TWI276139B - Closed observation environment for electron microscope - Google Patents

Description

1276139 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 特別是指一種電子顯微 本發㈣與電子顯微鏡有關 、見用之封閉式觀測環境。 【先前技術】

通當2習知技術中，在操作電子顯微鏡來觀察物體時， 十域於電子輕勒的樣品㈣之真空環境，使^曰 {觀祭的物體必須為非揮發性的固體方能進行觀察。若3 ，發性物體，例如液態或氣態的流體物質，在置入真空^ 品腔室後會產生的大量氣體，不僅會造成電子束無法=過 物體進行繞射或成像的貫驗，亦會導致顯微鏡電子搶等高 真空區域的真空度下降或造成污染，而損壞電子顯微鏡。 由上可知，受限於真空環境的限制，傳統電子顯微鏡 只能在其樣品腔室内觀察固態物質之結構，或觀察乾燥脫 水後的生物細胞(例如原核細胞prokaryote的細菌，與真核 細胞eukaryote的動植物），病毒等等生物組織，並不能觀察 流體樣品或流體環境中具有生理功能的細胞與病毒等等， 當然更無法在一大氣壓的流體環境下觀察細胞内或細胞間 各種胞器的運作，例如細胞核内DNA轉錄(transcription) 20 RNA、RNA 轉譯(translation)蛋白質(protein)、細胞質内微 管體(microtubules)等生化反應過程’以及神經肌肉接合 (neuromuscular junction)處的傳導生理（physiology of transduction)機制等等生命現象過程。 因此，必須有一種裝置可在其内部置入活體細胞或活 4 1276139 體組織，並可將該裝置置入於電子顯微鏡内進行觀察。目 前，雖已有部份人士提出在電子顯微鏡内提供一種可觀測 之環境’例如 Gai P· L· (Gai R L·，Micr〇sc〇py &

Microanalysis 8，2卜2002)。但是其缺點是無法將樣品室之 ’ 5壓力維持接近常壓或較高的壓力狀態下進行觀察與分析， • 係因液體為維持其液氣平衡之穩定狀態而會迅速揮發殆 • 盡，所以必須持續補充液體進入樣品室，但此舉將造成待 -觀測的樣品產生嚴重的流動或新舊樣品混合不均的問題而 。 影響觀測的真實性。另外大量揮發之高壓蒸氣或從外界注 1〇入氣室區的高壓氣體將充滿上下極塊間的整個空間，也會 造成電子因撞擊大量氣體分子產生之多重散射效應變得非 常嚴重，而導致電子束無法順利成像或進行電子繞射的實 驗。同時，其樣品室的設計無法有效控制注入的液體量， 故極易造成液體厚度過厚使得電子束無法穿透樣品，導致 15 無法觀測與分析。 7 > ㈣其設計仍必顯微賴域分解才能將這些愛 件安裝，故量產的可能性不高。 一 7 有鑑於此，本案發明人乃經過不斷之試作與實驗後， 終於發展出-種封閉式的觀測環境，而可解決前述問題 2〇並可用來置入-般樣品或活體細胞供電子顯微鏡進 測。 【發明内容】 本發明之主要目的在於提供一種電子顯微鏡用之封閉 5 1276139 式觀測淨碑 ^ _ 长兄，其可供置入一般樣品或活體細胞，藉以配合 /、龟子顯微鏡進行觀測。 弋#本务明之次一目的在於提供一種電子顯微鏡用之封閉 ^觀劂％境，其在内部注入液體時，不會有液體逸出或揮 毛而產生大量氣體的問題，觀測上更為容易、清淅。 …緣是’依據本發明所提供之一種電子顯微鏡用之封閉

