TWI339130B - Purification of taxanes and taxane mixtures using polyethyleneimine-bonded resins - Google Patents

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1339130 玖、發明說明： [相關申請案之交又參考] 根據美國專利法第120條（35 u s r 、士 Α太 〈）υ·、α§120)’本申請案主張 美國申請案第ΙΟ/664 539祙夕保 ，5虎之榷利，根據美國專利法第 "9(e)條4果國中請案主張分別於細3年3月口日及⑽3 年3月21日^的美國臨時中請㈣60/455,377號及第 60/456,478號之權利。每— ’ 上逃申靖案均以全文引用的方式 併入本文中。 【發明所屬之技術領域】 本\月ίτ、關於一種用於自含有紫杉烷類之物質分離或單 離一種或多種紫杉；^化合物之方法，及由該方法産生之組 物或化σ物本發明亦關於_種用於純化包含—種咬多 種紫杉炫類的生物量提取物之方法a在一實施例卜該方 法涉及使用-種或多種附著至一基質（例如，固體基質）之含 胺基物質，該物質包括（但不限於）聚乙缚亞胺·鍵結碎土層 析樹脂㈣S樹脂）.此等樹脂促進紫杉㈣以高産量及高二 度進仃純化。在-實施例令’層析樹脂包含鍵結至各種粒 子大小或孔徑大小之矽土的非官能化及/或非衍生聚乙烯 亞胺（PEI )么合物。在另一實施例中使聚乙烯亞胺甲基 化以形成二乙基胺基甲基-鍵結矽土（，，DEAM>在本發明之 一替代實施例令，DEAM及PEI均可在醆性pH值下用於正相 層析中。 【先則技術】

本發月涉及使用由固體基質支樓的含胺基物質（例如pBS 92029 doc 1339130 μ月曰）自含有一種或多種紫杉烷類的物質單離或分離太平 洋！t醇或其它紫杉烧類。本發明亦涉及純化包含紫杉燒 類之生物量提取物。 吾人已熟知：可藉由使用層析技術來純化各種紫杉烷 類’例如太平洋紫杉醇。在文獻中已報導了適用於該目的 之層析媒；I，例如矽土、氧化鋁 '烷基_鍵結矽土樹脂（例如 及C 8)及水笨乙稀二乙稀苯樹脂。然而’視純化方法之 性質，所有此等媒介均有限制。 吾人已發現附著至一基質之含胺基物質（例如pBS樹脂） 可提供優於其它用於單離及純化紫杉烷類之習知層析樹脂 的選擇性及解析度（resolution)。因此，可利用附著至一基 質之含胺基物質（例如pBS樹脂）來執行較紫杉烷純化領域 中之其它樹脂更有效的分離。例如，在文獻中，太平洋紫 t醇（¾•、杉醇A)與三尖杉寧絵(cephalomannincX紫杉醇B)的 分離已被描述為難以實現。如本文所述，使用一種或多種 PBS樹脂極大地促進此等化合物的分離。同樣的，因為可使 用有機溶劑來利用PBS樹脂，所以該樹脂比逆相樹脂（例如 C 1 8 ' C8及聚苯乙烯二乙烯基苯樹脂）更易於裝載，且樣品 可以更高的裝載量來施用。

PBS樹脂主要用於離子交換層析應用中。紫杉烷類極少含 有可離子化的基團，例如竣酸或胺基，且因此相互作用的 模式不是傳統的離子交換。意想不到的是，使用PBS樹脂提 供了單離或純化紫杉烷類時的優良的選擇性與解析度。在 本發明中，當在流動相中使用少量酸性改質劑或鹽時，P B S 92029.doc U9130 樹脂發揮最佳作用。 另外’吾人已發現：可拉士 a #儿 g烷基化、芳基化或醒化來宫 能化ΡΕΓ聚合物之胺基。五 ^木g 。人亦已發現·· PBS樹脂可用來勃 行紫杉烷化合物的製備性分_ 執 刀離及分析性分離。製備性 可以分批、半連續或連續模弋.佳一 只镇式進仃。+連績模式可為 移動床（SMB)層析之形式。 缺 【發明内容】 本發明涉及使用附著（例如鍵結）至—固縣質之含胺基 物貝自含有一種或多種紫杉烷類之物質單離或分離太平洋 紫杉醇或其它紫杉烧類，其中該固體基質包括(但不限於 可單離或分離紫杉烧類之聚乙稀亞胺基質，例如鍵結至石夕 土的承乙烯亞胺。其它附著至—基質（例如固體基質）之適宜 的含胺基物質可包括美國專利第5风779號及第5，㈣，992 號中所揭示之彼等物質。此等兩個專利均以全文引用的方 式併入本文中。

在替代實施例中，本發明係關於使用PBS樹脂來幫助自 二有紫杉烧類的組合物分離或純化各種紫杉烷類，包括太 平洋备、杉醇。據信，基於該目的使用此等樹脂較先前技術 新穎且優良。較佳之樹脂包括PEI及DEAM。 在一替代實施例中，本發明係關於一種自紫杉烷混合物 單離—種或多種紫杉烷類及其類似物之方法。紫杉烷混合 物可包括生物量提取物’或其可自半合成或總合成製程獲 得。邊方法包含以下步驟： 木用附著至—基質的含胺基物質（例如PBS樹脂）來處 92029.doc -9- 1339130 理紫杉烷混合物； (b) 自層析樹脂溶離一種或多種紫杉烷類及其類似物；及 (c) 在一份或多份溶離液中回收一種或多種紫杉烷類及其 類似物。 在另一替代實施例中’本發明係關於一種純化及/或增大 含有紫杉院之物質中的紫杉烷類之濃度的方法，含有紫杉 烷之該物質可為（例如）紫杉屬提取物、或自半合成或總合成 製程獲得的紫杉烷混合物’其由選自稱為紫杉木（Yew)的植 物組成之群的植物物質衍生。該方法包含下列步驟： (a) 採用附著至一基質的含胺基物質（例如pBS樹脂）來處 理包含紫杉烷類及其天然類似物的物質； (b) 自層析樹脂溶離紫杉烷類及其類似物；及 (c) 在一份或多份溶離液申回收紫杉烷類及其類似物。 藉由參照下列詳述及隨附圖式將進一步瞭解本發明及其 優勢。 【實施方式】 本文中所使用之”烷氡基π意指附著至氧原子的直鏈、支 鏈或環狀飽和烴β烷氧基較佳具有一至六個碳原子。烷氧 基亦指經取代之烷氧基，例如，其可包括下列取代基：烷 醯氧基、烯基、烷基、烷基甲矽烷基、烷基磺醞基、烷基 硫氧基、烷基硫基、炔基、胺基（例如，單烷基胺基與二烷 基胺基及單芳基胺基與二芳基胺基）、醯胺基、芳基、芳基 烷基、羧基、羧基烷氧基、羧基醖胺基、羧酸基、齒代烷 基、画素、羥基、腈基、硝基、磷酸基、曱矽烷氧基、硫 92029.doc •10- 1339130 酸基 '續醯胺基、續s&氧基及其組合。其中，烧氧基之較 佳實例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、環丙氧基、異丙 氧基、正丁氧基、異丁氧基、第二丁氧基、第三丁氧基、 環丁氧基、戊氧基、異戊氧基、新戊氧基、環戊氧基、己 氧基及環己氧基。 本文中所使用之"院基"意指直鏈、支鏈或環狀飽和烴。 烷基較佳具有一至六個碳原子。烷基亦指經取代之烧基， 例如，其可包括下列取代基：烷醯氧基、烯基、烷基、烷 基甲矽烷基、烷基磺醯基、烷基硫氧基、烷基硫基、炔基、 胺基（例如，單烷基胺基與二烷基胺基及單芳基胺基與二芳 基胺基）、醯胺基、芳基 '芳基烧基、緩基、繞基烧氧基、 緩基酿胺基、緩酸基' 代烧基、齒素、經基、猜基、石肖 基、鱗酸基、甲矽烷氧基、硫酸基、續醯胺基、續醯氧基 及其組合。較佳的取代基為烷氧基、胺基（例如，二烷基胺 基'二芳基胺基）、含有羧酸之基團'鹵代烷基、鹵素、經 基、腈基、硝基及磺酸基。