TWI227737B

TWI227737B - Catalytic nucleic acid-based diagnostic methods

Info

Publication number: TWI227737B
Application number: TW088104968A
Authority: TW
Inventors: Alison V Todd; Caroline J Fuery; Murray J Cairns
Original assignee: Johnson & Johnson Res Pty Ltd
Priority date: 1998-03-27
Filing date: 1999-08-31
Publication date: 2005-02-11
Also published as: US6361941B1; EP1025266B1; EP1025266A4; WO1999050452A1; EP1025266A1; ATE431852T1; CA2312288A1; IL136443A; IL136443A0; AU2003252934A1; ZA992374B; DE69940903D1; AU3530399A; AU763135B2

Description

A7 B7 1227737 五、發明説明（本申請案中引證多份公開資料。這些公開資料揭示之内容併入本發明作為參考，以詳盡說明本發明相關技術領域之現況。本發明之技術本發明係關於診斷疾病之方法，該疾病之特徵在於習知核酸之突變。本發明方法使用觸酶核酸分子，其能有效用於診斷諸如癌症及AIDS之類的疾病。

主登明之技術H 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 4多先天及後天疾病與遺傳變異有關’例如單點突變、刪除與插入。這些變異有些直接與疾病有關，但有些與疾病的發生危機及/或預後有關聯。至少有500種以上的人類遺傳疾病由單一基因的突變所致（21，22)。這些疾病包括纖維變性、肌肉萎縮症、αΐ—抗胰蛋白酶缺乏症、苯基酮尿、鐮狀細胞型貧血或特質、及許多其他血紅素病變（21，22)。此外，個體增加對一些常見的多因性疾病 (例如動脈糜瘤硬化性心臟疾病）的敏感度，已知與特定 DNA序列多形化的遺傳有關。咸信癌症的發展係由於累積涉及細胞複製或分化之基因的遺傳病變所致。原致癌基因（Κ-ras，N-ras及 Η-ras)與P53腫瘤抑制基因是人類癌症中常見突變之基因範例。這些基因中的特定突變增加細胞變形的可能性。遺傳分析在臨床評估疾病發病危機、診斷疾病、預測病患預後情形或對治療的反應、及追蹤病患之病況發展上十分 88103a(9J&JRES) 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（21GX297公瘦） 1227737 Α7 ___ Β7 五、發明説明（2 ) 重要。然而套用這類遺傳測試將由用於檢測遺傳變異之簡單、不貴且快速分析法的發展情形決定。活體外核酸擴大法廣泛應用於遺傳學及疾病診斷上。近十年來’已發表許多擴大核酸的技術。這些技術包括聚合酶鏈鎖反應（“PCR”）（1-7)、接合酶鏈鎖反應（LCR) (8)、股置換擴大分析法（SDA) (9)、及轉錄調介擴大法 (TMA) (1〇，11)(也稱為自身保留序列複製法（SSR))。由 PCR、LCR及SDA生產的擴大產物（“擴大物“）是⑽八，而RNA擴大物是由TMA生產。由這些方法或其他方法所產生的DNA或RNA模板可用於分析與確診疾病有關之序列變異（突變）的存在情形。核酸擴大法中，近年來業已深入研究觸酶核酸。使用觸酶核酸作為治療劑來抑制基因功能的可能性在文獻中討論頻繁（12-18)。觸酶RNA分子（“核酶（rib〇zyme)，，）顯示可切割RNA分子（12)與腿分子⑵）。同樣地，觸酶 DNA分子（DNA酶）顯示能夠切割RNA分子（13，19)與 DNA分子（18)。觸酶核酸祇能切割標的核酸受質的前提是，標的序列符合嚴格的序列要件。標的受質一定要與觸酶核酸之雜交區互補，且該標的物在切割位置含有特定序列。切割位置之序列要件範例包括，某一類醜酶（1〇一23 型）（19)之切割作用需要嗓呤··㈣序列，對挪頭型核酶 (23)需要序列尿嘧啶核苷：H，其"可為八、。^，但不是G。 ______________-4_ 财關家觯（CNS ) Χ^ΤΤωχ297公董）-〜-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂線經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227737 A7 _____ _______________________ B7 五、發明説明（3 ) 觸酶核酸分子除了具有治療可能性，也可用來區別有單點突變之不同標的物（14-16)。此目的可利用特定序列為標乾而達成，此特定序列存在於野生型但不存在於突變型模板，反之亦然。至今，此種鑑別能力已開發出治療性操作基因表現的方法。

No 11 au-Wagener之評論中（24 )比較單點突變的數種檢測方法，其中言及被分析之核酸種類、被檢測之突變機率、進行該項分析之時間與成本、及使用有毒試劑之相關問題。所檢測的每一種方法皆有其缺點。例如，變性梯度凝膠電泳耗費時間，RNA酶A切割法只能檢測約70%之可能突變，而化學切割法涉及使用有毒物質。咸知之限制片段長度多形法（RFLp)為另一種方法，其涉及確認所欲區域有無限制酶作用位置。在極少範例中，因為突變剛好位在天然存在之限制核酸内切酶的辨識/切割位置上，故可檢測出突變（31)。活體外擴大法所用的引子中含有不配對鹼基可導入人為之限制核酸内切酶辨識/切割位置，故增加了可被RFLP 分析的區域數目（32)。業已使用含有不配對鹼基之經修飾引子’在/"as*基因族中關鍵密碼處導入限制核酸内切酶的人為辨識/切割位置（33-35)。業已建立含有不配對鹼基之引子的設計通則，該不配對鹼基係位在接近引子3,端處（36) 〇雖然使用不配對引子擴大了 RFLP分析法的利用性，本紙張尺度通用T國國家標準（CNS ) μ規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 訂線經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227737 五、發明説明（此技術仍^:限於-事實，即最少需要四個祕對以供限酶辨識與切割。發明簡述本發明提供一種檢測對象是否患有疾病之方法，該疾病之特徵在於具有習知核gn個突變，該方法包括下列步驟·（a)由對象分離具有核酸分子的樣品；化）（丨）將經分離樣品中的核酸片段擴大，該片段已知含有該患有疾病之對象的突變’ & (ii)在適合條件下，令所產生的經擴大片奴與觸酶核酸分子接觸，該觸酶核酸分子能特異地辨識與切的序列，該標的相存在於⑴具有已二突變之核酸片段中，或（2)對應之野生型核酸片段中，但此兩種情形不同時存在，其前提是，步驟（ii)可在步驟（i) 之後或同時進行；及（c)檢測步驟（1)) (ii)中的觸酶核酸分子是否切割經擴大片段，藉此決定對象是否患有該疾病。本發明也提供一種檢測對象是否患有疾病之方法，該疾病之特徵在於具有習知核酸的多個突變，該方法包括下列步驟：（a)由對象分離具有核酸分子的樣品；（b) (i) 將經分離樣品中的核酸片段擴大，該片段已知含有該患有疾病之對象的多個突變，及（ii)在適合條件下，令所產生的經擴大片段與多個觸酶核酸分子接觸，每個觸酶核酸分子能特異地辨識與切割標的序列，標的序列存在於（1) 具有已知突變之核酸片段中，或（2)對應之野生型核酸片 -6- 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） f請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} .訂- !227737

;在二但此兩種情形不同時存在’其前提是，步驟(ii) 中^驟⑴之後或同時進行；及（G)檢測步驟⑹⑴) 象，個觸酶核酸分子是否切割經擴大片段，藉此決定該野象疋否患有該疾病。本發明另提供—種檢測對象是否騎疾狀方法，該列=特徵在於具有f知核酸的多個突變，該方法包括下將八M a)由對象分離具有核酸分子的樣品；⑹⑴ 病=樣品中的核酸片段擴大，該片段已知含有該患有疾 2對象的多個突變，及㈤在適合條件下，令所產生 :擴大片段與錢觸_酸分子接觸，每侧酶核酸分此特異地辨識與_標的序列，標的相存在於⑴具有已知突變之-的一個核酸片段中，或⑵對應之野生型 4片&中’但此兩種情形不同時存在，其前提是，步驟可在步驟⑴之後或同時進行；及（c)檢測步驟（b) u)中的各個觸酶核酸分子是否切割經擴大片段（此片段包括其代表之標的序列），藉此決定對象是否患有該疾病0 請先閱面之注意事項

