TWI284040B

TWI284040B - Herbal compositions for treating immunological disorders

Info

Publication number: TWI284040B
Application number: TW090128893A
Authority: TW
Inventors: Shuenn-Jyi Sheu; Ching-Shiang Shiu
Original assignee: Sun Ten Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2000-12-14
Filing date: 2001-11-20
Publication date: 2007-07-21
Also published as: US6383525B1

Description

1284040 A7 ___B7 _ 五、發明説明（1 ) 發明之領域本發明係關於新穎性草藥組成物及其應用於治療％ g 失調，尤其是I g E所仲介之疾病，包括，但不限於，過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、過敏性氣喘、異位性淫疼、異位性皮膚炎、食物過敏、I g E過高症候群及類風濕關節炎等方面的用途。本發明也涉及草藥組成物的製造方法及這些藥方的療法等。發明背景抗原引起的，尤其是過敏原引起的免疫失調，如氣喘等’是世界上已知的嚴重的健康疾患之一。過敏以各式各樣型態侵襲了世界上2 0 %以上的人群。近幾年來統計顯示，與過敏有關的免疫失調的發作已轉移到較年輕的族群，這表示有更多的小孩及青少年已有了過敏引起的免疫失調。譬如，在台灣小孩氣喘症的流行，自1 9.7 4年的 1 · 3%增加到1985年的5 · 07%及1991年的 5 · 8 %。又過敏性鼻炎自1 9 8 5年的7 · 8 4 %增加到1 9 9 1年的2 0 . 6 %。此外，異位性溼疹從 1974 年的 1.· 43%，1985 年的 1 . 23% 到 1 9 9 1年的3 · 8 4 %。咸認爲過敏免疫失調的早年發作可能是環境污染所致。呼吸道過敏症是一種免疫球蛋白E ( I g E )所彳中# 的一種反應〔參 Brinker登於自然療術期J·

