TWI233450B - Recombinant Candida rugosa lipases - Google Patents

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1233450 A7 B7 五、發明説明（1 ) 先前技術 脂肪酶（EC3.1.1.3)能催化廣範圍之化學反應，其包括非 特異性及立體-特異性水解、酯化、轉移酯化及相互酯化。 此外，其能催化在水-脂肪交界面之酯鍵之水解。例如參見 Ader 等人，（1997)^/^/^(^五/22>^〇/.286:351 -385; Gandhi ( 1997) J. Am. Oil Chem. Soc. 74:621 -634 ； Klibanov (1990) dee. C/zem· 23:114- 120 ; Shaw 等人，（1990) 5沁35:132-137 ;以及Wang 等人，（ 1988) Biotechnol· Bioeng, 31:628-633 o 由於其之催化能力，市售脂肪酶中之皺褶假絲酵母菌脂 肪酶係在生物工業中廣泛使用。一般而言，粗製皺褶假絲 酵母菌脂肪酶被用於幾乎所有生物催化應用，然而，已報 告來自各種供應廠之酶在催化效力及立體特異性上顯示差 異0 參見 Barton 等人，（1990) Enzyme Microb. Technol. 12:577-583。數種脂肪酶異構物（即同功異構酶）已自粗製皺 褶假絲酵母菌脂肪酶單離出，以及此等脂肪酶之同功異構 酶顯示在催化效力及特異性上不同。參見Shaw等人，（1989) Biotechnol. Lett. 11:779-784 ; Rua 等人，（1993) 少/dcia 1156:181-189 ; Diczfalusy 等人，（ 1997) Biochem· Biophys · 34S:l-S。 至目前為止，得自皺褶假絲酵母菌之5種編碼脂肪酶之基 因組序列已被鑑定特徵。參見例如，Longhi等人，（1992) 广^[cia 1131:227-232 以及 Lotti 等人， ( 1993) 124:45-55。5種編碼脂肪酶之基因（LIP1， O:\73\7325I.DOOLLM - 4 " 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）

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線 1233450 A7 B7 五、發明説明（2 ) 2，3，4及5)已藉由群落雜合從酵母菌中之皺褶假絲酵母 菌之化cl基因組庫中單離出。該5種基因編碼具534個殘基 之成熟蛋白質，其分別具有長15個胺基酸（在LIP1，3，4及 5中）及14個胺基酸（在LIP2中）之推定信號胜肽。該五種推 衍出之胺基酸序列共有66%之總相同性（identity)及84%之 相似性（similarity)。由於該5種推衍出之胺基酸序列間之高 度序列類似性（homology)以及該5種脂肪酶基因之不同表現 度（Lee 等人，（1999) Appl· Environ. Microbiol· 65:3888-3895)，直接自皺褶假絲酵母菌之培養物以工業應用之製造 規模純化各同功異構酶是困難的。 再者，雖然此等同功異構酶在催化三聯體（包括胺基酸 S209、H449及E341)及涉及雙硫鍵形成之部位（包括胺基酸 C60、C97及C268及C277)皆為保守性（conserved)，但其在 N -糖基化部位、等電點及其疏水性圖譜中之一些其他特徵 上則不相同。此外，各同功異構酶可能主導某些性質，諸 如催化效力及特異性。參見Chang等人，（1994) 5如ec“o/· jp〆5/ocAem. 19:93-97。因此，期望利用皺褶假絲酵母菌 脂肪酶之同功異構酶之基因選殖及功能性表現以製造出具 有某些適於工業應用之性質之純同功異構酶。 不過，皺褶假絲酵母菌為二態（dimorphic)酵母菌，其 中三聯碼CTG(為白胺酸之通用密碼子）被譯讀為絲胺酸。 結果皺褶假絲酵母菌同功異構酶之功能性表現在一般宿主 細胞（其中CTG被譯讀為白胺酸）内變成無法實施。見.

Kawaguchi 等人，（ 1989) 341:164-166。 O:\73\73251.DOaLLM - 5 - 本紙張尺度適用中國國家操準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

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線 1233450 A7

1233450 A7 B7 五、發明説明（4 ) 性之多肽序列之DNA。事實上，只要多肽之預期催化能力 未被完全除去，多肽序列無須為上述胺基酸序列之全長。 舉例言之，突變序列為含有序列編號3，5，9及1 1之核甞 酸序列之至少1070個核甞酸（例如1200或1500個核甞酸）之 功能性片段；或者為編碼含有序列編號4，6，10及12之胺 基酸序列之多肽之功能性片段，其中該片段包括至少350個 胺基酸（例如400或500個胺基酸）。 術語「單離核酸」係指一種核酸，其結構不同於任何天 然產核酸之結構，或者不同於橫跨3個以上分開基因之天然 產基因組核酸之任何片段之結構。因此，該術語涵蓋，例 如，（a)具有天然產基因組DNA分子之一部份之序列，但其 兩側非均為在生物之天然產基因組中該部份分子之兩側之 編碼序列；（b)被納入載體或者原核細胞或真核細胞之基因 組DNA中之核酸，且其被納入之方式為能使生成之分子不 同於任何天然產之載體或基因組DNA ; (c)分離之分子諸如 cDNA、基因組片段、聚合酶鏈反應（PCR)產生之片段或限 制片段（restriction fragment);以及（d)為雜合基因（亦即編碼 融合蛋白質之基因）之一部分之重組核棼酸序列。本發明之 上述單離核酸可被引進微生物中並在其中表現，該微生物 亦在本發明之範圍内。該微生物之例子有細菌（例如大腸桿 菌）或酵母菌（例如巴斯德畢赤酵母菌（Pichia Pastoris ))。 二胺基酸序列或二核酸序列之「相同性百分率」（或「類 似性百分率」）可用Thompson等人之計算法（CULSTALW， 1994 22:4673-4680)決定。胺基酸序列或 O:\73\73251.DOaLLM - 7 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（5 ) 核甞酸序列亦可被用做「查詢序列」以對公用資料庫進行 搜尋，例如鑑定相關序列。此等搜尋可用Karlin及Altschul 之計算法（ 1990 iVoc· A^/· ZcW. &ζ·. USA 87:2264-2268)進 行，且如 Karlin 及 Altschul ( 1993 尸Λ^ί/. dead. 5W. USA 90:5873-5877)所述修飾。該計算法被納入Altschul等 人之 NBLAST 及 XBLAST 程式（ 1990 /.M?/.5^/.215:403-410)。81^8丁核省:酸搜尋用NBLAST程式進行，其中分數= 100以及字長=12。BLAST蛋白質搜尋用XBLAST程式進 行，其中分數=50以及字長=3。在二序列間存在缺口之 場合，利用 Altschul 等人（ 1997 TVwc/ez’c Λα. 25:3389- 3402)所述之加缺口 BLAST (Gapped BLAST)。當使用 BLAST 及加缺口 BLAST程式時，使用個別程式（例如XBLAST及 NBLAST)之缺陷參數。參見http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。 在另一方面，本發明之特徵在於提供一種編碼皺褶假絲 酵母菌脂肪酶之突變DNA之製法。該方法包括提供一編碼 皺褶假絲酵母菌脂肪酶之野生型DNA ;以及藉由將野生型 DNA、DNA聚合酶、一對包含野生型DNA之全部之外部引 子以及許多對分別包含野生型DNA之片段之内部引子混合 而進行PCR增幅。「外部引子」為被設計成增幅突變DNA 之全部之PCR引子，以及「内部引子」為被設計成增幅突 變DNA之片段之PCR引子；引子不論為外部引子或内部引 子皆可運作。各内部引子包括一個或多個選自TCT、TCC、 TCA、TCG、AGT、AGC、AGA、GGA、TGA、CGA、 ACT及GCT中之絲胺酸之通用密碼子或反密碼子，其中該 O:\73\7325I.DOOLLM - 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（6 ) 通用达碼子或反密碼子對應於野生型DNA中之至少個 CTG密碼子。再者，各内部引子以可得到編碼皺褶假絲酵 母菌脂肪酶之突變DNA之方式與另一内部或外部引子交 疊。 再方面’本發明之特徵為提供一種嵌合敏褶假絲酵母 菌脂肪酶，其包括第一皺褶假絲酵母菌脂肪酶之受質交互 作用領域及第二皺褶假絲酵母菌脂肪酶之非受質交互作用 領域（例如羧酸酯酶領域）。舉例言之，第二皺褶假絲酵母 菌脂肪酶為序列編號8之多肽以及第一皺褶假絲酵母菌脂肪 酶為序列編號4 ’ 6，1 〇或12之多肽。 上述核酸在製造供生物催化應用之皺褶假絲酵母菌脂肪 酶方面之用途亦在本發明之範圍内。 本發明之其他特徵，目的及優點從本說明書及申請專利 範圍將顯而易知。 詳細說明 本發明係關於一種編碼皺褶假絲酵母菌脂肪酶之單離聚 核甞酸，該皺褶假絲酵母菌脂肪酶包含序列編號2所述之胺 基酸序列。本發明之發明者發現一種被稱為皺褶假絲酵母 菌脂肪酶8之新穎敏褶假絲酵母菌脂肪酶，其包含序列編號 2所述之胺基酸序列。本發明之新穎脂肪酶8之基因衍生自 具脂肪酶產生能力之敏褶假絲酵母菌。脂肪酶8之基因較佳 具有序列識別編號1所述之核酸序列。 以下所列者為皺褶假絲酵母菌脂肪酶8之核酸序列以及其 所:二 、 O:\73\7325 l.IX)C\LLM · 9 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) '" ~ 1233450 A7 B7 五、發明説明（7 ) 皺褶假絲酵母菌脂肪酶8 1 ATG GAG CTC GCT CTT GCG CTC CTG CTC ATT GCC TCG GTG GCT GCT 45 1 MELALALSLIASVAA 15 46 GCC CCC ACC GCC ACG CTC GCC AAC GGC GAC ACC ATC ACC GGT CTC 90 16 APTATLANGDTITGL 30 91 AAC GCC ATC ATC AAC GAG GCG TTC CTC GGC ATT CCC TTT GCC GAG 135 31 NAIINEAFLGIPFAE 45 136 CCG CCG GTG GGC AAC CTC CGC TTC AAG GAC CCC GTG CCG TAC TCC 180 46 PPVGNLRFKDPVPYS60 181 GGC TCG CTC GAT GGC CAG AAG TTC ACG CTG TAC GGC CCG CTG TGC 225 61 GSLDGQKFTSYGPSC75 226 ATG CAG CAG AAC CCC GAG GGC ACC TAC GAG GAG AAC CTC CCC AAG 270 76 MQQNPEGTYEENLPK90 271 GCA GCG CTC GAC TTG GTG ATG CAG TCC AAG GTG TTT GAG GCG GTG 315 91 AALDLVMQSKVFEAV 105 316 CTG CCG CTG AGC GAG GAC TGT CTC ACC ATC AAC GTG GTG CGG CCG 360 106 SPSSEDCLTINVVRP 120 361 CCG GGC ACC AAG GCG GGT GCC AAC CTC CCG GTG ATG CTC TGG ATC 405 121 PGTKAGANLPVMLWI 135 406 TTT GGC GGC GGG TTT GAG GTG GGT GGC ACC AGC ACC TTC CCT CCC 450 136 FGGGFEVGGTSTFPP 150 451 GCC CAG ATG ATC ACC AAG AGC ATT GCC ATG GGC AAG CCC ATC ATC 495 151 A Q Μ I T K S I A M G K P I I 165 496 CAC GTG AGC GTC AAC TAC CGC GTG TCG TCG TGG GGG TTC TTG GCT 540 166 HVSVNYRVSSWGFLA 180 541 GGC GAC GAG ATC AAG GCC GAG GGC AGT GCC AAC GCC GGT TTG AAG 585 181 GDEIKAEGSANAGLK 195 586 GAC CAG CGC ATG GGC ATG CAG TGG GTG GCG GAC AAC ATT GCG GCG 630 196 DQRMGMQWVADNIAA 210 631 TTT GGC GGC GAC CCG AGC AAG GTG ACC ATC TTT GGC GAG CTG GCG 675 O:\73\73251.DOCM-LM - 10 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（8 ) 211 FGGDPTKVTIFGESA 225 676 GGC AGC ATG TCG GTC ATG TGC CAC ATT CTC TGG AAC GAC GGC GAC 720 226 GSMSVMCHILWNDGD 240 721 AAC ACG TAC AAG GGC AAG CCG CTC TTC CGC GCG GGC ATC ATG CAG 765 241 NTYKGKPLFRAGIMQ 255 766 CTG GGG GCC ATG CCG CCG CTG GAC CCG GCG GAC GGC GTC TAC GGC 810 256 SGAMPPSDPADGVYG 270 811 AAC GAG ATC TTT GAC CTC TTG GCG TCG AAC GCG GGC TGC GGC AGC 855 271 NEIFDLLASNAGCGS 285 856 GCC AGC GAC AAG CTT GCG TGC TTG CGC AGTGTG CTG AGC GAC ACG 900 286 ASDKLACLRSVSSDT 300 901 TTG GAG GAC GCC ACC AAC AAC ACC CCT GGG TTC TTG GCG TAC TCC 945 301 LEDATNNTPGFLAYS 315 946 TCG TTG CGG TTG CTG TAC CTC CCC CGG CCC GAC GGC GTG AAC ATC 990 316 SLRLSYLPRPDGVNI 330 991 ACC GAC GAC ATG TTT GCC TTG GTC CGC GAG GGC AAG TAT GCA AGC 1035 331 TDDMFALVREGKYAS 345 1036 GTT CCT GTG ATC ATC GGC GAC CAG AAC GAC GAG GGC ACC TTC TTT 1080 346 V P V I I G D Q N D E G T F F 360 1081 GGC ACC CTG CTG TTG AAC GTG ACC ACG GAT GCC GAG GCC CGC CAG 1125 361 GTSSLNVTTDAEARQ 375 1126 TAC TTT AAG GAG TTG TTT GTC CAC GCC AGC GAC GCG GAG CTC GAC 1170 376 Y F K E L F V H A S D A E L D 390 1171 ACG TTG ATG ACG GCG TAC CCC CAG GAC ATC ACC CAG GGT CTG CCG 1215 391 TLMTAYPQDITQGSP 405 1216 TTC GAC ACG GGT GTT CTC AAC GCC CTC ACC CCG CAG TTC AAG AGA 1260 406 F D T G V L N A L T P Q F K R 420 1261 ATC CTG GCG GTG CTC GGC GAC CTT GCC TTC ATC CAC GCC CGT CGC 1305 421 ISAVLGDLAFIHARR435 1306 TAC TTC CTC AAC CAC TAC ACC GGC GGC ACC AAG TAC TCA TTC CTC 1350 O:\73\7325 l.DOCi-LM -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇X 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（9 ) 436 YFLNHYTGGTKYSFL 450 1351 CTG AAG CAG CTC CTG GGC TTG CCG GTG CTC GGA ACG TTC CAC TCC 1395 451 SKQLSGLPVLGTFHS 465 1396 AAC GAC ATT GTC TTC CAG GAC TAC TTG TTG GGC AGC GGC TCG CTC 1440 466 NDIVFQDYLLGSGSL 480 1441 ATC TAC AAC AAC GCG TTC ATT GCG TTT GCC ACG GAC TTG GAC CCC 1485 481 I Y N N A F I A F A T D L D P 495 1486 AAC ACC GCG GGG TTG TTG GTG AAG TGG CCC GAG TAC ACC AGC AGC 1530 496 NTAGLLVKWPEYTSS 510 1531 CTG CAG CTG GGC AAC AAC TTG ATG ATG ATC AAC GCC TTG GGC TTG 1575 511 SQSGNNLMMINALGL 525 1576 TAC ACC GGC AAG GAC AAC TCC CGC ACC GCC GGC TAC GAC GCG TTG 1620 526 YTGKDNSRTAGYDAL 540 1621 TTC TCC AAC CCG CCG CTG TTC TTT GTG TAA 1650 (SEQ ID NO:l) 541 FSNPPSFFV* (SEQ ID NO:2) 本發明係關於一種包括突變DNA之單離核酸，該突變 DNA與編碼皺褶假絲酵母菌脂肪酶之野生型DNA具有至少 80%相同性。 下文所列者為皺褶假絲酵母菌脂肪酶2、皺褶假絲酵母菌 脂肪酶3、皺褶假絲酵母菌脂肪酶4、皺褶假絲酵母菌脂肪 酶5及皺褶假絲酵母菌脂肪酶8之突變核酸序列，其中所有 對應於野生型DNA中之絲胺酸之所有CTG密碼子已被通用 絲胺酸密碼子取代。已突變之核苷酸以黑底表示。被編碼 之胺基酸序列亦被列出。 皺褶假絲酵母菌脂肪酶2

TCGATGAATTCACGTGGCCCAGCCGGCCGTCTCGGATCG

IgHcccacSgccacIct

CGC CAACGGCGACACCATCACCGGTCTCAACGCC 90 -12-

〇:\73\7325l.D〇aLLM 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（1〇 )

SMNSRGPAGRLGSVPTATLANGDTITGLNA ATTGTCAACGAAAAGTTTCTCGGCATACCGTTTGCCGAGCCGCCCGTGGGCAfflcTCCG CTTCAAGCCGCCCGTGCCGTACTCGGCGTCG 180