訂

經濟部智慧財產局員工消費合社印製〜本發明提供用於實施本發明診斷方法的套組。本發明之第一套組包括（a)觸酶核酸分子，其特異地辨識與切割標的序列’該標的序列存在於⑴具有突變的核酸片段中’該突變已知為一疾病的特徵，或(ii)對應之野生型核酸片段中，但此兩種情形不同時存在，及⑻核酸試劑，其適用於擴大含有標的序列之核酸片段。

1227737 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（6 ) 本發明之第二套組包括（a) 10-23 DNA酶，該酶特異地辨識與切割標的序列，該標的序列存在於（丨）具有突變的核fee片&中，該突變已知為一疾病的特徵，或（丨丨）對應之野生型核酸片段中，但此兩種情形不同時存在，及（b) DMA引子，其在聚合酶鏈鎖反應條件下，適用於開啟該片段的擴大反應，該引子含有至少一個嘌呤核糖核苷酸殘基’此殘基係作為經擴大片段中被1〇一23 DNA酶辨識與切割之位置的5’端。本發明之弟二套組包括（a)第一 DNA引子，其包括編碼10-23 DNA酶之產酶基因，該10一23 DNA酶特異地辨識與切割標的序列，該標的序列存在於（i)具有突變的核峻片I又中’該突變已知為一疾病的特徵，或（i i)對應之野生型核SiL片段中’但此兩種情形不同時存在，該第一弓j子在聚合酶鏈鎖反應條件下，適用於開啟該片段的擴大反應；及（b)第二DNA引子，其在聚合酶鏈鎖反應條件下，適用於開啟該片段的擴大反應，該第二引子含有至少一個嘌呤核糖核苷酸殘基，此殘基係作為經擴大片段中被1〇、 23 DNA酶辨識與切割之位置的5’端；因此擴大反應後，（i) 所產生的經擴大核酸分子包括10-23 DNA酶，且（ii)鎚擴大核酸片段被該DNA酶辨識且順式切割。發明詳細說明本發明提供使用觸酶核酸檢測對象是否患有疾病之方法，該疾病之特徵在於具有習知核酸的一個或多個突變。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁}

1227737 at B7 五、發明説明（7 ) 這些方法可共同用於預期疾病，其中該疾病的特徵為（i) 單一核酸片段中的單一突變，或（ii)單一核酸片段中的多數突變，或（iii)多數核酸片段中的多數突變。使用核酸擴大法測試各突變的特異切割作用並分析之，本發明方法由是否具有突變而提供“有”或“無”的答案。此答案最後轉而引導出對象是否具有對應疾病之”有”或“無”的答案。詳言之，本發明提供檢測對象是否患有一疾病的方法，該疾病之特徵在於具有已知核酸之一個突變，該方法包括下列步驟：（a)由對象分離具有核酸分子的樣品；（b) (i)將經分離樣品中的核酸片段擴大，該片段已知含有該患有疾病之對象的突變，及（ii)在適合條件下，令所產生的經擴大片段與觸酶核酸分子接觸，該觸酶核酸分子能特異地辨識與切割標的序列，該標的序列存在於（1)具有已知突變之核酸片段中，或（2)對應之野生型核酸片段中，但此兩種情形不同時存在，其前提是，步驟（ii)可在步驟（i)之後或同時進行；及（c)檢測步驟（b) (ii)中的觸酶核酸分子是否切割經擴大片段，藉此決定對象是否患有該疾病。本發明也提供一種檢測對象是否患有疾病之方法，該疾病之特徵在於具有習知核酸的多個突變，該方法包括下列步驟：（a)由對象分離具有核酸分子的樣品；（b) (i) 將經分離樣品中的核酸片段擴大，該片段已知含有該患有 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）請先閱面之注意事項再

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 1227737 五、發明説明（） V 8 ’ 疾病之對象的多個突變，及（Π)在適合條件下，令所產生的經擴大片段與多個觸酶核酸分子接觸，每個觸酶核酸分子能特異地辨識與切割標的序列，標的序列存在於G) 具有已知突變之核酸片段中，或（2)對應之野生型核酸片丰又中’但此兩種情形不同時存在，其前提是，步驟（Η) 可在步驟（i)之後或同時進行；及（c)檢測步驟（b) (ii) 中的各個觸酶核酸分子是否切割經擴大片段，藉此決定該對象是否患有該疾病。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明另提供一種檢測對象是否患有疾病之方法，該疾病之特徵在於具有習知核酸的多個突變，該方法包括下列步驟··（a)由對象分離具有核酸分子的樣品；（b) (i) 將分離樣品中的核酸片段擴大，該片段已知含有該患有疾病之對象的多個突變，及（ii)在適合條件下，令所產生的經擴大片段與多個觸酶核酸分子接觸，每個觸酶核酸分子能特異地辨識與切割標的序列，標的序列存在於（1)具有已知突變之一的一健酸片段中，或⑵對應之野生型核酸片段中，但此兩種情形不同時存在，其前提是，步驟 (11)可在步驟⑴之後或同時進行；及（〇檢測步驟⑹ (11)中的各個觸酶核酸分子是否切割經擴大片段（此片段包括其代表之標的序列），藉此決定對象是否患有該疾病。 ▲本發明可用於料任何對象之麵。本文所用，，對象，，乙詞表示任何動物，包括小白鼠、大鼠、狗、天竺鼠、雪 Μ氏張尺度適财縣（CNS) A. ( Ϊ227737 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明~' - 翁、兔子及靈長類。較佳實施體系中，對象是人類。以、本發明所診斷的疾病可為具有已知核酸之至少一個突 ^為特徵的任何疾病，無此突變則無此疾病。這類疾病是二技術領域熟知的，舉例而言，包括癌症、舰、囊性，、、隹變性、肌肉萎縮症、α卜抗胰蛋自酶缺乏症、苯基闕 Κ、鐮狀細胞型貧血或特質、及許多其他血紅素病變。實體糸之，該疾病係選自癌症、AIDS及囊性纖維變性。六仏貝知體糸中，該疾病是癌症。下文之實驗詳述乙章中，提供特異突變、含彼之標的序列、及診斷這類疾病 (癌症、AIDS及囊性纖維變性）所用之觸酶核酸的許多範例。本文所用觸酶核酸分子”表示能特異地辨識不同受質且切割不同標的核酸序列的DNA分子（此技術領域也稱為“DNA酶，，）、或RNA分子（此技術領域也稱為“核酶 <nb〇zyme)”）。DNA酶及核酶兩者所作用的標的核酸序列可以是DNA或RNA。含有已知疾病特徵之突變殘基（經本發明方法擴大之序列）的核酸序列，可以是DNA或RNA序列。這些突變包括作為範例的單點突變、缺失突變、插入突變、及移碼突變等。每個經擴大核酸片段與觸酶核酸分子皆可以是DNA 或RNA。實施體系之一，經擴大核酸片段是RNA，觸酶核酸分子是DNA或RNA。另一實施體系中，經擴大核酸片段是DNA，觸酶核酸分子是RNA或DNA (25)。 __ -U-_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（21〇χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再^^本頁) |裝- 太訂線· 1227737

