜

를 형성시키는 단계를 포함하는 고분자 접합체의 제조방법:

이때, A₂는 생물학적 활성제의 잔사이다.
1) 확장 봉쇄된 이중기능성 연결자 1 당량을 산 보호된(protected) 바이신 부위 1 당량과 반응시켜 하기 화학식의 중간체를 형성시키는 단계:

이때, tBu는 보호기이다;

2) 상기 중간체를 아실화제와 반응시켜 하기 화학식의 중간체를 형성시키는 단계;

3) 상기 결과 생성된 중간체를 탈보호(deblocking)시키고, 이를 염기 커플링 조건하에서 활성화된 고분자와 반응시키는 단계;

4) 바이신 산을 탈보호(deprotecting)시키고, 이로부터 커플링 조건하에서 적절한 활성기로 상기 산을 활성화시키는 단계를 포함하는 바이신계 고분자 운반 시스템의 제조 방법.
제1항의 화합물을 유효량으로 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법, 이때 A′는 알킬기이고, A는 생물학적 활성제의 잔기이다.