IVNEKFLGIPFAEPPVGSLRFKPPVPYSAS ctcaacggccagcagtttaccHJtacggcccgBBtgcatgcagatgaaccctatgggc TCGTTTGAGGACACACTTCCCAAGAATGCG 270

LNGQQFTSYGPSCMQMNPMGSFEDTLPKNA cBHaIttggtgctccagtccaagatcttccaagtggtgcttcccaacgacgaggactgt CTCACCATCAACGTGATCCGGCCGCCCGGC 360

LDLVLQSKIFQVVLPNDEDCLTINVIRPPG ACCAGGGCCAGTGCTGGTCTCCCGGTGATGCTCTGGATCTTTGGCGGTGGGTTTGAGCT TGGCGGCTCCAGCCTCTTTCCAGGAGACCAG 450

TRASAGLPVMLWIFGGGFELGGSSLFPGDQ ATGGTGGCCAAGAGCGTGCTCATGGGTAAACCGGTGATCCACGTGAGCATGAACTACCG CGTGGCGTCATGGGGGTTCTTGGCCGGCCCC 540

MVAKSVLMGKPVIHVSMNYRVASWGFLAGP GACATCCAGAACGAAGGCAGCGGGAACGCCGGCTTGCATGACCAGCGCTTGGCCATGC AGTGGGTGGCGGACAACATTGCTGGGTTTGGC 630

DIQNEGSGNAGLHDQRLAMQWVADNIAGFG

BkcGGGCAGCATGTCGACGTTTGT 720

GGCGACCCGAGCAAGGTGACCATATACGGCGAG

GCACCTTGTGTGGAACGACGGCGACAACACG

GDPSKVTIYGESAGSMSTFVHLVWNDGDNT tacaacggcaagccgttgttccgcgccgccatcatgcagHggctgcatggtgccg|

IgACCCGGTGGACGGCACGTACGGCACCGAG 810

YNGKPLFRAAIMQSGCMVPSDPVDGTYGTE -13-

O:\73\73251.DOOLLM 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（11 )

ATCTACAACCAGGTGGTGGCGTCTGCCGGGTGTGGCAGTGCCAGCGACAAGCTCGCGTG cttgcgcggccttiHcaggacacgttgtac 900

IYNQVVASAGCGSASDKLACLRGLSQDTLY caggccacgagcgacacgcccggcgtgttggcgtacccgtcgttgcggttgHitatct CCCGCGGCCCGACGGCACCTTCATCACCGAC 990

QATSDTPGVLAYPSLRLSYLPRPDGTFITD GACATGTATGCCTTGGTGCGGGACGGCAAGTACGCACACGTGCCGGTGATCATCGGCGA CCAGAACGACGAGGGCACTTTGTTTGGGCTC 1080

DMYALVRDGKYAHVPVIIGDQNDEGTLFGL HSHttgaacgtgaccacagatgctcaggcacgggcgtacttcaagcagButtcatc CACGCCAGCGATGCGGAGATCGACACGTTG 1170

SSLNVTTDAQARAYFKQSFIHASDAEIDTL atggcggcgtacaccagcgacatcacccagggtHIccgttcgacaccggcatcttcaa TGCCATCACCCCGCAGTTCAAACGGATC 团 1260

MAAYTSDITQGSPFDTGIFNAITPQFKRIS

GCGTTGCTTGGCGACCTTGCGTTCACGCTTGCGCGTCGCTACTTCCTCAACTACTACCAG GGCGGCACCAAGTACTCGTiJcTcHaAG 1350

ALLGDLAFTLARRYFLNYYQGGTKYSFLSK cagcttUSBgggttgcccgtcttgggcaccttccacggcaacgacatcatctggcaggac TACTTGGTGGGCAGCGGCAGTGTGATCTAC 1440

QLSGLPVLGTFHGNDIIWQDYLVGSGSVIY CAACGACCTC 丨 gIBcao AACAACGCGTTCATTGCGTTTGCC CAACTGGCCCACGTACACCAGCA< GACCCGAACAAGGCGGGCTTGTGGAC 1530

NNAFIAFANDLDPNKAGLWTNWPTYTSSSQ

jGCAACAACTTGATGCAGATCAACGGCTTGGGGTTGTACACCGGCAAGGACAACTT -14 本紙银尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（12 ) CCGCCCGGATGCGTACAGCGCCCTCTTTTCC 1620 SGNNLMQINGLGLYTGKDNFRPDAYSALFS AACCCGCcBBriTCTTTGTG 1641 (SEQIDNO:3) N P P S F F V (SEQ ID NO:4) 皺褶假絲酵母菌脂肪酶3

：CCACCGCCAAGCTCGC

TCGATGAATTCACGTGGCCCAGCCGGCCGTCTCGGATCG

CAACGGCGACACCATCACCGGTCTCAACGCC

SMNSRGPAGRLGSVPTAKLANGDTITGLNA ATCATCAACGAGGCGTTCCTCGGCATTCCCTTTGCCGAGCCGCCGGTGGGCAACCTCCG CTTCAAGGACCCTGTGCCGTACTCTGGCTCG 180

IINEAFLGIPFAEPPVGNLRFKDPVPYSGS CTCAACGGCCAGAAGTTSACT[B〇TACGGCCCGjHiTGCATGCAGCAGAACCCCGAGGG CACGTTTGAAGAGAACCTTGGCAAGACGGCA 270

LNGQKFTSYGPSCMQQNPEGTFEENLGKTA CTCGACTTGGTGATGCAGTCCAAGGTGTTCCAGGCGGTGCTTCCCCAGAGTGAGGACTG CCTCACCATCAACGTGGTGCGGCCGCCGGGC 360

LDLVMQSKVFQAVLPQSEDCLTINVVRPPG ACCAAGGCGGGCGCCAACCTCCCGGTCATGCTCTGGATCTTTGGCGGTGGGTTTGAGAT CGGCAGCCCCACCATCTTCCCTCCCGCCCAG 450

TKAGANLPVMLWIFGGGFEIGSPTIFPPAQ ATGGTCACCAAGAGTGTGCTCATGGGCAAGC|CATCATCCACGTGGCCGTCAACTACCG TGTTGCCTCGTGGGGGTTCTTGGCTGGTGAT 540

MVTKSVLMGKHIIHVAVNYRVASWGFLAGD GACATCAAGGCCGAGGGCAGCGGGAACGCCGGCTTGAAGGACCAGCGTTTGGGCATGC AGTGGGTGGCAGACAACATTGCCGGGTTCGGC 630 -15-

O:\73\7325I.DOOLLM 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1233450 A7 B7 五、發明説明（13

DIKAEGSGNAGLKDQRLGMQWVADNIAGFG ggcgacccgagcaaggtgac||atctttggcgagHgcgggcagcatgtccgtgttgtg CCACCTCATCTGGAACGACGGCGACAACACG 720

GDPSKVTIFGESAGSMSVLCHLIWNDGDNT TACAAGGGCAAGCCGTTGTTCCGCGCGGGCATCATGCAG 团GGAGCCATGGTGCCgB IgACCCGGTGGACGGCACGTACGGCAACGAG 810

YKGKPLFRAGIMQSGAMVPSDPVDGTYGNE

ATCTACGACCTCTTTGTCTCGAGTGCTGGCTGTGGCAGCGCCAGCGACAAGCTCGCGTG cttgcgcagtgcgHagcgacaccttgctc 900

IYDLFVSSAGCGSASDKLACLRSASSDTLL

gatgccaccaacaacactcctgggttcttggcgtactcctcgttgcggttgHtaJctI

CclcGGCCCGACGGCAAGAACATCACCGAT 990

DATNNTPGFLAYSSLRLSYLPRPDGKNITD

fCAAGT, GfflCTC

GACATGTACAAGTTGGTGCGCGACGGC CCAGAACGACGAGGGCACCATCTTTG ATGCAAGCGTTCCCGTGATCATTGGCGA 1080

DMYKLVRDGKYASVPVIIGDQNDEGTIFGL

rCTTCT

iTTGAACGTGACCACGAATGCTCAGGCCCGTGCTTACTTCAAGCAGBSrTCATC 1170

CACGCCAGCGACGCGGAGATCGACACCTTG

SSLNVTTNAQARAYFKQSFIHASDAEIDTL

TCAA

atggcggcgtacccccaggacatcacccagggt8SBccgttcgacac1gg8St|H CGcHTCACCCCGCAGTTCAAGAGAATcBajJ 1260

MAAYPQDITQGSPFDTGVLNALTPQFKRIS GCGGTGCTCGGCGACCTTGCATTCATCCACGCCCGCCGCTACTTCCTCAACCACTTCCAG GGCGGCACCAAGTACTCGTTCCTCiHaAG 1350

AVLGDLAFIHARRYFLNHFQGGTKYSFLSK

O:\73\73251.I •16- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（14 ) CAGCTC|0〇GGGTTGCCAATCATGGGCACCTTCCATGCCAACGACATTGTGTGGCAGGA CTACTTGTTGGGAAGCGGCAGCGTCATCTAC 1440

QLSGLPIMGTFHANDIVWQDYLLGSGSVIY AACAACGCGTTTATCGCGTTCGCCACCGACTTGGACCCCAACACCGCGGGGTTGTTGGT GAACTGGCCCAAGTACACCAGCAGcHcAG 1530

NNAFIAFATDLDPNTAGLLVNWPKYTSSSQ

Hggcaacaacttgatgatgatcaacgccttgggcttgtacaccggcaaggacaactt CCGCACCGCTGGCTACGACGCGTTGATGACC 1620 SGNNLMMINALGLYTGKDNFRTAGYDALMT AACCCgBBBBtTCTTTGTG 1641(SEQIDNO:5) N P S S F F V (SEQ ID NO:6) 下文所列者為皺褶假絲酵母菌脂肪酶4之突變核酸序列及 其所編碼之胺基酸序列，其在Archives of Biochemistry and Biophysics，Vol. 387, No· 1，March 1，ρρ· 93-98, 2001 中被公 開。 皺褶假絲酵母菌脂肪酶4

GlfflCCCACTGCCACGCTCGC

TCGATGAATTCACGTGGCCCAGCCGGCCGTCTCGGATCG CAACGGCGACACCATCACCGGTCTCAACGCC 90

SMNSRGPAGRLGSVPTATLANGDTITGLNA ATCATCAACGAGGCGTTCCTCGGTATTCCCTTTGCTCAGCCGCCGGTGGGCAACCTCCGC TTCAAGCCGCCTGTGCCGTACTCGGCGTCT 180

IINEAFLGIPFAQPPVGNLRFKPPVPYSAS CTckATGGTCAGAAGTTTACirHG丁 A 丁 GGCCCtHgTGCATGCAGATGAACCCATTGGGC AACTGGGACTCCTCGCTTCCCAAGGCTGCC 270

LNGQKFTSYGPSCMQMNPLGNWDSSLPKAA -17-

O:\73\73251.DOC\LLM 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210X297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（15 ) ATCAACuETTGATGCAGTCCAAGCTCTTCCAGGCGGTGCTTCCTAACGGCGAGGACTGT CTCACCATCAACGTGGTGCGGCCG^BgGC 360

INSLMQSKLFQAVLPNGEDCLTINVVRPSG ACCAAGCCGGGTGCCAACCTCCCCGTGATGGTGTGGATTTTTGGCGGCGGGTTTGAGGT TGGCGGCTCCAGTCTCTTCCCTCCCGCACAG 450

TKPGANLPVMVWIFGGGFEVGGSSLFPPAQ ATGATCACCGCCAGCGTGCTTATGGGCAAGCCCATCATCCACGTGAGCATGAACTACCG CGTTGCTTCGTGGGGGTTCTTGGCTGGTCCA 540

MITASVLMGKPIIHVSMNYRVASWGFLAGP GACATCAAGGCCGAGGGCAGCGGGAACGCCGGTTTGCACGACCAACGCTTGGGTTTGCA GTGGGTGGCGGACAACATTGCCGGGTTCGGC 630

DIKAEGSGNAGLHDQRLGLQWVADNIAGFG

GGCGACCCGTCCAAGGTGACCATCTTTGGTGA TCAGCTCCTCTGGAACGACGGCGACAACACG gHggcgggcagcatgtcggtaatgtg 720

GDPSKVTIFGESAGSMSVMCQLLWNDGDNT TACAACGGCAAGCCGTTGTTCCGTGCCGCCATCATGCAG 豳 GGGGCCATGGTGCCGj GGACCCGGTGGATGGGCCCTACGGCACGCAG 810

YNGKPLFRAAIMQSGAMVPSDPVDGPYGTQ

ATCTACGACCAGGTGGTTGCTTCAGCCGGCTGTGGCAGTGCCAGCGACAAGCTCGCGTG cttgcgcagcatcHgaacgacaaactcttc 900

IYDQVVASAGCGSASDKLACLRSISNDKLF CAGGCCACCAGCGACACTCCGGGGGCCTTGGCGTACCCCTCGTTGCGGTTGI CCGCGGCCCGACGGCACCTTCATCACCGAT 990

TC

GTTTCTC

QATSDTPGALAYPSLRLSFLPRPDGTFITD

GACATGTTCAAGTTGGTGCGCGACGGCAAGTGTGCCAACGTTCCGGTGATCATTGGCGA -18-

O:\73\73251.DOOLLM 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（16 )

CCAGAACGACGAGGGCACAGTGTTTGCGTTG 1080 DMFKLVRDGKCANVPVIIGDQNDEGTVFAL I_ ygSEBlTTGAACGTGACTACGGATGCTCAGGCACGCCAGTACTTCAAGGAAB^TTCAT CCACGCCAGCGACGCGGAGATCGACACCTTG 1170

SSLNVTTDAQARQYFKESFIHASDAEIDTL ATGOCOOCGTACCCCAGCGA^^ CGCCATCACCCCGCAGTTCAAACGGATTGCA 1260 MAAYPSDITQGSPFDTGIFNAITPQFKRIA GCGGTGCTTGGTGACCTTGCGTTCACTCTCCCCCGGCGCTACTTCCTCAACCACTTCCAG GGCGGCACCAAGTACTCGTTCCTCHGAAG 1350 AVLGDLAFTLPRRYFLNHFQGGTKYSFLSK CAGcnffllooc CTTTTTGGTGAG· GGTTGCCGGTGATTGGCACCCACCACGCCAACGACATTGTGTGGCAGGA CCACAGCAGCGCCGTGTAC 1440 QLSGLPVIGTHHANDIVWQDFLVSHSSAVY AACAACGCGTTTATTGCCTTTGCCAACGACCTCGACCCGAACAAGGCCGGTTTGCTTGTG AACTGGCCCAAGTACACCAGC AGC 团CAG 1530 NNAFIAFANDLDPNKAGLLVNWPKYTSSSQ Iggcaacaacttgttgcagatcaacgccttgggcttgtacaccggcaaggacaactt CCGCACCGCTGGCTACGACGCGTTGTTTACC 1620 SGNNLLQINALGLYTGKDNFRTAGYDALFTΑΑοααοΒΒΗττΙτττατΙ N P S S F F V (SEQ ID NO:8)皺褶假絲醏母茴脂肽g每5 1641 (SEQIDNO:7) tcgatgaattcacgtggcccagccggccgtctcggatcgSta

GiECCCACflGCCACGCTCGC

CAACGGCGACACCATCACCGGTCTCAACGCC

O:\73\73251.I 19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 x 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（17 ) SMNSRGPAGRLGSVPTATLANGDTITGLNA ATCATCAACGAGGCGTTCCTCGGCATTCCCTTTGCCGAGCCGCCGGTGGGCAACCTCCG CTTCAAGGACCCTGTGCCGTACCGTGGGTCT 180

IINEAFLGIPFAEPPVGNLRFKDPVPYRGS

CTCAACGGTCAATCCTTCACCGCGTACGGTCCG CACCTACGAGGAGAACCTCCCCAAGGTGGCG JTGCATGCAGCAGAACCCCGAGGG 270 LNGQSFTAYGPSCMQQNPEGTYEENLPKVA CTTGACTTGGTGATGCAGTCCAAGGTGTTCCAGGCTGTTCTCCCCAACAGCGAGGACTG CCTCACCATCAACGTGGTGCGGCCGCCGGGC 360 LDLVMQSKVFQAVLPNSEDCLTINVVRPPG ACCAAGGCGGGCGCCAACCTCCCGGTCATGCTCTGGATCTTTGGCGGTGGGTTTGAGAT CGGCAGCCCCACCATCTTCCCTCCCGCTCAG 450

TKAGANLPVMLWIFGGGFEIGSPTIFPPAQ atggtctccaagagtgtgctcatgggcIagcccatcatcgacgtggccgtcaactaccg CTTGGCGTCCTTTGGTTTCTTGGCCGGTCCG 540 MVSKSVLMGEPIIHVAVNYRLASFGFLAGP GACATCAAGGCCGAGGGCAGCTCCAATGCCGGCCTCAAGGACCAGCGCTTGGGCATGCA GTGGGTGGCAGACAACATTGCCGGGTTCGGC 630