習矣本=所用分離與擴大核酸分子的方法是該技術領域 * °詳8之’由對象分離核酸分子樣品之方法包括酚氣仿萃取法、快速溶解法、管柱捕捉法及聚合物捕捉法等 (2〇’ 26 29) °擴大核酸序列之方法包括PCR、LCR、SDA及 ΤΜΑ(也稱作（SSR)) (Μι)。、’擴大核k片段（其含有標的序列）與觸酶核酸分子接並進*完成對標的序列的特異辨識及切制適合條件 unnim的。再者，這類條件在下文實驗詳述乙章中舉例說明。檢測觸酶核酸分子是否切割經擴大核酸片段的方法也疋遠技術領域常用的。這類方法包括聚丙烯_凝膠電泳及毛細管電泳（2〇，30)。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明之較佳實施體系中，（a)擴大反應係使用聚合酶鍵鎖反應進行；（b)觸酶核酸分子是10-23 DNA酶；及（c)聚合酶鏈鎖反應使用DM引子（一種“嵌合型，，引子），該引子適合開啟該片段之擴大反應，且含有至少一個嘌呤核糖核苷酸殘基，其係作為經擴大片段中被1〇一23 DNA酶辨識與切割之位置的5，端。嵌合型引子中的該嘌呤核糖核苷酸殘基是被10-23 DNA酶切割所需的。故使用此嵌合型引子，在PCR反應中可產生1〇—23 DNA酶之切割位置。此嵌合型引子也包括一核糖核苷酸殘基，其係作為被10-23 DNA酶辨識與切割之位置的3,端。此實施體系的形式之一，經擴大片段被該DNA酶辨識 __ -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 11 1227737 五、發明説明（且反式切割。另-形式巾，⑷聚合_鎖反應使用適合開啟該片段之擴大反應的第二DNA引子，該第二引子包括編碼10-23 DNA酶之產酶基因，擴大反應後，所產生的經擴大核酸好含有10-23 _酶；及⑹_大核酸片段被該DNA酶辨識及順式切割。本文所述被DNA酶“順式，，切割表示該腿酶辨識並切割共存於相同經擴大核酸分子上的序列。“反式切割，，表示DNA酶切割位在不同分子上的受質。“產酶基因 (zymogene)’’表示一核酸序列，其包括觸酶核酸分子的反義（互補）序列，且其轉錄產物是觸酶核酸分子本身。本發明也提供用於實施本發明診斷方法的套組。本發明之第一套組包括（a)觸酶核酸分子，其特異地辨識與切割才示的序列，該標的序列存在於（丨）具有突變的核酸片段中，該突變已知為一疾病的特徵，或（ii)對應之野生型核酸片段中，但此兩種情形不同時存在，及（b)核酸試劑’其適用於擴大含有標的序列之核酸片段。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製實施體系之一，該套組包括多個觸酶核酸分子。用於擴大含有標的序列之核酸片段的核酸試劑，舉例而言，可為核S文引子。實施體系之一，套組包括多組這類核酸試劑。詳言之，本發明之第二套組包括（a)10—23 DM酶，該酶特異地辨識與切割標的序列，該標的序列存在於（i)具有突變的核酸片段中，該突變已知為一疾病的特徵，或 --——一 -13- 本紙張尺度適用 —下21〇^^--—-__ 1227737

五、發明説明（ 12 (ii)對應之野生型核酸片段中，但此兩種情形不同時存在’及（b) DNA引子，其在聚合酶鏈鎖反應條件下，適用於開啟該片段的擴大反應，該引子含有至少一個嘌呤核糠核苷酸殘基，此殘基係作為經擴大片段中被10-23 DNA酶辨識與切割之位置的5’端。本發明之第三套組包括（a)第一 DNA引子，其包括編碼10-23 DNA酶之產酶基因，該10-23 DNA酶特異地辨識與切割標的序列，該標的序列存在於（i)具有突變的核酸片段中，該突變已知為一疾病的特徵'或（ii)對應之野生型核酸片段中，但此兩種情形不同時存在，該第一引子在聚合酶鏈鎖反應條件下，適用於開啟該片段的擴大反應；及（b)第二DNA引子，其在聚合酶鏈鎖反應條件下’ 適用於開啟該片段的擴大反應，該第二引子含有至少一個嘌呤核糖核苷酸殘基，此殘基係作為經擴大片段中被10一 23 DNA酶辨識與切割之位置的5’端；因此擴大反應後’（1) 所產生的經擴大核酸分子包括10-23 DNA酶，且（ii)經擴大核酸片段被該DNA酶辨識且順式切割。實施體系之一，本發明套組額外包括一個或多個下列物質：（a)由待診斷對象分離出核酸分子樣品所使用的試劑；（b)用於擴大經分離樣品中存在之核酸片段的試劑’ 該片段已知包括患有該疾病之對象中所見的突變；及（c) 形成觸酶核酸活性之合適反應條件所用的試劑。本發明套組之組份（a)-(c)中的試劑可由商業購得，或可根據該技 -14- ___ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本買) 訂線經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227737 at B7 五、發明説明（13 ) — 術領域已知的方法製備，下文實驗詳述乙章中將舉例說明。本發明套組之組份可為溶液形式或加以適當冷凍乾燥。實施體系之一，本發明套組之組份在相同的隔間内，另一實施體系中，本發明套組之組份在分開不同的隔間内。較佳實施體系中，套組另外包括使用說明。本發明將藉由參照下文之實驗詳述而更加明瞭，但熟悉該技術領域者可輕易明白這些特定之實驗詳述只用於說明本發明，隨後之申請專利範圍將更充分說明之。實驗詳述如下列示之DNA酶及核酶範例係基於10—23 DNA酶 (19) ’且其係設計用來切割如下醫藥上重要之標的物。如下列示之核酶範例係基於榔頭型核酶（12)。 I. DNA 酶

其中 R=嘌呤，A或G Y=嘧啶，C、T或U H=A、T、U、或 C(非 G) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 D=A、T、U、或 G(非 C) B=C、T、U、或 G(非 A) V=A、C 或 G(非 T，非 U) W=T、U、或 A。斜體字=經活體外擴大法而人為導入的鹼基，該擴大法使用的引子含有與標的序列不配對的鹼基。 _；______A5z_____ 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS )八4規格（210X297公釐） 1227737 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（14 ) 粗體字=用於分析之標的驗基或序列。劃底線者=辨識位置（RY/R)。庐經修飾之序列（經引子導引出的人為序列）。 A. 後天性疾病 (1)癌症 (a) K-ras密碼12，位置2—突變型（G變為C、U或A)

5' - GUU GGA GCU GGU GGC GUA GGC - 3T 5* - GUU GGA GCU GYU GGC GUA GGC - 3, 3* - CAA CCT CGA CCG CAT CCG - 5T Α <Γ G G C C A T A A C G A C T 野生型RNA 突變型RNA DNA酶 51 - GUU GGA GCU GAU GGC GUA GGC - 3f 野生型 RNA 3f - CAA CCU CGA CUA CCG CAU CCG - 5f 反義序列

5* - GCC UAC GCC M3C AGC 3' - CGG ATG CGG 一SG TCG A (Γ G G C C A T A A C G A C T

UCC AAC AGG TTG 3·5, 反義序列 DNA酶 I#r1:n^ 一察中曾」 7. (b) 密碼13，位置1—突變型(G變為A、1或C) __-16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1227737 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（15) 5, - GGA GCU GGU GGC GUA GGC AAG - 3

野生型RNA

5，- GGA GCU GGU HGC GUA GGC AAG - 31 突變型 RNA 31 - CCT CGA C^A DCG CAT CCG TTC - 5 DNA 酶 A G G G C A C τ 闕 A A C G A C : ' V| T 小t、| ,.j (c) H-ras密碼61，位置1—突變型（C變為G、U或A)

5 · - ACC GCC GGC CAG GAG GAG

5' - ACC GCC GGC DAG GAG GAG - 31 3' - TGG CGG C^G HTC CTC CTC - 5, A G G G 野生型RNA突變型RNA DNA酶 c C > -~r j ' ‘ A T 丨Φ ; A A i-' ' - y- C G A C 丨皆冗. (d) H-ras密碼61，位置2—突變型（A變為C、G或U) 5f -ACC GCC GGC CAG GAG GAG - 3f 野生型RNA 31 一 UGG CGG CCG GUC GUC cue - 5· f野生型RNA 5f -cue CUG CUG GCC GGC GGU - 31 E野生型MA 31 奢GAG GA A GAC G CGG CCG CCA - 5· DNA酶

G G C C A T A A C G A C T ,,,..>·! : i I (請先閱讀背面之注意事項*|填寫本頁) 17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227737 at B7 五、發明説明（16 ) (e) H-ras密碼61，位置3 —突變型（G變為C或U) (注意：G變為A是一種無作用（silent)突變 5f - ACC GCC GGC CAG GAG GAG - 3'

野生型RNA 5· - ACC GCC GGC CAY GAG GAG - 3' 3e - UGG CGG CCG GOR CUC CUC - 51 突變型RNA 反義序列

5· - CUC CUC RUG GCC GGC GGU - 3f 反義序歹丨J 3' - GAG GAG **AC CGG CCG CCA - 51 DNA 酶 A G G G

A

C C T A A C G A C T (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1' (f) N-ras密碼61，位置1—突變型（C變為A、G或U) 5·

GCU GGA CAA

GAG 3,

野生型RNA 蔡專突變型RNA E野生型· 5，- GCU GGA DAA GAA GAG - 3f c: 31 - CGA CCU HUG CUU CUC - 5 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

