1252759 A7 ___B7 五、發明説明（i ) 發明背景 1. 發明範圍 本發明係關於醱酵大旦（Glycine max ( L .))萃取液於增強 自然殺手細胞（NK細胞）之活性、預防及/或治療個體涉及 自然殺手細胞（N K細胞）活化作用之疾病上之用途。本發明 亦有關提鬲個體免疫力之用途，如在化療法與放射療法等 病患的免疫力提昇作用，減輕此等療法副作用的產生。 2. 先前技術說明 自然殺手（N K)細胞為在免疫系統中具有活性之淋巴球次 族群，平均佔人體周邊血液中單核細胞之15%。已發現NK 細胞在防止及排除體内癌細胞及排除多種病毒上扮演重要 角色。其專一性功能為殺死有感染細胞及癌細胞。許多研 究者指出NK細胞活性與癌症及傳染性疾病有關（Yamazaki et al.? Oncology Reports, 2002, Vol.9? pp. 359-363; Rosenberg et al·，Cancer Research (suppl.)，1991，Vol.51，pp. 5074-5079; Britteenden et al.? 1996, Cancer, 1996, Vol.77? No.3? pp.1226-1243; USP 5,082.833; USP 4,883,662)。此外，有許多研究已 進一步探討及確認NK細胞活性與預防原發性腫瘤及抑制已 有之惡性腫瘤病的轉移具有相關性。因此，NK細胞活性有 缺陷或缺乏時，會與多種的人類疾病有關。根據美國疾病 防治中心（Center for Disease Control)指出，所有疾病中之NK 細胞活性均有降低的現象。NK細胞功能因此成為疾病之生 物標記，且可為健康情形下降或改善之重要指標。因此增 強N K細胞活性已成為可以有效治療或處理癌症與傳染性疾 O:\79\79216.DOC 4 - 4 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252759 A7 B7 五、發明説明（2 ) 病之值得注意之方法。 具有增強NK細胞活性效力之物質可用於作為預防或治療 疾病之藥劑。大豆為人類膳食中一種異黃酮之集中來源。 其亦包含多種化合物，包括皂素（saponins)答、植物固醇類 (phytosterols)、大豆植酸鹽（soybean phytates)、蛋白酶抑制 劑（protease inhibitors)、驗酸（phenolic acids)、複合糖類 (complex sugars)、、卵鱗脂、ω-3脂防酸與葉酸，其對健 康有益。許多柬方傳統食品（如··天貝（tembe)與納豆）均由 大豆醱酵製成。例如：天貝係由大豆使用少孢根黴 (Rhizopus oligosporus)、米根黴（R. Oryzae)、少根黴（R. arrihizus)與黑根黴（R. stolonifer)釀酵製成。納豆則使用納豆 芽孢桿菌（Bacillus natto)酸酵製成。傳統之酸酵食品可作為 優良的蛋白質來源。然而，先前技術均未揭示任何已知之 醱酵大豆食品與大豆具有增強NK細胞活性之功效。 ’發明概要 本發明係關於潑酵大豆（Glycine max( L·))萃取液提高NK 細胞活性之用途，其中該醱酵大豆萃取液係由大豆水性萃 取液與至少一種乳酸菌及至少一種酵母共同醱酵製成。 本發明一目的為提供一種增強個體NK細胞活性之方法， 其包括對有此需要之個體投與有效量之醱酵之大豆萃取 液，其中醱酵大豆萃取液係由大豆水性抽水物與至少一種 乳酸菌及至少一種酵母共同醱酵製成。特定言之，大豆 (Glycine max(L.))為一種黃豆或黑豆。更特定言之，本發 明之醱酵之大豆萃取液包括醱酵之黃豆萃取液與醱酵之黑 O:\79\79216.DOC 4 -5 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252759
豆萃取液。 本發明另一目的為提供—