DIKAEGSSNAGLKDQRLGMQWVADNIAGFG GGCGACCCGAGCAAGGTGACCATCTTTGgIgAG 团GCGGGCAGCATGTCCGTGTTGTG

CCACCTTCTCTGGAATGGCGGCGACAACACG 720 gdpskvtifgesagsmsvlchllwnggdnt tacaagggcaagccgttgttccgcgcgggcatcatgcagH1ggagccatggtgccg| IgACCCGGTGGACGGCACCTATGGaIcCCAA 810

YKGKPLFRAGIMQSGAMVPSDPVDGTYGAQ

O:\73\7325I.DOOLLM -20- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（18 ) ATCTATGACACGTTGGTGGCTuSQACGGGCTGCAGCAGTGCCAGCAACAAGCTTGCGTG cttgcgtggtcttJHBactcaggcattgctc 900

IYDTLVASTGCSSASNKLACLRGLSTQALL

gatgccaccaacgacacccctgggttcttgtcgtacacctcgttgcggttgBBta|ctS

CcScGGCCCGACGGCGCCAACATCACCGAT 990

DATNDTPGFLSYTSLRLSYLPRPDGANITD GACATGTACAAGTTGGTACGCGACGGCAAGTATGCAAGCGTTCCCGTGATCATTGGCGA CCAGAACGACGAGGGCTTCTTGTTTg|tCTC 1080

DMYKLVRDGKYASVPVIIGDQNDEGFLFDL BSBSSBttgaacaccaccaccgaggccgacgccgaggcatacctcagaaagBptcatc CACGCCACCGACGCCGATATCACCGCATTG 1170

SSLNTTTEADAEAYLRKSFIHATDADITAL

AAGGCGGCGTACCCCAGCGATGTCACCCAGGG CGCCCTTACACCCCAGCTCAAGCGGATCAAT tHccgttcgacacgggcattctcaa 1260

KAAYPSDVTQGSPFDTGILNALTPQLKRIN GCTGTGCTTGGCGACCTCACCTTTACCCTCTCGCGCCGCTACTTCCTCAACCACTACACC GGTGG 丁 CCCAAGTACTCGTTCC 丁 cHaAG 1350

AVLGDLTFTLSRRYFLNHYTGGPKYSFLSK CAGCTTuSlGGiTTGCCCATTCTCGGSACGTTCCACGCGAACGACATTGTGTGGCAGCAC TTTTTGTTGGGCAGCGGCAGCGTCATCTAC 1440

QLSGLPILGTFHANDIVWQHFLLGSGSVIY aacaacgcgttcatcgcgtttgccaccgacttggaccccaacaccgcgggcttgBBgt GCAGTGGCCCAAGtIcaCCAGCAGcIIBcaG 1530

NNAFIAFATDLDPNTAGLSVQWPKYTSSSQ

GCGGGGGACAACTTGATGCAGATCAGTGCCTTGGGCTTGTACACCGGCAAGGACAACTT O:\73\7325l.l -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（19 ) CCGCACCGCCGGCTACAACGCTTTGTTTGCC 1620 A G D N L M Q ISALGLYTGKDNFRTAGYNALFA GACCCG 团 CACTTTTTCGTG 1641 (SEQIDNO:9) D P S H F F V (SEQmNOrlO) 皺褶假絲酵母菌脂肪酶8

:CCAC〇GCCACGCTCGC

TCGATGAATTCACGTGGCCCAGCCGGCCGTCTCGGATCG CAACGGCGACACCATCACCGGTCTCAACGCC 90

SMNSRGPAGRLGSVPTATLANGDTITGLNA ATCATCAACGAGGCGTTCCTCGGCATTCCCTTTGCCGAGCCGCCGGTGGGCAACCTCCG CTTCAAGGACCCCGTGCCGTACTCCGGCTCG 180 e

IINEAFLGIPFAEPPVGNLRFKDPVPYSGS ctcgatggccagaagttcacBHtacggcccgHtgcatgcagcagaaccccgaggg CACCTACGAGGAGAACCTCCCCAAGGCAGCG 270

LDGQKFTSYGPSCMQQNPEGTYEENLPKAA ctcgacttggtgatgcagtccaaggtgtttgaggcggtgBjccgBHagcgaggactg TCTCACCATCAACGTGGTGCGGCCGCCGGGC 360

LDLVMQSKVFEAVSPSSEDCLTINVVRPPG ACCAAGGCGGGTGCCAACCTCCCGGTGATGCTCTGGATCTTTGGCGGCGGGTTTGAGGT GGGTGGCACCAGCACCTTCCCTCCCGCCCAG 450

TKAGANLPVMLWIFGGGFEVGGTSTFPPAQ ATGATCACCAAGAGCATTGCCATGGGCAAGCCCATCATCCACGTGAGCGTCAACTACCG CGTGTCGTCGTGGGGGTTCTTGGCTGGCGAC 540

MITKSIAMGKPIIHVSVNYRVSSWGFLAGD GAGATCAAGGCCGAGGGCAGTGCCAACGCCGGTTTGAAGGACCAGCGcilGGGCATGC AGTGGGTGGCGGACAACATTGCGGCGTTTGGC 630

O:\73\73251.I -22- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（2〇 )

EIKAEGSANAGLKDQRMGMQWVADNIAAFG ggcgacccgaccaaggtgaccatctttggcgagHgcgggcagcatgtcggtcatgtg CCACATTCTCTGGAACGACGGCGACAACACG 720

GDPTKVTIFGESAGSMSVMCHILWNDGDNT jt|cc 、g|9Bg( TACAAGGGCAAGCCGCTCTTCCGCGCGGGCATCATGCAGJHJGGGGCCATGGTfflCCGi OOACGcSoTOOACOOcir^^^ 81〇

YKGKPLFRAGIMQSGAMVPSDAVDGVYGNE atctttgacctcttggcgtcgSacgcgggctgcggcagcgccagcgacaagcttgcgtg cttgcgcggtgtg|Hagcgacacgttggag 900

IFDLLASDAGCGSASDKLACLRGVSSDTLE gacgccaccaacaacacccctgggttcttggcgtactcctcgttgcggttg|B|ta|ctc CC|CGGCCCGACGGCGTGAACATCACCGAC 990

DATNNTPGFLAYSSLRLSYLPRPDGVNITD

CCTGTGATCATCGGCGA gacatgtuu|gccttggt!cgcgagggcaagtatgc| CCAGAACGACGAGGGCACCTTCTTTGGCACC 1080 DMFALVREGKYASVPVIIGDQNDEGTFFGT |TTGAACGTGACCACGGATGCciAGGCCCGc|AGTACTTCAiGCAGi

TCTTCT

riTTGTC CACGCCAGCGACGCGGAGHTCGACACGTTG SSLNVTTDAEARQYFTQSF ATGACGGCGTACCCcHJjACATCACCCAGGGHHiCCGTTCGACACGGGl CGCCCTCACCCCGCAGTTCAAGAGAATClHl 1260 MTAYPQDITQGSPFDTGVLNALTPQFKRIS gcggtgctcggcgaccttgBctiSaIHcEHgc|cgtcgctacttcctcaaccactacacc V H A iBwHc

1170 SDAELDTL

rCTCAA :ii1aHcHgc :ctcBHaag

GGCGGCACCAAGTACTCATTCCTCIHIAAG 1350 AVLGDLAFIHARRYFLNHYTGGTKYSFLSK -23-

O:\73\73251.DOOLLM 本紙倀尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（21 ) CAGCTCEHlGGCTTGCCGGTGCTCGGAACGTTCCACTCCAACGACATTGTCTTCCAGGAC TACTTGTTGGGCAGCGGCTCGCTCATCTAC 1440

QLSGLPVLGTFHSNDIVFQDYLLGSGSLIY

:GGACTT ffljCAG AACAACGCGTTCATTGCGTTTGCCACi

GAAGTGGCCCGAGTACACCAGCAGC GGACCCCAACACCGCGGGGTTGTTGGT 1530

NNAFIAFATDLDPNTAGLLVKWPEYTSSSQ

Sggcaacaacttgatgatgatcaacgccttgggcttgtacaccggcaaggacaact| 1620

CCGCACCGCCGGCTACGACGCGTTGTTCTCC

SGNNLMMINALGLYTGKDNSRTAGYDALFS 1641(SEQIDNO:ll)

AACCCGCCGfHlTTCTTTGTG N P P S F F V (SEQIDNO:12) 各突變DNA與其之對應野生型DNA間之差異係由於CTG 密碼子用通用絲胺酸密碼子取代，此外，亦可能由於基因 密碼子之簡併，該基因密碼子之簡併將產生基於通用密碼 子而編碼野生型皺褶假絲酵母菌脂肪酶或其功能同等性胺 基酸序列之DNA變型。含有該突變DNA之單離核酸可被用 於在常用宿主細胞中選殖及表現皺褶假絲酵母菌脂肪酶。 DNA變型可具有特定原核細胞或真核細胞偏好之密碼子。 密碼子，可根據密碼子被宿主利用之頻率來選擇，以增加 在原核細胞或真核細胞宿主中多肽之表現率。突變DNA尚 可包括野生型DNA上之變異諸如核甞酸取代、刪除、反轉 或插入。該變異可修改皺褶假絲酵母菌脂肪酶之選殖、加 工及表現。 方才所述之突變DNA，可藉由部位-指向性突變誘發法將 -24-

O:\73\73251.DOOLLM 本紙張尺度適中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（22 ) 高度特異性之核甞酸取代（即突變）引進至核酸序列中之界 定位置而製備。例如參見Zoller and Smith ( 1983) MeiA· Enzymol· 100:468 y人反 Molecular Cloning, A Laboratory

Manual { 1 9 8 9) Sambrook ， Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, Ν·Υ· Chapter 15。另外，突變 DNA可用本技藝已知之化學方法全部或部份合成。參見 Caruthers et al. ( 1 980) NucL Acids Res. Symp. Ser. 215-223 以及Horn et al. ( 1 980) iVW/. dczA 办m/?· Ser· 225-232。更特定而言，引進多個突變可經由各種藉由例如聚合 酶鏈反應（PCR)、脂肪酶鏈反應（LCR)或交疊伸長聚合酶鏈 反應之方法而達成。參見Ge and Rudolph ( 1997) BioTechniques 〇 突變DNA可編碼序列編號4，6，10或12之多肽。或者， 其可編碼具有與序列編號4，6，10或12有90%相同性或有 1，5，10，50或以上個胺基酸不同之胺基酸序列之多肽變 型。若需要整列比對（alignment)以供比較，則應將序列整 列成具最大類似性。多肽變型與序列編號4，6，10或12編 碼之多肽之至少一催化活性，例如酯键水解或酯化有相關 性。多肽變型可具有「保守性（conservative)」改變，其中 被取代之胺基酸具有相似結構或化學性質。具有相似支鏈 之胺基酸殘基之族群在本技藝中業經界定。此等族群包括 具有鹼性支鏈（例如離胺酸、精胺酸及組胺酸），酸性支鏈 (例如天冬胺酸及穀胺酸），未帶電極性支鏈（例如甘胺酸、 天冬醯胺、穀胺醯胺、絲胺酸、羥丁胺酸、酪胺酸及半胱 O:\73\73251.DOOLLM - 25 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(2i〇x 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（23 ) 胺酸）’非極性支鏈（例如丙胺酸、纈草胺酸、白胺酸、異 白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸及色胺酸），分 枝支鏈（例如羥丁胺酸、纈草胺酸及異白胺酸）以及芳香族 支鏈（例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及組胺酸）之胺基 酸。在一些實施例中，多肽變型可具有「非保守性」改 變，例如白胺酸用甲硫胺酸取代。再者，多肽變型亦可包 括胺基酸刪除或插入或二者。決定何種胺基酸殘基可被取 代、插入或刪除而不會喪失催化活性之指南可用本技藝已 知之電腦程式，例如DNASTAR軟體尋找。 已熟知角質素酶為最小之脂解酶，其三度空間結構已被 決定且被認為係具有較廣活性之酯酶（亦包括水解脂肪）。 根據二級結構（例如α -螺旋或沒-股）之整列比對，皺褶假 絲酵母菌脂肪酶多肽鏈之拓樸結構與角質酶者相似（LIP 1及 LIP3之二度空間結構已被決定’例如參見Grochulski et al. ( 1993) /· 5b/.以挪· 268:12843-12847 ;以及Ghosh et al. ( 1995) Arwciwre 3: 279-288)。所以根據脂肪酶之共同交疊 模式（Cygler et al. (1997) 284:3-37),測 定出敵褶假絲酵母菌脂肪酶之最小功能性片段在殘基1 〇〇_ 456之範圍内（例如2股至8，9螺旋，總共約350個胺基酸及 1070個核甞酸）。 具有序列編號2之胺基酸序列之多肽與野生型皺褶假絲酵 母菌脂肪酶1不同之處在於20個胺基酸（即M184L、 P245V、P249A、A250V、V253I、S280G、F320Y、 S330N 、 V331I 、 E357Q 、 Q360E 、 E364Q 、 L365S 、 -26- 裝

線

O:\73\7325I.DOC\LLM 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（24 ) L3 74I、Q3 83 G、V3 95I、A414G、I416T、H417L、 S 5 1 7 F )，約為野生型皺禮假絲酵母菌脂肪酶1全部5 3 4個 胺基酸之3.7%。具有序列編號4之胺基酸序列之多肽與野生 型皺褶假絲酵母菌脂肪酶2不同之處在於N-端胜肽（即 SMNSRGPAGRL GS)以及4個胺基酸（即 A1V、T35S、R78L 及H79D)。具有序列編號6之胺基酸序列之多肽與野生型皺 褶假絲酵母菌脂肪酶3不同之處在於N-端胜肽及5個胺基酸 (即 A1V、P148H、I395V、F396L 及 I399L)。具有序列編號 1 0之胺基酸序列之多肽與野生型皺褶假絲酵母菌脂肪酶5不 同之處在於N:端胜肽及5個胺基酸（即A1V、K147E、 T256A、G346D及S492Y)。具有序列編號12之胺基酸序列 之多肽與野生型皺褶假絲酵母菌脂肪酶1不同之處在於N-端胜肽及17個胺基酸（即A1V、L184M、I253V、N265D、 Y320F、N330S、I331V、Q357E、E360Q、K363T、I374L、 G383Q、I395V、G414A、T416I、L417H 及 F517S)(約為野 生型皺褶假絲酵母菌脂肪酶1全部5 3 4個胺基酸之3.2%)。 上述多肽可藉由使用含有本發明之單離核酸之表現載體 製造。在本文中，術語「載體」係指一種核酸分子，其能 輸送與其連結之另一核酸，該載體可包括質體、宇宙體 (cosmid)或病毒載體。該載體能自行複製及含有呈適於在宿 主細胞中表現之形式之本發明核酸。其包括一個或多個與 待表現核酸序列可操控式連鎖之調節序列。術語「調節序 列」包括啟動子、促進子及其他表現控制單元（例如多腺芬 酸信號）。調節序列包括指引核甞酸序列之構成性表現者， O:\73\7325I.DOOLLM - 27 - 本紙張尺度適用中國國家橾準(CMS) A4規格(210X 297公釐）

裝 訂

線 1233450 A7 B7 五、發明説明（25 ) 以及組織-特異性調節或可謗導序列。載體可被設計成供皺 褶假絲酵母菌脂肪酶在原核或真核細胞[例如細菌細胞(如 大腸菌）、昆蟲細胞（如使用桿狀病毒表現載體）、酵母菌細 胞（例如巴斯德畢赤酵母菌）或哺乳動物細胞]中表現。適當 的宿主細胞在 Goeddel，（ 1990) Gwe

Methods in Enzymology 185， Academic Press, San Diego, CA. 中被進一步討論。皺褶假絲酵母菌脂肪酶之表現可用含有 指引融合或非融合脂肪酶表現之構成性或謗導性啟動子之 載體進行。融合脂肪酶利於可溶性多肽之純化。融合載體 將許多胺基酸加至其中被編碼之多肽上，通常加在該多肽 之胺基終端上。典型的融合表現載體包括pGEX (Pharmacia Biotech Inc ； Smith and Johnson ( 1988) Gene 67:31-40)， pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA)及 pRIT5 (Pharmacia，Piscataway，NJ)，彼等分別將穀胱甘肽S-轉移 酶（GST)，麥芽糖E結合蛋白質或蛋白質A與標的多肽融 合。 載體可經由習知之轉形或轉染技術引進宿主細胞中。在 本文中，術語「轉形」及「轉染」係指將外來核酸（例如 DNA)引進宿主細胞中之各種本技藝公知技術，包括麟酸#5 或氣化鈣共沉澱、DEAE-葡聚糖-媒介之轉染、脂染或電穿 孔。本發明之宿主細胞可被用於表現皺褶假絲酵母菌脂肪 酶。被表現之皺褶假絲酵母菌脂肪酶可從宿主細胞或培養 基中單離出。 本發明亦提供嵌合皺褶假絲酵母菌脂肪酶，其含有一同 O:\73\73251.DOOLLM - 28 - 本紙張尺度適用中國國家橾準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（26 ) 功異構酶之受質交互作用領域及另一同功異構酶之非受質 交互作用領域。「受質交互作用領域」係指以具有約32個 胺基酸序列（例如序列編號4，6，8，1〇或12之胺基酸63-94) 及參與受質交互作用為特徵之片段。「非受質交互作用領 域」包括至少一催化領域，諸如幾酸酯酶領域。受質交互 作用領域可為受質結合區之一部分，其通常沿著全長胺基 酸序列分布及形成隧道狀，以與脂族醯基鏈交互作用。參 見 Cygler 等人，（1999) Biochim. Biophys· Acta 1441..205- 214 〇 致酸酯酶領域可催化致酸酯之水解以及包括催化三聯 體··絲胺酸、穀胺醯胺（或天冬胺酸）及組胺酸。環繞活性 部位絲胺酸之序列被充分保存以及可被用做簽署模型 (signature pattern)。參見例如 Krejci 等人，（1991 ) #以/·