10 式觀剩環境，包含有·· 一殼體，内部具有一液室，該殼體 之頂底面各具有至少一觀視孔連通於該液室且彼此相對同 袖，各該觀視孔封設一薄膜。藉此，可於該液室内置入一 般樣品或活體細胞，藉以配合供電子顯微鏡進行觀測。且 可將液體封於該殼體内，解決液體玎能向外逸散或揮發的 問題。 本务明弟一貫施例主要係於一殼體内形成一液室，且 該液室係以薄膜上下封住。 15 本發明第二實施例主要係於一殼體内形成一液室，以 及形成位於該液室上下方之一氣室，且該氣室係以薄膜上 下封住。 本發明第三實施例主要係於一殼體内形成一液室，以 及形成位於該液室上下方之一氣室，以及形成位於該二氣 2〇室上下方之二緩衝室，且該緩衝室係以薄膜上下封住。 【實施方式】 為了詳細說明本發明之構造及特點所在，兹舉以下之 三較佳實施例並配合圖式說明如后，其中： 6 1276139 第-圖係本發明第—較佳實施例之立體示意圖。 第二圖係本發明第—較佳實施例之剖视示i圖。 ^圖⑷(B)(CXD)係本發㈣—較佳實施例之 圖，顯不潯膜之狀態。 5

