TW593679B - Method for gene cloning - Google Patents

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Masayuki Tsuchiya
Mikiyoshi Saito
Toshihiko Ohtomo
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Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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Description

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技術範H| 用來選擇性且有 本發明係有關新穎的基因選殖方法 效地分離編碼膜結合蛋白質之基因。 技術背章 細胞合成之蛋白暂，/少甘々, 枋、扮妗Μ , 質依其各別之性質可以分類成為 核、粒線體、細胎皙莖& 门 在者、接為俨弋、s :、、、胞内各種細胞器（Organelle)所 杜有 接又體或通這分早望έ士人+ ^ 151 ^ ^ ^ 于寺、纟σ合於細胞膜而產生機能者和
支曰殖因子或細胞素算^L 社八认，A 2畜寻在、项胞外所分泌而具機能者。特別是 結合於細胞膜的蛋白質分 ^ 八；raj21 、贫曰Λ刀子，對於解決細胞之增殖因子或
:你Μ 1κ ϋ'細胞間相互作用、荷爾蒙等擔任著 ^ ^ 的機此’疋為對各種疾病之診斷等或治療藥的 標的分子。 、年基因方案中最具代表性隨機的方法發展出大量基 &，方法’累積了 大量之EST(Expressecl Sequence Tag)等魔大基因序列資訊（Matsubai^，κ. Artif iciai O^gans(19 96) 2 0, 823〜827 )。但由這些est來確認具目的機 :的蛋白質卻絕非易事，自基因序列資訊到以其編碼蛋白 f之機能預測及解析，需要許多的時間與心力，因此即使 =在隨機地cDNA選殖階段，亦希望儘量能夠得到具目的機 月b或以所期待編碼蛋白質的基因之選擇方法。 此解決對策即是開發出利用蛋白質所在特性之選殖方 法。例如，表現於細胞膜上蛋白質，具分泌所需丨5〜3 〇個 左右之胺基酸殘基所形成之胺基酸序列，一般稱之為分泌 信號序列或領導序列。
Tashiso氏等注意到此分泌蛋白質的生合成特徵，發
593679 ____案號88107113 年月日_^^ 五、發明說明（2) 展出編碼此分泌蛋白質之基因之特殊選殖法（78311丨50，1(· et al.，Science( 1 993 ) 26 1，300〜6 03 )。本來表現於細胞 膜上蛋白質，例如Interleukin(IL-2)接受體，若其信號 序列缺失則不可能在細胞膜上表現，因此，若是編碼分泌 信號序列之cDNA融合時，此IL-2接受體可以融合蛋白質形 態在細胞膜再被表現。因為IL-2接受體融合蛋白質之表現
細胞，可以I L-2接受體之認識抗體加以選擇，細胞中導入 之信號序列能夠分離編碼機能性蛋白質之cDNA。本法為編 碼信號序列之基因的選殖法，因此一般被稱為SST(Signal Sequence Trap)法。另外，基本上以相同的原理亦開發出 酵母菌的選殖方法。（美國專利第5536637號）。 但是，即使以本法所得之編碼具信號序列蛋白質的基 因斷片亦無法得知其是否為分泌蛋白質或膜結合蛋白質。 而且，在本法中必須用到含5，側末端之cdnA引子，但是選 擇性地含5’側末端之cDNA引子之有效的組成技術卻非一般 簡單之普通技術。 最近，編碼結合於細胞膜之蛋白質的基因選殖方法， 有由市原氏及中内氏等所報告（市原慶和及黑澤良知、曰 本生物學會總會（ 1 998 )抄錄集No. 3 -509-p-533、中内氏、 國際公開第 98-03645 號）之TMT(Transmembrance Trap) 法。市原氏的方法基於與上述SST法相反的原理。亦即， 含有IL-2接受體之細胞外領域及包覆kcDNA之細胞膜結合 區的蛋白質融合後令其於細胞膜表面表現，使用IL — 2接受 體之抗體來選擇此細胞。由本方法之實驗模型中’，I型及 I I 型模結合蛋白質及gly cosy Iphosphat idyl inositol
593679 Λ_3 修正 曰 盖號88〗Π71Μ 五、發明說明（3) (GPI)錯型之膜結合蛋白質及與IL-2接受體融合分子之細 胞膜上之表現，以抗IL-2接受體抗體來予以確認。 但疋，在導ACDNA引子時，亦得到所選擇cdna中不具 f區或膜結合區之蛋白質。亦即，以此tmt法對編碼 、+ β蛋白質之基因選殖之選擇性並非絕對要高，例如不 具$貫通區或GPI錨之融合蛋白質理應完全分泌，但因其 或胺基酸組成，會不以膜貫通區或Gpi^，在細胞膜 產生非特異性的凝集。 另外，此TMT法，可使認識抗體之認識抗原決定部位 口 ，合蛋白質中表現，如上述所表現融合蛋白質非特異地 ΪIΪ Ϊ ί膜上’只要認識抗原決定露出’抗體就會認識 切Q m 了二L接著，在分泌到細胞外過程中，抗體依然能 分子。因此’以讓法’對膜結合蛋白質細 胞之選擇性可望得以提升。 發明之猖元 本發明為解決上述TMT法之問題點，提供 基因之選殖方法。 一 &擇庄 本發明的特徵為，將自體蛋白質與機能性蛋， 來分離編碼膜結合蛋白質基因，令融合蛋白質中右: 抗體決定，此與以往之TMT法有所差異。因此，可以八的離油 選擇性地編碼膜結合蛋白質的基因。 刀 亦即本發明為一種編碼膜結合蛋白質之基因 方法，包括下列步驟： 丞因的分離 (1)將含有DNA的載體導入細胞之中，上述DNa 具有與抗原結合親^性、且可分泌之機能性蛋白質的dna
2125-2578-pfl.ptc 第6頁 修正 i 藏 88107113 五、發明說明（4) 以及連結其3,側下游之““構成； (1 1 )在細胞内表現出具有盥 泌之機能性蛋白質與編碼CDNA: :: δ親和性、且可分 (iii)使在細胞膜上表現出融蛋^白質之融合蛋白質； 接觸，並且選擇結合於抗原的細胞°蛋白質的細胞與抗原 (1 V )由選擇的細胞中分離 本發明尚提供（2)，上述第⑴^載/内的CDNA° “)導入細胞的載體，將方法之中，步驟 位所得到的載體，該限制酵辛栽邱體;；限制酵素認識部 白質之DNA的3,侧下游。 咸心立位於編碼機能性蛋 本發明尚提供（3)，上述第⑴項的方法之中步驟 乂t入細胞的載體為1編碼機能性蛋白質的DNA以及連 二其3側下游之cDNA所構成的MA導入載體所得到的載 體0 、本發明仍提供（4)，上述第（1) —(3)項任一項所述之方 法之中’編碼機能性蛋白質的DNA以及連結其3,側下游之 cDNA之間是以編碼肽連接分子（pept ide 1 inker)的DNa連 結著。 本發明尚提供（5 )，上述第（1) — (4 )項任一項所述之方 法之中，cDNA為由哺乳動物細胞得到““庫而來。 本發明尚提供（6)，上述第（1) — ( 5)項任一項所述之方 法之中，步驟（i)導入細胞的載體之中，含有在編碼機能 性蛋白質的DNA之5’側上游編碼分泌信號序列的DNA。 本發明尚提供（7)，上述第（1)-(6)項任一項所述之方 法之中，機能性蛋白質為抗體。
2125-2578-pf1.ptc 第7頁 …b79
法本發明尚提供（8)，上述第（1)-(4)項任一項所述之方 之2，與抗原具結合親和性之機能性蛋白質為單鏈抗 。單鏈抗體最好是一價或二價之單鏈抗體。 法本發明尚提供（9)，上述第（1)-(8)項任一項所述之方 飨之中’載體包含’將編碼抗體的固定區域之DNA連結於 、為碼單鏈抗體的DNA之3,側下游所構成的!)^。 本發明尚提供（10)，上述第（1)-(9)項任一項所述之 方法之中，抗原與支持體結合著。 本發明尚提供（11)，上述第（ίο)項所述之方法之中， 支持體為細胞培養用支持體。 本發明尚提供（12)，上述第（1) —(11)項任一項所述之 去之中，包括分析步驟，用以決定從細胞得到的基因是 否有新穎序列。 勹本發明尚提供（13)，上述第（12)項所述之方法之中， l括cDNA庫篩選步驟，用以得到含有從細胞得到的新穎序 列之基因的全長基因。 勺.本發明尚提供（1 4 )，上述第3 )項所述之方法之中， 匕括從細胞得到的新穎序列之基因的全長基因之分離步 驟。 本發明尚提供（15)，一種用來分離編碼膜結合蛋白質 之基因的試藥組（k i t )，其中本發明步驟，包括：具有限 制^素認識部位的載體，該部位為用來將cDNA插入編碼具 有可分泌與抗原結合親和性的機能性蛋白質的DNA之3，側 下游。 训 本發明尚提供（1 6 )，
593679
匕用來導入結合於抗原的支持體及/或載體的細胞。 u本發明之方法所分離之膜結合蛋白質有如，例！型 5聖膜結合蛋白質及GPI錨型之膜結合蛋白質。I型或II =膜釔合蛋白質為其膜貫通區之蛋白質，由所表現多胜肽 員=各N側末端或者C側末端向細胞外分泌，並與膜結合。 膜二，區疋為貫通細胞膜内外之區，當此膜貫通區，一般 而曰疋在蛋白質的胺基酸序列中，富含疏水性胺基酸殘基 所構成。對於蛋白質是否具有膜貫通區，可以市售之
puter program ，例如GCG Sequence Analysis oftware Package(Genetic Computer Group , Oxford Molecular Group，lnc·)簡單的予以推測得知。Gpl錨型 之膜結合蛋白質；以GPI來修飾，並以此為輔，是為細胞 膜脂質層中被固定化蛋白質（Gpi錨型膜結合蛋白質）。 本發明分離方法之第一步驟（（丨））中，在細胞中導入 編碼具有與抗原結合親和性之分泌機能性蛋白質的DNA， 及包含其3側下游中連結cdna之DNA載體。
「與抗原具結合親和性的機能性蛋白質」為，與機能 性抗原結合的蛋白質之意。機能性蛋白質以與抗原之結合 定數在1 Ο7 Μ以上者為佳。結合定數在丨〇8 M以上更好，最好 是1 09M以上。機能性蛋白質具體而言有如抗體、抗體斷 片、單鏈抗體荨。抗體由2重鏈（heavy鏈、Η鏈）及2輕鏈 (1 ight鏈、L鏈）形成，這些H鏈與L鏈以二硫化物結合形成 一抗體分子。Η鏈與L鏈由可變區（V區，Fv)及恆常區（C 區’ F c )所形成。抗體斷片為具與抗原之節結合親和性之 抗體的一部份蛋白質，有如Fab、F(ab’）z、Fv等。單鏈抗
2125-2578-pfl.ptc 第9頁 593679 ---案號88107113_ 年月日 修正 _i一 五、發明說明（7) 體（以下稱為single chain FV(scFv)或單健Fv)為，η鏈Fv 與L鏈F v以連接分子連接，具與抗原結合親和性之蛋白 質’ 一價之單鏈抗體及二價之單鏈抗體。一價之單鏈抗體 有一個由Η鏈之Fv及L鏈之Fv所構成之抗原結合部位，二價 之單鏈抗體具一價之單鏈抗體以連接分子連結所形成之構 造，具二個抗原結合部位。 抗體、抗體斷片或單鏈抗體為各種目的，例如為改善 結合定數、一個或一個以上之胺基酸殘基產生欠缺、插入 及/或因其他之胺基酸殘基而置換、或與其他的胜肽或多 胜肽融合之抗體，不論是抗體斷片或單鏈抗體皆可使用改 善抗體。 ， 改善抗體有如欲合體抗體及人型化抗體等。礙合體抗 體是由相異的動物之抗體的V區及C區所形成之抗體。人型 化抗體則是由人類以外之動物之抗體的相輔性決定區 (CDR)及人類抗體之基本結構（framew〇rk)區（j?R)及c區所 形成之抗體。 本發明機能性蛋白質之具結合親和性之抗原為只需具 抗原性物質皆可。抗原則有如蛋白質、胜肽、糖等，以^ 白質為佳。當成抗原所使用之蛋白質有如表現蛋白質之細 胞及微生物、血清蛋白質、細胞素、細胞内蛋白質、膜蛋 白質等。 、 、 編碼抗體之DNA則可以一般周知的方法得知。亦即， 產生抗體之細胞有如融合瘤、以抗原來製作之不死化淋巴 球、可以導入抗體基因產生重組型抗體而自細胞中分離出 來。另外，亦可使用導入已經分離載體之DNA。至
593679 ——_案號 88107113_年月日_ί±£-_^ 五、發明說明（8) 碼抗體之DNA本發明中只限使用得之，而不問其由來及種 類。 編碼抗體斷片或單鏈抗體之DNA，可依普通使用之方 法’編碼抗體之D Ν Α來進行構架。編碼一價之單鏈抗體之 DNA，是以抗體之Η鏈V區（H鏈Fv)為密碼，連結編碼連接分 子之DNA及編碼L鏈V區（L鏈Fv)之DNA而得之。連接分子為 具Η鏈Fv及L鏈Fv抗原親和性之立體再現時，其餘並無特殊 限制。連接分子最好是胜肽連接分子，例1 2〜1 9個胺基酸 殘基所構成（Huaton，J.S. et al.，Proc. Natl. Acad. 31<^1^.八.（1988)85，587 9〜5883)。具體而言，具有如
下列胺基酸序列之胜肽連接分子。Gly Gly Gly Gly Ser
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser((Gly4Ser)3) t序列編號·· 1)。編碼二價之單鏈抗體DNA，則可編碼一價 單鍵抗體之二分子，其DNA之5，末端及3，末端以編碼胜肽 連接分子之DNA予以連結，構築而成。連結二分子之單鏈 抗體的胜狀連接分子為，例如Gly Gly Giy Gly Ser Gly
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser((Gly4Ser)3)(序 列編號：1 )之胺基酸殘基所形成。
&在本發明中為了提高選殖效率，例如使用單鏈Fv當成 機能性蛋白^時，其C末端為疏水性胺基酸之數目愈少愈 好’具體而&，有如後述實驗中之欠缺…⑽區之單鏈 二:另夕十卜，在本發明中，係於單鏈Fv之C末端，甚至，由 t區，例如，因與後述之實施例中所述之抗體其 =吊區=編碼胺基酸DNA連結，安定性及表現效率有所提
2125-2578-pfl.ptc mKNA之分離源雖 組織、也液、器官 593679 _案號88107113_年月日_ 五、發明說明（9) 機能性蛋白質因可能分泌，故可以使用分泌信號序 列。亦即，編碼分泌信號序列之DN A，若能與編碼具抗原 結合親和性之機能蛋白的DNA之5’側上游連結為佳。分泌 信號序列，在使用細胞中cDNA庫之表現，使用適於蛋白質 分泌者。分泌信號序列為限於能分泌機能性蛋白質之任何 分泌蛋白質之信號序列皆可。由動物所來之分泌序列，較 佳者由如哺乳動物之分泌信號序列。由哺乳動物來之分泌 蛋白質之信號序列，如人之免疫球蛋白之信號序列 (Rabat, Ε· el a 1. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services(1991))，細胞素之信號序列、細胞 素接受體之信號序列等。 連結於編碼機能性蛋白質DNA之3,側下游DNA，最好是 來自cDNA引子。cDNA引子可使用一般周知之方法所得到2 cDNA引子、或使用市售之cdna引子。CDNA引子可由所寄望 之材料中分離mRNA，再以此mRNA合成cDNA。
Mrna的分離源，可以利用例如哺乳動物、哺乳動物以 外之動物、植樹、酵母、細胞或藍藻等，最好使用哺 物。而以哺乳動物而言，如人、猴子、兔子、大白鼠、小 白鼠等特別以人為佳。哺乳動物以外的動物為昆 言有如蜂繩（Drosophila)。 m w ^ 丨一/午、 所得之細胞所建立之細胞種株、胚胎、驵織、血哭— 或臟器等。這些中之代表為骨芽細胞、造血幹細胞、二 肌細胞、神經細胞、基質細胞、ES細胞 '肝、腸道、:π “碰_瞧醒敝"⑴…二…二Ξ·.·：：~ ---—
593679 案號 88107113 ___Ά 曰 修正 五、發明說明（10) 腎、淋巴腺等。 分離mRNA時，將分離所使用之材料懸浮在通常所使用 之緩衝液中，再以通常使用之方法加以分離。為了調製分 離第一階段之全RNA，可使用胍（guanidine)超離心法 (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry(1979)18, 5294-5299)或AGPC 法（Chomczynski， P. and Sacchi, Ν·， Anal. Biochem.(1987)162， 156-159)等。接著為 了由全 RNA 來精製mRNA，可使用如mRNA Purificatoin kit (Pharmacia製）等。為了濃縮mRNA以募dT做親和力精 製時，可使用有如QuickPrep mRNA Purification kit(Pharmacia 製）之市售試藥組（kit )。 所得到的mRNA，以逆轉錄酶合成cDNA。逆轉錄酶可使 用市售之逆轉錄酶。使用mRNA互補的募dT引子，或使用隨 機的鹼基序列之募核苷酸當引子，可以合成與mRNA的 poly-A互補之單鏈cDNA。cDNA之合成可用有如AMV Peseave Transcriptase First-strand cDNA Synthesis k i t (生化工業製）。 另外，cDNA引子可以使用一般使用法，為特定目的做 選擇性地濃縮。特定目的乃是為得到有如表現量變化基因 之cDNA，可以使用差別（Differential)選殖法（Lau，L. F· et al·，and Nathans, D. EMBOJ. ( 1 985 )4,
3145-3151)、差別（Differential)展示法（Liang，P· and Pardee, A.B. Science(1992)257， 967-971)、 Subtractive 選殖法（Nucleic Acids Research( 1 988 ) 1 6， 10937)或method of seriai anaiysis 法（SAGE
2125-2578-pfl.ptc 第13頁 593679 _案號88107113_年月日 修正 ____^ 五、發明說明（11) 法）（Velculescu， V.E· et al·， Science(1995)270， 484-487)。而為了濃縮編碼分泌蛋白質之cDNA，亦可使用 SST 法（Tashiro， K· et al·， Science(1993)261， 300 - 603)或美國專利第5536637號令所記載之方法。 載體只需使用能夠表現含有細胞形態轉換DNA之任# 表現載體皆可。表現載體則最好選擇以形態轉換細胞作動 所得到之載體。表現載體則例舉了質體載體、病毒由來的 載體。 將所得之cDNA連結載體。此時含編碼蛋白質的dna之
