TWI301853B - - Google Patents
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- TWI301853B TWI301853B TW95144871A TW95144871A TWI301853B TW I301853 B TWI301853 B TW I301853B TW 95144871 A TW95144871 A TW 95144871A TW 95144871 A TW95144871 A TW 95144871A TW I301853 B TWI301853 B TW I301853B
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4301853 九、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 本發明係一種鑑定番茄斑點萎凋病毒屬(〜”⑽卜心 • genus )之西瓜銀斑病毒血清群病毒(WSM〇V_ser〇group tospovimses)之融合瘤細胞株、其單株抗體、其製備方法 與其應用。 【先前技術】 _ 番蘇斑點萎凋病毒屬()為布尼亞病毒科 (如family )中唯一感染植物之一屬(genus), 該科之其他屬病毒皆為感染人、畜、禽等動物之病原,具 有脂質外套膜的球型病毒顆粒内含三條負極性或雙極性之 基因體RNA,由於病毒顆粒極不穩定且遺傳變異性大,因 此病毒蛋白產物純化不易且研究工作難以進行。番茄斑點 萎凋病毒群(t〇Sp〇viruses)由薊馬(thrips)以永續性的 方式傳播,分佈遍及全球,可感染至少超過82科9〇〇多 • 種(SpecieS)單子葉與雙子葉植物,並危害多種重要經濟 作物,為一全球重要性的植物病原病毒,因而受到國際間 學者的重視。 ’ 本發明有雲於東南亞地區屬熱帶、亞熱帶氣候,相當 適合薊馬生長而成為t〇Sp0viruses的溫床,西瓜銀斑病毒 (心⑽㈣/⑽卿"仏vz>WiS,WSM〇v)血清群為番蘇 斑點萎凋病毒屬中最大病毒群之一,亦為該地區最主要的 病毒種類。目前該血清群病毒已發表者有台灣的wsm〇v ,1301853 孝筹> 色海于黃化斑點病毒(Caiia Hiy chl〇r〇tic spot virus, CSV)、印度的7匕生與西瓜頂芽壞痕病毒(户泛⑽w v/rws,PBNV 及 Watermelon bud necrosis virus, WBNV)、以及澳洲、泰國的甜椒黃化病毒 chlorosis virus,CaCV)等。 此外,由於國際交通便利,各國之間的農產品交易頻 繁’谷易將境外病毒或媒介昆蟲輸入,農產品防檢疫工作 甚為重要’因此,發展快速、精確的檢測系統將有助於了 解本土病毒的分布與危害情形、監控境外病毒的入侵與發 生等’以提升農作產業之國際競爭力。 【發明内容】 目前檢測tospoviruses時,乃以其大量表現的核鞘蛋 白(nucleocapsid protein)做為抗原,以製備高專一性的抗 體,但抗體僅侷限於單一病毒反應,而僅適合做為病毒鑑 疋之用。而本發明乃改以tospoviruses的非結構性]sfSs蛋 白(nonstructural protein)之高保留性區域(c〇nserved regi〇n) 做為抗原,用以製備具尚度血清群專一性之抗血清與單株 抗體,可與有血清群關係的病毒反應,因此相當適合用於 大規模田間檢測或病毒親緣關係研究。 此外,由於tospoviruses極不穩定且其蛋白產物純化 不易,而原核細胞的細菌表現系統又缺乏蛋白修飾的機 制,因此,本發明改以人工建構之植物病毒載體表現系統 於植物細胞中大量表現NSs蛋白,再以親和性層析管柱純 化方法將表現的NSs蛋白萃取出來,此技術有別於傳統自 J301853 筛選可產生抗該免疫抗原之單株抗體。 較佳地,其中NSs蛋白係經由基因選殖之方法,而獲 得NSs蛋白之cDNA後,將eDNA構築在病毒載體上後, 進入至真核細胞中生產NSs蛋白。 較佳地’其中該真核細胞係指植物細胞。 較佳地,其中該病毒載體係為矮南瓜黃化嵌紋病毒 (Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)氧後。 較佳地,其中將NSs蛋白之cDNA構築在ZYMV載體 後,其表現之NSs蛋白於c端上具有六個組胺酸(histidine) 構成之標誌(tag)。 