TWI375023B - A cellular microarray and its microfabrication method - Google Patents

Description

1375023 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種生物晶片，尤指一種適用於介電電 •泳附著細胞之細胞微陣列晶片。 * 5 【先前技術】 微陣列生物晶片因為可以廣泛地應用於醫學檢測，藥 物筛選，以及細胞研究，近年來吸引眾多業界之目光。.例 如，將不同的細胞植入於同一微陣列生物晶片，並以藥物 10 '則。式其對藥物之反應，如此可以快速地同時偵測出不同細 胞對於藥物之反應，其用於研究或臨床之應用，可以大量 即省時間，並提高效率。然而，一般的微陣列生物晶片之 製造，因為需要利用高價之打點機逐點植入目標細胞，植 點入細胞所花費之時間冗長（約十小時至數天），成本也 15 2常地高昂，所以雖然微陣列生物晶片有廣泛之應用潛 能’尚無法大量地應用於研究及臨床領域。 越來越多的研究指出，使用微陣列技術來做病理分類 或藥物篩選等，是-個方便又有效率的方法1 了提高臨 床樣本測試的正確性，必須筛選出與疾病有關之正確細 20胞，如此才能做出具有可信度之基因表達圖譜。Y. Huang 等人曾在2002年發表一種利用矽晶圓的標準半導體製程技 術所製造之微陣列晶片，製作出圓形平板狀電極，並在此 電極上覆蓋有洋菜膠（agarose)，做為生物附著層。而此技 術即是利用不同細胞具有不同之介電泳力的特性，藉著調 5 1375023 整外部電壓，順利將細胞分離（Y. Huang，ei α/.义⑽厂cAe/w 2002, 74, 3362-3371)。 Y. Huang等人之目的在如何在多種細胞中篩選出所要 研究之單一細胞，所以利用這樣平板狀電極，可以順利將 5 不同細胞之混合物分離’得到單一種細胞，且可正確地檢 測這些分離之細胞之基因表達圖譜。然而使用這樣的平板 狀電極裝置’顯示出細胞無法均勻地分布在電極上，且電 極的某些部分並無細胞附著等缺點。 此外，C. T. Ho等人曾在2006年發表利用微陣列技 ίο 術，製作出一種同心圓電極，用來模擬肝臟細胞組織（C T Ho’ ei α/_ Ch>. 2006, 6, 724-734)。而此同心圓電極， 係使用聚-D-賴氨酸(poly-D-lysine)，做為生物附著層。 此同心圓電極之構造，係由正負極平行排列而成。當施加 交流電時’藉由細胞在電場中會形成介電泳力，使細胞可 15 以均勻的分布於每一個同心圓電極上。最後，可以模擬出 一人造之肝臟組織》然而，在製作電極的過程中，須.經過 至少12小時潤洗流道，才能完全將聚賴氨酸覆蓋於電極 表面上。以此方法所模擬出的人造組織，在丨小時之後進行 細胞存活率測試，結果顯示多數的細胞仍存活於電極上。 20 综上所述’業界極需要可以克服前述缺點之微陣列生 物晶片’特別是極需可以快速及均勻地附著細胞，提高產 量’並降低生物晶片之生產及使用成本微陣列生物晶片， 以因應研究及臨床領域大量地應用。 6 1375023 【發明内容】 本發明之主要目的係在提供一種細胞微陣列晶片， 能快速及均勻地附著細胞，簡化製程，提高產量0 細胞微陣列晶片之生產及使用成本。 " 5 為達成上述目的，本發明細胞微陣列晶片’包括一 基材：多個第—導線，係位於該基材之表面；多個第二: 線，係位於該基材之表面，且該第二導線不與該第一導線 電性連接；《及多個羽形電極單元。