5· - CUC UUC GUH UCC AGC 3· · GAG AAG ~AD AGG TCG A G G G C ' C A T A A C G A C T 3, 5! E野生型RNA DNA酶 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 1227737 at B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

1227737 A7 B7 五、發明説明（ 18 (c)密碼215-突變型（C變為U或A) - AGG UGG GGA UUU ACC ACA CCA GAC - 31 野生型腿 •突變型RNA 5f - AGG UGG GGA UUU AUC ACA CCA GAC - 5f 麗 _ 3* _ TCC ACC CCT A?U\ ~G TGT GGT CTG - 31 A G _ . G G 蒂 K: C C Λ -. - -. A T 广< ί A A Λ ,』 ; — C G A C T ' '

5f - AGG UGG GGA UUU J\AC ACA CCA GAC - 5' 突轡型腿 3% - TCC ACC CCT AAA T一5 TGT GGT CTG - 31 A g 酶 G G C C A T A A C G A C T (d)密碼74-突變型（U變為G，提供ddT抗性） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂線經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5, -AAA UGG AGA AAA UUA GUA GAU - • 3f 野生型RNA 5, -AAA UGG AGA AAA GUA GUA GAU _ 3, 突變型腿 3f -TTT ACC TCT TTT "^T CAT CTA : 3* IM酶 B. 先天彳生疾病

A G G G C C

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C G A C T -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227737 A7 B7 五、發明説明（ 19 (1)囊性纖維變性 (a)密碼542-野生型 51 - UAGUUCUUGGAGAAGGU - 3， 51 - UAGUUC翌GGAGAAGGU，3· 3* - atcaag""Xcctcttcca - 5' A —G G G C C A T A A C G ; A C F T少野生型RNA E突變型RNA IM酶 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 密碼542-突變型（G變為U) 51 -UAGUUCUUUGAG7VAGGU - 3' 突變型腿 5,-3，_ -XJAGUUCGUUGAGAAGGU --ATCAAG^AACTCTTCCA - 3， 5· Ε突變型RNA A IS DNA酶訂

G G C C

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A C T (b)密碼551-野生型

G G C C

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A C T _-21- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) 線_ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5, -GAGUGGAGGUCAACGAG - 3- & 野生型臟 3' -CUCACCUCCAGUUGCUC - 5* 反義序列 5f -CUCGUUGACCUCCACUC - 3· 反義序列 DNA酶 3f —GAGCAAC GGAGGTGAG * A G 5' 1227737 A7 B7五、發明説明（2())密碼551-突變型（G變為A) 5 353

-GAGUGGAGAUCAACGAG - 3f -cucaccucuKguugcuc - 51 -CUCGUUGAUCUCCACUC - 3f - GAGCAAC^AGAGGTGAG - 51 A G G G C C A T A A C G A C T 突變型RNA 反義序列反義序列 DNA酶 (c)密碼508-野生型 5f - GAAAUAUCAUCUUUGGUGUUU - 3' 3· - CTTTATAG^GAAACCACAAA - 5' A G G G C C A T A A C G A C Έ T 「;r’二野生型臟 DNA酶密碼508-突變型（刪除CTT) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

5， - AAAUAUCAUUGGUGUUU 3· - TTTATAG^ACCACAAA A G G G C C A T A A C G A C T 5f 31 突變型RNA DNA酶 -22- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 1227737 at B7 五、發明説明（ 21 (2) al-抗騰蛋白酶密碼342-突變型（G變為A) 5，- GACCAUCGACGAGAAAGG 3,

野生型RNA 5e - GACCAUCGACAAGAAAGG - 3f 3f - CTGGTAGC GTTCTTTCC - 5f 大艾土

A G G G C C A T A A C G A C T DNA酶 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) II.核酶丨v : - 广，，二；其中粗體字=分析用之標的驗基劃底線者=辨識位置（UH) A. 後天彳生疾病 (1)癌症密碼12，位置1 一突變型（G變為A、C或U) 5' - GUA GUU GGA GCU GGU GGC GUA - 3f 野生型腿經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5· 3,

GUA GUU GGA GCU HGU GGC GUA - 31 CAU CAA CCU CGA ~CA CCG CAU - 5» A C A U GAG C GGA A U U G C G C A G G U 突變型RNA 核酶 η ϊ -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) 1227737 at B7 五、發明説明（) 22 K-ms密碼12，位置2—突變型（G變為U) 5· — GUU GGA GCU GGU GGC GUA GGC- 31

野生型RNA

5f · GUU GGA 31 - CAA CCU

Gc A CGG U G c J G gccuagucc u aagcaggag CUGA G c GGC- CCG- 3' 5f 突變型RNA 核酶 I察襄! (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (2) HIV 1-ΑΠ 抗性 (a)密碼41-突變型（A變為U或C)

、1T 5, -UGU ACA GAA AUG GAA AAG - 3f 5· 3· 5, 3· UGU ACA GAA YUG GAA AAG -ACA UGU CUU RAC CUU UUC -

CUU UUC GAA AAG CAR UUC GUY JTg UGU ACA -ACA UGU - 3 5 3 5 野生型腿突變型RNA 反義序列反義序列核酶 -線經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

A C A U GAG C G G A A U U G C G C A G G U

-八」 (b)密碼70-突變型（A變為G) -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1227737 at B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（ 23 5, 5' 3, 5f GAC AGU ACU AAA UGG AGA AAA - 3· GAC AGU ACU AGA UGG AGA AAA - υσυ - 3r CUG UCA UGA UCU ACC UCU 5, UUU AAA UCU CCA UCU AGU ACU GUC - 3· AGA GGU AGA 一 CA UGA CAG - 5f A C A U G A G C G G A A U U G C G C A G G U l:r n 野生型RNA突變型RNA 反義序列反義序列核酶 (c)密碼215-突變型（C變為U或A)

5，一 AGG UGG GGA UUU ACC ACA CCA GAC - 3T 野生型 5_ -AGG UGG GGA UUU AWC ACA CCA GAC - 31 突變型RNA 3f . -UCC ACC ecu AAA UWG UGU GGU CUG - • 5f 反義序列 5f -GUC UGG UGU GWU ΆΆΑ UCC CCA ecu - • 31 反義序列 3· -CAG ACC ACA CWA A 一 UU C AGG GGU GGA - 5· 核酶 A U G A G C G G A A U U 一 G C G C A G G U (d)密碼74-突變型（U變為G ，提供ddT抗性） -25-

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1227737 at B7 五、發明説明（24 ) 5* - AAA UGG AGA AAA UUA GUA GAU - 31 野生型腿 5 3

AAA UUU

UGG ACC

AUA UAA GXdAAG CAG G」G A A 3, 突變型RNA 5, 核酶 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) B. 先天彳生疾病 (1)囊性纖維變性 (a)密碼542-野生型

Sf 31 -UAGUUCUUGGAGAAGGUGGA - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

-AUCAAGA CCUCUUCCACCU A C A U GAG C G G A A U U G C G C A G G U 3· 5f 野生型RNA 核酶 X ( ;Ή.!_ -線密碼542-突變型（G變為U) -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1227737 A7 B7 五、發明説明（ 25

5f - UAGUUCUUUGAGAAGGU 3，- aucaaga"acucuucca A C A U G A G C G G A A U U G C G C A G G U 51 3f 突變型臟核酶丨賴 (b)密碼551-野生型 -------1 51 - GAGUGGAGGUCAA.CGAG - 3'

野生型RNA t 3 c

Be A G u c c ( u :AAAGCAGGkG CCA u、 σ 5 酶

A G ϋ u G

G 密碼551-突變型（G變為A) 訂線經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

5· - GAGUGGAGAUCAACGAG · 3f - CUCACCUCUA^UUGCUC 一 A C A U GAG C G G A A U U G C G C A G G U 3 5 突變型RNA 核酶 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 1227737 A7 B7五、發明説明（26 )(c)密碼508-野生墊野生型RNA 核酶

5· - GAPAUAUCAUCUUUGGUGUUU - 3' 3· - CUUUAUAGUAGA ACCACAAA - 51 A C A U GAG C G G A A U U G C G C A G G U 或密碼508-突變型（刪除CUU) 5 3

-GAAAUAUCAUUGGUGUUU - 3· 突變型腿 -cuuuauagua"ccacaaa - 5' 核酶 AC A U GAG C G G A A U U G C G C ___ a g G U 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (2) /3— 血球蛋白/3+ -黑（聚A訊號）-突變型（U變為C) -28-

