TWI241193B

TWI241193B - Human interferon-beta formulations

Info

Publication number: TWI241193B
Application number: TW091115171A
Authority: TW
Inventors: Michael Mccaman; Susanne Ottoboni; Erno Pungor
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 2001-07-09
Filing date: 2002-07-09
Publication date: 2005-10-11
Also published as: WO2003006053A1; JP2004538275A; US20030118548A1; UY27373A1; US20050163752A1; PE20030303A1; AR034749A1

Description

1241193 五、發明説明（^ 本發明有關例如-種對干擾素-β之醫藥調配物，其包括在pU2.0 土約4.〇下之甘胺酸緩衝液’及其不含有實質量之人類血清白蛋白或清潔劑。發明背景干擾素-β (” IFN-β ”）經用以治療一些醫學病狀及經探討其他一些者。為著大多數目的，使用重組產生之人類㈣· β。特別地，基因工程版本之人類IFN_p ,其中置換 Cys ( IFN β-ib”），如述於美國專利號4,588,585，已經核准以治療多發性硬化。發明簡要本發明有關例如低pH(例如pH約2 〇至約4 〇)干擾素_ β (IFN β)之，’且合物，包括甘胺酸緩衝液。本發明組合物在 f傳統穩定劑（例如人類血清白蛋白）和/或溶化劑（例如清訂潔劑）存在下係穩定為液體調配物及為凍乾物。本發明特別有關生物活性之人類„^-(3，較佳地重組IFN_p，包括 IFN-β類似物及最佳地IFN p-lb，如述於美國專利號 4,588,585。 ~ 本發明之一個特點為包括生物活性之IFN-β之IFN-β組合物，其中經加入甘胺酸緩衝液以達成約2至約4之？9，例如其中緩衝液再包括HC1 ;具有pH約2至約4之組合物，包括生物活性之IFN-β和甘胺酸緩衝液或生物活性之IFNj和甘胺酸；基本上由生物活性Ι]ΡΝ·β組成之IFN-p組合物，其中經加入甘胺酸緩衝液以達成約2至約4之？11，例如其中緩衝液包括HC1 ;或具有pH約2至約4之組合物，基本上由生物本紙張尺度適用中@國家標i^(CNS) A4規格(21GX297公寶） -4 1241193 A7 ---_ —__B7 五、發明説明（2 ) f之IFN β水和甘胺酸緩衝液，或生物活性之IFNj、水和甘胺酸組成。在本發明組合物中之水較佳地為無菌水’其例如為實f無熱原或少量礦物質，最佳地供注射之 USP 級水（WFI)。本發明之另一個特點為任何以上之IFN-β組合物，其中甘胺酸係在穩定有效量下；#中、组合物係為醫藥組合物之沁式、為供菌的或在腸外或皮下施用（例如注射或吸入）之容器内·’纟中至少75%之生物活性㈣β·11}在組合物在4 C下保存後維持至少9個月；其中IFN-p係未經酷芬化的及係在細菌宿主中產生，例如為IFN p]b，·其中組合物為實質無人類血清白蛋白或清潔劑和/或係在實質無甘油或而存在下；其中生物活性IFN邛之濃度係在約ι〇毫克/毫升至約20毫克/毫升間；及/或其中IFN_p不為非共價連結之聚集物形式。本發明之另一個特點為凍乾之IFN邛組合物，基本上由生物活性之IFN-β和甘胺酸/HC1或生物活性之IFN-p和甘胺酸組成；或包括生物活性之IFN-p和甘胺酸。本發明亦有關任何以上之凍乾IFN-p組合物；其中Ι]ΡΝ·β係未經醣荅化的及係在細菌宿主中產生，例如為IFN p-lb ;或其中至少 7 5 %之生物活性ΐΡΝ-β係可在組合物在約2 5 π下保存至少 6個月後以可溶形式回復。本發明亦有關凍乾tIFN_p組合物’由；東乾具有pH約2至約4之溶液製備，其基本上由生物活性之IFN-β、水（例如WFI)和甘胺酸緩衝液組成，以獲得該凍乾之IFN-β組合物，或由凍乾具有卩11約2至約4之溶液本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1241193 A7 B7 五、發明説明（3 ) '- 製備，其包括生物活性之IFN-β、水（例如WFI)和甘胺酸緩衝液’以獲得該凍乾之IFN-β組合物。本發明之另一個特點為製備凍乾IFN_p組合物之方法，包括;東乾具有pH約2至約4之溶液，其基本上由生物活性之 IFN-β、水（例如WFI)和甘胺酸緩衝液組成，以獲得該凍乾足IFN-β ;或包括凍乾具有pH約2至約4之溶液，包括生物活性之IFN-β和甘胺酸緩衝液，以獲得該凍乾之IFN邛組合物，或以上方法之一，其中IFN-β係未經醣：y：化的及係在細菌宿主中產生，例如為IFN β-lb。本發明之另一個特點為一種套組，包括a)含有如上之凍乾IFN-β組合物之容器及b)含有供復原該組合物之合適水溶液（例如無菌水、較佳地無菌、無熱原之水，最佳地 (WFI)。在最佳之具體實施例中，組合物包括或基本上由約5毫克/毫升之生物活性IFN β-lb在pH約3.0下之約0.02M甘胺酸/HC1緩衝液中組成。驚人地，頃發現具pH約2.0至約4.0，較佳地約3.0至約 4.0，更佳地約3.0至約3.5及最佳地約3.0，例如2.8至3.2，較佳地2.9至3 ·1之緩衝溶液提供IFN-β在液體調配物中或作為凍乾物之優良穩定性和溶解度。在較佳之具體實施例中，緩衝液為甘胺酸緩衝液，其除甘胺酸外，包括HC1。然而，許多其他類型之緩衝劑可使用（例如天冬胺酸或麩胺酸）；及許多其他類型之酸可用以調整pH(例如磷酸）。在此之討論焦注在甘胺酸/HC1緩衝液。然而，熟諳技藝者 _-6-___ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1241193

將了解此僅為可用之許多類型緩衝液之舉例。本發明緩衝液之優點係在其賦予IFN-|3穩定性和或溶解度’甚至在實質無傳統穩定劑和/或溶化劑存在下，例如人類血清白蛋白（HSA);高分子量或多元醇穩定劑/溶化劑，如聚乙二醇（PEG)、甘油、多元糖醇，或聚乙婦基吡咯啶酮或類似物，如述於例如美國專利號5,643,566、 5,004,605、3,981，991 或 4,496,537、歐洲專利號〇8〇 879或 082 481 A或BE 897,276。合適之穩定劑和溶化劑係不利於醫藥組合物，因為其增加組合物製備之成本，可導致過敏反應，及不相容於加工、凍乾和凍乾物復原之較佳pH條件。本發明緩衝液之成份，例如甘胺酸係以穩定有效量存在於組合物中。溶化劑如SDS，其可用以溶化包含物體，其中異質蛋白貝如IFN-β $以水集或變性形式由細菌產生，必須自異質蛋白貝在加工期間除去，因為如此溶化劑係有毒的和/或使/、貝蛋白貝之生物活性形式變性，例如由展開異質蛋白質足天然結構。然而，&細菌產生之異質蛋白冑，及特別地由細菌產生之抒义^在除去溶化劑或sds後遭遇溶解度問題。本發明之優點係在其提供可溶、生物活性之重組㈣· β之t足岭液’甚至在貫質無清潔劑和/或溶化劑例如Sds 或Zwit 3 14存在下。本發月之、.爰衝劑亦降低形成非共價連結之多重體或永集物（即其最適化非共價連結單體之形成）。聚集度可由傳統方法決定，例如動力光散射或粒度排斥層析法。因