該羽形電極單元係 10 於該基材表面形成陣列排列，且每一羽形電極單元包含有 多個第-指形電極，以及多個第二指形電極。纟中該二— 指形電極係、位於該基材之表面，該第二指形電極係位於該 基材之表面’且於每-羽形電極單元内之該些第—指形電 極與該些第二指形電極交錯排列於該基材之表面。再者， 該第一導線與每一羽形電極單元之該第一指形電極電性連 15 接’該第二導線與每—羽形電極單元之該第二指形電極電 性連接，且每二個鄰接之羽形電極單元之最外層指形電極 之電性不同。 20 本發明細胞微陣列晶片之基材無限制，較佳可為透明 基材，或矽基材。本發明細胞微陣列晶片使用之透明基材 無限制，較佳可為玻璃基材或透明樹脂基材。本發明細胞 微陣列晶片之同一羽形電極單元之第一指形電極與第二指 形電極不電性連接’兩者延伸相對應配置以於使用時，施 用不同之fl形成電場，以藉由介電鋒方式吸著細胞於 羽形電極單元之生物附著層。其中，同—羽形電極單元之 7 1375023 第-扎形電極及第二指形電· 連接延伸，並相互對唐心“第f線或第二導線 Θ 對應延伸配置或圍繞。同-羽形雷拓置 元之最外層指形電極，為 早 極，鲂佐了為第一指形電極或第二指形電 較佳為相鄰之羽形電極單元之啬外 5 15 20 為第一指形電極或第二指形= )電極交替地 本發明細胞微陣列晶片相鄰之羽形電極單元 形狀無限制，較佳為任_ ^ 】或 為任一相鄰之羽形電極單元之大小或形 =同。本發明細胞微陣列晶片之羽形 :本晴極單元周緣為多邊形，圓形,或:圓 讀微陣列晶片之同—羽形電極單元内之第一 广=第二指形電極形狀可為相同或不相同，較佳為 電：第二指形電極形狀相同，更佳為第一指形 s -曰形電極形狀為線形，或折線形，或弧形。本 二細列：片之同一羽形電極單元内之排列圖形無 佳為第一指形電極與該第二指形電極形成同心圓 带列’或梳形排列.。本發明細胞微陣列晶片之同一羽形 :極：元内之第一指形電極或第二指形電極之間距無限 較佳為每一羽形電極之相鄰第一指形電極與第二指形 電極間之間距相等’或每一羽形電極之相鄰該第一指形電 極與該第二指形電極間之間距由内向外遞增。 本發明細胞微陣列晶片同一羽形電極單元之第一指形 電極寬度與該第二指形電極寬度無限制，較佳為同一羽形 =極單元之第一指形電極寬度與該第二指形電極寬度相 •同，更佳為每一羽形電極之相鄰該第一指形電極寬度與該 8 1375023 第一才曰形電極寬度相同。本發明細胞微陣列晶片同-羽形 電極單元之第-指形電極與該第二指形電極之總數= 7:較佳為相鄰之羽形電極單元之第一指形電極與該第二 指形電極總數相同。本發明細胞微陣列晶片之羽形電極單 5兀之第-指形電極之邊緣可選擇性地更設有第一突刺以 增強使用時之電場，增加界電電泳吸著細胞之能力。本發 明細胞微陣列晶片之羽形電極單元之第二指形電極之邊緣 可選擇性地更設有第二突刺，以增強使用時之電場，增加 界電電冰吸著細胞之能力。本發明細胞微陣列晶片之每相 10鄰第-突刺間之距離無限制，較佳為每相鄰第—突刺間之 距離相同。本發明細胞微陣列晶片之每相鄰第二突刺間之 距離無限制，較佳為每相鄰第二突刺間之距離相同。 本發明細胞微陣列晶片之羽形電極單元於基材上排列 形成之陣列無限制’較佳為羽形電極單元形成—個或多個m 15 X η之陣列’ 別地為之整數。本發明細胞微 陣列晶片之第-導線與該第二導線於該基材表面之排列益 限制’較佳為第-導線與該第二導線於該基材表面交錯地 排列，且每一羽形電極單元並於該第一導線與該第二導線 之間’更佳為第-導線與該第二導線相互平行且交錯地排 20列。本發明細胞微陣列晶片之第一導線與該第二導線形狀 無限制，較佳可為折線，直線，或曲線。