較佳烷基之實例包括（但不限於） 甲基、乙基、丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、 第二丁基、第三丁基、環丁基、戊基、異戊基、新戊基、 1-乙基丙基、環戊基 '己基及環己基。 本文中所使用之"芳基”意指可視情況經取代之苯基或萘 基。芳基上的取代基之實例包括（但不限於）烷醯氧基、烯 基、烷氧基、烷基甲矽烷基、烷基磺醯基、烷基硫氧基、 烷基硫基、炔基、胺基（例如，單烷基胺基與二烷基胺基及 單芳基胺基與二芳基胺基）、醯胺基、芳基、芳基烷基、羧 92029.doc -11 - 1339130 基、緩基烧氧基、敌基醯胺基、緩酸基、鹵代烧基、[il素、 羥基、腈基、硝基、磷酸基、曱矽烷氧基、硫酸基、磺醯 胺基、磺醯氧基及其組合。較佳的取代基為烷氧基、烷基、 胺基（例如二烷基胺基及二芳基胺基）、含有羧酸之基團、鹵 代烷基、ii素、羥基 '腈基、硝基及磺酸基。 本文中所使用之”芳基烷基，，意指附著至烷基之芳基。芳 基烧基之一貫例為节基。 本文中所使用之"驗式毀果赤毒素（basic baccatin) III結構" 意指具有圖6所示之分子式之化合物，在該分子式中，每一

Ri、R2、R4、R7、R10及Rl3個別為氫、烷基、醯基、芳基、 芳基烧基、乙烯基、醚基、酯基、糖苷基、氧基或經基保 護基。驗式漿果赤毒素III結構之定義中包括具有圖7所示之 分子式之漿果赤毒素ΠΙ及具有圖8所示之分子式之1〇_去乙 醯基漿果赤毒素III ’在圖8所示之分子式中，Ac為乙醯基或 乙酸基（CH3C(0)-) ’且Bz為苯甲醯基（PhC(O)-或 c6h5c(o)-) 〇 本文中所使用之”酯基”意指具有酯官能度之直鏈、支鏈 或環狀取代基，意即_C(0)_0R。酯基之實例包括鍵結至羥 基之醞基’例如乙醯基及笨曱醯基。 本文中所使用之"醚基”意指具有醚官能度之直鏈、支鏈 或環狀取代基，意即-C_〇_c…醚基之實例包括（但不限 於）HOCH2CH2OC(CH2OH)H-。 本文中所使用之"糖皆基”或”糖基”意指含有鍵結至氧原 子或虱原子的非糖基且一經水解即可産生糖（例如，葡萄糖） 92029.doc 丄339130 之許多糖衍生物中的任一種。較佳糖基之—實例為木糖基。 本文中使用之"鹵素"意指氟、氣、溴及/或碘。 本文中使用之’·雜環基”為在一環中含有至少一個不同於 碳的原子（例如氧、氮或硫）之飽和、不飽和或芳香族環狀化 合物。雜環基之貫例包括諸如2-。夫喃之夫喃基、嗎琳某、 哌啶基、。底唤基、Ν-甲基哌嗓基、吡咯基' ^比啶基及噻吩。 本文中所使用之氧基"意指由糖苦基（例如，美國專利第 5，3 5 6，9 2 8號中所描述的木糖皆）之氧化所衍生之取代芙。 本文中所使用之"紫杉烷或紫杉烷分子，，包括（但不限於） 含有鹼式漿果赤毒素m結構的分子，且其中（2R，3s)_C6H5 CH(Rx)CH(0H)C(0)-基團與位於鹼式漿果赤毒素m結構之 C-13位置處的經基形成酯。由rx表示的基團可為胺基、胺 基鹽（例如銨鹽）、由胺基保護基保護的胺基或可轉換為胺基 的取代基。紫杉烷分子之定義中亦包括鹼式漿果赤毒素m 結構與（2R，3S)-C6H5CH(Rx)CH(OH)C(0)-基囷之各種異構 體、同系物及類似物。同樣地，紫杉烧分子之範疇涵蓋1 〇_ 去乙醯基漿果赤毒素III結構。紫杉烷或紫杉烷分子之定義 内包括（但不限於）初級紫杉烷類，例如紫杉醇A(太平洋紫 杉醇）、紫杉醇B(三尖杉甯鹼）、紫杉醇C、紫杉醇D、紫杉 醇E、紫杉醇F及紫杉醇G。紫杉烷或紫杉烷分子之定義進 一步包括多西紫杉醇（Docetaxel)(TAXOTERE®)。（例如’參 見圖5-6)。 本文中所使用之”乙烯基”意指具有碳-碳雙鍵的直鏈或支 鏈取代基。乙烯基之實例包括（但不限於）丨-甲基-1 -丙烯基 92029 doc -13 - 1339130 (CH3CH C(CH3)-)及 2-曱基小丙稀基（(CH3)2C=CH_)。 !心木ίτ、因a午多紫杉屬物種的樹木而得％ ;紫杉屬係紫 杉科m列中之主要種類。最初於丨962年開始自Washingt〇n State收集到自太平洋紫杉木(短葉紫杉)之樹皮單離的紫杉 醇，IW後在1 97 1年有報導稱紫杉醇出現於其它兩種紫杉屬 物種中’包括漿果紫杉（Taxus bac_)(歐洲紫杉木）及東北紫 杉（Taxus cuspidata)(日本紫杉木）。隨著深入細緻的研究，進一 步有報導稱紫杉醇出現於許多其它紫杉屬物種及栽培品種 中。此等1杉物種及栽培品種包括（但不限於）：球形紫杉 (Taxus gl〇bosa)(墨西哥紫杉木）、佛羅里達紫杉（Taxus floridana)(佛羅里達条杉木）、加拿大紫杉（Taxus canacjensjs)(加 拿大紫杉木）、瓦氏紫杉（Taxus waUichiana)(喜馬拉雅紫杉 木）、雲南紫杉（Taxus yunnanensis)、中國紫杉（Taxus chinensis)， 以及許夕觀貝雜種’諸如曼地亞紫杉（Taxus ma(jia)栽培品 種，例如"丹斯佛米斯（Densiform}s)"曼地亞紫杉、”希克西 (Hicksii)"曼地亞紫杉、"布朗尼（Brownii)"曼地亞紫杉、"暗綠 色斯布蘭德（Dark Green Spreader)"曼地亞紫杉、"朗安（Runyan)，· 曼地亞紫杉、"沃地（Wardii)"曼地亞紫杉、，•套托尼（Tautonii)" 曼地亞紫杉、"卡皮塔特（Capitata)，'東北紫杉（τ· cuspidata)等 等。在本發明中，紫杉屬提取物或半合成反應混合物可自 任一紫杉屬物種衍生，包括（但不限於）上述物種及栽培品 種。本發明中所使用之其它紫杉物種識別於·· Chadwick，L c 及 Keen，R. A.，1986年 5 月，"AstudyoftheGenusTaxus，'，Res. Bull. 1086，Ohio Agricultural Research and Development Center ； Appendino, 92029 doc 14 1339130 G‘ ’】995 年’ "The Phytochemistry of the Yew Tree": Phytochemistry，Natural Products Reports 12(4):第 349-360 頁；Convention On International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora: Eleventh meeting of the Plants Committee ’ 美國 LungKawi (Malaysia)，2001 年 9 月 3-7 日， Document PCI 1 DOC. 22-p.l ;及 Greer, C. E,，Schutzki R.E.，Fernandez, A. 及 Hancock, J_F.’ 1993 年 10 月 12 月，"Electrophoretic Characterization ofTaxusCultivars" : HortTechnology，3(4):第 430-433 頁。