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為本發明組合物係實質無穩定劑例如hsa時，本發明之 IFN-β不與例如hSA聚集（例如複合）。本發明足組合物（以液體或凍乾形式）亦提供在常溫保存條件下穩定之優點。液體調配物因此不需在保存和配銷期間冷藏。本發明提供IFN邛予無毒、在醫藥上可接受之溶劑，特別地未醣苷化之IFN-p，其在凍乾前、其間及其後提供穩定且可溶之蛋白質。人類’’IFN-β” 一詞，如在此所用，涵蓋天然人類IFN邛以及重組產生之人類IFN-β。天然來源之IFN_p包括由纖維組織母細胞，例如人類包皮纖維組織母細胞產生者。重組之人類IFN-β可在任何多種宿主細胞產生，以醣茹化形式（例如在哺乳類細胞中）或以未糖苷化形式（例如在細菌細胞中）。典型之宿主細胞包括例如哺乳類細胞，特別地倉鼠卵巢細胞（見例如美國專利號5,376,567)。在較佳之具體實施例中，IFN-β係在細菌細胞中產生，較佳地大腸桿菌。重組產生異貝蛋白質之方法為傳統的及述於例如gambrook, J·等人（1989) ’分子選殖，實驗室手冊。冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；Ausubel，F.M·等人（ 1995)，分子生物學之目前實驗計劃，紐約，約翰.懷尼氏；及Davis等人 ( 1986) ’分子生物學之基本方法，Elsevir科學出版公司，紐約。亦見美國專利號5,004,605、4,45 0，103、4,3 15,852、 4,343,73 5和4,343,736。本發明亦涵蓋1卩义0類似物。較佳之IFN-β類似物為人類重組之半胱胺酸置換突變體ifn β-lb，其含有在胺基酸17上置換天然未配對半胱胺酸殘基之 _______________- 8 -____ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1241193 A7

絲胺酸殘基，如述於例如美國專利號4，^^。 IFN-β在要以液體保存之液體調配物中之量較佳為約⑽ 毫克/毫升至約25.0毫克/毫升，更佳地自約〇·5毫克/毫升至約1〇.〇毫克/毫升，及最佳地自約1〇毫克/毫升至約1〇〇毫克/毫升。在最佳量範圍内，在要以液體保存之液體調配物中取佳4量為約5·〇毫克/毫升。在要經;東乾東乾物保存之液體調配物中IFN-β之量較佳係自〇·25毫克/毫升至約 25.0¾克/毫升，更佳地自約〇·5亳克/毫升至約IQ·。亳克/毫升，及最佳地自約1.0毫克/毫升至約1〇〇毫克/毫升。在最佳I範圍内，在要經凍乾以凍乾物保存之液體調配物中最佳之量為約5.0毫克/毫升。 •’生物活性之’’ IFN-β或IFN-β (或IFN-β類似物）之”生物活性’’如在此所用，指在細胞病變作用（CPE卜抑制分析法中生物活性之測定。如此分析法測定病毒細胞病變由干擾素之抑制I。CPE-抑制分析法係述於w.E. Stewart，干擾素系統，Springer-Verlag，紐約，1979。特定地，WISH-CP£ 分析系統可採用，如述於S.E· Gross berg等人，’’人類干擾素之生物與免疫分析法”，臨床免疫學手冊（1986)，第3 版 ’ N.R. R〇se，H. Friedman 和 J.L. Fahley(編者），華盛頓特區，295-299頁。此外，其他活性檢測系統，如MxA誘導分析法可採用，如述於E· Pungor，Jr.等人，干擾素與細胞素研究會刊（ 1998)，18卷，1025-1030頁及J· Files等人，干擾素與細胞素研究會刊（ 1998)，18卷，1019-1024頁。在本發明調配物中IFN-β之生物活性如在CPE-抑制分析 __________— 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1241193 A7 B7 五發明説明（法中測定’較佳為自約〇 75χ 1〇7 m/毫克至約12χ 1〇8 愛克’更佳地自約1·〇χ 107 m/毫克至約4·5χ 1〇7 11;/毫克，及最佳地在約3.〇xl〇7 IU/毫克。在要以液體保存或要經凍乾以凍乾物保存之液體調配物中甘胺酸之濃度較佳係自約1微莫耳濃度（mM)至約1 〇〇 mM ’更佳地自約5 mM至約50 mM，及最佳地在約20 mM 及在約2至5 mM。為著以液體調配物保存，預期IFN-|3組合物係足夠穩足’以使至少約50%，較佳地至少約75%，及更佳地至少約90%之生物活性在液體調配物在下保存後維持至少6 個月，較佳地至少約9個月，及更佳地至少1年。亦預期 IFN-β組合物係足夠穩定，以使至少約5〇%，較佳地至少約75%，及更佳地至少約9〇%之生物活性在液體調配物在常溫（〜25°C )下保存後維持至少約6個月，較佳地至少約9 個月，及更佳地至少約12個月。為著以/東乾物保存，預期IFN-β組合物係足夠穩定，以使至少約50%，較佳地至少約75%，及更佳地至少約9〇% 足生物活性可在凍乾物在常溫（約25艽）下保存至少2個月，較佳地至少4個月，更佳地至少6個月，及最佳地至少 12個月後以可溶形式回收。亦預期IFN_p組合物係足夠穩足，以使至少約5 0 %，較佳地至少約7 5 °/〇，及更佳地至少約90%之生物活性可在凍乾物在37t下保存至少約6個月，較佳地至少約9個月，及更佳地至少約12個月後以可溶形式回收。 -------10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）五 1241193 '發明説明（ ―本發明之另一特點係在本發明之IFN-β組合物，為液體周配物或為/東乾物，係實質無例如用於蛋白中分離之清潔劑和/或落化劑。本發明特別有關如此重：產生未醣甘化之IFN-β组合物，其係實質無用於蛋白質自細菌宿主分離之清潔劑和/或溶化劑。藉” 此IFN-β组合物盥立有關而右 ...... /…、有關而有耆S5〇 ppm之清潔劑和/或溶化劑含量’較佳地％ ppm，更佳地，啊，甚更佳地 $5 ppm ’及最佳地ppm。在較佳之具體實施例中，清 f狀量係不可檢出的。例如，為著SDS，SDS可檢出之最低量為約25 ppm ;因此”無SDS”組合物據稱包括α 沖二⑽。實質無清潔劑和/或溶化劑之組合物有時在此稱 ’’實質不存在”清潔劑和/或溶化劑或，，實質全部，，之清潔劑和/或溶化劑自其中除去。片、本發明亦有關穩定之IFN-P;東乾物，其可在無實質量si^ 或其他清潔劑和/或溶化劑例如Zwh 3丨4存在之水（例如 WFI)中或其他在醫藥上可接受之水溶液中復原，生成實質可洛且生物活性之IFN-p。特別佳的為可在腸外施用水溶液中復原之凍乾物。供復原凍乾物之溶液可含有想要以2 技蟄中熟知之其他在醫藥上可接受之賦形劑。本發明亦有關IFN-β調配物，其係適合以噴霧劑施用。此些可自液體製備物或自凍乾物調配，直接以粉末或在以適當液體復原後。甘胺酸緩衝之組合物亦可含附加傳統在醫藥上可接总之賦形劑’其提供例如改進之處理性質。增積劑如甘露择醇本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）訂 -線 11 1241193 、發明説明（ ::例如:為改進·β/甘胺酸緩衝溶嶋特性之醇旦如用甘路糖醇與庶糖組合亦為預期的。採用之甘露糖 /里/佳f於約50% (w/v)，更佳地約1.0%至5.0% *及瑕佳地約2，Q% (w/v)。當甘露糖醇與薦糖組合〜甘路糖醇/庶糖之比值較佳為約5Q份甘露糖醇對^份二、而更佳地約75份甘露糖醇對25份蔗糖，最佳地約1〇〇 :甘，糖醇對〇份蔗糖。甘露糖酵加上絲之總量較佳為、·力 1.0% (W/V)至約 5 〇% (w/v)，更佳地約 2 〇% ㈤V)。 =較佳之具體實施例卜跡β為細菌產生的及自其細 2百主由以下方法回收，其方法除去用於自細菌包含物體分離IFN-β之實質全部溶化劑，例如sds，及其生成實質生物活性《ΙρΝ·β。如此方法係教導於美國專利號4,術，刚和Μ43,566及特別地美國專利號5，_，6〇5。含有溶於甘胺酸緩衝溶液之汀队卩之組合物、其凍乾物及以水或其他傳統在醫藥上可接受之水媒復原之凍乾物係可以相同方式作為傳統含有IFN-β之醫藥組合物。例如，其可施至哺乳類，包括人類以治療不同之疾病和症狀，例如病母疾病、癌症、多發性硬化等。合適量之ΙΡΝ_β與施用療法’包括施用以治療不同之疾病和症狀之途徑與頻度在技蟄中係熟知的及可例行地由熟練執行者決定。劑量值和療心可對個別病患取適化。劑量之最適化可由監測臨床症狀決定。有效之劑量為例如該等實質減輕臨床症狀及/ 或減緩疾病進展者。與本發明一致之IFN-β製備物可以施用蛋白質物質之標 -12 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1241193 五發明説明準技藝之傳統方式調配。太议巧此。本發明之調外傳送下為醫藥上可接受的；配物在供㈣或非揭為操囷的，及/或經製備^ 或保存於容器中（例如小藥、、 &備和 i开瓦、〉王射液瓶、注射筒等係適合施至病患(例如經注射)。本發明之具體實施例為: 種套組，括a)含有根據本發明之㈣乾製備之器及b)含有供復原凍乾物乏人^ ^ 木钇物又合通無菌水溶液之容器，無菌水’其較佳無教原、灰被4 …、原鹆碾物質。在最佳之具體實施中，水為供注射之USP級水（WFO。由注射或吸人與在醫藥上可接受之載劑或賦形劑，單獨或與另-藥劑組合施用係較佳的。合適之調配物包括溶液或懸浮液，或乳化液或供復原成注射液之固體組合物或液體噴霧調配物。可接受之醫藥載劑為該等溶解IFN_P或將其保持在懸浮液者，及其對病患無毒性。熟諳技藝者將知道，或能確認不祇途徑實驗法，還有此組合物之特別合適醫藥載劑。見例如美國專利號4,462,940、5,643,566和 5,004,605。液體噴霧調配物可根據採用於例如美國專利號 5,941，240和 5,558,085 之方法製備。