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第四圖係、本發明第-較佳實施例之操作示咅、圖。 第五圖係本發明第-較佳實施例之另—剖視示意圖， 顯殼體由蓋體與座體結合之狀態。 ，六圖係本發明第二較佳實施例之剖視示意圖。 第七圖係本發明第二較佳實施例之操作示意圖。 第八圖係本發明第三較佳實施例之剖視示意圖。 第九圖係本發明第三較佳實施例之操作示意圖。 第十圖係本發明第三較佳實施例之另_剖視示意圖 顯示配合樣品治具之狀態。 如第固至第二圖(A)所示，本發明第一較佳實施例所 提供之一種電子顯微鏡用之封閉式觀測環境1〇，主要具有： 一殼體11，係一體成型，内部具有一液室12，該殼體 11之頂底面各具有至少一觀視孔13連通於該液室12且彼 此相對同，；各該觀視孔13封設一薄膜131，該薄膜l3i 可為非結晶碳膜或較具彈性的高分子膜，該薄膜131係位 於該觀視孔13靠近該液室12之一端，且該二薄膜131之 距離小於l〇“m。且本實施例中，各該薄膜13丨係於其外 端面設置複數肋條132，該等肋條132係彼此交叉設置，可 藉以，化各4溥獏131的強度，使得其至少可承受〆大氣 壓之壓差而不致破裂；該殼體Π與該等薄膜131與該等肋 7 20 1276139 ，^可藉由習知的微紐刻方式製造並—體成型。各該 親視孔13之孔徑介於5啊5〇〇_之間，較佳孔徑為50 #m。該殼體u之—側 ^ , 側°又有一〉主入孔111，另一側設有一 流出孔112。 5 、在對销閉式_環境1()内置人樣品％的方式是， 將液體以及待觀測樣品99(例如活體細胞）自該殼體^的注 入孔m >主入至該液室12，並利用該流出孔ιΐ2來適時讓 庄入的液體流出，以做為壓力調節·,此外，亦可利用對該 =孔112抽取液體樣品，藉以控制該液室12内液體樣品 ίο的里。备待觀測樣品99為活體細胞時，則可在該液室12 内注入培養液，並可將活體細胞之樣品99固定在該薄膜 131或液室12内壁面，其固定方法是在薄膜131或液室12 内土面1佈層如右疑光性的聚離胺酸(p〇iy-D-lysine)之類 的細胞固定劑。本實施例中，該等肋條132除了以交叉方 15式（第三圖（A))設置於該薄膜131上之外，如第三圖（B)(C)(D) 所示，亦可以平行或同心圓或輻射狀的方式佈設於各該薄 膜131上，而此薄膜131與肋條丨32可以習知的微影蝕刻 方式製造。 在進行觀測時，如第四圖所示，係將該封閉式觀測環 2〇 境10配合一樣品治具92實施，並置入至電子顯微鏡9〇中， 並使該電子顯微鏡90的電子束（圖中未示)通過該二觀視孔 13，藉此可觀測到位於該液室12内的樣品99，並進行成 像。其中，由於該等觀視孔13上設有薄膜131，因此該液 室12内的液體不會經由該等觀視孔13流出或逸散或揮發 1276139 至該殼體11外，電子顯微鏡90内的真空環境即不會被破 壤。藉此可達到觀視活體細胞樣品99或其他樣品的功效。 又’由於該二薄膜131之距離小於，因此該液室12 的可觀測高度極低(亦即液層極薄），可讓電子顯微鏡的電子 束通過並有效成像。 又，該殼體11除了如第二圖所示可為一體成型之外， 如第五圖所示’該殼體11亦可由一蓋體14與一座體15組 合而成，可在樣品99置入座體15後，再將該蓋體14蓋上， 再將該蓋體14與該座體15間以一黏著劑（圖中未示)接合。 晴再參閱第六圖，本發明第二較佳實施例所提供之一 種電子顯微鏡用之封閉式觀測環境2〇,主要具有： 一殼體21，内部具有至少一隔板24，本實施例中係為 二隔板24,該等隔板24將該殼體21内部分隔出一液室22 以及—氣室25 ’分別位於該液室22之上方及下方，該液室 15 22之頂底面各具有至少一觀視孔23設於該隔板24，各該 觀視孔23係連通於該液室22 ;該二氣室25係涵蓋於該二 觀視孔23，且該氣室25之頂底面各具有至少一氣孔26， 該等氣孔26與該等觀視孔23同軸；各該氣孔26封設有一 薄膜261，各該薄膜261係設於各該氣孔26靠近於該氣室 2〇 25之一端，該殼體21於各該氣室25之一側設有一氣壓平 衡孔251。該殼體21於該液室22之一側設有一注入孔211， 並於該液室22之另一側設有一流出孔212。 各該觀視孔23其剖面構造在本實施例中5係為外大内 小之推拔狀，並且於該觀視孔23之孔壁及該隔板24外之 9 1276139 表面施以疏水或超疏水處理，例如製造許多直徑在數百奈 米以内的柱狀物(Pillar)，並在其表面附著一層疏水性自我 組衣單力子膜(self-assembly monomolecular layer)，可以使 15 付水滴在此表面的接觸角（C〇ntact angle)大於度，以達 不沾水的排水性。而該殼體21可以習知的微影蝕刻方式製 ，並一體成型，故該液室22與該氣室25均可被控制在極 薄的厚度，故可減少電子束通過氣室時產生之電子多重散 射的問題。在對該封閉式觀測環境20置入待觀測樣品99 柃，可將液體以及待觀測樣品99自一體成型之殼體21的 注入孔211注入至該液室22内，注入過多的樣品可自流出 孔<212排出，而從觀視孔23溢漏出來的液體樣品，則會受 到觀視孔23孔鼓該隔板2〇卜的超疏水表面所排斥，而 在殼體21直立置放時自氣壓平衡孔251流出；另外，為避 免液體樣品自觀視孔23溢出，亦可選擇在操作時提供預定 壓力的特定氣體於該氣室25中，並控制該特定氣體壓力斑 注入該液室22内的液體壓力差小於或等於該液室22内液 體溶液的臨界溢漏塵力（Keller s “，J〇umai 〇f f咖 ㈣tect應66 ’ 1260，)，藉此可使注入的培養液或待分 析之液體樣品在液室22 _環流動而不會自該觀視孔 流出。