TWI357333B - Method for obtaining natural astaxanthin from eggs - Google Patents

Description

1357333 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於自螺卵及/或生殖腺體萃取及純化天然蝦 紅素。 【先前技術】 大里研究已證明蝦紅素清除自由基之能力為P胡蘿蔔素 的彳。且為維生素E的1 0 〇倍。亦發現蝦紅素可透過血腦障 壁（blood brain barrier，BBB)且對腦中樞神經系統直接提 供抗氧化作用。 目則，蝦紅素主要為化學合成且用作動物飼料、營養補 充劑及食用顏料。因為合成蝦紅素含有特定對映異構體且 其對人類健康之影響尚未完全瞭解，所以合成蝦紅素是否 適用作健康食品中之添加劑尚存疑慮。因此，使用來自生 物來源之蝦紅素將會成未來的趨勢。另外，為鼓勵利用來 自天然來源之添加劑，許多歐洲國家及美國正立法以限制 使用化學合成化合物作為飼料添加劑。 已知蝦紅素之天然來源為蝦、蟹、魚、鳥類羽毛、酵母 菌、海藻等。美國專利第3,9G6，112號揭示自蝦加工廢料萃 取蝦紅素之方法，其包含在8(rc_9(rc之溫度下以大豆油 萃取之步驟。美國專利第4,5G5,936號揭示萃取蝦紅素之方 法，其使用自幾丁質殼移除蛋白質組織且接著以植物油自 幾丁質殼萃取瑕紅素的步驟。美國專利第5,21()，186號揭示 藉由在沸騰期間利用驗性溶劑自蝦及其他甲殼類動物回收 蝦、.工素之方法CN 1824652係關於利用超臨界流體c〇2自 132816.doc 1357333 植物萃取蝦紅素之方法。美國專利第5,599,711號、第 5,356,8㈣及第5,972,642號係關於自紅法切母⑽咖 萃取蝦紅素之方法。因為紅法夫酵母產生之蝦 紅素存在於細胞質中，所以為自細胞獲得蝦紅素，其必須 藉由可破壞細胞壁或允許蝦紅素穿過細胞壁之方法來處 :王里。在此等美國專利巾’酵母細胞必須先乾燥，而此乾燥 -過程將增加萃取之複雜性，並在加工程序中因蝦紅素的損 鲁 失造成蝦紅素產量降低，且增加能量的消耗。美國專利第 4,87 1，55 1號揭示利用合適有機溶劑，例如油、芳族化合 物、鹵化烴及烷烴自雨生紅球藻 獲得蝦紅素之方法^ WO 2007/029627揭示利用超臨界流體 C〇2自雨生紅球藻萃取蝦紅素之方法。美國公開案第 2007/0 196894號揭示自雨生紅球藻分離自由態蝦紅素 astaxanthin)之方法，該方法包含以烷烴類溶劑萃取且接著 以醇萃取之步驟。 φ 亦稱為蘋果螺（aPPle snail)之福壽螺（户⑽ ca«Wcw/aia)(Lamarck)(腹足綱（Gastropoda)，蘋果螺科 (Ampullariidae))因其強生殖能力及其強拓展地理範圍之能 '力’而已變成全世界農業之嚴重災害。蘋果螺之卵為球形 且為粉紅色至紅色。已發現其卵及生殖腺體含有大量蝦紅 素。本發明發現自蘋果螺卵及生殖腺體萃取及純化天然蝦 紅素之有效方法。 【發明内容】 本發明提供自螺卵及生殖腺體獲得天然蝦紅素之方法。 132816.doc 1357333 【實施方式】 除非在本文中另作定義，否則與本發明關聯使用之科學 及技術術語應具有—般技術者通常所瞭解之含義。術語之 含義及範疇應為清禁的。妙、 勺π走的。然而，在任何潛在歧義之情況 下’相對於任何詞典定義或外來定義，以本文中提供之定 義為準。 一般而言’除非另作說明，否則根據在此項技術中熟知 i如本書整篇引用及討論之不同通用及更特定參考文 獻中所述之白知方法來進行本發明之方法及技術。如在此 項技術中通常實現或如本文所述，根據製造商說明書來進 行酵素反應。 除非另作說明，否則應瞭解如根據本發明所用之以下術 語具有以下含義。 本發明係關於自螺卵及/或生殖腺體獲得蝦紅素之方 法。該方法包含以下步驟： (a) 研磨卵及/或生殖腺體； (b) 將經研磨之卵及/或生殖腺體試樣與第一溶劑混合且 進行超音波處理； (c) 移除混合物中之固體組份以獲得醣脂蛋白類胡蘿_素 (glycol-lipo-carotenoprotein)溶液； (d) 使聽脂蛋白類胡蘿蔔素溶液與蛋白酶在黑暗中在n2 氣氛下接觸以使蛋白質消化； (e) 移除經消化之蛋白質以獲得醣脂類胡蘿_素（giyc〇i_ lipo-carotenoid)溶液； 132816.doc 1357333 (f) 自膽脂類胡蘿蔔素溶液移除脂質及醣化合物以獲得類 胡蘿蔔素溶液； (g) 以第二溶劑萃取類胡蘿蔔素溶液以獲得含蝦紅素之 溶液；及 (h) 自含蝦紅素之溶液純化蝦紅素β 根據本發明，術語"蝦紅素"表示游離形式與酯化形式之 混合形式’其具有下文所示之式：