本發明細胞微陣 列晶片之羽形電極單元之第一導線，或第二導線之材料無 限制’較佳為第-導線，或第二導線之材料為金屬或透明 電極材料。本發明細胞微陣列晶片第一導線，或第二導線 9 1375023 使用之透明電極材料無限制，較佳為透明電極材料為〖το或 ΙΖΟ。 ’ 本發明細胞微陣列晶片之羽形電極單元之第一指形電 極，或該第二指形電極之材料無限制，較佳為第一指形電 5極，或該第二指形電極為金屬電極或透明電極。本發明細 胞微陣列晶片使用之透明電極無限制，較佳為透明電極為 ΙΤΟ電極或ΙΖΟ電極。

00本發明細胞微陣列晶片可更包含一位於每一羽形電極 單元之電極表面或基材表面之生物附著層，附著或吸著生 物物質或細胞0本發明細胞微陣列晶片並可更包含一保護 層該保》蒦層係位於該基材之表面上彳，以保護該基材及 該多個羽形電極單元。再者，本發明細胞微陣列晶片可選 擇性地更包含-濃度梯度產生單元，以及多個流道以於應 用時同時控制流入各羽形電極單元之電極表面生物附著 層之生物物質或細胞濃度。其中，該濃度梯度產生單元， 以及該些流道位於該基材之表面，且該流道係連接該濃度 梯度產生單元及該些羽形電極單元。 【實施方式】 20 實施例1 本實施例中之細胞微陣列晶片100，如圖i與圖4所示， 係包含一基材101與411、一濃度梯度產生單元103、多個流 道1。07、多個第一導線m、多個第二導線112、多個羽形電 極單元113、一生物附著層461、與一保護層1〇2與452。 1375023 此外，如圖1與圖4所示，該細胞微陣列晶片loo之濃度 梯度產生單元103、多個流道107、多個第一導線in、多個 第二導線112、多個羽形電極單元113'生物附著層460、及 保護層102與452，皆位於基材101與311之表面上方。 5 如圖1所示’其中圖1B是為圖1A之電極陣列區1〇9之放 大圖。於本實施例中之流道107，係連接濃度梯度產生單元 103及羽形電極單元113;故當緩衝溶液由注入口 1〇5注 入，從濃度梯度產生單元103經由流道107流至羽形電極單 元113,最後於出口 1〇8流出時，可在羽形電極單元113上分 10 布有不同濃度之緩衝溶液。此外，本實施例中之羽形電單 元113 ’係使用ITO做為電極的材料，以形成透明電極。其 令’多個羽形電極單元113以6 X 6陣列的方式排列於基材 1〇1的表面上，且並列於第一導線11丨與第二導線n2之間。 由於第一導線1U與第二導線U2於基材1〇1表面係為交錯 15 地平行排列，故兩者間並無電性連接。 如圖2所示，在羽形電極單元213中，第一導線211與羽 | 形電極單元213之第一指形電極221電性連接，第二導線212 與羽形電極單元213之第二指形電極222電性連接；因此， 相鄰之羽形電極單元213之最外層之指形電極，交替地為第 20 一指形電極221與第二指形電極222，造成每兩個鄰接之羽 形電極單元之最外層指形電極之電性均不同。在本實施例 中，每一個羽形電極單元213均包含有一個第一指形電極 221，以及一個第二指形電極222 ,且兩種指形電極之寬度 均相同，並以同心圓的方式相互交錯排列於基材之表面。 11 1375023 此外，第一指形電極221與第二指形電極222間之間距，係 從同心圓之圓心由内向外遞增。 在本實施例中，如圖丨所示，第一導線U1係接交流電 •原第一導線112係接地，由於每兩個鄰接之羽形電極單元 之最外層父替為第一指形電極與第二指形電極因此在通 電後，可使相鄰之羽形電極單元113之最外層指形電極間形 成電位差，使得細胞從細胞注入口 1〇6注入至陣列腔室1〇4 後，可以順利地藉由介電泳力同時附著於兩鄰接之羽形電 極上。 