裝訂

A 表現、分離和調配根據本發明之IFN-p和iFN-pserl7之全部物質在技藝中係已知的。例如人類IFN-p在大腸桿菌中之表現係揭示於Taniguchi等人，proc· Natl· Acad· Sci·美國（ 1980)，77卷，5230-5233頁，及人類iFN-β在倉鼠卵巢細胞中之表現係揭示於美國專利號5,376,567。IFN-β類似物，如人類重組半胱胺酸置換突變體IFN β -1 b，其含有在胺基酸17上置換天然未配對半胱胺酸殘基之絲胺酸殘基， ____- 13- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公爱） 1241193

係揭示於例如美國專利號4,588,585。合適之純化與調配方法（但非相同之調配物組份）係揭示於美國專利號 4,462,940、5,004,605 ; 5,702,669 及 5,643,566，其皆以引用之方式併入本文中。載有質體PSY2501之大腸桿菌K12/MM294-1 ,其產生 IFNβ-lb，在ATCC號39517下，置於美國菌種收集中心， 12301 Parklawn Dr·，洛克維拉，馬里蘭州，2〇852 ,美國。圖之簡要說明圖1為0.6毫克/毫升ifn β-lb在100 mM甘胺酸緩衝液， pH 3.0 在 t=0(板 A)與 t=l 週，37°C(板 B)之 RP-HPLC 層析法比較。圖2為0.1毫克/毫升ifn p-lb在含4〇/〇甘露醣醇（w/v)或 4%甘露醣醇（w/幻和1%蔗糖（w/v)i 1〇〇 mM甘胺酸緩衝液，pH 3.0之調配物之凍乾循環圖。圖3為0.1毫克/毫升IFN β-lb在含4%甘露醣醇之1〇〇 mM 甘胺酸緩衝液，pH 3 ·0經凍乾及然後在以下時間點復原之 RP-HPLC層析法比較：（1)預凍乾；（2)在t=〇時復原；（3) 在t=25週，4°C時復原；（4)在t=25週，25°C時復原；（5)在 t=25週，37°C時復原；（6)在t=2週，50°C時復原。圖4為0.1毫克/毫升IFN β-lb在含4%甘露醣醇之1〇〇 mM 甘胺酸緩衝液，pH 3.0經凍乾及然後在以下時間點復原之 RP-HPLC層析法比較：⑴在t=0時復原；（2)在8週，4t：時復原；（3)在25週，4t：時復原。