每一此 等參考文獻均以全文引用的方式併入本文中。 現吾人驚奇地發現：可藉由裝填有PBS樹脂的正相液相層 析管枉以高產量自紫杉屬物種單離及純化紫杉烷化合物， 包括太平洋紫杉醇及太平洋紫杉醇類似物及其同種類物。 藉由本方法，可自天然生物量提取物及由半合成或總合成 製程獲得之物質單離大量太平洋紫杉醇之類似物。 本發明之起始物質可為選自由通常稱為紫杉樹木的植物 組成之群的植物物質該群之最適宜植物為紫杉屬物種。 在紫杉屬物種中’尤其較佳為紫杉x曼地亞栽培品種。例 如，較佳的栽培品種包括（但不限於）"希克西"紫杉或"暗綠 色斯布蘭德”曼地亞紫杉。雖然在本發明中方便地使用紫杉 樹木之特定部分’但是紫杉醇及其天然類似物可自整棵植 物或獨立部分（例如’木材 '莖、根、葉（針葉）、種子或其 任意組合）提取°待提取之物質可為新鮮或乾燥。較佳使用 樹皮或針葉。本發明之方法可進一步用於純化來自成熟的 植物細胞之紫杉烧類’或培養藉由使用試管内培養技術獲 得的上清液。此外，可施用該方法自藉由層析技術處理的 92029.doc •15- 1339130 混合物或未藉由該等技術處理的混合物分離或純化紫杉烷 類。該方法可進/步施用於分離及純化由半合成或總合成 程序獲得之紫杉烷類。 在本發明之一態樣中，使用附著至一基質（例如矽土）之含 胺基物質自含有紫杉烷類的混合物分離或單離一種或多種 紫杉烷化合物。待分離或待純化之該等物質包括（但不限於） 紫杉醇A ' B、C、D ' E、F、G、？ s紫杉醇、壬紫杉醇 (N〇nataxel)。附著至_基質之該等含胺基物質之實例包括 (但不限於）PBS樹脂a此等樹脂通常用於離子交換應用中’ 且因此不期望其適用於分離中性分子，例如通常不含有可 離子化之基團之紫杉烷類。藉由使用（例如）pBS樹脂驚人地 增強了紫杉烷混合物之分離的選擇性及解析度。例如，相 李父於（例如）逆相樹脂，例如C18、C8及聚苯乙烯二乙烯基 苯PBS樹月曰更谷易裝載至更高含量a例如，印㈣脂亦有 利地與有機溶齊ι| 一起使用。 PBS樹脂可自結合至各種孔徑大小及/或粒子大小之石夕土 的聚乙烯亞胺聚合物衍生。矽土具有6〇 3〇〇埃單位範圍内 之平均孔徑大小。矽土較佳具有約丨〇〇至2〇〇埃單位之平均 孔往大小K圭為約12〇埃單位1 土亦可具有約0 ^至約 5〇〇微米範@内之平均粒子大小1土較佳具有㈣·⑶微 未之平均粒子大小，更佳為約2()至6()微米，最佳為約賴 米。 本發明之適宜的PBS樹脂可包括沉颇。此樹脂可自；τ 陳r購得’CAS登記號産品代碼為：73丨7' 747丨、則、 92029.doc 1339130 7473 ’ 其名稱為"BAKERBQND® DEAM Chromatography Packing”。另一適宜的PBS樹脂可包括PEi。此樹脂亦可自 J.T. Baker購得，CAS登記號為：126850-07-5，産品代碼 為：7134、 7180、 7264、 7368、 7476及 8179 ，其名稱為 •Polyethyleneimine Bonded SUica Gel"。 在本發明之一替代實施例中’附著至一基質之含胺基物 質（例如PBS樹脂）可為非衍生性，例如PEI。本發明之層析 樹脂可包括（但不限於）其中聚乙烯亞胺部分之一級及/或二 級胺基與反應性部分反應的衍生性P B S樹脂。本發明之P B S 樹脂可由下列通式表示： PBS樹脂之通用結搆

pei：r=h DEaM：R = cHj 以上結構僅為ii成說明之非限制性目的e PBS樹脂之結構 可呈現許多其它支鏈圖案或包含單個或多個附著至矽土粒 子表面的附著點〇同樣的’ R基團可包括（但不限於）Η基、 甲基、醞基、烷基、芳基、芳基烷基、磺醯基或其住意組 合a 92029.doc •17. 1339130 pEI聚合物之胺基可藉由烷基化、芳基化或醯化或其它方 法來官能化。官能化胺基可導致增加樹脂之選擇性、解析 度或其它所要性質。例如’ DEAM係一經官能化的PEI之具 體貫例。 本發明之樹脂可用於自紫杉烷混合物單離或純化紫杉炫 類’其中該紫杉烷混合物包括（但不限於）生物量提取物，例 如紫杉屬提取物。在一替代實施例中，本發明可用於自藉 由溶劑分割、離心過濾、過濾、沈澱或其任意組合而產生 的紫杉烷混合物（例如，生物量提取物）單離或純化紫杉烷 類。本發明之樹脂亦可用於自含有天然衍生之紫杉烷的混 合物單離及/或純化紫杉烷類，其中該等紫杉烷類並非由合 成或半合成製程形成。本發明之樹脂可進一步用於自包含 由半合成或總合成製程獲得之紫杉烷類的混合物單離或純 化紫杉烷類。 吾人已熟知可用於純化紫杉醇八及來自紫杉屬提取物之 其匕1杉炫類的各種形式之層析，例如石夕土、氧化鋁、C 8、 C18、聚苯乙烯二乙烯基苯#。層析可藉&熟悉此項技術者 已知的其它方法來補充，例如溶劑分割及結晶。pBS樹脂可 與此等其它技術結合使用以簡化自紫杉屬提取物純化紫杉 醇A及其它紫杉烧類。例如，吾人已發現pBs樹脂可尤其有 效地用於自紫杉醇B、N_甲基紫杉坑類、肉桂酸紫杉㈣及 其它物質分離紫杉醇A。PBS樹脂亦可用於自紫杉屬提取物 中所發現的其它紫杉炫類分離相關群之紫杉烧類，例如初 級紫杉烷類（參看圖6)。PBS樹脂可用於自非吾人所要之成 92029.doc •18· 丄 刀刀離兔杉垸類’從而增大混合物中紫杉烧的濃度ο =替代貫施例中，起始物質可包含選自由通常稱為， 杉木的植物組成 、、 群的植物物質。此群之最適宜植物為势 (TaXUS)物種。本發明中所使用的起始物質可包括（但不 ⑴任何包含藉由除了半合成程序或總合成程序以外 矛序製備之—種或多種紫杉烧類的物質；（2)任何包含藉 曰=法t備之-種或多種紫我類的物質；⑺任何包含 、,¥精由層析法製備之一種或多種紫杉烷類的物質 ，藉由溶劑分配、離心 '過渡、沈殿或其…合製 之種或多種紫杉烧類的物質；⑺任何包含來自紫杉 ㈣m多«杉㈣的物質；或⑹任何包含來自— 種或多種紫杉屬植物之-種或多種紫杉烧類的物質，其中 該行杉烧類並非僅衍生自短葉紫杉（τ_ b⑽咖⑷。起 始物質可包括任何包含藉由前述參數之任意組合製備之— 種或多種紫杉院類的物質。此項技術_已熟知製備含有紫 ^之物質（例如’生物量提取物或半合成或總合成反應混 合物）之方法。 在另一替代實施例_ ’本發明係關於一種自含有紫杉烷 之混合物單離一種或多種紫杉院類的方法，該方法包含以 下步驟：⑷採用PBS樹脂來處理該混合物，並卜種或户 種紫杉院類係衍生自一種或多種紫杉屬植物，兑中一二 多種紫杉垸類並非僅料自短葉紫杉；⑻採用溶離劑自 哪接m溶離-種或多種紫㈣類；及（加收經溶離之一 種或多種紫杉烷類。 92029.doc -19- 1339130 在另-實施例’，本發明係關於一種自含有紫杉烷之混 合物單離—種或多種紫杉烧類的方法，該方法包含以下步 驟⑷採用PBS树脂來處理該混合物，其中該混合物包含 以重里计/於25%或多於4〇%的初級紫杉烷類；（b)自印§樹 月曰/谷離種或夕種紫杉烧類；及（c)回收經溶離之一種或多 種紫杉烷類。 