Naturopathic Medieine; ( 1 9 9 3 ) 4 ·· 6 4 - 6 8 ) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 Φ, 經濟部智慧財i局員工消費合作社印製 -4- 1284040 A7 A7 B7 五、發明説明（2) 〕。呼吸道過敏反應，主要有兩型：立即過免反應’包括過敏性鼻炎（稻草熱）及過敏性（外因性）支氣管喘息’ 過敏性鼻炎是由抗原/ I g E結合於過敏化的肥大細胞及嗜鹼細胞上，造成環單磷酸核酸苷（c A M p )減少’而釋出嗜伊紅化學恆定因子及組織胺所引起的。組織胺結合在H i受體上會有很多結果。它會增進血管擴張，毛細血管通透性，及平滑肌收縮，表現出鼻塞流鼻水，打噴嚏，及眼睛癢的症狀。過敏性氣喘是一種I g E所媒介的免疫反應，由肥大細胞釋出組織胺，緩激肽，花生四烯酸的代謝物，包括特異反應的白三烯遲反應物質，以及血栓素/前列腺素等血管收縮物所造成。血小板激活因子是由一些白血球釋出的一種強力的氣喘發作介質。依這一種情況，組織胺在 c A Μ P減少後釋出，再作用於Η :受體上，以產生支氣管攣縮。這也與擬副交感神經反射作用，及半數的特異反應中前列腺素的產生有關。當罹患這些疾病的人的百分比及疾病的嚴重程度一直在上昇之際，當今的治療過敏的方法主要仍依靠經驗的及搜尋的發現，而不是靠科學的方法。目前，多數患者治療的藥物是針對控制效應器細胞釋出的介質所產生的症狀。雖然有些藥物，短時間內看來有效，且少副作用，但長期防止疾病的進展及永久破壞方面的效果，仍大部分不知道。例如，長期口服治劑，像類固醇治療，用於治療氣喘症時，現在已知與一些令人衰弱的副作用，如生長延遲，骨本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -5- 1284040 A7 ___B7___ 五、發明説明（3) 質疏鬆，及副腎抑制等有關。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 中草藥及醫藥組合物在改進免疫系統的功能及治療慢性免疫失調方面已爲人知。例如：濱崎（H a m a s a k i e t a丨）等人刊登於人種藥理學期干[丨(J. Ethnopharmacology )( 1997) 50: 123 — 131的文章，顯示中草藥辛脾湯（神秘湯），能抑止大鼠嗜鹼性白血病- 2 Η 3細胞中由I g Ε媒介的白三烯合成。神秘湯是一種經由冷凍乾燥的中草藥，由七種中草藥提煉而成，即麻黃，杏仁，厚朴，陳皮，甘草，柴胡及蘇葉。神秘湯對小孩氣息喘很有用。戶田等人（Toda et al )於人種藥理學期刊（」· Ethnopharmacology) (1988) 24: 303 - 309 ’發表柴朴湯，證實它能抑止小鼠腹膜肥大細胞釋出組織胺。柴朴湯含十種中草藥，即柴胡，半夏，茯苓，黃芩，大棗，人參，厚朴，蘇葉及生薑。李等人（Li et al)在免疫藥理學一書中（ Immunopharmacology) (1999) ，43: 11 — 21 經濟部智慧財產局員工消費合作社印紫指出補中益氣湯能恢復壓力引起的免疫抑制症。補中益氣湯含十味中草藥，即人參，白朮，黃耆，當歸，大棗，陳皮，柴胡，炙甘草，生薑及升麻。周等人（Zou et al)在中西醫學雜誌（1 9 9 6 ): 5 2 9 - 5 3 2中指出溫陽通絡合劑，可治療冷症氣喘。