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 1227737 Λ7 B7 五、發明説明（27 ) 5f 一 UCUGCCUAAUAAAAAACAU - 31 野生型腿

5, _ UCUGCCUAACAAAAAA 3' - AGACGGAUUGUUUUUU

3 5 I 錢 WJA A U c G 突變型RNA 反義序列

5' - AUGUUUUUUGUIJAGGCAGA 一 3· 31 - UACAAAAAACA~UCCGUCU - 5' A C A U GAG C G G A A U U G C G C A G G U 反義序列核酶 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

....* J.V '· 、1· III.使用核酶之K-/*a5·分析 A. 對準K-ras密碼12之突變的核酶密碼12之人K-ras基因序列是GGT。與胰臟癌、肺癌及大腸癌有關之單點突變經常見於該序列的前兩個鹼基。設計兩個核酶切割突變型，但不切割野生型K-ras。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

K-ras 5，…· AGUUGGAGCUHGUGGCGUAGG 核酶 I 3f ucaaccucgaT CACCGCAUCC A C A U GAG

C G G A A U U G C G C A G G U 3 5 蔡 (K-ras密碼12-粗體字；核酶標的雙核苷酸-劃底線者) -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1227737 A7 ---- B7 五經濟部智慧財產局員工消費合作社印製發明説明（28 ) 上述核酶I係設計來切割位在密碼12第1個位置有單點突變的所有RNA分子，但此設計不會切割野生型序列。核酶所作用的標的序列是UH，其中Η可以是C、U或 A ’但不是g。由於野生型序列中該位置是G，故該核酶將切割所有突變。

K-ras 核酶II

•UUGGAGCUGUUGGCGUAGGCA · AACCUCGACA* CCGCAUCCGU

GAG C G G A 專,

Iri

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G (K-ras密碼12之突變型對偶基因-粗體字；核酶標的雙核苷酸-劃底線者）上述核酶II係設計來找出密碼12第2個位置有G 變為U之取代作用。野生型序列之G不能與核酶雜交臂中第1位置的A鹼基配對，因此不預期野生型序列會被此核酶切割。編碼核I及II之DNA序列係由Marcomolecular Resources (Fort Collins, CO)合成。粘合核酶之反義股與有意義股並將其殖入載體pSP70 (Promega公司， Madison，WI)，殖入位置在T7聚合酶啟動子之後。藉由 Nde I切割核酶之3’位置，將這些純系直線化，純化之。 -30- 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐）訂線 1227737 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（29 ) 製備放射標記之核酶係根據標準活體外RNA轉錄反應，其利用這些模板將[α -32P] UTP併入（20)。 Β· 備 K-ras 模板人細胞株SW480及Calu I得自美國菌種保存中心 (Rockville, MD)。大腸肉瘤細胞株SW480在密石馬 12之第2位置具有同種接合突變（GTT)。Cain 1是一種肺肉瘤細胞株，其在K-ras密碼12之第1位置具有異種接合，同時具有野生型（GGT)與突變型（TGT)對偶基因。利用PCR擴大Calu 1及SW480 DNA，以及擴大含有嵌入物之pUC質體純系，製備K-ras DNA模板（密碼12之4種突變型及1種野生型），該嵌入物在密碼12 處有突變。5’ PCR引子的序列為 TGGACTTAATACGACTCACTATAGGGCGACTGAATATAAACTTGTGGTAG 。此5’引子將T7啟動子併入5’端。3,引子之序列為 CCTCTATTGTTGGATCATATTCG。製備放射標記之 k—ms RNA 模板係藉由使用T7/K-rasPCR產物之標準活體外RNA轉錄反應，將[a」2P] UTP併入（20)。 C.檢測單點突變活體外切割實驗進行如下。令4 : 1莫耳比之核酶與受質於切割緩衝液（10 mM MgCL· ; 250mM Tris. Cl，pH 7· 5)中靜置反應。為了達到活體外切割活性，令核酶I與 II與放射標記之K-rasRNA模板於50°C靜置反應6小時。分析反應結果係根據聚丙烯醯胺凝膠電泳。核酶I成 ___-31：___^__ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' 广请先閲#背韵年江意事項真本貢) 丨隊.

、1T 線丄227737

請先閲面之線意事項

訂 I227737 at Β7 五、發明説明（ 31 U)作用在K-ras密碼12突變H)NA酶；天然 (a)策略使用5’ DNA/RNA嵌合型引子（5K42r)與3’引子（3Κ2) 之PCR，擴大了 K-ras基因的一區域。5K42r雜交至鄰接密碼12之Κ-ras序列，且其含有形成DM酶之預期切割位置的17票呤：σ密咬殘基。欲合型引子與K-ras1序列完全互補，故提供10-23 DNA酶之天然切割位置。利用DNA 酶將5K42r之3’端延伸，擴大了 K-ras基因的密碼12。 DNA酶，Dzl，係設計來切割K-ras密碼12具有野生型序列的擴大物。此DNA酶的5’端與野生型密碼12之序列完全互補。K-ras密碼12之突變導致與DNA酶之5, 雜交臂不配對，預測DNA酶切割效力將明顯降低。 lb)引子與DNA酶之序列 TGAACACCATCAACCT GACCACCG 5e TATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAA 3# K~ras TATAAACTTGTGGTAGTTGGAgcT^T7" “5K42f ’引子職酶經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製

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C G A T C 赛il ίψ' Ί： das野生型序列的密碼12是劃底線者，引子5K42f 的核糖核苷酸鹼基以小寫字母表示）。另一個PCR引子，3K2，係設計來與5K42r —起擴大 -33· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 1227737 五、發明説明（32 ) 生產82個鹼基對之擴大物。3K2之序列為： 5，CGTCCACAAAATGATTCTGA3’ “3K2”弓|+ 由 Pacific Oligos Pty·股份有限公司（Lism〇re， NSW，澳洲）或 Oligos Etc·公司（Wilsonville，〇R，美國）合成引子及DNA酶。修飾DNA酶（Dzl)係藉由添加3, 填酸基，以防止DNA聚合酶將其延伸。5，引子

(5K42r)之5,端被r -32P標記，此係將25//1之20//M 引子與2·5// 1聚核苷酸激酶（l〇x 1〇3 U/ml，無3，鱗酸酶，Boehringer Mannheim 麻），2.5//1 RNasin (40 U/ "I重組型RNasin恣A核糖核酸酶抑制劑，promega 廠），5# 1聚核苷酸激酶緩衝液（Boehringer Mannheim 廠），10//之 r -32P 腺苷 5’-三磷酸（2.5/zM，Stable Label Gold TM，Bresatec 廠）及 5// 1 之 DEPC 水於 37°C靜置反應30分鐘。 (c)製備K-ras模板經濟部智慧財產局員工消費合作社印製使用PUC18質體載體作為進行PCR之DNA模板，該載體包括K-ras表現序列1，此序列之密碼12為野生型 (GGT)或突變型（CGT或AGT)。 ⑷測定單點突》

PCR混合液含有下列物質：〇·2 pg/μ 1質體DNA、10 pmole 經 7 -32ρ 標記之 5K42r、 2 pmole 3K2、 ImM DTT、8 mM MgCh、各為 100//M 之各種 dNTP (dATP、 dCTP、dTTP、dGTP)、0· 4 U//z 1 RNasin ® 及 1 x 緩衝液 ______-34-— 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公^ ~~ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227737 Α7 Β7 五、發明説明（） 33 (100 mM NaCl 與 50 mM Tris，ΡΗ8·3，25°C)。建立使用 0.5//M Dzl之兩組相同反應組，並建立不使用dz1之一組反應作為對照反應。令6單位DNA聚合酶（5 U//z 1