在本發明另一較佳具體事實中,本發明提供一種檢測 番茄斑點萎凋病毒屬之WSMoV血清群病毒之方法,係包 括下列步驟: 提供檢體; 使檢體與上述之單株抗體接觸;以及 藉由免疫分析法檢測,當免疫分析法呈現正相反應 (positive)時,表示待測物為受番茄斑點萎凋病毒屬之 WSMoV血清群病毒感染;當免疫分析法呈現負相反應 (negative)時,表示待測物為未受番茄斑點萎凋病毒屬^ WSMoV血清群病毒感染。 較佳地,其中該免疫分析法為免疫擴散法、酵素連結 免疫吸附法、墨點免疫分析法、組織轉印免疫分析法、螢 光免疫法或免疫電顯法。 由於tospoviruses危害許多重要經濟作物且分佈遍及 ^1301853 全球,其中的WSMoV血清群之病毒主要分佈於東南亞地 區’造成嚴重的危害,因此利用本發明之檢測方法及套組, 將可快速且方便的檢測出WSMoV血清群之病毒,而協助 檢測人員了解病毒的分布與危害情形、監控境外病毒的入 侵與發生等。 【實施方式】 WSMoV為台灣瓜類作物栽培的主要限制因子之一, 除了核鞘蛋白之外,此病毒之其他蛋白皆難於自罹病植物 組織中純化,故利用基因選殖方法將其NSs蛋白基因增幅 出來,再構築於ZYMV載體的P1和HC_Pr〇基因之間, 所表現的NSs蛋白C端具有六個組胺酸所構成的標誌與一 段NIa蛋白質裂解酶的辨識序列,有助於表現蛋白的游離 與純化。利用Ni2+-NTA親和性層析管柱將游離態的NSs 蛋白純化出來,再以蛋白質電泳進一步分離純化之,即可 得到高純度的NSs蛋白。將所得的NSs蛋白免疫注射於紐 西蘭白兔與小白鼠體内,分別用以製備抗血清及單株抗 體。抗血清與WSMoV血清群中的WSMoV反應良好,與 CaCV有微弱的反應,而與CCSV則無任何血清反應。反 之’單株抗體則與WSMoV、CaCV及CCSV皆反應良好。 利用ZYMV載體表現一系列的缺失NSs蛋白可得知第89_ 125個胺基酸的區域為單株抗體的辨識位置,其中第ι〇8 個cysteine (C)和第109個lysine (K)扮演重要的角色。 序列比對後發現,此單株抗體辨識區域具有一段高度保留 的序列,即位於NSs蛋白第98-120個胺基酸的位置,序 10 1301853
列為 VRKPGVKNTGCKFTMHNQIFNPN (命名為 WNSscon, 胺基酸 SEQ ID No· 19),分別與 wSMoV、CaCV、CCSV 和PBNV具有86-100%的相同度。以人工合成高保留性區 域胺基酸SEQ ID No. 19可與NSs之單株抗體反應良好, 證實此高保留性區域確實含有單株抗體的結合序列。由此 可知,本發明之單株抗體具有高度的親緣專一性,可與 WSMoV血清群之病毒反應良好,而NSs蛋白為植物防禦 反應基因沉寂的抑制子,亦具有研究植物防禦反應與病毒 間交互關係之學術價值。 本說明書之「免疫抗原」係指能夠引起動物體内產生 免疫反應之物質。 本說明書之「套組」係進一步包括有固相支撐物與訊 諕生成物;其中固相支撐物係可為:微孔盤、微膠粒、微 球體、膜紙、玻璃、矽晶片、金屬或陶瓷物;纟中訊號生 成物可^放射㈣質、酵素、填光物質、狂素、生物 素或螢光物質。 」係為植物組織萃取液或是植物細 本說明書之「檢體 胞溶液,較佳地該植物組織係指葉。
事實及申請專利範圍。 實例 下列實施例用於示範說明本發明。這此 何方式意欲限制本發明之範圍, 這些實施例不以任 但用於指示如何實施本發 Γ301853 明的材料及方法。 實施例 1 ·病毒來源與培養: 1 · 1 西瓜銀斑病毒(fTaierme/ow Wrws, WSMoV)分離自台灣之西瓜50。 1 · 2彩色海芋董化斑點病秦(CaUa lily chlorotic spot Wrw,CCSV)分離自台灣之彩色海芋5。 1 · 3 甜椒黃化病毒(Capicwm c/z/orosb Wrws,CaCV) φ 來自美國21。 1 · 4 番茄斑點萎凋病毒, TSWV-NY)分離自紐約之番茄,由 R· Provvidenti,New York State Experiment Station,Geneva 提供 ° 1 · 5 花生輪斑病毒办wi r/ngspoi v/rws,GRSV) 分離自巴西受到感染之番茄,由D. Gonsalves提供39。 1 · 6鳳仙花壞疫斑點病毒似加crohc χροί Wrw,INSV-M)分離自美國之鳳仙花,由J· Moyer提供3G。 參 1·7花生黃化扇斑病毒(戶^⑽wi c/z/oroi/c
