TW593331B

TW593331B - Method for large-scale production of di(uridine 5')-tetraphosphate and salts thereof

Info

Publication number: TW593331B
Application number: TW087121475A
Authority: TW
Inventors: Benjamin R Yerxa; William Pendergast
Original assignee: Inspire Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-07-25
Filing date: 1998-12-21
Publication date: 2004-06-21
Also published as: US6765090B2; US20040267005A1; US6713458B1; US20010011079A1; US7091334B2

Description

593331

曰修_ 本專利申請早於1 9 9 7年7曰9 C m遗掩ΔΑ ¥ m 干f月2 5日建才s的吴國臨時申請書第60/054, 147 號。 τ τ 月曰技術本t明係關於治療用二核苷酸包含其新穎 &甘四4酸鹽的合成方法比起製造方法的先前技藝有更多的優點。 =

發明U _pl，P4〜二（尿苷5’）—四磷酸鹽是〆種具有下列結構的二核甘酸：

其中： X是Na，NH4或!1，其條件為全部的X基不是η。 ρ1，Ρ4〜二（尿苷5’）_四磷酸鹽的解離酸，其中X是氫，先月ίι已經以尿苷5 ’ _ (五氫四磷酸鹽），p，，，—帶有尿苷的5，一醋予以描述。（CAS Registry Number: 59985-21-6; C· Vallejo et Biochimica et Biophysica Acta 438,

O:\56\56373.ptc 第6頁 593331 _案號87121475_年月日修正_ 五、發明說明（2) 305 (1976) and H. Coste et al., J. Biol. Chem. 262, 12096 (1987))。不同的方法已經於嘌呤二核苷酸如二腺苷四磷酸鹽 (A2P4)的合成中描述（E. Rappaport et al, Proc. Natl· Acad. Sci, 78, 838, (1981); A. Guranowski et al, ,

Biochemistry, 27, 2959, (1988); C. Lobaton et al,

Eur. J. Biochem·, 50，495, 1 975; K· Ng 和 L. Orgel, Nucl· Acid Res·, 15， 357 3，（ 1 98 7 ))。然而，這方法對於為嘧啶核苷酸的U2P4並不正確。雖然嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸外表類似，但用於嘌呤核苷酸合成的方法不一定作_ 用於嘧啶如尿苷。二尿杳四鱗酸鹽已顯示在治療各種疾病上，如慢性阻塞性肺病（C0PD )，具備有益的特質。舉例來說，其被證實可幫助受試者清除肺臟分泌的黏液，受試者如哺乳動物包含因各種原因需要治療的人類，這些原因包含囊性纖維化， k性支氣管炎’氣喘，支氣管擴張，手術後黏液滯留，肺炎，原發性纖毛運動困難（M· J. stuttS， III, et al， U. S. Patent No. 5,6 35,1 6 0； PCT International Publication WO 9 6/4 0 0 5 9 )和限制活動患者的肺炎預防與治療。此外治療的使用範圍包括治療鼻竇炎（pct

International Publication W0 98/03177)，中耳炎（PCT

International Publication W0 97 /29756 )，乾眼症，視網膜剝離，鼻淚管阻塞，治療女性不孕症和經增加黏液分「泌和上皮細胞表面保水性治療因陰道乾燥而引起的刺激，"

O:\56\56373.ptc 第了胃 593331

和提昇運動員的動作。〇2匕亦可用作為哺乳動物的家畜產品，哺乳動物如狗、 I田和馬，但不僅限於這些。先岫的方法學技藝僅敘述一種製備二尿苷四驟。此方法十分耗時，至少超過5天且僅能製造小量-的二尿苷四磷酸鹽（c. Vallej0 et al.，BiQchimica et

Biophysica Acta 438, 305 (1976), Sillero et al.，

Eur J Bi〇chem 76，332 ( 1 972 ))。根據此技術，二尿苷四磷酸鹽是經由尿苷5，-單磷酸鹽⑼· 54毫莫耳濃度）與焦 =的二乙基胺鹽（〇·35毫莫耳濃度）在單水嘧啶（1〇毫升）介你貝中反應合成。在3 〇 °c下經過5天，藉蒸發將嘧啶由反應混合物中移除，然後以蒸餾水（8毫升）將殘餘物再分散，此懸浮液經過DEAE-纖維素管柱（37.5 X 2.6公分），以3·2 公升呈線性比率（〇· 06 —〇· 25 μ)的碳酸氫銨，ρΗ 8· 6，進行分鶴。在0 . 1 7 - 0 · 1 9 Μ碳酸氫銨沖洗出的尖峰依下列評斷標準以UJ4不完全地描述··對鹼性磷酸酶沒反應，磷酸對驗的比率和水解產物（UTP + UMP)的分析，經過磷酸二酯酶I的處理’在檸檬酸鹽緩衝液，pH 5 · 〇，進行電泳分析。沒有產量或提供分光光度的數據。因此先前的技藝於合成二尿苷四磷酸鹽的步驟是冗長且僅獲得少量不完全屬於一尿脊四破酸鹽的產物。本發明致力於製備此醫藥上有用化合物的方法，使其更有效率且便於實行，且可施用於一尿甘四碟酸鹽及其鹽類的大量製備。發明概述丨

O:\56\56373.ptc 第8頁 593331 案號 87121475 年月修正五、發明說明（4) 本發明係提供一種合成治療用二核苷酸，P1，P4_二（尿苷 5’）-四磷酸鹽（式I)的新方法，且適宜施用於大量製備。本發明的方法可實質上減少合成二尿苷四磷酸鹽所需的時間，較好是3天或者更少。新穎的P1，P4-二（尿苷5’）-四磷酸鹽之銨鹽和鈉鹽是藉由這些安定、可溶、無毒及製造過程易於操作的方法製備。