在另一實施例中’本發明係關於一種用於單離一種或多 種紫杉烧類的方法’該方法包含以下步驟：⑷採用pBs樹 月曰來處理含有紫杉烷之混合物，其中該混合物包含以重量 計約25%至40%的初級紫杉烷類，其中一種或多種紫杉烷類 並非僅衍生自短葉紫杉；（b)自？的樹脂溶離一種或多種紫 杉烷類；及（c)回收經溶離的一種或多種紫杉烷類。 在本發明之一替代實施例中，起始物質可包含以重量計 少於約25%或多於約40%的初級紫杉烷類，包括（但不限於） 篡杉醇A、B、C、D、E、F或G。提取物中之剩餘物質可包 含其它化合物’包括（但不限於）雜質。在起始物質中初級紫 杉烧類之其它適宜量可包括自約〇.5%至1%、1%至1〇%、1〇0/。 至 15%、15%至 20%、20% 至 25%、25。/。至 3 0。/。或 30。/。至 3 50/〇、 或35%至40°/。。其它量亦可包括約4〇%至5〇%、5〇。〆。至6〇0/〇、 60% 至 70%、70%至 80%、80。/。至 90% 或 90% 至 100%。 在另一替代實施例中，生物量提取物衍生自紫杉屬植 物。在又一替代實施例中，生物量提取物衍生自除短葉紫 杉外之任何紫杉屬植物。在另一替代實施例中，生物量提 取物衍生自除短葉紫杉外之任何紫杉屬植物，且其包含以 92029 doc -20- 1339130 重量计自約25%至約40%的初級紫杉烷類’其包括（但不限 於）备、杉醇A、B、C、D、E、F或G。 在另一實施例中，本發明係關於一種自生物量提取物純 化種或多種紫杉烧類化合物的方法’其中該生物量提取 物衍生自一種或多種紫杉屬植物。在一實施例中，生物量 提取物係來自除短葉紫杉外之一種或多種紫杉屬植物。在 另一貫施例中’生物量提取物包含以重量計少於2 5 〇/〇或大 於40°/。的初級紫杉烷類。在又一實施例中，生物量提取物 包含自約25%至約40°/。的初級紫杉烷類，其中該生物量提取 物衍生自除短葉紫杉外之一種或多種紫杉屬植物。 另外’在一替代實施例中’生物量提取物可包含如下量 之異丁醇：少於約50%、40%、30%或20%，較佳少於1〇〇/0， 更佳少於5% ’最佳少於3%、2% ' 1%、0.5%或0.25%。 本發明之方法可使生物量提取物之純度增加約丨0。/〇至 20%、20。/。至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、50%至 60%、 60% 至 70%、70°/。至 80%、80% 至 90%、90% 至 100%、1〇〇〇/0 至 110 ❶/〇、110°/。至 120%、120% 至 130%、130% 至 140%、140〇/〇 至 150%、150°/。至 200%、200%至 250%、250%至 300%、300% 至 350%、3 50%至 400%' 400°/〇至450%、450%至 500%、500〇/〇 至 550%、550%至 600%、600%至 650%、650%至 700%、700% 至 75 0%、75 0%至 800%、800%至 85 0%、850%至 900%、900% 至950%、95 0%至1 000%。本文中所使用之術語純度意指在 乾燥形式之物質或生物量提取物中所存在的一種或多種紫 杉炫> 化合物之重量百分比。 92029.doc -21 - 本發明之樹脂可用於自完全或部分由半合成製程或總合 成製裎獲得的紫杉烷混合物純化—種或多種紫杉烷類。在 —替代實施例中，本發明之樹脂可用於自粗反應混合物純 化半合成紫杉醇A或其它半合成紫杉烷類。因為大多數的合 成反應會産生副産物或未反應的起始物質，該等物質在許 多情況下在結構上與所要産物緊密相關，所以純化該等産 #的方法很重要。例如’已展示PBS樹脂來增強及簡化自諸 如圖10所示之許多相關雜質及結構上相關之化合物純化由 本文中所拖述之方法製得的半合成紫杉醇A之純化過程。 在一替代實施例中，本發明涉及自藉由半合成或總合成 製辁氣備之物質純化一種或多種紫杉烧化合物。圖丨與圖2 展示利用本發明之樹脂的示範非限制性半合成製程。在以 下兩個申請案中描述了該製程：2003年8月4曰申請的標題 為 Conversion of Taxane Molecules” 的第 PCT/US03/10556號申請案 及 4不《I 為 Methods and Compositions for Converting Taxane Amides to Pac丨itaxel or Other Taxanes"的第 PCT/US03/24666 號申請案。每一上 述申請案均以全文引用的方式併入本文中。 在一替代實施例中，該等物質包含以重量計少於約 10%、較佳少於約5%、更佳少於約3%、最佳少於約 笨甲醒初級紫杉烷類。在另一替代實施例中，含有紫杉烷 之物質包含少於約 9%、8%、7%、6% ' 4%、2%、1% ' 0.5%、 〇·1%或0.01%之C_2,笨甲醯初級紫杉烷類。紫杉烷雜質包括 (但不限於）紫杉醇A、B、C、D、E、F或G之C-2,笨曱酸酯。 紫杉院雜質亦可包括少於約1 〇%、9%、8%、7°/〇、6°/。、5%、 92029.doc .22 - 1339130 4 %、3 %、2 %、1 % 或 〇 · 5 % 的紫杉醇 B、C、D、E、F 或 G 之 C-2'笨甲酸酯。本文中所使用之術語重量百分比意指在乾燥 固體形式的物質中所存在的一種或多種化合物之百分比。 — 在一替代實施例中，本發明係關於一種自包含由半合成 ’ 或總合成製程獲得之紫杉烷化合物的物質單離一種或多種 紫杉烷類的方法，該方法包含以下步驟：採用PBS樹脂 來處理該物質’其中在半合成或總合成製程中用作反應物 的分子並非僅衍生自短葉紫杉；（b)自PBS樹脂溶離一種或 多種紫杉烷類；及（c)回收經溶離的一種或多種紫杉烷類。 痛 在另一實施例中，本發明係關於一種自包含由半合成或 總合成製程獲得之紫杉烷化合物的物質單離一種或多種紫 杉烧類的方法：（a)採用PBS樹脂來處理該物質，其中該物 質包含以重量計少於約8%至3〇/。的經組合之紫杉醇A、b、 C、D、E、F或G之2，-笨甲酸酯；（b)溶離一種或多種紫杉烧 類；及（c)回收經溶離之一種或多種紫杉烷類。在另一實施 例中本發明係關於一種自包含藉由排除苯甲酿化紫杉烧 分子之C-2,羥基之步驟的製程獲得之紫杉烷化合物的物質 ^ 單離一種或多種紫杉烷類的方法。 在另—實施例中，本發明係關於一種自包含由半合成或 總合成製程獲得的紫杉烷化合物的物質單離一種或多種紫 杉烧類的方法，該方法包含以下步驟：（a)採用PBS樹脂來 處理該物質，其中該物質包含以重量計少於0.5%的經組合‘ 之紫杉醇B、C、D、E、！：或〇之2，-笨f酸酷；（b)溶離一種 或夕種务、杉烷類；及（c)回收經溶離的一種或多種紫杉烷類。 92029.doc -23- 1339130 在另一替代實施例中’本發明係關於一種製備紫杉烷混 合物之方法。該方法包含以下步驟：採用pBS樹脂來處理包 含由半合成或總合成製程獲得之一種或多種紫杉烷類的物 質。半合成製程中所使用的紫杉烷類或其它化合物衍生自 一種或多種紫杉屬植物或除短葉紫杉外的一種或多種紫杉 屬植物。