它能改善肺部通氣功能，調節周邊血液及淋巴的交感/3 -受體，及減少血淸中的5 -咀色胺的濃度。溫陽通絡合劑本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ297公釐） -6 - 1284040 Α7 Β7 五、發明説明（4) 含十一種中草藥，即紅參，製附片，淫羊藿，乾薑，製黃奢’當歸’麻黃，遠志，桑白皮，生石膏，五味子，炙甘草。另網路（www.herb.C〇m.tw)上公佈麥門冬湯，由六味中草藥組成：麥門冬，半夏，梗米，大棗，人參，甘草。可用於治療氣喘。中草藥的草藥品質控制很重要，因爲草藥的生長條件 ’收穫季節及炮製法等皆會影響其內容物及有效成分。若這些重要的條件或因素中的任一項，如產地，收穫季節，及炮製方法沒有符合時，中草藥的效力就會不同。迄今尙無報告顯示，有任何科學的方法，可用來監控中草藥的品質。本發明提供新穎而無毒的中草藥方，主要是從台灣及中國的草藥所製成者。這些中草藥合倂的用途，係文獻報告上則所未有的。這些藥方對治療免疫失調患者特別有效，尤其是I g E仲介的疾病。本發明的藥方，對白細胞介素4 ( interleukin 4 ) ( I L — 4 )的向下調節，及對 I g E的抑制，有特別效果。此外，本發明用薄層層析法 (T L C )及高效能液相層析法（Η P L C )，對方中每一味中藥作指紋分析，以有效控制其品質，並確保每一方藥所含的草藥皆一致且可重現的。發明的簡述本發明提供含有數種中草藥的藥方。藥方的主味藥爲本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部智慧財產局I工消費合作社印製 1284040 A7 B7 五、發明説明（7) 瀉白散，B .:小青龍湯，C :麥門冬湯，D :淸燥救肺湯，E :蘇子降氣湯，及F :安慰劑。圖7是投予中藥製劑後脾細I L 一 4基因表現圖。I L — 4基因是用RT — PCR (反轉錄酶一聚合酶連鎖反應）測得的。其値以中値土S EM來表示S E Μ。A :瀉白散，B :小青龍湯，C :麥門冬湯，D :淸燥救肺湯，E : 蘇子降氣湯，及F :安慰劑。*表示P<〇 · 05。圖8顯示經吸入D e r P 5，並施以各種草藥的小鼠血淸中I g G濃度。第一排表示治以麥門冬湯後的效果。第二排表示治以黨參後的效果，第三排表示半夏的治療效果，第四排表示甘草的治療效果，第五排表示安慰劑的療效。血淸中I g G濃度用E L I S A測定，其値以中値土S EM來表示S E Μ。圖9是經投予D e r P 5，再治以各種草藥或醫藥組成物（即S T A - 3 6 ，如下述）後的小鼠血淸I g e 値。第一排爲麥門冬療效，第二排爲黨參療效，第三排爲半夏療效，第四排爲生甘草療效，第五排爲s TA — 3 6 療效，第六排爲安慰劑療效。血淸I gG是用EL I SA 測定。其値以中値土SEM來表示S E Μ。圖1 0是小鼠脾細胞I L - 4基因在小鼠經投予 D e r P 5並治以各個草藥或醫藥組成物（即s 丁 A — 36 ，如下述）。IL 一 4的表現由RT—pCr (反轉錄酶-聚合酶連鎖反應）測定。第一排是麥門冬的療效，第二排是黨參的療效，第三排是半夏的療效，第四排是生本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公着） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) *1Τ