-0Η :游離態蝦紅素 -OR :酯化蝦紅素。 本發明中所用之螺印及生殖腺體不受限制，只要其中

素P可在—較佳實施例中，卵及生殖腺體係自 果螺科（famUy〜他咖㈣獲得更佳自福壽螺 (卿⑽叫獲#，且甚至更佳自福壽螺獲得。 根據本發明，第—溶劑可為水或水與丙酮之混合物。. 广：明之-實施例中，僅使用螺印時，第一溶劑為水， 二與水之間的比率為約〗至約1··5,更佳為約撕 1:4，且甚至更# Α 伟… 3。在本發明之另-實施例中叫 使用螺生殖腺體時，坌 腺體、㈣及水之門弟；洛劑為水與丙銅之混合物… 的比率（W/V)為約1:1:3至約1:2:3，i 季乂 1圭為約1 · 1 ’ 3。+丄 發明之另一實施例中，使用卵及生透 1328 Ϊ 6.doc 1357333 溶劑為水與丙鲷之混合物。如上所述， 尺及丙綱之體積分別視卵及生殖腺體之 併本1月之步驟⑷中所用之蛋白酶可為任何可水解蛋白 貝及多肽以使其變成肽、寡肽及/或胺基酸之酶。水解反 應之條件視所選蛋白酶之種類而定。蛋白酶之實例包括 (但不限於）木瓜蛋白酶（papain)、鳳梨蛋白酶（br〇meiain)、

嗜熱菌蛋白酶（the_lysin)、胃蛋白酶（pepsin)、姨蛋白酶 鳳梨蛋白酶（trypsin b_elain)、驗性蛋白酶、 風味蛋白酶（Flavorzyme)、益瑞蛋白酶（Esperase)及其混合 物較佳使用之蛋白酶為木瓜蛋白酶或鳳梨蛋白酶，且更 佳為使用木瓜蛋白。以醣脂蛋白類胡蘿萄素溶液之體積 计，所添加之蛋白酶之量為約〇·5%至約15%(w/v)。