在另一實施例中’含有紫杉院之物質包含以重量 計少於3%的紫杉醇A、B、C、D、E ' F或G之2，-笨甲酸酯。 在另一實施例中，含有紫杉烷之物質包含少於0.5%的紫杉 醇A、B、C、D、E、F或G之C-2,苯甲酸酯。 在另一替代實施例中，待由本發明處理之物質可包含笨 甲酸酐、苯甲酸及苯甲醯氣，其量較佳少於1 〇〇/〇，較佳少 於5%，更佳少於1 %且最佳少於0.3%。 就由半合成或總合成程序獲得的物質而言，當該等物質 藉由本發明來處理時，由其獲得之所要産物可具有至少 70%純度，較佳為至少約80%，更佳為至少90%，最佳為至 少約 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。 在另一替代實施例中，待由本發明處理之物質可包含具 有約1 i 04分子量的紫杉烷雜質及/或具有約87 1分子量的環 氧丙烷之開環紫杉烷類。 本發明之方法可使該物質中之特定紫杉烷之純度增加約 10% 至 20%、20%至 30°/。、30%至 40%、40% 至 50%、50% 至 60%、60%至 70%、70%至 80%、80% 至 90%、90%至 1 〇〇〇/〇、 100%至 1 10%、1 10%至 120%、120%至 130%、130%至 U0%、 92029.doc -24- 1339130 140%至 150%、150。/。至 200%、200% 至 25 0% ' 250% 至 3 00%、 300〇/〇 至 350%、350%至 400%、400%至 450%、45 0%至 5 00%、 500°/。至 550%、550%至 600°/。、600%至 650%、650%至 700%、 700°/。至 750%、750%至 800%、800% 至 850%、850%至 900%、 9000/。至950%、950%至1〇〇〇〇/0。本文中所使用之術語純度意 指在乾燥形式之物質中所存在的一種或多種紫杉烷化合物 的重量百分比。 本發明之一實施例涉及使用PBS樹脂來製備級地分離紫 杉烧化合物’包括太平洋紫杉醇，製備性分離可以分仳' 半連續或連續模式進行。半連續及連續模式可為模擬移動 床（SMB)層析之形式。 在另一實施例f ’本發明包括使用PBS樹脂來執行藉由液 相層析法之分離a在一該類實施例中’液相層析分離之流 動相中使用了少量的駿或鹽改質劑《流動相中所使用的酸 或鹽改質劑可包括（但不限於）乙酸、蟻酸、乙酸銨或甲酸銨。 PBS樹脂可以正相模式運行，且其展示對紫杉烷類的獨特 選擇性。對於標準類型之層析法而言，在c_18及矽土上， 其它紫杉烷類均可在太平洋紫杉醇之前與之後進行溶離。 在PBS樹脂之正相層析法申，大多數結構相似的其它紫杉烷 類係在太平洋紫杉醇之前進行溶離以提供製備性分離中的 簡易性。在最常見的紫杉烷類中，1 〇_去乙醞基紫杉醇係在 太平洋紫杉醇之後於PBS樹脂上進行溶離。幸運的，1〇_去 乙醯基紫杉醇之極大延長的保留時間允許製備性系統上的 輕鬆分離。此係重要的，因為1〇_去乙醞基紫杉醇為半合成 92029.doc -25- 1339130 製備中的重要副産物 之天然提取物中。 八亦#見於紫杉所有種（Taxus spp) 較 毫 圖H)展示各種媒介上之保留時間與紫杉烷標準物之比 。在圖 1 〇 令’靠 1 表示 Phen~- Syne妒μ Hydro__ 米（25〇χ4·6毫米）HPLC管柱：以h5毫升/分鐘乙猜/水样度

溶離（40% 至 60% ACN 經45分鐘）。腳註2表示Amicon

Si-100-10sp(250 X 4‘6 毫米）HPLC營刼·望 a，— a W ^ s往·専度溶離，60。/。乙酸乙 酯/40%己烷及1,〇毫升/分鐘。腳+ 本_ 七丨刀理聊5主3表不J. T. Baker® Wide-P〇re PEI 的 5 微米（250 χ 4.6 毫米）HPcr# . 、，！ Λ + 笔不柱·以lo毫升/分鐘8〇% 乙酸乙醋/20%己⑦（具有0.5%乙酸）等度溶離。腳註*表示上丁 Bake成 Wide-Pore DEAM的 5微米（25〇 χ 4 j 毫米）Hpcc管柱以 1.0毫升/分鐘乙酸乙醋（具有〇5%乙酸）等度溶離。腳註5表 不皁一注入紫杉烷標準物之混合物的保留時間。腳註6表示 相對於太平洋紫杉醇的保留時間。腳註7表示三次注入單一 紫杉烧標準物之平均時間。 PEI鍵結樹脂展示了類似的對紫杉烷類之選擇性但是— 些紫杉烷類仍以非常接近於太平洋紫杉醇的溶離程度進行 =離（例如’丨0-去乙醯基_7_表_紫杉醇，參見圖1〇)。化學改 貝形式之PEI(例如’ DEAM)保留了同樣的選擇性模型 (pan⑽），且其展示出太平洋紫杉醇與其最接近的溶紫杉院 類的更大分離。 PBS樹脂具有對紫杉烧類之高親和力。如圖1G所見，約 6〇%乙酸乙酯及約侧己院之混合物足以在合理的時間内 自矽土溶離太平洋紫杉醇。在-些情形下，PEI需要與更強 92029.doc -26- 1339130 的溶劑混合：例如，約79.75%乙酸乙酯，1 9.75%己烷及0.5% 乙酸。DE AM對太平洋紫杉醇之親和力強於PEI，此需要約 99.5°/。乙酸乙酯及約0.5%乙酸之混合物作為其流動相。與 PEI及DE AM—起使用之更強的溶劑系統更大程度地溶解紫 杉烷類，從而允許更高的裝載量。 在一些變體中，使用聚乙烯亞胺-鍵結矽土樹脂自紫杉烷 類之混合物（例如，紫杉屬提取物）或半合成或總合成紫杉烷 反應混合物分離包括太平洋紫杉醇之各種紫杉烷類。在以 下申請案中描述了用於製造包含太平洋紫杉醇的半合成紫 杉烷混合物之適宜方法及組合物：於2002年8月4曰申請第 6 0/401，191號申請案（'191申請案）；2003年4月5曰申請的 PCT/US03/10557 ； 2003 年 2 月 4 日申請標題為 ’’Method and Compositions for Preparing a Pharmaceutical Compound (e.g., Paclitaxel or other Taxanes) Using a Benzoylating Agent Essentially Free of Ring Chlorination"的第60/444,847號美國臨時申請案。每一此等申 請案均以全文引用的方式併入本文中。 在一替代實施例中，本發明之方法包含下列步驟中之一 個或多個步驟：（i)以適量PBS樹脂來裝填管柱；（ii)採用有 機溶劑來平衡管柱，該有機溶劑較佳為含有乙酸之丙酮； (iii)將紫杉屬提取物之混合物或半合成或總合成反應混合 物裝載至管柱上；（iv)採用有機溶劑來溶離混合物，該有機 溶劑較佳為丙酮/乙酸；（v)將溶離液收集為一份或多份溶離 份；（vi)確認一份或多份溶離份中所要紫杉烷的存在；及（vii) 藉由結晶來純化所要紫杉烷。 92029.doc -27 - 1339130 根據一替代實施例’使含有紫杉烷之物質經受正相液相 層析（"NPLC ’’）以純化粗提取物或半純化提取物中所含有之 紫杉醇及其它紫杉烷類。通常檢查若干變量以藉由液相層 析法達成分離及纯化，該等變量包括管柱裝填（例如，固定 相或吸收劑）、溶離劑（例如，流動相）之組成、管柱尺寸及 溶離劑流速.