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -10- 1284040 A7 B7 五、發明説明（8) 甘草的療效，第五排是STA - 3 6的療效’第六排是安慰劑的療效。發明詳述本發明提供6個醫藥組成物（所謂S T A — 3系列的 STA — 3 1 〜STA — 36)。本 STA-3 系列的所有組成物，對免疫失調病，尤其是抑制I g E的產生及向下調節白細胞介素一 4 ( I L 一4)的合成，具有療效。抗原或過敏原媒介的氣喘症是一種呼吸道疾病，主要由慢性發炎所致。發炎的反應是經由細胞中發炎因子的釋出所引起，這個因子有血小板激活因子，組織胺，前列腺素及白三烯。發炎反應刺激了 T淋巴細胞（T細胞），尤其是C D 4 +細胞的抗原反應。C D 4 +細胞有二種。 T h 1型C D 4 +細胞分泌細胞素（I F N — r ) T h 2 型，過敏原刺激Th 2產生過多的I L 一 4，再引起B淋巴細胞產生及分泌I g E。 STA - 3 1〜STA - 3 6草藥組成物內容如表1 所示本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X29*7公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

'II 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -11 - 1284040 A7 ^__B7 五、發明説明（11) 麥門冬屬於百合科，其塊莖具有藥效。最佳採收期爲夏天，採收後，塊莖洗淨，去雜質及細根，再經日曬保存備用。麥門冬是根的膨大部分。麥門冬產於中國的浙江，四川’江蘇等省。余等人在中藥材期刊（China Journal of

Chinese Materia Medica) 1 6 ·· 5 8 4 〜5 8 5 中報導稱麥門冬水萃取物（浸膏）能加強小鼠排除靜脈中焦炭粒子，並拮抗clophosphamide引起的白血球缺乏症。黨參屬桔梗科，其藥效部分在根。黨參可由野生或栽培取得。黨參典型的採收季節爲秋季。採收後曬乾，切段備用。黨參在台灣南投縣及台中縣有產。花旗參屬五加科，其藥效部分在根。花旗參產於北美及加拿大。在法國及中國北方也有栽培。最佳採收季節爲秋天。半夏屬於天南星科，其塊莖具有藥效。半夏產於中國的四川，湖北，河南，貴州及安徽省。正常採收期在7月到9月之間。在台灣的台中縣也有。生甘草屬於豆科。其根及葡萄莖帶或不帶表皮，皆具有藥效。生甘草含2 · 5%以上的甘草酸（依乾燥藥材計算），可做爲生甘草的指標成分。生甘草生長在中國內蒙 ’甘肅，新疆，及東北部。最佳採收季節在春或秋季。在台灣的台中縣亦有生甘草。甘草的根具有消炎作用，可單獨使用，以助緩解氣喘症狀。參閱H.W.Morningstar的書 :^ 一個人及社群的另類變化（Sentient Times: Alternative for Personal and Community 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -14· 1284040 Α7 Β7 五、發明説明（14) (1 )所有藥材，除麥門冬外，依表3之量，切細，乾媒’硏末’過舖（通過4 0〜1 2 0目之餘子的粒度），做成粉末。 (2 )麥門冬照表3的量，浸置煎煮容器中，容器中加水到滿淹過藥材1 〇公分。泡浸水中的麥門冬，用9 7 〜1 0 3 °C溫度加熱6 0分，共加熱萃取2次，每次萃取液過濾（用約1 0 0目之篩子）。收集濾液，以5 0〜 6 0°C’在真空度爲4 0 0〜6 5 OmmHg的壓力下濃縮’以獲得需要濃度的流浸膏，其濃縮率最好是麥門冬滅液的1 / 1 4。 (3 )麥門冬濃縮液與其他藥材的粉末混合，混合物送到流動造粒機及用濾布做好的噴管中。造粒機設定在 9 0〜1 1 〇 °C預熱5分鐘後，混合物即開始造粒，每次噴霧時間約4 0〜5 5秒’噴到一定量後，噴布管即拍振，以振落粉末，其拍振頻率爲每1 〇秒一次。造粒後，顆粒經乾燥並冷卻，然後過篩，再包裝於聚乙烯（p E )袋中。顆粒的水分含量最好在6 %以下。顆粒可再充塡於任何種類的傳統膠囊中，包括天然明膠，果膠，酪蛋白，膠原，蛋白，修改的澱粉及聚乙烯吡咯烷酮（P V P )。例2 用高效能液相層析法（Η P L C )來管制S T A -3醫藥組成物的品質本發明用Η P L C來確保草藥的品質受到良好的管制。有三種Η P L C方法來配合每種草藥的化學及生理特性本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) Α4規格（210X29*7公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -17· 1284040 A7 B7 五、發明説明（id 。這三種方法分述如下。 (A ) Η P L c分析方法1 第一法使用前置管 Lichrospher R P — 1 8 ( endcapped) (5//ιώ，4·0 內徑乂1〇111111，默克製）及 Cosmosil 5C18— MS 管（5//m Nacalai tesque 5C18 - MS，4 · 6 內徑 x25〇mm)在室溫操作。管柱的移動相採梯度沖提，含（A ) Η 2〇： KH2PO4： 1〇%H3P〇4 (1000ml :2.72 g：lml；v/w/v) ( B ) C H 3 C N ； (C) H 2〇及（D ) C H 3〇H其梯度沖提程式如表4所示，流速爲1 · 0 m 1 / m i η檢測波長2 5 0 n m，分析的總滯留時間爲6 0分。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表4 方法1移動相的梯虔 ΐ沖提程式時間（分） (A)(%) (Β)(%) (〇)(%) (D)(%) 開始 90 10 0 0 30 7 5 25 0 0 40 65 35 0 0 55 0 75 25 0 60 0 10 90 0 後續沖提1 5 m i η (B)HPLC分析方法2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -18- 1284040 A7 B7 五、發明説明（β HPLC分析方法2，使用前置管Uchrospher RP 一 1 8 ( endcapped ) ( 5 // m，4 · 0 內徑 xl 〇mm， (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 默克製）及Cosmosil 5 C 1 8 — MS的管柱（5 μιη Nacalai tesque 5 C 1 8 — MS，4 · 6 內徑 x2 5 0 mm)，工作溫度3 5 °C其移動相採梯度沖提，含（A ) 1 0 m M KH2P〇4+l〇mM K 2 Η P Ο 4 + 〇· 〇1%HsP〇4 (KH2PO4 ： K2HPO4 ： 10