Wrws,PCFV),分離自台灣之花生9〇 1 · 8所有病毒皆接種於於草(Wcoiia/ia feewi/zamz·训α Domin·)中與奎藜(C/z⑼ope?山’wm Willd·);由錄南瓜 黃化嵌紋病毒(Zwcc/zzW Wrws,ZYMV)分 離之TW-TN3接種在矮南瓜與(CwcwrHia L.)與奎 藜。 其中,上述之WSMoV、CCSV與CaCV為WSMoV血 12 1301853 清群病毒24 ’38。 2 ·生產WSMoV之NSs蛋白之方法 2 · 1表現NSs蛋白之方法 利用弓1子 WNSs67KS (核苷酸 SEQ ID No.l )與 WNSsl383ck (核苷酸 SEQ ID No· 2)將 WSMoV 之 S RNA 上NSs開放讀碼區(open reading frame,ORF)藉由反轉錄 聚合酶連鎖反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)進行增幅,再利用 TOPO ΤΑ cloning kit 春 (Invitrogen,Carlsbad,CA),接入至 pCR2.1-TOPO 載體中, 而得到pTOPO-WNSs質體。與NSs開放讀碼區相應之DNA 片段係利用限制酶與尤/^1由pTOPO_WNSs切下後, 再接合至ZYMV之重組載體(p35SZYMVGFPhis6,18)上,而 得到p35SZWSMoV-NSs。利用 mini-prep方法將帶有NSs 開放讀碼區之ZYMV重組體分離出來後,溶解在TE緩衝 液(含10 mM HC1與1 mM EDTA,pH為8)中,並機械 接種在奎藜葉上與矮南瓜子葉6中。利用Ultraspec RNA _ 分離系統(Biotex Laboratories,Houston,TX )將有病徵 之植株葉中萃取總RNA,並利用引子WNSs67KS (核苷酸 SEQ ID No.l )與 WNSsl3 83ck (核苷酸 SEQ ID No· 2)進 行痛認並將PCR產物利用電泳進行分析。 2 · 2純化NSs蛋白之方法
利用親合性層析法自受到感染之矮南瓜葉中純化出 NSs蛋白12。秤取5〇克受到感染之矮南瓜葉片,置於含有 1〇0 niL 緩衝液 A (含有 50 mM Tris-HCl,pH 為 8,15 mM 13 1301853
MgCl2,10 mM KCM,20%(v/v) glycerol,0.05%硫基乙醇 (β-mercaptoethanol)與 0·1 mM 苯甲基石黃醜氟 (phenyl methyl sulphonyl fluoride,PMSF)之研磨機中研磨 後,於3,000 x g下離心10分鐘,收集上清液且以不織布 濾過。收集濾液後,以1% Triton X-100於4°C處理30分 鐘,再於30,000 X g下離心30分鐘,並收集懸浮液通過0.45 μηι濾膜。於收集之濾液中添加1 mL已預先與緩衝溶液B (50 mM Tris_HCl,pH 為 8.2,15 mM MgCl2,10 mM KC1, 20%(v/v) glycerol,0.05% p_mercaptoethanol 與 0.1 mM PMSF)平衡之Ni2+-NTA resin後,於4°C輕微震盪1小時 並注入管柱中。當膠體沉澱後,丟棄未被結合的物質,再 以2倍體積之含有5 mM味峻(imidazole)之緩衝溶液B沖 洗。將接合在膠體上之蛋白質以 10 mL含有250 mM imidazole緩衝溶液B沖洗,進一步跑蛋白質膠體電泳純化 49。每一個純化步驟的成分(fraction)利用單株抗體MAb-His ( Amersham Pharmacia Biotech , Buckinghamshire, England )與組胺酸標誌、(His-tag )結合以西方印潰法檢測。 純化NSs蛋白的含量係以含有組胺酸標誌之綠色螢光蛋白 (GFP )做為對照標準,且利用單株抗體MAb-His以西方 印潰法檢測,以及以聚丙醯氨凝膠電泳(SDS_PAGE )以 牛血清(BSA)做為對照,以及以Software Spot Density of Alphlnnotech IS2000 ( Alpha Innotech Corporation, San Leandro,CA)儀器分析。 