腺體兩者時，第一 在5亥第一溶劑中， 重量而定。 在本發明之步驟（e)中，可藉由此項技術中已知之任何方 法來移除經消化之蛋白質。舉例而言，可藉由Syn〇wieeki 等人（I994)及Lagocka等人（1997)所述之方法使經消化蛋白 質自醣脂蛋白類胡蘿蔔素溶液中沈澱出來。在本發明之一 實施例中，係將蛋白質沈澱劑添加至溶液中。蛋白質沈澱 劑可選自飽和硫酸鎂、氣化鈉、半飽和硫酸銨、三氯乙酸 鹽、水楊酸磺醯酯（sulfony Salicylate)、乙酸及濃無機 酸。所添加之試劑之量為約5%至1〇% (w/v)。 在本發明之步驟（f)中，可藉由此項技術中已知之任何方 法來移除脂質及醣化合物。舉例而言’藉由Lag〇cka等人 (1997)、Heras 等人（2002)、Dreon 等人（2004)及 Chan 等人 132816.doc -10· 1357333 (1974)所述之方法，可使脂質及醣化合物自醣脂類胡蘿蔔 素溶液中沈澱出來。在本發明之一實施例中，係將脂質/ 醣沈疵劑添加至溶液中。脂質/醣沈澱劑可選自丙_、曱 醇及乙醇（其均含有丨。/。毛地黃皂苷（digit〇nin)或。丁出⑽ X-1 〇〇)。所添加之沈澱劑的體積為醣脂類胡蘿蔔素溶液體 積之約2倍至約5倍。 根據本發明，例如步驟（c)中之固體組份、步驟（幻中之

經消化蛋白質及步驟（f)中之脂質及醣化合物的沈澱物可藉 由諸如過濾及離心之此項技術中已知之任何方法自溶液中 分離。

可用於本發明中之第二溶劑為所有能夠萃取蝦紅素之有 機疏水性溶劑。舉例而言，溶劑可選自由以下各物組成之 群.可食用油(例如，大豆油、花生油、橄欖油、葡萄籽 油、玉米油及葵花油）、具有6至2〇之碳數的直鏈烷烴或支 鏈烧烴（例如正己院）、院基_ (例如，二氯甲烧、三氣甲烧 及四氣甲貌）、芳族化合物（例如，苯及甲苯）、醋（例如， 乙酸乙酯及乙酸丁酯）及醚（例如乙醚）。 在本發明之步驟⑻中，蝦紅素可藉由此項技術中已知 之任何方法純化，該等方法諸如Sarada等人(2〇〇6)、㈣ 等人（2007)及Khanafad等人（2〇〇7)所述之方；去。在本發明 之:實施例中，利㈣自由以下各物組成之群的溶離劑藉 由管柱溶離來純化蝦紅素：正己烷、乙酸乙酯、丙酮、二 甲醇、乙醇、乙腈及其混合物1在步驟（g)中使 用可艮用油作為第二溶劑時’則將具有6至2〇之碳數的直 132816.doc 1357333 ==Γ煙(例如正己_(—至含 如，替及氧::)t油之黏度’且接著可使用吸收劑(例 /胗及乳化鋁）以吸收油中所含之蝦紅素。 :發明進一步包含使醋化形式之瑕紅素(包括 素及二m素）轉化為游離g蝦紅素1 此 :)技：中已知之任何方法一等人_)=