Acad· Sci· USA 88:6647-6651 (1991),或 Cygler 等人，

( 1993) PrWeh 6W· 2:366-382。本發明之嵌合多肽可藉領域 洗牌法（domain shuffling)製備。舉例言之，該方法包括交換 SphI(184)-BstXI(304)限制DNA片段，以得到編碼成熟嵌合 皺褶假絲酵母菌脂肪酶之重組核酸。成熟脂肪酶含有一同 功異構酶之受質交互作用領域及另一同功異構酶（例如LIP4) 之非受質交互作用領域。然後將重組核酸連結至載體如 pET-23a ( + )大腸菌 T7 表現載體（Novagen)之 A^I 與 EcoRI 部位之間。 方才所述之各領域，只要在嵌合多肽中之預期功能被保. 有’則與對應野生型序列具有至少70% (例如80%，90%， O:\73\73251.DOC\LLM - 29 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CMS) A4規格(210 X 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（27 ) 95%或100%)之類似性即可。嵌合多肽可被製成融合嵌合多 肽（例如將硫氧還蛋白與嵌合多肽之N-端融合）。 下述特定實例僅係用於例示說明，絕非以任何方式為揭 示内容之其餘部分設限。咸信熟習本技藝人士依據本文之 說明，可在無需進一步鑽研下充分利用本發明。所有本文 引用之刊物以全文作為參考資料之方式被納入本文。 皺褶假絲酵母菌脂肪酶2 (LIP2)之表現 材料及方法 菌株及質體含質體之轉形體主要在補充有胺卞青黴素 (100 // g/ml)之Luria-Bertani (LB)培養液中培養。將巴斯德 畢赤酵母菌表現載體pGAPZ a (Invitrogen，Carlsbad，C A )在 大腸菌菌株TOPIO’中處理，該大腸菌菌株TOPIO’在補充有 zeocin(25 /z g/ml)之低鹽 Luria-Bertani (LB)培養液（1% 胰蛋 白腺，0.5%酵母菌萃取物及0.5% NaCl，ρΗ7·5)中培養。巴 斯德畢赤酵母菌Χ-33(野生型）被用於表現Ζ/Ρ2，以及其之 轉形體用含100 # g/ml zeocin之YPD( 1 %酵母菌萃取物， 0.2%蛋白腺及0.2%右旋葡萄糖，ρΗ7·2)於26°C培養。 雀趨滅鑊之#襄 Z/P2先前曾被定序（EMBL資料庫登記 編號X64704)。製備含有全部ZZP2編碼區且在5’端有尺I 限制部位及在3 ’端有I部位之PCR產物及將其選殖入巴 斯德畢赤酵母菌表現載體pGAPZaC之KpnI-Notl部位中， 以產生pGAPZa-LIP2。 用質體DNA轉形巴斯德畢赤酵母菌將具有被構築之脂 肪酶基因之質體DNA(10#g)在20//L總體積中用五⑺RV消化 O:\73\73251.DOC\LLM - 30 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（28 ) 2小時。將線性化質體藉由電穿孔法轉形入巴斯德畢赤酵母 菌中。藉由使用設有脈衝控制器之Gene Pulser®裝置（Bio-Rad Laborotories)，將高電壓脈衝（1.5kV)輸送至在0.2 cm電 極狹縫小杯中之100 β L樣品内。將轉形體之個別群落排列 在三丁酸甘油g旨-乳液型YPD平皿上。藉由在不透明三丁酸 甘油酯乳液上之澄清區鑑別出分泌脂肪酶之轉形體。用 pGAPZaC轉形之巴斯德畢赤酵母菌被用做陰性對照組。 叙I/P2之趑允來自巴斯德畢赤酵母菌之培養基藉由在 排除界限為30,000分子量之膜上進行超濾而濃縮。然後將此 等樣品加至HiPrepTM16/10 Octyl FF 管柱（Pharmacia Biotech) 中。將該管柱用5管柱體積之TE緩衝液及1 mM CHAPS沖 洗，然後用4 mM CHAPS沖洗。結合蛋白質然後用5管柱體 積含30 mM CHAPS之TE緩衝液溶離出。將溶離出之物質對 TE緩衝液透析。 然後將溶離出之蛋白質加至用TE緩衝液平衡化之 HiPrep™ 16/10 Q XL 管柱（Pharmacia Biotech)中以及將該蛋 白質用線性梯度之0至300 mM (NH4)2S04溶離出5管柱體 積。溶出部分中之蛋白濃度用Bio-Rad測定套組測量以及酯 酶活性用丁酸對-硝基苯酯作為受質來測定。將純化之蛋白 質貯存在-20°C之貯存緩衝液（60 mM KC1，10 mM Tris-HCl， 1.25 mM EDTA，1% Triton X-100 及 17% 甘油，ρΗ7·5)中。 酶特徵之鑑定純化重組Ζ/Ρ2及市售脂肪酶（脂肪酶VII 型，Sigma)之分子量藉由SDS-PAGE分析來決定。為了分析 脂肪酶之熱安定性，將樣品在37至100°C之各種溫度培育1〇 O:\73\73251.DOOLLM - 31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（29 ) 分鐘，以及殘餘活性藉由分光光度測量法（Redondo et al. ( 1995) J?zVc/n_m·价印1243:15-24)測量，其中使用辛 酸（對-硝基苯）酯作為受質在37°C進行。脂肪酶之最適反應 溫度以在10-60°C範圍内之不同溫度研究，以及活性藉由分 光光度測量法測量，其中使用丁酸對-硝基苯酯作為受質在 pH 7.0進行。脂肪酶之最適反應pH值以在3.0至9.0範圍内之 不同pH值研究，以及活性藉由分光光度測量法測量，其中 使用丁酸對-硝基苯酯作為受質在37°C進行。 脂肪酶活性藉滴定法測量，其中使用具各種鏈長之脂肪 酸之三酸甘油酯作為受質。參見Wang等人（ 1988) Biotechnol.Bioeng· 31:628-633。游離酸之釋出藉由在pH-Stat 上用1 mM NaOH滴定而連續監測。於37°C之酯酶活性藉由 分光光度測量法測定，其中使用對-硝基苯酯作為受質。一 單位活性被界定為每分鐘能釋出1微莫耳對-硝基酚之最小 量酶。 結果 表現質體之構築及重組LIP2之過度表現 LIP2基風之所 有17個CTG密碼子，藉由同時多部位-指向性突變誘發法， 以通用絲胺酸密碼子（TCT)取代。參見Ge及Rudolph ( 1997) 22:28-30。將駐有被構築之之質體藉由 電穿孔轉形入巴斯德畢赤酵母菌中。將轉形體細胞在含有 200毫升YPD培養基之500毫升燒瓶中培養3日。甘油醛3-磷 酸酯去氫酶（GAP)之構成性強力啟動子允許LIP2之高度表. 現。大部分被表現之LIP2被分泌入培養基中，以及據評估 O:\73\73251.DOC\LLM - 32 - ^紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) ' 1233450 A7 B7 五、發明説明（3〇 ) LIP2之量為2.3毫克/公升。該轉形體高度安定以及產生之 LIP2在高細胞密度發酵中被大幅增加。參見Cereghino及 Cregg (2000) FEMSM/cr允ζ·ο/· Αν. 24:45-66。 重組LIP2之生化特徵 LIP2之最適pH值為7以及該酶在 pH6顯示90%之活性。相對地，LIP4及市售毅褶假絲酵母菌 脂肪酶（CRL)之最適pH值分別為pH7-8及8。LIP2，在所有 被測試之pH值（尤其是pH6)下，顯示對於丁酸對-硝基苯酯 之比活性遠比LIP4及CRL高。LIP2，LIP4及CRL之比活性 之比在pH6時為100 : 4 : 3，而在pH8時為100 ·· 80 : 25。所 以就工業應用而言，LIP2在微酸至中性pH值下特別有用。 再者，對於LIP2，LIP4及CRL而言，最適溫度分別為40-50，40及37°C。LIP2顯示寬廣的最適溫度範圍（30-50°C)以 及在所有被測試之溫度（10-60 °C )顯示遠比LIP4及CRL高之 比活性。出乎意料之外地，LIP2在低溫顯示相當高之活 性，例如在10°C之比活性為1000 U/毫克，其為在最適溫度 時之比活性之50%。此暗示該酶可被應用於在低溫下合成 熱不安定性化合物以及低沸點化合物。 在各種溫度下加熱10分鐘後之酶活性亦被比較。在50-70 °C，LIP2比LIP4及CRL之任一者安定。於70°C加熱1〇分鐘 後，LIP2，LIP4及CRL之殘餘活性分別為80%，50%及 35% 〇 就具各種鏈長脂肪酸之對-硝基苯酯之水解言之（表1)， LIP2，LIP4及CRL顯示對酯類受質具不同的偏好。LIP2， LIP4及CRL之最佳受質分別為棕櫚酸對-硝基苯酯，棕櫚酸 O:\73\73251.DOOLLM - 33 - 本紙倀尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（31 ) 對-硝基苯酯及辛酸對-硝基苯酯。LIP2及LIP4二者對於中 鏈至長鏈脂肪酸酯（C12-C18)顯示高許多之活性，但LIP2之 活性比LIP4者高2-3倍。對於大部分對-硝基苯酯（包括丁 酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉苴蔻酸、棕櫚酸及硬脂酸之 對-硝基苯酯）而言，比活性之排序為·· LIP2 > LIP4 > CRL 〇 三酸甘油酯之水解活性脂肪酶之一重要工業應用為脂 肪及植物油（其天然以三酸甘油酯之形式產生）之水解，以 產生脂肪酸。例如參見Shaw等人（ 1990) 35:132-137。表2顯示LIP2，LIP4及CRL對於三酸甘油酯受 質具有不同的偏好。LIP2，LIP4及CRL之最佳三酸甘油酯 受質分別為三丁酸甘油酯、三辛酸甘油酯及三辛酸甘油 酯。 對於三丁酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三棕櫚酸甘油 酉旨、三硬脂酸甘油g旨及三油酸甘油酯，水解之比活性之排 序為LIP2 > LIP4 > CRL。對於三乙酸甘油酯及三己酸甘油 酯，排序為LIP2 > CRL > LIP4。對於三辛酸甘油酯，排序 為LIP4 > CRL > LIP2。對於三癸酸甘油酯及三肉莖蔻酸甘 油酯，排序為CRL > LIP2 > LIP4。所以在在三酸甘油酯水 解方面，不同的LIP異構形式應被用於不同的工業應用。 膽固醇酯酶活性如表3所示，對於三種被測試之膽固醇 酯，LIP2顯示之膽固醇酯酶之比活性遠高於LIP4及CRL 者。在各種膽固醇酯中，月桂酸膽固醇酯為LIP2水解之最 佳受質。所以，LIP2可做為供臨床化學、生化學及食物分 O:\73\73251.DOOLLM - 34 - 本紙張尺度適用中國國家樣·準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

裝 訂

線 1233450 A7 B7 五、發明説明（32 ) 析應用之膽固醇酯酶。既然約70-80 %之血清膽固醇用具各 種鏈長之飽和脂肪酸S旨化（RGschlau et al· ( 1974) 12:403-407)，所以LIP2(具有膽固醇酯酶活性）可被用於與膽固醇 氧化酶及過氧化酶偶合，以用酶方法測定血清膽固醇。 LIP2對於各種膽固醇酯之高比活性允許血清及食物中之膽 固醇酯可被極有效率且正確地測定。 酿之合成 脂肪酶可有效率地催化供工業應用之各種酯 之合成，該工業應用諸如水果調味之產品（例如飲料、糖 果、果凍及果醬），烘焙食品，酒，乳品（例如人造奶油、 酸乳酪、發酵乳及乾酪），乳化劑、潤滑劑及化妝品。例如 參見 Kim 等人（ 1998) J· dm. Oz7 CT^m· &C· 75:1109-1113 ; Shaw 及 Lo (1994) dm. (9z7 CAem. 71:715-719 ;或

Shaw 等人（1991) MzcrM. 13:544-546。表 4 顯示LIP2在肉蓋蔻酸十六基醋或十八基醋之合成上遠比 LIP4或CRL為優，此暗示肉苴蔻酸用不同醇之等莫耳混合 物酯化時，LIP2利於長鏈醇。相對地，對於肉莖蔻酸之己 酯、辛酯及十二基酯之合成而言，以CRL為最佳，此暗示 在肉苴蔻酸醋合成時，CRL利於中鏈或短鏈醇。 表5顯示LIP2在丁酸丙酯之合成上遠比LIP4或CRL活性 高，此暗示其在正丙醇用不同鏈長脂肪酸之等莫耳混合物 醋化時，LIP2利於短鏈酸。相對地，對於十二酸、十六酸 及十八酸之丙酯之合·成而言，以LIP4為最佳，此暗示在丙 酯合成時，LIP4利於中鏈至長鏈脂肪酸。 O:\73\73251.DOOLLM - 35 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（33 ) 表1各種鏈長脂肪酸之對-硝基苯酯（P-NP)之水解 LIP2 LIP4 CRL (U/毫克a) 乙酸對-硝基苯酯(C2) 11±1 (0.4)b 10±1 (0.7) 16±2(3.1) 丁酸對-硝基苯酯(C4) 1986±30(72) 899土20(63) 359±42(72) 己酸對-硝基苯酯(C6) 108±15(4) 151土13 (11) 72±5(14) 辛酸對-硝基苯酯(C8) 978土126(35) 504土24 (35) 498士67 (100) 癸酸對-硝基苯酯(C10) 1453土210(53) 1295 ±179 (91) 395 ±19 (79) 月桂酸對-確基苯酯(C12) 2567土277 (93) 867土41 (61) 264土44 (54) 肉苴蔻酸對-硝基苯酯(C14) 2567±277 (93) 1140土41 (80) 372 ±5 (75) 棕櫚酸對-硝基苯酯(C16) 2766土4(100) 1429±127(100) 317±5(64) 硬脂酸對-硝基苯酯(C18) 1580土21 (57) 580土21 (41) 67±1 (13) a·單位（U)之定義 :一單位活性為於37°C及pH 7.0下每分 鐘水解1.0微莫耳對-硝基苯酯所需之酶量。 b·括弧中之數值代表就同一酶而言，對各受質之活性與最 高活性之比。 表2各種鏈長脂肪酸之三酸甘油酯之水解 LIP2 LEP4 CRL (U/毫克a) 三乙酸甘油酯(C2) 39±l(2)b 10土1 ⑼ 11 ±1(0) 三丁酸甘油酯(C4) 2540 ±60(100) 1138 ±10(28) 1029 ±64 (33) 三己酸甘油酯(C6) 599 ±37 (24) 167 ±7(4) 358 ±14(11) 三辛酸甘油酯(C8) 1239 ±31 (49) 4082 ±298 (100) 3118 ±190(100) 三癸酸甘油酯(C10) 1399 ±176(55) 628 ±11(15) 2160 ±75 (69) 三月桂酸甘油酯(C12) 1743 ±110(69) 389 ±4(10) 1502 士 8 (48) 三肉苴蔻酸甘油酯(C14) 504 ±33 (20) 375 ±33 (9) 915 ±26(29) 三棕櫚酸甘油酯(C16) 54 ±6(2) 151 ±10(4) 137 ±12(4) 三硬脂酸甘油酯(C18) 422 ±9(17) 348 ±38(9) 39 ±2(1) 三油酸甘油酯（C18 : 1) 513 ±4(20) 352 ±5(9) 303 ±24 (10) a·單位（U)之定義 :一單位活性為於37°C及pH 7.0下每分 鐘水解1.0微莫耳酯鍵所需之酶量。 b.括弧中之數值代表就同一酶而言，對各受質之活性與最 高活性之比。 O:\73\73251.DOOLLM -36 • 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（34 ) 表3各種鏈長脂肪酸之膽固醇酯之水解 LIP2 LEP4 CRL (1(T2U/毫克 a) 正丁酸膽固醇酯(C4) 127.1 ±1.4 (32)b 24.7 ±1.3(25) 7.3 ±0.1 (53) 月桂酸膽固醇酯(C12) 402.0 ±35.5 (100) 98.2 ±3·2 (100) 13.8 ±0.5(100) 硬脂酸膽固醇酯(C18) 127.1 ±1.4(32) 45.0 士 1.8 (46) 6.5 ±0.7(47) a·單位（U)之定義 :一單位活性為於37°c及pH 7.0下每分 鐘水解1.0微莫耳膽固醇酯所需之酶量。 b.括弧中之數值代表就同一酶而言，對各受質之活性與最 高活性之比。 表4肉苴蔻酸用各種鏈長醇之酯化 LIP2 LIP4 CRL (103 ^mol/h/mg)a 肉莖蔻酸正己酯 1.86 ±0.17 (57)b 2.35±0·24(100) 3.89 ±0.47(100) 肉苴蔻酸正辛酯 2·28 ±0.27(70) 1.55 ±0.16(66) 2.73 ±0.30(70) 肉莖蔻酸正十二基酯 1.16 ±0.11 (35) 0.66 ±0.07(28) 1.79 ±0.20(46) 肉笪蔻酸正十六基酯 2.33 ±0.22(72) 1.04 ±0.08 (44) 1.13 ±0.13(29) 肉莖蔻酸正十八基酯 3.26 ±0.33 (100) 1.71 ±0.11 (72) 1.19 ±0.07(31) a. 在用重組體及市售CRLs催化肉苴蔻酸用不同鏈長烷醇 之等莫耳混合物酯化時，反應之初始速率。 b. 括弧中之數值代表就同一酶而言，對各受質之活性與最 高活性之比。 O:\73\73251.DOC\LLM 猶 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（35 ) 表5各種鏈長酸與正丙醇之酯化 LIP2 LIP4

