TW590775B - Pharmaceutical compositions for increasing or decreasing phagocytosis in mammalian cells - Google Patents

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590775 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

五、發明説明（1 )1·發明範疇 本發明係有關一種產生細胞呑嗤作用與細胞吸液作 用及/或降低細胞呑噬作用與細胞吸液作用之方法。更 特定言之，本發明係有關影響細胞呑噬作用與細胞吸液 作用，且可用為許多用途之製劑之化合物，例如：用於 加強免疫反應，促進傷口癒合、加強肺纖維母細胞納食 毒性粒子或微生物之能力，並增加或減少色素沈積，等 等。2·發明背景 本發明係有關細胞納食粒子或包膜粒子或實体之能 力。其包括（但不限於）二種主要過程··細胞呑噬作用 及細胞吸液作用，及藉由細胞與細胞之間互相納食物質 之細胞一細胞交互作用，細胞呑噬作用過程使細胞納食 及通常分離或破壞粒狀物質。在脊椎動物中，這種過程 為各種白血球及網狀内皮細胞之功能特性，為動物体内 對抗微生物感染或防止外來粒子與組織碎片閉合粘液表 面或組織之重要防衛機轉。 細胞吞噬作用亦用於自黑細胞中轉移含黑色素之黑 色体至角質細胞中。此時，所轉移之物質黑色素未受破 壞，而疋用於保護角質細胞之細胞核，以免受到紫外光 (UV)破壞。細胞吸液作用為細胞利用套疊及夾緊胞漿 膜吸收液体。所有此料程在下文中均稱為細胞呑嗟作 用及納食作用。 L -- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 • 1- I- s !1 I- 本紙張尺纽财 590775 A7 ___ __B7 五、發明説明（2 ) — ' 在不同細胞巾調節細胞吞嗟作用之能力有重要的意 義。例如··增加免疫細胞納食外來物体（如··細菌與病 毒）之能力來加強免疫反應。此細胞不僅包括循環中之 巨噬細胞，也包括其他細胞如··皮膚藍蓋罕氏細胞，纖 維母細胞及角質細胞。另一個例子為藉由提高傷口角質 細胞與纖維母細胞之細胞呑噬能力促進傷口癒合，特別 指受感染’糖尿病或慢性傷口。第三個例子為加強肺部 細胞呑噬作用，以降低或防止感染及曝露到毒性物質 如·石綿或“二手煙”。第四個例子係有關利用角質細 胞-黑細胞交互作用來調節色素沈積作用。提高及降低角 質細胞之細胞吞噬能力會分別導致膚色加深及淡化，因 為角質細胞會改變黑色体吸收速率。 本發明係有關受蛋白酶活化之受体，且特別指（但 不限於）：PAR-2。向上調節PAR_2之結果會加強細胞 呑噬作用，而向下調節PAR_2之結果則降低細胞呑噬作 用。 受蛋白酶活化之受体_2 (PAR_2)為一種與七個穿 膜G蛋白為偶合之受体，該受体與凝血酶受体（tr， 亦稱為PARd，及PAR-3)之序列相關，但不同。這二 種受体均在細胞外區域，經由蛋白質水解作用裂解精胺 酸·絲胺酸而活化。新形成之N—末端則再活化此等受体 成為鏈結之配体。這二種受体均受胰蛋白酶活化，但僅 TRs受凝血酶活化。僅PAR_2受肥大細胞類胰蛋白酶活 -4- 本紙張尺緖準（GNS )公瘦） ί — (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 s\ 590775 A7 ------ —一 B7 __ 五、發明説明（3 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 化。這二種受体亦可受相當於其新N-末端之肽活化，不 受受体裂解作用影響。SLIGRL (小白鼠PAR-2活化 肽）在活化人類受体上具同等效力。雖然TR之功能已 有報告詳細說明，但PAR-2之生物學則尚未完全了解。 PAR-2活化作用在抑制角質細胞生長及分化上之角色近 年來已有詳細說明（狄李恩（Dedan)等人，“新穎蛋 白酶活化受体對人類角質細胞之生長與分化之差異性調 郎作用（Differential Regulation of Human Keratinocyte Growth and Differentiation by a Novel Family of Protease-activate Receptors)，Cell Growth & Differentiation，Vol· 8, pp 743-749, 1997 年 7 月）。 