載體’由於在該DNA之3,側下游中導入cDNA，故能將CDNA
導入載體中。為此，設計載體之編碼機能性蛋白質的DNA 之3 ’側下游中適當限制酶的認識部位，例如多選殖部位之 汉计’在此部位中可導入cdna。另外，初次編碼機能性蛋 白質的DNA之3’側下游以cDNA連結，再以載體導入所得之 DNA亦可。為導入DNA，可以在含載體⑽人適當的限制酶認 識部位中導入DNA。在調製載體之際，編碼機能性蛋白質 =ΜΑ及位於其3,側下游+cDNA直接連接亦可，或為了機 月b I*生蛋白質與抗原結合容易之故，以編碼肽連接分子麗a 居中連結亦可。 、、表現載體最好是含有在細胞中能表現所寄望之關a的 必，之表現限制區。表現限制區為，例如啟動因子，具體 ^^如人類EF 1 α啟動因子、HCMV啟動因子或SV40啟動 千4。如此之製作表現載體，可依常用之方法導入細胞 = ^中導入法有如電穿孔法（EMB0J，0982)1， ----^ ^ ^ ^^VIr〇l〇gy( 1 9 73 ) 52. 456-467 )、核 593679 案號 88107113 五、發明說明（12) 醣核蛋白體法、DEAE葡聚糖法等。 形態轉換細胞除載體含分泌信號序列或具表現限制區 機能外，所有細胞皆可，最好是動物細胞，例如c〇s、cH〇 或BAF3等。 在本發明之第一工程（（i i ))中，具抗原結合親和性且 能分泌之機能性蛋白質及編碼⑼^之蛋白質的融合蛋白 質，在細胞内表現之。具體而言，含編碼上述融合蛋白質 之DNA的載體’做細胞形態轉換，以適合細胞生育的條件' 下培養。培養乃依常法進行。培養液可用，例如DMEM、 MEM、RPMI 1 640、IMDM，亦可併用牛胎兒血清（FCS)等血生 補液。 ， & 為了在細胞内表現DNA，可以使用誘導表現DNA之系 統。例如使用四胚黴素之表現限制系統或刺激，例如用名 胞素、脂多醣類（LPS)、類固醇荷爾蒙等對應之表現啟動田 因子。若使用如此之啟動因子，藉由刺激細胞，可以曾 細胞中DNA之表現。若MA被表現則產生含有機能性蛋°白= 及cDN A基因產物之融合蛋白質。cDNA為編碼膜結合蛋白二 時，融合蛋白質為粗面小胞體（ER)合成過程中，^去八質 信號序列、融合蛋白質在細胞膜上表現。編碼機能性^己 質之DNA及cDNA之間以編碼肽連接分子連結⑽八時，匕 蛋白質及cDNA之基因產物之間，表現含肽之融合蛋白=性 在本發明之第三步驟（（iii))，細胞膜上表現融入、。 白質的細胞，使之與抗原接觸、選擇與抗原結合之細°蛋 11 U I板為佳，例如塑膠平板、多孔穴板、捭^巫支持 _ ---------^ ^ ^ ^ 或有
抗原最好與支持體結合。以支持體而言，細胞二養：^。 2125-2578-pfl,ptc 第15頁 593679 修正 案號 88107113 五、發明說明（13) 珠子則有如磁性之有孔珠子，依照常法可 ^ ^ ^ ^ +十板令，適當的緩衝液存 η” ’放置一⑨’再以洗淨方式使抗原與支持體 2。另夕卜’抗原亦可因特殊結合抗體之介入而與支持體 ΐ板之抗原中’添加特殊結合抗體，再將抗 μ α疋於平板後，加入抗原，再將抗原與支持體結合亦 I。或者m有與支持體結合之抗原與細胞結合，接 者將固定在支持體上抗原卩特殊結合之抗體，彳細胞與支 持體結合亦可。&有與支持體結合之抗原肖細胞結合後， 抗原及細胞可以架構劑，例 DMS(Dimethy1sulberimidate)、 ， BS3(Bis(sulfosuccinimididyl)suberate ^ DSS(Disuccinimidyl Suberate)等予以架構。 平板上細胞與抗原結合所得條件下培養，細胞與抗原 結合後，以適當的條件洗淨平板，除去沒有與抗原結合之 細胞，則能夠選擇與抗原結合之細胞。另外，為選擇與抗 原結合之細胞，可以使用連續（流）細胞計數法（FACS)。以 故些方法回收所選擇之細胞。重複2〜數次這些方法，能夠 選擇性地回收所希望的細胞。
第16頁 本發明之第四步驟（（i v D，分離由所選細胞所插入載 體之cDNA。首先將平板上結合細胞所導入載體抽出，分離 載體中=含cDNA。使用質體載體時，將質體載體抽出，導 入大腸菌中令其增幅，接著調製質體分離。“即可。再 者’決定所分離基因之鹼基序列。此外使用載體上之鹼基 序列’設計PCR引子’再此將cDNA增幅，並決定鹼基 593679 年月日_ _案號 88107m 五、發明說明（14) 序列亦可。使用反錄病毒載體十，同樣地以PCR增幅 再決定鹼基序列即可。 另外，本發明八凹含決定上述所分離之基因是否含有 新穎之序列之解析步驟。所分離之DNA序列可用DNA資料 庫，例如GENBANK、EMBL等，序列之相同性（胺基酸殘基之 相等性），亦可以依照檢索解析是否是新穎的序列。決定 蛋白質的相同性，則可依照文獻（wi丨lbru，w. j. and
Lipman， D.J·， Proc. Natl. Acad· Sci· USA(1983)80， 726 - 730)中記載之計算法。
除此之外本發明亦可包含為得到上述分離基因之全長 基因所做cDNA引子之篩選步驟。依照，常法，使用標示所分 離之基因斷片為探針，與CDNA庫雜交，經由標示與分離基 因斷片所結合cDNA仿製體而加以檢測出能夠筛選⑼^引 子0 本發明又可包含、分離上述所分離之全長基因之步 驟，如上所述綿選cDNA引子，分離以常法所檢出icDNA仿 製，決定其鹼基序列即可。
此外’本表現包含分離編碼上述膜結合蛋白質基因所 用之試藥組（kit)。本發明之試藥組包含編碼具抗原結合 親和性及可能分泌的機能性蛋白質的DNA之3，側下游中為 了插入cDNA而有限制酶認識部位之載體。本發明之試藥 組，導入與抗原結合之支持體/或載體最好甚至包含細 胞。其他，淘洗之洗液、抗原與細胞架構劑DNA引子、溶 解所選擇細胞回收液等皆可包含在試藥組中。 圖面箪說明
593679 案號 88107113 年月日 修正 · 五、發明說明（15) 圖1為表示表現選殖載體—pTMT_SR345之構造模式圖， 圖中之「SR345」為人類IL-6接受體細胞外區，「ΝΕΟ」為 新黴素（Neomycin)耐藥性基因，「EF1 α」為肽鏈伸長因 子Ια之啟動因子區。為SV40初期啟動因子，「Ampr」為 安比西林（Ampici 1 1 in)耐藥性基因。 圖2為表示，表現載體—pTMT — scFv之構造模式圖。圖 中「scFv」為單鏈抗體，「ig’s」為抗體分泌信號肽。其 他記號與圖1相同。 圖3為使用導入各種質體DN a之c〇S-7細胞進行淘洗 (panning)，回收菌落數之表示。
圖4為表示，表現載體—pTMT —BvGS3之構造模式，圖中 之「hPMI-BvGS3」為二價之單鏈抗體。其他所用之記號與 圖1及圖2相同。 圖5為表示相對於導入各種質體DNa之C0S —7細胞所人 型化PM- 1抗體，使用兔子多株抗體以連續（流體）細胞計數 器予以解析時之頻率分佈圖表。 圖6為表示，導入各種質體DN a之c〇s-7細胞，使用小 白鼠抗IL-6接受體抗體MT-18，以連續（流體）細胞計數器 解西時之頻率分佈圖表。
圖7為表示’表現載體-pTMT —shpM1F —κ之構造模式。 圖中「shPM-Kappa」為單鏈抗體。其他記號與圖1及圖2相 同0 實施本發明之最# 本發明之選殖法，具體而且可依下列型式實施，但本 發明並非以此為限。
2125-2578-pfl.ptc 第18頁 593679 案號 88107113 年 月 曰 修正 五、發明說明（16) 【實施例1】表現選殖載體-pTMT-SR345之構成 構成表現選殖載體-PTMT-SR34 5。編碼含表現選殖載 體-PTMT-SR34 5DNA之SR345為人類I L-6接受體之細胞外區 部份，由N末端由來345個胺基酸殘基所構成。於表現選殖 載體-PTMT-SR345、編碼SR345之DNA的下游中插入以cDNA 為編碼蛋白質是當成與SR345之融合蛋白質兒表現。又， 併記SR345之胺基酸序列之鹼基序列以序列編號：2表示。 首先 ’ IL-6 接受體之 cDNA(Yamasaki, K. et al，
Science( 1 988 )241, 825-828 )由來，有編碼 SR345 的 cDNA 為增幅1· lkb左右，設計PCR引子之IL6R1 (序列編號：3)及 IL6R2(序列編號：4) °l〇mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCL、0.1mM dNTPs、1.5mM MgCl2、100pmol 之上述各引 子，1 OOng之DNA鑄模（編碼il-6接受體之cDNA)、及含5單 位的Ampli Tag Gold酶之l〇〇ml PCR反應混合物，在94°C 變性後以94 °C 1分鐘、55 °C 1分鐘、72 °C 1分鐘的順序循 環進行3 0次’隶後以7 2 °C 1 0分鐘培養。所增幅之D N A斷片 以1 %低融點瓊脂糖膠體電氣泳流動加以回收、精製、以 EcoRI消化後，插入表現載體pc〇S 1之EcoRI部位。將此形 質導入大腸菌中，調製質體，DNA斷片得到正確地插入之 質體又，表現載體pCOS 1是由質體HEF-PMh-grl(參考國際 公開第92- 1 9759號）’消除由EcoRI及Smal消化而含有之基 因，連結EcoRI-Notl-BamHI Adaptor(寶酒製造）而予以構 成。 接著，SR345上游側之EcoR I部位以下述方法除去。首 先，質體以EcoRI部分分解，回收切斷一處之進入直鏈分
第19頁 VI593679 案號 88107113 五、發明說明（17) 子，此等以 DNA 聚合酶（P〇lymerase)I(Klenow 斷 >|(Klenow f lagment))平滑末端後，進行自我結紮（self ligation)、大腸菌中形質導入後，得到表現選殖載體 pTMT - SR345，pTMT-SR345之構造模式如圖丨所示。 【實施例2】表現載體pTMT-scFv之構成 構成表現載體pTMT-scFv。編碼表現載體pTMT_scFv中 所含DNA之單鏈抗體（scFv)為使用認識人類IL 接受體之 人型化單株抗體PM-1的可變區及連接分子區來予以設計。 表現載體pTMT-scFv表現當成編碼scFv之關八之丁游中所插 入以DNA為編碼蛋白質是與scpv的融合蛋白質。另外， scFv基因之胺基酸序列併記之鹼基序，列以序列編號· 5表 示0 a 1 幅 1 )編碼抗體V區之D N A片斷之增幅 人型化PM1抗體Η鏈及L鏈V區之基因（sat〇，K. et CancerRes. ( 1 993 )53，85卜856)以 pCR 法予以增 Η鏈V區為目的之後方引子TMn(序列編號：㈧為編曰碼h 鏈V區之DNA與相雜交，且設計使其具有Sa丨丨限制酵素切、 識部位。Η鏈V區為目的之前方引子UNK1(序列編號：7)為 編碼Η鏈V區之DNA與相雜交，且設計使其具有連接分子區 之5’端之序列。另外，[鏈乂區為目的的後方引子unk3(序 列編唬· 8)為與編碼l鏈V區之N末端的DNA雜交，設 1· 具有連接分子區之2’端的序列。L鏈¥區為目的之前方引子 SCP-C(序列編號：9)為與編碼[鏈通常區eib〇w部位 之胺基馱序列的鹼基序列相雜交，H i nd工I I限制酶認 位編碼FLAG肽（序列j號：10)的鹼基序列，設計使其:;
第20頁 2125-2578-pfl.ptc 593679 ___案號88107113_ 年月日 修正__ 五、發明說明（18) 2個反複翻譯終止的密碼子。 10mM Tris-HCl(pH8.3) 、50mM KC1 、0.1mM dNTPs 、 1· 5mM MgCl2等引子各100pm〇i與i〇〇ng之鑄模DNA及含5單 位之Ampli Tag Gold酵素之i〇〇mi PCR反應混合物，在94 °C 9分鐘變性後，以94 °C 30秒、60 °C1分鐘的循環進行30 回，最後在60 °C中培養5分鐘。PCR生成物使用1. 5 %低融 點瓊脂糖凝膠予以精製。 2 )編碼連接分子區之DNA片斷的增幅
編碼（Gly4Ser)3之胺基酸序列由來連接分子之DNA片 斷’以人型化單鏈抗體表現載體PSCFVT7-hM21(參照國際 公開第95 - 1 404 1號），使用PCR法予以增幅。後方引子 L I N K 2 (序列編號：11 )與連接分子區之5 ’端雜交，設計使 具有Η鏈V區3’ -端之DNA序列。前方引子LINK4(序列編號： 12)為與連接分子區之3’端雜交，設計使具有l鏈v區-hM 21 之5’端DNA序列。使用PCR為lOOng之鑄模 DNA(pSCFVT7-hM21)，以上述相同之條件下PCR生成物使用 1 · 5 %低融點瓊脂糖凝膠予以精製。 3)人型化PM1抗體單鏈Fv之構成
編碼上述所調製Η鏈、L鏈V區之DNA片斷，以及編碼連 接分子區的DNA片斷以PCR法予以結合，加入後方引子ΤΜΤ1 及前方引子ΤΜΤ2(序列編號：13)，將編碼人型化ΡΜ1之 scFv的全長DNA片斷增幅。又，前方引子ΤΜΤ2為Hind I I I 限制i母認識部位與編碼F L A G肽之D N A序列相雜交，設計使 其具有2個之反複翻譯終止密碼子及EcoR I限制酶認識部
位。一次PCR 為10mM Tris-HCl(pH8.3) 、50mM KC1 、0.1mM
2125-2578-pfl.ptc 第21頁 593679 案號 88107113 年 月 曰 修正 五、發明說明（19) dNTPs、1 · 5mM MgCl2等引子各100ng之上述PCR生成物，及 與含5單位之Ampli Tag Gold酶之98ml PCR反應混合物， 在94 °C 最初變性後，以94 °C 2分鐘、55 °C 2分鐘、72 °C 2分鐘的循環進行2次，使各各DNA片斷連結。二次PCR為各 引子中分別加入上述之PCR反應液lOOpmol，接著，94°C 30秒、60 °C 1分鐘的循環進行30次，最後60 t 下培養5分 鐘。 使用1 · 5 %低融點瓊脂糖凝膠來精製PCR生成物後，以 S a I I及N 〇 t I消化後，插入人類E F 1 α啟動因子，及具抗 體leader序列（序列編號·· 14)之表現載體pSFLAG。DNA序 列決定之後，得到含有正確DNA序列之DNA片斷的質體 pTMT - scFv。表現載體PTMT - scFv之構造如圖2所示。而 pSFLAG貝丨J如以下所述構成。EcoRI P艮制酶認識部位，抗體 之leader序列（序列編號：14)、FLAG肽（序列編號：10)及 編碼Κρη I、Not I、BamH I限制酶認識部位之讀出 (Sense)方向及反讀出（Antrisense)方向之重疊2支募核zg： 酸S-FLAG1(序列編號：15)、S-FLAG2(序列編號：16)予以 設計並且分別合成之。這些含100 pmol合成募核喹酸之反 應液在96 °C下培養5分鐘後，經20分鐘冷卻到65 °C，65 t 下再培養5分鐘。接著，又花2〇分鐘冷卻到42 °C後，再培 養5分鐘之後又經由2 〇分鐘冷卻至室溫，將此支合成寡核 喹酸予以鍛鍊。此DNA片斷插入EcoRI及BamH I消化之 乂 pCOS- 1中構成。 【貫施例3】SR345 - gpl30、scFv-gpl30融合蛋白質表現系 之構成 μ
2125-2578-pfl.ptc 第22頁 593679 案號 88107113 Λ_Ά Β 修正 五、發明說明（20) (A)SR345-gpl30 細胞素信號傳達分子gpl30為I型之膜結合蛋白質 (Taga， T· et al·， Cell(1989)58， 573-581 、Saito， M·，et al·，J· Immunol.( 1 992) 1 48，4066-4071 )。編碼 表現載體PTMT-SR345之可溶性IL-6接受器 (receptor)(SR345)之 cDNA下游中小白鼠gpl30 cDNA 之一 部份連結，使COS細胞表現由SR345及小白鼠gpl30之部份 區所形成之融合蛋白質。融合蛋白質因gpl30之部份區的 不同製作成2種類。其一為g p 1 3 0膜結合區及其接續之細胞 内區所連結之膜結合型融合蛋白質（SR345-mgpIC)。又全 長之小白鼠gp 1 30之胺基酸序列及鹼基序列，以序列編 號：1 7表示。 1) 膜結合型融合蛋白質SR345-mgpTMIC表現載體之製 作 小白鼠gpl 30 cDNA之全長以EcoRI切斷，得到相當約 1· lkb之EcoRI片斷。此EcoR I片斷為編碼序列編號：1 7中 小白鼠gpl 30之第603位置之胺基酸到917位置之胺基酸（C 末端），包含小白鼠gpl30之細胞外區之一部份（15胺基酸） 及連續這些膜貫通區及細胞内區之全部。此EcoRI片斷插 入pTMT-SR345表現載體之EcoRI部位，製作膜結合型融合 蛋白質SR-345-mgpTMIC表現載體。 2) 分泌型融合蛋白質SR345-mgpIC表現載體之製作 為了得到編碼小白鼠gpl 30細胞内區之cDNA片斷，製 作付加Hind I I-EcoRI部位之PCR引子mgp2(序列編號： 20 ’包含編序列編號：1 7之胺基酸序列第646位胺基酸到