3·生產兔子抗血清之方法 Γ301853 生產兔子抗血清之方法,係將ZYMV表現之NSs蛋白 經過純化後注入紐西蘭白兔中49。將NSs蛋白與等體積之 Freund’s完全佐劑一起乳化後進行兔子之皮下注射。接著, 將1 mL含有1〇〇 yg免疫抗原(imrnun〇gen)之磷酸緩衝 溶液與等體積之Freund,s不完全佐劑一起乳化後每個禮拜 注射一次,注射三次,從第四次注射後連續兩個月每個禮 拜抽血一次。 4·生產老鼠單株抗體與腹水之方法 將250 kL含有50 由上述方式獲得之NSs蛋白之鱗 酸緩衝液與等體積之Freund’s完全佐劑乳化,以腹腔注射 進入6至8星期之母鼠(B ALA/cByJ)體内,相同含量之免 疫抗原與等體積之Freund’s不完全佐劑一起乳化後,連續 兩個禮拜每週一次腹腔注射。當老鼠追加注射25〇 含有 50 pg NSs蛋白之磷酸緩衝溶液而不含有佐劑之三天後解 剖取其脾臟細胞,將獲得之脾臟細胞與F〇x_NY骨髓瘤細 胞(American Type CuUure c〇Uecti〇n,仏刪咖,VA2〇i〇8) 進行融合m。經過融合後,將細胞培養在含6%二氧化碳之 37°C培養箱中,利用粗萃取感染有WSM〇v之菸草植物葉 子之間接型酵素連接抗體免疫吸附方法(Indirect eusa ) 篩選,接下來利用限數稀釋法獲得單一融合瘤細胞,經過 三次之轉殖以獲得穩定之細胞株,再於老鼠腹中注入ι〇ό 之融合瘤細胞以產生腹水。 5 ·西方印潰方法 蛋白質的表現與純化、NSs蛋白含量的評估與病毒之 15 Γ301853 法15。粗萃取受到 a卒取受到t〇spoViruses感
檢測係利用西方印潰方法 染之菸草葉子後,利用公 疗液(100 mM Tris_HCl,pH 0.005%漠紛藍(bromophenol 籲病毒’以會與wsmgV „蛋白結合之含有融合瘤細胞株 134B1A8所分泌之單株抗體之腹水,以及會與ccsy核鞘 蛋白結合之含有融合瘤細胞株335F9E7所分泌之單株抗體 之腹水’檢測WSMoV核鞘蛋白或是CCSV核鞘蛋白證 明tospoviruses之存在。以鹼性磷酸脂酶標記—抗兔免疫 球蛋白G與驗性磷酸脂酶標記—抗鼠免疫球蛋白〇稀釋2 X 10 4分別做為偵測兔子與老鼠抗體之二次抗體,且添加呈 色物(將硝基四氮嗤藍鹽(nitro_bluetetrazolium) /5-漠-4·氣引 11 木填酉夂對曱本胺鹽(5-bromo-4-chloro-3indolyl phosphate paratoluidine salt)溶於含有 100 mM NaC卜 5 mM MgCl2與100 mM Tris-HCl,pH為9·5之緩衝液中)使其 呈色。 6 ·間接型酵素連接抗體免疫吸附方法 係依照葉等人49之方法,稀釋100倍受到WSMoV感 染之菸草或是20倍受到ZYMV重組病毒感染之矮南瓜做 為被覆(coating)抗原。稀釋一半之細胞培養液做為篩選生 ♦1301853 產抗體之融合瘤細胞。從1〇-3以10倍系列稀釋兔子之抗 血清或老鼠之腹水做為力價(titer)測定。將鹼性磷酸脂酶 標記一抗鼠免疫球蛋白G與驗性填酸脂酶標記一抗兔免疫 球蛋白G稀釋2 X 10_4做為二次抗體,再添加完鹼性磷酸 脂酶基質後10至40分鐘,以儀器ELx800微量盤測讀儀 於波長405 nm下進行判讀。 7 ·單株抗體之抗原決定位測定 將pTOPO_WNSs做為模板以PCR放大將不同之NSs 鲁蛋白開放讀碼區相應之DNA片段,用來放大之引子如表 一所示,PCR之步驟為於94°C下30秒進行變性作用,於58°C 下30秒進行黏合作用,於72°C下1分鐘進行合成,且循 環30次,最後於72°C下進行7分鐘。再以TOPO TA cloning kit (Invitrogen)將放大之DNA片段黏合於pCR2.1-TOPO載 體,進行定序確認序列正確無誤。利用限制酶办/2 I與^^ I 將DNA片段從PCR2.1-TOPO切下後,再接合至ZYMV載 體中,如陳等人6與許等人18所述。 # 表一 NSs開放讀碼區上不同之DNA片段所使用之引 子 引子名稱(SEQID 序列· 限制酶切位 SRNA之位置b ZYMV嵌合醴
No.)_