圖5為0.1毫克/毫升IFN β-lb在含4%甘露醣醇之1〇〇 mM -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1241193 A7 B7 五、發明説明（12 ) 甘胺酸緩衝液，pH 3.0經凍乾及然後在以下時間點復原之 RP-HPLC層析法比較：（1)在t=〇時復原；⑺在8週，25〇c 時復原；（3)在25週，25°C時復原。圖6為0.1¾克/¾升IFN β-lb在含4%甘露醣醇之1〇〇 mM 甘胺酸緩衝液，pH 3.0經凍乾及然後在以下時間點復原之 RP-HPLC層析法比較：（1)在t=〇時復原；（2)在8週，37它時復原；（3)在25週，37°C時復原。圖7為0.1毫克/毫升IFN β-lb在含4%甘露醣醇和1%蔗糖之100 mM甘胺酸緩衝液，PH 3.0經凍乾及然後在以下時間點復原之RP-HPLC層析法比較·（ 1)在t = 〇時復原；（2)在$ 週，4°C時復原；（3)在25週，4°C時復原。圖8為0·1毫克/ ¾升IFN β-lb在含4%甘露醣醇和1%蔗糖之100 mM甘胺酸緩衝液，pH 3.0經凍乾及然後在以下時間點復原之RP-HPLC層析法比較：（1)在t==〇時復原；（2)在8 週，25°C時復原；（3)在25週，25°C時復原。圖9為0.1¾克/ ¾升IFN β-lb在含4%甘露醣醇（調配物！）或4%甘露醣醇和1 %蔗糖（調配物2)之丨oo 甘胺酸緩衝液，pH 3.0經凍乾及然後在t=〇時復原之rp'HPLc層析法比較。圖10為0.1¾克/毫升IFN β-lb在含4°/。甘露醣醇（調配物i) 或4%甘露醋醇和1%蔗糖（調配物2)之i〇〇甘胺酸緩衝液，pH 3.0經康乾及然後在t=25週，4°C時復原之RP-HPLC 層析法比較。圖11為0.1¾克/ ¾升IFN β- lb在含4%甘露醋醇（調配物1) -15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇X297公爱) -

裝訂

、線 1241193

或4%甘靈祕給< 、、。~和1%蔗糖（調配物2)之1〇〇 mM甘胺酸緩衝夜PH 3·0經凍乾及然後在t=25週，25 °C時復原之RP-HPLC層析法比較。 ’、。圖為0·1笔克/耄升IFN β-lb在含4%甘露醣醇（調配物〇或4%甘露醣醇和1%蔗糖（調配物2)之100 mM甘胺酸緩衝 P 3 ·0、”Λ凍乾及然後在t= 8週，37。(：時復原之rp—hPLC 層析法比較。圖。U為而0·1毫克/毫升⑽β-lb在含4〇/〇甘露醣醇（調配物！）或4/°甘露醣醇和1°/。蔗糖（調配物2)之1〇〇 mM甘胺酸緩衝 :pH 3 ·〇、.Λ凍乾及在所示之溫度下保存週後復原之減 I樣品之SDS-PAGE分析圖像。樣品以二重複進行。亦示出。預凍軋樣品、在t=〇之樣品、分子量標記及ifn標準品之直行。圖14為〇·ι笔克/毫升IFN ^比在含4%甘露醣醇（調配物1) 或4%甘露醣醇和丨％蔗糖（調配物2)之100 mM甘胺酸緩衝液，pH 3.0經凍乾及在所示之溫度下保存以週後復原之未減量樣品之SDS-PAGE分析圖像。樣品以二重複進行。亦不出含預凍乾樣品、在t=〇之樣品、分子量標記及ιρΝ 準品之直行。圖15為0.1亳克/毫升IFN卜11}在含4%甘露醣醇（調配物u 或4%甘露醣醇和1%蔗糖（調配物2)之1〇〇 mM甘胺酸緩衝液，ΡΗ 3·0經凍乾及在5〇t下保存2週後復原之樣品之 SDS-PAGE分析圖像。樣品經示出為減量或未減量的。圖16為0.1毫克/毫升IFN (3-113在含4%甘露醣醇（調配物〇 -16- 本紙張尺度適财國國家標準(CNS) Μ規格(21GX297公爱)----- 1241193 A7

或4%甘露酷醇和1%蔑糖（調配物2)之⑽福甘胺酸緩衝 =阳3翁;東乾及在所示之溫度下保存—段所示之時間 4復原之試驗樣品之ΜχΑ誘導結果圖。

If之闡述，當然地熟讀技藝者可使用前面說明以怎用本發明至其最完全之境界。以下之較佳特定具體實施例□此L構成僅在說明及不以任何方式限制說明書之剩餘部分。在前面與以下之實施例中’全部溫度係為未修飾之攝氏度數；及除非另有說明，全部份量與百分比為重量比。在^面與以下之實施财，生4勿活性係以每毫升溶液之國際單位或IU/耄升表示。國際單位係如述於研究參考試劑筆記號35計算，由國家衛生研究所出版，Bethesda，馬里蘭州，有關於HuIFN-β NIH參考試劑〇^ 23-9〇2d31作為標準品。實施例實施例1 以pH與添加物為函數之溶解度及穩定性

純化之IFN β-lb在10 mM NaOH，pH 10·8之溶液，在 0.3-0.5毫克/毫升之濃度（9·6χ1〇6-ΐ·6χΐ〇7 ιυ/毫升）下，經作為原料。IFN β-lb係衍生自載有質體pSY25〇i之Κ12/ MM294-1之大腸桿菌發酵液（Atcc 395 17)，根據美國專利號5,004,605中所述之方法純化。起始IFN β-ib溶液之pH 由添加早已經滴定至要pH值之1 /1 〇體積1 μ各添加物之母液而同時調至想要之pH值。生成iFN-β溶液之pH經測定以 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

裝訂

-線 1241193 A7 B7 五、發明説明（15 ) 裝確認在添加物溶液之pH上無因為稀釋所致之顯著變化。附加之樣品係由IFN β-lb起始溶液之pH以1 N乙酸在有或無 0.1% SDS存在下調整至pH 5.0或pH 6.5而製備。樣品在4 °C下保存24小時，及IFN β-lb在溶液中剩餘之濃度係由溶液在12,000 rpm下離心2分鐘，及其上清液在酵素免疫測定法（ELISA)中測定，由相似於該等述於以下之方法：P.N. Redlich 等人，Proc· Natl· Acad· Sci·美國（1991)，88 卷， 404-4044 頁；P.N. Redlich 等人，免疫學會刊（1989)，143 卷，6期，1 887-1 893 頁；及 P.N. Redlich等人，Ein*. J. of Immunol.( 1990)，20卷，1933-1939 頁。ELISA分析之結果係示於下表1。訂

-18-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1241193 A7 B7 五、發明説明（16 ) 表1、IFN β-lb調配物之穩定性（ELISA) PH 緩衝液調配物之組成在4°C下24小時後之％回收率 10.8 lOmMNaOH 78.0 10.0 100 mM甘胺酸 6.0 9.0 100 mM甘胺酸 3.0 8.0 100 mM磷酸鈉 23.0 7.0 100 mM磷酸鋼 10.0 7.0 100 mM擰檬酸鈉 11.0 6.5 10mM 乙酸鈉，0.1%SDS 139.0 6.5 100 mM精胺酸 11.0 5.0 10mM 乙酸鈉，0.1%SDS 86.0 5.0 10 mM乙酸納 39.0 4.0 100 mM乙酸鈉 85.0 4.0 100 mM甘胺酸 50.0 4.0 100 mM檸檬酸鈉 4.0 4.0 100 mM天冬胺酸 88.0 3.0 100 mM甘胺酸 94.0 裝訂以具少於30% IFN β-lb回收率之樣品而言，顯著量之可見沉澱物在調整起始溶液之pH時立即形成。IFN β-lb在調整pH值至低於pH 10.8和高於pH 5.0時，大大不溶解，除非加入溶化劑如SDS。IFN-β之溶解度可在4°C下24小時後維持在pH 5.0和更低下，根據調整pH之添加物。乙酸鈉緩衝液和天冬胺酸緩衝液兩者在p Η 4.0下顯著地溶解及穩定 IFN-β。然而，檸檬酸鈉緩衝液並不保持IFN-β之溶解度。甘胺酸緩衝溶液在pH 3.0下得到基本上完全之IFN-β回收率。 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