AmpliTaq，Perkin-Elmer 廠）與 TaqStart TM (Clontech 廠）混合，得DNA聚合酶·· TaqStart tm抗體之終莫耳比為1 : 5。添加至PCR混合液之前，令DNA聚合酶：TaqStart TM抗體混合液於室溫靜置反應15分鐘。總反應體積為50//1。將反應混合物置入GeneAmp pcR 96〇〇 (Perkin-Elmer廠），於94°C變性2分鐘，然後進行15 次循環之下列步驟：60°C歷1分鐘，然後94°C歷20 秒。反應繼續進行25次循環之下列步驟：4〇°C歷1分鐘，然後94°C歷20秒。將2.5//1等份之各種反應混合物與2·5/ζ1裝填染料（97.5%甲醯胺、〇.1%；^1如6(^抓〇1、〇1%溴苯酚藍及0· 01Μ之EDTA)混合，於75°C靜置反應2分鐘，然後立刻填入經過預溫之16%變性（尿素）丙稀醯胺凝膠上。令該凝膠進行電泳約1小時。利用分子動態磷光顯像儀 445 S1掃描凝膠而檢視pcr產物及切割片段。、、凝4^1冕到數條顯逆帶（數據未顯示）。依照最慢至最快之移動性順序（由起點至凝膠底部），這些片段為（a) PCR擴大物（呈雙帶形式移動）、（b)未被併入的引子、及 (C)經切割之PCR擴大物。由5’引子之核糖核苷酸殘基背景水解所產生少量的兩個片段也可見到，其在引子與經切 —~…----- -35· 本紙張尺度通用T國國豕標準（CNS )八4^格（21〇><297公釐）

1227737 A7 B7 五、發明説明（ 34 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製割擴大物之間移動且與經切割擴大物平行移動。所有反應皆可見到PCR產物與未被併人之引子。反應結果含有經切割之擴大物者，其反應混合物中含有密碼12是野生型（與 DNA酶完全互補）之模板DNA。反應結果不含有經切割之擴大物者，其反應混合物中含有密碼12經過突變（與DM酶不配對）之模板DNA。這些反應結果在凝膠上該處只有少量背景水解產物可被觀察到。⑵作用Has密碼12突變之〇皿^^_^^!3^ ί(a) 策略使用5’ DNA/RNA嵌合型引子（5K44r)與3,引子（3K2) 之PCR ’擴大了 K-基因的一區域。5Κ44γ雜交至鄰接密碼12之K-ras序列，且其含有形成DNA酶之預期切割位置的嘌呤：嘧啶殘基。5K44r中的該嘌呤核糖核苷酸與 K-ras模板（其中野生型序列在該位置具有一個嘧啶）不配對。故此引子誘生了 DM酶切割位置。利用DNA酶將 5K44r之3’端延伸，擴大了 K-ras基因的密碼12。DNA 酶，Dz3，係設計來切割K-ras密碼12具有野生型序列的擴大物。K-ras密碼12之突變導致與DNA酶之5，雜交臂不配對，預測DNA酶切割效力將明顯降低。 (b) 引子與DM醮之序列 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 *- - - ! 1227737 A7 B7 35 五、發明説明（ 3 5# TATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAA 3rK~ras 5r TATAAACTTGTGGTAGTTGGAGguT7* 6ΏΚ44τ^Ι; GAACACCATCAACCTC ACCACCGC 5, 丁

AG G G C C Η

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C G

A T C (K - ras野生型序列的密碼12是劃底線者，引子5K44r 的核糖核苷酸鹼基以小寫字母表示。引子5K44r之核糖核苷酸“g”與K-ras序列不配對。）另一個PCR引子，3K2，係設計來與5K44r —起擴大生產82個驗基對之擴大物。3K2之序列為： 59 CGTCC AC AAAATG ATTCTGA35 “3K2” 引子經濟部智慧財產局員工消費合作社印製由 Pacific 01 igos Pty·股份有限公司（Lismore， NSW，澳洲）或 Oligos Etc·公司（Wilsonville, 0R，美國）合成引子及DNA酶。修飾DNA酶（Dz3)係藉由添加3, 填酸基，以防止DNA聚合酶將其延伸。5，引子 (5K44r)之5’端被r」2P標記，此係將25//1之20/zM 引子與2· 5// 1聚核苷酸激酶（ι〇χ i〇3 u/ml，無3，鱗酸酶，Boehringer Mannheim 廠），2.5//1 RNasin (40 U/ //1重組型RNasin恣A核糖核酸酶抑制劑，Pr〇mega 廠）’ 5//1聚核苷酸激酶緩衝液（B〇ehringer Mannheim 廠），l〇# 之 r -32P 腺苷 5，-三磷酸（2. 5//Μ，Stable Label 化Λ/ μ，Bresatec 廠）及 5//1 之 DEPC 水於 —_ -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4^格（210X297公餐） A7 B7 36 1227737 五、發明説明（ 37°C靜置反應30分鐘。 (c)製備K-ras模板使用pUC18質體載體作為進行pCR之DNA模板，該載體包括K-ras表現序列1，此序列之密碼12為野生型 (GGT)或突變型（CGT )。 ⑷測定單點突變

PCR混合液含有下列物質：〇 2pg///丨質體DM、1〇 pmole 經 r —32P 標記之 5K44r、 2 pmole 3K2、 ImM DTT、8 mM MgCl2、各為 100 " m 之各種 dNTP (dATP、 dCTP、dTTP、dGTP)、0.4 U/α i RNasin ⑧及丨 χ 緩衝液（100 mM NaCl 與 50 mM Tris，pH8. 3，25°C)。建立使用0.5//M Dz3之兩組相同反應組，並建立不使用ο” 之一組反應作為對照反應。令6單位dna聚合酶（5 U//z 1 AmpliTaq， Perkin〜Elmer 廠）與 TaqStart τΜ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (Clontech廠）混合，得DNA聚合酶：ΤΜ 抗體之終莫耳比為1 : 5。添加至PCR混合液之前，令 DNA聚合酶：TaqStart TM抗體混合液於室溫靜置反應15 分鐘。總反應體積為50/z 1。將反應混合物置入以此八师 PCR 9600 (Perkin-Elmer 廠），於 94。(：變性 2 分鐘，然後進行30次循環之下列步驟：60°C歷〗八@ 从、a α ί分鐘，然後 94°C歷20秒。反應繼續進行1〇次循環之下列步驟训 °C歷1分鐘，然後94°C歷20秒。將2·5//1等份之各種反應混合物與2 ^ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1227737 A7 B7 五、發明説明（。） ~" "~ 37 7 料（97.5%甲醯胺、0.1%乂乂16此〇7&11〇1、0.1%溴苯酴藍及0· 01M之EDTA)混合，於75°C靜置反應2分鐘，然後立刻填入經過預溫之16%變性（尿素）丙烯醯胺凝膠上。令該凝膠進行電泳約1小時。利用分子動態磷光顯像儀 445 S1掃描凝膠而檢視PCR產物及切割片段。凝膠上可見到數條顯像帶（數據未顯示）。依照最慢至最快之移動性順序（由起點至凝膠底部），這些片段為（a) PCR擴大物（呈雙帶形式移動）、（b)未被併入的引子、及 (c)經切割之PCR擴大物。由5’引子中核糖核苷酸鍵背景水解所產生少量的兩個片段也可見到，其與經切割擴大物平行移動。全部反應中皆可見到PCR產物與未被併入之引子。反應結果含有經切割之擴大物者，其反應混合物中含有密碼12是野生型（與DNA酶完全互補）之模板DNA。反應結果不含有經切割之擴大物者，其反應混合物中含有密碼12經過突變（與DNA酶不配對）之模板DNA。這些反應結果在凝膠上該處只有少量背景水解產物可被觀察到。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (3) jjF用在K-ras密碼12突變之DNA酶；順式方式之切割反應也可使用PCR反應過程中合成的活性DNA酶，切割自嵌合型引子所生產的擴大物。這類反應的一個實例中， DNA酶以順式方式切割受質。 (a)策略使用5’ DNA/RNA嵌合型引子（5Κ42〇與3,產酶基因 _____-39- _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21^<297公楚) 五經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227737 at ___B7 發明説明（w) ό ο 引子（3K42Dz2)之PCR，擴大了 κ—基因的一區域。 5Κ42γ雜交至鄰接岔碼12之K-/as序列，且其含有形成 DMA酶之預期切割位置的嘌呤：嘧啶殘基。產酶基因引子 (3K42Dz2)具有與K-r批互補之3,區，以及包括DNA酶反義序列的5,區。產酶基因引子本身並不具有觸酶活性，但當其與5K42r合併使用時，有助於生產擴大物，此擴大物在接近其5端處具有DNA酶切割位置，且在其3,端旦有活性（有意義）MA酶。該DNA酶係設計來順式切割擴大物之5’端。此DNA酶5’臂與密碼12為野生型之序列完全互補。K-ras密碼12之突變導致與DNA酶之5,臂不配對，預測DNA酶切割效力將明顯降低。 (b)引子序列 5’嵌合型引子5K42r (大寫字體-去氧核糖核苷酸殘基；小寫字體—核糠核苷酸殘基） 55 TATAAACTTGTGGTAGTTGGAgcT 35 3’產酶基因引子3K42Dz2 (與10 : 23觸酶核心互補（反義）之序列以粗體字表示）

