TWI360655B - Apparatus and methods for detecting nucleic acid i - Google Patents

Description

1360655 九、發明說明： I：發明所屬之技術領域3 發明領域 本發明係有關用於偵測生物性樣品中之核酸的裝置及 5 方法。特定地，本發明係有關一利用電場協助核酸雜交作 用以偵測DNA序列的新穎裝置與方法，及此裝置之執行的 最佳化方法，此外本發明擴及電場協助雜交作用於任何包 含帶電實體的生物性方法之用途。 【先前技術3 10 發明背景 高密度聚核苷酸(如DNA或RNA)陣列技術的出現已改 變了基因體及蛋白質體分析的基本概念。從「點潰試驗」 到「玻璃透明薄片上的陣列」，再到DNA微陣列（又名DNA 晶片）的轉變已革命性改變了產業，使大規模臨床診斷測試 15 及篩選程序實現到實際應用上。眾所週知，一種典型的微 陣列，含有一預定配置的反應位置在一基質上，當與一帶 有與附著在反應位置上捕獲片段互補的鹼基序列的目標核 酸片段之樣品接觸時，就會顯示出一種結合樣態。當適當 的偵測機制被使用時，此結合樣態及結合效率可利用光學 20 或電的方法偵測出來，該偵測機制可能包含如螢光標示、 電流偵測、泰阻抗測量。 電輔助核酸雜交的使用是一已知的技術，用來分析含 DNA的生物樣品，如血液、血漿、尿液等。依慣例，一用 於DNA偵測的晶片是由包含玻璃、矽及金屬等種種材質中 5 的種製成的。在晶片的表面，-些電性接點利用已知的 技術被形成。為了㈣-生物性樣品中的特定DNA序列， 由互補的DNA片段組成之捕獲探針係利用一附著層附著在 晶片表面’此㈣層依慣例為瓊脂膠。若生物樣品包含該 目標DNA，此目標DNA將會透過雜交與互補DNA片段結 合，而許多種顯像技術可被用來偵測此雜交，如此則可得 知樣品中目標DNA的存在。 先前技術 核酸片段是帶電的，因此透過電極的使用可被靜電吸 力吸往特定位置，如此藉由適當電流的應用，雜交過程可 以被加速’而憤測過程也可以被加速。然而，是不可能讓 電極與核酸>1段直接接觸的，因為會有樣品被電化學降解 或電解的危險。S此依辭卜料/附著層通常會被塗附在 電極上，如美國專利第5605662號以及第63〇6348號。此滲 透/附著層通常是W孔性材質製作而成，如溶膠_凝膠材 質、多孔性水凝膠材質、多孔性氧化物，而供小分子的選 擇性擴散之用，也可當一捕獲探針的附著表面。核酸片段 與電極的直接接觸會被減少，由於滲透性材質的孔洞大小 通常太小而不能讓大核酸片段通過。 當一電壓加諸於滲透/附著層之下的電極時，先前技術 的裝置就會在無樣品電化學降解的情況下提供電泳運輸效 果，因此加強雜交。然而，此能讓電誘導雜交的先前技術 並不是沒有缺點。例如，多孔性材質如水凝膠和聚合物在 與水溶液、數種化學藥品和一些週遭的因子接觸時會有惡 化之虞。溶膠-凝膠材質的配製昂貴而複雜，增加了製造的 成本此外，多孔性物質容易自然損壞且易附著與捕捉到 不想要的外來物質如空氣中的潮濕錢化合物，導致裝置 的使用壽命縮短。 【發^明内容^】 發明概要 根據本發明提供用則貞測樣品十目標核酸的裝置，包 含由至j/一個反應單元形成的基質，其中該反應單元包 含-由介電質材質形成的附著表面，以供紐捕獲探針附 著，且其中提供一與該介電質材質直接接觸的金屬電極。 該樣品可能包含生物性物質且該樣品可能為廢水、溶液戈 反應劑。該樣品也可能是生物性樣品如血液、血渡與尿液 較佳的是該電極是供設在附著表面之下，也就是 與介電質材質的附著表面反側接觸。然而可想見地，其可 甚或與附著表面本身接 被施加與介電質材質的一側接觸 觸。 