式I 。:6 。:0 o

OH 〇H 0 0 0 0 (i II II II 〇—p一〇—.p—〇—p—o一p_〇 ι ox I ox ox I ox

OH OH 其中： X是Na，NH4或[1，其條件為全部的X基不是H。合成式I化合物及其醫藥可接受鹽類的方法，通常以下列步驟執行：1 )溶解尿苷或分子式I I a-d的尿苷核苷酸化合物於一極性，質子惰性有機溶劑和疏水性胺中；2)以分子式I V a - b的填酸化劑進行填酸化和/或以分子式I I I a - c 的活化劑進行活化；和3 )以離子交換色層分析法進行純化。本發明的另一個方向是治療各種疾病的方法，這些疾病包含但不限於此：慢性阻塞性肺病，鼻竇炎，中耳炎，鼻

O:\56\56373.ptc 第9頁丄案號 87121475 曰月五、發明說明（5) 道^塞，乾眼病，硯纟同膜剝離，肺炎和女性不孕或因陰 ^乾燥所引起的刺激。甽本f明的另一個方向是包含式I化合物與醫藥可接受載劑一起的醫藥組合物。又軾羊細描述本發明係提供一種合成治療用二核苷酸，ρι，Ρ4_二（尿苷四，酸鹽的新方法，且適合施用於大量製備。本發明 ^方法貫質上減少合成二尿苷四磷酸鹽所需的時間，較好疋3^天或者更少。新穎的P1，P4-二（尿苷5’）〜四磷酸鹽（式I) 之銨鹽和鈉鹽是藉由這些安定、可溶、無毒及製造過程於操作的方法製備。勿此外本發明提供式I的化合物：

w °H 〇H 。:6

OH 〇H 〇—P一〇—p —〇—p一〇一p一O—I q OX OX OX OX

其中 X疋Na，NH4或H，其條件為全部的χ基不是h。 P1’ P4-二（尿苷5’四磷酸鹽的鈉鹽和銨鹽有咛多優點此鈉鹽和銨鹽與催化磷酸酯水解的二價陽離子（\aCa2+ ·‘，

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“2+ ,ΜΡ)相較下可提供良好 (尿苷5,）-四石来舻_ Μ 如疏間疋的形象。ρ1，ρ4 一二其他陽離子可#合醎及眼睛沒有刺激性。士二+ 會刺激肺臟’眼睛和其他黠暖μ 士七免方面在人體内耐受性不I。這4b =广上皮或另一胺鹽如二一"、、機鋼鹽和銨鹽與疏水性妝|如一和四丁基銨及相似性。高皮、、六如☆ 4财+ 風喊相1乂下具備較好的水溶解點。pi ρ4_ _ r p J合禋/辰度適應上是重要的優、、容性籬早展二鹽的四銨和四鈉鹽在藉由水 :=層析法中士使用任何有機.溶劑來迅速純化也是相 :二士的、占此夕卜，延些鈉鹽易絨毛般白色的固體與當帶有扣孤日守的油脂或膠體相較下易於操作。四鈉鹽較好。、式I、的化合物可被使用於幫助受試者清除肺臟分泌的黏 2，X試者如哺乳動物包含因各種原因需要治療的人類，這些原因包含囊性纖維化，慢性支氣管炎，氣喘，支氣管擴張，手術後黏液滯留，肺炎，原發性纖毛運動困難（Μ· J. Stutts, III, et al, U.S. Patent No. 5,635,160； PCT International Publication WO 96/40 0 5 9 )和限制活動患者的肺炎預防與治療（Κ· M. Jacobus and H. J. Leighton, U.S. Patent No· 5, 763,447)。此外治療的使用範圍包括治療鼻竇炎（PCT International Publication WO 98/03177)，中耳炎（PCT International Publication W 0 9 7 / 2 9 7 5 6 )，乾眼症，視網膜剝離，鼻淚管阻塞，治療女性不孕症和經增加黏液分泌和上皮細胞表面保水性治療因陰道乾燥所引起的刺激和提昇運動員的動作。

O:\56\56373.ptc 第11頁 593331 案號 87121475 Λ_Μ 修正五、發明說明（7) 式I的化合物可以經口，局部、非經腸胃道，藉吸入或喷霧，在手術時，經直腸或陰道投予劑量單位配方，此劑量單位配方包含無毒的醫藥可接受載劑，輔助劑和媒劑。此處所用的局部投予形式包括貼布，凝膠，乳霜、軟膏，栓劑，避孕套或鼻用、耳用或眼用滴劑。此處所用的非經腸胃道投予形式包括皮下注射，靜脈注射，肌肉注射，胸骨内注射或灌注技術。此外提供一種包含一般的式I化合物和醫藥可接受載劑的醫藥配方。一般式I的一種或多種化合物可以與一種或多種無毒性醫藥可接受載劑或稀釋劑或輔助劑和，在如果需要的情況下，與其他活性成份結合存在。這些載劑之一是糖類，使得化合物經玻璃化作用或與載劑（如乳糖、蔗糖，繭蜜菌藻糖，甘露醇）或其他可接受賦形劑簡單混合可以在肺臟或呼吸道傳送時與基質緊密結合。一般式I之一種或多種化合物可以分別或合併投予，或與黏液分解劑如D N A s e ( P u 1 m 〇 z y m e ®)或丙基半胱胺酸，抗生素包括但不限於此的吸入的Tobramycin®;非類固醇抗發炎藥，抗病毒劑，疫苗，消腫劑和腎上腺皮質固醇，合併或分別投予。包含一般式I化合物的醫藥組合物可以適合口服的形式如錠劑，嘴片，喉片，水溶性或油性懸浮液，分散的粉末或顆粒，乳化液，硬或軟的膠囊，或糖漿或藥酒投予。想要給口服使用的組合物可以根據任何已知的製造醫藥組合物技藝方法來製備且此種組合物包含一種或多種選自由甜