發明總結 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 根據本發明，我們已發現一種改變哺乳動物細胞吞 噬作用之方法，其包括對哺乳動物施用一種可作為胰蛋 白酶、類胰蛋白酶、絲胺酸蛋白酶或PAR-2促效劑以提 高細胞呑噬作用之化合物，或施用可作為胰蛋白酶抑制 劑、或類騰蛋白酶抑制劑、或凝血酶抑制劑或作為PAR-2抑制劑以降低細胞呑噬作用之化合物。 本文中採用之“哺乳動物”指“包括哺乳動物綱在 内之較高等脊椎動物”之任何成員（如韋氏醫學小字典 407 ( Webster’s Medical Desk Dictionary 407) ( 1986) 之定義），其包括（但不限於）人類。本文採用之“受 体”係指細胞内及細胞外受体，且應指可以接收及轉導 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 590775 A7 B7 五、發明説明（4 ) 訊號之分子。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 蛋白酶活化受体-2(下文稱為“PAR-2”）為一種絲 胺酸蛋白酶活化受体，其表現在許多組織中，包括角質 細胞及纖維母細胞。凝血酸受体（亦稱為PAR-1 , PAR-3，下文稱為“TR”）為表現在許多組織中之絲胺胺酸 —蛋白酶活化受体。PAR-2與TR之生物角色並不完全 了解。我們相信，仍有其他未鑑定之蛋白酶活化受体。 由於PAR-3會還原成PAR-1，因此我們認為仍有其他具 有與PAR-2之角色類似或角色重疊之蛋白酶活化受体。 我們已發現PAR-2途徑影響細胞吞噬作用。我們發 現凝血酶及胰蛋白酶抑制劑及PAR-2拮抗劑可用為降低 細胞吞噬能力之製劑。PAR_2促效劑及絲胺酸蛋白酶 (如：胰蛋白酶或類胰蛋白酶）可用為增加細胞吞噬能 力之製劑。此外，PAR-2適用為調節細胞呑噬作用之製 劑之作用目標，其他具有類似（但不相同）PAR-2角色 之蛋白酶活化受体亦適用於調節細胞吞噬作用。 較佳具体實施例之詳細說明 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Δ 我們已發現，絲胺酸蛋白酶及PAR-2促效劑可用於 提高細胞吞噬作用，而胰蛋白酶與類胰蛋白酶抑制劑與 PAR-2拮抗劑之作用則可降低哺乳動物細胞之細胞吞噬 作用。有一種可作為凝血酶與胰蛋白酶抑制劑且具有降 低哺乳動物細胞呑噬作用活性之化合物為（S)-N-甲基_D-苯基丙胺醯基-N-[4-[(胺基亞胺甲基）胺基]-1-(2-苯并噻唑 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 590775 A7 B7 五、發明説明彳) 羰基）丁基]脯胺醯胺（化學摘要(Chemical Abstracts) 名稱）（下文稱為“化合物I”）。此化合物說明於美國 專利案N〇.5,523,308及柯斯坦索（Costanzo)等人，“檢測 S :副位置之強效凝血酶抑制劑：以雜環活化羰基為主 之三狀過渡狀態類似物”（Potent Thrombin Inhibitors That Probe the S/ Subsite: Tripeptide Transition State Analogues Based on a Heterocycle-Activated Carbonyl Group), J· Med· Chem，1996, Vol· 39, pp 3039-3043，其結 構式如下： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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、1T d 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 ^ 案 我們相信仍有其他類似此化合物及示於美國專利不 Ν〇·5,523,308(其係以提及之方式併入本文中）且可作為凝 血酶及/或胰蛋白酶抑制劑之化合物，或具有D_苯基丙 胺酸·脯胺酸-精胺酸特性且可作為凝血酶與/或胰蛋白 酶抑制劑之化合物亦適用於本發明方法。我們相信仍有 其他抑制胰蛋白酶之化合物（如：絲胺酸蛋白酶抑制