本發明的較佳實施例中介電質材質最好是—氧化物 如其可能選自於由Al2〇3、Si〇2及Ta2〇5組成的族群。金屬電 極則可能由，例如，銘組成。 本發明的較佳實施例中，該裝置可能包含多層構造， 其包含：第一基底層，形成在該基底層上的第二絕緣層， 形成在該絕緣層上且包含劃定至少一金屬電極的定型傳導 區域之第三層，及第四層包含至少一介電質材質的區域， 其中每一在該第三層的該金屬電極會被該第四層的介電質 1360655 材質區域覆蓋。較好的是該第三層的定型傳導區域會被由 介電質材質形成的區域隔開。更好的是在該第四層的介電 質區域會被惰性材質區域隔開，而此惰性材質區域可能延 伸至該介電質材質區域的邊緣，以界定該反應單元。 5 從另一廣泛的觀點來看本發明，其提供了一進行電場 輔助雜交的方法以偵測生物性樣品中的目標核酸，包含以 下步蹕：提供一具有由介電質材質形成的附著表面之反應 單位，提供一在該介電質材質之下且與該介電質材質直接 接觸的金屬電極，將核酸捕獲探針附著在該附著表面，將 10 —樣品加入該反應單元，及提供一電性電位給該電極《此 樣品可包含生物性物質且此樣品可能為廢水、溶液或反應 劑。此樣品也可能是生物樣品如血液、血漿或尿液。 此電性電位可能以一連續電位提供，或可能是一平穩 地變動，或脈衝電位。 15 由另一廣泛的方面來看本發明，其亦提供了一當操作 生物性反應時可吸引或排斥帶電實體往或來自一反應單位 表面的方法，包含以下步驟：提供一介電質材質作為該表 面，及藉由在該介電質材質上引發電荷分離而產生一電 場。此帶電實體可為核酸分子。 20 由又另一方面來看本發明，其亦延伸至一種形成用以 進行生物性分析的反應單元之一陣列的方法，包含以下步 驟：將金屬電極佈型於絕緣物質上，將介電質物質區域沉 積於該金屬電極上，及在該介電質材質上表面的邊緣週遭 形成一框邊以界定該反應單元。 8 較佳地，例如，本方法可包含沉積—層金屬於一絕緣 體表面上，以-光阻物質依想要的型樣覆蓋在該金屬層 上’以及祕刻方法移除該金屬層多餘的部分，沉積一層 該介電質材質於減_麵，藉此該介電質材質覆蓋^ 定型的金屬而佔據該定型電極之_區域，沉積一惰性層 於該介電質材質層上，以-光阻物f佈型該惰性層且移 除該惰性物質叫_介電質材質覆蓋該金屬電極的地方 以界定該反應單元。 圖式簡單說明 本發明的-些具體實施例現在將會以實例 的圖示來說明，其中： 4 第1圖是依據本發明具體例的一切面的觀視； 曰第2圖係1第1圖相似的觀視，但顯示的是使用中的 晶片； 第3圖疋〜概要的描緣，顯示本發明的較佳具體例的潛 在原理； ' 第4圖欽迷了—可能製造過程的步驟； 第5圖(a)和(b)顯示了第一次測試的結果； 第6圖(a)和⑼顯示了第二次測試的結果和 第7圖（）至(c)顯示了第三次測試的結果。 【實施冷式】 較佳實施例之詳細說明 第 ^示了—部分本發明之具體實施例的切面，其 含了二個可’含樣品緩衝液的單元，但可了解的是任何 數量的單元都可以被提供，而他們通常會被組成矩形的陣 列。 根據此發明的具體實施例，此裝置之製造係藉由使用 傳統沉積技術依序沉積至一矽基質上。第一，（第4圖（3))一 5由Si〇2構成之絕緣層，厚度介於200奈米至5〇〇奈米間，可 藉任何適當技術’包括：熱氧化作用或任何適當的沉積技 術’形成至該Si基壯，如雜、電子束蒸鍍以及相似者。 在此絕緣層之上被架構了（第4圖（b))—層鋁，厚度介於5〇〇 奈米與1000奈米之間，也是使用任何傳統沉積技術構成的。 一紹層被形成，就會被用（第4圖（c)) 一層光阻物質佈 型，而未被遮罩的區域就會被用蝕刻（第4圖⑷)移除，而光 阻物質也會被移除（第4圖⑷）。然後此晶片會被塗上（第4圖 ⑼Al2〇3至厚度介㈣.