細胞、、、、 /、防及或治療個體涉及NK 細胞沽化作用炙疾病，其 |之鹼括對有此為要之個體投與有效 酵大·"卒取液。特定言之，本發明之發酵大豆萃取 液可用於預防及/或治療 病，可藉由發酵的大豆萃：二及f細胞活化作用之疾 «症、感染性疾 病或调即㈣涉及自然殺手細胞活性之免疫系統。 本發明也關於一種改呈症吉 一 _改。届患健康又方法，此方法包括將 的健康大旦萃取液給藥至需要改善和增進免疫力 瞭= : = = 要介紹。為7更詳細 、 、 /〜、他目的及本發明本身，習知技藝 、 咸瞭解應配合附圖解讀本發明之詳細說明與申請專 利範圍。_與圖式中指定之編號係代表相同或相似之 組件。 …、P曰相關技藝之人士當參考詳細說明與附圖時將更瞭解 本發明4多其他優點與特色，其中涵括本發明原則之較佳 結構具體實施例僅為實例說明。 發明詳細說明_ 、本發明係關於以輯大豆萃取液於增強NK細胞活性及治 療f及NK細胞活性作用之疾病上之新穎用途，其中釀酵大 二萃取液係由大且水性萃取液與至少一種乳酸菌及至少一 種^母醱酵製得。㉟已意外地發現，料之大豆萃取液在 低濃度下即可有效增強N K細胞活性。 O:\79\79216.DOC4 ^ 本紙張^^適财㈤料料(CNS) A4規格(2ig_x撕么€ 1252759
特足n，本發明醱酵大豆萃取液可用於預防及/或户 療個體涉及NK細胞活化作用之疾病，如：癌症及感染性: 病。此外，本發明醱酵大豆萃取液亦可用於調節個體涉及 NK細胞活化作用之免疫系統，如：經化療法及放射療法治 療之癌症病人。 製造潑酵之大豆萃取汸夕 醱酵大豆萃取液之製法係由大豆水性萃取液與至少一種 乳酸菌與至少一種酵母共同醱酵後，醱酵液體經例如：加 熱叙囷’及視需要過滤與濃縮。 根據本發明，用於製備醱酵大豆萃取液之較佳大豆係選 自由黃豆與黑豆之群組。更特定言之，本發明醱酵之大豆 萃取液為醱酵黃豆萃取液或醱酵黑豆萃取液。 醱酵大旦萃取液之製法係由大豆萃取液與至少一種乳酸 菌（例如：一種乳酸样菌屬（Lact〇bacnus)之一種或多種菌株 或多種乳酸桿菌屬之數種菌株）及至少一種酵母菌（例如：一 種酵母菌屬（Saccharomyces)之一種或多種菌株或多種酵母菌 屬之數種菌株）共同醱酵。水性大豆萃取液與一種或多種乳 酸菌及視需要選用之酵母菌之醱酵作用可依任何順序進行 或同時進行，以同時進行較佳。 若醱酵過程中使用之微生物超過一種以上時，該醱酵作用 係使用微生物按順序進行或同時進行。較佳者，採用選定 品級之非基因改造之有機大豆之水性萃取液作為起始原 枓。較佳者，醱酵作用係採用乳捍菌之多相培養物進行， 例如：含5、10、15、20、25或30株乳桿菌之培養物，並 O:\79\79216.DOC 4
1252759 A7 B7 五、發明説明（5 ) 在乳桿菌之多相培養物中添加至少一種酵母。可使用之乳 桿菌菌株包括例如：嗜酸乳样菌（Lactobacillus acidophilus CCRC 10695、14026、14064、14065與 / 或 14079)，德氏乳 桿菌（Lactobacillus delbrueckii bulgaricus CCRC 10696、 14007、14009、14010、14069、14071、14098 及 / 或 16054)、乳酸乳桿菌（Lactobacillus lactis lactis CCRC 10791、12267、12306、12312、12315、12323、14016、 14015及 / 或 14117)，克非乳桿菌（Lactobaciilus kefir CCRC 14011)及 / 或克氏乳样菌（Lactobacillus kefiranofaciens CCRC 16059))。可使用之酵母菌包括例如：釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae CCRC 20577、20578、20581、 21494、2 1 550、21797、21805、22 13 8、22234、22337、 22731與/或22728，及/或乳酒假絲酵母（Candida kefyr CCRC 2 1269、21742與/或22057))。