Up stream PI WNSs67KS(l) 5、GGGTACCGCATGCATGTCTACTGCAAAGAATGCTGCT-3, Sphl 67-90 ZWSMoV-NSs, ZWNSsN, ZWNSsNM, ZWNSsNC, ZWNSsA89-125 P2 WNSs331KS(2) 5.-GGCATGCTTCTGCGAGCATGAAATGAACTTAATT-3, 5,-GGGCATGCGGTGTGAAGAACACAGGCTGCAAGTTC.3, Sph\ 331-357 ZWNSs89 P3 WNSs370S(3) Sphl 370-396 ZWNSsl02 P4 WNSs379S(4) 5,-GGGCATGCAACACAGGCTGCAAGTTCACAATGC-3, Sphl 379-403 ZWNSsl05 P5 WNSs382S(5) 5,-GGGCATGCACAGGCTGCAAGTTCACAATGCACA-3, Sphl 382-406 ZWNSsl06 P6 WNSs388S(6) 5,-GGGCATGCTGCAAGTTCACAATGCACAATC:AAATC-3, Sphl 388-414 ZWNSsl08 P7 WNSs394S(7) 5,-GGGCATGCTTCACAATGCACAATCAAATCTTTA-3, Sphl 394-418 ZWNSsllO P8 WNSs397S(8) 5,-GGGCATGCACAATGCACAATCAAATCTTTAATC-3, Sphl 397-421 ZWNSslll 17 Γ301853 株抗體進行反應。將合成的WNSscon (SEQ ID No.l)胜肽 也注射至紐西蘭白兔(New Zealand white rabbit)中而用 於生產抗血清。將前述方法產生之抗血清稀釋l〇·2後分別 與受到to spo viruses感染之於草於西方印潰法上進行反應。 1 0 ·結果 1 〇 · 1 ZYMV重組病毒於矮南瓜植物中表現WSMoV 之NSs蛋白
將構築有WSMoV NSs開放讀碼區之ZYMV之cDNA • 稱為 p3 5SZWSMoV-NSs。此 p3 5SZWSMoV-NSs 質體所誘 發表現之重組病毒ZWSMoV-NSs可於奎藜葉上誘發典型單 斑,且在矮南瓜植物中接種14天後造成組織之黃化嵌紋 與葉子之扭曲變形(如第一圖A所示),將受到感染之葉 子中萃取獲得之總RNA做為模板,以WNSs67KS與 WNSsl383ck做為引子進行RT-PCR,確認ZWSMoV_NS之 NSs之開放讀碼區之DNA片段大小為1.3 kb (如第一圖B 所示)。將表現出之NSs蛋白利用單株抗體MAb-His以西 • 方印潰法檢測,結果顯示具有組胺酸標誌之NSs蛋白分子 量為52.2 kDa,較原本之NSs蛋白49.7kDa分子量大(如第 一圖C),且利用兔子之抗血清於西方印潰法上偵測到 ZYMV之鞘蛋白(如第一圖D)。 1 0 · 2蛋白質之純化 從受到ZYMV感染之矮南瓜葉組織中,用單株抗體 MAb-His以西方印潰法分析每一個純化步驟獲得之NSs蛋 白。利用MAb-His鑑定52.2 kDa蛋白質是由ZYMV表現 19 1301853 之NSs蛋白(如第二圖),且獲得微量之較大分子 斷之蛋白質,該蛋白質應為NSs蛋白(52 2 k )、
的 HC-Pr〇 蛋白(52lkD、s 蛋白(52.2kDa)與 ZYMV a)之融合蛋白質。經過Ni2+-NTA 親^層析管柱與蛋白質電泳而獲得大量<购 鼻出母1。。克之矮南瓜組織中獲得47、之购蛋白Z 1Q · 3抗體生產
NSs蛋白做為生產兔子抗血清與老鼠單株抗體之免疫 抗原’從免疫的兔子中獲取抗血清,藉由EUSA測定其稀 釋終點為1G.5 ’且使用1()·3做為研究之稀釋濃度。 此外利用限制稀釋法獲得數個融合瘤細胞株,其中 株WNSs239FlA8 (係|存於食品工業發展研究所,寄存 編號為BCRC 960280 ),將融合瘤細胞注入老鼠之腹腔中 而生成腹水’腹水之稀釋終點皆I 1〇·8,以1〇.5做為試驗 之稀釋濃度。 10·4兔子的抗血清與老鼠腹水之血清反應 兔子的抗血清與經過WSMov感染之菸草與奎藜葉中 粗萃取之NSs蛋白有強烈反應,與經過CaCV感染之樣品 有些微反應,但是與 TSWV、GRSV、INSV、CCSV、PCFV 與ZYMV TW_TN3沒有反應(第三圖A)。此外,於間接 型酵素連接抗體免疫吸附法中,於405 nm之波長下讀取 吸收值,WSMoV為2.14,CaCV為〇·93,分別高於對照組