此等變量已為熟悉此項技術者所熟知，或不 需要過多的實驗便可容易地確定。 層析官柱之尺寸以及溫度、流速及層析分離之時間並不 是實踐本發明之關鍵，且其主要基於熟悉此項技術者所熟 坤的或不需要過多的實驗便可容易確定之有效層析之要 求。 在—替代實施例中，半合成太平洋紫杉醇的層析純化可 使用具有0.5。/。乙酸之乙酸乙酯作為流動相而在DEAM樹脂 (20微米球狀，100 A)上實現。分離之進度可藉由適當吸收 波長（較佳為254奈米及280奈米）處的紫外線（uv)吸光率來 n。收集溶離份中之太平洋紫杉醇的峰。收集若干溶離 份（通常為2份或3份）之峰的上升部分（自基線至頂峰）。最早 的此等溶離份將含有大部分的7 ·表-紫杉醇及1 0 -去乙醯基 -7-表-紫杉醇雜質。收集一份或多份溶離份中之峰的剩餘部 分。可採用分級梯度之50:50的曱醇與具有〇5%乙酸的乙酸 乙酯之混合物自管柱溶離丨〇_去乙醯基紫杉醇。 在—替代實施例令，為了操作的簡潔性及容易性，剩餘 雜質之分級梯度溶離較使用線性梯度佳。利用線性梯度需 要更複雜的整套設備《使用預混合溶劑系統的分級梯^溶 92029.doc -28- 離可藉由改變將流動相供應至果的單—間來實現。在另— 替=貫施例令’較佳延遲將甲醇導入至流動相系統，因為 ;2：的甲醇會加快稍後的溶離雜 ,, 杉醇)之溶離。 貝(例…去本甲酿基紫 在-替代實施例中’本發明之液相層析系統較佳以製備 核式（大於100毫克量）進行使用。製備管柱之直徑通常為7 以至·毫米’且其長度為10公分至⑽公分。熟悉層析 技術村容易地選擇具有適宜於正被純化之物質的量之床 尺寸的管柱。根據各種因素來調整流動相之流速，包括管 柱尺寸、樹脂之粒子大小及孔徑大小以及所要峰之解析 度。製備管柱的典型流速在自10毫升/分鐘至4公升/分鐘的 範圍内。 層析運行過程所需的時間在自約10分鐘至約30分鐘的範 圍内。層析分離之溫度通常為周圍溫度，但亦可使用稱高 的溫度。 田根據本發明貫踐層析分離時，管柱可在通常為10至 P.s.i.g的低壓（LPLC)至中壓（MPLC)模式下操作。其亦可在 通常為500至2000 p.s.i,g的高壓模式（HpLC)下運行。 在另一貫％例中，可在裝載至管柱之前溶解紫杉屬提取 物之足合物或半合成或總合成反應混合物。例如，可使用 有機溶劑或藉由熟悉此項技術者已知的其它方法來溶解該 混合物°較佳的有機溶劑混合物包含丙酮/乙酸。接著，可 將浴解後的混合物裝載至裝填有適當量PBS樹脂的管柱上。 可藉由參考層析法之標準慣例來選擇適用於本發明之溶 92Q29.doc •29- 溶離劑）。通常’可使用適度的極性有機溶劑作為溶離 劑，例如丙嗣 '乙酸乙醋、四氨七南或乙猜。亦可使用含 :丨-5個碳原子之其它嗣類、醚類及酯類。若混合物含有愈 夕的極性紫杉烷類，則溶離劑之改質劑可包括愈多的極性 溶劑（例如，低碳數醇類、乙酸）及水，且若混合物含有愈少 的極性紫龍類，則溶離劑之改f劑亦可包括愈少的極性 有機各劑，{列如院烴及經鹵化之煙類。視待純化之昆合物 的性質而定，改質劑之百分比可為0_100%。此百分比可由 熟悉此項技術者很容易確定。 在另一實施例中，可將紫杉屬提取物之混合物或粗反應 混合物溶解於包含乙酸乙酯/THF的有機溶劑中以形成紫杉 烷溶液。在溫和加熱的同時攪拌紫杉烷溶液，並接著進行 真空過遽以移除其中的雜質與碎片。 粗紫杉烷溶液亦可稀釋於有機溶劑中，該有機溶劑較佳 為EtOAc/THF溶液。可將溶液注入及/或裝載至含有適當量 PBS樹脂的管柱上。可採用有機溶劑來預先平衡管柱，該有 機洛劑杈佳為EtOAc/乙酸。在將紫杉烷溶液注入/裝載至管 柱上之後，可將EtOAc注入管柱内。經溶離之物質可收集成 多份溶離份。可使用包含甲醇/Et〇Ac混合溶劑之分級梯 度。自官柱溶離所要紫杉烷，並接著收集成一份或多份溶 離份。可使用洗滌步驟。 在一些情況下，最好使用分級梯度或連續梯度之梯度溶 劑系統。梯度之濃度界限由以下因素決定：（1)自吸收劑溶 離紫杉烷類所必須的有機溶液之濃度；及（2)在溶離紫杉烷 92029.doc -30- 1339130 類所需之濃度下，有機溶劑可完全混合並以一 相存在的 要求。例如’最初可使用100%乙酸乙酯，接著 仕早—步驟、 夕個步驟或連續梯度式樣中切換為丨_10%甲醇。該么 Λ i統對於 分離各種極性大體上不相同的紫杉烷類而言係必須的， 其不難由熟悉此項技術者確定。 一份或多份溶離份中所要紫杉烷之存在可藉由使用此項 技術中已知之分析技術來偵測，例如薄層色譜法（丁Lc)、紅 外（IR)光譜技術、核磁共振（NMR)光譜技術、高效能液相色 譜法（HPLC)、逆相HPLC及質譜測定技術（⑽）。 自管柱收集到所要紫杉烷（類）之後，視終産物紫杉烷分子 或紫杉烷混合物之所要純度，可使用其它層析方法或結晶 及/或一次或多次再結晶來進一步對其進行純化。結晶及再 結晶可藉由使用二元或三元溶劑系統（亦即，至少一種增溶 溶劑及至少一種抗溶劑）來進行其中，增溶溶劑之實例包 括丙酮、甲基第三丁醚、二氣甲烷、THF、曱醇、乙醇、 異丙醇及乙腈。抗溶劑之實例包括烴類溶劑（例如，己烷及 庚院）及水。在大多數情況下’增溶溶劑及抗溶劑可按使用 比率混合。其中’與紫杉烧分子一起使用的溶劑系統之實 例包括丙酮/己炫及曱醇/水。 圖1及2展示使用本發明之pbs樹脂（例如DE AM)之示範性 化學反應流程圖。具體而言，其展示將紫杉烷醯胺轉換為 太平洋紫杉醇或其它紫杉烷類並使用PBS樹脂自反應産物 純化紫杉烷之半合成製程。將紫杉烷醯胺轉換為太平洋紫 杉醇或其它紫杉烷類之方法展示於本文先前所陳述的專利 92029.doc -31 - 1339130 申請案中。 、在摇述了適於本發明之特定層析技術及條件後，下文描 、〔捃據本毛明之單離、分離及純化紫杉烷衍生物之較佳實 施例。 實例 以下所包括之貫例僅為達成說明之目的，且並不希望將 本發明之範嚀限制於（例如）任何特定步驟或成份。 實例1 该實例展不在自半純化之丹斯佛米斯曼地亞紫杉提取物 純化紫杉醇A(太平洋紫杉醇）及紫杉醇B(三尖杉寧鹼）中使 用PEI樹脂。此處’ 75公升之管柱裝填有24 5千克的】τ. Baker PET樹脂（40微米的粒子大小，275埃的孔徑大小，J. τ. Baker Item #7264)。採用2倍管柱體積（即，150公升）之含有 0.5%乙酸的丙酮以3.2公升/分鐘之流速來平衡樹脂。接著， 將半純化之紫杉屬提取物原料以丙酮中約2 5 〇毫克/毫升之 濃度及〇_5公升/分鐘之速率裝載至管柱上。紫杉醇之濃度為 2.5重量％或每100克PEI樹脂2.5克原料固體。原料固體中紫 杉醇A與紫杉醇B之重量百分比為1〇.8重量％。採用含有 0.5¾乙酸的丙嗣以3.2公升/分鐘之流迷（表觀速度=4.4公 分/分鐘）來溶離原料。總共收集到10份溶離份。溶離份1及 溶離份10為75公升（1管柱體積），且溶離份2-9各為19公升 (1 /4管柱體積）。産物溶離份2-5含有原料中之紫杉醇A & B 總量的87_96°/〇 ’且經組合之産物溶離份的重量百分比為 5 8·59°/。。