CRL 丁酸正丙酯 辛酸正丙酯 十二酸正丙酿 十六酸正丙醋 十八酸正丙酯 (103微莫耳/小時/毫克)a 9.96 ± 1.04(100)5 2.41 ±0.24(24) 1.10 ±0.13 (11) 0.68 ±0.07(7) 0.77 ±0.02(8) 5.19 ±0.49(100) 2.35 ±0.11 (45) 1.35 ±0.06 (26) 1.56 ±0.21 (30) 1.01 ±0.06(19) 0.95 ±0.05(99) 0.68 ±0.05 (70) 0.43 ±0.05 (45) 0.96 ±0.12(100) 0.94 ±0.12(98) a. 在以重組體及市售CRLs催化正丙醇用各種鏈長脂肪酸 之等莫耳混合物酯化時，反應之初始速率。 b. 括弧中之數值代表就同一酶而言，對各受質之活性與最 高活性之比。 嵌合蛋白質之表現 材料及方法 表現載體之構築大腸桿菌表現載體pET23a-Z/P心S19及 pET23a-trx-L/i^-S19 如 Tang 等人（2000) Protein Exp. Purif· 20··308-313所述構築。户7户23及i：/户5之開放譯 碼區（不具引導序列）藉由反錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR)得 到。參見Longhi 等人（ 1992) 1131:227- 232 及Lotti 等人（ 1993)G^^ 124:44-55。嵌合DNA序列藉 由將之SphI (184)-BstXI (3〇4)限制DNA片段分別用 LIP 1，LIP 2，LIP 3戚LIP 5之對應片段取代。生成之序列編 碼成熟嵌合皺褶假絲酵母菌脂肪酶，其分別被命名為丁^-LIP4/lidl、Trx-LIP4/lid2、Trx-LIP4/lid3 及 Trx-LIP4/lid5，以

O:\73\73251.I -38- 本纸浪尺度適用中國國家操準(CNS) A4規格(210x 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（36 ) 及藉由DNA定序確證。

從大腸菌製備重組L1P4 將駐有重組質體之大腸菌株 AD494 (DE3)(Novagen，Milwaukee, WI)在補充有 50/zg/mL 胺卞青黴素及15# g/mL卡那黴素之Luria-Bertani (LB)培養 液中於37°C培養一夜。然後將細胞用新鮮培養基稀釋20倍 及於振搖及25°C下培育。加入IPTG後使最終濃度成為0.05 mM，將細胞在10°C培育，直至OD_達到1.0。 重組ΙΛΜ之純化 謗導後，AD494 (DE3)轉形體藉於 4000 g及4°C離心10分鐘而被收取。將該細胞丸再懸浮於TE 緩衝液（20 mM Tris-HCl 及 2.5 mM EDTA，ρΗ8·0)中。將該細 胞用超音波器打碎，然後將細胞裂解物之可溶部分藉於 15,000 g及4°C離心30分鐘而收集。該可溶部分藉由在排除 界限為10,000分子量之膜上進行超濾而濃縮。然後將此等樣 品加至用TE緩衝液平衡化之DEAE-瓊脂糖CL-6B管柱 (Pharmacia Biotech)中。重組脂肪酶用5管柱體積之線性梯 度之 0 至 100mM (NH4)2S04 溶離。 然後將溶離出之蛋白質加至丁基-瓊脂糖4快速流動疏水 性交互作用管柱（Pharmacia Biotech)中。將該管拄用5床體 積之TE緩衝液及1 mM CHAPS沖洗，然後用4 mM CHAPS沖 洗。結合蛋白質然後用5床體積含30 mM CHAPS之TE緩衝 液溶離出。將溶離出之物質對TE緩衝液透析以及貯存在-20 。(：之貯存緩衝液（60 mM KC1，10 mM Tris-HCl，1.25 mM EDTA，1% Triton X-100 及 17%甘油，ρΗ7·5)中。溶出液中之 蛋白濃度用Bio-Rad測定套組測量以及酯酶活性用丁酸對-硝 O:\73\73251.DOC\LLM - 39 - 本紙浪尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（37 ) 基苯酯作為受質來測定。純化重組脂肪酶及市售脂肪酶 (VII型脂脖酶，Sigma L1754)之分子量藉SDS-PAGE分析測 定。 後合蛋白質表現嵌合蛋白質（一者之受質交互作用領域 用另一異構物之受質交互作用領域交換而得者）如下述製 備。 酶測定脂肪酶活性藉滴定法測量，其中使用三丁酸甘 油酿作為受質。游離酸之釋出藉由在pH-Stat上用1 mM NaOH滴定而連續監測。於37°C之酯酶活性藉由分光光度測 量法測定，其中使用對-硝基苯醋作為受質。一單位活性被 界定為每分鐘能釋出1微莫耳對-硝基酚之酶之量。 結果 為改良蛋白質溶解度及利於純化，將大腸桿菌硫氧還蛋 白（Trx)與LIP4之N-端融合，以產生融合蛋白質Trx-LIP4。 Trx-LIP4具有較佳之溶解度及保有與天然LIP4相似之活性。 雖然LIP1，LIP2，LIP3及LIP5之全部胺基酸序列與LIP4之 兩兩相同性分別為81%，83%，84%及78%，但受質交互作 用領域（即lid區）之胺基酸相同性分別為50%，53%，50%及 56% (表 6) 〇 為研究lid區對於脂肪酶活性及特異性之影響，將來自其 他四個皺褶假絲酵母菌異構形之lid區（LIP1，2，3及5，以 及對應之lid 1，2，3及5)與LIP4者交換，且分別以嵌合蛋 白質 Trx-LIPWlidl 、Trx-LIP4/lid2、Trx-LIP4/lid3 及 Trx， LIP4/lid5表示。如表7所示，在用三丁酸甘油酯做為受質 O:\73\73251.DOOLLM - 40 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（38 ) 時，與天然之 LIP4 相較，Trx-LIP4/lid2 及 Trx-LIP4/lid3 之脂 肪酶水解活性分別增加14%及32%，而Trx-LIP4/lidl及Trx-LIP4/lid5 分別減少 85% 及 20%。

Lid對於脂肪酶特異性之影響大部分視所用之受質決定。 如表8所示，雖然具有lid改變之所有嵌合蛋白質，與天然之 Trx-LIP4相較，顯示不同程度之活性減低，但對於各種不同 鏈長脂肪酸之膽固醇酯之相對活性顯示實質之改變。舉例 言之，對於Trx-LIP4、Trx-LIP4/lid2 及Trx-LIP4/lid3 而言最佳 之受質為癸酸膽固醇酯，但對於Trx-LIP4/lidl及Trx-LIP4/lid5而言，最佳之受質為硬脂酸膽固醇酯。相對地， 當對-硝基苯酯被用做受質時，對於Trx-LIP4及Trx-LIP2而 言，癸酸對-硝基苯酯及硬脂酸對-硝基苯酯二者均為最佳 受質，但對Trx-LIPWlidl、Trx-LIP4/lid3 及 Trx-LIP4/lid5 而 言，只有癸酸對-硝基苯酯為最佳受質。在對各種不飽和脂 肪酸之膽固醇酯之選擇性方面，lid改變亦會影響 之受質 特異性。如表9所示，對於Trx-LIP4而言，油酸膽固醇酯 (18 : 1)為最佳受質，其次為亞麻油酸膽固醇酯（18 ·· 2，相 對活性為68%)，而硬脂酸膽固醇酯（18 : 0)為最差之受質 (相對活性為7 %)。Trx-LIP4/lid2及Trx-LIP4md3具有相似之 受質偏好模式。 再者，Trx-LIP4Aidl之最佳受質為硬脂酸膽固醇酯，其次 為亞麻油酸膽固醇酯，再其次為油酸膽固醇酯。對於Trx-LIP4Mid5而言，受質偏好排序為油酸膽固醇酯，硬脂酸膽. 固醇酯及亞麻油酸膽固醇酯。分析各種重組LIP4嵌合蛋白 O:\73\73251.DOOLLM - 41 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）

裝 訂

線 1233450 A7 B7 五、發明説明（39 ) 質對於亞麻油酸膽固醇酯之動力參數。如表10所示，融合 蛋白質Trx-LIP4顯示與天然LIP4相似之kcat/Km，惟Vmax及 Km二者均增加。Trx-LIP4/lid2保有與Trx-LIP4相似之催化效 力，而Trx-LIPWlidl，Trx-LIP4/lid3及 Trx-LIP4/lid5 顯示大 幅降低之kcat/Km。在催化效力上之降低似乎由於kcat大幅 降低。 lid領域亦會影響脂肪酶之對掌性選擇性。如表11所示， 皺褶假絲酵母菌脂肪酶對於乙酸/-薄荷酯水解之促進勝於 對乙酸心薄荷酯者。重組Trx-LIP4及所有嵌合LIP4顯示對掌 性選擇性遠比市售之皺褶假絲酵母菌脂肪酶（VII型脂肪 酶，Sigma)者佳。只有Trx-LIP4/lid3之對掌性選擇性與Trx-LIP4相似。其他嵌合蛋白質（Trx-LIP4/ lidl，Trx-LIP4/ lid2 及Trx-LIP4/ lid5 )，在用乙酸薄荷酯做為受質時顯示對掌性 選擇性實質降低。若使用其他對掌性受質，對掌性選擇性 偏好排序很可能改變。 lid領域對於脂肪酶催化性之影響之結構基礎為何？從電腦 分析可知，在天然LIP4之lid領域（lid4)中之帶正電Lys75與 在蛋白質表面上帶負電之Asp292形成氫鍵及發生靜電性交 互作用，而使開放形式構形（對於疏水性受質而言，其為脂 肪酶之活性態）中之lid4安定化。所以，此導致LIP4對於疏 水性受質諸如中鏈及長鏈脂肪酸酯具有高活性（表8 - 10)。 lid2在安定化開放形式構形方面具有與Hd4相似之lid構形及 胺基酸殘基（表6)，所以Trx-LIP4/ lid2嵌合蛋白質顯示與 Trx-LIP4接近之催化效力。相對地，Lys75-Asp292交互作用 O:\73\73251.DOOLLM - 42 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（4〇 ) 被lidl，3及5中之Glu71干擾，所以此等嵌合蛋白質對於疏 水性受質乏催化效力顯示大幅降低。 對於短鏈疏水性受質而言，開放形式安定化之影響較不 重要。因此，對於三丁酸甘油酯之水解，Trx-LIP4/ lid3之 月旨肪酶活性甚至比Trx-LIP4還要佳（表7)，此可能係由於活 性部位或受質結合部位之構形不同。同樣地，Trx-LIP4/ lid3顯示與Trx-LIP4相似之對掌性選擇性（表11),以及在設 定對二級醇之對掌性偏好性之催化機構上亦可能與Trx-LIP4 相似。參見Cyglei:等人（1994) /· dm. C/zem·116:3180-3186。在此等情況，lid領域交換之影響可能係由於構形改 變，構形改變對活性部位區產生敏銳之影響而導致受質特 異性及催化效力改變。 總結言之，lid領域對於LIP酶之催化效力、酯受質之脂肪 酸鏈長及不飽和度選擇性、以及對掌性選擇性均具顯著之 影響。所以lid領域為進行蛋白質修飾之良好區域，以將皺 褶假絲酵母菌脂肪酶之生物催化性質合理設計成適於期望 之工業應用者。在LIP4之lid區上之部位-指向性突變謗發目 前正在進行中，以精確找出負貴受質特異性、催化效力、 對掌性選擇性、或許酶安定性之胺基酸殘基。 表6 5種皺褶假絲酵母菌脂肪酶異構形式之全部及lid領域 胺基酸序列相同性之比較。序列藉由CLUSTAL W程 式整列比對。 O:\73\73251.DOOLLM - 43 _ 本紙張尺度適用中國國家樣準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（41 ) 全長LIP蛋白質（534個胺基酸）之兩兩相同性（相似性）百分率 LIP1 LIP2 LIP3 LIP4 LIP5 LIP1 100(100) 80(89) 88(95) 81(90) 82(92) LEP2 100(100) 82(89) 83(91) 77(88) LLP3 100(100) 84(91) 86(94) LIP4 100(100) 78(90) LIP5 100(100) 5種序列之間：相同性 =66% ;相似性= =81% 野生型及嵌合型LIP4之經改變lid領域（殘基63-94)之兩兩相 同性（相似性）百分率 lidl lid2 lid3 lid4 lid5 lidl 100(100) 56(75) 81(91) 50(72) 88(91) lid2 100(100) 63(78) 53(81) 66(81) lid3 100(100) 50(75) 88(94) lid4 100(100) 56(75) lid5 100(100) 5種序列之間：相同性 =37.5% ;相似性 =62.5% 表7在大腸菌中被表現之重組LIP4之脂肪酶活性 比活性 相對活性 (103U/mg)a (%)b Trx-LIP4 6.76 100.0 Trx-LIP4/ lidl 1.03 15.2 Trx-LIP4/ lid2 7.71 114.2 Trx-LIP4/ lid3 8.90 131.7 Trx-LIP4/ lid5 5.37 79.5 O:\73\73251.DOCLLM - 44 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（42 ) a. —脂肪酶單位（U)被界定為於ρΗ7·0及37°C下每分鐘從三 丁酸甘油酯產生1.0微莫耳丁酸之酶量。 b. 相對活性為各酶之活性與野生型LIP4之活性之比。 表8各種鏈長脂肪酸之膽固醇酯及對-硝基苯酯之水解 膽固醇酯活性 (l〇-2U/mg)a 對硝基苯酯活性 fU/mg)a 丁酸酯 癸酸酯 硬脂酸酯 丁酸酯 癸酸酯 硬脂酸酯 Trx-LIP4 6.2 (10)b 62.2 (100) 24.9 (40) 12.5 (44) 28.5 (100) 28.2 (99) Trx-LIP4/ 0.0 3.7 4.8 0.7 5.1 0.6 lidl (〇) (78) (1〇〇) (17) (1〇〇) (11) Trx-LIP4/ 4.4 47.7 22.4 * 7.3 27.9 26.9 lid2 (9) (100) (47) (26) (100) (97) Trx-LEP4/ 0.8 14.5 8.9 1.2 18.6 5.0 Ud3 ⑹ (100) (61) (6) (100) (27) Trx-LIP4/ 0.8 6.4 7.3 0.5 9.4 1.0 lid5 (11) (89) (100) (5) (100) (11) a. 一單位活性（U)為於37°C及pH 7·0下每分鐘水解1.0微莫 耳膽固醇酯或對-硝基苯酯所需之酶量 b.括弧中之數值代表就同一酶而言，對各受質之活性與最 高活性之比。 表9各種不飽和脂肪酸之膽固醇酯之水解 酶 膽固醇酯酶活性 (l〇-2U/mg)a 硬脂酸 膽固醇酯 油酸膽固醇酯 亞麻油酸 膽固酵酯 Trx-LIP4 24.9 (7)b 354.6(100) 242.0 (68) Trx-LIP4/ lidl 4.8 (100) 1.5 (32) 2.5 (53) Trx-LEP4/ lid2 22.4 (9) 244.7 (100) 148.9 (61) Trx-LEP4/ lid3 8.9 (43) 20.7 (100) 18.6(90) Trx-LIP4/ lid5 7.3 (85) 8.5 (100) 6.5 (76) a. —單位活性（U)被界定為於37°C及pH 7.0下每分鐘水解 O:\73\73251.DOOLLM - 45 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210X297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（43 ) 1.0微莫耳亞麻油酸膽固醇酯所需之酶量 b·括弧中之數值代表就同一酶而言，對各受質之活性與最 高活性之比。 表10使用亞麻油酸膽固醇酯做為受質之水解反應之動力學 參數 酶 Mr Vmax 10*3^mol/min/mg Km 10'3mM min"1 Kca/^-m Trx-LIP4 69680 2895 ±117 104 土 10 202±8.12 1940±139 LIP4 57051 1235 ±32 41±5 70±0.17 1740±298 Trx-LDP4/ lidl 69717 28 ±1 103±5 2 ±0.04 19 ±0.47 Trx-LIP4/ lid2 69877 1851 ±24 74±3 129±0.22 1751 ±64 Trx-LIP4/ lid3 69757 231 ±14 46±1 16±0.17 349±7 Trx-LIP4/lid5 69797 70 ±4.8 34±1 5±0·01 147±3 a·測定溫度為37°C及pH值為7.0