之實進行’且可在步驟⑷後之任何時間進行。在本發明 二-實w，將驗性溶液(例如’0.1MNaoH)添加至步 之反應中以將PH值調節至約12以使酷化形式 為=本發明之另一實施例中，為使醋化形式轉化 為游離形式’以軸至約叫/v)之量將抗氧鄉^^ 如:丁基經基苯甲鱗（BHA)'丁基經基甲苯（贿）'亞硫 酸虱鈉、維生辛E及盆、、g人Μ 類胡藥㈣二且:驟(姻 且隹…暗中在&軋鼠及酸性條件下在 約60°C下進行反應。 根據本發明之方法’所使用之第一及第二溶劑可回收以 降低操作成本。 提供以下實例以幫助熟習此項技術者實施本發明。雖然 =’但因為在不㈣本發明之精神或㈣的情況下可由 叙技術者在本文所讨論之實施例中進行修改及變化，所 以不應將該等實例視為其不當地限制本發明。 實例 實例1製備醣脂蛋白類胡蘿霉素溶液 a)自蘋果螺卵製備醣脂蛋白類胡蘿萄素溶液： 132816.doc 1357333 在室溫下，將1，000 g新鮮蘋果螺即在3，_ ml去離子水 中劇烈搜拌並研磨，且接著將所得均質混合物以超音波處 =20秒鐘。過濾經超音波處理之混合物，且收集濾液以獲 得酶脂蛋白類胡㈣素溶液。將酿脂蛋白類胡蘿萄素溶液 在K乳汛下儲存於4。〇暗箱中以避免與空氣、光及高溫接 觸。 < b)自蘋果螺生殖腺體（包括蛋白腺（albumin以抓句及卵 巢）製備醣脂蛋白類胡蘿蔔素溶液： 在室溫T，1，000 g自絲螺獲得之新鮮韻果螺生殖腺體 在3,000 ml去離子水及丨’000 ml丙酮中劇烈攪拌並研磨， 且接著將所得均質混合物以超音波處理2〇秒鐘。過濾經超 音波處理之混合物，且分別收集濾液及固體殘餘物。以 250 m丨丙酮將固體殘餘物進一步萃取3次。將滤液與萃取 物混合以獲得醣脂蛋白類胡蘿蔔素溶液。將醣脂蛋白類胡 蘿蔔素溶液在N2氣氛下儲存於4。〇暗箱中以避免與空氣、 光及高溫接觸。 c)自蘋果螺印及生殖腺體製備醣脂蛋白類胡蘿範素溶 液： 在至溫下，將600 g新鮮蘋果螺卵及4〇〇 g新鮮蘋果螺生 殖腺體在3,000 ml去離子水及4〇〇 ml丙酮中劇烈攪拌並研 磨，且接著將所得均質混合物以超音波處理2〇秒鐘。過濾 經超音波處理之混合物，且分別收集濾液及固體殘餘物。 以150 ml丙酮將固體殘餘物進一步萃取3次。將濾液與萃 取物混合以獲得醣脂蛋白類胡蘿菌素溶液。將醣脂蛋白類 132816.doc •13· 胡蘿蔔素溶液在N2 It裔ΠΓ袖+ 尽 ”飞下儲存於4°c暗箱中以避免與空 氣、光及兩溫接觸。 實例2自聽脂蛋白類胡蘿萄素溶液純化瑕紅素 在乂氣氛下之暗室中，將15 g木瓜蛋白酶（Merck ^emicals； 1 〇7149.! 〇〇〇 , 30000 USP.U/mg) 添加至1，_ ml獲自實m之各畴脂蛋白類胡蘿萄素溶液中 且授拌24小時。過;慮各經消化之溶液，收集隸且移除固 體殘餘物。將m ml 1()%乙酸滴人各遽液中。在Ν2氣氛下 之暗室中將各混合物攪拌3小時，且接著過濾混合物以移 除3有A 4化蛋白質之沈殿物。將體積比各濾液大三倍之 含有2% TritonX-ΙΟΟ之乙醇溶液添加至各濾液中，且接著 過遽混合物以移除含有脂質及酶化合物之沈則勿。將濾液 濃縮且藉由減壓回收其中所含之乙醇。以正己烷萃取各濃 縮濾液中所含之蝦紅素。將有機相以丨〇〇 ml去離子水洗滌 右干次，且接著經無水硫酸鈉乾燥。經由減壓濃縮方法獲 知蝦紅素混合物。藉由薄層層析（TLC ; 〇 25爪爪預塗片）以 正己烷：丙酮（4:1)移動相分析蝦紅素混合物之組份。自 TLC圖觀察到游離態蝦紅素、單酯-蝦紅素及二酯-蝦紅 素。進一步研究發現自管柱層析分析（矽膠（7〇_23〇目）、溶 離劑（正己烷：乙酸乙酯：丙酮=1〇:2:1))獲得之游離態蝦紅 素具有以下特徵： 3,3'-二經基·β，β_胡蘿蔔素·4,4，_二酮，深紫色針狀晶 體 ’ mp : 181 〜183°C，UV-vis Xmax 485 nm(CHCl3)，及1η NMR(CHC13)400 MHz δ(ρριη)1.2ΐ (s，6Η，C(CH3)2)，1.32 (s， 132816.doc 14 1357333 6H, C(CH3)2), 1.81 (t, J= 13.6 Hz, 2H, CH2CHOH), 1.94 (s, 6H, =C(CH3)CO), 1.99 (s, 6H, CH3C=CH), 2.00 (s, 6H, CH3C=CH), 2.16 (dd, J = 5.6, 12.5 Hz, 2H, CH2CHOH), 3.49 (s, 2H, OH), 4.32 (dd, J = 5,6, 13.6 Hz, 2H, CHOH), 6.19-6.46 (m，10H，=CH)，6.62-6.69 (m，4H, =CH)。 實例3選擇性萃取及純化游離態蝦紅素-在鹼性條件不水 解酯化蝦紅素 在N2氣氛下之暗室