O:\56\56373.ptc 第12頁 593331 SS-87121475 ，五、發明說明（8)

味劑、香料，呈色劑和防腐劑組成集 — 乃是為了提供醫藥上優良且味美的製p的$劑，這些集團製造錠劑的醫藥可接受賦形劑混合的、、=°鍵劑包含與適合可能是如惰性的稀釋劑例如碳酸氫鈣，^成份。這些賦形酸#5或鱗酸納，造粒和崩解劑例如玉乎a自欠鋼，乳糖，填· 合劑例如澱粉，明膠或阿拉伯膠；和^救粉或藻膠酸；結_ 鎂，硬脂酸或滑石粉。錠劑不包裹糖'閑滑劑例如硬脂酸裹糖衣以延缓在腸胃道的崩解和吸枚$ ^藉已知技藝來包活性維持。例如，時間延緩物質如甘/藉此提供長時間的油基二硬脂酸鹽可以被使用。 /由基單硬脂酸鹽或甘口服配方可以硬式明膠膠囊投予， _ 的固態稀釋劑例如碳酸氫鈉，碟酸^ $中活性成份與惰性以軟式明膠膠囊投予其中活性忐二、巧或高嶺土混合，也可生油，液態石蠟或撖欖油混合。、义和油性介質例如花水溶性懸浮液包含與適合水溶性换一合之活性物質。這些賦形劑是懸浮=〉手液製造的賦形劑混納’甲基纖維素和海藻酸鈉。分散f例如··敌甲基纖維素磷脂或丙炔氧化物與脂肪酸的凝^或渴潤劑是天然存在的長鍵脂肪族醇類的凝集產物產物，或乙炔氧化物與和六硝基二苯醇的部份酯類之凝集、乳化物與來自脂肪酸衍生自脂肪酸和六硝基二笨醇軒的^物，或乙炔氧化物與這些技藝之技術認可的許多牯、部份酯類之凝集產物。面的一般性敘述中。水溶性懸浮液^蜊和濕潤劑包含在上· 劑例如乙基或η-丙基p-羥基1 j也包含一種或多種防腐 + τ酸鹽，一 · Μ 修正 --^^1121475 年月日五、發明說明（9) ' 二：-種或多種香料，和一種或多種甜味劑如蔗糖或糖可分散的粉末和顆粒適合於水溶性懸進活性成份與分散或濕潤心=:4; 添加的賦形劑例如甜$、香味和呈色劑也的化合物可以無菌介質非經腸方式投予。此藥物， ^ s，使用的媒劑和濃度，可以是懸浮或溶解在媒劑中。 ^ 輔助劑如局部麻醉劑，防腐劑和緩衝劑可以溶解 f媒剎中。此無菌的可注射藥劑是存在於無毒的人體可接受稀釋劑或溶劑中之無菌可注射溶液或懸浮液。在可接受的媒劑和〉谷劑中使用的是無菌水、生理食鹽水或林格氏液。一般式I的化合物也可以耳用，直腸用或陰道用藥物权劑的型恶投予。這些組合物可以藉混合藥物與適合的無刺激性賦形劑混合，此賦形劑在平常溫度下是固態但在體 '盟下疋液怨且因此溶解來釋放藥物。這些物質是可可油脂和聚乙烯二醇。一、式I化合物的溶液可在手術時内置於身體的任何部位。用>於治療上述呼吸道情形的常態單一劑量是從丨左右至 4〇J宅克左f，較好的是在1〇至3〇〇毫克的範圍，而最好是 5至2 5 0耄克的範圍。用於治療上述眼睛情形的常態單 :，量士從0.0 0 0 5左右至5毫克左右，較好是在〇〇〇1至3 笔的範圍，且最好是在0 · 〇 2 5至1毫克的範圍。活性成份

O:\56\56373.ptc 第14頁 593331 修正曰皇號 87121 五、發明說明（10) 可與負載物質結合產生單一劍量曰、的對象和投予的特殊模式而改變二而:：Τ二：f治療病人用的特別劑量根據下列因子而’改變，U =殊用的特殊化合物之活性年齡 "" 匕括使別，飲食，體重，一般健康情形，性特殊疾病遭受治療的嚴重性。羊柰物、、、。合和合成方法描述如下包含幾個產生ρι 酸鹽的合成策略。通常，全部的方法使用一尿苷；來四碟性，貝子惰性有機溶劑（如二甲基甲醯胺，二二氧陸圜，Ν_曱基四氫吡咯，二土亞楓， (如，三乙基胺，三丁基胺，2,4,6_可力丁，三和四_烷基胺，雜環胺）。藉著鱼土，文， (如，二虱乳化W，焦磷酸鹽，隹、— 與來自式ΙΠ的活化劑（如，辦美Ί乳〕進仃磷酿化或者山# - π ^ ^基二味唾，烧基或芳香庐其石反酉&·^一亞fe，烧基或芳香煙美赌工土 —^ |膦虱酸鹽）進行磷酸基活昝反應獲得之產物，各別地，接著 _ 各種方法加以純化，這|方^=熟此技*者所熟知的 DEAE Sephadex ^ DEAE cellul〇Se η π 1 陽離子交換樹脂），但不僅限於此。矛嘧啶/5 -D-核糖呋喃糖基起啟物 ^ _ οσ 鹽（UMP)，尿苷5，_二磷酸鹽（UDp) ' \甘 ''早磷酸