線 1241193 A7 ___B7 五、發明説明（17 ) 實施例2 IFN β-lb在100 mM甘胺酸緩衝液，pH 3.0溶液之穩定性純化之IFN β-lb在100 mM甘胺酸緩衝液，pH 3(以鹽酸調整）溶液，在0.6-1.1毫克/毫升之濃度（1 9χ ι〇7-3·5χ 107 IU/毫升）下’衍生自大腸桿菌發酵液（如述於以上實施例 1)，再評估其穩定性。樣品保存在-70°c、4°C或37°C下。 IFN β-lb穩定性係由逆相高壓液相層析法（rp-hplc)分析、ELISA分析或WISH-CPE生物活性分析法評估。結果經示於表2。表2、IFN-β在100 mM甘胺酸緩衝液，PH 3.0之穩定性保存溫度時間 t=0 之 RP% t=0 之 ELISA% t=0 之 WISH% -70°C 3天 103 103 111 4t 1週 120 120 - 2週 110 110 - 37〇C 3天 97 97 197 37〇C 1週 90 90 63 實施例3 IFN-β調配物之穩定性研究以下三種調配物經評估其穩定性：調配物1 : 1.1毫克/毫升IFN β-lb在100 mM NaOAc緩衝液，pH 5.0。調配物2 : 1.1毫克/毫升IFN β-lb在100 mM NaOAc緩衝液，pH 5.0+ 0.1% SDS。調配物3 : 1.1毫克/毫升IFN β-lb在100 Mm甘胺酸緩衝 ___-20-_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1241193 A7 B7 五、發明説明（18 ) —- 液，pH 3.0。 IFN β-lb係衍生自如述於實施例1中之大腸桿菌發酵液。調配物丨-3係自IFN Mrg — 25集中液製備，由=似於該等述於美國專利號4,462,94()之方法。全部三種調配物係經連至注射器之〇·2微米過遽器過滤。單一過遽器經用於全部調配物以降低因為吸收之蛋白質損失。過遽器以水在樣品間潤洗，及含有SDS之調配物最後過濾。各調配物之穩定性在滲透壓泵（2〇〇微升容量）中在37它下培養7天後評估。泵以約215微升溶液根據泵方向過濾填充。泵在填充前及其後稱重，以確認完全填充。在37<3c下 7天後，泵經轉移至冰箱及在自泵取出溶液供分析前在4。。下保存6天。穩定性亦在各調配物之部份在〇.5毫升 Eppendorf试管中保存後評估。在Eppend〇rf試管中之樣品在37°C下培養3天和7天，及控制組樣品在4ac下保存直至义析時（約1 〇天後）。經冷凍-解凍暴露之各調配物之穩定性亦經評估。4份1 〇〇微升之各調配物在各時間點上自保存取出供分析。穩定性係由RP-HPLC、ELISA和WISH-CPE生物活性評估。RP-HPLC和ELISA結果經示於表3，及WISHCPE生物分析法結果經示於表4。接受冷凍-解凍循環之樣品（樣品在

Eppendorf試管中在_70°C下冷凍）之RP-HPLC結果指出得到完全之IFN-β回收率。樣品在Eppendorf試管中在37°C下保存1週之RP-HPLC結果顯示以下之IFN-β回收率：調配物1 之95%、調配物2之94%及調配物3之86%。以保存在泵中 ___21 · 本紙張尺度適用中國國家標準(CNs) A4規格(210X297公釐） 1241193 A7 B7 五、發明説明（19 ) 在37°C下1週之樣品而言，rp — hPLC回收率結果係如下：配物1之9 1 %、调配物2之8 8 %及調配物3之7 1 %。在栗中士立養後之回收率係較在其他相同條件下之試管者在更低4_ 15%間。比較調配物4在37°C下t=0和1週時之rp-HPLC層析圖（在試管或泵中）經示於圖1。自ELISA分析之數據較自rP — hplC分析之數據具有更大之標準差。雖是如此，自調配物1-3得到之結果係相似於該等由RP-HPLC分析得到者。調配物}和2在37 下穩定1 週，而調配物3則失去約25%之最初活性。 WISH-CPE生物分析法具有大標準偏差。此外，樣品在不同分析次數中評估，因為在一次分析中可分析的樣品數目有限。調配物1和2似乎對冷凍-解凍循環穩定，及在3 下在Eppendorf試管或在泵中穩定1週。以調配物3而言，全部結果係顯著更高於預期，及因此此調配物之結果很難評估。調配物1亦分析其生物活性，由測定在培養物中由活化單核細胞下調TNF之表現。此些樣品在37。(：下培養1週後分析及與在4°C下保存之樣品比較。此分析法顯示調配物1在 37°C下保存1週後失去18%活性。 _ -22- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規4(210 X 297公£5- 1241193 A7 B7 五、發明説明（2〇表 3、RP-HPLC與 ELISA結果製備物 # 分析法 t-0 冷凍-解凍-70°C 在37°C下 3天在37°C下 7天在37°C下7 天(系） RP-HPLC 微克/毫升微克/毫升微克/毫升微克/亳升微克/毫升 1 1112 1224 1121 1063 1010 2 1094 1107 1087 1031 960 3 1076 1082 997 920 761 ELISA 1 790 1620 1160(789) 1010(556) nt 2 (970) 1100 1470(925) 1530(824) nt 3 860 600 830 860 nt 裝 0中之數目係自第2次分析。 nt=未測試。表4、WISH-丨 CPE生物活， f生結果製備物# t=0 冷凍-解凍在37°C下3天在37°C下7天在37°C下7 天(泵） IU/毫升 IU/毫升 IU/毫升 IU/亳升 IU/毫升 1 1.04χ108+ 9.8〇χ107+ 3.28x10s* 1.36χΐ〇8* 3.14χ l〇8# 3.56x10” 2 1·28χ108+ 1·09χ108+ 2.11x10s" 2·05χΐ〇8* 4·69χ1〇8# 2.1〇χ108* 3 5.17χ107+ 8.2〇χ108# 2.94x10s* 3·1〇χΐ〇8* 1·08χ109* — 訂麻樣品在同一天處理。樣品在同一天處理。樣品在同—天處理。實施例4 凍乾之IFN β-lb在甘胺酸緩衝液，pH 3.0之穩定性 -23- 本紙張尺度適用中國國家操準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐） 1241193 A7 B7 五、發明説明（21 ) 束乾之IFN β係自純化之重組IFN β -1 b在1 00 mM甘胺酸緩衝液，pH 3.0(以鹽酸調整）之溶液，在0.1毫克/毫升 (3·2χ106 IU/毫升）之濃度下製備。IFN β-lb係衍生自如述於實施例1中之大腸桿菌發酵液。小藥瓶（5.0毫升）經填充以1毫升量之IFN β_ lb溶液。凍乾完成後，當仍在真空時，用灰色橡皮蓋將藥瓶密封。凍乾之IFN β-lb藥瓶在-70 °C或在50°C下保存及在實驗之選定時間點上以1毫升水復原以注射。重組之IFN β-lb樣品由RP-HPLC分析、ELISA 分析或WISHCPE生物活性分析評估其IFN β-lb濃度。IFN β-lb樣品濃度之評估結果經示於下表5。在50°C下培養之樣品係由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法（PAGE)分析。表5、復原之IFN β-lb凍乾物（％預凍乾量）保存溫度時間 RP-HPLC WISH-CPE ELISA -70°C 1個月 87 - - -70°C 6個月 92 121 - 50°C 2週 - - 85 結果展現在甘胺酸緩衝溶液，pH 3.0中調配之凍乾IFN β-lb在保存在-70°C時係穩定至少6個月及保存在50°C時2 週。在復原樣品中>85% IFN β-lb之回收率係在全部時間點上測得。在實驗全程未見到IFN β-lb之RP-HPLC側析圖變化及凍乾之IFN β-lb在甘胺酸緩衝溶液，pH 3.0中由 SDS-PAGE未檢出IFN β-lb之降解。實施例5 凍乾之IFN β-lb在甘胺酸緩衝液+甘露糖醇或甘胺酸緩 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1241193 A7 B7 五、發明説明（22 ) 衝液+甘露糖醇/蔗糖中之穩定性凍乾之IFN β-lb調配物係自含有以下之溶液製備：0.1毫克/毫升IFN β-lb、100 mM甘胺酸緩衝液，pH 3.0之溶液及由4%甘露醣醇（調配物1)或4%甘露醣醇和1 %蔗糖（調配物2)組成之增積劑。IFN β-lb係衍生自如述於以上實施例 1中之大腸桿菌發酵液。小藥瓶（5.0毫升）經填充以1毫升量之IFN β-lb溶液。凍乾完成後，當仍在真空時，用灰色橡皮蓋將藥瓶密封。藥瓶保存在4 °C和25 °C下及在實驗全程之選定時間點上以1毫升水復原以注射。復原之樣品由逆相HPLC分析IFN β-lb之純度（表6)及在WISH CPE中分析其生物活性（表7)。表6、如由RP-HPLC測定之復原IFN β-lb凍乾物裝復原時間調配物保存溫度 (0〇 0 2週 4週 8週 25週 1 4 99 99 99 99 98 1 25 99 99 99 98 97 2 4 100 100 100 100 99 2 25 100 100 100 100 99 訂