此産物足以藉由結晶來進一步純化。 92029.doc 1339130 實例2 該實例展示在自半純化短葉紫杉提取物中所發現之雜質 中純化紫杉醇A(太平洋紫杉醇）、紫杉醇B(三尖杉寧鹼）及 紫杉醇C中使用PEI樹脂。此處，將半純化的短葉紫杉提取 物之固體原料溶解於含有0.6%乙酸的丙酮中。將此溶液裝 載至J.T. Baker PEI樹脂（40微米的粒子大小，275埃的孔徑 大小’ J. T. Bakerltem#7264)之上。原料負載為3〇/〇或每1〇〇 克PEI樹脂3克原料固體。溶離溶劑為含有〇 6%乙酸之丙 酮。隨著原料組份自管柱溶離，收集大約每1/2〇th管柱體積 之樣品。藉由HPLC來分析此等溶離份，並將數據繪製成如 圖3所不之曲線。此操作展示將紫杉醇A、6及c與雜質分離。 實例3 該實例說明在半合成粗紫杉醇A(太平洋紫杉醇）純化中 使用DEAM樹脂。此處’在半合成或總合成製程中用作反應 物之分子係衍生自除短葉紫杉外之紫杉屬植物。在該實例 中，所使用的儀器為波長設定為254奈米之HitacM l_74〇〇 UV偵測器與N〇vaPrep 200製備型高效能液相色譜儀系統之 組合。此等兩個單^均直接連接至操作LCg?應控制器軟體 -2.11.V版本（R&s Technology, lnc.)的 pC介面。 該管柱為 Load & L〇ck 2 "製備 sLC 管柱（R&S Tech^〇gies， Inc./vanan)’其具有下列尺寸：内徑=5公分；長度=25公分； 體積=490.87立方公分。該管柱裝填有二乙胺基甲基 (DEAM)鍵結石夕谬：,求形，粒子大小為2〇微米，平均孔徑大 小為120埃。該管柱裝填有270克壓縮至800 psi的樹脂。 92029.doc -33· 1339130 藉由標題為”C〇nversion of Taxane M〇丨，，的美國申 請案第PCT/US03/10557號中所描述之_級胺轉換化學法來 製備共7‘1克的粗紫杉醇A。使用約35毫升的包含9〇%(體積） 乙酸乙酯/10%(體積）四氫呋喃的溶劑來溶解該粗紫杉醇。 在溫和加熱（〜3 5-40°C )的同時攪拌該溶液3 〇分鐘。真空過 濾澄清溶液以在注入前移除所有細小纖維或顆粒。過濾之 後’將浴液轉移至量筒’並使用9(hi〇之Et〇Ac/THF溶液將 其稀釋至42.5毫升的最終體積（6χ稀釋接著，在取樣之前 重新混合以確保均一性。該運行過程之裝載量為2 625%或 每100克DEAM樹脂2.625克原料固體。流速設定為9〇毫升/ 刀在里。採用由Et〇Ac + 〇.50/〇乙酸（ν/ν)組成之標準流動相來平 衡該管柱20分鐘。到20分鐘標記時，將整個體積的先前製 備之樣品溶液注入於管柱上，接著立即用Et〇Ac沖洗至2〇 毫升注入線。以下列方式收集溶離份（所列出的所有時間均 以注入點-時間〇開始）： 表2 溶離份 開始 結束 總時間 太平洋紫杉酵 之面積％ 太平洋紫杉醇 之質量(mg) 1. 6:15 15:00 8:45 10.37 ΪΖ2 ~ 2. 15:00 15:15 0:15 74.95 964 - 15:15 16:30 Γ 1:15 95.43 99^0 - 4. 16:30 29:00 Γ 12:30 99.25 4284.6 5. 29:00 35:15 Γ 6:15 100.00 555.3 — 總計 5943.4 mg 5〇%分級梯度在29分鐘標記處（亦即，自注入點-時間〇起） 開始，其由50:5〇甲醇/乙酸乙酯洗滌溶劑流動相組成。至該 運行過程完成總共運行了 20分鐘。該洗滌步驟允許在紫杉 92029.doc -34 - 1339130 醇A之後 >谷離的1 〇 _去乙酿基紫杉醇a化合物更快溶離。一旦 UV偵測器記錄到表示1 〇_去乙醯基紫杉醇a溶離的吸光率 迅速增大’就關閉最後一個溶離份收集閥（亦即溶離份5)。 在上述情形下’所有的10-去乙醯基紫杉醇A均在1 〇分鐘内 流出管柱。然而，為了確保管柱已清除完所有殘餘物質且 按照習慣做法’洗滌步驟總是要進行完整的2〇分鐘。因此， 自注入點至完整的管柱洗務步驟的整個運行過程為49分 鐘。圖4展示了顯示溶離份1 _5的收集點之色譜迹線。 在通道池（pass pool)中組合溶離份3、4及5以進行隨後的 結晶工作。通過的溶離份之溶離份分析（藉由HPLC)共給定 5.835克紫杉醇A。除以所有溶離份之紫杉醇的總質量後， 汁具所得的回收率為9 8 · 1 8 %。流至管柱上的粗物質之純度 為87.9重量％紫杉醇且在管柱純化之後，通過的組合溶離份 之純度為98.71 %面積（藉由HPLC)紫杉醇A。 實例4 44公升管柱裝填有1〇千克的j.t. Baker PEI樹脂（粒子大 小為40微米’孔徑大小為275埃）。採用3倍管柱體積（即135 公升）之含有0.5%乙酸的50 v°/〇/50 v°/〇乙酸乙酯及庚烷以1 〇 公升/分鐘的流速來平衡該樹脂。剩餘溶離份之流速為1 .〇 公升/分。將半純化之原料（衍生自，朗安’曼地亞紫杉）以乙酸 乙酯中250毫克/毫升的濃度裝載至管柱上。原料之初級紫 杉烷類之純度為57重量％。首先，第一溶離份為170公升的 含有0.5 v%乙酸之50 v%/50 v°/。乙酸乙酯與庚烷。其次，收 集三份10公升的含有0.5 v%乙酸之50 v%/50 V%乙酸乙酯與 92029.doc -35- 丄: 、元的/合離伤。接著’産物溶離份為9〇公升的⑽v%/1 〇 v〇/〇 乙酸乙醋與甲醇。最後’以45公升的90ν%/Ι0ν%乙酸乙醋 /甲醇來洗條該官柱。產物池含有93 5重量％的初級紫杉炫 類'。紫杉醇Α與Β之回收百分比為95%。 在整個指述中’將本發明描述為具有、包括或包含特定 組份’或將方法指述為具有、包括或包含特定製程步驟， 預』本發明巾基本上由或由所敍述之組份或處王里步驟組 成。、另外，應瞭解：只要本發明仍具可操作性，步驟之順 序或執订特定措施之順序就不重要。而且，只要本發明仍 /、可操作/1，兩個或兩個以上步驟或措施可同時進行。同 樣的’只要本發明仍具可操作性，一或多個步驟或要素可 在本發明省略’或在缺少本文中未具體揭示之任何組份或 步驟下’適當地實踐本文中所描述之本發明。 另外，可在不脫離本發明之精神或本質特徵前提下以其 匕特疋形式來實施本發明。因此’前述實施例應被視為是 說明本文中所描述之本發明，而不是限制本發明。 本文中所參考的每—專利及非專利文獻之内容均以全文 引用的方式明白地併入本文中。 【圖式簡單說明】 圖1展不一使用本發明之層析樹脂的示範性化學反應流 程圖； 圖2展不一使用本發明之層析樹脂的示範性化學反應流 程圖； 圖展示使用本發明之pE丨樹脂自紫杉醇bc及其它雜質 92029.doc 1339130 分離紫杉醇A ; 圖4展示使用本發明之deaM樹脂分離主人丄 仔—, 卞5成紫杉醇A盥 其它紫杉烷副產物； 〃 圖5展示非限制性紫杉烷分子； 圖6展示非限制性的示範化合物（"初級紫杉燒類”）. 圖7-9展示非限制性的示範紫杉烷分子； 圖I 〇展示各種媒介之伴留卩生 ’、夺間與紫杉院標準物的比較。

92029.doc '37.