5 ’ ACTTGTGGTAGTTGGATCGTTGTAGCTAGCCCTGG TGGCAGCTGTATCGTCAAGGCACTC 3’ -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂線- 39 1227737 A7 B7 五、發明説明（由 Pacific Oligos Pty·股份有限公司（Lism〇re， NSW，澳洲）或 OligosEtc·公司（Wils〇nville，〇R，美國）合成引子。5’引子（5K42r)之5,端被r標記，此係將25//1之20//M引子與2·5//1聚核苷酸激酶 (10χ 10 U/ml，無 3 私酸酶，B〇ehringer Mannheim 廠），2.5/zlRNasin(40U/#l 重組型 RNasiri 恣 a 核糖核酸酶抑制劑，Promega廠），丨聚核苷酸激酶緩衝液 (Boehringer Mannheim 廠），10//! 了 —32p 腺苷已，_三構酉夂（2.5//M’ Stable Label Bresatec 薇）及 5 //1之DEPC水於37°C靜置反應3〇分鐘。 (c)製備K-ras DNA模板使用pUC18質體載體作為進行ρα之j)NA模板，該載體包括K-ras1表現序列1，此序列之密碼12為野生型 (GGT)或突變型（CGT或AGT)。 ⑷PCR反應中合成之DNA酶的順式切割作用 PCR混合液含有下列物質·· 〇· 2 pg/ // 1 K-r狀質體 ΜΑ、10 pmole 經 r —32P 標記之 5K42r、2 pmole 3K42Dz2、ImM DTT、8 mM MgCl2、各為 i〇〇"m 之各種 dNTP (dATP、dCTP、dTTP、dGTP)、0· 4 U//z 1 RNasin ® 及 1 x 緩衝液（100 mM NaCl 與 50 mM Tris，ρΗ8·3，25°C)。對每種DNA模板建立兩組相同反應組。令6單位DNA 聚合酶（5 U/ // 1 AmpliTaq，Perkin-Elmer 廠）與 TaqStart TM (Clontech 廠）混合，得 /邱 DNA 聚合酶： -41- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填頁) r 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227737 五、發明説明（

TaqStart抗體之終莫耳比為丨：5。添加至卿混合液之1令細DNA聚合酶：TaqStart TM抗體混合液於室靜置反應15分鐘。總反應體積為5〇# 1。將反應混合 $ 置入 GeneAmp PCR 9600 (Perkin〜Elmer 廠），.於 9代變丨生2分鐘，然後進行3〇次循環之下列步驟：⑼。c歷 1刀鐘，然後94 C歷20秒。反應繼續進行1〇次循環之下列步驟：50C歷1分鐘，然後94它歷2〇秒。、將2·5#1等份之各種反應混合物與2·5//1裝填染 0.1% xylene cyanol > 〇. 1% 及〇·〇1Μ之腿）混合，於75。〇靜置反應2分鐘然後 =刻填入經過預溫之16%變性（尿素）丙烯醯胺凝膠上。 7該凝膠進行電泳約丨小時。利用分子動態縣顯像儀 445幻掃描凝膠而檢視PCR產物及切割片段。凝膠上可見到數條顯像帶（數據未顯示）。依照最慢至取快之移動性順序（由起點至凝膠底部），這些片段為（a) PCR擴大物（呈帶形式移動未被併入的引子、及（c) I切割之PCR擴大物。由5’引子中核糖核苷酸殘基背景水解所產生少量的兩個片段也可見到，其在引子與經切割之擴大物之間移動，且與經切割擴大物平行移動。全部反應中皆可見到PCR產物與未被併入之引子。反應結果含有經切割之擴大物者，其反應混合物中含有密碼12是野生型 (與DNA酶完全互補）之模板DNA。反應結果不含有經切割之擴大物者，其反應混合物中含有密碼12經過突變（與 -42- 本紙張尺度通用T囤囤豕標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -線經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227737 - 五、發明説明（41 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 c c

T A

C f專 DNA酶不配對）之模板DNA。這些反應結果在凝膠上該處只有少量背景水解產物可被觀察到。如下所示序列是一擴大物，其密碼12之第1位置是野生型（劃底線者），此構型中所示之DNA酶（粗體字者）以順式雜交。 TATAAACTTGTGGTAGTTGGAgcTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGC 3f TGAACACCATCAPlCCT gaccaccgtcgacatagcagtt A 6 c

A

G

A V.結論本發明之診斷方法具有優點。觸酶核酸僅需要特異序列中兩個鹼基對如此少之鹼基對，即可產生一個切割位置。自然發生之觸酶核酸二核苷酸切割位置比限制酶切割位置更常發生。再者，以先前使用不配對引子而誘生人為限制酶切割位置的相同方法，可使用不配董士引子誘生觸酶核酸之切割位置。切割位置僅需要兩個核苷酸序列之觸酶核酸實例有榔頭型核酶及10—23 DNA酶。這兩種分子也需要雜交區域 (臂）與被切割之分子之間有互補性。然而這些區域可製成對“的有特異性。儘管觸酶核酸分子僅能切割單股之核酸模板，然而產製合適單股模板的方法是該技術領域熟知 _____— _-43- 一本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

421227737 、發明説明（ ^ °舉例而言’單股RNA模板可根據諸如TMA之類的方法製侍’單股DNA可根據不對稱PCR (37)或將雙股產物予以變性而製得。本發明方法提供一種用於序列分析的新穎工具，其比刀析法更具彈性。核酸擴大法與觸酶核酸切割法的組合克服了使用限制酶分析的限制。本發明中，將切割所舄之表序列降低了。再者，因為觸酶核酸一定要與雜交區域互補，在二核苷酸切割位置兩側的這些雜交區域也會衫％切割效力。因此，被一種觸酶核酸掃描之序列長度可比使用單一限制酶掃描之序列長度更長。使用觸酶核酸的序列分析法也有優於其他方法的優點，因為其不需要蛋白質酶類（例如限制酶或RNAaseA)或毒性化合物。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •έ· 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製用適度尺 I張 -紙本準標 I家 I釐 9 2 1227737 五、發明説明（）參考資料 1· Mullis, Κ·Β·, U-S. Patent No. A, 683,202. 5 2. Arnheim, Ν·, et al. / u.s. Patent No. 4,683,195. 3. Arnheim, et a.s. Patent No. 4,000,159. 10 4· Ehrlich H·A·, et al·, U-S· Patent No· 4,965,188· 5. Ehrlich Η·Α·, et al.r U.S. Patent No. 5,176,995· 6, JE\F. Chehab, et al· (1987) Nature 329:293-294. 15 7· R.K· Saiki, et al· (1985) Science 230:1350-1354. 8. Barany, F. (1991) Proc. Natl. Acad. 5ci· 88:189-193. 20 9· Walker, G.T./ et al- (1992) Nucleic Acids Res. 20:1691· 10. Jonas, V. # et al· (1993) Journal of Clinical 25 Microbiology 31:2410-2416· 11. Fahy, E·, et al· (1991) PCR Methods Άρρΐ 1: 25-33. 12. Haseloff, J· and Gerlach, W.L. (1988) Nature 30 334:585-591. 13· Breaker, R.R. and Joyce, G· (1994) Chemistry and

Biology 1:223-229. 35 14. Koizumi, M·, et al, (1989) Nucleic Acids Research 17:7059-7069. -45.- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇 x297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填- ~^-- 頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -----1T---^-Ih-^!-----1---- A7 B7 1227737 五、發明説明（ 15. E. Otsuka and M. Koizurai, Japanese Patent No. 4,235,919· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 5 16· Kashani-Sabet/ M·, et al. (1992) Antisense Research and Development 2:3-15. 17. Raillard, S.A. and Joyce, G.F. (1996) Biochemistry 35:11693-11701. 10 18· Carmi, N., et al. (1996) Chemistry and Biology 3:1039-1046. 19. Santoro, S^W· and Joycer G· (1997) PNAS 94:4262- 15 4266· 20. Promega Protocols and Applications Guide. Titus, D.E· (Ed), Promega Corporation (1991). 20 21· Watson/ J,D·f Tooze, J, and Kurtz, D.T. (1983)