1〇 如圖3所不，本實施例t之羽形電極300，其中羽形電 極之第一指形電極301設有第一突刺311，而第二指形電極 302則設有第二突刺312 ;這些突刺的設置，係使羽形電極 之邊緣有區域性的電場極大值，使得細胞可以均勻附著於 電極上。 15 此外，如圖4所示’本實施例中之細胞微陣列晶片之生 物附著層461，係位於每一羽形電極單元431之電極表面，. 以附著細胞且讓細胞不受電極之損傷。並且本實施例中之 生物附著層461之材料，係為膠原，其原因為生物體之胞外 基質多數為膠原所組成。本實施例同時也包含一保護層 20 4 5 2，以保護基材411及多個羽形電極單元431。 接下來’將詳細敘述本實施例之細胞微陣列晶片之製 作。首先’如圖4A所示，先在玻璃基材411上塗佈一層用以 形成電極之ITO薄膜413。接著，在薄膜413上覆蓋光阻412, 藉由氬離子電漿姓刻法，在薄膜上形成羽形電極421(圖 12 1375023 4B)。羽形電極421形成後，用丙酮將光阻412移除（圖4〇。 為了要在羽形電極421上形成膠原層，故在基材411上重新 覆蓋另一光阻441(圖4D)。然後再使用氧離子電漿，將pDMS 製成之保護層452與濃度梯度產生單元設置於基材々I〗上， 5 且在保護層45 2上打孔’形成細胞注入口（圖4e)。在使用去 離子水沖洗之後，將細胞微陣列晶片與膠原461(1〇μιη/πιΙ〇 於37 C下進行結合（圖4F)。在結合1小時後，利用超音波震 盡移除光阻（10分鐘）；且移除的過程係在乙醇中進行，因 為與在丙_中來移除光阻相比，使用乙醇可減少膠原與晶 10 片分離的可能性（圖4G)。最後，將附著有膠原之晶片用去 離子水清洗後’再使用氮氣乾燥之。 接著’將詳細敘述如何利用介電電泳將細胞圖案化 (DEP cell patterning)。首先，先極細心地配置介電電泳緩 衝溶液（10 mM HEPES、55 mM D-葡萄糖、221 mM蔗糖、1 15 %盤尼西林/鏈霉素、0.5 mMEGTA(乙二醇四乙酸，ethylene glycol tetraacetic acid); pH 7.0、300 Osm、231 ps/cm)，以 確保將來可維持長時間的細胞生物活性。將細胞完全的懸 浮於緩衝溶液中，接著注入於含有細胞微陣列晶片之腔室 中°接著，將電極接上交流電源（5 Vpp、5 MHz)，以將細 20 胞圖案化。當細胞懸浮溶液之流速穩定之後，通入含有鈣 離子之緩衝淳液（1·8 niM CaCl2、274 ps/cm),以去除沒有附 著於電極上之細胞，且可以幫助細胞附著於電極上之膠 原。待含有鈣離子之緩衝溶液流速穩定之後，切斷交流電 源、。然後’當細胞完全附著於膠原上後，使用含有1〇 %之 13 1375023 胎牛血清與1 %盤尼西林/鏈霉素之DMfi培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM)，取代原本之|弓離子緩 衝溶液。最後，將已細胞圖案化之晶片，置於37°C培養之。 利用本實施例所述之細胞微陣列晶片構造，將肝癌細 5 胞株HepG2注入此細胞微陣列晶片。依照細胞的介電電泳 特性，在施加5 Vpp、5 MHz之電壓，且注入5百萬細胞/ml 之HepG2後，結果顯示本實施例之細胞微陣列晶片之羽狀 電極上，佈有均勻之HepG2，如圖6 A所示。因此，利用本 實施例之細胞微陣列晶片，可得到具有高一致性之細胞圖 10 案。