2125-2578-pfl.ptc 第23頁 593679 _案號 88107113 五、發明說明（21) 年月曰 修正 917位胺基酸（C末端）的DNA)，使用這些得到約lkb之小白 鼠gpl30cDNA片斷。此約lkb之cDNA片斷為編碼序歹*J編號： 17之胺基酸序列第646位胺基酸到917位胺基酸（C末端）， 這相當於N末端側欠缺6胺基酸之細胞區。以此所得之cDNA 片斷以EcoRI切斷後插入pTMT-SR34 5表現載體之EcoRI部 位，製作分泌型融合蛋白質SR345-mgpIC表現載體。 (B)scFV-gpl30 表現載體pTMT-scFv中，連結scFvcDNA之下游中小白 鼠gpl 3 0cDNA之一部份，並以COS細胞表現scFv及小白鼠 gpl30之部份區所形成之融合蛋白質。因融合蛋白質連結 gpl30之部份區不同，故製作出2種類，。其一為gpl 30之膜 結合區及連結其連續細胞區之膜結合型融合蛋白質 (scFv-mgpTMIC)，其二為限與連結gpl30之細胞内區之分 泌型融合蛋白質（scFv-mpgIC)。 1)膜結合型融合蛋白質scFv-mpgTMIC表現載體之製作 為了得到編碼小白鼠gpl 30細胞内區之cDNA片斷，製 作付加Hind I I-EcoRI部位之PCR引子mgpl (序列編號： 1 8，包含編碼序列編號：1 7之胺基酸序列第6 0 3位胺基酸 到6 08位胺基酸（C末端）的DNA)，使用這些得到約1. lkb之 小白鼠8?130。0^片斷。此約1.11^之〇0—片斷為編碼序 列編號：17之胺基酸序列第603位胺基酸到917位胺基酸（C 末端），這些小白鼠gpl 30之細胞外區之一部份（15胺基酸） 及這些膜貫通區及細胞内區之全部。以此所得之cDNA片斷
以Hind III-Not I切斷後插入pTMT-scFv表現載體之Hind III-Not I部位，製作膜結合型融合蛋白質scFv-mpgTMIC
2125-2578-pfl.ptc 第24頁 593679 案號 88107113 年 月
B 修正 五、發明說明（22) 表現載體。 2)分泌型融合蛋白質scFv —mgpIC表現載體之製作 為了得到編碼小白鼠g p 1 3 0細胞内區之c D N A片斷，製 作付加Hind I I-EcoRI部位之PCR引子mgp2(序列編號： 20，包含編碼序列編號·· 1 7之胺基酸序列第646位胺基酸 到9 1 7位胺基酸（C末端）的DN A )，使用這些得到約1 kb之小 白鼠gpl30 cDNA片斷。又，PCR法與實施例3(A)-2)相同條 件。此約lkb之cDNA片斷為編碼序列編號：17之胺基酸序 列第646位胺基酸到917位胺基酸（c末端），這相當於N末端 側欠缺6胺基酸之細胞區。以此所得之cDNA片斷以Hind III-Not I切斷後插入pTMT-scFv表現截體之Hind III-Not I部位，製作分泌。 【實施例4】C 0 S細胞之表現 _ 將上述各種表現載體形質導AC〇s細胞中，使迅速地 表現融合蛋白質’並確認淘洗由來之融合蛋白質為選擇性 地濃縮細胞膜上表現之細胞。另外，只有不含基因之表現 載體pCOS-1與轉移感染者做陰性對照組，另外編碼ΗΜ1· 24 抗原蛋白質的DNA(國際公開第98- 1 4580號），以導入 pCOS - 1中之表現載體ρ3· 1 9轉移感染之，而以相對於此之 抗體淘洗者為陽性對照組。
1)C0S-7細胞之轉移感染 質體DNA 使用Lip〇fect AMINE PLUSTM Reagent (GIBCO-BRL製），轉移感染至c〇s_7細胞。亦即，轉移感 染前日以1 X 105細胞/Well(6wel 1平板）播種之C0S-7細 胞’在過夜培養後，以無血清之DMEM培養液（GIBCO-BRL
2125-2578-pfl.ptc 第25頁 593679 案號 88107113 曰 修正 五、發明說明（23) 製）洗淨後再添加0· 8ml之同培養液。一方面，質體DNA 1 "g及PLUS Reagent 6 //1 加入無血清之DMEM培養液 0.1ml，室溫下培養15分鐘後，與0.1ml之Lipofect AMINE 溶液（4μ1 之Lipofect AMINE/無血清之DMEM培養液 0 · 1 m 1 )相混合，室溫下培養1 5分鐘。接著此混合液中添加 上述之C0S-7細胞，37 °C下培養3小時後，添加含有20 %牛 胎兒血清（616(：〇-61^製）之〇11£^1培養液11111(最終濃度10〇/〇 血清）。過夜培養後，與含有10%牛胎兒血清之DMEM培養 液3ml做培養基交換，37 °C、5 % C02條件下培養3日。 2 )淘洗皿之調製 使用表現載體pTMT-SRS45時，將包覆小白鼠抗人類 1L - 6抗體MT18(參照特開平第2-288898號）淘洗皿，依 Seed, B.. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA· ( 1 987 )84， 3365-33 69之方法予以調製。亦即，加入 50mM Tris - HCl(pH9.5)至小白鼠抗IL-6接受體抗體成10 // g/ml。如此所調製之抗體溶液3ml 加入直徑60mm之細胞 培養皿中，室溫下培養2小時。以〇· 15M NaCl 溶液洗淨3 次後，加入含有5 %牛胎兒血清、ImM EDTA、0· 02 % NaN3 之PBS隔離阻斷後用於下述之淘洗中。 使用pTMT-scFv時，調製之種類的淘洗皿。其一為以 可溶性 IL-6 接受體（SR344)(Yasukawa，K. et al·，J. Biochem.( 1 990 ) 1 08,673-676 )包覆著，其二為使用上述之 小白鼠抗IL-6接受體抗體包覆者。SR344以50mM Tris-HCl(pH9· 5)溶液調製成2 /zg/ml，調製與上述相同之 淘洗皿。使用陰性對照組（N e g a t i v e c ο n t r ο 1)之p C 0 S -1
2125-2578-pfl.ptc 第26頁 593679 案號 88107113 曰 修正 五、發明說明（24) 時，使用上述之小白鼠抗IL-6接受體抗體有包覆者。使用 陽性對照組之ΗΜ1. 24抗原蛋白質表現載體ρ3· 19時，使用 相對於ΗΜ1. 24抗原有包覆者。 3 )淘洗 以pCOS-1、pTMT-SR345轉移感染COS-7細胞後，以含 有1〇^£07八之？88剝下，含有5%牛胎兒血清之？88洗淨一 次後，懸浮於含有2m 1之15 %牛胎兒血清及0· 02 % NaN3之 P B S中，加到以小白鼠抗IL - 6接受體包覆之淘洗板中。 以pTMT-scFv轉移感染之COS-7細胞以3種方法進行淘 洗。方法一，將C0S-7細胞與上述相同剝下，以含有5 %牛 胎兒血清之pBS洗淨一次，懸浮於含2#g/ml之SR344及5% 牛胎兒血清及0· 02 % NaN3之500 // 1 PBS中，冰上培養1小 時。冰冷的PBS洗淨3次後，再懸浮於含有與scFv及SR344 有架構目的的0. 2mM交互連接分子 (Crosslinker)Bis(sulfosuccinimidyl)suberate(BS3 ； PIERCE製）及50mM Hepes(pH8.0)之pBS中，接著於冰上培 養30分鐘。加速1M Tris-HCl(pH8.0)使最終濃度成為 5 0mM，除去過剩之交互連接分子。細胞以pbs洗淨後，加 入包覆小白鼠抗I L-6接受體抗體到淘洗板中。方法二，與 SR344予培養過之C0S-7細胞不經交互連接分子處理，加入 包覆小白鼠接受體抗體之淘洗板中。方法三，C0S-7細胞 直接加入以SR344直接包覆之淘洗板中。冰上培養時間、 Tris-HCl促進、洗淨操作等皆與上述3種類方法相同。 HM1· 24抗原蛋白質表現載體ρ3· 19轉換感染之c〇s_7細 胞為，將相對於抗原之抗體（國際公開第9 8 -1 4 5 8 0號）加入
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第27頁 593679 -m一88ΜΠ3__年月 _ 五、發明說明（25) 包覆之淘洗板中’上述各種COS-7細胞在各各淘洗板中， 室溫下培養2小時後’以含有5 %牛胎兒血清及〇 · 〇2 % NaN3 之PBS ’ 3次緩慢洗淨後，使用含〇· 6 % sds及10mM EDTA之 溶液，進行由淘洗皿所結合細胞做質體之回收。以淘洗所 做之濃縮效果為所回收之質體DNA之1 / 5的量以電鍍法形質 導入大腸菌DH5a中，比較評估其出現之安比西林耐藥性菌 落數。其結果如圖3所示。 使用表現載體pTMT-SR345時，SR345-mgpIC較
SR3 4 5-mgpTMIC出現較多之菌落，確認其對膜結合蛋白質 不具特異性。另一方面，使用表現載體pTMT — scFv時，任 何淘洗方法皆出現SCFvigpTmic之菌落數較scFvigpi(： 為多，膜結合蛋白質為表現細胞所特異地濃縮。 用架構劑時，其選擇性更顯著。 以上結果顯示，機能性蛋白質（單鏈抗體）以融合 質在細胞表面上表現者，相較於認識抗體之單獨抗 部位以融合蛋白質表現者，更能回收編碼高的^ ^ 效性的膜結合蛋白質的cDNA。 ^ 般而言’淘洗若為多次反覆操作 提 性 因 的 :’但本貫施例中所示，在本發明令細 ： 此再進行多次之淘洗，得到編碼非：：：，的選擇性。 膜結合蛋白質之基因之選殖。 卞且回遠擇性 實施例5】使用人型二價單鏈Fv之融合 1 ·人型化PM1抗體二價單鏈Fv表現载體之二=構成
2125-2578-pfl.ptc 第28頁 5人型化PMi抗體之Fv為價單絲J t __________________________*--V 表現载體 593679
案號 88107113 五、發明說明（26) 之構成。具有二價之可變區之人型KPM1抗體單鏈 Fv(hPMl-BvGS3)為設計或由上述實施例2之人型化？|^1抗體 單鏈Fv2分子（Gl^Serh(序列編號：1)所形成以肽連接分 子形式。h Ρ Μ1 - B v G S 3之胺基酸序列及驗基序列以序列編 遽· 2 1表示。 表現載體pTMT-BvGS3之構成依下述為之。（Gly4Ser)3 所形成連接分子’編碼其c末端具人型化pMi抗體單鏈Fv的 基因，以PCR法增幅。使用後方引子之tmt—j(序列編號： 6)。另外前方引子BvGS3(序列編號：22)與編碼L鏈V區領 域之C末端之DNA雜交，且編碼連接分子之鹼基序列設計使 成具限制酶Sa I I認識部位。pcr為使用1 〇〇ng之pTMT-scFv 為鑄模DNA，與上述相同條件下進行，PCR生成物使用l 5 %低融點瓊脂糖凝膠予以精製。 所精製之PCR生成物以限制酶以！ ！消化後插入，選殖 載體 pBluescirpt II(stratagane 製）中。DNA 序列決定 後’含具有正確DNA序列之DNA片斷的質體以限制酶sa I I 消化後’得到編碼由（Gly4Ser)3所形成連接分子其末端中 所持有人型化PM1抗體單鏈FV的基因。接著，上述所得之 DNA片斷插入PTMT-scFv中，得到hPM卜BvGS3表現載體 pTMT-BvGS3。hPMl-BvGS3 表現載體PTMT-BvGS3 的構造模式 如圖4所示。 2·融合蛋白質hPMl-BvGS3表現載體之構成 表現載體hPMl - BvGS3中，編碼hPM卜BvGS3之CDNA的下 游中連結一部份之小白鼠gpl30cDNA，由hPM1-BvGS3及小 ^ ^gP1 30之部份領域來構成融合蛋白質表現系。融合蛋
2125-2578-pfl.ptc 第29頁 593679 __案號 88107113 五、發明說明（27) 年 月 日 修正 白質因連結gpl30之部份領域有所不同故製成2種類。其一 為連結G p 1 3 0之膜結合區與其連續的細胞内領域之分泌型 融合蛋白質（BvGS-mgTMIC)，其二為只連結gpi3〇之細胞内 領域之分泌型融合蛋白質（BvGSigpIC)。（BvGSigTMIC) 及（BvGS-mgpIC)使用各實施例3之（B)- 1)及2)中所製作完 成者，將此插入pTMT-BvGS3之Hind III-Notl部位，構成 膜結合型融合蛋白質表現載體pTMT-BvGS3 -mgpTMIC及分 泌型融合蛋白質表現載體pTMT-BvGS3-mgpIC。
【實施例6】連續（流體）細胞計數器所表現的解析 上述所構成之各種表現載體pTMT_BvGS、 pTMT-BvGS3-mgpIC、pTMT-BvGS3-mgpTMIC 以形質導入 C0S-7細胞中進行融合蛋白質的驟然表現，使用連續（流 體）細胞計數器（FACScan，Becton Dickinsonn公司製）對細 胞膜上表現進行解析。對所表現的解析以2種方法進行。
其一為對人型化PM-1抗體，以兔子多株抗體予以檢出，其 二為可溶型IL-6接受體存在下，以小白鼠抗人類IL-6接受 體MT-18來予以檢出。其結果可以確認，細胞膜上可明顯 地表現能認識可融型I L-6接受體之機能性形態之膜結合型 融合蛋白質BvGS-mgpTMIC。而且，只有轉換感染表現載體 pCOS-1者當成陰性對照體。 1 )C0S-7細胞之轉換感染 質體為使用轉換感染試藥組 (kit)FuGENETM6(Boehringer Mannheim 公司製），轉換感染 到COS—7中。
2125-2578-pfl.ptc 第30頁 593679 _案號88107113_年月曰 修正___ 五、發明說明（28) /Well(6Well平板）播中後，含10%牛胎兒血清之DMEM培養 液（018(：041^製）21111，在37°〇：，5%(：02之條件下過夜培 養。轉換感染當日，將6 β 1之FuGENETM6加入無血清之DMEM 培養液中。室溫下培養5分鐘後，與質體DNA 2 // g混合並 且在室溫下培養3日。 2)COS-7細胞之染色 上述之COS-7細胞，以含ImM EDTA之PBS剝離後，以含 5 %牛胎兒血清之PBS洗淨一回，並懸浮於50 # 1之FACS緩 衝液中。（2 %之牛胎兒血清及含有〇. 〇5 % NaN2 iPBS)，再 以下列2種方法染色。 A) 對於人型化PM-1抗體以兔子多株抗體來染色 上述之C0S-7細胞中添加對於人型化PM-1抗體以兔子 多株抗體2 /zg/反應，並在冰上培養30分鐘後，以lml之 FACS緩衝液洗淨2次，再懸浮於50 # 1之FACS緩衝液中。接 著’以FITC(Fluorescein Isothiocyanate)標示之山羊抗 兔子IgG(AMERICAN QUAREX製）2/zl/反應，甚至為區別死 細胞染色，故添加PI(pr〇pidium Iodide)2.5//g/反應， 避光，冰上培養30分鐘後，以lml之FACS緩衝液洗淨2次， 再懸浮於〇 · 5 m 1之F ACS緩衝液後，以連續（流體）細胞計數 器予以解析。 B) 由小白鼠抗IL-6接受體抗體MT-18來染色 上述之COS-7細胞中，添加可溶型IL-6接受體3/zg/反 應’在冰上培養4小時後，以lml之FACS緩衝液洗淨2次， 再懸浮於50 // 1之FACS緩衝液中。接著，添加小白鼠抗 IL — 6接受體抗體MT-18 2//g/反應，並在冰上培養30分鐘
2125.2578-pfLptc 第31頁 593679 修正 案號 88107113 五、發明說明（29) 後’以lml之FACS緩衝液洗淨2次，再懸浮於5〇 " 1之以以 緩衝液中。之後，FITC標示之山羊抗小白鼠IgG2b(大曰本 製藥製）2//1/反應’甚至為區別死細胞染色添加pi 2.5“ g/反應、避光’冰上培養30分鐘後，再懸浮於Q 5mii FACS緩衝液後’以連續（流體）細胞計數器予以解析。 3 )以連續（Μ體）細胞計數器所表現之解析 以？1及？8(：(?〇^3『(18〇&1^6〇展開之結果，可明白？1 所染色之細胞集團（死細胞）的存在。死細胞因屬非特異之 FITC染色，故妨害解析。因此，寄望於ρι無染色之細胞集 團，使只有此細胞集團成為解析之對象。 ” 相對於人型化PM-1抗體，以兔子多株抗體來染色之結 果，雖沒表現細胞膜上之分泌型蛋白fhPM1_BvGS3，但卻 表現最明顯的膜結合型融合蛋白質BvGS3_mgpTMIC。由 此，hPMl-BvGS3，具有膜貫通區2BvGS3 — mgpTMIC推測其 不被分泌，而阻塞於細胞膜上。但是另一方面，無關於 BvGS3-mgpIC是否為分泌型融合蛋白質，檢出表現其在細 胞膜上。此乃推測其原因恐怕是BvGS3_mgpIC其分子量大 小或構造’含維繫下游之mgpIC疏水性區域等，與BVGS3特 性上有差異之故。亦即，BvGS3 —mgpIC因其特性不同，故 較BvGS3無法迅速通過細胞膜，而須花更多的時間。其結 果表現’細胞膜上局部的量增多時，將抗原決定部位 (epi tope)向外推出者全為相對人型化pM—丨抗體之兔子多 株抗體所檢出之物。其結果如圖5所得示。 另一方面’以小白鼠抗^^接受體抗體MT-18來染 色’並無表現以相對於人型化PM-1抗體之兔子多諸抗體予
2125-2578-pfl.ptc 第32頁 593679 案號 88107113 i 月日_修正 五、發明說明（30) 以染色的結果相同之分泌型蛋白hPM1-BvGS，但卻表現最 顯著的膜結合型融合蛋白質BvGS3-mgpIMIC。雖然如此， 分泌型融合蛋白質BvGS3-mgpIC對於人型化PM抗體與兔子 多株抗體來染色的結果相異，幾乎在細胞膜上無表現。此 乃相較於膜結合型融合蛋白質BvGS3-mgpTMIC，其形成能 認谶可〉谷型I L - 6接受體的機能性構造，並在細胞膜上被表 現，分泌融合蛋白質BvGS3-mgpIC是屬細胞膜上局部存 在，其絕大多數不具可認識可溶型丨L —6接受體的機能性構 造。其結果如圖6所示。 以上由連續（流體）細胞計數器的解析結果看來，抗體 所認識之單抗原決定部位，以融合蛋白質形成表現時，分 泌型融合蛋白貝即使局部存在於細胞膜上，亦會選擇成偽 陽性（* 9 )，另一方面，在細胞表面上表現本發明之機能 性蛋白質（例單鏈抗體）為融合蛋白質形成時，顯示能夠選 殖編碼更高選擇性及高效率的膜結合型蛋白質的cDNA。 【實施例7】 1·人型化PM-1抗體單鏈fv之設計 為k咼選殖效率’設計3種類之單鏈F v及其二價單鏈 Fv。前述之人型化PM1抗體單鏈!^之構成之際，附加之 elbow區域（序列編號：5，第242位到256位之胺基酸序列） 中，因含有疏水性高之胺基酸殘基，為了安定地在細胞外 表現，於是設計3種類之人型化ΡΜι抗體單鏈以。亦即為要 喪失存在於C末端之疏水性區域，設計欠缺eib〇w區域之單 鏈FV，即shPMl( ΔΕΙΟ(序列編號：23)。另外，單鏈Fv之c 末端上附加有由分泌蛋白質由來之大分子結構，表現其安
2125-2578-pfl.ptc 593679 — 案號88107113_年月 曰 攸X * 五、發明說明（31) 疋性及表現率皆有提尚’人類k鍵恨常區或人類模髮#鏈 十亙常區外基因（exon)4(Dorai， H and Gillies s D.