奈米間，此Al2〇3區域被架構在 $成於—氧切基質上的減域間。_惰性層（例如）秘4 Μ隨後被以電漿加強的化學蒸氣沉積或相似技術沉積(第4圖 (g))在八丨2〇3上。此惰性層隨後被以光阻物質（第4圖（h))覆 蓋，而此惰性層接著被姓刻（第4圖⑼以打開該八说區域以 成為该反應單元的附著表面。最後該光阻物質會被移除 4圖⑴）。 2〇 此製作過程的結果為第1圖的多層構造。銘區域被形成 在二氧切的絕緣層上’而這_區域是被αιλ分隔開 的。形成在紹和Al2〇3層之上的是一層包含位於純域之上 的Α1203區域，且藉由惰性材質_4分離，該啊覆蓋於 ai2o3區域上，該Al2〇3分離該純域與後來者。此惰性材質 10 1360655 亦延伸覆蓋至上層Al2〇3的邊緣，俾界定一表面給欲放置的 生物樣品供分析。 如此可被了解顯示在以圖的例子中，該晶片是由三個 單W-3形成，每-單元是由具有一下層铭塾的Ai2〇3形成。 5雖然未顯示在第1圖，當紹區藉钱刻方式形成時，電的連結 也可被形成以允許-電性電位被施加至該紹區域。 -旦第1®的晶片被製成，其可被用作為數個不同的生 物測試及分析的基礎。特別是第1圖中每個單元卜3可能被 H的捕獲探針，如第2圖所示^取決於施行的測試， 10每卩το可月Μ皮供給相同的捕獲探針或不同的捕獲探針， 該捕獲探針含有與該測試或分析所欲尋找的樣品中的片段 互補的核酸片段。在第2圖的例子中，單元1-3都是-樣的二 ，且-含緩衝溶液的樣品液滴被加入單元中以覆蓋所有的： 個單元。 ~~ 15 將可被理解的是藉由熟練的技術，若該樣品中含有與 捕獲探針互補的核酸片段，他們將會藉由雜交結合在捕择 探針上，而可被已知的技術偵測。既然該核酸片段是帶電 的’此雜交便可藉由提供一電場以吸引所欲之核酸片段往 附著表面與該捕獲探針去而加強。該機制可藉此完成， 20 第3圖所示。 如 特別疋，如第3圖所示，若一電位是施加在一單元下 鋁電極，則因八丨2〇3為一介電質材質，電荷分離將會在〇 内發生，其極性會取決於施加在氧化鋁下之鋁電極電壓 極性。如第3圖左邊所示，若一正電位施加在該紹電槐，的 11 丄則0：)5 氧化銘上方的表面將也會有一正電位會吸引帶負電的片 且排斥帶正電的片段。相反地，若一負電位施加在鋁 則該氧化鋁上方的表面也會有一負電位會吸引帶正 電的片辟 又’且排斥帶負電的片段，如第3圖右手邊所示。如 此選擇，托 叹地施加一電位在氧化鋁附著表面正下方且與其直

觸的趣電極，可使核酸片段選擇性的吸引/排斥，如此 使電誘I 赞雜交實現。可被了解的是該電位可以許多不同方 式施力σ ^ 該電位可為如一固定持續的電位，也可能是平穩 地改變， 心 10 或可能是一有規律的脈衝或依任何所要的模式。 先，本蝥明的一個特別優點是，至少在其較佳的型態，與 m 特相比，因為無電子在樣品溶液及該介電質層之間 得遞，戶斤、 15 杉r萨片以不想要的電化學反應及/或電解可完全被避免。 著表=^可因此在無電化學降解的情況下被電性拉往該附 、面。本發明的電場輔助雜交方法及裝置的另一個重要 將^、至少在較佳的型態，是該樣品的鹽濃度與酸鹼值 ^會破改變。這些參數是影響雜交效率與雜交核酸片段 二度的決定性因子。先前技術中的電場輔助雜交技術由 : 予反應會導致鹽濃度與酸驗值嚴重的改變，且為了 20 ，償這些作用，其他技術，如特別的緩衝溶液，是所需的。 發明的另-個優點是沒有電化學反應會發生，而接下來 表不參與找制過㈣毅/_料會奸I在 測過程帽不會__纽/或㈣㈣，這在改 訊號的品質上是很重要的。 °貞^ 應該也可被了解的是當本發明的較佳實施例在促進雜 12 1360655 交以偵測核酸片段的内文中被敘述時，本發明更一般地應 用在涉及帶電實體的任何生物性方法中，且其中它所被希 望的是能夠控制這些帶電實體的移動，藉由吸引或排斥這 些實體往或來自一表面。 