%H3P〇4 : H2〇=l · 36g : 1 . 74g : 1ml :1000ml) ( B ) C H 3 C N ； (C)H2〇&(D )C H 3 Ο H，其梯度沖提程式如表5所示。流出速爲 1 · 0 m 1 / m i η檢測波長2 6 0 n m，分析的總滯留時間爲3 5分。表5 方法2移動相的梯度 [沖提程式時間（分） (A) (B) (C) (D) 開始 100 0 0 0 25 60 0 20 20 30 20 0 20 60 35 1 00 0 0 0 後續沖提1 5 m i η 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (C ) Η P L C分析方法3 第3法用 Lichrospher RP - 18爲前置管及 Cosmosil 5C18— MS 的管柱（5"m，Nacalai 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） •19、 1284040 A7 •_________ B7_ 五、發明説明（17) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) tesque ’5C18— MS，4.6 內徑 X250mm)，工作溫度3 5 °C，移動相爲梯度沖提，含（A ) Η 2〇： KH2P〇4 (iQOQml : 2 · 72g，v/w) ( B )CH3CN;(C)H2〇及（D) CH3〇H，其梯度沖提程式如表6所示。流出速度爲1 · 〇 m 1 / m i n檢測波長2 0 3 n m，分析的總滯留時間爲6 0分。表6 方法3移動相的梯度沖提程式時間（分） (A) (B) (C) (D) 開始 80 20 0 0 40 65 35 0 0 55 0 80 20 0 60 0 20 80 0 後續沖提1 5 m i η 例3 STA—3醫藥組成物中之草藥成分的HPLC分析經濟部智慧財產局員工消費合作社印製對S T A - 3醫藥組成物中各草藥所作Η P L C分析，包括分析方法，主要指標成分，每味草藥的檢測波長，皆綜列於表7中。 S ΤΑ - 3醫藥組成物中各味草藥的HP L C層析圖譜則錄在於圖1〜5中。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210 X 297公釐） -20- 1284040 A7 _ B7 五、發明説明（1謔結果 : 麥門冬的Η P L C層析圖譜如圖1所示。如表7所載，用Η P L C分析法1 ，以2 1 4 n m波長檢測。在麥門冬的Η P L C圖譜上可辨認出二個明顯的波峰，6 1 1 5 一 1及6 1 1 5 — 2。6 1 1 5 — 1的滯留時間爲 11 · 5分，6115 - 2者爲13分，雖然此二波峰的化學成分未鑑定出來，它們可用來確保麥門冬的品質。半夏的HP L C層析圖譜如圖2所示。如表7所載，用Η P L C分析法2，以2 5 0 n m波長檢測，半夏有二個顯著指標成分，腺嘌玲及鳥苔（adenine及guanosine) ，二者皆爲核酸成分。腺嘌呤（adenine)有升高醛縮酶（ a 1 d ο 1 a s e )的效果。腺嘌呤的滯留時間爲 14 .8分，鳥苷者爲17分。生甘草的HPLC層析圖示於圖3。如表7所示，用 Η P L C分析法1 ，以2 5 0 n m波長檢測生甘草，在生甘草的HP L C層析圖中發現1個化學指標成分，甘草甜素（Glycyrrhizin)。甘草甜素（C42H62〇16)是一個很甜的物質，已知它具有解毒，消炎及溶血作用，並被用於治療愛迪生症。其滯留時間爲4 6 .4分。花旗參的HP LC層析圖示於圖4。如表7所示，使用Η P L C分析法3，在2 0 3 n m波長下檢測花旗參。在其Η P L C層析圖中發現一化學指標成分，人參皂苷 R b】。人參皂苷Rb 1對擴張血管，消除疲勞及避免溶血等有藥效。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇>< 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -22- 1284040 A7 __ B7 五、發明説明（21) (A )生甘草 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) T L C分析生甘草使用固定相爲附著於τ L C板上的矽膠60F254，移動相爲醋酸乙酯：4N氨水：乙醇 =4 : 1 : 2 ( v / v / v )。檢體點在T L C板後，把丁 L C板放入含移動相槽室內，溶媒的高度勿超過τ L C 板上施點檢體的水平線位置。讓溶媒後升到離原點9 c m 時，取出T L C板，並讓其在空氣中乾燥。乾燥後， T L C板噴以香莢蘭素/硫酸的試劑，並在1 〇 5 °C加熱 2分鐘，板上會在Rf約=〇·5的位置出現一黃色點，代表生甘草。R f =呈色點到施點檢體之點的距離/溶媒移動距離（即9 c m )。 (B )麥門冬經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 T L· C分析麥門冬使用固定相爲附著於τ L C板上的矽膠60F254，移動相爲正丁醇：4N氨水：乙醇= 5*2-1 (v/v/v)。施點檢體後，丁 L C板放入含移動相溶媒的TL C槽室內，其溶媒的高度勿超過 T L C板上施點檢體之原點位置。讓溶媒移升離原點達 9 c m時，取出T L C板，令其在空氣中乾燥後，將香莢蘭素/硫酸的試劑噴在T L C上，並以1 〇 5 加熱2分鐘。有一代表麥門冬的褐色點出現在R f = 〇 . 4位置。 (C )花旗參本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） "---- -24 _ 1284040 A7 B7 五、發明説明（23) (I gG)、免疫球蛋白E ( I gE)及白細胞介素4 (I L 一 4 )等的效用。麈蟎是家中灰塵中的蟎，它如同抗原會對有特異反應的人，造成過敏性氣喘的反應。此五種中草藥湯劑的組成列示於表8中。此五組成物對肺部有關的疾患如氣喘等有特別的功效。表8五種中草藥湯劑的組成中草藥湯劑名重量比組成瀉白散甘草2·25，桑白皮4·5，地骨皮4.5，粳米6 小青龍湯半夏4，麻黃4，芍藥4，薑1.5，甘草4，桂枝4，五味子1.5 麥門冬湯人參2，粳米4，半夏2，大棗2，甘草2，麥門冬8 淸燥救肺湯桑葉7·5 ’阿膠2，人參2，石膏6.5，甘草2.5，麥門冬3，杏仁2,胡麻仁2.5,枇杷葉2 蘇子降氣湯紫蘇子5，陳皮3，半夏5，當歸2，前胡2.5，甘草2，桂枝3 ，厚朴2，生薑2，大棗1 實驗之設計 (A )藥材製備上記中草藥湯劑（皆來自順天堂藥廠股份有限公司）每種各取50mg ，個別與18〇// 1的Twe en80 混合’予以均質化（使用台灣新光精機廠製之均質機D C 一 3 5型），加水至此均質體到2 m 1 ，即最終濃度2 5 mg/ml ，每隻小鼠投予每2〇公克體重〇·4毫升的一種中草藥方的溶液，隔天一次，共1 4天。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公餐）—-- -26- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1284040 Α7 Β7 五、發明説明（24) (B )動物雌性B A L B / C小鼠’ 4〜6周大，取自國立台灣大學動物飼養中心。動物的性別及年·齡要符合每一實驗。 (C )塵蟎過敏原D e I* P 5之純化