Chemicals;目錄號 107149.1〇〇〇’ 比活性 30000 usp.U/mg 添加至1，000 ml自實例1之（a)獲得之醣脂蛋白類胡蘿蔔^ 溶液中且攪拌24小時》過濾經消化之溶液以移除固體殘音 物。將]20 ml 10%乙酸滴入濾液中。在乂氣氛下之暗室弓 將混合物攪拌3小時，且接著過濾混合物以移除含有經^ 化蛋白質之沈澱物。將體積為濾液體積三倍之含有2〇/ THt〇nX-1GG之乙醇溶液添加域液中，且藉由添加〇」^ Ν顧將其PH值調節至12。接著將溶液於冰甲培育8小時以 使其中所含之脂質及醣化合物沈殿’且同時使自旨化瑕紅素 水解。使用TLC分析確定水解反應完成。完成反應之後， ==τ沈殿物且獲得含蝦紅素之親水性溶液。 將办液心且藉由減屡回收其令所含之乙醇。以正己 取經濃縮溶液中所含之蝦紅辛。 兀 W I⑯有機相幻00 m】去離子 尺洗4右干次’且接著經無水硫酸納乾燥。 方法獲得40 mg蝦紅素。藉 π由減[浪細 貌:_ ”移動相分析瑕έ去 _預塗片)以正己 ”動相刀析瑕紅素化合物。發 132816.doc -15- 1357333 及二酯-蝦紅素均轉化成游離態蝦紅素。進一步研究發現 所得游離態蝦紅素具有與標準物之光譜資訊相同之光譜資 訊。 實例4選擇性萃取及純化游離態蝦紅素在酸性條件下水 解酯化蝦紅素 在N2氣氛下之暗室中，將15 g木瓜蛋白酶（Merck Chemicals;目錄號 107149.1〇〇〇,比活性 3〇〇〇〇 usp_u/mg) 添加至MOO ml自實例獲得之醣脂蛋白類胡蘿勤素 溶液中且㈣24小時。過I經消化之溶液以移除固體殘餘 物。將120 ml 10%乙酸滴入濾液中。在^氣氛下之暗室中 將混合物搜拌3小時，且接著過據混合物以移除含有經消 化蛋白質之沈澱物。將抗氧化劑(2 §丁基經基苯甲驗 (BHA)及3 g 丁基羥基甲苯（BHT))添加至濾液中，且將反應 物保持於乂氣氛下之60t:暗室中且授掉12小時以使酿化瑕 紅素水解。使用TLC分析確定水解反應完成。反應完成之 後，將產物冷卻至室溫。將體積為產物體積三含有 W —之乙醇溶液添加至產物令，且接；過：混 合物以移除含有脂質及醣化合物之沈澱物，並獲得含蝦紅 素之親水性溶液。將溶液濃縮且藉由減壓回收其中所含之 乙醇。以正己炫萃取經濃縮溶液中所含之瑕紅素。將二機 :以:oo mI去離子水洗條若干次’且接著以無水硫酸納乾 燥。經由減壓濃縮方法獲得35 m to 尔 進一步研穿發 現所得游離態瑕紅素具有與標準物之 資$。 貝訊相同之光譜 J32816.doc •16- 1357333 實例s藉由可食用油自類果螺印及生殖腺趙萃取蝦紅素 :1，000 ml大豆油添加至⑽mi自蘋果螺印及生殖腺 獲得之含瑕紅素的親水性溶液（其中蛋白質、脂質及醣 ::物已經自該溶液移除)中’且接著藉由在A氣氛下之 /至:中劇烈攪動來混合混合物。當經％小時萃取後水相之 ::色消失’再猎由分液漏斗使水相與油相互相分離，以獲 传含蝦紅素之大豆，、由·^媒 ,. 旦油4樣。接考以大豆油將含蝦紅素之大 丑油稀釋W倍。根據UV_Vis吸收光譜_侧nm)，含瑕 紅素之大旦油在480 nm下展示吸收峰。 根據上述方法，分別以橄欖油、葡萄籽油、玉米油及葵 花油來萃取含瑕紅素之親水性溶液。基於自^吸收光 錢得之資料測定且計算由以上油萃取之瑕紅素的比率。 將萃取率展示於下表1中。 表1