Claims (1)

1339130 拾、申請專利範圍： 1.—種自含有紫杉烷之混合物單離一種或多種紫杉烷類之 方法，該方法包含以下步驟： (a) 採用PBS樹脂來處理該混合物，其令該或該等紫杉烧 類係衍生自一種或多種紫杉屬（Taxus)植物，其中該或 該等紫杉烷類並非僅衍生自短葉紫杉（Taxus brevifolia)； (b) 採用溶離劑自該pBS樹脂溶離該或該等紫杉烷類；及 (e)回收經溶離之該或該等紫杉烷類。 2· 一種自含有紫杉烷之混合物單離一種或多種紫杉烷類之 方法，該方法包含下列步驟： (a) 採用PBS樹脂來處理該昆合物，其中該混合物包含以 重量計小於25%或大於40%的初級紫杉烷類； (b) 自該PBS樹脂溶離該或該等紫杉烷類；及 (c) 回收經溶離之該或該等紫杉烷類。 3· 一種用於單離一種或多種紫杉烷類之方法，該方法包含 下列步驟： (a) 採用PBS樹脂來處理含有紫杉烷之混合物，其令該混 合物包含以重量計約25%至40%的初級紫杉烷類，其中 該或該荨紫杉坑類並非僅衍生自短葉紫杉； (b) 自該PBS樹脂溶離該或該等紫杉院類；及 (c) 回收經溶離之該或該等紫杉烷類。 4. 一種自包含紫杉烷化合物之物質單離一種或多種紫杉烷 類的方法，其中該等紫杉烷化合物係由一半合成製程或 92029 doc 總合成製程獲得，該方法包含下列步驟： (a) 採用PBS樹脂來處理該物質，其中在該半合成製程或 總合成製程中用作反應物之分子並非僅衍生自短葉紫 杉； (b) 自該PBS樹脂溶離該或該等紫杉烷類；及 (c) 回收經溶離之該或該等紫杉烷類。 5. 一種自包含紫杉烷化合物之物質單離一種或多種紫杉院 類的方法’其中該等紫杉烷化合物係由—半合成製程或 總合成製程獲得，該方法包含下列步驟： (a) 採用PBS樹脂來處理該物質，其中該物質包含以重量 計少於約8%的經組合之紫杉醇A、B、c、D、E、F或 G之C-2’苯曱酸酯； (b) 溶離該或該等紫杉烷類；及 (c) 回收經溶離之該或該等紫杉烷類。 6. 一種自包含紫杉烷化合物之物質單離一種或多種紫杉烧 類的方法’其令該等紫杉烷化合物係由—半合成製程或 總合成製程獲得，該方法包含下列步驟： (a) 採用PBS樹脂來處理該物質，其中該物質包含以重量 計少於1.0%的經組合之紫杉醇B、c、D、E、F或G之 C-21笨甲酸酯； (b) 溶離該或該等紫杉烷類；及 (c) 回收經溶離之該或該等紫杉烷類。 7. 一種自含有天然衍生紫杉院之昆合物單離紫杉醇a之方 法’該方法包含下列步驟： 92029.doc p39130 (a) 採用PBS樹脂來處理該紫杉烷混合物； (b) 自該PBS樹脂溶離該紫杉醇A ;及 (c)回收經溶離之該紫杉醇A。 8 · —種自生物量提取物純化一種或多種紫杉烷類之方法， 該方法包含下列步驟： (a) 藉由除層析法之外的方法來製備該生物量提取物； (b) 採用P B S樹脂來處理該生物量提取物； (c) 自該PBS樹脂溶離該或該等紫杉烷類；及

(d) 回收經溶離之該或該等紫杉烷類。 9.如申請專利範圍第N3項中任一項之方法，其中含有紫杉 烷之該物質包含衍生自曼地亞紫杉（Taxus medu)栽培品 種之生物量提取物。 A如申請專利範圍第W項中任—項之方法，其中含有紫杉 院之該物貝包含衍生自"希克西（HieksH)"曼地亞紫杉之 生物量提取物。

U.如申請專利範圍第卜3項中任一項之方法，其中含有紫杉 烧之該物質包含衍生自"暗綠色斯布蘭德⑽比“ Spreader)"曼地亞紫杉之生物量提取物。 如申°月專利祀圍第1 -3項中任一項之方法，其中含有紫杉 炫之該物質包含衍+ 自水果备、杉（Taxus baccuta)之生物 量提取物。 13.如申請專利範圍第η項中任_項之方法，其 ,、 - 丫 丟发 杉炫:之物質包合h 4 A ± ' 自東北冬、杉（Taxus cuspidate)之 量提取物。 92029.doc 14.1339130 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. &中請專利範圍第 $中 弟1-3項宁任一項之方法，其中含有紫杉 烧之該物蜇$L 3竹生自佛羅里達紫杉（Taxus floridana)之 生物量提取物。 如申叫專利範圍筻]ug φ杯 ^ 第N3項中任一項之方法，其中含有紫杉 烷之。玄物質包含衍生自加拿大紫杉(Taxus C_dens〖s)之 生物量提取物。 如申叫專利乾圍第1 _3項中任-項之方法，其中含有紫杉 炫之該物質包含衍生自瓦氏紫杉（TaXUS wallichiana)之生 物量提取物》 如申請專利範圍第1-3項中任-項之方法，其中含有紫杉 炫之該物f包含衍生自雲南紫杉（Taxus yimna隱sis)之 生物量提取物。 如申請專利項中任—項之方法，其中含有紫杉 炫之該物質包含衍生自中國紫杉（TaXUS —s)之生物 量提取物。 如申請專利範圍第N3項t任-項之方法，其_含有紫杉 烷之該物質包含衍生自"丹斯佛米斯（Densif〇rm丨s),，曼地 亞紫杉之生物量提取物。 如申請專利範圍第1-3項中任一項之方法，其中含有紫杉 烷之該物質包含衍生自，，布朗尼（Br〇wnii)"曼地亞紫杉之 生物量提取物。 如申請專利範圍第1_3項中任一項之方法，其中含有紫杉 烷之該物質包含衍生自"希克西"曼地亞紫杉之生物量提 取物。 92029.doc 1339130 22 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 如申5月專利範圍第1 _3項中任一項之方法，其中含有紫杉 烷之該物質包含衍生自”朗安（Runyan)"曼地亞紫杉之生 物量提取物。 如申請專利範圍第1-3項中任一項之方法，其甲含有紫杉 烷之該物質包含衍生自"沃地（Wardn)"曼地亞紫杉之生物 量提取物。 如申咕專利範圍第丨_3項中任一項之方法其中含有紫杉 烷之該物質包含衍生自"套托尼（Taut〇nii)”曼地亞紫杉之 生物量提取物。 如申請專利範圍第4·6項中任—項之方法，其中待單離之 該紫杉烷係紫杉醇A » 如申請專利範圍第4,中任—項之方法，其中待單離之 έ亥紫杉烧係紫杉醇B。 如申π專利id圍第4·6項中任-項之方法，其中待單離之 該紫杉烷係紫杉醇C。 如申請專利範圍第4·6項中任—項之方法，其中待單離之 該紫杉烷係紫杉醇D。 如申請專利範圍第4·6項中任-項之方法，其中 離之 該紫杉烷係紫杉醇Ε。 如申請專利範圍第4·6項中任—項之方法，其中待單離之 該紫杉烷係紫杉醇F。 如申請專利範圍第4,6項中任-項之方法，其中待單離之 該紫杉烷係紫杉醇G。 如申請專利範圍S 4-6項中任-項之方法，其中待單離之 92029 doc 該紫杉烷係多西紫杉醇。 33. 如申請專利範圍第W項中任-項之方法，其中該PBS樹 脂具有自約60至約300埃單位範圍内之平均孔徑大小。 34. 如申請專利範圍第U t 乐8項宁任一項之方法，其中該PBS樹 脂具有自約100至約200埃單位範圍内之平均孔徑大小。 35. 如申請專利範圍 項中任一項之方法，其中該PBS樹 脂具有約120埃單位之平均孔徑大小。 3 6.如申清專利範圍第丨_ 8項中杯 t 罘8項中任一項之方法，其申該PBS樹 脂具有自約0.25至約微米範圍内之平均粒子大小。 37. 如申請專利範圍第1_8項中一 t Τ 1項之方法，其中該PBS樹 月曰具有自1至⑽微米範圍内之平均粒子大小。 38. 如申請專利範圍第1 Τ 項之方法，其中該PBS樹 脂具有自約Π)至約120微米範圍内之平均粒子大小。 3 9 ‘如申請專利範圍第1 一 ^ Τ 項之方法，其中該PBS樹 脂具有自約20至約6〇微米範圍内之平均粒子大小。 40. 如申請專利範圍第1 T任項之方法，其中該PBS樹 脂具有約40微米之平均粒子大小。 41. 如申請專利範圍第丨_8項 $文·方法，其中該PBS樹 脂為DEAM。 42. 如申請專利範圍第丨_8項中 脂為PEh 項之方法，其中該PBS樹 43. 如申請專利範圍第丨_8項中任_ $ <方法，其中該PBS樹 脂具有自約6〇至約_埃單位範圍内之平均孔徑大小。 44. 如申請專利範圍第丨_8項中任一 $之方法，其中該pBS樹 92029.doc •6· 1339130 脂在聚乙烯亞胺部分上具有一級或二級胺基β 45. 如申請專利範圍第1 _8項中任一項之方法其中該pH聚合 物之胺基係經官能化。 46. 如申請專利範圍第4_6項中任一項之方法其中經溶離之 該或該等紫杉烷類具有至少約7〇%的純度。 47. 如申凊專利範圍第4_6項中任一項之方法，其中經溶離之 該或該等紫杉烷類具有至少約8〇%的純度。 48. 如。申凊專利範圍第心6項中任一項之方法，其令經溶離之 該或該等紫杉烷類具有至少約90%的純度。 92029.doc