此外，將細胞圖案化後繼續培養24小時，進一步使用 螢光染劑（calceinAM，用於活體細胞之螢光染劑）染色；結 果顯示，如圖6B所示，大多數之HepG2對於螢光染劑顯示 陽性反應，此即表示本實施例.之細胞微陣列晶片所圖案化 之細胞，於24小時之後，仍可保有良好的細胞生物活性。 15 本實施例的結果，顯示此細胞微陣列晶片具有以下之 優點。其一、此細胞微陣列晶片具有上游特殊流道的設計， 具有製造濃度梯度之功能，可在同一時間内進行不同濃度 試劑對細胞影響之測試，故能滿足高產量的需求。其二、 在產生介電泳力之介電電泳援衝溶液中，因加入盤尼西林/ 2〇 鏈霉素以及EGTA(10 mM HEPES、55 mM D-葡萄糖、221 mM蔗糖、1 %盤尼西林/鏈霉素、0.5 mM EGTA; pH 7.0、 300 Osm、231 ps/cm)，可確保細胞長時間存活率，並避免 細胞黏成一團，而獲得良好的細胞微陣列。其三、使用介 電電泳細胞圖案化（DEP)，可以在短時間内（40分鐘），得 14 1375023 到具有高-致性之細胞圖案；相較於其他的微陣列製作技 術，則需要數小時才可得到一致性之細胞圖案。其四由 於藥物的測試必須經過24小時’而在此細胞微陣列晶片上 圖案之細胞’經過24小時之後，依然維持有良好的生物活 5性；這即代表此細胞微陣列晶片，具有高度之生物相容 性。其五、因為此晶片沒有複雜之結構，因而可確保長時 間使用之穩定性。 實施例2 0 如實施例1所述之細胞微陣列晶片構造與製作方式，除 了羽形電極單元周緣為多邊形，且部分第一指形電極為線 形或折線形電極；如圖5a所示’本實施例之羽形電極單元 為梳狀電極。 15 實施例3 如實施例1所述之細胞微陣列晶片構造與製作方式，除 了羽形電極單元周緣為多邊形，且部分第一指形電杻為線 形或折線形電極；如圖5b所示，本實施例之羽形電極單元 為六角形電極。 20 實施例4 如實施例1所述之細胞微陣列晶片構造與製作方式，除 了羽形電極單元周緣為多邊形，且部分第一指形電極為線 形或折線形電極；如圖5c所示，本實施例之羽形電極單元 25 可為三角形電極。 15 實施例5 '如實施例1所述之細胞微陣列晶片構造與製作方式，除

了每一羽形電極之相鄰第一指形電極與第二指形間之間距 皆相等。 S 實施例6 如實施例1所述之細胞微陣列晶片構造與製作方式除 了第一導線與第二導線為折線形或圓弧形。 實施例7 如實施例1所述之細胞微陣列晶片構造與製作方式，除 了第一指形電極與第二指形電極為金屬電極，如銘電極或 上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所 主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限 於上述實施例。 【圖式簡單說明】 圖1係本發明-較佳實施例之細胞轉列晶片之俯視圖。 圖2係本發明-較佳實施例之羽形電極部分陣列之放大圖。 1375023 圖3係本發明一較佳實施例之羽形電極單元之放大圖。 圖4係本發明一較佳實施例之細胞微陣列晶片製作之流程 圖。 圖5係本發明一實施例之羽形電極之示意圖。 5圖6係本發明一較佳實施例之實驗結果之照片。 【主要元件符號說明】 100細胞微陣列晶片 102, 452保護層 104陣列腔室 106細胞注入口 108 出口 111，211第一導線 113, 213, 300羽形電極單元 222, 302第二指形電極 3 12第二突刺 413薄膜 461膠原 101，411 基材 103濃度梯度產生單元 105緩衝溶液注入口 107流道 109電極陣列區 112,212第二導線 221，301第一指形電極 3 11第一突刺 412, 441 光阻 421羽形電極 17