5 第5到7圖顯示一些使用了第1到3圖之構造，有或沒有 一電位施加在單元下之鋁電極的實驗結果。當然可以被了 解的是在所有的這些例子中’反應時間，施加的電壓及其 他參數是純示範性質而可以依需要被改變。 第5圖（a)及(b)顯不了 一控制組，兩個例子皆無一電位 10施加在鋁電極上，因此雜交過程中沒有電的輔助。在這個 例子中樣品中的目標寡聚物是合成的万—肌動蛋白（91驗 基，純的）而雜交時間是90分鐘。此目標寡聚物有存在第5 圖（a)的樣品中而沒有存在第5圖（b)的樣品中。在第5圖（a) 或5(b)中都沒有一電位施加在鋁電極上，但第5圖（a)的單元 15明顯地較5(b)黑’歸因於在第5圖（a)的樣品中有目標寡聚物 的存在。 在第6圖⑷及(b)中的情況與第5圖⑻及(b)中相同，同樣 的目標寡聚物被提供在第6圖（a)的樣品中而沒有目標寡聚 物被提供在第6圖（b)的樣品中。然而在這個例子中，+10V 2〇 的電壓被施加在鋁電極上且雜交時間被縮短至10分鐘。第5 圖（a)和第6圖（a)的比較顯示，明顯地敘述了即使該雜交時 間實質上被減少了，在第6圖（a)中該單元是更黑的，證明了 施加電壓在促進雜交的有效。第5圖（b)及沒有目標募聚物存 在的第6圖（b)間相同的結果顯示了該電壓的施加沒有導致 13 任何偽陽性結果。 =7圖(a)_(c)相述了第三個例子，其樣品中的目標寡聚 物為家禽冰仃性礅冒病毒(AIV)H5亞型（250驗基混合其他 非專一性寡聚物）。在全部三個例子⑷切中雜交時間.為10 5 分鐘。第7圖γ^ (e)間的不同處如下.在第7圖（a)中目標募 聚物存在樣。。中且+雨的電位被施加在單元之下的紹電 極.，,第7圖(b)中沒有目標寡聚物存在樣品中且+ l〇V的電 位被^在單元<下_電極；而在第7圖（e)中目標寡聚物 存在樣°°中但無電位被施加在單元之下的紹電極。這些例 10 == 次顯不了在僅有10分鐘的雜交時間下，施加在電極的 + 10V電丨，導致雜交的促進及強訊號(非常黑暗的區域在第7 圖⑷的早兀）°比較第7圖⑻(沒有目標物而有電位施加）與 第7圖（C)(有目標物但無電位施加）間外觀的相同顯示在沒 有電场辅助雜交下是不可能以同樣的時間（10分鐘)得到有 15 效的雜交。 本發明至少在其應用形式提供了 一簡單低成本的裝置 可讓核酸電場輔助雜交及/或其它生物程序以-更快的速 度進行而有高效果，可被實施在許多可能的應用。本發明 利用電荷分離的原理在與被施加電位的電極接觸的介電質 20材質中。在上述此具體實施例中，電極是鋁，且介電質材 質是氧化紹’但金屬電極與介電質附著表面的其他組合也 是可能的。例如’ Si〇2、Ta2〇5可被作為氧化物為基礎的介 電質材質供用為附著表面。 與使用一滲透層的先前技術裝置做比較，以氧化物為 14 1360655 基礎的介電質層直接與電極接觸，提供一對於通常應用在 生物反應中大多數的酸、鹼及其他試劑而言是強韌的、緊 密的、化學非活性的結構。此結構對於週遭因子如溫度和 渔度也是穩定的，且對物理傷害是較不易受傷的。製造成 5本較低而此裝置用標準沉積技術及其他微電子裝配技術可 被#常簡單的製造。的確使用此微電子沉積和裝配技術而 製造本發明的裝置，也具有一優點係可被容易的併入一以 相同或相似技術製造的裝置中。 I：闺式簡單說明3 ίο 第1圖是依據本發明具體例的一切面的觀視； 第2圖係一與第1圖相似的觀視，但顯示的是使用中的 晶片； 第3圖是一概要的描繪，顯示本發明的較佳具體例的潛 在原理； 15 第4圖敘述了一可能製造過程的步驟； 第5圖（a)和（b)顯示了第—次測試的結果； 第6圖⑷和(b)顯示了第二次測試的結果，和 第7圖（a)至(c)顯示了第三次測試的結果。 【主要元件符銳說明】 (無） 15