Trx-LIP4，LIP4，Trx-LIP4/lidl，Trx-LIP4/lid2，Trx-LIP4/lid3 及Trx-LIP4/lid5之濃度分別為 29 ηΜ，39 ηΜ， 11 ηΜ，86 ηΜ，58 ηΜ及66 ηΜ。該值為三項實驗之平均 值。 b .重組蛋白質之分子量從推衍之胺基酸序列預測以及市售 酶之分子量藉由SDS-PAGE測定。 表1 1 在大腸菌中表現之重組LIP 4及市售脂肪酶（CRL)對於 作為受質之（d)及（/) -乙酸薄荷酯之對掌性選擇性 (β mol/h/mg) 掌性選擇性b (//mol/h/mg)

Tix-LIP4 Trx-LJP4/lidl Trx-LIP4/ lid2 Trx-LIP4/ lid3 Trx-LIP4/ lid5 CRL 53.65 ±4.10 2.15 ±0.18 33.00 ±3.48 54.11 士 3.10 6·02 ±0.57 53.38 ±3.38 1.69 ±0.13 0.40 ±0.06 2.89 ±0.45 1.70 ±0.23 0.48 ±0.06 42.65 ±7.67 31.73 5.35 11.41 31.81 12.59 1.26 -46-

O:\73\73251.DOOLLM 本紙張尺度適用中國國家楝準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐） 1233450 A7 B7 五、發明説明（44 ) a.比活性（v )被界定為於30°C及pH 7.0下每小時每毫克酶 釋出之（c/)或（/)薄荷醇之量。 其他實施例 在本說明中所揭示之所有特徵可以任何組合方式組合。 本說明書所揭示之各特徵可被提供相同、同等或相似目的 之另一特徵取代。因此，除非另有明白陳述，被揭示之各 特徵僅為一系列同等或相似特徵之一例。 熟習本技藝人士從上述說明可輕易認知本發明之主要特 徵，以及可在不偏離本發明之精神及範疇下對本發明進行 各種改變及修飾，以適應各種用途及條件。因而，其他實 施例亦在申請專利範圍之内。 O:\73\73251.DOOLLM ~ 47 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐）

裝

線

Claims (1)

1. 26049號專利申請案 請專利範圍替換本(9|/年11月裘 申請#利範圍 1 · 2. 3. 4. 5. 6 · Α8 Β8 年月 充 一種單離核酸，其包含編碼與序列編號4、6、10或12 至少有90%相同且與序列編號4、6、10或12具有相同 活性之皺褶假絲酵母菌脂肪酶胺基酸序列之突變 DNA ，其中序列編號4、6、10及12中具有 LANGDTITGLNAI之胺基酸序列。 如申請專利範圍第1項之核酸，其中皺褶假絲酵母菌脂 肪酶之胺基酸序列為序列編號4、6、10或12。 如申請專利範圍第2項之核酸，其中該突變DN Α係為 序列編號3、5、9或1 1。 一種包含申請專利範園第1項之核酸之微生物，其中該 微生物為細菌或酵母菌。 如申請專利範圍第4項之微生物，其中該細菌為大腸桿 菌（E. coli)。 如申請專利範圍第4項之微生·物，其中該酵母菌為巴斯 德畢赤酵母菌（P· pastoris)。 一種製造如申請專利範圍第1至3項中任一項之核酸之 方法，其包含： 供一編碼敏褶假絲酵母菌脂肪酶之野生型DNa ;以 及 藉由將野生型DNA、DNA.聚合酶、一對包含全部野生 土 DNA之外部引子以及許多對分別包含野生型dna之 片段之内邵引子混合而進行PCR增幅； 其中各内部引子包括一個或多個選自tct、TCC、 TCA、TCG、AGT、AGC、AGA、GGA、TGA、 裝 訂 CGA .、ACT及GCT之絲胺酸之通用密碼子或反密碼 子’其中該通用密碼子或反密碼子與野生型Dna中之 土 y 12個CTG金碼子對應；以及各内部引子，以可得 到編碼皺褶假絲酵母菌脂肪酶之突變DNA之方式，與 另一内部或外部引子交疊。 8· 一種嵌合皺褶假絲酵母菌脂肪酶，其包含第一皺褶假 絲酵母菌脂肪酶之與序列編號4之胺基酸6 3至9 4具有 相同作用之約32個胺基酸之受質交互作用領域及第二 敲褶假絲酵母菌脂肪酶之非受質交互作用領域。 9 ·如申請專利範圍第8項之脂肪酶，其中第二皺褶假絲酵 母菌脂肪酶為序列編號8。 1 0 ·如申請專利範圍第8項之脂肪酶，其中第一皺褶假絲酵 母菌脂肪酶為序列編號4、6、10或12。 U· —種單離核酸，其編碼包含序列編號2所述之胺基酸序 列之皺褶假絲酵母菌脂肪酶，其中序列編號2中具有 LANGOTITGLNAI之胺基酸序列。 1 2 ·如申請專利範圍第丨丨項之單離核酸，其包含序列編號i 之序列。 13· —種皺褶假絲酵母菌脂肪酶，其包含序列編號2所述之 胺基酸序列。 14. 一種包含申請專利範圍第12項之單離核酸之微生物， 其中該微生物為細菌或酵母菌。 1 5 ·如申請專利範圍第1 4項之微生物，其中該細菌為大腸 桿菌。 -2 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 8 8 8 8 A B c D 1233450 申請專利範圍 1 6 .如申請專利範圍第1 4項之微生物，其中該酵母菌為巴 斯德畢赤酵母菌。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1233450

   第090126049號專利申請案 中文補充序列表(93年11月） 序列表 <110〉中央研究院 <120〉重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶 <130> 08919-066001 <140> 090126049 <141> 2001-10-22 <150〉 09/943,857 <151> 2001-08-31 <160> 13 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210〉1 <211> 1650 <212> DNA <213〉皺褶假絲酵母菌 <400〉1 atggagctcg ctcttgcgct cctgctcatt gcctcggtgg ctgctgcccc caccgccacg 60 ctcgccaacg gcgacaccat caccggtctc aacgccatca tcaacgaggc gttcctcggc 120 attccctttg ccgagccgcc ggtgggcaac ctccgcttca aggaccccgt gccgtactcc 180 ggctcgctcg atggccagaa gttcacgctg tacggcccgc tgtgcatgca gcagaacccc 240 gagggcacct acgaggagaa cctccccaag gcagcgctcg acttggtgat gcagtccaag 300 gtgtttgagg cggtgctgcc gctgagcgag gactgtctca ccatcaacgt ggtgcggccg 360 ccgggcacca aggcgggtgc caacctcccg gtgatgctct ggatctttgg cggcgggttt 420 gaggtgggtg gcaccagcac cttccctccc gcccagatga tcaccaagag cattgccatg 480 ggcaagccca tcatccacgt gagcgtcaac taccgcgtgt cgtcgtgggg gttcttggct 540 ggcgacgaga tcaaggccga gggcagtgcc aacgccggtt tgaaggacca gcgcatgggc 600 atgcagtggg tggcggacaa cattgcggcg tttggcggcg acccgaccaa ggtgaccatc 660 1233450 tttggcgagc tggcgggcag catgtcggtc atgtgccaca ttctctggaa cgacggcgac 720 aacacgtaca agggcaagcc gctcttccgc gcgggcatca tgcagctggg ggccatgccg 780 ccgctggacc cggcggacgg cgtctacggc aacgagatct ttgacctctt ggcgtcgaac 840 gcgggctgcg gcagcgccag cgacaagctt gcgtgcttgc gcagtgtgct gagcgacacg 900 ttggaggacg ccaccaacaa cacccctggg ttcttggcgt actcctcgtt gcggttgctg 960 tacctccccc ggcccgacgg cgtgaacatc accgacgaca tgtttgcctt ggtccgcgag 1020 ggcaagtatg caagcgttcc tgtgatcatc ggcgaccaga acgacgaggg caccttcttt 1080 ggcaccctgc tgttgaacgt gaccacggat gccgaggccc gccagtactt taaggagttg 1140 tttgtccacg ccagcgacgc ggagctcgac acgttgatga cggcgtaccc ccaggacatc 1200 acccagggtc tgccgttcga cacgggtgtt ctcaacgccc tcaccccgca gttcaagaga 1260 atcctggcgg tgctcggcga ccttgccttc atccacgccc gtcgctactt cctcaaccac 1320 tacaccggcg gcaccaagta ctcattcctc ctgaagcagc tcctgggctt gccggtgctc 1380 ggaacgttcc actccaacga cattgtcttc caggactact tgttgggcag cggctcgctc 1440 atctacaaca acgcgttcat tgcgtttgcc acggacttgg accccaacac cgcggggttg 1500 ttggtgaagt ggcccgagta caccagcagc ctgcagctgg gcaacaactt gatgatgatc 1560 aacgccttgg gcttgtacac cggcaaggac aactcccgca ccgccggcta cgacgcgttg 1620 ttctccaacc cgccgctgtt ctttgtgtaa 1650 <210>2 <211>549 <212〉蛋白質 <213>皺褶假絲酵母菌 <400〉2 Met Glu Leu Ala Leu Ala Leu Ser Leu lie Ala Ser Val Ala Ala Ala 5 10 15 Pro Thr Ala Thr Leu Ala Asn Gly Asp Thr lie Thr Gly Leu Asn Ala 20 25 30 lie lie Asn Glu Ala Phe Leu Gly lie Pro Phe Ala Glu Pro Pro Val 35 40 45 Gly Asn Leu Arg Phe Lys Asp Pro Val Pro Tyr Ser Gly Ser Leu Asp 50 55 60 Gly Gin Lys Phe Thr Ser Tyr Gly Pro Ser Cys Met Gin Gin Asn Pro 65 70 75 80 Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Asn Leu Pro Lys Ala Ala Leu Asp Leu Val 85 90 95 Met Gin Ser Lys Val Phe Glu Ala Val Ser Pro Ser Ser Glu Asp Cys 100 105 110 Leu Thr lie Asn Val Val Arg Pro Pro Gly Phr Lys Ala Gly Ala Asn 115 120 125 Leu Pro Val Met Leu Trp lie Phe Gly Gly Gly Phe Glu Val Gly Gly 130 135 140 Thr Ser Thr Phe Pro Pro Ala Gin Met lie Thr Lys Ser lie Ala Met 145 150 155 160 Gly Lys Pro lie lie His Val Ser Val Asn Tyr Arg Val Ser Ser Tip 165 170 175 -2 - 1233450 Gly Phe Leu Ala Gly Asp Glu lie Lys Ala Glu Gly Ser Ala Asn Ala 180 185 190 Gly Leu Lys Asp Gin Arg Met Gly Met Gin Trp Val Ala Asp Asn lie 195 200 205 Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Thr Lys Val Thr lie Phe Gly Glu Ser 210 215 220 Ala Gly Ser Met Ser Val Met Cys His lie Leu Trp Asn Asp Gly Asp 225 230 235 240 Asn Thr Tyr Lys Gly Lys Pro Leu Phe Arg Ala Gly lie Met Gin Ser 245 250 255 Gly Ala Met Pro Pro Ser Asp Pro Ala Asp Gly Val Tyr Gly Asn Glu 260 265 270 lie Phe Asp Leu Leu Ala Ser Asn Ala Gly Cys Gly Ser Ala Ser Asp 275 280 285 Lys Leu Ala Cys Leu Arg Ser Val Ser Ser Asp Thr Leu Glu Asp Ala 290 295 300 Thr Asn Asn Thr Pro Gly Phe Leu Ala Tyr Ser Ser Leu Arg Leu Ser 305 310 315 320 Tyr Leu Pro Arg Pro Asp Gly Val Asn lie Thr Asp Asp Met Phe Ala 325 330 335 Leu Val Arg Glu Gly Lys Tyr Ala Ser Val Pro Val lie lie Gly Asp 340 345 350 Gin Asn Asp Glu Gly Thr Phe Phe Gly Thr Ser Ser Leu Asn Val Thr 355 360 365 Thr Asp Ala Glu Ala Arg Gin Tyr Phe Lys Glu Leu Phe Val His Ala 370 375 380 Ser Asp Ala Glu Leu Asp Thr Leu Met Thr Ala Tyr Pro Gin Asp lie 385 390 395 400 Thr Gin Gly Ser Pro Phe Asp Thr Gly Val Leu Asn Ala Leu Thr Pro 405 410 415 Gin Phe Lys Arg lie Ser Ala Val Leu Gly Asp Leu Ala Phe lie His 420 425 430 Ala Arg Arg Tyr Phe Leu Asn His Tyr Thr Gly Gly Thr Lys Tyr Ser 435 440 445 Phe Leu Ser Lys Gin Leu Ser Gly Leu Pro Val Leu Gly Thr Phe His 450 455 460 Ser Asn Asp lie Val Phe Gin Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Gly Ser Leu 465 470 475 480 lie Tyr Asn Asn Ala Phe lie Ala Phe Ala Thr Asp Leu Asp Pro Asn 485 490 495 Thr Ala Gly Leu Leu Val Lys Trp Pro Glu Tyr Thr Ser Ser Ser Gin 500 505 510 Ser Gly Asn Asn Leu Met Met lie Asn Ala Leu Gly Leu Tyr Thr Gly 515 520 525 Lys Asp Asn Ser Arg Thr Ala Gly Tyr Asp Ala Leu Phe Ser Asn Pro 530 535 540 Pro Ser Phe Phe Val <210> 3 <211> 1469 <212> DNA <213〉皺褶假絲酵母菌 1233450 <400> 3 gcccacgcca cctcgccaac ggcgacacca tcaccggtct caacgccatt gtcaacgaaa 60 agtttctcgg cataccgttt gccgagccgc ccgtgggcac tccgcttcaa gctcaacggc 120 cagcagttta cctacggccc gtgcatgcag atgaacccta tgggctcgtt tcattggtgc 180 tccagtccaa gatcttccaa gtggtgcttc ccaacgacga ggactgtctc accaccaggg 240 ccagtgctgg tctcccggtg atgctctgga tctttggcgg tgggtttgag cttggcggct 300 ccagcctctt tccaggagac cagatggtgg ccaagagcgt gctcatgggt aaaccggtga 360 tccacgtgag catgaactac cgcgtggcgt catgggggtt cttggccggc cccgacatcc 420 agaacgaagg cagcgggaac gccggcttgc atgaccagcg cttggccatg cagtgggtgg 480 cggacaacat tgctgggttt ggcggcgacc cgagcaaggt gaccatatac ggcgaggcgg 540 gcagcatgtc gacgtttgtg caccttgtgt ggaacgacgg cgacaacacg tacaacggca 600 agccgttgtt ccgcgccgcc atcatgcagg gctgcatggt gccggacccg gtggacggca 660 cgtacggcac cgagatctac aaccaggtgg tggcgtctgc cgggtgtggc agtgccagcg 720 acaagctcgc gtgcttgcgc ggcctttctc aggacacgtt gtaccaggcc acgagcgaca 780 cgcccggcgt gttggcgtac ccgtcgttgc ggttgtatct cccgcggccc gacggcacct 840 tcatcaccga cgacatgtat gccttggtgc gggacggcaa gtacgcacac gtgccggtga 900 tcatcggcga ccagaacgac gagggcactt tgtttgggct cttgaacgtg accacagatg 960

   ctcaggcacg ggcgtacttc aagcagttca tccacgccag cgatgcggag atcgacacgt 1020 tgatggcggc gtacaccagc gacatcaccc agggtccgtt cgacaccggc atcttcaatg 1080 ccatcacccc gcagttcaaa cggatcgcgt tgcttggcga ccttgcgttc acgcttgcgc 1140 gtcgctactt cctcaactac taccagggcg gcaccaagta ctcgttctca agcagcttgg 1200 gttgcccgtc ttgggcacct tccacggcaa cgacatcatc tggcaggact acttggtggg 1260 cagcggcagt gtgatctaca acaacgcgtt cattgcgttt gccaacgacc tcgacccgaa 1320 caaggcgggc ttgtggacca actggcccac gtacaccagc agcagggcaa caacttgatg 1380 cagatcaacg gcttggggtt gtacaccggc aaggacaact tccgcccgga tgcgtacagc 1440 gccctctttt ccaacccgcc ttctttgtg 1469 <210> 4 <211〉 547 <212>蛋白質 <213〉敏梢假絲酵母菌 <400> 4 Ser Met Asn Ser Arg Gly Pro Ala Gly Arg Leu Gly Ser Val Pro Thr 15 10 15 Ala Thr Leu Ala Asn Gly Asp Thr 工le Thr Gly Leu Asn Ala lie Val 20 25 30