實例6純化以可食用油萃取之蝦紅素 將⑽nU正己烧添加至500 ml獲自實例5之含瑕紅素的大 丑油’以使大豆油的黏度降低。錢拌期間㈣§石夕膠 W筛目)添加至試樣中直至試樣中粮紅素之顏色轉移 132816.doc -17- 1357333 至矽膠。以50 ml正己烷洗滌矽膠，且將該步驟重複3次以 洗掉大豆油。接著以減壓處理矽膠以移除附著於其上之溶 劑。以50 ml 95〇/。乙醇溶離吸收於矽膠中之蝦紅素，且將 溶離步驟重複3次。在收集乙醇試樣之後’移除乙醇以獲 得瑕紅素固體。

或者’將吸收有蝦紅素之矽膠置於空管柱中，接著以溶 離月1](正己烧.丙明=4:1)洗條該管柱以獲得經純化之游離 態瑕紅素。發現經純化之游離態蝦紅素具有與標準物之光 譜資訊相同之光譜資訊。 參考文獻： 1. Synowiecki, J.; Shahidi, F. Isolation 〇f mucopolysaccharides from processing discards of seal and beef·. Food C/zew· 1994, ：W，89-93 °

2. Lagocka, J.; Sadowska, M.; Synowiecki, J. Separation and characteristics of different mucopolysaccharides from bovine trachea cartilage. Food C/zew· 1997, 60，533-536 ° 3. Heras，H_; Pollero，R. J. Lipoproteins from plasma and perivitellin fluid of the apple snail pomacea canaliculata. Bio cell. 2002, 26, 111-118 ° 4. Dreon, M. S.; Schinella, G.; Heras, H.; Pollero, R. J.

Antioxidant defense system in the apple snail eggs, the role of ovorubin. Jrc/z. jBz'oc/ze/w. 2004,窣22，1-8。 5. Chan, J. T.; Patterson, G. W.; Dutky, S. R.; Cohen, C. F. Inhibition of sterol biosynthesis in Chlorella sorokiniana 132816.doc

1 SI 1357333 by triparanol. Ρ/ζγίζ.ο/. 1974，53，244-249。 6. Sarada, R·; Vidhyavathi, R.;Usha, D.; Ravishankar, G. A. An efficient for extraction of astaxanthin from green alga Haematococcus pluvialis. J. Agric. Food Chem. 2006, 5( 7585-7588 °

7. Kang, C. D.; Sim, S. J. Selective extraction of free astaxanthin from Haematococcus culture using a tandem organic solvent system. Biotechnol. Prog. 2007, 23, 866-87卜 8. Khanafari, A.; Saberi, A.; Azar, M.; Vosooghi, Gh.; Jamili, Sh.; Sabbaghzadeh, B. Extraction of astaxanthin esters from shrimp waste by chemical and microbial methods. Iran. J. Environ. Health. Sci, Eng. 2007, 4, 93-98。 9. Yuan, J. P.; Chen, F. Hydrolysis kinetics of esters and

stability of astaxanthin of Haematococcus pluvialis during saponification. ·/. Fooi/ C/2e/w. 1999，47，31-35。 132816.doc -19-

Claims (1)

1. 1357333 十、·· ' 1. 一種自螺卵及/或生殖腺體獲得蝦紅素之方法，其包含以 ' 下步驟： (a) 研磨該卵及/或生殖腺體； (b) 將該等經研磨之卵及/或生殖腺體試樣與第—溶劑 混合，同時進行超音波處理： (c) 移除該混合物中之固體組份以獲得醣脂蛋白類胡蘿 蔔素（glycol-lipo-carotenoprotein)溶液； (d) 使該醣脂蛋白類胡蘿葡素溶液與蛋白酶在黑暗中在 N2氣氛下接觸以便消化蛋白質； (e) 移除該經消化之蛋白質以獲得醣脂類胡蘿蔔素 (glycol-lipo-carotenoid)溶液； σ)自該醣脂類胡蘿蔔素溶液移除脂質及醣化合物以獲 得類胡蘿蔔素溶液；