使用pGEX — 2T質體來表現大腸桿菌（E. coli) 的塵蟎抗原5 -谷胱苷肽S —轉移酶（GST)。融合蛋白的分子量約爲4 2 K D蛋白是用谷胱苷肽結合的瓊脂糖膠管柱層析法來純化。利用受轉殖（transfected )的大腸桿菌，培養在含Ampicillin ( 1 〇〇 // g/m 1 )的培養液中，來選取一個對塵蟎D e r P 5呈陽性反應的菌株的單一菌落（colony)。再培養此菌落使產生足量之塵蟎抗原（D e r P 5 — G S T )。然後收集細菌培養液並用離心分離之。去掉上淸液，菌體用TBS (pH7 · 5) 洗滌後收集於離心管中。在T B S沖開後隨即將〇 . 1 Μ 苯甲基磺醯氟加入菌液中，再加DNa s e I ， Tween 2 0，及溶菌酶（Lysozyme)。菌液利用冷凍再解凍程序來釋出塵蟎抗原（Dei: P5 - GST )蛋白。之後將E D T A切入細胞裂解液中，以離心方式分離細胞沉澱物，丟棄沉澱物，上淸液倒入谷胱苷肽結合的瓊脂糖膠吸附管柱中，此管柱吸附有塵蟎抗原D e r P 5 — G S T。管柱先用T B S緩衝液在4 0 °C下淸洗，再用含還原態的谷胱苷肽的T r 1 s — b a s e ( p Η 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21 ΟΧ 29*7公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -27- 1284040 A7 _____^B7_ , 五、發明説明（25) 8 · 〇 )淸洗，以將塵蟎抗原D e r P 5 — G S T從瓊脂糖膠粒中分離出來。塵蟎抗原De r P5 — GST的純度可用S D S — P A G E確認之。蛋白的量可用傳統的蛋白分析法量測之。 (D )動物之致敏化 B A L· B / c小鼠先予腹腔注射1 〇 // g的麈蟎抗原 (D e Γ Ρ5)及4mg的氫氧化鋁（衛氏藥廠）使之致敏化。第一次致敏後7天，除安慰劑組外，其他各組小鼠飼以中草藥方湯劑。第一次致敏後三週，小鼠再追加一次塵蟎抗原D e r P 5。在第2次追加注射後3天，將小鼠放置於圓形塑膠容器中，再用0 · 1 % D e r P 5以超音波噴霧式刺激之。每次追加注射後第2天，自每隻小鼠尾靜脈採血5 0 V 1 ’此血在室溫下靜置1小時，然後離心分離，血淸收集存於一 8 0 °C備供ELISA分析用（見下述）。 (E ) D e r P 5 —特異性I g G及I g E的測定· 測定D e r P 5 -特異性I g G及I g E的量是使用”酵素聯結免疫分析法” （E L I S A )。在對蛋白質有強吸附力的微滴盤上面，吸附以1 0 〇 // 1濃度爲5Mg / m 1 的純化 D e r P 5 ，（用 0 · 1 Μ Ν a Η C Ο 3 ’ ΡΗ8 · 2溶液稀釋）。吸附De r P5的微滴盤在本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -28- 1284040 Α7 ___Β7 五、發明説明（26) 4 °C溫度下培養一夜後，經沖洗三次後，以3 % ( w / ν 重量/容積）的B SA — PB S緩衝液於2 環境下塡 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