   Asn Glu Lys Phe Leu Gly lie Pro Phe Ala Glu Pro Pro Val Gly Ser 35 40 45 Leu Arg Phe Lys Pro Pro Val Pro Tyr Ser Ala Ser Leu Asn Gly Gin 50 55 60 Gin Phe Thr Ser Tyr Gly Pro Ser Cys Met Gin Met Asn Pro Met Gly 65 70 75 80 Ser Phe Glu Asp Thr Leu Pro Lys Asn Ala Leu Asp Leu Val Leu Gin 85 90 95 Ser Lys lie Phe Gin Val Val Leu Pro Asn Asp Glu Asp Cys Leu Thr 100 105 110 lie Asn Val 工le Arg Pro Pro Gly Thr Arg Ala Ser Ala Gly Leu Pro 115 120 125 Val Met Leu Trp lie Phe Gly Gly Gly Phe Glu Leu Gly Gly Ser Ser 130 135 140 Leu Phe Pro Gly Asp Gin Met Val Ala Lys Ser Val Leu Met Gly Lys 145 150 155 160 Pro Val lie His Val Ser Met Asn Tyr Arg Val Ala Ser Trp Gly Phe 165 170 175 -4 1233450 Leu Ala Gly Pro Asp lie Gin Asn Glu Gly Ser Gly Asn Ala Gly Leu 180 185 190 His Asp Gin Arg Leu Ala Met Gin Trp Val Ala Asp Asn 工le Ala Gly 195 200 205 Phe Gly Gly Asp Pro Ser Lys Val Thr lie Tyr Gly Glu Ser Ala Gly 210 215 220 Ser Met Ser Thr Phe Val His Leu Val Trp Asn Asp Gly Asp Asn Thr 225 230 235 240 Tyr Asn Gly Lys Pro Leu Phe Arg Ala Ala lie Met Gin Ser Gly Cys 245 250 255 Met Val Pro Ser Asp Pro Val Asp Gly Thr Tyr Gly Thr Glu lie Tyr 260 265 270 Asn Gin Val Val Ala Ser Ala Gly Cys Gly Ser Ala Ser Asp Lys Leu 275 280 285 Ala Cys Leu Arg Gly Leu Ser Gin Asp Thr Leu Tyr Gin Ala Thr Ser 290 295 300 Asp Thr Pro Gly Val Leu Ala Tyr Pro Ser Leu Arg Leu Ser Tyr Leu 305 310 315 320 Pro Arg Pro Asp Gly Thr Phe lie Thr Asp Asp Met Tyr Ala Leu Val 325 330 335 Arg Asp Gly Lys Tyr Ala His Val Pro Val lie lie Gly Asp Gin Asn 340 345 350 Asp Glu Gly Thr Leu Phe Gly Leu Ser Ser Leu Asn Val Thr Thr Asp 355 360 365 Ala Gin Ala Arg Ala Tyr Phe Lys Gin Ser Phe lie His Ala Ser Asp 370 375 380 Ala Glu lie Asp Thr Leu Met Ala Ala Tyr Thr Ser Asp lie Thr Gin 385 390 395 400 Gly Ser Pro Phe Asp Thr Gly lie Phe Asn Ala lie Thr Pro Gin Phe 405 410 415 Lys Arg lie Ser Ala Leu Leu Gly Asp Leu Ala Phe Thr Leu Ala Arg 420 425 430 Arg Tyr Phe Leu Asn Tyr Tyr Gin Gly Gly Thr Lys Tyr Ser Phe Leu 435 440 445 Ser Lys Gin Leu Ser Gly Leu Pro Val Leu Gly Thr Phe His Gly Asn 450 455 460 Asp lie lie Trp Gin Asp Tyr Leu Val Gly Ser Gly Ser Val lie Tyr 465 470 475 480 Asn Asn Ala Phe lie Ala Phe Ala Asn Asp Leu Asp Pro Asn Lys Ala 485 490 495 Gly Leu Trp Thr Asn Trp Pro Thr Tyr Thr Ser Ser Ser Gin Ser Gly 500 505 510 Asn Asn Leu Met Gin lie Asn Gly Leu Gly Leu Tyr Thr Gly Lys Asp 515 520 525 Asn Phe Arg Pro Asp Ala Tyr Ser Ala Leu Phe Ser Asn Pro Pro Ser 530 535 540 Phe Phe Val 545 <210> 5 <211> 1532 <212> DNA <213〉皺褶假絲酵母菌 5- 1233450 <400> 5 gcccaccgcc ggcgttcctc tgtgccgtac aaccccgagg tccaaggtgt cggccgccgg gggtttgaga ctcatgggca tggctggtga tgggcatgca catctttggc caacacgtac ggacccggtg ctgtggcagc tgccaccaac cgacggcaag cgttcccgtg accacgaatg atcgacacct caacgctcac cccgccgcta tcgggttgcc tgggaagcgg ccaacaccgc tgatgatgat acgacgcgtt aagctcgcca ggcattccct tctggctcgc gcacgtttga tccaggcggt gcaccaaggc tcggcagccc agccatcatc tgacatcaag gtgggtggca gaggcgggca dagggcssgc gacggcacgt gccagcgaca aacactcctg aacatcaccg atcattggcg ctcaggcccg tgatggcggc cccgcagttc cttcctcaac aatcatgggc cagcgtcatc ggggttgttg caacgccttg gatgaccaac acggcgacac ttgccgagcc tcaacggcca agagaacctt gcttccccag gggcgccaac caccatcttc cacgtggccg gccgagggca gacaacattg gcatgtccgt cgttgttccg acggcaacga agctcgcgtg ggttcttggc atgacatgta accagaacga tgcttacttc gtacccccag aagagaatcg cacttccagg accttccatg tacaacaacg gtgaactggc ggcttgtaca ccgttctttg catcaccggt gccggtgggc gaagttactt ggcaagacgg agtgaggact ctcccggtca cctcccgccc tcaactaccg gcgggaacgc ccgggttcgg gttgtgccac cgcgggcatc gatctacgac cttgcgcagt gtactcctcg caagttggtg cgagggcacc aagcagttca gacatcaccc cggtgctcgg gcggcaccaa ccaacgacat cgtttatcgc ccaagtacac ccggcaagga tg ctcaacgcca aacctccgct acggcccgtg cactcgactt gcctcaccat tgctctggat agatggtcac tgttgcctcg cggcttgaag cggcgacccg ctcatctgga atgcagggag ctctttgtct gcgagcgaca ttgcggttgt cgcgacggca atctttggct tccacgccag agggtccgtt cgaccttgca gtactcgttc tgtgtggcag gttcgccacc cagcagccag caacttccgc tcatcaacga tcaaggaccc catgcagcag ggtgatgcag caacgtggtg ctttggcggt caagagtgtg tgggggttct gaccagcgtt agcaaggtga acgacggcga ccatggtgcc cgagtgctgg ccttgctcga actcccggcc agtatgcsdg cttgaacgtg cgacgcggag cgacacggtt ttcatccacg ctcaagcagc gactacttgt gacttggacc ggcaacaact accgctggct 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1532 <210〉 6 <211> 547 <212> 蛋白質 <213>皺褶假絲酵母菌 <40〇> 6 Ser Met Asn Ser Arg Gly Pro Ala Gly Arg 15 10 Ala Lys Leu Ala Asn Gly Asp Thr lie Thr 20 25 Asn Glu Ala Phe Leu Gly lie Pro Phe Ala 35 40 Leu Arg Phe Lys Asp Pro Val Pro Tyr Ser 50 55 Lys Phe Thr Ser Tyr Gly Pro Ser Cys Met 65 7〇 Thr Phe Glu Glu Asn Leu Gly Lys Thr Ala 85 90 Ser Lys Val Phe Gin Ala Val Leu Pro Gin 100 105 工le Asn Val Val Arg Pro Pro Gly Thr Lys 115 120 Val Met Leu Trp lie Phe Gly Gly Gly Phe 130 135 lie Phe Pro Pro Ala Gin Met Val Thr Lys 145 150 Leu Gly Ser Val Gly Leu Glu Pro Gly Ser 60 Gin Gin 75 Leu Asp Ser Glu Ala Gly Glu He 140 Ser Val 155 Asn Ala 30 Pro Val 45 Leu Asn Asn Pro Leu Val Asp Cys 110 Ala Asn 125 Gly Ser Leu Met Pro Thr 15 lie lie Gly Asn Gly Gin Glu Gly 80 Met Gin 95 Leu Thr Leu Pro Pro Thr Gly Lys 160 -6 1233450 His lie 工le His Val Ala Val Asn Tyr Arg Val Ala Ser Trp Gly Phe 165 170 175 Leu Ala Gly Asp Asp lie Lys Ala Glu Gly Ser Gly Asn Ala Gly Leu 180 185 190 Lys Asp Gin Arg Leu Gly Met Gin Trp Val Ala Asp Asn 工le Ala Gly 195 200 205 Phe Gly Gly Asp Pro Ser Lys Val Thr lie Phe Gly Glu Ser Ala Gly 210 215 220 Ser Met Ser Val Leu Cys His Leu lie Trp Asn Asp Gly Asp Asn Thr 225 230 235 240 Tyr Lys Gly Lys Pro Leu Phe Arg Ala Gly lie Met Gin Ser Gly Ala 245 250 255 Met Val Pro Ser Asp Pro Val Asp Gly Thr Tyr Gly Asn Glu lie Tyr 260 265 270 Asp Leu Phe Val Ser Ser Ala Gly Cys Gly Ser Ala Ser Asp Lys Leu 275 280 285 Ala Cys Leu Arg Ser Ala Ser Ser Asp Thr Leu Leu Asp Ala Thr Asn 290 295 300 Asn Thr Pro Gly Phe Leu Ala Tyr Ser Ser Leu Arg Leu Ser Tyr Leu 305 310 315 320 Pro Arg Pro Asp Gly Lys Asn lie Thr Asp Asp Met Tyr Lys Leu Val 325 330 335 Arg Asp Gly Lys Tyr Ala Ser Val Pro Val lie 工le Gly Asp Gin Asn 340 345 350 Asp Glu Gly Thr lie Phe Gly Leu Ser Ser Leu Asn Val Thr Thr Asn 355 360 365 Ala Gin Ala Arg Ala Tyr Phe Lys Gin Ser Phe lie His Ala Ser Asp 370 375 380 Ala Glu 工le Asp Thr Leu Met Ala Ala Tyr Pro Gin Asp lie Thr Gin 385 390 395 400 Gly Ser Pro Phe Asp Thr Gly Val Leu Asn Ala Leu Thr Pro Gin Phe 405 410 415 Lys Arg lie Ser Ala Val Leu Gly Asp Leu Ala Phe lie His Ala Arg 420 425 430 Arg Tyr Phe Leu Asn His Phe Gin Gly Gly Thr Lys Tyr Ser Phe Leu 435 440 445 Ser Lys Gin Leu Ser Gly Leu Pro lie Met Gly Thr Phe His Ala Asn 450 455 460 Asp lie Val Trp Gin Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Gly Ser Val lie Tyr 465 470 475 480 Asn Asn Ala Phe lie Ala Phe Ala Thr Asp Leu Asp Pro Asn Thr Ala 485 490 495 Gly Leu Leu Val Asn Trp Pro Lys Tyr Thr Ser Ser Ser Gin Ser Gly 500 505 510 Asn Asn Leu Met Met lie Asn Ala Leu Gly Leu Tyr Thr Gly Lys Asp 515 520 525 Asn Phe Arg Thr Ala Gly Tyr Asp Ala Leu Met Thr Asn Pro Ser Ser 530 535 540 Phe Phe Val 545 〈210〉 7 <211> 1548 <212> DNA <213>皺褶假絲酵母菌 1233450 <4〇0> 7 gcccactgcc acgctcgcca acggcgacac catcaccggt ctcaacgcca tcatcaacga 60 ggcgttcctc ggtattccct ttgctcagcc gccggtgggc aacctccgct tcaagccgcc 120 tgtgccgtac tcggcgtctc tcaatggtca gaagtttact gtatggccct gtgcatgcag 180 atgaacccat tgggcaactg ggactcctcg cttcccaagg ctgccatcaa cttgatgcag 240 tccaagctct tccaggcggt gcttcctaac ggcgaggact gtctcaccat caacgtggtg 300 cggccgggca ccaagccggg tgccaacctc cccgtgatgg tgtggatttt tggcggcggg 360 tttgaggttg gcggctccag tctcttccct cccgcacaga tgatcaccgc cagcgtgctt 420 atgggcaagc ccatcatcca cgtgagcatg aactaccgcg ttgcttcgtg ggggttcttg 480 gctggtccag acatcaaggc cgagggcagc gggaacgccg gtttgcacga ccaacgcttg 540 ggtttgcagt gggtggcgga caacattgcc gggttcggcg gcgacccgtc caaggtgacc 600 atctttggtg agggcgggca gcatgtcggt aatgtgtcag ctcctctgga acgacggcga 660 caacacgtac aacggcaagc cgttgttccg tgccgccatc atgcaggggg ccatggtgcc 720 gggacccggt ggatgggccc tacggcacgc agatctacga ccaggtggtt gcttcagccg 780 gctgtggcag tgccagcgac aagctcgcgt gcttgcgcag catcgaacga caaactcttc 840 caggccacca gcgacactcc gggggccttg gcgtacccct· cgttgcggtt ggtttctccc 900

   gcggcccgac ggcaccttca tcaccgatga catgttcaag ttggtgcgcg acggcaagtg 960 tgccaacgtt ccggtgatca ttggcgacca gaacgacgag ggcacagtgt ttgcgttgtt 1020 gaacgtgact acggatgctc aggcacgcca gtacttcaag gaattcatcc acgccagcga 1080 cgcggagatc gacaccttga tggcggcgta ccccagcgac atcacccagg gtccgttcga 1140 caccggcatc ttcaacgcca tcaccccgca gttcaaacgg attgcagcgg tgcttggtga 1200 ccttgcgttc actctccccc ggcgctactt cctcaaccac ttccagggcg gcaccaagta 1260 ctcgttcctc gaagcagctt gggttgccgg tgattggcac ccaccacgcc aacgacattg 1320 tgtggcagga ctttttggtg agccacagca gcgccgtgta caacaacgcg tttattgcct 1380 ttgccaacga cctcgacccg aacaaggccg gtttgcttgt gaactggccc aagtacacca 1440 gcagccaggg caacaacttg ttgcagatca acgccttggg cttgtacacc ggcaaggaca 1500 acttccgcac cgctggctac gacgcgttgt ttaccaaccc gtttttgt 1548 <210〉 8 <211> 547 <212>蛋白質 <213>皺褶假絲酵母菌 <400> 8 Ser Met Asn Ser Arg Gly Pro Ala Gly Arg Leu Gly Ser Val Pro Thr 15 10 15

   Ala Thr Leu Ala Asn Gly Asp Thr lie Thr Gly Leu Asn Ala lie lie 20 25 30 Asn Glu Ala Phe Leu Gly lie Pro Phe Ala Gin Pro Pro Val Gly Asn 35 40 45 Leu Arg Phe Lys Pro Pro Val Pro Tyr Ser Ala Ser Leu Asn Gly Gin 50 55 60 Lys Phe Thr Ser Tyr Gly Pro Ser Cys Met Gin Met Asn Pro Leu Gly 65 70 75 80 Asn Trp Asp Ser Ser Leu Pro Lys Ala Ala lie Asn Ser Leu Met Gin 85 90 95 Ser Lys Leu Phe Gin Ala Val Leu Pro Asn Gly Glu Asp Cys Leu Thr 100 105 110 工le Asn Val Val Arg Pro Ser Gly Thr Lys Pro Gly Ala Asn Leu Pro 115 120 125 Val Met Val Trp lie Phe Gly Gly Gly Phe Glu Val Gly Gly Ser Ser 130 135 140 Leu Phe Pro Pro Ala Gin Met lie Thr Ala Ser Val Leu Met Gly Lys 145 150 155 160 -8 1233450 Pro lie 工le His Val 165 Leu Ala Gly Pro Asp 180 His Asp Gin Arg Leu 195 Phe Gly Gly Asp Pro 210 Ser Met Ser Val Met 225 Tyr Asn Gly Lys Pro 245 Met Val Pro Ser Asp 260 Asp Gin Val Val Ala 275 Ala Cys Leu Arg Ser 290 Asp Thr Pro Gly Ala 305 Pro Arg Pro Asp Gly 325 Arg Asp Gly Lys Cys 340 Asp Glu Gly Thr Val 355 Ala Gin Ala Arg Gin 370 Ala Glu 工le Asp Thr 385 Gly Ser Pro Phe Asp 405 Lys Arg lie Ala Ala 420 Arg Tyr Phe Leu Asn 435 Ser Lys Gin Leu Ser 450 Asp 工le Val Trp Gin 465 Asn Asn Ala Phe lie 485 Gly Leu Leu Val Asn 500 Asn Asn Leu Leu Gin 515 Asn Phe Arg Thr Ala 530 Phe Phe Val 545 <210〉 9 <211〉 1541 <212> DNA <213〉皺褶假絲酵母菌 Ser Met Asn Tyr Arg Val Ala Ser Trp Gly Phe 170 175 lie Lys Ala Glu Gly Ser Gly Asn Ala Gly Leu 185 190 Gly Leu Gin Trp Val Ala Asp Asn 工le Ala Gly 200 205 Ser Lys Val Thr lie Phe Gly Glu Ser Ala Gly 215 220 Cys Gin Leu Leu Trp Asn Asp Gly Asp Asn Thr 230 235 240 Leu Phe Arg Ala Ala lie Met Gin Ser Gly Ala 250 255 Pro Val Asp Gly Pro Tyr Gly Thr Gin lie Tyr 265 270 Ser Ala Gly Cys Gly Ser Ala Ser Asp Lys Leu 280 285 lie Ser Asn Asp Lys Leu Phe Gin Ala Thr Ser 295 300 Leu Ala Tyr Pro Ser Leu Arg Leu Ser Phe Leu 310 315 320 Thr Phe 工le Thr Asp Asp Met Phe Lys Leu Val 330 335 Ala Asn Val Pro Val lie lie Gly Asp Gin Asn 345 350 Phe Ala Leu Ser Ser Leu Asn Val Thr Thr Asp 360 365 Tyr Phe Lys Glu Ser Phe lie His Ala Ser Asp 375 380 Leu Met Ala Ala Tyr Pro Ser Asp lie Thr Gin 390 395 400 Thr Gly lie Phe Asn Ala lie Thr Pro Gin Phe 410 415 Val Leu Gly Asp Leu Ala Phe Thr Leu Pro Arg 425 430 His Phe Gin Gly Gly Thr Lys Tyr Ser Phe Leu 440 445 Gly Leu Pro Val lie Gly Thr His His Ala Asn 455 460 Asp Phe Leu Val Ser His Ser Ser Ala Val Tyr 470 475 480 Ala Phe Ala Asn Asp Leu Asp Pro Asn Lys Ala 490 495 Trp Pro Lys Tyr Thr Ser Ser Ser Gin Ser Gly 505 510 lie Asn Ala Leu Gly Leu Tyr Thr Gly Lys Asp 520 525 Gly Tyr Asp Ala Leu Phe Thr Asn Pro Ser Ser 535 540