(0.25) 8.4 倍與 3·7 倍,但是 TSWV、GRSV、INSV、CCSV 與PCFV之平均為〇·24至0.29,而與對照組無顯著差異(第 三圖Β)。 20 •1301853 由篩選出之融合瘤細胞產生之腹水會與各自以 WSMoV、CaCV與CCSV感染之菸草與奎藜葉中粗萃取之 NSs蛋白有反應,但是與TSWV、GRSV、INSV、PCFV與 ZYMV TW-TN3沒有反應(如第三圖C ),此外,於間接 型酵素連接抗體免疫吸附法中,以單株抗體WNSs239FlA8 (寄存編號為BCRC 960280 )為例,分別與WSMoV、CaCV 以及CCSV之抗原,於405 nm之波長下吸收值為1.84、1.27 與0.85,係高於對照組(0.14) 13.2倍、9·1倍與6.1倍, _ 但是與 TSWV ( 0.12) 、GRSV(0.13) 、INSV(0.12)以 及PCFV( 0·13 )無顯著差異(第三圖D)。為測試tospoviruses 之一致性與存在,係利用對於WSMoV與CCSV之核鞘蛋 白具有專一性之單株抗體以西方印潰法檢測。結果顯示單 株抗體134B1A8鑑定出含有WSMoV與CaCV(第三圖E), 以及單株抗體335F9E7鑑定出含有CCSV (第三圖F)。 由上述結果顯示,所獲得之單株抗體對於WSMoV、 CaCV與CCSV之NSs蛋白皆具有相同的辨識區,但是兔 # 子之抗血清卻對CCSV之NSs蛋白沒有反應,是因為IgG 於NSs蛋白之辨識區與單株抗體不相同。 10·5單株抗體辨識區之決定 將WSMoV之NSs開放讀碼區上不同之DNA片段插 入ZYMV載體中而表現多種有缺失之NSs蛋白,其中所使 用之引子係如表一所示,在第四圖中,表示不同缺失之NSs 開放讀碼區的表現區域與單株抗體WNSs239FlA8 (寄存 編號為BCRC 960280 )以及單株抗體MAb-His的反應,其 21 •1301853 中N端區域(第1至157胺基酸),中間區域(第126至 291胺基酸),C端區域(第260至439胺基酸),N端 區域至中間區域(第1至291胺基酸),中間區域至C端 區域(第126至439胺基酸)以及將N端區域(第1至157 胺基酸)與C端區域(第260至439胺基酸)接合在一起, 而分別以代號 ZWNSsN、ZWNSsM、ZWNSsC、ZWNSsNM、 ZWNSsMC 以及 ZWNSsNC表示,結果顯示單株抗體 WNSs239FlA8 係與 ZWNSsNM 以及 ZWNSsNC 有反應,而 不與 ZWNSsN、ZWNSsM、ZWNSsC、ZWNSsNM 以及 ZWNSsMC有反應,因此單株抗體之辨識區域位於NSs蛋 白之N端。因此,再於N端形成多種缺失,結果顯示 ZWNSsll4 (第 114 至 439 胺基酸),ZWNSslll (第 111 至439胺基酸)與ZWNSsllO (第110至439胺基酸)沒 有反應。然而,ZWNSsl08(第108至439胺基酸),ZWNSsl06 (第106至439胺基酸),ZWNSsl05 (第105至439胺 基酸),ZWNSsl02 (第 102 至 439 胺基酸)與 ZWNSs89 (第89至439胺基酸)皆有反應,此外,將WSMoV S RNA 之第67至330核苷酸與第442至1383核苷酸接合在一起 以ZWNSsA89_125表現第89至125胺基酸缺失之NSs蛋 白質,結果顯示可與單株抗體MAb-His反應,但是卻不與 單株抗體WNSs239FlA8 (寄存編號為BCRC 960280 )反 應,因此,抗原決定位係位於NSs蛋白之第89至125胺 基酸之位置,且第108個半胱胺酸(cysteine,C )與第109 個賴胺酸(lysine,K)扮演重要角色,由於第108個半胱 22 * 1301853 胺酸能形成雙硫鍵而能穩定蛋白質之空間型態或是與交聯 (cross-linkage )或是蛋白質間(protein-protein interaction)的作用有關,而第109個賴胺酸帶有正電而 能加強蛋白質間與核酸之鍵結。 1 0 · 6比較單株抗體之辨識區域與WSMoV血清群 病毒之關係