線 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1241193 A7 B7 五、發明説明（23 ) 表7、如由WISHCPE分析法測定之復原IFN β-lb凍乾物調配物保存溫度(°C) 0 IU/毫升 8週 IU/毫升 28週 IU/毫升 ------- 1 4 8.71χ106 1.04Χ107 1 25 5.83χ106 1.75χ1〇7 1 37 1.32χ107 2 4 3.82χ106 4.92χ106 '2 25 6·3〇χ106 6.39Χ106 2 37 5·4〇χ106 保存在4°C與25°C下多至25週後未檢出IFN β-lb純度之顯著變化。此結果顯示甘胺酸緩衝溶液調配物之未預期優越性於無在傳統上需要之穩定劑如HSA之存在下，提供穩定之IFN β-lb調配物，特別地未經醣:y：化之凍乾〗|7^ β-lb ° 實施例6 在凍乾之IFN β-lb在甘胺酸緩衝液+甘露醋醇或甘胺酸緩衝液+甘露醣醇/蔗糖中穩定性之進一步研究兩種甘胺酸基質、不含HSA之IFN β-lb調配物在凍乾後經測試其穩定性。兩種IFN β -1 b調配物係如下·· 調配物1 : 0.1亳克/毫升IFN ^:^在丨⑽mM甘胺酸緩衝液，pH 3.0加上4%甘露醣醇。 #]配物2: 0.1 毫克 / 亳并 β 1h;4irm w 兀毛开抄N β-lb在100 甘胺酸緩衝液，pH 3.0加上4%甘露醣醇和丨％蔗糖。 IFN β·1{^衍生自如述於實施例1中之大腸桿菌發酵液。IFN β-lb係自IFN p_lt^G_25集中液製備（由以上實 -26- 1241193 A7 B7 五、發明説明（24 ) 施例3中所述之方法製備），其再在Q-Sephar〇se(G-25Q)上純化以降低糖類之值。各調配物之約75個藥瓶經填充供滚乾及IFN β-lb調配物之其他藥瓶經填充及保存在_7〇艽下，以作為預/東乾控制組樣品。West公司藥瓶（5毫升）經填充以1 ·0毫升之調配溶液。調配物兩者同時經凍乾及自；東乾之循環數據經示於圖2。樣品經冷凍至_43它及保持5小時。初次乾燥在-35 C下進行25小時，接著在_ 1〇它下4小時。第二次乾燥在22 C下進行12小時。藥瓶在全真空（〜5〇毫托）下，使用非石夕S同化20 mM西44 16/50塞子蓋好。 IFN β -1 b调配物之復原係由添加1.〇毫升水（wfi)至藥瓶而完成。各調配物之藥瓶保存在4°C、25°C和37°C下，及樣品在t=2、4、8、12和25週下取出及復原，以檢視穩定性。各調配物之兩個藥瓶在滚乾後立即復原及在_ 7 〇下冷凍供其後分析t=0復原控制組。復原溶液經區分至 Eppendorf試管（0.5毫升/試管）中及保存在-7〇它下直至分析。兩種調配物之凍乾得到具優良外觀之塊狀物。無明顯之收縮及所有塊狀物為白色而具平滑之頂部。卡耳費雪殘留水份僅在一時間點上測定，使用已保存在-7〇。〇下約6個月之藥瓶。卡耳費雪分析係使用Aquastar比色滴定器，曱醇作為萃取溶劑，及不含吡啶之試劑（c〇ul〇mat A和c，EM 科學）。殘留水份結果在兩種調配物中係相似的：調配物1 為0.63%及調配物2為0.75% (各調配物兩個藥瓶之平均）。調配物2之凍乾樣品在更高之培養溫度下隨時間生成黃/棕 ____-27- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1241193