590775 A7 B7 五、發明説明（6 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 劑，特定言之大豆胰蛋白酶抑制劑（ST))適用於本發明 方法。大豆萃物及其他由大豆製造之天然產物（如：大 豆奶、味噌，等等）亦可利用此機轉降低細胞吞噬作 用。 我們亦已發現，PAR-2促效劑及絲胺酸蛋白酶 (如：胰蛋白酶）可用為提高細胞吞噬能力之製劑。特 定言之，作為PAR-2活化劑之肽SLIGRL及SLIGKVD 可誘發細胞之吞噬能力。我們相信仍有其他會活化PAR-2之化合物，如：結合活化PAR_2之肽或分子之衍生物 或類似物亦適用於本發明。 雖然不希望受到理論限制，但我們認為可以影響細 胞吞噬作用過程之化合物係藉由直接或間接與PAR-2交 互作用而直接或間接影響細胞呑噬作用。本發明化合物 可能誘發（若欲提高細胞吞噬作用時）或降低（若欲降 低細胞吞噬作用時）自環境或自其他細胞納食物体之訊 號。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ^ 本發明組合物及方法中之活性化合物係利用相關技 藝已知之局部或全身性方法傳送。若需要活性劑之傳送 參數，則本發明活性組合物最好再包括可作為傳送系統 之醫藥上或化粧品上可接受之載劑，使活性劑得以滲入 細胞中。 一種可接受用於局部傳送本發明某些組合物（特定 言之蛋白質如：胰蛋白酶及STI或肽如：SLIGRL及 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 77 907 A7 _____ _ _B7 五、發明説明（7 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) SUGKVD)之載劑可包含微脂粒。更佳者，微脂粒為非 離子性且包含a)二月桂酸甘油酯；b)具有膽固醇之類固 醇主幹之化合物；及c)具有約12個至約18個碳原子之 脂肪酸醚，其中微脂粒之組成化合物比例約37 5 : 12 5 ： 33·3 : 16·7。最佳微脂粒包括二月桂酸甘油酯/膽固醇/ 聚氧乙烯_10-硬脂基醚/聚氧乙烯_9_月桂基醚(gdl微 脂粒）。較佳者，微脂粒含量佔組合物總体積約1〇毫克 /毫升至約100毫克/毫升，更佳者約25毫克/毫升至 約50毫克/毫升。最佳比例約37·5 : 12 5 : 33 3 : 16.7。 合適之微脂粒最好根據我們的專利申請案序號 60/053942(1998年7月28日申請)所示之方法製備，但 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 此相關技藝上常用之其他方法亦可接受。上述說明之組 合物製法可由所需組成份於合適容器中組合，於周邊條 件下，於相關技藝上用於非離子性微脂粒製劑之任何習 知高剪力混合裝置中進行混合，如述於尼米亞克 (Niemiec)等人，“非微脂粒組合物對局部傳送肽藥物進 入皮囊與皮脂腺單位之影響：使用倉鼠耳模式之活体内 試驗”（Influence of Nonionic Liposomal Composition On Topical Delivery of Peptide Drugs Into Pilosebacious Units: An In Vivo Study Using the Hamster Ear Model )，12 pharm Res· 1184-88 (1995)( “尼米亞克”）（該案係以提 及之方式併入本文中）。已發現，本發明組合物中含有 這些微脂粒可加強本發明組合物之能力。 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準( CNS ) A4規格（210X297公釐）