Nucleic Acid Res·， 17,6412，1 98 9 )為密碼之胺基酸序 列’付加於單鏈Fv(序列編號：23)之C末端。而人類[^鏈值 常區中，第107位之胺基酸殘基本來是半胱氨酸 (C y s t i n e)，但本次使用絲氨酸（S e r i n e)殘基之取代物（序 列編號：2 4)。另外，對人類膜型//鏈怪常區外基因為密 碼之胺基酸序列，使用欠缺膜貫通區及細胞内領域之物 (序列編號：2 5 )。其單鏈F v之C末端所付加物分別是為 shPMl-Kappa(序列編號；27)。
2.shPMl(AEL)表現載體之構成， 編碼s h Ρ Μ1 ( △ E L )之基因以P C R法增幅。使用後方引子 EF-1(序列編號：28)及前方引子SCP-C2(序列編號：29)。 PCR為用l〇〇ng之pTMT-scFv為鑄模DNA，與上述相同條件下 進行，PCR生成物使用1 · 5 %低融點瓊脂糖凝膠予以精製。 又’前方引子SCP-C2為與編碼L鏈V區之C末端之DNA雜交， 且付加編碼限制酶Hind III、Not I認識部位及FLAG肽（序 列編號：1 0 )之鹼基序列。 所精製之PCR生成物以限制酶及Notl消化後，插入
psFLAG 載體中，得到shPMl( AEL)表現載體pTMT-shPMF。 接著與上述之實施例5相同之方法，得到具二價之可變 區，欠缺elbow區之單鏈Fv，shPMl(AEL)-BvGS3(序列編 號：30)表現載體pTMT-shPMl-BvGS3。 3. shPM-Fappa表現載體之構成 編碼人型化PM1抗體單鏈Fv(序列編號：23)及人類k鏈
2125-2578-pf1.ptc 第34頁 593679 一 —_案號 88107113_年 _9--- 五、發明說明（32) 恆常區（序列編號：24)所形成融合蛋白質的基因，以PCR 組合法（Assembly )予以構成。亦即，編碼人型化PM抗體之 單鏈Fv及人類k鏈恆常區之基因各以PCR法增幅後，以各各 基因所具有之互補性予以組合，由外側引子來將全長基因 增幅。 首先，編碼人類k鏈恆常區的基因以PCR法增幅。設計 使其與編碼後方引子Kappa 1 (序列編號：31)人類k鏈恆常 區之e 1 bow區及其隨後胺基酸序列（序列編號：24之第1 2位 Pro到21位之Gly)的鹼基序列相雜交。前方引子Kappa 2 (序列編號：3 2 )為編碼人類k鏈恆常區之C末端（序列編 號：24之第1 0 1位之Ser到第11 1位之Ser)的驗基相雜交， 且編碼限制酵素Hind III、Not I認識部位及FLAG(序列編 號：1 0 )之鹼基，設計成有2個終止密碼子的形態。又，使 用此引子，將原來的半胱氨酸殘基之序列編號：2 4之第 1 〇7位的胺基酸殘基以絲氨酸取代。PCR為與上述方法相同 條件下進行，並使用上述2種引子及為鑄模之人型化ΡΜι抗 體1^鏈表現載體—1^-?乂13(參照腳92 / 1 9 759外01^生成物則使 用1 · 5 %低融點瓊脂糖凝膠予以精製。 接著’編碼人型化PM1抗體單鏈FV之基因以同樣方式 增幅。PCR為與上述相同的條件下進行，並使用EF丨（序列 編號：28)為後方引子，SCP — K (序列編號：33)為前方引 子，而以pTMT-scFv為鑄模DNA。前方引子％卜κ為與編碼 序列編號：5中所示單鏈Fν之〇末端區的鹼基序列相雜交， 甚至利用PCR設計使成為具有增幅後之k鏈基因的5，末端互 補的驗基序列。以同樣方式精芻
第35頁 593679 案號 88107113 午 月日 修正 五、發明說明（33) 使用實施2-3 )中所示方法，將編- Kappa的全 長DNA片斷增幅。亦即，i00ng之上述各DNA片斷以一次PCR 組合後，各加入1 OOpmole之後方引子EF-1 (序列編號：28) 及前方引子Kappa 2(序列編號·· 32)，將全長之DNA片斷增 幅0 PCR生成物以1 · 5 %低融點瓊脂糖凝膠精製後，再以限 制酶EcoRI及Not I消化，插入pSFLAG載體中，得到 shPM-Kappa表現載體PTMT-shPMlF-K(圖7)。接著，以上述 貫施例5相同之方法，得到具有二價可變區之單鏈]pv，
shPM-Kappa-BvGS3(序列編號：34)表現載體 pTMT-shPMIFk-BvGS3 〇 , 4. shPMl-MCH4表現載體之構成 編碼人型化PM1抗體單鏈!^(序列編號：23)及人類# 鏈恆常區部份序列（序列編號：25)之融合蛋白質的基因依 PCR組合法予以構成。亦即，編碼人型化pM1抗體單鍵π及 人類#鏈恒常區部份序列的基因，分別一pCR法予以增幅 後，再以各別基因所具有之互補性予以組合，並由外曰側田引 子增幅全長之基因。 首 予以增 常區外 其具有 序列。 //鍵恒 制酶Hi 先 幅 基 人 前 常 nd
因 型 方 區 I
2125-2578-pfl.ptc 第36頁 編碼人類//鏈恆常區部份序列的基因以pcR法 後方引子MCH4-1(序列編號：35)與人類#鏈恆 (exon) 4之5’端之驗基序列相雜交，且設計使 化PM1抗體單鏈Fv(序列編號：23)之3，之驗美 引子MCH4-2· 1(序列編號：36)為與編碼人膜型 之細胞外區的鹼基序列相雜交，且設計使成限 I I認識部位。PCR為與^2種之引子及為⑽广 593679 案號 88107113 曰 修正 五、發明說明（34) 鑄模由人骨髓瘤（myeloma)細胞株CL-4細胞由來固定法所 調製之cDNA。PCR生成物以1 · 5 %低融點瓊脂糖凝膠予以精 製。 、 接著，編碼人型化PM1抗體單鏈Fv的基因，以相同方 式增幅。PCR為前述同樣條件下進行，以後方引子為 EF1(序列編號：28)、前方引子為SCP-Mu(序列編號： 37)，鑄模DNA為pTMT-scFv來使用。前方引子SCP-Mu為與 編碼序列編號23中所示單鏈Fv之C端區的鹼基序列相雜 交，再設計成P C R增幅之//鏈部份序列基因之.5 ’末端有互 補性之鹼基序列。以相同方法精製PCR生成物。 使用實施例2 - 3 )中所示方法，將編碼s h Ρ Μ1 - M C Η 4的全 長DNA片斷予以增幅。亦即，100ng之上述各DNA片斷以一 次P C R組合後’加入1 〇 〇 p m ο 1 e之後方弓丨子E F -1 (序列編號： 28)及前方引子MCH4-2· 2(序列編號·· 38)，將全長之DNA片 斷予以增幅。前方引子MCH4-2· 2與編碼上述由來增幅之人 膜型//鏈部份序列的鹼基序列之3 ’端相雜交，且將之設計 成編碼FLAG肽的鹼基序列，並具有2個終止密碼子及限制 酶Not I認識部位。 PCR生成物用1. 5 %低融點瓊脂糖凝膠精製後，以限制 酶EcoRI及Not I予以消化後，插入pSFLAG載體中，得到 shPMl-MCH4表現載體pTMT-shPMlF-MCH4。接著，以與上述 實施例同樣的方法，可得到具二價之可變區的單鏈F v、 shPMl -MCH4-BvGS3(序列編號：39)表現載體 pTMT-shPMIFM-BvGS3 。 【實施例8】使用shPMl - Kappa表現載體（圖7)依TMT法做
2125-2578-pfl.ptc 第37頁 593679 _案號88107113_年月 日修正 · 五、發明說明（35) STX561 cDNA庫之篩選 1. STX561 cDNA庫之製作 依小白鼠造血基質（stroma)細胞株，以常法調製 mRNA，再以此合成cDNA，在將之組入TMT表現載體 shPM卜Kappa中，製作STX561 cDNA庫。CDNA庫之製作為使 用 cDNA 合成試藥組（STRATAGENE 社製，cDNA synthesis kit)。基本上依照STRATAGENE社製cDNA合成試藥組之計晝 書來製作，但改良下列幾點。亦即，逆轉錄酶為使用 GIBC0-BRL社製之Superscript II，第一鏈合成時之引子 用Not I - dT 引子（Pharmacia Biotech 設製，1st strand cDNA synthesis kit付屬引子），cDNA之5’端上付加接合 器為Takara社之Hind ΙΙΙ-Sma I部份接合器，為大小分級 之柱狀層析則使用Pharmacia Biotech社製之Size sep 400 Spun Column 〇 具體之cDNA庫製法為以5 /zg之mRNA為起始，首先使用 3’ polyAtail 到Not I-dT primer(Pharmacia Biotech 社 製，lst strand cDNA synthesis 付屬弓丨子）再以逆轉錄 酶（GICO-BRL社製Superscript II)合成第一鏈。接著， 以D N A聚合酶合成第二鏈之後，將c D N A二端平滑末端化， 付加 Hind ΙΙΙ-Sma I(Takara 社製）《Hind III 及 Not I 將 cDNA之兩端切斷後，為排除〇· 5kb以下大小之cDNA片斷， 進行大小分級（Pharmacia Biotech 社製，Size sep 400 Spun Column)。將回收之cDNA組入TMT表現載體 shPMl-Kappa之Hind III-Not I部位，以電鑛法導入大腸 菌DH10B(GIBC0-BRL社製，Electro max 商品名DH10B)，
2125-2578-pfl.ptc 第38頁 593679 案號 88107113 曰 修正 五、發明說明（36) 製作STX561 cDNA 庫。 STX5 61 cDNA庫以1六約1 0 0 0 Clone分別灌注，其中2 穴（鶴編號：#Kappa_l，#Kappa-6)，全部200 Clone 以 TMT法予以篩選。 2.以淘洗法筛選STX cDNA庫 1 )C0S-7細胞之轉錄感染 由#Kappa-1及#Kappa_6穴所調製質體DNA各2 "g， 及使用 FuGENETM6(Boehringer Mannheim 社製），轉錄感染 C 0 S - 7細胞。 馨 即，轉錄感染前日，COS-7細胞以1 X 105細胞/穴（6穴 板）播種，以含10%牛胎兒血清之〇乂£^1培養液（016(：0-31^ 社製）2ml，在3 7 °C、5 % C02之條件下過夜培養。轉錄感 染當日6 # 1之FuGENETM6加入無血清之DMEM培養液0. lml 中，室溫下培養5分鐘後，與質體DΝΑ 2 # g混合，且在室 溫下培養15分鐘。接著，將此混合液加入上述之COS-7細 胞中，37 °C、5 % C02之條件下培養3日。 2 )淘洗皿之調製 包覆山羊抗小白鼠I gG抗體（大曰本製藥社製山羊抗小 白鼠 IgG(H+L 鏈））之淘洗皿，依Seed, B· et al.，Proc· Natl· Acad. Sci. USA· (1987)84· 3365-3369 之方法， 予以調製。亦即，將山羊抗小白鼠IgG抗體加入50mM之 Tris-HCl(pH9.5)中使成10//g/ml，如此調製所得之抗體 溶液3ml，加入直徑60mm之細胞培養皿中，室溫下培養3小 時。以0· 15M NaCl溶液洗淨3回後，加入含5 °/。牛胎兒血 清、ImM EDTA、0· 02 % NaN3之PBS、隔離阻斷後用於下述
2125-2578-pfl.ptc 第39頁 593679 案盤 88107113 年 月 曰 修正 五、發明說明（37) 淘洗中。 3 )淘洗 如前所述，轉移感染之COS-7細胞，以含imM之PBS剝 取’再以含5 %牛胎兒血清之ρ β s洗淨一回後，懸浮於5 〇 a 之FACS緩衝液（含2 %牛胎兒血清及〇· 〇5 % NaN3 iPBS)。 將2 /zg之可溶sIL-6加至細胞懸浮液中，冰上培養90 分鐘，接著，細胞以FACS緩衝液洗淨二回後，再懸浮於50 V 1之FACS緩衝液中，將丨· 5 之小白鼠抗IL —6接受體抗 體加入細胞懸浮液中，冰上培養3〇分鐘。細胞wFACS緩衝 液洗淨二回後，使其於含2mi 5 %之牛胎兒血清及〇· 〇2 % 之NaN3的PBS中，加入包覆山洋小白鼠，IgG抗體之淘洗板 中 〇 上述之各種C0S-7細胞在淘洗板上，室溫下約培養2小 時後，以含5%牛胎兒血清及〇·〇2%Ν3Ν3之PBS緩衝洗淨3 次後’再用 Hirts，solution(含 0.6%SDS 及 10mM EDTA 溶 液）’進行自淘洗皿中結合細胞中回收質體DNA。所回收之 質體DNA之1/2量以電鍍法形質導入大腸菌 DH10B(GIBC0 - BRL 社製，InterleukinO DH10B)40 //1 中， lml 之S0C培養基培養1小時後，將5〇 // 1以滴定量檢測器 (ti tercheck)取樣，播種於LB-安比西林（100 // Ι/ml)板 中。另一方面，所剩之5〇〇ml移至LB-安比西林（1〇〇 # g/ml )液體培養基中進行培養，過夜培養後，使用質體DNA 精製試藥組（QIAGEN社製，Plasmid-Maxi)調製質體DNA， 並於-20度下凍晶保存。 依上述所得質體DNA中各取l//g，用3//1
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__案號 88107113 五、發明說明（38)
FuGENETM6(Boehringer Mannheim 社製）再一次轉錄感染到 COS-7細胞中，與上述相同方法將第二次之淘洗及質體關八 的回收進行調製。 3 ·所彳于c D N A選殖之驗基序列及推測之胺基酸序列之解 析 以第1回CDNA及第2回之淘洗後之滴定量檢測用平板， 隨機地收集其菌落，各2πι1之LB-安比西林（1〇〇//1/ml)液 體培養基中培養後，調製質體DNA。接著，以 I的限制酶解析，選別具⑼.插入物之仿製體，進行5,側
i序二v上些鹼基序列及所推測胺基酸序列所解析之結 果丄用TMT法所做篩選，可選擇性地得到種種膜結 白質之基因。其結果如表一所示β 赏 m
2125-2578-pfl.ptc
593679
B 案號 88107113 五、發明說明（39) 表1 次淘洗 培養今名稱 (1000 dooe/pool) 解析之同本妇胞數 具联結合領域 之同本鈿炮數 内容(插入大小、胺基酸或基數、錤結合領域ft) kappa-1 11 祕隹隹•—隹—擊_隹每··· 1 — Cytochrome oxidase (0.75 kb, 44aa 91TM) •••••••••«•«a»········#······擊 lcappa-6 7 3 NADH-dchydrogcnasc (1.7 kb, 8Saa, 2ΓΜ) NADH-dchydrogcnasc (1.7 kb, 8Saa, 2TM) ATP-synthasc (0.85 kb, 42aa, 1TM) 2次淘洗 培養«名稱 (1000 d〇0€/pcoQ 解析之同本細胞數 具膜結合領域 之同本紅胞數 内容(插入λ小、胺基酸或基數、膜結合領域數） kappa-l 11 4 ATP-synthasc (0.85 kb, 42aa # 1TM) ATP-synlhasc (0.E5 kb, 42aa, 1TM) ATP-synthasc (0.85 kb, 42aa, 1TM) Cytochrome oxidase (0.75 kb, 44aa, 1TM) kappa-6 11 3 NADH-dchydrogcnasc (12 kbf 8laa, 2TM) NADH-dchydrogcnasc (3S kb, 5Saa f 2TM) PolyT(0.9kb, 35aaelTM) 由1次淘洗得到已知的膜結合型蛋白質、細胞色素氧 化酶（1選殖）、NADH-脫氫酶（2選殖）、ATp_熔渣酶 (cinderase)(l選殖）。另一方面，由2次淘洗得到膜結合 型蛋白質、細胞色素氧化酶（1選殖）、NADH—脫氫酶（2選 殖）、ATP-熔渣酶（cinderase)(3選殖）。上述皆為粒腺體
2125-2578-pfl.ptc 第42頁 之内膜中局部存在的膜結合型蛋白質。例如，Ατρ—熔渣酶 (cinderase)為1次膜貫通型、淘洗為2次膜貫通型、NAM &酉每H 5二欠M f if型蛋白質。這些結果可知，由ΤΜτ法 593679 — 案號 88107113___年月日_修正__^_ 五、發明說明（40) 不只有分離I型膜結合型蛋白質，亦可分離具複數膜貫通 區之蛋白質。 在2次淘洗時雖然得到具P 〇 1 y T序列之選殖，但此乃 含poly A之cDNA逆向插入的結果。p〇iy τ為疏水性之苯基 丙氨酸（phenyl alanine)所串聯並列之胺基酸序列所翻 譯，非常地富疏水性，故已被分離。 另外，在收集的選殖中所含膜結合型蛋白質的比率為 2次淘洗較1次淘洗為高。此乃表示，重覆淘洗的結果，膜 結合塑蛋白質能被選殖性地濃縮。 以上的結合顯示，在實際cDNA庫之筛選系中，TMT法 對具有I型膜結合蛋白質及複數膜貫通區之膜結合型蛋白 質之選殖是為一有效方法。 產業上利用的可能性 在細胞分泌過程中，細胞膜中蓄積之狀態或與融合蛋 白質之不自然構造、或胺基酸組成所凝集的狀態，皆可視 為構造上問題所引發抗體分子不易發揮抗原結合活行所 致。因此，如本發明中，例如以淘洗板製作抗體所認識之 抗原，再利用此點，可以選別僅有機能性的細胞表面上表 現抗體融合蛋白質的細胞。亦即，由本發明，可有效地排 除細胞表面上抗原結合活性低或不具有抗原結合活性之融 合蛋白質的細胞，並且提供非常選擇性地編碼細人 蛋白質的基因之選殖方法。 、…口
1/71 序列表
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI PHARMACEUTICAL C0.5 LTD. 中外製藥股份有限公司
<120> METHOD FOR GENE CLONING ‘新穎的基囡飾選方法
<130> C1-001DP1PCT <150> JP 1998-138652 <151〉 1998-05-20 <150〉 JP 1998-279876 <151> 1998-10-01 <160〉 39
<210> 1 <211〉 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220〉 593679 2/71 <223> Description of Artificial Sequence:Peptide Linker Sequence <400〉 1
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 2 <211> 1035 <212〉 DNA <213〉 Homo sapiens <220〉 <221〉 CDS <222> (1)..(1035) <400> 2 48 atg ctg gcc gtc ggc tgc gcg ctg ctg get gcc ctg ctg gcc geg ccg
Met Leu Ala Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Pro 15 10 15 96 gga gcg gcg ctg gcc cca agg ege tgc cct gcg cag gag gtg gca aga^
Gly Ala Ala Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gin Glu Val Ala Arg 20 25 30 ggc gtg ctg acc agt ctg cca gga gac age gtg act ctg acc tgc ccg
Gly Val Leu Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro 144 593679 3/71 35 40 45 ggg Sta gag ccg gaa gac aat gcc act gtt cac tgg gtg etc agg aag 192
Gly Val Glu Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys 50 55 60 ccg get gca ggc tee cac ccc age aga tgg get ggc atg gga agg agg 240
Pro Ala Ala Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg 65 70 75 80 ctg ctg ctg agg teg gtg cag etc cac gac tet gga aac tat tea tgc 288
Leu Leu Leu Arg Ser Val Gin Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys 85 90 95 tac egg gcc ggc ege cca get ggg act gtg cac ttg ctg gtg gat gtt 336
Tyr Arg Ala Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val 100 105 110 ccc ccc gag gag ccc cag etc tee tgc ttc egg aag age ccc etc age 384
Pro Pro Glu Glu Pro Gin Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser 115 120 125 — aat gtt gtt tgt gag tgg ggt cct egg age acc cca tee ctg aeg aca 432
Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr 130 135 140 593679 4/71 aag get gtg etc ttg gtg agg aag ttt cag aac agt ccg gee gaa gac 480
Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gin Asn Ser Pro Ala Glu Asp 145 150 155 160 ttc cag gag ccg tgc cag tat tee cag gag tee cag aag ttc tee tgc 528
Phe Gin Glu Pro Cys Gin Tyr Ser Gin Glu Ser Gin Lys Phe Ser Cys 165 170 175 cag tta gca gtc ccg gag gga gac age tet ttc tac ata gtg tee atg 576
Gin Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr lie Val Ser Met 180 185 190 tgc gtc gee agt agt gtc ggg age aag ttc age aaa act caa acc ttt 624
Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gin Thr Phe 195 200 205 cag ggt tgt gga ate ttg cag cct gat ccg cct gee aac ate aca gtc 672
Gin Gly Cys Gly lie Leu Gin Pro Asp Pro Pro Ala Asn lie Thr Val 210 215 220 act gee gtg gee aga aac ccc ege tgg etc agt gtc acc tgg caa gac~^ 720
Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gin Asp 225 230 235 240 ccc cac tee tgg aac tea tet ttc tac aga eta egg ttt gag etc aga 768
Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg 593679 5/71 245 250 255 tat egg get gaa egg tea aag aca ttc aca aca tgg atg gtc aag gac 816
Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp 260 265 270 864
etc cag cat cac tgt gtc ate cac gac gee tgg age ggc ctg agg cac Leu Gin His His Cys Val lie His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His 275 280 285 gtg gtg cag ett cgt gee cag gag gag ttc ggg caa ggc gag tgg age 912
Val Val Gin Leu Arg Ala Gin Glu Glu Phe Gly Gin Gly Glu Trp Ser 290 295 300 960
gag tgg age ccg gas gee atg ggc aeg cct tgg aca gaa tee agg agt Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser 305 310 315 320 cct cca get gag aac gag gtg tee acc ccc atg cag gca ett act act 1008
Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gin Ala Leu Thr Thr 325 330 335 ^ aat aaa gac gat gat aat att etc ttc 1035
Asn Lys Asp Asp Asp Asn lie Leu Phe 340 345 593679 6/71
<210〉 3 <211〉 40 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223〉 Description of Artificial Sequence: ”IL6R1”， an artificially synthesized primer sequence <400> 3 ttcgaattcc caccatgctg gccgtcggct gcgcgctgct 40
<210> 4 <211〉 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223〉 Description of Artificial Sequence: *IL6R2”， an artificially synthesized primer sequence <400> 4 ttcgaattcg aagagaatat tatcatcgtc tttatt 36 <210〉 5 <211> 768 593679 7/71
<212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <221> CDS <222> (1)·.(768) <220〉 <223> Description of Artificial Sequence: a designed single chain Fv gene sequence <400> 5 cog gtc caa ctg cag gag age ggt cca ggt ett gtg aga cct age cag 48
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin 15 10 15 acc ctg age ctg acc tgc acc gtg tet ggc tac tea att acc age gat 96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser lie Thr Ser Asp 2〇 25 30 cat gcc tgg age tgg gtt ege cag cca cct gga ega ggt ett gag tgg— 144
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp 35 4〇 45 att gga tac att agt tat agt gga ate aca acc tat aat cca tet etc 192 lie Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly lie Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu 593679 8/71 50 55 60 aaa tcc aga gtg aca atg ctg aga gac acc age aag aac cag ttc age 240
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser 65 70 75 80 ctg aga etc age age gtg aca gee gee gac acc geg gtt tat tat tgt 288
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga tec eta get egg act aeg get atg gac tac tgg ggt caa ggc 336
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110 a«c etc gtc aca gtc tec tea ggt ggt ggt ggt teg ggt ggt ggt ggt 384
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 teg ggt ggt ggc gga teg gac ate cag atg acc cag age cca age age 432
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 130 135 140 ~ ctg age gee age gtg ggt gac aga gtg acc ate acc tgt aga gee age 480
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser 145 150 155 160 593679 9/71 cag gac ate age agt tac ctg aat tgg tac cag cag aag cca gga aag 528
Gin Asp lie Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 165 170 175 576
get cca aag ctg ctg ate tac tac acc tee aga ctg cac tet ggt gtg
Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val 180 185 190 cca age aga ttc age ggt age ggt age ggt acc gac ttc acc ttc acc
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr 195 200 205 ate age age etc cag cca gag gac ate get acc tac tac tgc caa cag 672 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 210 215 220 720
ggt aac aeg ett cca tac aeg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa ate Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 225 230 235 240 aaa ega act gtg get gca cca tet gtc ttc ate ttc ccg cca tet gat-Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp 245 250 255 <210> 6 <211〉 32 593679 10/71
<212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: ^ΤΜΤΓ, an artificially synthesized primer sequence <400> 6 ggtgtcgact cccaggtcca actgcaggag ag 32
<210〉 7 <211〉 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223〉 Description of Artificial Sequence: *LINK1' an artificially synthesized primer sequence <400> 7 ctcgtcacag tctcctcagg tggtggtggt tc 一 32
<210> 8 <211〉 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>593679 11/71 <223〉 Description of Artificial Sequence: ”LINK3*, synthesized primer sequence <400> 8 gacatccaga tgacccagag cccaagcagc ctgagcgc
<210〉 9 <211〉 63 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220> <223〉 Description of Artificial Sequence: ”SCP-C”， synthesized primer sequence <400> 9 gctgaattct tattatttat cgtcatcgtc tttgtagtca agcttatcag gat <210> 10 <211> 9
<212> PRT an artificially 38 an artificially atggcgggaa 60 〜 63 593679 12/71 <400> 10
Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5
<210〉 11 <211〉 34 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220〉 artificially <223〉 Description of Artificial Sequence: ”LINK2' an synthesized primer sequence <400〉 11 34 aaccaccacc acctgaggag actgtgacga ggct
<210> 12 <211〉 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> artificially <223〉 Description of Artificial Sequence: ”LINK4' an synthesized primer sequence <400> 12 593679 13/71 aggctgcttg ggctctgggt catctggatg tccga 35
<210〉 13 <211〉 36 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223> Description of Artificial Sequence: ΜΤΜΤ2Λ, an artificially synthesized primer sequence <400> 13 atccgcggcc gcttattatt tatcgtcatc gtcttt 36
<210> 14 <211> 19 <212〉 PRT <400> 14
Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15 〜
Val Asp Ser <210> 15 593679 14/71
<211> 106 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223> Description of Artificial Sequence: ^S-FLAGr, an artificially synthesized oligonucleotide sequence <400> 15 as/ttcccacc atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt 60 cgactccgac tacaaagacg atgacgataa aggtaccgcg gccgcg 106
<210> 16 <211> 106 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223〉 Description of Artificial Sequence: *S-FLAG2”， an artificially synthesized oligonucleotide sequence ^ <400> 16 gatccgcggc cgcggtacct ttatcgtcat cgtctttgta gtcggagtcg acacctgtag 60 ctgttgctac caagaagagg atgatacagc tccatcccat ggtggg i〇6 593679 15/71 <210> 17 <211> 2995 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221〉 CDS <222> (29)..(2839) <400> 17 gaattccgga catctagagg cagcgaactt gtttccgatt catgctttat catttcttaa tttcgtatgt tgggaacatc cctgcaag atg tea gca cca agg att tgg eta
Met Ser Ala Pro Arg lie Trp Leu 1 5 geg caa get ttg ett ttt ttc etc acc act gaa tet ata ggt caa ett Ala Gin Ala Leu Leu Phe Phe Leu Thr Thr Glu Ser lie Gly Gin Leu 10 15 20 ttg gaa ccg tgt ggt tac ate tac cct gaa ttt cca gtt gtc cag ege
Leu Glu Pro Cys Gly Tyr lie Tyr Pro Glu Phe Pro Val Val Gin Arg 25 30 35 40 ggc teg aac ttc act gee att tgt gtg ctg aag gag geg tgt ctg cag 60 112 160 208 256 593679 16/71
Gly Ser Asn Phe Thr Ala lie Cys Val Leu Lys Glu Ala Cys Leu Gin 45 50 55 cat tac tac gtg aat gcc age tac ate gtg tgg aag acc aac cat get 304
His Tyr Tyr Val Asn Ala Ser Tyr lie Val Trp Lys Thr Asn His Ala 60 65 70 get gtt ccc agg gag cag gtc act gtc ate aac aga acc aeg tee agt 352
Ala Val Pro Arg Glu Gin Val Thr Val lie Asn Arg Thr Thr Ser Ser 75 80 85 gtc aeg ttc aca gac gtg gtc etc ccg age gtg cag etc acc tgc aac 400
Val Thr Phe Thr Asp Val Val Leu Pro Ser Val Gin Leu Thr Cys Asn 90 95 100 ate ctg tee ttt ggg cag ate gag cag aat gtg tat gga gtc acc atg 448 lie Leu Ser Phe Gly Gin lie Glu Gin Asn Val Tyr Gly Val Thr Met 105 110 115 120 ett tea ggc ttt cct cca gat aaa cct aca aat ttg act tgc att gtg 496
Leu Ser Gly Phe Pro Pro Asp Lys Pro Thr Asn Leu Thr Cys lie VaU 125 130 135 aat gag ggg aag aat atg ctg tgc cag tgg gac ccc gga agg gag act 544
Asn Glu Gly Lys Asn Met Leu Cys Gin Trp Asp Pro Gly Arg Glu Thr 140 145 150 593679 17/71 tac ctt gaa aca aac tac act ttg aaa tea gag tgg gca aca gag aag
Tyr Leu Glu Thr Asn Tyr Thr Leu Lys Ser Glu Trp Ala Thr Glu Lys 155 160 165 ttt cct gat tgc cag tea aag cat ggc act tea tgt atg gtc age tac
Phe Pro Asp Cys Gin Ser Lys His Gly Thr Ser Cys Met Val Ser Tyr 170 175 180 atg ccc acc tat tat gtc aac att gaa gtc tgg gtg gaa gca gag aat
Met Pro Thr Tyr Tyr Val Asn lie Glu Val Trp Val Glu Ala Glu Asn 185 190 195 200 gcc ett ggg aag gtc tcc tea gag tet ate aat ttt gac ccc gtg gat
Ala Leu Gly Lys Val Ser Ser Glu Ser lie Asn Phe Asp Pro Val Asp 205 210 215 aaa gtg aaa ccc acc cca cca tat aat tta tea gtg acc aac tea gaa
Lys Val Lys Pro Thr Pro Pro Tyr Asn Leu Ser Val Thr Asn Ser Glu 220 225 230 gaa tta tec agt ata tta aag eta tea tgg gtc agt tea ggg ctg ggc
Glu Leu Ser Ser lie Leu Lys Leu Ser Trp Val Ser Ser Gly Leu Gly 235 240 245 ggt ett tta gat eta aag tet gac ate caa tat agg acc aaa gat gcc 593679 18/71
Gly Leu Leu Asp Leu Lys Ser Asp lie Gin Tyr Arg Thr Lys Asp Ala 250 255 260 tea act tgg ate cag gtc cct ett gaa gat aca atg tet cct ega act 928
Ser Thr Trp lie Gin Val Pro Leu Glu Asp Thr Met Ser Pro Arg Thr 265 270 275 280 tcc ttc act gtg cag gac etc aag cct ttt aca gaa tat gtg ttt agg 976
Ser Phe Thr Val Gin Asp Leu Lys Pro Phe Thr Glu Tyr Val Phe Arg 285 290 295 ate egg tec att aag gac agt ggg aag ggc tac tgg agt gac tgg agt 1024 lie Arg Ser lie Lys Asp Ser Gly Lys Gly Tyr Trp Ser Asp Trp Ser 300 305 310 gag gag get agt ggg acc aca tac gaa gac aga cca tcc aga cca cca 1072
Glu Glu Ala Ser Gly Thr Thr Tyr Glu Asp Arg Pro Ser Arg Pro Pro 315 320 325 agt ttc tgg tat aag aca aat cca tcc cat ggg cag gaa tat aga tet 1120
Ser Phe Trp Tyr Lys Thr Asn Pro Ser His Gly Gin Glu Tyr Arg Ser^ 330 335 340 gta egg etc ata tgg aag gca ctg cct ett tet gaa gee aat ggg aaa 1168
Val Arg Leu lie Trp Lys Ala Leu Pro Leu Ser Glu Ala Asn Gly Lys 345 350 355 360 593679 19/71 ate ttg gat tat gaa gtg att ett aeg cag tea aag tee gtc tea caa 1216
He Leu Asp Tyr Glu Val lie Leu Thr Gin Ser Lys Ser Val Ser Gin 365 370 375 acg tac aca gtc act ggc aca gag ctg acc gtg aat etc acc aat gac 1264
Thr Tyr Thr Val Thr Gly Thr Glu Leu Thr Val Asn Leu Thr Asn Asp 380 385 390 ege tat gtc geg tet eta gca gca aga aac aag gtg ggc aaa tea get 1312
Arg Tyr Val Ala Ser Leu Ala Ala Arg Asn Lys Val Gly Lys Ser Ala 395 400 405 gca get gtc etc acc ate ccc age ccc cac gtc aca get get tat tet 1360
Ala Ala Val Leu Thr lie Pro Ser Pro His Val Thr Ala Ala Tyr Ser 410 415 420 gta gtg aat ett aaa gca ttt cca aaa gat aac ctg etc tgg gtg gaa 1408
Val Val Asn Leu Lys Ala Phe Pro Lys Asp Asn Leu Leu Trp Val Glu 425 430 435 440 tgg aca cct cca cct aaa ccc gtg age aag tac ate tta gag tgg tgt 1456
Trp Thr Pro Pro Pro Lys Pro Val Ser Lys Tyr lie Leu Glu Trp Cys 445 450 455 1504 gtg ttg tea gag aac gca ccc tgt gtt gaa gac tgg cag cag gaa gae 593679 20/71
Val Leu Ser Glu Asn Ala Pro Cys Val Glu Asp Trp Gin Gin Glu Asp 460 465 wo get acc gtg aat egg acc cac ttg aga gga cgc etc ctg gag age aag 1552
Ala Thr Val Asn Arg Thr His Leu Arg Gly Arg Leu Leu Glu Ser Lys 475 480 485 tgc ts/t caa ate aca gta act ccc gta ttc gee aeg ggg ccc gga ggc 1600
Cys Tyr Gin lie Thr Val Thr Pro Val Phe Ala Thr Gly Pro Gly Gly 490 495 500 tet gag tee ttg aag geg tac etc aaa caa gee get cct gee aga gga 1648
Ser Glu Ser Leu Lys Ala Tyr Leu Lys Gin Ala Ala Pro Ala Arg Gly 505 510 515 520 ccg act gtt egg aca aag aaa gtg ggg aaa aat gaa get gtc tta geg 1696
Pro Thr Val Arg Thr Lys Lys Val Gly Lys Asn Glu Ala Val Leu Ala 525 530 535 tgg gac cag att cct gtg gac gac cag aat ggc ttc att aga aac tac 1744
Trp Asp Gin lie Pro Val Asp Asp Gin Asn Gly Phe lie Arg Asn Tyr- 540 545 550 tee ata tet tac aga acc age gtg gga aag gag atg gtt gtg cat gtg 1792
Ser lie Ser Tyr Arg Thr Ser Val Gly Lys Glu Met Val Val His Val 555 560 565 593679 21/71 gat tct tct cac acg gag tac acg ctg tcc tct ctg agt agt gat acg 1840
Asp Ser Ser His Thr Glu Tyr Thr Leu Ser Ser Leu Ser Ser Asp Thr 570 575 580 ttg tac atg gtc cga atg gcc gcg tac aca gat gaa ggt ggg aaa gat 1888
Leu Tyr Met Val Arg Met Ala Ala Tyr Thr Asp Glu Gly Gly Lys Asp 585 590 595 600 ggg ccg gaa ttc act ttt aca aca cca aag ttc get caa gga gaa ata 1936
Gly Pro Glu Phe Thr Phe Thr Thr Pro Lys Phe Ala Gin Gly Glu lie 605 610 615 gaa gcc ata gtc gtg cct gtg tgc tta gcc ttc etc ctg aca acc ctg 1984
Glu Ala lie Val Val Pro Val Cys Leu Ala Phe Leu Leu Thr Thr Leu 620 625 630 ctg ggc gtc ttg ttc tgc ttt aac aaa cga gac eta att aaa aaa cac 2032
Leu Gly Val Leu Phe Cys Phe Asn Lys Arg Asp Leu lie Lys Lys His 635 640 645 ate tgg cct aat gtt cct gat cct tcc aag agt cat att gcc cag tgg 2080 lie Trp Pro Asn Val Pro Asp Pro Ser Lys Ser His lie Ala Gin Trp 650 655 660 2128 tea cct cac acc ccc cca agg cac aat ttt aac tcc aaa gat caa atg 593679 22/71
Ser Pro His Thr Pro Pro Arg His Asn Phe Asn Ser Lys Asp Gin Met 665 670 675 680 tac teg gac ggc aat ttc act gat gta age gtt gtg gaa ata gaa gca 2176
Tyr Ser Asp Gly Asn Phe Thr Asp Val Ser Val Val Glu lie Glu Ala 685 690 695 aac aac aag aag cct tgt cca gat gac ctg aag tcc gtg gac ctg ttc 2224
Asn Asn Lys Lys Pro Cys Pro Asp Asp Leu Lys Ser Val Asp Leu Phe 700 705 710 aag aag gag aaa gtg 3gt aca gaa ggg cac age agt ggc ate ggg ggc 2272
Lys Lys Glu Lys Val Ser Thr Glu Gly His Ser Ser Gly lie Gly Gly 715 720 725 tet tea tgc atg tcc tcc tcc agg ccc age ate tcc age aac gag gag 2320
Ser Ser Cys Met Ser Ser Ser Arg Pro Ser lie Ser Ser Asn Glu Glu 730 735 740 aat gag tet get cag age acc gcc age aeg gtc gag tac tcc act gtg 2368
Asn Glu Ser Ala Gin Ser Thr Ala Ser Thr Val Glu Tyr Ser Thr Val·- 745 750 755 760 gtg cac age ggc tac agg cac cag gtc ccg tcc gtg caa gtg ttc tea 2416
Val His Ser Gly Tyr Arg His Gin Val Pro Ser Val Gin Val Phe Ser 765 770 775 593679 23/71 agg tcc gag tcc acc cag ccc ctg eta gac teg gag gag egg cea gaa 2464
Arg Ser Glu Ser Thr Gin Pro Leu Leu Asp Ser Glu Glu Arg Pro Glu 780 785 790 gac ctg cag ctg gtg gat agt gta gac ggt ggg gat gag atc ttg ccc 2512
Asp Leu Gin Leu Val Asp Ser Val Asp Gly Gly Asp Glu lie Leu Pro 795 . 800 805 agg caa ccg tat ttc aag cag aac tgc a^t cag ect gaa gcc tgt cca 2560
Arg Gin Pro Tyr Phe Lys Gin Asn Cys Ser Gin Pro Glu Ala Cys Pro 810 815 820 gag att tea cat ttt gaa agg tea aac cag gtt ttg tcc ggc aat gag 2608
Glu lie Ser His Phe Glu Arg Ser Asn Gin Val Leu Ser Gly Asn Glu 825 830 835 840 gag gat ttt gtc aga ctg aag cag cag cag gtt tea gat cac att tet 2656
Glu Asp Phe Val Arg Leu Lys Gin Gin Gin Val Ser Asp His lie Ser 845 850 855 cag ccc tat gga tcc gag caa egg agg ctg ttt cag gaa ggc tet aca 2704
Gin Pro Tyr Gly Ser Glu Gin Arg Arg Leu Phe Gin Glu Gly Ser Thr 860 865 870 2752 geg gat get ett ggc aeg ggg get gat gga cag atg gag aga ttt gaa 593679 24/71
Ala Asp Ala Leu Gly Thr Gly Ala Asp Gly Gin Met Glu Arg Phe Glu 875 880 885 2800 2849 2909 2969 2995 tct gtt gga atg gag acc aca att gat gaa gaa att ccc aaa agt tac
Ser Val Gly Met Glu Thr Thr lie Asp Glu Glu lie Pro Lys Ser Tyr 890 895 900 ttg cca cag act gta aga caa ggt ggc tac atg ccg cag tgaaggactg
Leu Pro Gin Thr Val Arg Gin Gly Gly Tyr Met Pro Gin 905 910 915 gctcctgaac ttcagcagga actgcaaaat aaagctaaag acgagtggct tcagatgaga aacagtcctc actccctgaa gataggcatt gcctctaagg acaaagtcac acctgggccg tctccattcc agagtagctg gaattc
<210> 18 <211> 27 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence -<220> <223> Description of Artificial Sequence: ^ingpr, an artificially synthesized primer sequence 593679 25/71 <400〉 18 27 cccaagcttg aattcacttt tacaaca
<210〉 19 <211〉 29 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223〉Description of Artificial Sequence: 55mgp3”，an artificially synthesized primer sequence <400> 19 tttgcggccg cgaattccag ctactctgg 29
<210〉 20 <211〉 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉 一 <223〉 Description of Artificial Sequence: ”mgp2”， an artificially synthesized primer sequence <400〉 20 33 cccaagcttg aattcaaaaa acacatctgg ctt 593679 26/71
<210〉 21 <211〉 1662 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <221〉 CDS <222> (11)..(1648) <220〉 <223〉Description of Artificial Sequence: ” hPMl-BvGS3 ' a designed single chain Fv gene sequence <400> 21 gaattccacc atg gga tgg age tgt ate ate etc ttc ttg gta gca aca 49
Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr 1 5 10 get aca ggt gtc gac tcc cag gtc caa ctg cag gag age ggt cca ggt 97
Ala Thr Gly Val Asp Ser Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly^ 15 20 25 ett gtg aga cct age cag acc ctg age ctg acc tgc acc gtg tet ggc 145