Keecwnibinant DMA: A shdt Course· Scientific American Books, New York. 22. Antonarakis/ S.E. (1989) New England Journal of 25 Medicine 320:153-163. 23· Perriman, R· and Gerlach/ W.L. (1992) Gene 113:157-163. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 30 24· Nollau-Wagener, P. (1997) Clinical Chemistry 43: 1114一1128· 2S- Carmi, N·, et al. (1996) Ciiemi5try and Biology 3:1039-1046. 35 -46.- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4g ( 210X 297公釐） 1227737 A7 B7 五、發明説明（ 26· Kraiavis, A. · et al· (1996) Journal of Clinical Microbiology 34: 2731-2733. 27· Yong, S-L··, Thomas, R·J,S. and Phillips, W.A. 5 (1995) Nvcleic Acids Research 23:1640· 28· Sambrookf J.r Fritsch/ E.F. and ManiatiS/ T, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed-, New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press. 10 15 29. Backus, J.W·, et al·, U.S. Patent No· 5,582,988· 30. Wei, L·, Dai-Shu, H., Juf Y· and Andrieu, J，M· (1994) Nature 368; 269-271. 31· Bradley, S.H., et al.； PCT International Publication No. WO B4/01389- 32. · Cohen, J,B· and Levinson, A.D· (1988) Nature 20 334:119-124· 33· Kumar, R. and Barbacid, M. (1988) Oncogene 3:647-651. 25 34· Todd, A.V. f et al· (1991) Leukemia 5:160· 35. Levi, S·, et al, (1991) Cancer Res. 6:1079· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 36· Kwok, S., et al. (1990) Nucleic Acids Research 30 18:999-1005. 37. Gyllensten, U. B. and Erlich, H.A. (1988) PNAS 95:7652-7656. 35 38· Walder, R-Y·, et al. (1993) Nucleic Acid Research 21(18):4339-4343. -47.- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims

、申請專利範圍 1227737 種仏測對象是否患有疾病之方法，該疾病之特徵在於具有習知核酸的-個突變，該方法包括下列步驟： (a)由對象分離具有核酸分子的樣品； ⑻（i)將分離樣品中的核酸片段擴大，該片段已知含有該患有疾病之對象的突變，及(ii)在適合條件下， 7所產生的經擴大片段與觸酶核酸分子接觸，該觸酶核酸分子能特異地辨識與切割標的序列，該標的序列存在於（1)具有已知突變之核酸片段中，或(2) 對應之野生型核酸片段中，但此兩種情形不同時存在，其前提是，步驟（ii)可在步驟（i)之後或同時進行；及 (c)檢測步驟(b) (ii)中的觸酶核酸分子是否切割經擴大片段’藉此決定該對象是否患有該疾病。 2· —種檢測對象是否患有疾病之方法，該疾病特徵在於具有習知核酸的多個突變，該方法包括下列步驟： (a) 由對象分離具有核酸分子的樣品； (b) ⑴將分離樣品中的核酸片段擴大，該片段已知含有該患有疾病之對象的多個突變，及(ii)在適合條件下，令所產生的經擴大片段與多個觸酶核酸分子接觸，每個觸酶核酸分子能特異地辨識與切割標的序列，標的序列存在於（1)具有已知突變之核酸片# 中’或(2)對應之野生型核酸片段中，但此兩種情形不同時存在，其前提是，步驟(ii)可在步舞 -48· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21G X 297公t 881^03b(9J&JRES) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ----訂--------------— 1227737 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍之後或同時進行；及 (C)檢測步驟(b) (ii)中的各個觸酶核酸分子是否切割經擴大片段，藉此檢測對象是否患有該疾病。 3. —種檢測對象是否患有疾病之方法，該疾病特徵在於具有習知核酸的多個突變，該方法包括下列步驟： (a) 由對象分離具有核酸分子的樣品； (b) ⑴將分離樣品中的核酸片段擴大，該片段已知含有該患有疾病之對象的多個突變，及（ii)在適合條件下，令所產生的經擴大片段與多個觸酶核酸分子接觸，每個觸酶核酸分子能特異地辨識與切割標的序列，標的序列存在於（1)具有已知突變之一的一個核酸片段中，或(2)對應之野生型核酸片段中，但此兩種情形不同時存在，其前提是，步驟（ii)可在步驟（〇之後或同時進行；及 (c) 檢測步驟（b) (ii)中的各個觸酶核酸分子是否切割經擴大片段（此片段包括其代表之標的序列），藉此檢測對象是否患有該疾病。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 4. 如申請專利範圍第1、2或3項之方法，其中該對象是人類。 5. 如申請專利範圍第1、2或3項之方法，其中該疾病係選自癌症、AH3S及囊性纖維變性。 6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該疾病是癌症。 7. 如申請專利範圍第1、2或3項之方法，其中經擴大之 -49 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227737 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 ___________六、申請專利範圍核酸片段是RNA且觸酶核酸分子是DNA或RNA。 8. 如申請專利範圍第卜2 S3項之方法，其中經擴大之核酸片段是DNA且觸酶核酸分子是RNA或DNA。 9. 如申請專利範圍第卜2或3項之方法，其中⑷擴大反應係利用聚合酶鏈鎖反應進行；（b)觸酶核酸分子是 10-23 DNA酶；且(c)該聚合酶鏈鎖反應使用可開啟該片段之擴大反應的DNA引子，該引子含有至少一個嘌呤核糖核苷酸殘基，此殘基係作為經擴大片段中被ι〇_ 23 DNA酶辨識與切割之位置的5，端。 10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中經擴大片段被 DNA酶辨識且反式切割。 11·如申請專利範圍第9項之方法，其中（a)聚合酶鏈鎖反應使用可開啟該片段之擴大反應的第二DNA引子，該第二引子包括編碼10-23 DNA酶之產酶基因，故擴大反應後，所產生的經擴大核酸分子包括1〇_23 dna 酶；且(b)經擴大之核酸片段被該DNA酶辨識且順式切割。 12. —種用於實施申請專利範圍第i、2或3項之方法的套組，其包括(a)觸酶核酸分子，其特異地辨識與切割椤的序列，該標的序列存在於⑴具有突變的核峻片段中，該突變已知為一疾病的特徵，或(ii)對應之野生型核酸片段中，但此兩種情形不同時存在，及(b)核酸$ 劑，其適用於擴大含有標的序列之核酸片段。 -50 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)H^210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項㈣填寫本頁) I· 訂· --線· 1227737 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B8 g8S 六、申請專利範圍 ~ " 13·-種用於實施巾請專·圍第9項之方法的套組，其包括⑷10-23 DNA酶，該酶特異地辨識與切割標的序列，該標的序列存在於⑴具有突變的核酸片段中，該突變已知為-疾病的特徵，或⑼對應之野生型核酸片段中’但此兩種情形不同時存在，及⑼謝八引子，立在聚合酶_反應條件下，適驗開啟刻段的擴大反應，該引子含有至少-個料核糖⑽_基，此殘基係作為經擴大片段中被10_23 DNA酶辨識與切割之位置的5’端。種用於實施中請專利範圍第u項之方法的套组，立包括、… ⑷第一 DNA引子，其包括編碼1〇_23 DNa酶之產酶基因’該Η)·23 DNA酶特異地辨識與切割標的序列，該標的序列存在於⑴具有突變的核酸片段中該突變已知為-疾病的特徵，或⑼對應之野生型核酸片段中’但此兩種情形不同時存在，該第—引子在聚合酶鏈鎖反應條件下，適用於開啟該片段的擴大反應；及叫第二DNA引子，其在聚合酶鏈鎖反應條件下，適用於開啟該片段的擴大反應，該第二引子含有至少一個嘌呤核糖核苷酸殘基，此殘基係作為經擴大片段中被10-23 DNA酶辨識與切割之位置的5，端·，因此擴大反應後，⑴所產生的經擴大核酸分子包括

(請先閱讀背面之注音？事項μ 裝—— ^寫本頁) · •線· 1227737 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 10-23 DNA酶，且(ii)經擴大核酸片段被該DNA酶辨識且順式切割。 (請先閱讀背面之注意事填寫本頁) 裝 . 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）