巴。凋配物2樣品保存在37。〇下2至8週後變黃色。調配物2 在2 5 C和4 C保存條件未見到黃化。調配物1樣品在全部保存條件下維持白色。在全部時間點上，兩種調配物之樣品在復原時乂即落入溶液（< 3 〇秒）。全部白色塊狀物所生成 /谷液I色澤為澄清的。黃/棕色之調配物2樣品得到相同之有色洛液。任何樣品未見到混濁。復原之樣品由多種方法分析其穩定性，包括Rp_HpLc、 ELISA、SDS-PAGE、WISH-CPE生物活性及生物活性之 MxA誘導分析法。RP-HPLC數據係簡要於下表8和9。報導之RP-HPLC數據為各調配物兩個藥瓶之平均值結果。在任何兩個二重複之藥瓶間未檢出顯著差異。以在不同數據上分析足各組樣品而言，預凍乾和t=〇樣品在該等數據上分析比較。王斗預凍乾和t= 〇樣品之分析值在最後表列之數據中平均。調配物1之層析圖經示於圖3-6。預凍乾樣品與在t=〇復原之凍乾樣品得到相同的結果。保存在4它下25週之樣品層析圖基本上相同於預凍乾樣品與在t=〇樣品之層析圖，而例外的是在〜6分鐘時析出之小的新尖峰（圖3和4)。以保存在25 C和37 C下之樣品而言，見到主要IFN卜比尖峰之一些見化，而尖峰高度之同時降低，分別在25週和8週之時間點開始（圖5和6)。此外，見到在主要IFN ^lb尖峰（38_ 45分鐘）後物質之增加。在〜6分鐘時析出之小尖峰係見於保存在4°C下之樣品中，亦見於保存在25它和37<1：下之樣品，及尖峰在此些樣品中略大（圖3)。 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)

裝訂

線 1241193 A7 ____ B7 五、發明説明（26 ) 調配物2之層析圖經示於圖7和8。預凍乾樣品與在卜〇復原之凍乾樣品之層析圖皆相同。保存在4。〇下2 5週之樣品層析圖基本上相同於預凍乾樣品與在t=〇樣品之層析圖。以保存在25 C下之樣品而言，在25週之時間點上紀錄到主要IFN β-lb尖峰之些微寬化（圖8)。比較調配物1和2在相同時間與溫度條件下之層析圖經示於圖9-12。以保存在4°C下25週之兩種調配物樣品而言，當與預，東乾樣品及在0樣品之層析圖比較時，未檢出層析圖之顯著變化（圖3和10)。以保存在25 °C下之調配物2樣品而言，在25週時主要IFN β-lb尖峰之寬化程度係較調配物 1所見者更輕微（圖11)。亦相對於調配物1樣品，在保存在 25 t下調配物2樣品之逆相側析圖中未見到後溶析尖峰之增加。以保存在3 7 °C下之調配物1樣品而言，逆相側析圖之變化係相似於，但更廣泛於保存在25它下之樣品側析圖所見足變化。相反地，保存在371下之調配物2樣品相較於基本上未檢出降解之低溫保存樣品下，顯示顯著增加之降解（圖1 1和12)。簡T之’ RP-HPLC分析展現在調配物i*IFn β-lb之降解造成主要IFN β-lb尖峰之寬化及後溶析尖峰量之增加，其明顯對應於以低量存在於預凍乾樣品之後溶析尖峰。因此，由RP-HPLC檢出之降解途徑似乎相似於檢視之溫度範圍’及降解之I P过增加之保存時間和溫度而增加。相反地，相較於更低保存溫度，在3 7 °C下未顯著增加調配物2 之降解。廣泛降解經檢出為主要IFN |3 _丨b尖峰之顯著寬 -29- I紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）— ---' ^ 1241193 A7 B7 五、發明説明（化。不若調配物1，後溶析物質在預凍乾樣品中在低量下不解析為尖峰。以調配物2而言，降解路徑在較低溫度下保存t樣品中會不同於在升高溫度下保存之樣品。在大部份保存時間/溫度點上之復原樣品係由ELISA分析及頭不向度變化之結果（表丨〇)。在任何研究之溫度下保存 25週之兩種調配物樣品中似乎保持顯著量之elisa活性。復原之樣品亦由SDS_PAGE分析。分析包括調配物1和2 之兩種減量與未減量樣品，其保存在4它、25它和37^下 25週以及預凍乾和t=〇樣品（圖13和14)。樣品在ι〇-2〇%麥頁嗣凝膠上分析（precase N〇vex)。相較於預凍乾控制組下’任何樣品未檢出新條線。在IFN |3_113中所見之明顯變化為保存在37°C下25週之調配物2樣品中IFN β-lb條線之略高分子量移動。此變化可見於減量與未減量樣品中。相較於t=0樣品下，調配物1樣品未檢出IFN p-lb之變化，而相較於t=0樣品下，調配物2樣品有著輕微增加之ifn β-lb 移動性（圖1 3)。此IFN β -1 b移動性之變化似乎相似於保存在3 7°C下25週之調配物2樣品中所見者。有限量之樣品在WISH CPE生物分析法與MxA誘導分析法中分析生物活性（表1丨）。此些分析法經用以測定是否生物活性在特定條件下仍保持著。以WISH CPE生物分析法而言，IFN β-lb在〜80微克/毫升濃度（如由RP-HPLC所示）下之理論生物活性為3·8χ106 IU/毫升。結果顯示對預凍乾與t=0樣品之預期活性有著良好一致性。WISH CPE結果指出在全部保存溫度下兩種調配物之生物活性有顯著之保 ______-30- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) ' 1241193

留。此些相同樣品亦在MxA謗導分析法中測試其生物活性 (圖16) ^調配物1當保存在4°c和37°C時似乎保有顯著之生物活性。保存在4°C和37°C下之樣品低值也許亦因為稀釋误差。调配物2全部顯示如t= 0樣品百分比之相同生物活 f生建議著典顯著之時間依賴和/或溫度依賴之生物活性損失。表8、調配物# 1之逆相HPLC數攄溫度時間微克/毫升 1=0之％ %純度預凍乾 88.0 94.6 0 83.4 100.0 94.0 2週 83.5 100.1 93.9 4° 4週 82.5 98.9 93.7 8週 85.5 102.5 93.7 25週 82.0 98.3 93.3 預凍乾 88.0 94.6 0 83.4 100.0 94.0 25° 2週 82.5 98.9 93.6 4週 80.5 86.5 93.7 8週 81.5 97.7 93.1 25週 72.5 86.9 91.9 預滚乾 88.0 94.6 0 83.4 100.0 94.0 2週 81.0 97.1 92.1 4週 77.0 92.3 91.2 37。 8週 74.0 88.7 90.1 25週 64.5 113 91.2 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1241193 A7 B7 五、發明説明（29 ) 表9、調配物#2之逆相HPLC數據溫度時間微克/毫升护0之％ %純度預束乾 87.0 94.0 0 85.2 100.0 94.0 2週 85.5 100.4 93.9 4° 4週 87.5 102.7 93.9 8週 87.5 102.7 94.1 25週 81.0 95.1 93.4 預凍乾 87.0 94.0 0 85.2 100.0 94.0 25° 2週 89.0 104.5 93.9 4週 90.5 106.2 94.2 8週 91.5 107.4 94.2 25週 75.5 88.6 93.4 預陳乾 87.0 94.0 0 85.2 100.0 94.0 2週 84.5 99.2 94.1 4週 81.0 95.1 93.9 37° 8週 71.0 83.3 93.1 25週 63.5 74.5 66.8 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1241193 A7 B7 五、發明説明（30 ) 表10 、復原樣品之ELISA結果調配物# 1 溫度時間 1:=0之％ 4°C 4週 56 8週 85 12週 68 25週 104 25〇C 4週 55 8週 215 12週 66 25週 105 37〇C 4週 79 8週 271 12週 49 25週 80 調配物# 2 溫度時間 t=0 之％ 4t 4週 56 8週 276 12週 58 25週 97 25〇C 4週 61 8週 290 12週 50 25週 63 37〇C 4週 51 8週 246 12週 33 25週 49 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1241193 A7 B7 五、發明説明（31 ) 表11、復原樣品之生物活性結果調配物# 1 溫度時間 WISHCPE IU/毫升 t=0 之 MxA% 預凍乾 6.55χ106 0 8.71χ106 100 4°C 25週 1.04χ107 107 25。。 8週 5.83χ106 87 25〇C 25週 1.75χ107 11 37〇C 25週 1.32χ107 117 調配物# 2 溫度時間 WISHCPE IU/毫升 t=0 之 ΜχΑ% 預凍乾 3.53χ106 0 3.82χ106 100 4°C 25週 4.92χ106 68 25〇C 8週 6·3〇χ106 74 25〇C 25週 6.39χ106 73 37〇C 25週 5.4〇χ106 75 絕對固有於本說明書之文内及自前面之實施例，’’甘胺酸緩衝液π —詞指足夠之酸經加入以達成所示pH之甘胺酸。亦固有的係典型見於甘胺酸緩衝液之組份可使用，只要不是不相容於IFN β之使用。組份可包括無機鹽，例如 Mg、Ζη、Κ、Na等，只要在病患中無有害作用係由鹽所致。前面實施例可由本發明一般或特定描述之反應物和/或操作條件取代該等用於前面實施例者而同樣成功地重複。 -34- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1241193 A7 B7 五、發明説明（32 ) 以上和以下所引之全部申請案、專利和出版物之整個揭示書皆以引用之方式併入本文中。自前面描述，熟諳技藝者可輕易確定本發明之基本特性及不偏離其精神與範疇，可製作本發明之不同變化和修飾，以將其調適於不同之用途與條件。 -35- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