/ 、、UL>r」和尿甘5 -二磷酸BS (UTP)以下面式Ila-d的解離酸各別表示業上可大量取得各種鹽類型態者。貝王疋商

O:\56\56373.ptc 第15頁 593331 案號 87121475 年月日修正五、發明說明（11) 式Ila :尿苷。:ό

HO

OH OH

式lib: UMP

〇 π HO —P—O I 。:0

OH

OH 〇H 及其鹽類。

式lie: UDP

〇 HN

41

〇〇 1! Π ^ H〇一 P 一〇一 P 一0 I 1 OH OH

OH OH i jf i O:\56\56373.ptc 第16頁 593331 案號 87121475 年月曰修正五、發明說明（12) 及其鹽類

式 lid: UTP

〇〇〇 II II II H〇一 P —〇一 P~"〇一Ρ_〇 I I 1

OH OH OH 。:ό

OH 〇H 及其鹽類。活化劑碳醯二亞胺，活性羰基和活性磷化合物以下面通式I I I a - c分別表示。式I I I a :碳醯二亞胺

N=C = N 其中匕和匕係^-^烷基或環烷基，視情況經取代之烷基或環烷基（如羥基和胺基）；芳基或視情況經取代之芳基（如羥基和胺基）。較佳之式II I a化合物係二環己基碳醯亞胺和卜（3 -二曱基胺丙基）-3 -乙基碳醯二甲胺氣化氫式I I I b :活性羰基

X X

O:\56\56373.ptc 第17頁 593331 _一案號— 五、發明說明（13) 87121475

其中X是咪唑，四唑和/或_素。式11116較好的化合物是幾基二味°坐和幾基二三σ坐。

Ri一 Ρ—X I r2 其中Ri和1?2是匕-Cs烷基或環烷基，Cl —c8視情況經取代之烧基、烷氧基或環炫基（如羥基和胺基）；芳美，芳氧基，烷氧基或視情況經取代之芳基、芳氧基或院&基（如羥基和胺基）及/或鹵素；而X是鹵素。較佳之式丨丨Ic化合物係f 二苯基膦氯酸鹽、苯基膦二氯酸鹽、笨基膦二氯酸和笨基亞磷酸氯。單-和二磷醯化劑以IVa-b的通式表示如下。 AIV a :單磷醯化劑

X一P 一 X I

X

其中X是素。較佳之式I v a化合物係三氯氧化磷式J V b :二域Si化劑

X—广〇一ρ-χ X X 其中X是t ^基，或函素，及其鹽。較好的式IVb化合

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纏 8712U7R 五、發明說明（14) 物是焦鱗酸氯和焦鱗酸鹽。嫻热此技藝者知道本發明並不僅限於下列實例，且下列實例的步驟皆是可變的。實例1 使用尿苷5’ -二磷酸鹽製造二尿苷四磷酸鹽，四鈉鹽的方法尿甘 5，-二磷酸鹽（Yamasa，Ch〇shi，Japan; 6〇〇克）溶解在去離子水中（5·4 L)。將溶液通過Dowex 5〇Wx4 H+ (Dow Chemical管柱。收集含有尿苷5，-二磷酸鹽的部份亚以二丁基胺（Aldrich, St. Louis; 300毫升）中和。中❸ 和的部份以旋轉式蒸發器在水溶溫度55_6〇它下濃度成油狀。此油脂溶解在乾燥的二甲基醯胺（A丨dr i ch，3公升）然後以旋轉式蒸發器（水溶溫度55_6〇它）濃縮成油狀進行乾餘。此步驟可重覆二次。此油脂再次溶解至二曱基醯胺（3 公升）中然後添加1，1 —羰基二咪嗤。此溶液於5 下加熱2 1 /2小時。添化劑以添加量（33克）加入後持續加熱2 1 / 2小時。此溶液再以旋轉式蒸發器（水浴溫度5 5 —6〇它）濃縮成油狀。此產物油脂溶解在去離子水中至傳導係數等於〇. 2 M NH4HC〇3。此溶液置入 sephadex DEAE-A25 管柱 (Pharmacia, Upsala，Sweden ;預先充入 1·0 M NaHC03 並以2官柱量的去離子水清洗）中。此管柱以下列溶液依不同目的進行清洗：60公升的〇· 25 M NH4HC03，120公升的〇· 275 M NH4HC03，40 公升的〇· 30 M NH4HC03，和40 公升的· 〇· 35 M NIHCO3。收集以HPLC分析測定含有足夠量的純二‘

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第19頁 593331 案號 87121475 年月曰_修正五、發明說明（15) 尿苷四.磷酸鹽的部份並以旋轉式蒸發器（水浴溫度5 5_6〇 °C )濃縮。此產物殘餘物以去離子水（丨· 5公升）溶解再以旋轉式蒸發器濃縮。此步驟重覆丨5次或直到過多的二碳酸鹽緩衝液被移除為止。此產物油脂以足夠量之去離子水溶解至形成ca· 10%浴液。此溶液載入D〇wex 50Wx4Na+ (Dow) 管柱中，並以去離子水清洗。收集含^匕的部份並濃縮至 ca. 10-15%溶液，經親基化獲得白色固體狀的^匕四鈉鹽 (150克，約尿昏5’_二鱗酸鹽25%的產率）。已匕P4 -二（尿苷5 ’）-四磷酸鹽，四鈉鹽的結構說明因為在文獻中缺乏非腺苷基化的二核苷酸之適當分光光$ 度數據，P1，P4-二（尿苷5’）-四磷酸鹽，四鈉鹽的完整結構說明使用現代分析技術來執行。分子量以質譜儀測定為 878 [m/z 855，（M-Na+)-]，證實分子式ci8H22N4023P4 . 4Na 。精確地測量C18H22N4023P4 · 3Na [(M-Na+)_ ·•計算值是 854. 9318]值為854.9268。測量的質量與理論質量以5·〇毫質量單位（5· 9 ppm)的差異有99· 7%的可信度。Karl Fisher濕度分析獲得1·73%的水份含量，而更進一步從元素分析獲得的分子式證實：根據分子式Ci8H22N4〇23P4 · 4.、2Na ·丨.IHj (FW二90 2· 4 g/mol)計算得之Na = l 0· 70，發現為1 〇· 81% ; C: P比率計算得之為1 · 7 4，發現為1 · 8 0。經外線光譜顯示在 3 4 2 2 c nr1有寬闊的信號和1 7 0 2 cm-1處也有信號，指出經基 (突出的0-H)和羰基（突出的c = 0)官能基的存在。此外，突出的磷酸卜0可於1 26 5 cm-1處觀察到。在水中的紫外線光譜顯示在262 nm的；I 處有17, 004的莫耳吸收率（ε)。在 _