在進行觀測時，可視實驗需要而停止培養液與 析液體樣品的循環流動。 、刀 本第二實關在操作時，储闕询微细之 ，測壞境2G配合-樣品治具92實施，並置人於電子 微鏡90内的狀態概同於前揭第—實施例，如第七圖所示、、，、 10 20 1276139 係透過該注入孔211對該液室22内注入液體及樣品99(可 為活體細胞）’透過該氣壓平衡孔251來對該氣室25提供預 疋壓力之蒸氣，例如總壓為一大氣麈的飽和水蒸氣(或未飽 和水蒸氣)與特定氣體之混合氣體，該特定氣體可為氮氣、 5氧氣、二氧化碳與惰性氣體等，該氣室25内之水蒸氣可抑 制該液室22内的水的蒸發速率，另外，亦可供提供一大氣 壓的特定氣體於該氣室25中，並控制該特定氣體壓力與該 液室22内的液體的壓力差小於或等於該液室22内水溶液 的臨界溢漏壓力，藉此可避免該液室22内的液體溶液自該 10專觀視孔23流出，而僅以蒸氣形態緩慢揮發進入該氣室25 内。而藉由該氣壓平衡孔251可對該氣室25内之氣體及蒸 氣進行平衡調節。 本第二實施例中，由於該等氣孔26上設有薄膜261， 因此該氣室25内的蒸氣或氣體不會經由該等氣孔％逸散 I5 ^该殼體21外，電子顯微鏡9〇内的真空環境即不會被破 壞。藉此可達到觀視活體細胞或其他樣品99的功效。 請再參閱第八圖，本發明第三較佳實施例所提供之一 種電子顯微鏡用之封閉式觀測環境3〇，主要具有： -殼體，内部具有至少二隔板34，本實施例中係為 加四隔板34,該等隔板34係將該殼體31内部分隔出一液室 32、以及分隔出二氣室35分別位於該液室32上下方、以 及分隔出二緩衝室37分別位於該二氣室％的上下方。該 液室32之頂底面各具有至少一觀視孔33設於一該隔板 3斗，各該觀視孔33係連通於該液室& ;該三氣室％係涵 π 1276139 蓋住該等觀視孔33 ’且位於上方之該氣室35之頂面具有一 氣孔36設置一該隔板34，位於下方之該氣室35之底面具 有一氣孔36設置於一該隔板34 ;該二缓衝室37係涵蓋住 該等氣孔36，且該殼體31之頂部及底部分別具有一外孔 ^ 5 38 ’該等外孔38與該等氣孔36與該等觀視孔33同軸；各 、 該外孔38封設一薄膜381，各該薄膜381係設於各該外孔 38靠近於各該緩衝室37之一端；該殼體31於該氣室％ • 之一側設有至少一注氣孔351，以及於各該緩衝室37之一 側設有一抽氣孔37丨。該殼體31具有一注入孔311位於該 10液室32之一側，以及具有一流出孔312位於該液室之 另一側。 在對該電子顯微鏡用之封閉式觀測環境3 0置入待觀測 樣品99時，可將液體以及待觀測樣品99自該殼體31的注 入孔311注入至該液室32内，在操作時係提供預定壓力的 特J氣體於該氣室35中’並控制該特定氣體壓力與注入該 . 液至32内的液體壓力差小於或等於該液室32内液體溶液 的臨界溢祕力，藉此可避免㈣樣品自觀視孔33溢出。 對該二緩衝室37則需持續進行抽氣。 2n <本第三實關在齡m於電子顯魏9G内的狀 恕概同於前揭第-實施例’如第八圖及第九圖所示，係透 過該注入孔3H對該液室32内注入液體及樣品99或活體 細胞，並透過該注氣孔351對該氣室35提供預定壓力之基 ,，例如總Μ為-大氣壓的飽和水蒸氣(或未飽和水蒸氣) 則寸疋氣體之混合氣體，該特定氣體可為氮氣、氧氣、二 12 1276139 氧化碳與惰性氣鮮，錢室35内之錢氣 L2内的糾蒸發鱗，科，亦可提供—錢壓的特t 版於I室35巾’讀難特定氣缝力與該液室^内 =溶液的壓力差小於轉於_室Μ内水溶_ 10 =力，藉此可避免·室Μ _賴紐自料觀視孔 ^流出，而僅以条氣形態緩慢揮發進人該氣室％内，而該 W 35内的氣體及蒸氣亦會經由該二氣孔％向外逸散至 ^緩衝室37。對該二緩衝室37持續進行抽氣，藉此可將 =该氣室35逸散進人該二緩衝室37的蒸氣與氣體會被抽 ，’而不會累積在該二緩衝室37 β。在進行觀測時，係使 好顯微鏡9〇的電子束通過該科孔％以及料氣孔％ 从及該輪視孔33，即可對該液室32 _樣品99(可為活 體細胞)進行觀測。 、前述第三實施例中，該等緩衝室37分為上下各一層僅 • 5，舉例說明之用，並非為了限制本案範圍，上下多層緩衝 • 至亦可達到觀測的需求，並屬於本發明之等效變化，而應 為本發明之申請專利範圍所涵蓋。 、又’再如第九圖所示，本發明之主要結構亦可與樣品 /口具92(SpecimenHolder)結合在一起，而可以氣室35,與緩 衡至37’配合該樣品治具92本身之盒體94所形成之液室 32’來成型，其使用方式與前揭第三實施例相同，容不贅述。 另外’第十圖係顯示以類同於前揭第三實施例之二緩 衝至37’’配合該樣品治具％本身之盒體94，，所形成之液室 32與氣至35配合樣品治具92之實施狀態，一體成型的 13 1276139 = 以習知的輸刻方式製造，故該氣室％，， :重=Γ度以減少電子束通過氣室時所產生之電子 更增二咖狀態較前述第三實施例所揭 達到更高壓的環境。#•至35”内的氣體壓力可操作