Leu Val Arg Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly 30 35 40 45 193593679 27/71 tac tea att acc age gat cat gee tgg age tgg gtt cgc cag cca cct Tyr Ser lie Thr Ser Asp His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro 50 55 60 gsa ega ggt ett tgg att gga tac att agt tat gga ate aca Gly Arg Gly Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly lie Thr 65 70 75 acc tat aat cca tet etc aaa tee aga gtg aca atg ctg aga gac acc Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr 80 85 90 4 age aag aac cag ttc age ctg aga etc age age gtg aca gee gee gac Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp 95 100 105 acc geg gtt tat tat tgt gca aga tee eta get egg act aeg get atg Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met 110 115 120 125 gac tac tgg ggt caa ggc age etc gtc aca gtc tee tea ggt ggt ggt Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 130 135 140 241 289 337 385 433 ggt teg ggt ggt ggt ggt teg ggt ggt ggc gga teg gac ate cag atg 481 593679 28/71
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Gin Met 145 150 155 acc cag age cca age age ctg age gee age gtg ggt gac aga gtg acc 529
Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 160 165 170 ate acc tgt aga gee age cag gac ate age agt tac ctg aat tgg tac 577— lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr 175 180 185 cag cag aag cca gga aag get cca aag ctg ctg ate tac tac acc tee 625
Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Tyr Thr Ser 190 195 200 205 aga ctg cac tet ggt gtg cca age aga ttc age ggt age ggt age ggt 673
Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 acc gac ttc acc ttc acc ate age age etc cag cca gag gac ate get 721
Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp lie Ala- 225 230 235 acc tac tac tgc caa cag ggt aac aeg ett cca tac aeg ttc ggc caa 769
Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin 240 245 250 593679 29/71 ggg acc aag gtg gaa ate aaa tet aga ggt ggt ggt ggt teg ggt ggt Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 255 260 265 ggt ggt teg ggt ggt ggc gga teg gtc gac tee cag gtc caa ctg cag Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Asp Ser Gin Val Gin Leu Gin 270 275 280 285 gag age ggt cca ggt ett gtg aga cct age cag acc ctg age ctg acc Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr 290 295 300 tgc acc gtg tet ggc tac tea att acc age gat cat gee tgg age tgg Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser lie Thr Ser Asp His Ala Trp Ser Trp 305 310 315 gtt ege cag cca cct gga ega ggt ett gag tgg att gga tac att agt Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Ser 320 325 330 tat agt gga ate aca acc tat aat cca tet etc aaa tee aga gtg aca Tyr Ser Gly lie Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr 335 340 345 817 865 913 961 1009 1057 atg ctg aga gac acc age aag aac cag ttc age ctg aga etc age age 1105 593679 30/71 Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser 350 355 360 365 gtg aca gcc gcc gac acc gcg gtt tat tat tgt gca aga tcc eta get Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala 370 375 380 egg act aeg get atg gac tac tgg ggt caa ggc age etc gtc aca gtc Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Ser Leu Val Thr Val 385 390 395 tcc tea ggt ggt ggt ggt teg ggt ggt ggt ggt teg ggt ggt ggc gga Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 400 405 410 teg gac ate cag atg acc cag age cca age age ctg age gcc age gtg Ser Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 415 420 425 ggt gac aga gtg acc ate acc tgt aga gcc age cag gac ate age agt Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Ser Sep- 430 435 440 445 tac ctg aat tgg tac cag cag aag cca gga aag get cca aag ctg ctg Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 1153 1201 1249 1297 1345 450 455 460 1393 593679 31/71 ate tac tac acc tee aga ctg cac tet ggt gtg cca age aga ttc age lie Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 465 470 475 ggt age ggt age ggt acc gac ttc acc ttc acc ate age age etc cag Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin 480 485 490 cca gag gac ate get acc tac tac tgc caa cag ggt aac aeg ett cca Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Asn Thr Leu Pro 495 500 505 tac aeg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa ate aaa ega act gtg get Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala 510 515 520 525 1441 1489 1537 1585 gca cca tet gtc ttc ate ttc ccg cca tet gat aag ett gac tac aaa 1633
Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Lys Leu Asp Tyr Lys 530 535 540 gac gat gac gat aaa taataagegg ccgc Asp Asp Asp Asp Lys 545 1662 <210> 22 593679 32/71
<211〉 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223〉 Description of Artificial Sequence: ”BvGS3”3 an artificially synthesized primer sequence <400> 22 ggagtcgacc gatccgccac cacccgaacc accaccaccc gaaccaccac cacctttgat 60 ttccaccttg gt 72
<210〉 23 <211〉 780 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉
<221〉 CDS <222> (1)..(780) 〜 <220〉 <223> Description of Artificial Sequence: Λ shPMl(AEL)w,a designed single chain Fv gene sequence 48593679 33/71 <400> 23 atg gga tgg age tgt ate ate etc ttc ttg gta gca aca get aca ggt Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15 gtc gac tee cag gtc caa ctg cag gag age ggt cca ggt ett gtg aga Val Asp Ser Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg 20 25 30 cct age cag acc ctg age ctg acc tgc acc gtg tet ggc tac tea att Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser lie 35 40 45 acc age gat cat gee tgg age tgg gtt ege cag cca cct gga ega ggt Thr Ser Asp His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly 50 55 60 ett ga^ tgg att gga tac att agt tat agt gga ate aca acc tat aat Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly lie Thr Thr Tyr Asn 65 70 75 80 cca tet etc aaa tee aga gtg aca atg ctg aga gac acc age aag aac Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn 85 90 95 96 144 192 240 288 cag ttc age ctg aga etc age age gtg aca gee gee gac acc geg gtt 336 593679 34/71
Gin Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tat tgt gca aga tcc eta get egg act aeg get atg gac tac tgg 384
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp 115 120 125 ggt caa ggc age etc gtc aca gtc tec tea ggt ggt ggt ggt teg ggt „ 432
Gly Gin Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 ggt ggt ggt teg ggt ggt ggc gga teg gac ate cag atg acc cag age 480
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Gin Met Thr Gin Ser 145 150 155 160 cca age age ctg age gee age gtg ggt gac aga gtg acc ate acc tgt 528
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys 165 170 175 aga gee age cag gac ate age agt tac ctg aat tgg tac cag cag aag 576
Arg Ala Ser Gin Asp lie Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys^- 180 185 190 cca gga aag get cca aag ctg ctg ate tac tac acc tec aga ctg cac 624
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His 195 200 205 672593679 35/71 tct ggt gtg cca age aga ttc age ggt age ggt age ggt acc gac ttc Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 210 215 220 acc ttc acc ate age age etc cag cca gag gac ate get acc tac tac Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr 225 230 235 240 tgc caa cag gga aat act tta cca tac aeg ttc ggc caa ggg acc aag Cys Gin Gin Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys 245 250 255 720 768 gtg gaa ate aaa Val Glu lie Lys 260 780 <210〉 24 <211〉 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220〉 <221〉 CDS <222> (1)..(321) 593679 36/71 <400> 24 cga act gtg get gca cca tet gtc ttc ate ttc ccg cca tet gat gag Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 15 10 15 cag ttg aaa tet gga act gee tet gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 tat ccc aga gag gee aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gee etc caa Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45 teg ggt aac tee cag gag agt gtc aca gag cag gac age aag gac a^c Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 acc tac age etc age age acc ctg aeg ctg age aaa gca gac tac gag Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 δα- aaa cac aaa gtc tac gee tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg age teg Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 48 96 144 192 240 85 90 95 288 321593679 37/71 ccc gtc aca aag age ttc aac agg gga gag tet Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser 100 105 <210〉 25 <211> 363 <212> DNA <213〉 Homo sapiens <220〉 <221〉 CDS <222> (1)..(363) <400> 25 48 gtg gcc ctg cac agg ccc gat gtc tac ttg ctg cca cca gcc egg gag
Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu 15 10 15 96 cag ctg aac ctg egg gag teg gee acc ate aeg tgc ctg gtg aeg ggc
Gin Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr lie Thr Cys Leu Val Thr Gly- 20 25 30 ttc tet ccc geg gac gtc ttc gtg cag tgg atg cag agg ggg cag ccc
Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gin Trp Met Gin Arg Gly Gin Pro 35 40 45 144 192593679 38/71 ttg tcc ccg gag aag tat gtg acc age gcc cca atg cct gag ccc cag
Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gin 50 55 60 240 gcc cca ggc egg tac ttc gcc cac age ate ctg acc gtg tee gaa gag
Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser lie Leu Thr Val Ser Glu Glu 65 70 75 80 288 gaa tgg aac aeg ggg gag acc tac acc tgc gtg gcc cat gag gcc ctg
Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Ala His Glu Ala Leu 85 90 95 336 ccc aac agg gtc acc gag agg acc gtg gac aag tee acc gag ggg gag
Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Glu Gly Glu 100 105 110 363 gtg age gcc gac gag gag ggc ttt gag
Val Ser Ala Asp Glu Glu Gly Phe Glu 115 120
<210〉 26 <211> 1101 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220> <220>593679 39/71
<221〉 CDS <222> (1)..(1101) <220〉 <223〉Description of Artificial Sequence: * shPMl-Kappa 'a designed single chain Fv gene sequence <400> 26 atg gga tgg age tgt ate ate etc ttc ttg gta gca aca get aca ggt 48
Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15 gtc gac tcc cag gtc caa ctg cag gag age ggt cca ggt ett gtg aga 96
Val Asp Ser Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg 20 25 30 cct age cag acc ctg age ctg acc tgc acc gtg tet ggc tac tea att 144
Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser lie- 35 40 45 acc age gat cat gcc tgg age tgg gtt ege cag cca cct gga ega ggt 192
Thr Ser Asp His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly 50 55 60 240593679 40/71 ctt gag tgg att gga tac att agt tat agt gga ate aca acc tat aat Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly lie Thr Thr Tyr Asn 65 70 75 80 cca tet etc aaa tcc aga gtg aca atg ctg aga gac acc age aag aac Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn 85 一90 95 cag ttc age ctg aga etc age age gtg aca gee gee gac acc geg gtt Gin Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tat tgt gca aga tec eta get egg act aeg get atg gac tac tgg Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp 115 120 125 ggt caa ggc age etc gtc aca gtc tec tea ggt ggt ggt ggt teg ggt Gly Gin Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 ggt ggt ggt teg ggt ggt ggc gga teg gac ate cag atg acc cag age Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Gin Met Thr Gin Ser 145 150 155 160 288 336 384 432 480 cca age age ctg age gee age gtg ggt gac aga gtg acc ate acc tgt 528 593679 41/71
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys 165 170 175 aga gcc age cag gac ate age agt tac ctg aat tgg tac cag cag aag Arg Ala Ser Gin Asp lie Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys 180 185 190 cca gga aag get cca aag ctg ctg ate tac tac acc tcc aga ctg cac Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His 195 200 205 tet ggt gtg cca age aga ttc age ggt age ggt age ggt acc gac ttc Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly .Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 210 215 220 acc ttc acc ate age age etc cag cca gag gac ate get acc tac tac Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr 225 230 235 240 tgc caa cag gga aat act tta cca tac aeg ttc ggc caa ggg acc aag Cys Gin Gin Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys- 245 250 255 gtg gaa ate aaa ega act gtg get gca cca tet gtc ttc ate ttc ccg Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro 576 624 672 720 768 260 265 270 816 864593679 42/71 cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg
Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 275 280 285 912 ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp 290 295 300 960 aac gcc etc caa teg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac
Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp 305 310 315 320 1008 age aag gac age acc tac age etc age age acc ctg aeg ctg age aaa
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 325 330 335 1056 gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin 340 345 350 ggc ctg age teg ccc gtc aca aag age ttc aac agg gga gag tct
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser 355 360 365 1101 593679 43/71
<210> 27 <Z11> 1143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <221〉 CDS <222> (1)..(1143) <220> <223〉Description of Artificial Sequence: ” shPMl-MCH4'a designed single chain Fv gene sequence <400> 27 atg gga tgg age tgt ate ate etc ttc ttg gta gca aca get aca ggt 48
Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15 gtc gac tcc cag gtc caa ctg cag gag age ggt cca ggt ett gtg aga 96
Val Asp Ser Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg- 20 25 30 cct age cag acc ctg age ctg acc tgc acc gtg tet ggc tac tea att 144
Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser lie 35 40 45 192593679 44/71 acc age gat cat gee tgg age tgg gtt ege cog cca cct gga ega ggt Thr Ser Asp His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly 50 55 60 ett gag tgg att gga tac att agt tat agt gga ate aca acc tat aat Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly lie Thr Thr Tyr Asn 65 70 ~ 75 80 cca tet etc aaa tee aga gtg aca atg ctg aga gac acc age aag aac Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn 85 90 95 cag ttc age ctg aga etc age age gtg aca gee gee gac acc geg gtt Gin Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tat tgt gca aga tee eta get egg act aeg get atg gac tac tgg Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp 115 120 125 ggt caa ggc age etc gtc aca gtc tee tea ggt ggt ggt ggt teg ggt Gly Gin Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 240 288 336 384 432 ggt ggt ggt teg ggt ggt ggc gga teg gac ate cag atg acc cag age 480 593679 45/71 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Gin Met Thr Gin Ser 145 150 155 160 cca age age ctg age gcc age gtg ggt gac aga gtg acc ate acc tgt Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys 165 170 175 aga gcc age cag gac ate age agt tac ctg aat tgg tac cag cag aag Arg Ala Ser Gin Asp lie Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys 180 185 190 528 576 cca gga aag get cca aag ctg ctg ate tac tac acc tee aga ctg cac Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His 195 200 205 tet ggt gtg cca age aga ttc age ggt age ggt age ggt acc gac ttc Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 210 215 220 acc ttc acc ate age age etc cag cca gag Sac ate get acc tac tac Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr- 225 230 235 240 tgc caa cag gga aat act tta cca tac aeg ttc ggc caa ggg acc aag Cys Gin Gin Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys 245 250 255 624 672 720 768 816593679 46/71 gtg gaa ate aaa gtg gee ctg cac agg ccc gat gtc tac ttg ctg cca Val Glu lie Lys Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro 260 265 270 cca gee egg gag ca^ ctg aac ctg egg gag teg gee acc ate aeg tgc Pro Ala Arg Glu Gin Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr lie Thr Cys 275 280 285 ctg gtg aeg ggc ttc tet ccc geg gac gtc ttc gtg cag tgg atg cag Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gin Trp Met Gin 290 295 300 agg ggg cag ccc ttg tee ccg gag aag tat gtg acc age gee cca atg Arg Gly Gin Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met 305 310 315 320 cct gag ccc cag gee cca ggc egg tac ttc gee cac age ate ctg acc Pro Glu Pro Gin Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser lie Leu Thr 325 330 335 gtg tee gaa gag gaa tgg aac aeg ggg gag acc tac acc tgc gtg gee Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Ala 340 345 350 864 912 960 1008 1056 cat gag gee ctg ccc aac agg gtc acc gag agg acc gtg gac aag tee 1104 593679 47/71
His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser 355 360 365 acc gag ggg gag gtg age gcc gac gag gag ggc ttt gag 1143
Thr Glu Gly Glu Val Ser Ala Asp Glu Glu Gly Phe Glu 370 375 380
<210〉 28 <211〉 18 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223〉 Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 28 cagacagtgg ttcaaagt 18 <210〉 29 <211〉 107
<212> DNA <213〉 Artificial Sequence <220> <220>593679 48/71 <223〉 Description of Artificial Sequence: ”SCP-C2”，aii artificially synthesized primer sequence <400> 29
aaagcggccg cttattattt atcgtcatcg tctttgtagt ctgaagcttt gatttccacc 60 ttggtccctt ggccgaacgt gtatggtaaa gtatttccct gttggca 107 <210〉 30 <211〉 1557 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <221〉 CDS <222> (1)·.(1557) <220> <223〉 Description of Artificial Sequence: 55 shPMl(AEL)-BvGS3”，a-designed single chain Fv gene sequence <400> 30 atg gga tgg age tgt ate ate etc ttc ttg gta gca aca get aca ggt 48 593679 49/71
Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15 gtc gac tcc cag gtc caa ctg cag gag age ggt cca ggt ett gtg aga 96
Val Asp Ser Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg 20 25 30 cct age cag acc ctg sgc ctg acc tgc acc gtg tet ggc tac tea att 144
Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser lie 35 40 45 acc age gat cat gcc tgg age tgg gtt ege cag cca cct gga ega ggt 192
Thr Ser Asp His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly 50 55 60 ett gag tgg att gga tac att agt tat agt gga ate aca acc tat aat 240
Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly lie Thr Thr Tyr Asn 65 70 75 80 cca tet etc aaa tec aga gtg aca atg ctg aga gac acc age aag aac 288
Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn- 85 90 95 cag ttc age ctg aga etc age age gtg aca gcc gcc gac acc geg gtt 336
Gin Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 100 105 110 384593679 50/71 tat tat tgt gca aga tcc eta get egg act aeg get atg gac tac tgg Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp 115 120 125 ggt caa ggc age etc gtc aca gtc tec tea ggt ggt ggt ggt teg ggt Gly Gin Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 _ 140 ggt ggt ggt teg ggt ggt ggc gga teg gac ate cag atg acc cag age Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Gin Met Thr Gin Ser 145 150 155 160 cca age age ctg age gee age gtg ggt gac aga gtg acc ate acc tgt Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys 165 170 175 aga gee age cag gac ate age agt tac ctg aat tgg tac cag cag aag Arg Ala Ser Gin Asp lie Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys 180 185 190 cca gga aag get cca aag ctg ctg ate tac tac acc tec aga ctg cac Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His 195 200 205 432 480 528 576 624 tet ggt gtg cca age aga ttc age ggt age ggt age ggt acc gac ttc 672 593679 51/71 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 210 215 220 acc ttc acc ate age age etc cag cca gag gac ate get acc tac tac Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr 225 230 235 240 tgc caa cag ggt aac aeg ett cca tac aeg ttc ggc caa ggg acc aag Cys Gin Gin Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys 245 250 255 gtg gaa ate aaa ggt ggt ggt ggt teg ggt ggt ggt ggt teg ggt ggt Val Glu lie Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 260 265 270 ggc gga teg gtc gac tee cag gtc caa ctg cag gag age ggt cca ggt Gly Gly Ser Val Asp Ser Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly 275 280 285 ett gtg aga cct age cag acc ctg age ctg acc tgc acc gtg tet ggc Leu Val Arg Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly- 290 295 300 tac tea att acc age gat cat gee tgg age tgg gtt ege cag cca cct Tyr Ser lie Thr Ser Asp His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro 305 310 315 320 720 768 816 864 912 960 1008593679 52/71 gga cga ggt ctt gag tgg att gga tac att agt tat agt gga ate aca Gly Arg Gly Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly lie Thr 325 330 335 acc tat aat cca tet etc aaa tcc aga gtg aca atg ctg aga gac acc Thr Tyr Asn Pro Ser Leu tys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr 340 345 — 350 age aag aac cag ttc age ctg aga etc age age gtg aca gee gee gac Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp 355 360 365 acc geg gtt tat tat tgt gca aga tec eta get egg act aeg get atg Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met 370 375 380 gac tac tgg ggt caa ggc age etc gtc aca gtc tec tea ggt ggt ggt Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 385 390 395 400 ggt teg ggt ggt ggt ggt teg ggt ggt ggc gga teg gac ate cag atg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Gin Met 405 410 415 1056 1104 1152 1200 1248 acc cag age cca age age ctg age gee age gtg ggt gac aga gtg acc 1296 593679 53/71
Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 420 425 430 ate acc tgt aga gcc age cag gac ate age agt tac ctg aat tgg tac lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr 435 440 445 cag cag aag cca gga aag get cca aag ctg ctg ate tac tac acc tcc Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Tyr Thr Ser 450 455 460 aga ctg cac tet ggt gtg cca age aga ttc age ggt age ggt a^c ggt Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 465 470 475 480 1344 1392 1440 acc gac ttc acc ttc acc ate age age etc cag cca gag gac ate get Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp lie Ala 485 490 495 1488 acc tac tac tgc caa cag gga aat act tta cca tac aeg ttc ggc caa Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln~ 500 505 510 1536 ggg acc aag gtg gaa ate aaa Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 515 1557 593679 54/71
<210> 31 <211> 29 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223〉Description of Artificial Sequence: lappal'an artificially synthesized primer sequence <400> 31 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgg 29
<210〉 32 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉 〜 <223〉Description of Artificial Sequence: ”Kappa2'an artificially synthesized primer sequence <400> 32 ttatttatcg tcatcgtctt tgtagtcaag cttagactct cccctgttga agct 54 593679 55/71
<210〉 33 <211〉 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉 artificially 29 <223> Description of Artificial Sequence: ""SCP-K'an synthesized primer sequence <400> 33 ttcaactgct catcagatgg cgggaagat
<210> 34 <211〉 1878 _ <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <221> CDS <222〉 （1>·.(1878) <220〉 <223〉Description of Artificial Sequence: designed single chain Fv gene 56/71 sequence <400> 34 atg gga tgg age tgt ate ate etc ttc ttg gta gca aca get aca ggt 48
Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15 gtc gac tcc cag gtc caa ctg cag gag age ggt cca ggt ett gtg aga 96
Val Asp Ser Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg 20 25 3〇 cct age cag acc ctg age ctg acc tgc acc gtg tet ggc tac tea att 144
Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser lie 35 40 45 acc age gat cat gee tgg a^c tgg gtt ege cag cca cct gga ega ggt 192
Thr Ser Asp His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly 50 55 60 ett gag tgg att gga tac att agt tat agt gga ate aca acc tat aat- 240 Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly lie Thr Thr Tyr Asn 65 70 75 80 cca tet etc aaa tec aga gtg aca atg ctg aga gac acc age aag aac 288
Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn 593679 57/71 85 90 95 cag ttc age ctg aga etc age age gtg aca gee gee gac acc geg gtt Gin Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tat tgt gca aga tee eta get egg act aeg get atg gac tac tgg Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp 115 120 125 ggt caa ggc age etc gtc aca gtc tee tea ggt ggt ggt ggt teg ggt Gly Gin Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 ggt ggt ggt teg ggt ggt ggc gga teg gac ate cag atg acc cag age Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Gin Met Thr Gin Ser 145 150 155 160 cca age age ctg age gee age gtg ggt gac aga gtg acc ate acc tgt Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys 165 170 175 〜 aga gee age cag gac ate age agt tac ctg aat tgg tac cag cag aag Arg Ala Ser Gin Asp He Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys 336 384 432 480 528 180 185 190 576 624593679 58/71 cca gga aag get cca aag ctg ctg ate tac tac acc tee aga ctg cac Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His 195 200 205 tet ggt gtg cca age aga ttc age ggt age ggt age ggt acc gac ttc Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 210 215 220 acc ttc acc ate age age etc cag cca gag gac ate get acc tac tac Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr 225 230 235 240 tgc caa cag ggt aac aeg ett cca tac aeg ttc ggc caa ggg acc aag Cys Gin Gin Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys 245 250 255 gtg gaa ate aaa ggt ggt ggt ggt teg ggt ggt ggt ggt teg ggt ggt Val Glu lie Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 260 265 270 ggc gga teg gtc gac tee cag gtc caa ctg cag gag age ggt cca ggt- Gly Gly Ser Val Asp Ser Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly 275 280 285 672 720 768 816 864 ett gtg aga cct age cag acc ctg age ctg acc tgc acc gtg tet ggc 912 Leu Val Arg Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly 593679 59/71 290 295 300 tac tea att acc age gat cat gee tgg age tgg gtt ege cag cca cct Tyr Ser lie Thr Ser Asp His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro 305 310 315 320 gga ega ggt ett gag tgg att gga tac att agt tat agt gga ate aca Gly Arg Gly Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly lie.Thr 325 330 335 acc tat aat cca tet etc aaa tee aga gtg aca atg ctg aga gac acc Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr 340 345 350 age aag aac cag ttc age ctg aga etc age age gtg aca gee gee gac Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp 355 360 365 acc geg gtt tat tat tgt gca aga tee eta get egg act aeg get atg Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met 370 375 380 960 1008 1056 1104 1152 gac tac tgg ggt caa ggc age etc gtc aca gtc tee tea ggt ggt ggt Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 385 390 395 4〇〇 1200 593679 60/71 ggt teg ggt ggt ggt ggt teg ggt ggt ggc gga teg gac ate cag atg 1248