O:\56\56373.ptc ^3331 修正月曰案號 87121475 五、發明說明（16) 2 5 °c ( c = 1 ’ )時以偏光光度計測量特殊的旋轉角度為〜9.56。。核磁共振（NMR)光譜：iH N〇 (d2〇，TMS) 5 4· 1 1 (m， 2H)，4.14 (m，1H)，4·25 (m，1H)，4·27 (m，1H), 5.84 (d，J = 8.1 Hz，iH)，5.86 (d，j = 5 4 Hz，1H)，7· 81 (d，J = 8· 1 Hz); % NMR (D2〇，TMS) 565· i (d，j = 5· 5 Hz), 69·7，73.5，83.4 (d, J:9.4 Hz)，88.1, 1 02.8, 1 4 1.5, 1 5 2.9, 1 6 7.5; 31P NMR (D20, H3P04 std) δ - (m)’ - 1〇·75 σ1Η 結合 31p 光譜顯示因 1H 結合導致在5-10· 75 ppm處重覆而有信號加寬的現象。因此此重覆處確定為P 。在〜22·23 ppm處沒有1結合重覆的效應’以P表示此處的欠缺。核的翻轉效應（N〇E)乃從&對 I，和I，醣質子來觀察。因為&不可能顯示醣質子的 n〇e，因此證貫是I。此外，叱的取代被證明，因為&取代的結構沒有嘧啶-醣moe。另外二度空間的NMR實驗處理用於證實連結方式。hmqc 顯示h5對(：5與116對(：6的連結方式，確定C5和匕。c〇SY和_連。方式疋由Hs對Hs觀察得之，證明是&。鍵結連結 i ϊ=對[v:6對Ηι，，Ηι.對，He對c2觀察得之。這些 Η :代。Hl，對H2的C〇SY連結方式，證實是 2 11 口 2’代2,的⑽卩。連結方式證明c和C 。此外’眶顯示_4的2-鍵丁結方式，證實是;乂帶

Di Pi光m5顯示碳在5 6 5.1時相對於其他全部的碳原、仃、此觀察證實cs.是碳烯。P對碳原子的結合在

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593331 案號 87121475 五、發明說明（17) (5 6 5. 1和8 3 · 4證明C5,和C4，，因為C：4，是僅與碳烯結合。此外 HMQC顯示(V對&和C4,對H4,的連結方式，證實了 H4,和H5,。觀察ΗΓ對!^，，He對Hr和He對Hs,的NOE，證實了 /5醣反向異構物結構。結論，從商業可利用的起啟物質經總反應時間5小時合成150克P，P-^一（尿甘5，）-四構酸鹽，四納鹽，產率為 2 5 %。粗的產物可以藉離子交換層析化有效純化且反應產物的結構清楚地以質譜儀，NMR和其他分析技術證明。實例2 iU尿脊5’ -單一鱗酸鹽製造二屁茌四碰醢鹱，四銨鹽的方钃尿杳5’-單磷酸鹽（Sigma, Milwaukee，3.0 克，9·26 毫莫耳）溶解在乾燥的DMF (10毫升）和三丁基胺（Aidrich，2 毫升）中。此溶液在40 °C的真空中蒸發成油狀。此殘餘物以乾燥的DMF (Aldrich，8毫升）溶解形成溶液。添加羰基二味唾（Aldr ich，1 · 65克，1 〇· 1 8毫莫耳）至此溶液中，加熱至50 °C反應1小時。尿苷5,-三磷酸鹽（Yamasa，5. 60 克，10.18毫莫耳）以無水三丁基銨鹽溶於DMF (5毫升）和三丁基胺（2毫升）中來製備，製備方法如下面實例3所述，後添加至反應溶液中。當溶液在真空中蒸發成油狀此混合物允許在5(TC下攪拌3天，然後再溶解在水中（5毫升），並藉由管柱（ 3 0 0 X 50 mm)層析法（Sephadex DEAE —A25 , 40-120 // ’Aldrich，預先充滿 ι·〇 M NaHC〇3 並以2 管枉量的去離子水清洗）以至〇·3 M NH4HC03的階梯式清洗進行·

593331 _案號87121475—_年月日佟正__ 五、發明說明（18) 純化。純的部份以3 5 °C真空濃縮，並加水再蒸發5次以獲得白色固體狀的二尿脊四填酸四銨鹽（2.37克，產率 3 0%):藉HPLC以相同停滯時間作為標準純度92. 11%。此外，四銨鹽以FABMS分析獲得質量為788. 9857 [〇18^4 023?4(^[-11卞：計算值為 788.9 8 6 0 ]，證實(：1811261〇23?4 游離酸態的基本分子式。