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xpift明在:述三實施例中，係揭露出薄膜設置於各種 安5二之狀此係為舉例而已’並無意用以限制本 木之，以第二貝;^例之架構為例(參閱第人圖），薄膜除 了可設置於外孔上，亦可僅設置於觀視孔與氣孔其中之 …或薄膜亦可設置於觀視孔、氣孔與外孔其中之二，而 可同樣具有雙邊關的效果，且具有與前揭實施例相同之 功效以及相同之操作方式。 而月ίι述諸多實施例中，該薄膜設置之位置僅為舉例說 明之用，並非以靠近某一室(液室，氣室，緩衝室）的一端為 限制’故其等效之變化，應為本發明之申請專利範圍所涵 蓋。 另外’前述諸實施例中，各該液室32内係可供置入活 體細胞樣品99 ’活體細胞樣品99可固定於該液室32之内 壁面或内側壁面，或是在第一實施例中把活體細胞樣品99 20固定於一該觀視孔13上設置之薄膜131。 由上可知，本發明之優點在於： 一、可提供一觀察樣品或活體細胞的環境··本發明可 於該液室中置入一般樣品或活體細胞，藉以配合供電子顯 微鏡進行觀測，解決了習知技術無法對活體細胞進行觀測 14 1276139 的問題。 二、不會損壞電子顯微鏡··本發明在該液室内注入液 體時’可藉由該等薄膜之設置來避免該液室内的液體逸出 或向外揮發。故本技術不僅觀測上容易、清淅，且 壞電子顯微鏡。 曰貝 本么明所揭路的各元件，僅係為舉例說明，並