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Gin Met 405 410 415 acc cag age cca age age ctg age gee age gtg ggt gac aga gtg acc Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 420 425 430 ate acc tgt aga gee age cag gac ate age agt tac ctg aat tgg tac lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr 435 440 445 cag cag aag cca gga aag get cca aag ctg ctg ate tac tac acc tee Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Tyr Thr Ser 450 455 460 aga ctg cac tet ggt gtg cca age aga ttc age ggt age ggt age ggt Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 465 470 475 480 acc gac ttc acc ttc acc ate age age etc cag cca gag gac ate get- Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp lie Ala 485 490 495 acc tac tac tgc caa cag gga aat act tta cca tac aeg ttc ggc caa Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin 1296 1344 1392 1440 1488 1536 593679 61/71 500 505 510 ggg acc aag gtg gaa ate aaa ega act gtg get gca cca tet gtc ttc Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 515 520 525 1584 ate ttc ccg cca tet gat gag cag ttg aaa tet gga act gee tet gtt lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr JVla Ser VaU~ 530 535 540 gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gee aaa gta cag tgg Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp 545 550 555 560 aag gtg gat aac gee etc caa teg ggt aac tee cag gag agt gtc aca Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr 565 570 575 gag cag gac age aag gac age acc tac age etc age age acc ctg aeg Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 580 585 590 〜 ctg age aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gee tgc gaa gtc Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 595 600 605 1632 1680 1728 1776 1824 593679 62/71 acc cat cag ggc ctg age teg ccc gtc aca aag age ttc aac agg gga 1872
Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly 610 615 620 gag tet 1878
Glu Ser 625
<210> 35 <211> 29 <212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <223〉 Description of Artificial Sequence: ”MCH4-le，an artificially synthesized primer sequence <400> 35 gtggaaatca aagtggccct gcacaggcc 29 <210> 36 <211〉 68
<212〉 DNA <213> Artificial Sequence <220> <220> 593679 63/71 <223〉 Description of Artificial Sequence: ”MCH4-2.r，an artificially synthesized primer sequence <400> 36 tagtcaagct tctcaaatcc ctcttcgtcg gcgctaacct ctccttcggt ggacttgtcc 60 acggtcct 68
<210〉 37 <211〉 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: ”SCP-Mu'an artificially synthesized primer sequence <400> 37 tgcagggcca ctttgatttc caccttggt 〜29
<210〉 38 <211〉 53 <212〉 DNA 593679 64/71 <213> Artificial Sequence <220〉 <223〉 Description of Artificial Sequence: ”MCH4-2.2”，an artificially synthesized primer sequence <400> 38 aaagcggccg cttattattt atcgtcatcg tctttgtagt caagcttctc aaa 53
<210〉 39 <211> 1920 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220〉 <221> CDS <222> (1)..(1920) <220> <223〉Description of Artificial Sequence: ” shPMl-MCH4-BvGS3”，a-designed single chain Fv gene sequence <400> 39 atg gga tgg age tgt ate ate etc ttc ttg gta gca aca get aca ggt 48
Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 593679 65/71 l〇 15 gtc gac tcc cag gtc caa ctg cag gag age ggt cca ggt ett gtg aga 96
Val Asp Ser Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg 20 25 30 cct age cag acc ctg age ctg acc tgc acc gtg tet ggc tac tea att 144
Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser lie 35 40 45 acc age gat cat gee tgg age tgg gtt ege cag cca cct gga ega ggt 192
Thr Ser Asp His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly 50 55 60 ett gag tgg att gga tac att agt tat agt gga ate aca acc tat aat 240
Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly lie Thr Thr Tyr Asn 65 70 75 80 cca tet etc aaa tec aga gtg aca atg ctg aga gac acc age aag aac 288
Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn 85 90 95 -- cag ttc age ctg aga etc age age gtg aca gee gee gac acc geg gtt 336
Gin Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 100 105 no 593679 66/71 tat tat tgt gca aga tcc eta get egg act aeg get atg gac tac tgg 384
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp 115 120 125 ggt caa ggc age etc gtc aca gtc tec tea ggt ggt ggt ggt teg ggt 432
Gly Gin Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 ggt ggt ggt teg ggt ggt ggc gga teg gac ate cag atg acc cag age 480
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Gin Met Thr Gin Ser 145 150 155 160 cca age age ctg age gee age gtg ggt gac aga gtg acc ate acc tgt 528
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys 165 170 175 aga gee age cag gac ate age agt tac ctg aat tgg tac cag cag aag 576
Arg Ala Ser Gin Asp lie Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys 180 185 190 cca gga aag get cca aag ctg ctg ate tac tac acc tec aga ctg cac- 624
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His 195 200 205 tet ggt gtg cca age aga ttc age ggt age ggt age ggt acc gac ttc 672
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 593679 67/71 210 215 220 acc ttc acc ate age age etc cag cca gag gac ate get acc tac tac Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr 225 230 235 240 tgc caa cag ggt aac aeg ett cca tac aeg ttc ggc caa ggg acc aag Cys Gin Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys 245 250 255 gtg gaa ate aaa ggt ggt ggt ggt teg ggt ggt ggt ggt teg ggt ggt Val Glu lie Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 260 265 270 ggc gga teg gtc gac tee cag gtc caa ctg cag gag age ggt cca ggt Gly Gly Ser Val Asp Ser Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly 275 280 285 ett gtg aga cct age cag acc ctg age ctg acc tgc acc gtg tet ggc Leu Val Arg Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly 290 295 300 tac tea att acc age gat cat gee tgg age tgg gtt ege cag cca cct Tyr Ser lie Thr Ser Asp His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro 720 768 816 864 912 305 310 315 320 960 1008593679 68/71 gga cga ggt ctt gag tgg att gga tac att agt tat agt gga ate aca Gly Arg Gly Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly lie Thr 325 330 335 acc tat aat cca tot etc aaa tcc aga gtg aca atg ctg aga gac acc Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr 340 345 350 age aag aac cag ttc age ctg aga etc age age gtg aca gee gee gac Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp 355 360 365 acc geg gtt tat tat tgt gca aga tec eta get egg act aeg get atg Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met 370 375 380 gac tac tgg ggt caa ggc age etc gtc aca gtc tec tea ggt ggt ggt Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 385 390 395 400 ggt teg ggt ggt ggt ggt teg ggt ggt ggc gga teg gac ate cag atg- Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Gin Met 405 410 415 1056 1104 1152 1200 1248 acc cag age cca age age ctg age gee age gtg ggt gac aga gtg acc 1296 Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 593679 69/71 420 425 430 ate acc tgt aga gee age cag gac ate age agt tac ctg aat tgg tac lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr 435 440 445 cag cag aag cca gga aag get cca aag ctg ctg ate tac tac acc tee Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Tyr Thr Ser 450 455 460 aga ctg cac tet ggt gtg cca age aga ttc age ggt age ggt age ggt Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 465 470 475 480 acc gac ttc acc ttc acc ate age age etc cag cca gag gac ate get Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp lie Ala 485 490 495 acc tac tac tgc caa cag gga aat act tta cca tac aeg ttc ggc caa Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin 500 505 510 - ggg acc aag gtg gaa ate aaa gtg gee ctg cac agg ccc gat gtc tac Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr 1344 1392 1440 1488 1536 1584 515 520 525 593679 70/71 ttg ctg cca cca gcc egg gag cag ctg aac ctg ege gag teg gee acc Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gin Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr 530 535 540 1632 ate aeg tgc ctg gtg aeg ggc ttc tet ccc geg gac gtc ttc gtg cag lie Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gin 545 550 555 560 1680 tgg atg cag agg ggg cag ccc ttg tee ccg gag aag tat gtg acc age Trp Met Gin Arg Gly Gin Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser 1728 565 570 575 gcc cca atg cct gag ccc cag gcc cca ggc egg tac ttc gcc cac age Ala Pro Met Pro Glu Pro Gin Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser 580 585 590 1776 ate ctg acc gtg tee gaa gag gaa tgg aac aeg ggg gag acc tac acc lie Leu Thr Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr 595 600 605 1824 tgc gtg gcc cat gag gcc ctg ccc aac agg gtc acc gag agg acc gtg-Cys Val Ala His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val 610 615 620 1872 gac aag tee acc gag ggg gag gtg age gcc gac gag gag ggc ttt gag Asp Lys Ser Thr Glu Gly Glu Val Ser Ala Asp Glu Glu Gly Phe Glu 1920 593679

Claims (1)

  1. 、申請專利範圍
    種 六 編碼膜結合卷ώ m 列步驟： 貝之基因的分離方法，包括下 (i)將含有DNA的載#道λ 具有與抗原結合親和性、曰細胞之中，上述DNA由編碼 其3’側下游之待測 可分泌之抗體的DNA以及連結 選基因構成；、 /、有編碼膜結合蛋白質之可能性的候 (11)在細胞内表現呈 之抗體與編碼待測之1 ^ 〃抗原結合親和性、且可分泌 選基因之蛋白所二、、、瑪膜結合蛋白質之可能性的候 • I曰貝之嘁合蛋白質· (i i i )使在細胞膜上矣一 觸，並且選擇灶人E表現融合蛋白質的細胞與抗原接 (土 、，口。於抗原的細胞； & /V j ^ k擇的細胞中分離出插入載體内的具有編碼膜 結合蛋白質之可能性的候選基因。 、t 根據申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟（i) =入細胞的載體為，將待測之具有編碼膜結合蛋白質之可 月包性的候選基因導入载體的限制酵素認識部位所得到的載 體’遺限制酵素認識部位位於編碼抗體之DNA的3，側下 游0 3·根據申請專利第丨項所述之方法，其中步驟（i)導入 細胞的载體為，將編碼抗體的DNA以及連結其3,側下游之 待測之具有編碼膜結合蛋白質之可能性的候選基因所構成 的DNA導入载體所得到的載體。 4 ·根據申請專利第丨項所述之方法，其中編碼抗體的 DNA以及連結其3,侧下游之待測之具有編碼膜結合蛋白質
    593679
    _案號 六、申請專利範圍 mm3 修正 之可能性的候選基因之間是以編碼肽連接分子（peptide J i nli er )的ΜΑ連結著。 5 ·根據申請專利第2項戶斤述之方法，其中編碼抗體的 ΜΑ以及連結其3 ’侧下游之捋測之具有編碼膜結合蛋白質 之可能性的候選基因之間是以編碼肽連接分子（peptide 1 inker)的DNA連結著。 6 ·根據申請專利第3項戶斤述之方法’其中編碼抗體的 D N A以及連結其3 ’側下游之符測之具有編碼膜結合蛋白質 之可能性的候選基因之間是β編碼肽連接分子（p e p t i d e linker)的DNA連結著。 7 ·根據申請專利第1項戶斤述之方法’其中待測之具有 編碼膜結合蛋白質之可能性的候遠基因為由哺乳動物細胞 得到之c D N A庫而來。 8 ·根據申請專利第2項所述之方法’其中待測之具有 編碼膜結合蛋白質之可能性的候選基因為由哺乳動物細胞 得到之cDNA庫而來。 9 ·根據申請專利第3項所述之方法，其中待測之具有 編碼膜結合蛋白質之可能性的候選基因為由哺乳動物細胞 得到之cDNA庫而來。 I 〇 ·根據申請專利第4項所述之方法，其中待测之具有 編碼膜結合蛋白質之可能性的候選基因為由哺乳動物細胞 得到之cDNA庫而來。 II ·根據申請專利第5項所述之方法，其中待剛之具有 編碼膜結合蛋白質之可能性的候選基因為由哺乳動物j田胞
    2125-2578-pf4.ptc 第45貢
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    _案號 88107113 务月日 体正 六、申請專利範圍 ---— 之可能性的候選基因之間是以編碼肽連接分子（peptide linker)的DNA連結著。 5·根據申請專利第2項所述之方法，其中編碼抗體的 DNA以及連結其3,側下游之符測之具有編碼膜結合蛋白質 之可能性的候選基因之間是以編碼肽連接分子㈧叩tide linker)的DNA連結著。 6. 根據申請專利第3項所述之方法，其中編碼抗體的 DNA以及連結其3’側下游之符測之具有編碼膜結合蛋白質 之可能性的候選基因之間是以編碼肽連接分子（peptide linker)的DNA連結著。 7. 根據申請專利第1項所述之方法，其中待測之具有 編碼膜結合蛋白質之可能性的候選基因為由哺乳動物細胞 得到之cDNA庫而來。 8·根據申請專利第2項所述之方法，其中待測之具有 編碼膜結合蛋白質之可能性的候選基因為由哺乳動物細胞 得到之cDNA庫而來。 9 ·根據申請專利第3項所述之方法，其中待測之具有 編碼膜結合蛋白質之可能性的候選基因為由哺乳動物細胞 得到之c D N A庫而來。 I 0 ·根據申清專利第4項所述之方法，其中待測之且有 編碼膜結合蛋白質之可能性的候選基因為由哺乳動物細胞 得到之cDNA庫而來。 II ·根據申請專利第5項所述之方法，其中待測之具有 編碼膜結合蛋白質之可能性的候選基因為由哺乳動物細胞
    2125-2578-pf4.ptc 第45頁 593679 _案號8810711 3__年月曰_^_ 六、申請專利範圍 得到之cDNA庫而來。 1 2.根據申請專利第6項所述之方法，其中待測之具有 編碼膜結合蛋白質之可能性的候選基因為由哺乳動物細胞 得到之cDNA庫而來。 1 3 ·根據申請專利第1項所述之方法，其中步驟（丨）導 入細胞的載體之中，含有在編碼抗體的DNA之5，側上游編 碼分泌信號序列的DNA。 1 4 ·根據申請專利第2項所述之方法，其中步驟（丨）導 入細胞的載體之中，含有在編碼抗體的DNA之5，側上游編 碼分泌信號序列的D N A。 1 5 ·根據申請專利第3項所述之方法，其中步驟（丨）導 入細胞的載體之中，含有在編碼抗體的D N A之5，側上游編 碼分泌信號序列的D N A。 1 6 ·根據.申請專利第4項所述之方法，其中步驟（丨）導 入細胞的載體之中，含有在編碼抗體的DNA之5，侧上游編 碼分泌信號序列的DNA。 1 7.根據申請專利第5項所述之方法，其中步驟（丨）導 入細胞的載體之中，含有在編碼抗體的DNA之5，側上游編 碼分泌信號序列的DNA。 1 8 ·根據申請專利第6項所述之方法，其中步驟（i )導 入細胞的載體之中，含有在編碼抗體的DNA之5，側上游編 碼分泌信號序列的DNA。 1 9 ·根據申請專利第7項所述之方法，其中步驟（i)導 入細胞的載體之中，含有在編碼抗體的DNA之5，側上游編
    2125-2578-pf4.ptc 第46頁 593679 銮號 88107113 曰 修正 六、申請專利範圍 碼分泌信號序列的D N A。 2 〇 ·根據申請專利第8項所述之方法，其中步驟（i)導 入細胞的載體之中，含有在編碼抗體的DNA之5，側上游編 瑪分泌信號序列的D N A。 2 1 ·根據申請專利第9項所述之方法，其中步驟（i )導 入細胞的載體之中，含有在編碼抗體的DNA之5，側上游編 碼分泌信號序列的DNA。 2 2.根據申請專利第1 〇項所述之方法，其中步驟（i )導 入細胞的載體之中，含有在編碼抗體的DNA之5,側上游編 碼分泌信號序列的DNA。 2 3 ·根據申請專利第11項所述之方法，其中步驟（丨）導 入細胞的載體之中，含有在編碼抗體的DNA之5，側上游編 碼分泌信號序列的MA。 2 4 ·根據申請專利第1 2項所述之方法，其中步驟（丨）導 入細胞的載體之中，含有在編碼抗體的DNA之5，側上游編 碼分泌信號序列的DNA。 25·根據申請專利第卜24項任一項所述之方法，苴中 抗體為單鏈抗體。 —26·根據申請專利第25項所述之方法，其中載體包 含’將編碼抗體的固定區域之DNA連結於編碼單鏈抗體的 DNA之3’側下游所構成的训八。 27·根據申請專利第卜24項任一項所述之方法，直中 抗原與支持體結合著。 28.根據申請專利第25項所述之方法，其中抗原與支
    2l25-2578-pf4.ptc 第47頁 593679
    六、申請專利範圍 持體結合著。 、 2 9 ·根據申請專利第2 6項所述之方法’其中抗原與支 持體結合著。 3 0 ·根據申請專利第2 7項所述之方/套’其中支持體為 細胞培養用支持體。 3 1 ·根據申請專利第28項所述之方法’其中支持體為 細胞培養用支持體。 32·根據申請專利第29項所述之方法’其中支持體為 細胞培養用支持體。 33·根據申請專利第卜24頊任一項所述之方法，其中 包括分析步驟，用以決定從細胞得到的基因是否有新賴序 列。 3 4.根據申請專利第2 5項所述之方法，其中包括分析 步驟’用以決定從細胞得到的基因是否有新穎序列。 35·根據申請專利第26項所述之方法，其中包括分 步驟，用以決定從細胞得到的基因是否有新穎序列。刀 牛36·根據申請專利第27項所述之方法，其中包括 夕〃 ’用以決定從細胞得到的基因是否有新穎序列。 步驟，7·用根據申請專利第28項所述之方法，其中包括分析 币从決定從細胞得到的基因是否有新穎序列。 步驟，·根、據申請專利第29項所述之方法，其中包括分 3 g 以決定從細胞得到的基因疋否有新穎序列。 步驟，·根據申請專利第30項所述之方法，其中包括分 以決定從細胞得到的基因疋否有新穎序列。
    第48頁 593679 _案號88107113_年月曰 修正_ 六、申請專利範圍 4 0.根據申請專利第3 1項所述之方法，其中包括分析 步驟，用以決定從細胞得到的基因是否有新穎序列。 4 1.根據申請專利第3 2項所述之方法，其中包括分析 步驟，用以決定從細胞得到的基因是否有新穎序列。 4 2.根據申請專利第33項所述之方法，其中包括cDNA 庫篩選步驟，用以得到含有從細胞得到的新穎序列之基因 的全長基因。 43.根據申請專利第34項所述之方法，其中包括cDN A 庫篩選步驟，用以得到含有從細胞得到的新穎序列之基因 的全長基因。 4 4.根據申請專利第35項所述之方法，其中包括cDN A 庫篩選步驟，用以得到含有從細胞得到的新穎序列之基因 的全長基因。 4 5.根據申請專利第36項所述之方法，其中包括cDN A 庫篩選步驟，用以得到含有從細胞得到的新穎序列之基因 的全長基因。 46.根據申請專利第37項所述之方法，其中包括cDN A 庫篩選步驟，用以得到含有從細胞得到的新穎序列之基因 的全長基因。 4 7.根據申請專利第38項所述之方法，其中包括cDNA 庫篩選步驟，用以得到含有從細胞得到的新穎序列之基因 的全長基因。 4 8.根據申請專利第39項所述之方法，其中包括cDNA 庫篩選步驟，用以得到含有從細胞得到的新穎序列之基因
    2125-2578-pf4.ptc 第49頁 593679 _案號88107113_年月日__ 六、申請專利範圍 的全長基因。 4 9.根據申請專利第40項所述之方法，其中包括cDNA 庫篩選步驟，用以得到含有從細胞得到的新穎序列之基因 的全長基因。 5 0.根據申請專利第41項所述之方法，其中包括cDN A 庫篩選步驟，用以得到含有從細胞得到的新穎序列之基因 的全長基因。 5 1.根據申請專利第42項所述之方法，其中包括從細 胞得到的新穎序列之基因的全長基因之分離步驟。 5 2.根據申請專利第4 3項所述之方法，其中包括從細 胞得到的新穎序列之基因的全長基因之分離步驟。 5 3.根據申請專利第44項所述之方法，其中包括從細 胞得到的新穎序列之基因的全長基因之分離步驟。 5 4.根據申請專利第4 5項所述之方法，其中包括從細 胞得到的新穎序列之基因的全長基因之分離步驟。 5 5 .根據申請專利第4 6項所述之方法，其中包括從細 胞得到的新穎序列之基因的全長基因之分離步驟。 5 6 .根據申請專利第4 7項所述之方法，其中包括從細 胞得到的新穎序列之基因的全長基因之分離步驟。 5 7.根據申請專利第4 8項所述之方法，其中包括從細 胞得到的新穎序列之基因的全長基因之分離步驟。 5 8.根據申請專利第49項所述之方法，其中包括從細 胞得到的新穎序列之基因的全長基因之分離步驟。 5 9.根據申請專利第5 0項所述之方法，其中包括從細
    2125-2578-pf4.ptc 第50頁 593679 案號 88107Π3 _η 曰 修正 六、申請專利範圍 胞得到的新穎序列之基因的全長基因之分離步驟。 6 0. —種用來分離編碼膜結合蛋白質之基因的試藥組 (k i t)，包括： 具有限制酵素認識部位的載體，該部位為用來將待測 之具有編碼膜結合蛋白質之可能性的候選基因插入編碼具 有可分泌與抗原結合親和性的抗體的DNA之3’側下游；以 進行以下步驟： (i )將含有DNA之上述載體導入細胞之中，上述DNA由 編碼具有與抗原結合親和性、且可分泌之抗體的DNA以及 連結其3 ’侧下游之待測之具有編碼膜結合蛋白質之可能性 的候選基因構成； (i i)在細胞内表現出具有與抗原結合親和性、且可分 泌之抗體與編碼待測之具有編碼膜結合蛋白質之可能性的 候選基因之蛋白質之融合蛋白質； (i i i )使在細胞膜上表現出融合蛋白質的細胞與抗原 接觸，並且選擇結合於抗原的細胞； (i v)由選擇的細胞中分離出插入載體内的具有編碼膜 結合蛋白質之可能性的候選基因。
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