單株抗體之辨識區域為具有一保守序列SEQ ID No. 19 (VRKPGVKNTGCKFTMHNQIFNPN),而與 PBNV、CaCV • 以及CCSV分別具有95%、91%以及86%之相同度(如第 五圖所示)。 10·7單株抗體辨識區域之血清鑑定 合成23個胜肽後分別以西方印潰法分別與兔子之抗 血清以及單株抗體進測試,結果顯示本發明之單株抗體皆 與該胜肽反應,但是兔子之抗血清則否(如第六圖A)。 含有抗WNSscon胜肽(SEQ ID No.19)之兔子抗血清與 WSMoV、CaCV與CCSV之粗NSs抗原反應,但是不與 # TSWV、GRSV、INSV與PCFV反應(如第六圖B ),因此, 結果顯示tospoviruses之NSs蛋白在WSMoV血清群係具 有一 N端之保守序列。 根據本發明可做之不同修正及變化,對於熟習該項技 術者而言均顯然不會偏離本發明的範圍與精神。雖然本發 明已敘述特定的較佳具體事實,必需瞭解的是本發明不應 被不當地限制於該等特定具體事實上。事實上,在實施本 發明之已述模式方面,對於熟習該項技術者而言顯而易知
23 1301853 之不同修正亦被涵蓋於下列申請專利範圍之内。 【圖式簡單說明】 第一圖:A分別受到ZYMV重組病毒(ZWSMoV-NSs ) 與野生型ZYMV TW-TN3感染之葉子照片。B萃取感染葉 子中之總RNA,再經過rt-PCR後跑電泳之結果圖。C以 西方印 >貝法分析NSs蛋白之結果圖。d以西方印潰法偵測 到ZYMV之鞘蛋白之結果圖。 第二圖:利用單株抗體MAb-His以西方印潰法分析每 • 一個親合性層析之表現蛋白含量之結果圖。 第三圖:A利用兔子之抗血清以西方印潰法分析 tospoviruses之結果圖。b利用兔子之抗血清以間接型酵素 連接抗體免疫吸附方法分析tospoviruses之長條圖。C利 用老鼠之單株抗體(WNSs239FlA8 )以西方印潰法分析 tospoviruses之結果圖。D利用老鼠之單株抗體 (WNSs23 9Fl A )以間接型酵素連接抗體免疫吸附方法分 析tospoviruses之長條圖。E利用老鼠之單株抗體 鲁 (134B 1A8 )以西方印潰法分析tospoviruses之結果圖。;p 利用老鼠之單株抗體(335F9E7 )以西方印潰法分析 tospoviruses 之結果圖。 第四圖:NSs蛋白之抗原決定位圖示。 第五圖:WSMoV血清群之NSs蛋白之保留性序列。 第六圖:A利用兔子之NSs抗血清(R_ 74)與老鼠之單 株抗體(WNSS239F1A8 )以西方印潰法分析合成之 WNSscon。B利用兔子之NSs抗血清(R-74 )以西方印潰 24 1301853 法分析 tospoviruses 〇 【主要元件符號說明】 無
25 .1301853 參考資料 1. Arazi,T” Lee Huang,P·,Huang,P. L.,Zhang,L·,Moshe Shiboleth,Y” Gal-On, A., and Lee-Huang? S. 2002. Production of antiviral and antitumor proteins MAP30 and GAP31 in cucurbits using the plant virus vector ZYMV-AGII. Biochem. Biophys. Res. Commun. 292:441-448. 2. Arazi,T·,Slutsky,S· G·,Shiboleth,Y· M·,Wang,Y·,Rubinstein,M” Barak, S·,Yang,J·,and Gal-On,A. 2001. Engineering zucchini yellow mosaic potyvirus as a non-pathogenic vector for expression of heterologous proteins in cucurbits. J. Biotechnol. 87:67-82. 3. Bucher,E·,Sijen,T·,de Haan,P·,Goldbach,R” and Prins,M· 2003. Negative-strand tospoviruses and tenuiviruses carry a gene for a suppressor of gene silencing at analogous genomic positions. J. Virol. 77:1329-1336. 4. Chen, C.-C., Shy, J.-F.5 and Yeh? S.-D. 1990. Thrips transmission of Tomato spotted wilt virus from watermelon. Plant Prot. Bull. 32:331-332.