   -9 - 1233450 <400〉 9 gcccacgcca cgctcgccaa cggcgacacc atcaccggtc tcaacgccat catcaacgag 60 gcgttcctcg gcattccctt tgccgagccg ccggtgggca acctccgctt caaggaccct 120 gtgccgtacc gtgggtctct caacggtcaa tccttcaccg cgtacggtcc gtgcatgcag 180 cagaaccccg agggcaccta cgaggagaac ctccccaagg tggcgcttga cttggtgatg 240 cagtccaagg tgttccaggc tgttctcccc aacagcgagg actgcctcac catcaacgtg 300 gtgcggccgc cgggcaccaa ggcgggcgcc aacctcccgg tcatgctctg gatctttggc 360 ggtgggtttg agatcggcag ccccaccatc ttccctcccg ctcagatggt ctccaagagt 420 gtgctcatgg gcagcccatc atccacgtgg ccgtcaacta ccgcttggcg tcctttggtt 480 tcttggccgg tccggacatc aaggccgagg gcagctccaa tgccggcctc aaggaccagc 540 gcttgggcat gcagtgggtg gcagacaaca ttgccgggtt cggcggcgac ccgagcaagg 600 tgaccatctt tgggaggcgg gcagcatgtc cgtgttgtgc caccttctct ggaatggcgg 660 cgacaacacg tacaagggca agccgttgtt ccgcgcgggc atcatgcagg gagccatggt 720 gccggacccg gtggacggca cctatggacc caaatctatg acacgttggt ggctacgggc 780 tgcagcagtg ccagcaacaa gcttgcgtgc ttgcgtggtc ttactcaggc attgctcgat 840

   gccaccaacg acacccctgg gttcttgtcg tacacctcgt tgcggttgta ctcccggccc 900 gacggcgcca acatcaccga tgacatgtac aagttggtac gcgacggcaa gtatgcaagc 960 gttcccgtga tcattggcga ccagaacgac gagggcttct tgtttgtctc ttgaacacca 1020 ccaccgaggc cgacgccgag gcatacctca gaaagttcat ccacgccacc gacgccgata 1080 tcaccgcatt gaaggcggcg taccccagcg atgtcaccca gggtccgttc gacacgggca 1140 ttctcaacgc ccttacaccc cagctcaagc ggatcaatgc tgtgcttggc gacctcacct 1200 ttaccctctc gcgccgctac ttcctcaacc actacaccgg tggtcccaag tactcgttcc 1260 tcaagcagct tggttgccca ttctcggacg ttccacgcga acgacattgt gtggcagcac 1320 tttttgttgg gcagcggcag cgtcatctac aacaacgcgt tcatcgcgtt tgccaccgac 1380 ttggacccca acaccgcggg cttggtgcag tggcccaagt caccagcagc caggcggggg 1440 acaacttgat gcagatcagt gccttgggct tgtacaccgg caaggacaac ttccgcaccg 1500 ccggctacaa cgctttgttt gccgacccgc actttttcgt g 1541 <21〇> 10 <211> 547 <212〉蛋白質 <213>皺褶假絲酵母菌 <400> 10 Ser Met Asn Ser Arg Gly Pro Ala Gly Arg Leu Gly Ser Val Pro Thr 15 10 15

   Ala Thr Leu Ala Asn Gly Asp Thr 工le Thr Gly Leu Asn Ala lie lie 20 25 30 Asn Glu Ala Phe Leu Gly lie Pro Phe Ala Glu Pro Pro Val Gly Asn 35 40 45 Leu Arg Phe Lys Asp Pro Val Pro Tyr Arg Gly Ser Leu Asn Gly Gin 50 55 60 Ser Phe Thr Ala Tyr Gly Pro Ser Cys Met Gin Gin Asn Pro Glu Gly 65 70 75 80 Thr Tyr Glu Glu Asn Leu Pro Lys Val Ala Leu Asp Leu Val Met Gin 85 90 .95 Ser Lys Val Phe Gin Ala Val Leu Pro Asn Ser Glu Asp Cys Leu Thr 100 105 110 工le Asn Val Val Arg Pro Pro Gly Thr Lys Ala Gly Ala Asn Leu Pro 115 120 125 Val Met Leu Trp lie Phe Gly Gly Gly Phe Glu lie Gly Ser Pro Thr 130 135 140 lie Phe Pro Pro Ala Gin Met Val Ser Lys Ser Val Leu Met Gly Glu 145 150 155 160 -10- 1233450 Pro lie 工le His Val Ala Val Asn Tyr Arg Leu Ala Ser Phe Gly Phe 165 170 175 Leu Ala Gly Pro Asp lie Lys Ala Glu Gly Ser Ser Asn Ala Gly Leu 180 185 190 Lys Asp Gin Arg Leu Gly Met Gin Trp Val Ala Asp Asn 工le Ala Gly 195 200 205 Phe Gly Gly Asp Pro Ser Lys Val Thr lie Phe Gly Glu Ser Ala Gly 210 215 220 Ser Met Ser Val Leu Cys His Leu Leu Trp Asn Gly Gly Asp Asn Thr 225 230 235 240 Tyr Lys Gly Lys Pro Leu Phe Arg Ala Gly lie Met Gin Ser Gly Ala 245 250 255 Met Val Pro Ser Asp Pro Val Asp Gly Thr Tyr Gly Ala Gin lie Tyr 260 265 270

   Asp Thr Leu Val Ala Ser Thr Gly Cys Ser Ser Ala Ser Asn Lys Leu 275 280 285 Ala Cys Leu Arg Gly Leu Ser Thr Gin Ala Leu Leu Asp Ala Thr Asn 290 295 300 Asp Thr Pro Gly Phe Leu Ser Tyr Thr Ser Leu Arg Leu Ser Tyr Leu 305 310 315 320 Pro Arg Pro Asp Gly Ala Asn lie Thr Asp Asp Met Tyr Lys Leu Val 325 330 335 Arg Asp Gly Lys Tyr Ala Ser Val Pro Val_lie lie Gly Asp Gin Asn 340 345 350 Asp Glu Gly Phe Leu Phe Asp Leu Ser Ser Leu Asn Thr Thr Thr Glu 355 360 365 Ala Asp Ala Glu Ala Tyr Leu Arg Lys Ser Phe lie His Ala Thr Asp 370 375 380 Ala Asp lie Thr Ala Leu Lys Ala Ala Tyr Pro Ser Asp Val Thr Gin 385 390 395 400 Gly Ser Pro Phe Asp Thr Gly lie Leu Asn Ala Leu Thr Pro Gin Leu 405 410 415 Lys Arg lie Asn Ala Val Leu Gly Asp Leu Thr Phe Thr Leu Ser Arg 420 425 430

   Arg Tyr Phe Leu Asn His Tyr Thr Gly Gly Pro Lys Tyr Ser Phe Leu 435 440 445 Ser Lys Gin Leu Ser Gly Leu Pro lie Leu Gly Thr Phe His Ala Asn 450 455 460 Asp 工le Val Trp Gin His Phe Leu Leu Gly Ser Gly Ser Val lie Tyr 465 470 475 480 Asn Asn Ala Phe lie Ala Phe Ala Thr Asp Leu Asp Pro Asn Thr Ala 485 490 495 Gly Leu Ser Val Gin Trp Pro Lys Tyr Thr Ser Ser Ser Gin Ala Gly 500 505 510 Asp Asn Leu Met Gin lie Ser Ala Leu Gly Leu Tyr Thr Gly Lys Asp 515 520 525 Asn Phe Arg Thr Ala Gly Tyr Asn Ala Leu Phe Ala Asp Pro Ser His 530 535 540 Phe Phe Val -11 - 1233450 545 <210〉 11 <211> 1511 <212〉 DNA <213>皺褶假絲酵母菌 <400〉 11 gcccacgcca gcgttcctcg gtgccgtact accccgaggg ccaaggtgtt cgggcaccaa aggtgggtgg gcaagcccat gcgacgagat gcagtgggtg tggcgaggcg gtacaagggc gtggacggct cgccagcgac caacacccct tgaacatcac cggcgaccag gcccgcagta gcgtaccccg gttcaagaga tacaccggcg ttccactcca aacaacgcgt aagtggcccg ttgtacaccg cgttctttgt cgctcgccaa gcattccctt ccggctcgct cacctacgag tgaggcggtg ggcgggtgcc caccagcacc catccacgtg caaggccgag gcggacaaca ggcagcatgt aagccgctct ctacggcaac aagcttgcgt gggttcttgg cgacgacatg aacgacgagg cttcagcagt acatcaccca atcgcggtgc gcaccaagta acgacattgt tcattgcgtt agtacaccag gcaaggacaa g cggcgacacc tgccgagccg cgatggccag gagaacctcc ccgagcgagg aacctcccgg ttccctcccg agcgtcaact ggcagtgcca ttgcggcgtt cggtcatgtg tccgcgcggg gagatctttg gcttgcgcgg cgtactcctc tgccttggtc gcaccttctt ttgtccacgc gggccgttcg tcggcgacct ctcattcctc cttccaggac tgccacggac cagccagggc ctccgcaccg atcaccggtc ccggtgggca aagttcacta ccaaggcagc actgtctcac tgatgctctg cccagatgat accgcgtgtc acgccggttt tggcggcgac ccacattctc catcatgcag acctcttggc tgtgagcgac gttgcggttg gcgagggcaa tggcaccttg cagcgacgcg acacgggttt tgcttacgcc aagcagctcg tacttgttgg ttggacccca aacaacttga ccggctacga tcaacgccat acctccgctt cggcccgtgc gctcgacttg catcaacgtg gatctttggc caccaagagc gtcgtggggg gaaggaccag ccgaccaagg tggaacgacg ggggccatgg gtcgacgcgg acgttggagg tactccccgg gtatgcactc aacgtgacca gagtcgacac ctcaacgccc gtcgctactt gcttgccggt gcagcggctc acaccgcggg tgatgatcaa cgcgttgttc catcaacgag caaggacccc atgcagcaga gtgatgcagt gtgcggccgc ggcgggtttg attgccatgg ttcttggctg cgctgggcat tgaccatctt gcgacaacac tccgggacgc gctgcggcag acgccaccaa cccgacggcg ctgtgatcat cggatgccag gttgatgacg tcaccccgca cctcaaccac gctcggaacg gctcatctac gttgttggtg cgccttgggc tccaacccgc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 o o o o 1 2 8 4 0 1 3 3 4 5 5 -—_ i—I I—I i—I -—I <210〉 12 <211> 547 <212>蛋白質 <213>皺褶假絲酵母菌 <400〉 12 Ser Met Asn Ser Arg Gly Pro Ala Gly Arg 15 10 Ala Thr Leu Ala Asn Gly Asp Thr lie Thr 20 25 Asn Glu Ala Phe Leu Gly lie Pro Phe Ala 35 40 Leu Arg Phe Lys Asp Pro Val Pro Tyr Ser 50 55 Lys Phe Thr Ser Tyr Gly Pro Ser Cys Met 65 70 Thr Tyr Glu Glu Asn Leu Pro Lys Ala Ala 85 90 Ser Lys Val Phe Glu Ala Val Ser Pro Ser 100 105 工le Asn Val Val Arg Pro Pro Gly Thr Lys 115 120 Leu Gly Ser Val Gly Leu Glu Pro Gly Ser 60 Gin Gin 75 Leu Asp Ser Glu Ala Gly Asn Ala 30 Pro Val 45 Leu Asp Asn Pro Leu Val Asp Cys 110 Ala Asn 125 Pro Thr 15 lie lie Gly Asn Gly Gin Glu Gly 80 Met Gin 95 Leu Thr Leu Pro -12 - 1233450 Val Met Leu Trp lie Phe Gly Gly Gly Phe Glu Val Gly Gly Thr Ser 130 135 140 Thr Phe Pro Pro Ala Gin Met lie Thr Lys Ser lie Ala Met Gly Lys 145 150 155 160 Pro lie lie His Val Ser Val Asn Tyr Arg Val Ser Ser Trp Gly Phe 165 170 175 Leu Ala Gly Asp Glu lie Lys Ala Glu Gly Ser Ala Asn Ala Gly Leu 180 185 190 Lys Asp Gin Arg Met Gly Met Gin Trp Val Ala Asp Asn lie Ala Ala 195 200 205 Phe Gly Gly Asp Pro Thr Lys Val Thr lie Phe Gly Glu Ser Ala Gly 210 215 220 Ser Met Ser Val Met Cys His lie Leu Trp Asn Asp Gly Asp Asn Thr 225 230 235 240 Tyr Lys Gly Lys Pro Leu Phe Arg Ala Gly lie Met Gin Ser Gly Ala 245 250 255 Met Val Pro Ser Asp Ala Val Asp Gly Val Tyr Gly Asn Glu lie Phe 260 265 270 Asp Leu Leu Ala Ser Asp Ala Gly Cys Gly Ser Ala Ser Asp Lys Leu 275 280 285 Ala Cys Leu Arg Gly Val Ser Ser Asp Thr Leu Glu Asp Ala Thr Asn 290 295 300 Asn Thr Pro Gly Phe Leu Ala Tyr Ser Ser Leu Arg Leu Ser Tyr Leu 305 310 315 320 Pro Arg Pro Asp Gly Val Asn lie Thr Asp Asp Met Phe Ala Leu Val 325· 330 335 Arg Glu Gly Lys Tyr Ala Ser Val Pro Val lie lie Gly Asp Gin Asn 340 345 350 Asp Glu Gly Thr Phe Phe Gly Thr Ser Ser Leu Asn Val Thr Thr Asp 355 360 365 Ala Glu Ala Arg Gin Tyr Phe Thr Gin Ser Phe Val His Ala Ser Asp 370 375 380 Ala Glu Leu Asp Thr Leu Met Thr Ala Tyr Pro Gin Asp lie Thr Gin 385 390 395 400 Gly Ser Pro Phe Asp Thr Gly Val Leu Asn Ala Leu Thr Pro Gin Phe 405 410 415 Lys Arg lie Ser Ala Val Leu Gly Asp Leu Ala Phe lie His Ala Arg 420 425 430 Arg Tyr Phe Leu Asn His Tyr Thr Gly Gly Thr Lys Tyr Ser Phe Leu 435 440 445 Ser Lys Gin Leu Ser Gly Leu Pro Val Leu Gly Thr Phe His Ser Asn 450 455 460 Asp lie Val Phe Gin Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Gly Ser Leu lie Tyr 465 470 475 480 Asn Asn Ala Phe 工le Ala Phe Ala Thr Asp Leu Asp Pro Asn Thr Ala 485 490 495 Gly Leu Leu Val Lys Trp Pro Glu Tyr Thr Ser Ser Ser Gin Ser Gly 500 505 510 Asn Asn Leu Met Met 工le Asn Ala Leu Gly Leu Tyr Thr Gly Lys Asp 515 520 525 Asn Ser Arg Thr Ala Gly Tyr Asp Ala Leu Phe Ser Asn Pro Pro Ser 530 535 540 Phe Phe Val 545 <210> 13 <211> 13 13- 1233450 <212>蛋白質 <213>皺褶假絲酵母菌 <4〇〇> 13 Ser Met Asn Ser Arg Gly Pro Ala Gly Arg Leu Gly Ser 1 5 10

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