V 590775 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ---—---- B7___ 五、發明説明（8 ) 另一項具体實施例中，局部用活性醫藥或化粧品用 組合物可視需要與其他成份組合，如··保濕劑、化粧品 辅劑、抗氧化劑、界面活性劑、發泡劑、調理劑、濕化 劑、香料、增調劑、緩衝劑、防腐劑、防曬劑、等等。 局部用活性醫藥或化粧品用組合物之施用量應可有 效改變哺乳動物皮膚之細胞吞噬作用。本文採用之“有 效量係指足以覆蓋希望改變細胞呑噬作用之皮膚表面 區域之量。較佳者，當希望改變細胞呑噬作用時，施用 至皮膚表面之組合物用量應使每平方公分皮膚表面含有 約2微升至約8微升局部活性劑。 我們已意外地發現，當在培養之細胞中施用活性 劑，如：PAR-2促效劑及/或抑制劑及胰蛋白酶與凝血 酶或其抑制劑時，可顯著改變細胞吞噬作用。 本文所揭示之本發明適合在缺少本文未明確說明之 任何組成份、成份或步驟下操作。下文中出示數種實例 進一步、說明本發明及其進行方法。然而，本發明不應 受限於其詳細内容。 為了棟时PAR-2途徑在細胞呑嗟作用中之可能角 色，因此使用試管内模式系統。一種所採用之模式系統 包含原發人類角質細胞或人類角質細胞株。下列實例 中’以試驗化合物處理細胞1小時至3天不等，樣本再 經螢光微粒處理2小時。採用螢光顯微鏡為細胞所納食 之小珠照相。 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） IL------春衣II (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 590775 A7 B7 五、發明説明（9 ) 實驗方法如下： 實例1: SLIGRL及化合物I影響細胞吞噬作用 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 採用人類原發角質細胞或人類角質細胞株作為試管 内模式系統來研究PAR-2調節劑對細胞呑噬作用之影 響。所採用人類原發角質細胞為購自加州克倫狄克公司 (Clonetics of San-Diego, CA)之商品。細胞塗佈在有隔間 之載玻片上，每片2個隔間，每個隔間60,000個細胞。 以化合物1(1μΜ)或SLIGRL(lOpM)或載劑（磷酸鹽緩衝 生理食鹽水，PBS，來自奇布可公司（Gibco-BRL of Gaithersburg, MD)處理細胞，每天一次，共2或3天。 接受試驗化合物處理2或3天後，細胞曝露在尼羅紅 (Nile-red)螢光微粒中，直徑1微米，50個微粒/個細 胞，於37°C下2小時。微粒來自優金分子探針公司 (Molecular Probes of Eugene，OR)，並根據廠商之指示力口 工。經過該處理後，細胞與15%胎牛血清(FBS，來自奇 布可公司）培養，於37°C下15分鐘，以PBS潤洗。之 後，自載玻片上取出隔間，以甘油及蓋玻片覆蓋載玻 片。使用蔡司（Zeiss) Axiovert 35 或尼康（Nikon) Optiphot-2顯微鏡進行螢光顯微探視法。 圖1由人類原發角質細胞經載劑（對照組）、化合 物I或SLIGRL處理2天後之三張照片組成。由圖可 見，微粒被對照組角質細胞納食，並分佈在細胞核周 圍。亦在細胞周圍發現微粒，可能歸因於其非專一性附 -11- 本紙張尺渡適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 590775 A7 ___________ B7 五、發明説明（10 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 接細胞所分泌之細胞外基質組成份所致。所納食之微粒 數量隨處理差異而變化。使用化合物I(PAR-2活化作用 之抑制劑）之處理結果大幅減少納食之微粒數量。使用 SLIGRL (PAR-2活化肽）之處理結果大幅增加納食之微粒 數量。當改用人類角質細胞株替代原發角質細胞時，亦 得到相同結果。母項實驗均重覆至少3次。此實驗證明 調節PAR-2途徑之化合物亦可調節角質細胞吞噬作用 程度。 實例2: PAR-2訊號與細胞呑噬作用之間之劑量一效應 關係 依實例1之相同方式，以逐漸提高濃度之SLIGRL (PAR-2肽促效劑），〇，5及1〇μΜ，處理人類角質細胞2 天。提高SLIGRL (PAR-2活化劑）之濃度會提高細胞呑 噬作用。亦依實例1之方法，以逐漸提高濃度之化合物 I處理2天。以1PM至ΙμΜ逐漸提高濃度之化合物 I(PAR-2活化作用之抑制劑），會使細胞呑嗟作用出現隨 劑量提高而作用下降之現象。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 $ 實例3:化合物I效應需要細胞-細胞接觸 由於PAR-2表現在角質細胞上，而非黑細胞上， 因此我們試驗化合物I對來自黑細胞之黑色素体細胞呑 噬作用之影響可能需要之角質細胞-黑細胞接觸。取原發 黑細胞培養物（購自克倫狄克公司之商品）塗佈在表皮 同等物（Epi Derm，馬特公司（Mat Tek，Ashland，ΜΑ.) -12- 本紙張尺度適用—中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐)~~" 一 ' 590775 A7 B7 -- -丨· -~五、發明説明（11 ) 下，形成角質細胞與黑細胞之間沒有接觸之共培養物。 與Melano Derm同等物（馬特公司）比較，此同等物中 之黑細胞出現在同等物之底層中。以化合物I及以 2促效劑SLIGRL處理培養物。如表A所示，角質細胞 以“K”表示，黑細胞以“M”表示，缺少角質細胞'累 細胞之接觸則以“K-M不接觸”表示。如表A所示，接 受此等製劑處理之共培養物中，測定其色素沉積度時， 未觀察到對黑色体轉移之影響。在MelanoDerm同等物 中，即如同我們的專利申請案序號60/053,942 (該案已 以提及之方式併入本文）所述，藉由影響黑色素体之轉 移，化合物I降低而SLIGRL誘發色素沈積作用。此等 結果證明PAR-2對黑色素体細胞呑噬作用之影響需要角 質細胞-黑細胞接觸。 表A 處理 共培養t MelanoDerm (K-M不接觸）（Κ-M接觸） ，——·.------餐！ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁〕 • l·- I- ϋ— l·— 訂- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ Ν\ 化合物I 無影響 淡化 SLIGRL 無影響 變深 TFLLRNPNDK 無影響 無影響 實例4:化合物I及SLIGRL對細胞吞嗤作用之時間效 應 以化合物I或SLIGRL處理人類角質細胞不同時 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 590775 A7 B7 五、發明説明（12 ) 間，1小時至2天。處理結束時，依實例1所述，以微 粒處理。表B說明此等化合物影響細胞吞噬作用所需之 時間。“ + ”表示對細胞吞噬作用有影響，“一”表示 對細胞呑噬作用沒影響，“ — ”表示對細胞呑噬作 用之影響在邊界範圍。此實驗證明下列活化或抑制PAR-2之作用至少需8小時才可改變角質細胞之呑噬能力。 此表示PAR-2之訊號造成新蛋白質合成，或當需要一段 代謝時間來消除現有之相關蛋白質時，則減少蛋白質合 成。