實例3A 使用尿甘5 ~~二填酸鹽（UTP)製造二尿甘四碟酸鹽四錄鹽的方法尿苷5’-三磷酸（1]了？）三鈉鹽（？1^〇6丨〇8丨111:，¥3^3 6， Italy ’5·86克’0.01莫耳）溶在水（5毫升）中的溶液經過 BioRad AG-ΜΡ 50 (Aldrich)強陽離子交換樹脂在其三丁基胺形式中（充滿5 0升的容量）的管柱並以蒸館水（約3 〇〇毫升）進彳亍/月洗。此〉谷液添加二丁基胺（A1 d r丨c h，5毫升），並搖晃此懸浮液直至水溶液部份pH值上升至8。分離的各層和水溶性溶液蒸發至少量；然後進行親基化反應隔夜。殘餘物溶在乾燥的二曱基醯胺（Aldrich ; 2〇毫升）中，並在0 · 1 inmHg壓力下將溶劑蒸發。乾燥的三丁基胺鹽與無水丙酮形成100毫升的原液（〇·丨M的叮”添加碳化二環己亞胺（DCC) (Baker, Phill ipsburg ;〇·227 克，1·2 毫莫耳）至旎元全反應量的前述U ΤΡ溶液（ι〇毫升，丨·〇毫莫耳）中在至溫下攪拌3 〇分鐘。此混合物加至尿苷5，—單磷酸鹽的三乙基π胺鹽（2.0¾莫耳，藉添加三乙基胺（〇·5毫升）至尿苷 -單磷酸鹽（UMP) (Sigma ; 〇· 6 48克於DMF中）溶液中，再洛發至乾燥製成）中。此懸浮液

O:\56\56373.ptc 第23頁 593331 _案號 87121475_年月 J_修正 —__ 五、發明說明（19) 物加入乾燥DMF至5 · 0毫升，置於40 °C下24小時。此反應混合物以半製備的離子交換層析法（Hamilton PRP X-100管柱）；用0 -1. 0 Μ的碳酸氫濃度階梯清洗，5毫升/分，3 0分鐘以分離。二尿甘四碟酸鹽的洗出在21和23分鐘間，此產物（產率為叮？的76.7%)以紫外線於入_ 2 6 3]1111吸收率與ρι，Ρ4-二（尿苷5’）-四磷酸鹽標準溶液比較予以定量。

實例3B 使用尿苷5’ -三磷酸鹽（UTP)和大詈活化劑製造二尿苷四磓酸鹽四銨鹽的方法 UTP轉變成pi，P4-二（尿苷5’ —四磷酸鹽）可藉由三丁基胺I. 鹽（0.1毫莫耳）和大量DC C (0.1克，〇·5毫莫耳）活化來提昇；在這個例子中沉澱的二環己尿素可以過濾去除，反應混合物以趟類（i 〇毫升）萃取然後將殘餘物溶在先以三丁基胺UMP (0·2毫莫耳）處理過之乾燥DMF中。經過反應混合物 +的層析分離再以如上述實例3A的紫外線吸收法來定量，尿苷四磷酸鹽產物是在混合物中尿苷化種類的5 〇 · 7%，對應從UTP轉變而來的95. 9%。心

實例4A

AJI鹽製造二尿茌四石I 毯_用以幾基^ 活化尿

酸鹽四銨鹽^ 尿苷單磷酸鹽（UMP) ( 0.32 4克，丨〇臺茬耳）&經y 乾燥DMF (5毫升w 一 τ * 1·ϋ笔矣耳），谷％< 物中形成溶液進耔“么$ ☆ ρ 倣升，1笔莫耳）的混《 —丁基胺瓜。殘餘物溶解在DMF (5毫更多次以獲得盔水一丁 Α_…、後再以DMF進仃二次資

第24頁 593331 年修正屋號 87121475 五、發明說明（2〇) ::容二’唾(cdi) (°.81克，5毫莫尋）。 , 硭'、日卞，然後加入甲醇（3 24微升，8毫莫界）去二量的CM。溶液靜置1小時。添加三丁基胺隹磷酸鹽 (於室，下=克，〇.5毫莫耳)並將㈣ HPLC:: =二三小日"後以水結束反應，將混合物置入苔5,）四^二二A。由在26 3 nm的吸收率定量P1，P4-二（尿甘5 )-四蝣酸鹽的產率是9· 3%。

實例4 B 甘四碟酸鹽四聋鹽之~~-—~ ^-- :ΓΛ=三二胺鹽(1.°毫莫耳)，製造方式如上，溶解在乾知的二氧陆圚α古苯基膦氯酸鹽（〇 3毫升)$ σ F (1耄升）混合物中。二室溫下靜置3小時。溶“ ：：=(〇· 3毫升)加入溶液中晃後靜置於4 t下30分= 喊類(〜1〇毫升)搖丁基胺焦-酸鹽( 0.228克，〇犬51 而殘餘物溶解至三液中。此溶液貯存於室莫耳)於_ (3毫升)溶應並將混合物置入HPU d二=小時後以水中止反 ^ (尿甘5 )'四鱗酸鹽的產率是u%。 ( _脊四磷酸鹽四用尿苷、二焦磷酸鹽銨鹽的方法口尿苷（Aldrich，〇· 244公香，丨荟苗甘、酸鹽（Aldnch，5毫升）中/; Z莫耳）溶解在三曱基磷中然後加入三丁基胺（ 44 6微升，2 O:\56\56373.ptc 第25頁 593331 修正曰 i 號 87121475 五、發明說明（21) 毫莫耳）。此溶液在添加二素丄，！毫莫耳）時置於0度下;^化^碟（〇·153克（93·2微升） 0 °C下攪拌3小時。三丁基…\後獲得之懸浮液持續在浮液中於室溫下攪拌3小時。…以:=鹽（〇·、228克）添加至懸酸鹽中止反應並以氯碳烯萃 · Μ水溶性三乙基胺重碳性溶液置入HPLC中如上：：：，除三甲基鱗酸鹽。此水溶尿脊轉換犯二（尿^列3Α :由263 —收率來定量 ψριβ 乂甘5 )-四磷酸鹽是6.83%。尿苷5’-單磷酸鹽（UMp) ( 64 8毫克，〇2 乾燥=3毫升）中，在添加焦鱗酸氯⑴^耳升)(=在 mg)，0· 1笔莫耳）時置入冰中攪拌。溶液變成幾乎立成霧狀，然後大量的半結晶白色沉澱形成並不丨—2分鐘^ 變成膠狀質地。此混合物在室溫下貯存隔夜後，以反應，並置入HPLC中如上述實例3A。以263 nm吸收 P1，？4-二（尿苷5，）-四磷酸鹽產率是15 8%。所獲得ρι p3—= (尿苷5’）-四磷酸鹽（25· 4%)的實際量作為主& ，- 實例7 初。 ρ1，上t 士 (一座鈉鹽的水滚i安定忡另、:容{ 解度 ""~~ --— P1，P4-二（尿苷5,）—四磷酸鹽，四鈉鹽在水中的體部份至已知量的去離子水中直到溶液變成“。在水中取大的溶解度被測定為ca9〇〇毫克/毫升。固體或 593331 MM 87121475_修正瓦、發明說明（22) --— 溶液的安定性研究是在低溫（5 °c )和提高溫度（40 解。 4置三個月後以HPLC分析測定顯示少於1· 5%被降，=〜二（尿苷5,）—四磷酸鹽的四鈉鹽被測定出有較好 &解度和安定性適合醫藥上應用。