塞2小時。測定I g G時稀釋至1 : 1 〇〇，測定丨g E 時稀釋至1 ·· 1 〇。在4 °C培養，隔夜，加入結合生物素之大鼠抗-小鼠的I g E單株抗體，或大鼠抗一小鼠之 I gG單株抗體，這些抗體是稀釋於〇 · 〇5%的明膠緩衝液中的。這樣加一小時後，再加入抗生物素蛋白一鹼性磷酸酶（1: 1000)溶液，並再在25 °C下培養1小時；沖洗6次。呈色反應可於加入磷酸酶受質對位二氧化氮苯磷酸二鈉後產生。讀値可對照市售同型的標準品，也就是小鼠抗一 T N P抗體單株抗體，I g G 1 ( l〇7.3)，IgG2a (G155 — 178)，及 IgE(IgE — 3)。 (F)用RT - PCR (反轉錄酶一聚合酶鏈鎖反應）檢測脾細胞中I L 一 4的基因表現經濟部智慧財產局S工消費合作社印製在B A L B / c小鼠被致敏化及給予D e r P 5抗原刺激後，分別饌以表8所列五種方藥或安慰劑，再從小鼠分離出其脾細胞。脾細胞用D e r P 5 ( 1 5 // g / m 1 )培養4小時。用 Tridzol(Glbeo BRL，美國生命科技公司）抽取核糖核酸（R N A )。抽取的R N A是用來製造互補去氧核糖核酸（c D N A )(使用美國 Phamacia Biotech 公司製的 Ready to go T-prined First-strand Kit)。此cDNA是聚合酶鏈鎖反應（PCR)的本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐） -29 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1284040 A7 ___B7_ 五、發明説明（27) 模板（template )，使用一對具有下列排序的IL 一 4〜特異性引子，來做P C R放大及I L 一 4基因之檢測。 5’-GAATGTACCAGGAGCCATATC-3’（序歹ij 識 S!J 編號 1號）；及 5，-CTCAGTACTACGAGTAATCCA-3’ （序歹ij 識别J 編號 2 號）一對具有下示排序之Η P R T (次黃嘌呤氧化宿一鳥嘌呤-磷酸核糖轉化宿）一特異性之引子，用做P C R放大及Η P R Τ的檢測用。 5’-GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG-3，（序歹ij 識 g[] 編號3號）；及 5’-GATTCAACTTGCGCTCATCTTAGGC-3’ （序歹[j 識編號4號） P C R是在以下條件做的；在9 5 °C變性5分鐘，接下來用溫度循環機在9 5°C 1分鐘，7 2°C 1分鐘及5 5 °C 3分鐘循環3 5次。P C R產物在2 %瓊脂膠上做電泳分析。 (G )統計分析爲了評估在投予D e I* P 5後，D e r p 5 —特異性I g G，I g E及I L 一 4 / Η P R T比値的改變，必須重複量測A Ν〇V A，來比較各組間的差異。分析變異値（v a r i a n c e )後，用鄧肯多範圍測試法來區別實驗組及控制組間差異。以P < 0 · 0 5來表示統計上本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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的有顯著差異。結果 : (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 如圖6所示，在小鼠投予D e r P 5並餵以5種中草藥方後，其I g G及〗g E値與對照（安慰劑）組間，沒有明顯差別。E L S A的I g G單位在瀉白散組（a ) ，小青龍湯組（B )，麥門冬湯組（c )，淸燥救肺湯組 (D)，及蘇子降氣湯組（E)中分別爲7〇 · 9±42 ，62·5±44，63·3±44，63·3±43， 59 · 7±38 及 67 · 4±42。EL I SA 的 I gE 單位’在瀉白散組（A )，小青龍湯組（B )，麥門冬湯組（C )，淸燥救肺湯組（d )，及蘇子降氣湯組（E ) 中分別爲 99 · 3±23 ，1〇6 · 3±34 ，104 · 9 ±23 ， 105 · 7±23 ，93 · 9±2 1 及 97 · 8 土 19° 圖6中的結果顯示，五種中藥方湯劑，並不能抑制 I g E的產生。經濟部智慧財產A員工消費合作社印製圖7顯示，除麥門冬湯顯示對IL一4/HPRT比値有明顯降低外，其餘中草藥方湯劑，在抑制I L 一 4基因表現的產生方面，並無效果。例6 S T A — 3系列中各味草藥及S T A - 3 6組成物對過敏原所誘生之I g G、I g E及I L 一 4的效果利用BALB/c小鼠，以塵蟎抗原De r P5予本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -31 - 1284040 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（以致敏化，來硏究S Τ Α - 3系統中各味草藥，包括麥門冬、半夏，生甘草及黨參，以及S TA - 3 6組成物，對由抗原誘生之I gG、I gE及I L 一 4的效果。本例之實驗與例5者相同。結果· 經投以抗原D e r P 5，再餵以麥門冬、黨參，半夏及生甘草後的小鼠，其血淸中的I g G値如圖8所示。其結果表示由麥門冬、黨參及半夏治療的及由安慰劑治療的小白鼠血淸中I g G値，並無顯著不同。經生甘草治療後的I g G値，則較由安慰劑治療者顯著的低。然而如圖9所示，小白鼠經投以D e r p 5 ，再餵以麥門冬、黨參及S ΤΑ — 3 6組成物後，其血淸中的 I g Ε値，較安慰劑治療者顯著的低。事實上，經S T A 一 3 6治療後，I g E値降低2 · 5倍以上。經半夏及生甘草治療，I g E値與經安慰劑治療者沒有顯著不同。如圖1 0所示，小白鼠經投以D e r P 5 ，再各別餵以麥門冬、黨參，半夏及生甘草後，其脾細胞中的I L 一4基因表現（用RT—PCR測定，並以IL一4/ Η P R T比値表示之），與用安慰劑治療者，沒有顯著差別。但經治療以S Τ Α - 3 6後的I L 一 4基因比的表現卻比安慰劑治療者顯著的低，說明了 S Τ A — 3 6會向下調整I L 一 4基因的表現。細述本發明及參考較佳的具體例後，在不偏離如後附本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-32- 1284040 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（30) 申請專利範圍所定義之發明內容原則下，熟習此技藝人士將可輕易作出改變與修飾。列序表 < 11〇> 許淸祥許順吉 < 120> 治療免疫失調的草藥組成物 < 130 > 3321 1 -1 57867 < 140 > 無 < 1 4 1 > 無 < 1 60 > 4 < 170> 微軟文書編輯軟體word < 21 0 > 1 < 211> 21