表B

處理時間 化合物I SLGRL 1小時 - _ 11·1------衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 2小時 - - 4小時 - 一 6小時 - - 8小時 -/+ -/+ 16小時 + + 24小時 + + 48小時 + -14- + 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐）

Claims (1)

1. 590775

   A8B8G8D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 申請案第87120890號 攸 τ 你么如及OCiatent ΑΡΡ1η·No· 87120890 修正後無畫1線之f請專利範圍中文本替換頁-附件(一) -^mgBdgdClaims in Chinese - Rncl. (h 月日送呈)~ (Submitted on May >>，2003) • 一種於所需哺乳動物細胞中增加吞噬作用之醫藥組合 物’其包含治療上吞噬作用增加有效量之PAR_2促效 劑’该PAR-2促效劑係為肽SLIGRL。 2· —種於所需哺乳動物細胞中減少呑噬作用之醫藥組合 物，其包含治療上呑噬作用減少有效量之大豆胰蛋白 酶抑制劑，該大豆胰蛋白酶抑制劑係為（8)_；^•曱基_D_ 笨基丙胺醯基-N_[4_[(胺基亞胺基曱基)胺基]小(2苯并 嗔。坐羰基）丁基]脯胺醯胺。 3· 種冶療或預防患有由增加適當細胞中吞嗟作用而改 善的障礙之哺乳動物之醫樂組合物，其包含治療上吞 嗟作用增加有效量之PAR-2促效劑，該PAR-2促效劑 係為肽SLIGRL。 4· 種/σ療或預防患有由減少適當細胞中吞嗟作用而改 善的卩舍礙之哺乳動物之醫藥組合物，其包含治療上吞 嗟作用減少有效量之大豆胰蛋白酶抑制劑，該大豆騰 蛋白酶抑制劑係為⑻-Ν-甲基-D-笨基丙胺醯基_Ν_卜 [(胺基亞胺基甲基)胺基]-1-(2-苯并噻唑羰基)丁基]_L_脯 胺醯胺。 5·根據申請專利範圍第1至4項中任一項之醫藥組合 物’其中該活性成分含量佔該組合物〇〇〇〇1%至1〇0/〇 重量/體積比。 -44 -

   本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 87517B-接 590775 A8 B8 C8 _D8_ 六、申請專利範圍 6. 根據申請專利範圍第5項之醫藥組合物，其中該活性 成分含量佔該組合物0.0005至1%。 7. 根據申請專利範圍第6項之醫藥組合物，其中該活性 成分含量佔該組合物0.001%至0.05%。 &根據申請專利範圍第7項之醫藥組合物，其中該活性 成分含量佔該組合物0.005%至0.025%。 9. 根據申請專利範圍第1至4項中任一項之醫藥組合 物，其係局部投藥。 10. 根據申請專利範圍第1至4項中任一項之醫藥組合 物，其係吸入投藥。 11. 根據申請專利範圍第1至4項中任一項之醫藥組合 物，其係經口投藥。 12. 根據申請專利範圍第1至4項中任一項之醫藥組合 物，其係非經腸式投藥。 13. 根據申請專利範圍第4項之醫藥組合物，其中該活性 成分係衍生自大豆。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）