pi 在動物身h的表拇已一 / —(尿苔5 ’）-四磷酸鹽，四鈉鹽的非臨床毒性描述析、系列基因毒物學分析來評估包括細菌反轉突變分今爲1舌體外哺乳類細胞基因試驗，活體外哺乳類細胞基因大f试驗，老鼠的巨核細胞基因分析。在兔子的研究測試局部眼睛耐受度和每天多次投予超過6週的慢性眼睛毒性。此外，P1，P4-二（尿苷5，）-四磷酸鹽、四鈉鹽也被試驗在老氣和狗二種單一劑量急性吸入毒性研究。和在狗的單一劑量急性注射毒性研究。這些研究結果顯示P1，P4-二（尿苷5，）-四磷酸鹽，四鈉鹽’在一系列基因毒物學分析上不具基因毒性。在眼睛毒性分析研究上也沒有不利的發現。有低程度的急性毒性被發現在單一劑量吸入（鼠、狗）和注射（狗）毒性研究。 P’P — —（尿脊5，）-四填酸鹽，四銅鹽因此決定有良好的毒物學描述在人類使用上有寬闊的安全極限。實例9 瑞酸鹽，四鈉鹽在正常人類志願主^ p，p —(尿脊5，）-四填酸鹽’四納鹽以型悲i ’雙盲，

曰修正五、發明說明（23) 對照安慰劑，提昇劑量性和耐受性研究。4 〇么估在7 5名健康男性志願者的安全者一組共5組劑量系列名進非吸^者和3 5名吸煙者每⑴立志願單-噴霧劑量的Ρι，ρ4二仃/二，、每-組中包含12人接受 ( 20-40 0毫克）和4位接了(—尿尉^ r)_四構酸鹽，四納鹽列不良的現象發生。在FFV , Fvr )'又有糸在h vc，MMEF，臨床實驗，；[2 — 釔ECG，或尿液分析結果上安慰劑組或活性藥物組皆無明顯變異。在吸煙者，投藥5分鐘内pi，p4_:(尿苷5,）_ ‘四磷，鹽，，四鈉鹽產生2倍至7倍劑量依賴性增加咳吐痰的重量’並且在下次痰液收集前持續有痰被刺激咳出。pl，P4 一二（尿苷5’）-四磷酸鹽，四鈉鹽在非吸煙者引起咳吐痰的效應也同時被觀察。結論，P1，P4-二（尿苷5,）—四鱗酸鹽，四鈉鹽在正常男性是安全和耐受性佳且與安慰劑相比可有效刺激咳痰。

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Claims

5933311 A, βΐ- 9a5.〇4 ‘撫號 87121475

丰次—、一轉專现範圍 •種 P1，方性物 -4- — 甘應鹽 1 . 2. 3. 法 a ) b) 酸 5 C ) 類二（尿苷5’）-四填酸鹽，四納鹽。一種P1，P4 -二（尿苷5 ’）-四石粦酸鹽，四敍鹽。一種合成式I化合物及其醫藥可接受鹽類之方法，該包括：溶解一種式I I a - d之尿苷或尿苷核苷酸化合物至極質子惰性有機溶劑和疏水性胺中；以一種式I V a - b的磷醯化劑磷醯化，以產生式I化合及/或以一種式I I I a - c之活化劑活化該尿苷或尿普核化合物之磷酸基，以及與一適當之式I I b - d化合物反以產生式I化合物；及藉離子交換層析法純化該式I化合物及其醫藥可接受式I 。:6 〇 OH 〇H οχ I ox 0 0 0 II 11 Π H 〇—p—p一0一Ρ—0一Ρ—ο ox

OH OH 其中： X是選包括N a和Η，其條件為全部X基團不可均為Η

O:\56\56373-930503.ptc 第30頁 593331 案號87121475 @年^月日修正

O:\56\56373-930503.ptc 第31頁 593331 案號 87121475 月曰修正申請專利範圍〇 HN Λ 〇〇 I! II HO 一 Ρ一 0一 Ρ一〇 OH 1 OH 及其鹽類；。次N OH OH 式 lid: UTP

N 二 C=N 25 i A Ri 其中Ri和1係獨立選自由Ci-q烷基，環烷基，及芳基所組成之群，其中該烷基、環烷基或芳基係視情況經羥基或胺基取代；式I I I b :活化羰基 Λ O:\56\56373-930503.ptc 第32頁 11 593331 案號 87121475 月修正申請專利範圍其中X係獨立選丨包括：味唾，四嗤和鹵素式I I I c : 活化石粦酸〇 \\ R,— ?一 X r2 其中X是鹵素，而尺丨和!^各獨立選自包括：Ci-C8烧基，環烷基，Ci-Q烷氧基，環烷氧基，芳基，芳氧基及鹵素，其中該烧基、環烧基、烧氧基、環烧氧基、芳基或芳氧基係視情況以羥基、胺基、烷氧基或i素所取代；式I V a :單磷醯化劑〇 Η X —Ρ—X 1 X 其中X是i素；式I V b ·· 二石粦酉篮^[匕劑