   (g)以第 之溶液； 二溶劑萃取該類胡蘿葡素溶液以獲得含蝦紅素 (h)自該含蝦紅素之溶液純化蝦紅素。 2.如請求項1之方法 C GUCll ic III Qt ° 其中該螺為 福壽螺 °亥螺印，且 5亥螺生殖腺 5亥螺卵及生 3·如請求項之方法，其中該瑕紅素係獲自 該第一溶劑為水。 4，如。月求項⑷之方法，其中該瑕紅素係獲自 體且5亥第—溶劑為水與丙酮之混合物。 5·如。月求項1或2之方法’其中該蝦紅素係獲自 132816.doc 1357333 殖腺體，且該第一溶劑為水與丙酮之混合物。 6·如清求項1或2之方法，其中該蛋白酶係選自由以下各物 組成之群.木瓜蛋白酶（papain)、鳳梨蛋白酶 (bromelain)、嗜熱菌蛋白酶（therm〇lysin)、胃蛋白酶 (pep叫、騰蛋白酶鳳梨蛋白酶（trypsin br〇melain)、驗 性蛋白酶（Alcalase)、風味蛋白酶（Flav〇rzyme)、益瑞蛋 白酶（Esperase)及其混合物。

   如》青求項1或2之方法，其中在步驟⑷中添加選自由飽和 硫酸鎂、氯化鈉、半飽和硫酸銨、三氣乙酸鹽、水揚酸 %醯S曰、乙酸及濃無機酸組成之群的沈澱劑以使該經消 化之蛋白質自該醣脂蛋白類胡蘿蔔素溶液中沈澱出來。 ^請求項1之方法，其中在步驟（f)中添加均含有1%毛地 黃皂苷（digitoninM2% Triton χ_1〇〇之選自由丙酮、甲 醇及乙醇組成之群的脂質/醣沈澱劑以使脂質及醣化合物 自該酶脂類胡蘿葡素溶液中沈澱出來。 如請求項丨、2或8之方法，其中該第二溶劑為可食用 油具有6至20之碳數的直鏈或支鏈烷烴、烷基鹵、芳 族化合物、酯或醚。 10.:請求項9之方法’其中該第二溶劑為選自由大豆油、 化生油、撖欖油、葡萄籽油、玉米油及葵花油組成之群 的可食用油。 U.如=求項9之方法，其中該第二溶劑為正己烷。 12.=吻求項丨、2或8之方法，其中步驟（h)包含以下過程： *步驟（g)中所用之該第二溶劑為可食用油時，將具有6 132816.doc 1357333 至20之碳數的直鏈或支鏈烧烴或崎添加至該含瑕紅素之 洛液中；及添加吸收劑以吸收該油中所含之該瑕紅素。 13如請求項12之方法，其中該吸收劑係選自由矽膠及氧化 鋁組成之群。 14.如明求項丨、2或8之方法，其進一步包含將蝦紅素轉化 為游離態蝦紅素之過程。 士。月求項14之方法，其中該轉化過程包含將驗性溶液添 加至该聽脂類胡蘿蔔素溶液中以使該溶液之ρ Η值變成約 1 6 *如5月求項丨4夕士》，_|> , | . 加至中該轉化過程包含將抗氧化劑添 至"亥骑月曰類胡蘿蔔素溶液中 Ν名鸟η ▲ 且將5亥溶液在黑暗中在 Ν2巩汛及酸性條件約6(TC下反應。 在 17.如請求们6之方法，其μ 組成之群：丁其〜I _ 匕内丨係^自由以下各物 丁基經基苯甲醚（BiJA)、 (ΒΗΤ)、亞硫酸也 )丁基羥基Τ苯 文虱鈉、維生素Ε及其混合物。 I32816.doc