< 21 2 > DNA < 21 3 > 人工排序 < 220 > < 223 > 人工排序說明：引子 < 400 > 1 gaatgtacca ggagccatat c 21 < 21 0 > 2 < 211> 21

< 21 2 > DNA < 213> 人工排序本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-33- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1284040 A7 B7 五、發明説明（31) < 220 > < 223 > 人工排序說明：引子 < 400 > 2 ctcagtacta cgagtaatcc a 21 < 2 1Ό > 3 < 211 > 25

< 212> DNA <213〉人工排序 < 220 > < 223 > 人工排序說明：引子 < 400 > 3 gttggataca ggccagactt tgttg 25 <210〉 4 < 211 > 25 < 212 > DNA 〈213> 人工排序 < 220 > < 223 > 人工排序說明：引子 < 400 > 4 gattcaactt gcgctcatct taggc 25 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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Claims

1284040 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 1 第90 1 28 893號專利申請案中文申請專利範圍修正本民國93

93. 4.28年每月正 1 · 一種用於治療免疫失調之藥醫藥組成物，含有，相對於總重爲100% ’ (a ) 32-43 wt%之麥門冬(Tuber Ophiopogonis) (b ) 20-30 之半夏（Pz>?e//7w )， (〇:)6-18〜1:0/〇之生甘草（^?“山1〇/3^少厂7’/7 72：^)， (ά ) 6-18 wt°/〇之花旗參 C Rctdix JPanacis Quinquefolii ) 或黨參(Radix Codonopsitis)，以及 (e ) 6_18 wt0/〇之長柄菊{ Herba Tridacis Procumbentis )、風氣草（Z心?705^77?ma//*s*)或蕺菜（ Herba Houttuyniae^) ° 2 .如申請專利範圍第1項的醫藥組成物，其中成份 (a ) ： ( b ) : ( c ) : ( d ) : ( e )的重量比爲 37. 5%: 25%: 12.5%: 12.5%: 12. 5%，即， 3 : 2 : 1 : 1 : 1。 3 ·如申請專利範圍第1項的醫藥組成物，其中成份 (d )爲花旗參。 4 ·如申請專利範圍第1項的醫藥組成物，其中成份 (d )爲黨參。 5 ·如申請專利範圍第1項的醫藥組成物，其中成份 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 1284040 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 2 (e )爲長柄菊。 6 .如申請專利範圍第1項的醫藥組成物，其中成份 (e )爲風氣草。 7 .如申請專利範圍第1項的醫藥組成物，其中成份 (e)爲蕺菜。 8 .如申請專利範圍第1項的醫藥組成物，其中麥門冬爲沿階草（yqpcracm Ker. Gawl)的塊莖。 9 .如申請專利範圍第1項的醫藥組成物，其中半夏爲半夏（如(Thunb.) Breitenbach )的塊莖。 1 〇 .如申請專利範圍第1項的醫藥組成物，其中生甘草爲甘草（G/wtA/m Fischer)或光果甘草（Glycyrrhiza g/aZ?raLinne)的根或葡萄莖。 1 1 .如申請專利範圍第1項的醫藥組成物，其中花旗參爲西洋參（咖//_ L.)的根，黨參爲黨參（ Codonopsispilosula ( Franch.) Nannf.) |i； ° 1 2 .如申請專利範圍第1項的醫藥組成物，其中長柄菊爲長柄菊（况如似Linn.)的全株乾燥植物，風氣草爲下田菊（/om?/a (L. ) ktze.)的全株鮮品或乾燥品，蕺菜爲魚腥草（价祕Hywz’ac㈣fatoThunberg)的地上咅β。 1 3 . —種製備如申請專利範圍第1項的醫藥組成物之方法，包括：將下示草藥磨成粉末 (b )半夏， (c)生甘草，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格(210 X 297公釐) ^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1T ▼線經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1284040 ABCD 六、申請專利範圍 3 (d) 花旗參或黨參，及 (e) 長柄菊、風氣草或蕺菜；用水煎煮麥門冬，得一水萃取物；將該粉末與該水萃取物混合。 1 4 .如申請專利範圍第1 3項之方法，其中該粉末與該水萃取物混合所得混合物被造粒。 1 5 .如申請專利範圍第1 4項之方法，其中該混合物造粒後被包封。 1 6 .如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中該免疫失調係選自下列：過敏性鼻炎、過敏性結膜炎、過敏性氣喘、異位性皮膚炎、食物過敏、I g E過高症狀群、異位性濕疹及類風性濕關節炎。 J ^ ¾訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）