醱酵後，醱酵液經 由，例如：加熱或放射（以加熱較佳），殺菌以得到無菌液 體。較佳地，無菌液體經過濾或離心（以過濾較佳），去除大 部分或所有死微生物以得到醱酵大豆萃取液。更佳者，繼 過濾步騾後，去除濾液中部分水以濃縮醱酵液體而得到醱 酵大豆萃取液。除非另有詳細說明，否則本申請案進行之 試驗涉及濃縮步驟後之醱酵大豆萃取液。視需要，醱酵大 豆萃取液可經由乾燥（例如··利用冷凍乾燥法）而得到粉末型 式之醱酵大豆萃取液。 進行此方法時，混合有機大豆（已脫脂）與蒸鎢水，比例為 1 : 1 0。混合物於1 〇 〇 °C下加熱3 0分鐘後並接著過濾以得到 O:\79\79216.DOC 4 - 8 · 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1252759 A7 B7 五、發明説明（6 大豆萃取液。牛肉與海草於蒸餾水中煮沸3 〇分鐘以得到肉 汁。添加鹽、糖與洋菜以製成特製洋菜培養基。添加乳酸 菌與酵母菌株至特製洋菜培養基中。自培養基中取出乳酸 菌及視需要添加之酵母添加至大豆萃取液中，並於36-43 °C 下培養45至50小時。較佳者，依據類似之生長特性將各種 不同微生物菌株分類，例如：依獨特營養基之任何需求， 微生物菌株是否在撥酵後產生良好氣味，及所分類之微生 物是否可在獨特條件下存活等條件分類，以便在培養前將 分類之微生物分開加至大豆萃取液中。此步驟之目的在於 減少不同菌株之間任何不良交互作用。亦較佳者，在培養 前先添加等比例之不同類之微生物菌株至大豆萃取液中， 所得萃取液於40°C下培養45-47小時。培養期完成時，再將 多相培養物移至大豆萃取液中，於36-43 °C下培養100-150 小時。最終醱酵萃取液經加熱殺菌及過濾；於濃縮器中排 除濾液中9 5 %水份，得到濃縮型之醱酵大豆萃取液。取上 層經磁濾器過濾，然後分裝在容器中密封。 本發明範圍内容包括依上述類似方法製造，但改用中國藥 草替代大豆製成之醱酵之中國藥草萃取液。中國藥草之醱 酵萃取液可為甘草（Glycyrrhiza uralensis Fish)、枸杞（Lycium barbarum)、薏仁（Coix lacryma-jobi L. var· ma-yune Stapf)、山 豆根(Sophora tonkinensis gapnep.)、 決明(Cassia obtusifolia.)、黃答（Scutellaria baicalensis Georgi)、菌陳 (Artemisia capillaries Thunb.)、黃蓮（Coptis chinensis Frsnch.)、龍膽草（Gentiana scabra Bge·)、蓮子（Nelumbo -9- O:\79\79216.DOC4 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1252759 A7 B7 五、發明説明（ nucifera Gaertn.)、菊花(Chrysantheiferamum morifolium Ramat.)、梔子（Gardenia jasminoides Ellis)、麥芽（Hordeum vulgare L.)、肉桂（Cinnamomum cassia Presl)、蘿蔔（Raphanus sativus L.)、山藥（Dioscorea opposita Thunb.)、當歸（Angelica sinensis (Oliv·))、川弯（Ligusticum chuanxiong Hort.)、晃活 (Notopterygium incisum)、白柏（Paeonia lactiflora Pall.)、大蒜 (Allium satium L.)、五味子（Schisandra chinensis (Turcz.) Baill)、 生地(Rehmannia glutinosa Libosch.)