O:\56\56373-930503.ptc 第33頁 593331 修正案號 87121475 申請專利範圍其中X係選自由氧、羥基、鹵素及其鹽類所組成之群。 4 .根據申請專利範圍第3項之方法，其中式I I I a化合物係選自包括：二環己基碳化二亞胺和1 - ( 3 -二曱基胺丙基） -3 -乙基碳化二亞胺鹽酸鹽。其中式I I I b化合物二哇）。其中式I I I c化合物膦二氯酸鹽，二氯化其中式I Va化合物是其中式I V b化合物係其包括使如申請專極性、質子惰性有機利範圍第3項所述之以層析純化。，其包括使一種如申溶於極性、質子惰性請專利範圍第3項所接著與一種如申請專，然後以層析純化。，其包括使一種如申 5 .根據申請專利範圍第3項之方法係選自包括：幾基二σ米哇和幾基二（i 6 .根據申請專利範圍第3項之方法係選自包括：二苯基膦氯酸鹽，苯基苯基膦醯和氯二苯基次膦醯。 7 ·根據申請專利範圍第3項之方法氯化磷醯。 8.根據申請專利範圍第3項之方法選自包括：氯化焦磷醯和焦磷酸鹽。 9 .根據申請專利範圍第3項之方法利範圍第3項所述之式I I c化合物溶於溶劑和疏水性胺中，以一種如申請專式I I I a - c活化劑處理該化合物，接著 1 0 .根據申請專利範圍第3項之方法請專利範圍第3項所述之式I I b化合物有機溶劑和疏水性胺中，以一種如申述之式I I I a - c活化劑處理該化合物，利範圍第3項所述之式I I d化合物反應 1 1 .根據申請專利範圍第3項之方法

O:\56\56373-930503.ptc 第34頁 593331 案號 87121475 码年左月曰六、申請專利範圍請專利範圍第3項所述之式I I d化合物溶於極性、質子惰性有機溶劑和疏水性胺中，以一種相等莫耳量之如申請專利範圍第3項所述之式I I I a- c活化劑處理該化合物，接著與一種如申請專利範圍第3項所述之式I I b化合物反應，然後以層析純化。 1 2 .根據申請專利範圍第1 1項之方法，其中係使用過量活化劑。 1 3 .根據申請專利範圍第3項之方法，該方法包括使如申請專利範圍第3項所述之式I I b化合物溶於極性、質子惰性有機溶劑和疏水性胺中，以一種如申請專利範圍第3項所述之式I I I a - c活化劑處理該化合物，接著與一種如申請專利範圍第3項所述之式I Vb化合物反應，然後以層析純化。 1 4.根據申請專利範圍第3項之方法，其包括使如申請專利範圍第3項所述之式I I a化合物溶於極性、質子惰性有機溶劑和疏水性胺中，以如申請專利範圍第3項所述之式 I V a - b鱗Si化劑處理該化合物，然後以層析純化。 1 5 .根據申請專利範圍第3項之方法，其包括使如申請專利範圍第3項所述之式I I b化合物溶於極性、質子惰性有機溶劑和疏水性胺中，以如申請專利範圍第3項所述之式I V b 磷醯化劑處理，然後以層析純化。 1 6 . —種用以治療哺乳動物慢性阻塞性肺病之醫藥組合物，其包含有效慢性阻塞性肺病治療量之如申請專利範圍第1或2項所述之化合物。 1 7. —種用以治療哺乳動物鼻竇炎、中耳炎或鼻淚管阻

O:\56\56373-930503.ptc 第35頁 593331 _案號 87121475_&年f 月曰__ 六、申請專利範圍塞之醫藥組合物，其包含有效清除分泌黏液量之如申請專利範圍第1或2項所述之化合物。 1 8 . —種用以治療哺乳動物乾眼症之醫藥組合物，其包含有效乾眼症治療量之如申請專利範圍第1或2項所述之化合物。 1 9 . 一種用以治療哺乳動物視網膜剝離之醫藥組合物，其包含有效視網膜剝離治療量之如申請專利範圍第1或2項所述之化合物。 2 0 . —種用以治療或預防哺乳動物肺炎之醫藥組合物，其包含有效預防肺炎治療量之如申請專利範圍第1或2項所述之化合物。 2 1 . —種用以幫助哺乳動物痰誘發之醫藥組合物，其包含有效幫助痰誘發量之如申請專利範圍第1或2項所述之化合物。 2 2 . —種用以幫助哺乳動物咳嗷之醫藥組合物，其包含有效幫助咳嗽量之如申請專利範圍第1或2項所述之化合物。 2 3. —種用以治療女性不孕或因陰道乾燥所導致之陰道刺激之醫藥組合物，其包含有效陰道乾燥治療量之如申請專利範圍第1或2項所述之化合物。 2 4.根據申請專利範圍第1 6至2 3項中任一項之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含一種醫藥上可接受載劑。 2 5 .根據申請專利範圍第1 6至2 3項中任一項之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係經殺菌。

O:\56\56373-930503.ptc 第36頁 593331 修正案號 87121475 \、申請專利範圍 2 6 .根據申請專利範圍第1 6至2 3項中任一項之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係呈膠體、水溶液、顆粒或粉末形式。 2 7.根據申請專利範圍第1 6至2 3項中任一項之醫藥組合物，其包含至少9 2 %純度之P1，P4 -二（尿昏5 ’）四填酸鹽，四錢鹽。

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