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< 170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 37
<212> DNA <213>人工序列 ❿ <220〉 <230〉引子 <400〉 1 gggtaccgca tgcatgtcta ctgcaaagaa tgctgct 37 <210> 2 <211> 34 第1頁 130185^
<212> DNA <213>人工序列 <220> <230>引子 <400> 2 ggcatgcttc tgcgagcatg aaatgaactt aatt <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213>人工序列 <400> 3 gggcatgcgg tgtgaagaac acaggctgca agttc
<210> 4 <211> 33 <212> DNA <213>人工序列 <220> <230〉引子 <400> 4 第2頁 •1301853 gggcatgcaa cacaggctgc aagttcacaa tgc 33 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213>人工序列 <220> <230>引子 <400〉 5 gggcatgcac aggctgcaag ttcacaatgc aca 33 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213>人工序列
<220> <230>引子 <400> 6 gggcatgctg caagttcaca atgcacaatc aaatc 35 <210> 7 <211> 33 第3頁 1301853 <212> DNA <213>人工序列 <220> <230>引子 <400〉 7 gggcatgctt cacaatgcac aatcaaatct tta <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213>人工序列 <220> <230>引子
<400> 8 gggcatgcac aatgcacaat caaatcttta ate <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213>人工序列 第4頁 ^301853 <220> <230>引子 <400〉 9 gggcatgcaa tcaaatcttt aatccaaatt ccaat 35
<210> 10 <211> 37 <212> DNA
<213>人工序列 <220> <230>引子 <400> 10 37 gggtaccgca tgcatgacgc ccggaacaat ttcagaa <210> 11 ® <211〉 37 <212> DNA <213>人工序列 <220> <230>引子 <400〉 11 第5頁 ΒΘ1853 gggtaccgca tgcgaagggg ctttcgcaag gactttc <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <230>引子 <400> 12 ggcctaggat gacgcccgga acaatttcag aag <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213>人工序列
<220> <230>引子 <400〉 13 gcctagggaa ggggctttcg caaggacttt c <210> 14 <211> 31 1301853 <212> DNA <213>人工序列 <220> <230>引子 <400〉 14 gggtaccgca ctcatccaaa caccatcccg a <210〉 15 <211> 31 <212〉DNA <213>人工序列 <220> <230>引子
<400〉 15 gggtaccctc attactgttg tcagcaacag t
<210> 16 <211> 31 <212> DNA <213>人工序列 1301853 <220> <230〉引子 <400〉 16 gggtaccttc tgctttcaca acaaagtgct g <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213>人工序列 <220> <230>引子 <400〉 17 ggcctaggtg ttatgtctag tccaaatttt tcaaa
<210〉 18 <211> 31 <212〉DNA <213>人工序列 <220> <230>引子 <400> 18
Claims (1)
- B01853 十、申請專利範圍: 1 · 一種用於檢測番茄斑點萎凋病毒屬之西瓜銀斑病 毒血清群病毒的抗血清,其係由下列步驟製得: 提供含有SEQ ID NO. 19的胺基酸序列之胜肽做為免 疫抗原; 將總量為50吨至1〇〇叫免疫抗原施打於動物體内進 行免疫反應數次;以及自該動物體内獲取抗血清。 2 .如申請寻利範圍第1項所述之抗血清,其中該免 疫抗原係為100 含有SEQ ID N〇 19的胺基酸序列之胜 肽施打於動物體内。 •如申請專利範圍第1項所述之抗血清,其中該免 疫抗原係與Freund’s之完全佐劑以等體積混合後,施打於 動物體内進行免疫反應一次。 4 .如申請專利範圍第3項所述之抗血清,其中該動 物體内經過—次免疫反應後,將該免疫抗原與Freund,s之 不兀王佐剤以等體積混合後,再施打於該動物體内二至三 次,且每個禮拜一次。 ^ . -種應用-種與含有SEQ ID Ν〇· 19的胺基酸序 列了之單株抗體以檢測番蘇斑點萎祠病毒屬之wsm〇V 血 群病毒之方法,係包括下列步驟: 提供檢體; 呈現正相反應 使檢體與所請之單株抗體接觸;以及 藉由免疫分析法檢測,當免疫分析法 ΒΘ1853 •修⑧錄換1 (positive)時,矣一 以“ ——一~ WSMoV血、、主群待測物為文番加斑點萎凋病毒屬之 ――時V病毒感染;當免疫分析法呈現負相反應 瓜钯斑、广± 不待測物為未受番茄斑點萎凋病毒屬之西 瓜銀斑病毒血清群病毒感染。 •如申請專利範圍第5頊所述之檢測方法,其中該 免疫刀析法為免疫擴散法、錄素連結免疫吸附法、墨點免 疫分析法、組織轉印免疫分析法、螢光免疫法或免疫電顯 十一、围式: 如次頁
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TW95144871A TW200823289A (en) | 2006-11-30 | 2006-11-30 | The monoclonal antibody of WSMoV-serogroup tospoviruses for identifying the Tospvirus genue, the preparation method, and the application thereof |
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TW95144871A TW200823289A (en) | 2006-11-30 | 2006-11-30 | The monoclonal antibody of WSMoV-serogroup tospoviruses for identifying the Tospvirus genue, the preparation method, and the application thereof |
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TWI504747B (zh) * | 2013-08-08 | 2015-10-21 | Nat Univ Chung Hsing | 真核生物表現系統及其應用 |
-
2006
- 2006-11-30 TW TW95144871A patent/TW200823289A/zh unknown
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