、 五力口 (Acanthopanax gracilistylus W. W. Smith)、阿膠（Equus asinus L·)、女貞子（Ligustrum lucidum Ait·)、綠豆（Phaseolus radiatus L.)、小麥（Triticum aestivum L.)、爲豆（Dolichos lablab L.)、 白；]L (Atractylodes macrocephala Koidz·)、P方風（Saposhnikovia divaricata)、金 4艮花（Lonicera japonica Thund.)、桂枝 (Cinnamimum cassia Presl.)、生薑（Zingiber officinale Rose.)、 天麻（Gastrodia elata Bl·)、天門冬（Asparagus cochinchinensis (Liur.) Merr.)、石斛（Dendrobiun loddigesii Rolfe)以及黑芝麻 (Sesamum indicum L·)。 增強N K細胞活性之用i余 自然殺手細胞為周邊血液淋巴球之小族群，對人體健康 與疾病有重要性之功能。除了其於控制轉移與感染之角色 外，N K細胞亦參與免疫調節作用、造血作用、生殖及神經 内分泌交互作用。N K細胞活性與N K細胞數不相同。N K細 胞之數量可能充足，但除非經過活化，否則無法有效發揮 其作用。NK細胞活性下降與許多疾病之發展與進行有關， -10- O:\79\79216.DOC 4 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1252759
亦與放射療法及化療法有關。因此，N K細胞功能似乎為疾 病之生物標記，且為指示健康情形下降或改善之重要指 t。此外，Ν Κ細胞活性亦為多種癌症之重要診斷因素。 本發明之研究證實，醱酵大豆萃取液比其它已知之醱酵 大豆食品及未醱酵之大豆更能提高NK細胞活性。由醱酵大 旦萃取液提高之N K細胞活性可藉由調節訊號轉導、調節生 長因數活化及殺死癌細胞與/或傳染性細胞而具有細胞毒 性效應。且提高之NK細胞活性可抑制腫瘤生長。 由上文可知，本發明之醱酵大豆萃取液對增強Ν κ細胞活 性具有優越效果，因此可用於預防及/或治療個體涉及提 向N K細胞活性之疾病，如：癌症、傳染性疾病及免疫調節 作用。本發明具體實施例中，醱酵大豆萃取液可用為消炎 劑、抗癌劑或促進免疫功能之藥劑。 抗癌劑用涂 本發明撥酵大豆萃取液具有治療及/或預防癌症之抗癌 活性’並可克服先前技藝用於治療癌症之化放療劑之一項 或多項缺點。可使用醱酵大豆萃取液治療之癌症包括人類 最常見之癌症，亦即乳癌、結腸癌、子宮頸癌、攝護腺 癌、腎癌、肺癌、結腸癌與肝癌。 本發明醱酵大豆萃取液可在癌細胞中謗發一種或多種抑 制細胞增生之效應，謗發細胞分化，謗發細胞凋亡（漸進性 細胞死亡），及/或阻斷細胞循環。因此，本發明萃取液對 癌細胞具有極廣泛之活性，因此可有效治療與/或預防癌 症’包括良性攝護腺肥大、攝護腺癌、乳癌、子宮癌、白 O:\79\79216.DOC 4 - 11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1252759 A7 B7 五、發明説明（ 血病、卵巢癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、結腸癌、睪丸 癌、淋巴瘤、棱紋肌肉瘤、神經母細胞瘤、騰癌、肺癌、 月包‘皮膚癌、同癌、口腔癌、肝癌、喉癌、膀胱癌、甲 狀腺癌、肝癌、腎癌及鼻咽癌。 促進免疫功能用涂 除了控制癌症之角色外，N K細胞亦有助於調節及影響我 們整體健康之免疫系統功能。利用免疫療法來幫助提昇NK 細胞活性已漸成趨勢且將隨對免疫系統之知識增加而更為 廣泛應用。活體外試驗指出本發明醱酵大豆萃取液可改善 免疫功能。