Claims (1)

1. 第093131325號專利申請案申請專利範圍修正本 修正日期：100年11月15曰 、申請專利範圍： 一種用以偵測樣品中之目標核酸的裝置，其包含一形成 有至少一反應單元的基質，其中該反應單元包括一由一 介電質材質形成的介電質附著層以界定出一供核酸捕 獲探針附著的附著表面，且其中一金屬電極被供設為直 接與該介電質附著層接觸，其中該介電質附著層係有50 奈米以上的厚度，使得施加一電位於該金屬電極會在該 介電質附著層中導致電荷分離，而不在該反應單元中之 該層與樣品之間產生電流流動或導致電子傳遞。 如申請專利範圍第1項之裝置，其中該電極係與該介電 質材質相反於該附著表面的一側接觸。 如申請專利範圍第1項之裝置，其中該介電質材質為氧 化物。 如申請專利範圍第3項之裝置，其中該介電質材質係選 自於由Al2〇3、Si02及Ta205所組成的族群。 如申請專利範圍第1項之裝置，其中該電極是由鋁形成。 如申請專利範圍第1項之裝置，其中該介電質材質包含 ai2o3且該電極是由鋁形成。 如申請專利範圍第1項之裝置，其包含一多層構造，該 構造包含：一第一基底層、形成在該基底層上的一第二 絕緣層、形成在該絕緣層上且包含界定至少一金屬電極 的定型（patterned)傳導區域之一第三層以及一包含至少 一介電質材質區域之第四層，其中在該第三層的每一該 金屬電極會被該第四層的介電質材質區域覆蓋。 16 1360655 ♦ . 第093131325號專利申請案申請專利範圍修正本 修正日期：100年11月15日 8·如申請專利範圍第7項之裝置，其中該第三層之定型傳 導區域是被介電質材質形成的區域分隔的。 9·如申請專利範圍第7項之裝置，其中該第四層的介電質 材貝區域是被惰性材質（passivation material)區域分隔 5 的。 1〇.如申請專利範圍第9項之裝置，其中該惰性材質區域延 伸至該介電質材質區域的邊緣上以界定出該反應單元。 U.如申請專利範圍第1項之裝置，其中該樣品包含生物性 物質。 12·—種用以偵測一樣品中的目標生物性材料的裝置，包含 —形成有至少一反應單元的基質，其中該反應單元包含 由"電質材質形成的表面，其中一金屬電極被供設 為直接與該介電質材質接觸，且其中該介電質材質係有 50奈米以上的厚度，使得施加一電位於該金屬電極會在 15 該介電質材質中導致電荷分離，而不在該電極與接觸該 ;1電質材質的樣品之間產生電流流動或導致電子傳遞。 13>種形成用以進行生物性分析的反應單元陣列之方 法，包含以下步驟：將數個金屬電極佈型於絕緣物質 上，將數個介電質材質區域沉積於該等金屬電極上，及 2〇 在該等介電質材質區域上表面的邊緣週遭形成一框邊 乂界疋出該等反應單元，其中該介電質材質係有5〇奈米 以上的厚度，使得施加一電位於該等金屬電極會在該介 電質材質中導致電荷分離，而不在該等反應單元中之該 專電極與樣品之間產生電流流動或導致電子傳遞。 17 1360655 第093131325號專利申請案申請專利範圍修正本 I 修正日期：100年11月15日 .如吻專利範圍第13項之方法，包含沉積__層金屬於一 絕緣表面上’以—光阻物質依所欲的型樣覆蓋在該金屬 層上，以及用姓刻方法移除該金屬層其餘部分，沉積一 f該介電質材質於該定型的金屬，藉此該介電f材質覆 蓋該疋型的金屬而且伯據該等定型電極之間的區域，沉 積N性層於該介電質材質層上，以一光阻物質佈型該 惰性層’且雜該惰性層以職覆蓋料金屬電極處的 ;1電質材質以界定出該等反應單元。 