Claims (1)

1. 、申請專利範圍 叫（月I;日修(更)正本 ^96137479 ^ 年5月修正頁 公告本 κ 一種細胞微陣列晶片，包括： 一基材； 多個第一導線’係位於該基材之表面； 夕個第二導線，係位於該基材之表面，且該第二導線 不與該第—導線電性連接；以及 —夕個羽形電極單元，係於該基材表面形成陣列排列， 且母一羽形電極單元包含有多個第一指形電極，以及多個 10 第扣形電極，其中該第一指形電極係位於該基材之表 面該第二指形電極係位於該基材之表面，於每一羽形電 f早凡内之該些第-指形電極與該些第二指形電極係相互 交叉且交錯排列於該基材之表面，於相鄰之羽形電極單元 第私形電極及第二指形電極係分別部分包圍第二指形 15 電極及第-指形電極，而每一羽形電極之相鄰該第一指形 電和/、該第一才曰形電極間之間距由内向外遞增，每一羽形 電極單元之第一指形電極之邊緣並設有第一突刺，且每一 羽形電極之第二指形電極之邊緣並設有第二突刺； 其中該第-導線與每一羽形電極單元之該第一指形電 20 極電性連接’該第二導線與每—羽形電極單元之該第二指 形電極電性連接，且每二個鄰接之羽形電極單元之最外層 指形電極之電性不同。 曰 2.如申凊專利範圍第1項所述之細胞微陣列晶片其 中相鄰之羽形電極單元之最外層指形電極交替地為第一指 形電極或第二指形電極。 18 3. 如申請專利範圍第i項所述之細胞微陣列晶片，其 中每一羽形電極單元周緣為多邊形，且部分該第一指形電 極為線形或折線形電極。 4. 如申請專利範圍第1項所述之細胞微陣列晶片，其 中每一羽形電極單元周緣為圓形或橢圓形，且部分該第一 指形電極為弧形電極。 5. 如申請專利範圍4第項所述之細胞微陣列晶片，其 中該第一指形電極與該第二指形電極形成同心圓形排列。 6. 如申請專利範圍第1項所述之細胞微陣列晶片，其 中每一羽形電極之相鄰該第一指形電極寬度與該第二指形 電極寬度相同。 7. 如申請專利範圍第1項所述之細胞微陣列晶片，其 中該第一導線與該第二導線於該基材表面交錯地排列且 每一羽形電極單元並於該第一導線與該第二導線之間。 8. 如申請專利範圍第1項所述之細胞微陣列晶片，其 中該第一導線與該第二導線相互平行。 9. 如申請專利範圍第1項所述之細胞微陣列晶片，其 中該羽形電極單元形成—mx n之陣列，且m、n個別地為大 於1之整數。 10. 如申請專利範圍第1項所述之細胞微陣列晶片，其 中每相鄰第一突刺間之距離相同。 11 ·如申請專利範圍第1項所述之細胞微陳列晶片，其 中每相鄰第二突刺間之距離相同。 1375023 12. 如申請專利範圍第丨項所述之細胞微陣列晶片其 中該第-指形電極’或該第二指形電極為金屬電極或透明 電極。 13. 如申請專利範圍第12項所述之細胞微陣列晶片，其 5 中該透明電極為ITO電極或IZO電極。 14. 如申清專利範圍第1項所述之細胞微陣列晶片，其 更L•含生物附著層，且該生物附著層係位於每一羽形電 ^ 極單元之電極表面或基材表面。 15. 如申請專利範圍第1項所述之細胞微陣列晶片，其 10 更包含一保護層，該保護層係位於該基材之表面上方，以 保έ蔓該基材及該多個羽形電極單元。 16. 如申請專利範圍第1項所述之細胞微陣列晶片，其 更包含一濃度梯度產生單元’以及多個流道，其中該濃度 梯度產生單元’以及該些流道位於該基材之表面，且該流 15 道係連接該遭度梯度產生單元及該些羽形電極單元。 20