發酵大豆萃取液對於動物（Balb/c老鼠）免疫力的 調節之影響，是藉由將動物以發酵的大豆萃取液與含有或 不含各種促細胞分裂劑（mit〇gen)之刺激而試驗，這些促細 胞分裂劑包括脂多醣、刀豆素（c〇ncanavalin A)以及植物血 球凝集素（PHA)。脾臟細胞增殖分析顯示，發酵的大豆萃取 液是與免疫力凋節中的T細胞及b細胞之交互作用有關。發 酵的大且萃取液也是與抗發炎的反應有關。大豆萃取液也 可將巨噬細胞之呑噬活性增強7丨％。相似的結果也可在老 鼠的活體内試驗中發現。發酵的大豆萃取液之抗癌效果， 也證實是由所釋放的細胞激素而調節。由發酵大豆萃取液 而得到的培養液，可刺激45_56%之周圍血液單核細胞。介 百素-1 A (interleukin-1 /?)、介百素及腫瘤壞死因子“的 濃度，都遠高於未處理的對照組。因為未處理的巨噬細胞 及T淋巴球細胞產生很少或沒有產生細胞激素，以及正常的 單核球細胞並不會抑制血癌細胞之生長，因此，抗腫瘤的 O:\79\79216.DOC4 1252759 A7 B7 五、發明説明（1()) 活性可由增加的細胞激素的量而推估。 醱酵大豆萃取液之投藥 本發明中，醱酵大豆萃取液可單獨投藥或呈組合物投 藥，其中包含醱酵之大豆萃取液及醫藥上可接受之載體、 稀釋劑及/或賦形劑。較佳者，醱酵之大豆萃取液為酸酵 之黃豆萃取液或醱酵之黑豆大豆萃取液。醱酵大豆萃取液 之投藥劑量可為每公斤體重約0.0 0 1至4 0毫升，每次投藥之 最大劑量為每人2 0 0 0毫升。較佳者，鏺酵大豆萃取液劑量 為0.01至20毫升/公斤個體體重，以0.1益5毫升/公斤更 佳。此等劑量係以濃縮型之酸酵大豆萃取液為主，但可依 此計算呈未濃縮型或乾粉型式醱酵之大豆萃取液之適當劑 量。劑量可依個體之健康條件或待預防或治療疾病調整。 在嚙齒動物之慢性毒性試驗中已證實，長期每日攝取1至 10毫升之醱酵大豆萃取液長達6個月時，安全性極高。接受 20毫升/公斤與1毫升/公斤投藥之兩組試驗動物均未出現 肉眼可見之毒性或死亡率。在艾氏（Ames)試驗中，證明醱 酵之大豆萃取液沒有謗發突變性，不會在活體外造成哺乳 動物細胞染色體傷害，而且不會在ICR試驗小白鼠之骨髓細 胞中謗發小核形成。 以醱酵大豆萃取液銀食小白鼠（Balb/c)3週後，檢視 N K (殺手）細胞活性如下：測試三組。第一組Balb/ c小白鼠 接受PBS缓衝液，第二組接受0. 1%FSE，第三組則接受 0.4%FSE。 O:\79\79216.DOC4 -13 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)
1252759 A7 B7 五、發明説明（u 表1 組別 N K細胞活性，殺死百分比 銀食P B S補充液體之試驗組 24.8土4.8 0. 1%FSE 33.2±4.2** 0.4%FSE 氺本 3 5 · 1 ± 5 · 9 每個數值均以平均值土 SD表示。採用單向ANOVA試驗分 數數據，〃表示與對照組相比較之顯著差異程度達0.0 1。 為分析FSE對化療法所謗發NK功能下降之恢復能力，為 1 8位接受化療處理之患者檢查投與醱酵大豆萃取液前及後 之NK活性變化。結果顯示口服醱酵大豆萃取液患者之NK 總活性由 5 · 7 5 1 % 提高至 1 3.4 9 3 % (p = 0.0 2 )。 NK活性百分比示於下表2 : 表2 Ν Κ活性：臨床分析法（η = 1 8 ) 處理 NK活性 L%,K562. F/T = ?<；) P值 對照組（C/T) 5.75 1 FSE(C/T + FSE) 13.493 0.02 述結果為開放標識’父叉試驗，沒有安慰劑對照組設計 之臨床分析法。 雖然本文已出示及說明本發明某些新穎特色，且在附錄 之申請專利範圍中指明，但並無意受上述詳細說明之限 制，因為鹹暸解，習此技藝之人士可在不編離本發明精神 下，為所說明裝置之形式與細節進行各種省略、修飾、取 代及改變。 O:\79\79216.DOC 4 - 14 -