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Claims

12411¾ 091115171號專利申請案 = -DO 中文申請專利範圍再替換本(94年5

ι· 一種用於治療病毒疾病、癌症、多發性硬化的醫藥組合物，其基本上由生物活性之IFN-p-lb及達成ΡΗ約2至约 4之甘胺酸緩衝液或天冬胺酸緩衝液組成，且其基本上不含甘油及聚乙二醇。 2·如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中緩衝液達成 3.0至 3.5之pH。 3·如申凊專利範圍第1項之醫藥組合物，其中緩衝液達成 2.8至 4之pH。 4·如申明專利範圍弟1項之醫樂組合物，其中緩衝液達成 3.1 至4之pH。 5·如申凊專利範圍第1項之醫藥組合物，其中緩衝液達成約3.0之pH。 6.如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其進一步含有水0 7·如申請專利範圍第i項之醫藥組合物，其中緩衝液含有 Ηα。 8·如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其進一步含有在醫藥上可接受之載劑。 9. 如申請專利範圍第丨項之醫藥組合物，其係無菌的。 10. 如申請專利範圍第！項之醫藥組合物，其中75%之生物活性IFN-p-lb在組合物在4°C下保存後維持至少9個月。 11. 如申請專利範圍第丄項之醫藥組合物，其中IFN_p-1b係未經醣菩化的及在細菌宿主中產生。 12·如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中75%之生物 79460-940531 .doc A8 B8 C8 D8 1241193 六、申請專利範圍活性IFN-hlb在組合物在37t：下保存後維持至少9個月。 13·如申請專利範圍第！項之醫藥組合物，其中組合物係會質無人類血清白蛋白。 14·如申請專利範圍第卜員之醫藥組合物，其中組合物不含可檢出量之清潔劑。 15.如申請專利範圍第5項之醫藥組合物，其中生物活性 IFN-P-lb之濃度係約〇·25毫克/亳升至約2 5毫克/毫升。 16·如申請專利範圍第15項之醫藥組合物，其中生物活性 IFN-β - lb之濃度係約1毫克/毫升。 17. 如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其包括在約pH 3.0之甘胺酸緩衝液中之約5毫克/亳升之生物活性IFN-p_ lb ° 18. 如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中甘胺酸緩衝液含有HC1。 19·如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中iFN 0_113不為非共價連結之聚集物形式。 20. 如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中甘胺酸緩衝液為100 mM甘胺酸緩衝液。 21. 如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中甘胺酸或天冬胺酸成份係以穩定有效量存在。 22·如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中甘胺酸成份係以約1 mM至約100 mM之濃度存在。 23.如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中甘胺酸.成份 79460-940531 .doc - 2 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1241193

係以約2-5 mM之濃度存在。 24. 如申請專㈣圍第卜頁之醫藥组合⑯，其係在供腸外或皮下施用之容器内。 25. 如申請專利範圍第丨項之醫藥組合物，其中腸外或皮下施用係由注射或吸入。 26·如申請專利範圍第}項之醫藥組合物，其係凍乾的。 27·如申請專利範圍第26項之醫藥組合物，其由生物活性之IFN-P_lb及達成ρΙ^々2至約4之甘胺^緩衝液或天冬胺酸緩衝液組成之組合物製備。 28. —種用於治療病毒疾病、癌症、多發性硬化的套組，其包括 a) 含有如申請專利範圍第26項之凍組合物之容器及 b) 含有無菌、無熱原水之容器。 29·如申請專利範圍第28項之套組，其進一步於“和/或b) 之容器中和/或於分開之容器中，含有在醫藥上可接受之賦形劑。 30·—種製備如申請專利範圍第1項之醫藥組合物之方法，其包括製備達成pH約2-4之甘胺酸緩衝液或天冬胺酸緩衝液，及將該緩衝液與IFN-β帶至組合物中。 31·—種製備如申請專利範圍第26項之醫藥組合物之方法，其包括凍乾基本上由生物活性之IFN-β-lb及達成pH約2 至約4之甘胺酸緩衝液或天冬胺酸緩衝液，組成之組合物。 79460-940531.doc . 3 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1241193 申請專利範園 32.-種製備如令請專利範園第28项之套組之方法，包括放置/東乾之IFN-p-lb組合物至容器中。 33·如申請專利範圍第1項之醫藥組合物發性硬化。 34·如申請專利範圍第1項之醫藥組合物下施用至需要彼等之病患。 35·如申請專利範圍第34項之醫藥組合物外或皮下。 36.如申請專利範圍第2 1項之醫藥組合物酸成分，1¾克/毫升之IFN-f3-lb且其具有約為4之 pH。 37·如申睛專利範圍第1項之醫藥組合物，其基本上由生物活性之IF N - β - 1 b及達成ρ η約2至約4之天冬胺酸緩衝液組成。 38·如申請專利範圍第37項之醫藥組合物，其含有1毫克/毫升之IFN-p-lb且其具有約為4之pH。其係用於治療多其係由腸外或皮其中施用係由腸其含有該天冬胺 79460-940531.doc 4 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇 X 297公茇)