種進行電場輔助雜交以偵測一樣品中的核酸目標物 之方法，包含以下步驟：提供一具有由介電質材質形成 之層以界定出一附著表面之反應單元，提供一與該介電 質附著層直接接觸的金屬電極，將核酸捕獲探針附著在 该介電質附著層，將該樣品加入該反應單元，以及提供 電性電位給該金屬電極以在該介電質附著層中導致 電荷分離，但不在該層與該樣品之間產生電流流動或導 致電子傳遞。 16·如申凊專利範圍第15項之方法’其中該電極係被供設為 與該層相反於該附著表面之一表面接觸。 17. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該電性電位為一持 續供應的電位。 18. 如申請專利範圍第項之方法，其中該電位係以一系列 的脈衝被施加。 β·如申請專利範圍第15項之方法，其中該樣品包含生物性 物質。 18 1360655 . 第093131325號專利申請案申請專利範圍修正本 修正日期：100年11月15日 20. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該電極係與該介電 質層相反於該附著表面的一側接觸。 21. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該介電質材質為氧 化物。 5 22.如申請專利範圍第21項之方法，其中該介電質材質係選 自於由Al2〇3、Si02及Ta205所組成的族群。 23. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該電極是由鋁形 成。 24. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該介電質材質包含 ίο ai2o3且該電極是由鋁形成。 25. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該層對樣品中之分 子而言係不可滲透的。 26. —種當操作生物性反應時可吸引或排斥帶電實體前往 或離開一反應單元表面的方法，包含以下步驟：提供一 15 由介電質材質所形成之層以界定出該表面，及藉由在該 介電質層中引發電荷分離而產生一電場，但不在該介電 質層與樣品之間產生電流流動或導致電子傳遞。 27. 如申請專利範圍第26項之方法，其中在該介電質層中之 電荷分離是藉由置放一電極直接與該介電質層接觸且 20 施加一電位於該電極而引發。 28. 如申請專利範圍第27項之方法，其中一連續電位被施加 至該電極。 29. 如申請專利範圍第27項之方法，其中一脈衝電位被施加 至該電極。 19 1360655 第093131325號專利申請案申請專利範圍修正本 修正日期：100年11月15曰 30. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該電極被置於與該 介電質層的一表面相接觸，該表面係相反於該帶電實體 會被吸引前往或被排斥離開的表面。 5 31. 如申請專利範圍第26項之方法，其中該層對含有帶電實 體之樣品中的成份而言係不可滲透的。 10 32. —種用以促進於一反應單元中所進行生物性分子的偵 測過程之方法，包含以下步驟：提供一由介電質材質所 形成之層以界定出該反應單元的附著表面，及藉由誘發 該介電質材質中之電荷分離而產生一電場，但不在該介 電質層與該生物性分子或該生物性分子所在的媒質之 間產生電流流動或導致電子傳遞。 33. 如申請專利範圍第32項之方法，其中該分子為核酸分 子。 34. 如申請專利範圍第32項之方法，其中該層對含有生物性 分子之樣品中的成份而言係不可滲透的非孔狀形式。 20