Hi案之乾圍’本案之範圍仍應以申請專利範圍為準， ==所衍生的其他的變化及轉用，亦 : 專利範圍所涵蓋。 丁月 15 1276139 【圖式簡單說明】 第一圖係本發明第一較佳實施例之立體示意圖。 第二圖係本發明第一較佳實施例之剖視示意圖。 第三圖（A)(B)(C)(D)係本發明第一較佳實施例之示意 5圖，顯示薄膜之狀態。 第四圖係本發明第一較佳實施例之操作示意圖。 第五圖係本發明第一較佳實施例之另一剖視示意圖， 顯示殼體由蓋體與座體結合之狀態。 第六圖係本發明第二較佳實施例之剖視示意圖。 ίο 第七圖係本發明第二較佳實施例之操作示意圖。 第八圖係本發明第三較佳實施例之剖視示意圖。 第九圖係本發明第三較佳實施例之操作示意圖。 第十圖係本發明第三較佳實施例之另一剖視示意圖， 顯示配合樣品治具之狀態。 15

16 1276139 【主要元件符號說明】 ίο電子顯微鏡用之封閉式觀測環境

11殼體 111注入孔 112流出孔 12液室 13觀視孔 131薄膜 5 132肋條 14蓋體 15座體 20電子顯微鏡用之封閉式觀測環境 21殼體 211注入孔 212流出孔 22液室 23觀視孔 24隔板 25氣室 251氣壓平衡孔 26氣孔 10 261薄膜 30電子顯微鏡用之封閉式觀測環境 31殼體 311注入孔 312流出孔 32 ， 32,， 32”液室 33觀視孔 34隔板 35 ， 35,， 35”氣室 351注氣孔 36氣孔 15 37 ， 37,， 37”緩衝室371抽氣孔 38外孔 381薄膜 90電子顯微鏡 92樣品治具 94，94’’盒 99樣品 17

Claims (1)

1276139 申請專利範圍 1· -種電子顯微鏡用之封閉式觀測環境，包含有： I一了殼體’内部具有—液室，該殼體之頂底面各具有至 ==孔連通於該液室且彼此相對同轴；各該觀視孔封 2·依據中請專利範圍第1ιΜ所述之電子顯微鏡用 閉式硯測魏，其巾：各軸視孔之聽介於 //m 之間。 a 〇υυ Ρ依？申請專職圍第1項所述之電子顯微鏡用之封 二二境’其中：各該薄膜絲於各該觀視孔靠近該 /文至—端，且該二薄膜之距離小於⑺“茁。 閉請專職㈣3項所述之電子鏡用之封 =詞環境，其中··各該薄膜之至少1砂有複數肋 15 閉式5觀：ΓίΓ圍第4項所述之電她 或於平行或交叉或㈣ PM t k財料利範圍第3項所述之電子輸鏡用之封 γ環境’其中：各該薄膜係與該殼體1成型。 側設有〜 9 目依據中請專利範圍第6項所述之電子顯微鏡用之封 ^叫壤境，其中··該等肋條係與各該薄蹲一體成型。 依據申請專利範圍第1項所述之電子_微鏡用之封 才/硯碉環境，其中：該殼體之一側設有一迭入孔，另一 流出孔。 、種電子顯微鏡用之封閉式觀測環境，包含有： 18 20 1276139 一殼體，内部具有至少一隔板將該殼體内部分隔出一 液室以及至少一氣室，該液室之頂底面各具有至少一觀視 孔設於該隔板，各該觀視孔係連通於該液室；該氣室係至 少涵蓋住該等觀視孔，且該殼體之頂底面各具有至少二家 5孔γ該等氣孔與該等觀視孔同軸；各該氣孔封設—薄獏虱 忒设體於該氣室之一側設有至少一氣壓平衡孔。 1〇·依據申請專利範圍第9項所述之電子顯微鏡用之 封閉式觀測環境，其中：各該薄膜係設於各該氣孔靠 該氣室之一端。 1〇 η·依據申請專利範圍第9項所述之電子顯微鏡用之 封閉式觀測環境，其中：該殼體於該液室之一側設有一注 入孔，並於該液室之另一側設有一流出孔。 / 12· —種電子顯微鏡用之封閉式觀測環境，包含有： 一殼體，内部具有至少二隔板將該殼體内部分隔出一 I5液室以及至少一氣室以及至少一緩衝室，該液室之頂底面 各具有至少一觀視孔設於一該隔板，各該觀視孔係連通於 該液室；該氣室係至少涵蓋住該等觀視孔，且該氣室之頂 底面各具有至少一氣孔設於另一該隔板；該緩衝室係至少 涵蓋住該等氣孔，且該殼體之頂底面各具有至少一外孔， 2〇該等外孔與該等氣孔與該等觀視孔同軸；各該外孔封設一 薄膜；該殼體於該氣室之一側設有至少一注氣孔，以及於 該緩衝室之一側設有至少一抽氣孔。 、 13·依據申請專利範圍第12項所述之電子顯微鏡用之 封閉式觀測環境，其中：各該薄膜係設於各該外孔靠近於 19 1276139 該緩衝室之一端。 14.依據申請專利範圍第12項所述之電子顯微鏡用之 封閉式觀測環境，其中：該殼體於該液室之一側設有一注 入孔，並於該液室之另一側設有一流出孔。 20