TW554044B - Production of biologically active recombinant insulin-like growth factor II polypeptides - Google Patents
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Description
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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（ 發明領域： 本發明（發表在 DKA and Cell Biology (1997)， 16:883-892,已併入於參考文獻中）是有關於魚類類胰島 素生長因子II (IGF-II)之互補去氧核醣核酸（cDNA)和由 此cDNA所表現出具有生物活性之IGF-II多胜肽，且特 別是有關於一種重組之吳郭魚的類胰島素生長因子π 的cDNA和此重組cdna在細胞中的表現。這igF_II 之重組cDNA可在大腸桿菌、酵母菌、病毒和魚類細胞 中被選殖並且表現。 發明的背景： 類騰島素生長因子（IGFs)是促進細胞分裂的胜肽 類激素’它在脊椎動物生長與分化上扮演重要的角色。 類胰島素生長因子是以前胜肽原方式轉譯，此前胜肽原 可衍生出一個含氮端的胜肽原（亦可稱為一個含有訊號 胜或領導胜）、一個由B到D區域所產生之胜肽（此包含 由B，C，A和D區域所形成之胜肽）和一個含碳端之e區 域所產生之胜肽（亦可稱為追蹤者胜肽）。此類胰島素生 長因子之訊號胜肽和E區域胜肽在IGF蛋白質成熟作 用時’會從B到D區域多胜肽移除（Schamblott and Chen (1992)?£x〇Ct]^ati,Acad.Sci.USA^Q-RQn-«Qi7)。因 此’ B到D區域多胜肽也稱之為”類胰島素生長因子成 熟胜肽"。 到目前為止，類胰島素生長因子的訊號及E區域 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 請 閲 讀， 背 ft 之 注 意 項
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554044 i___ 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 A7 B7 發明説明（2 ) 胜肤的功能尚不清楚，但可知的是訊號胜肽可能參與幫 助蛋白質傳送到細胞膜上。至於E區域胜肽，當E區 域仍是前蛋白原一部份時，可能是所分泌之完整原激素 的一部份。因此E區域可能對於成熟胜胜肽的加工、傳 遞或分泌有所影響，也可能對於成熟胜肽之降解、受體 的相互關係或結合蛋白質的相互關係有著直接或間接 的調節作用。 類騰島素生長因子的類型有兩種，分別命名為類 胰島素生長因子I(IGF-I)以及類胰島素生長因子 II(IGF-II)。這兩類型在蛋白質摺疊結構上有很高的相似 性’雖然這兩種類胰島素生長因子被不同的受體所調節 (如IGF-I是由酪胺酸激酶受體所調節，mu〗是由甘露 糖6-填酸受體所調節），但在促進生長的效果上卻相 似。1GF·1是一含有70個胺基酸的多胜肽，是居間調節 生長激素的促進生長作用，以及在許多器官中IGIM於 旁分泌（paracrine)和自體分泌（autocrine)扮演重要的角 色（Kavsan 以 α/· (1993)，DNA and Cell Biology, 12:729-737) 〇 在哺乳動物中，成熟的IGF-II由67個胺基酸殘基 所組成’是一種含有三個雙硫鍵的中性蛋白質。IGF_n 是含有NH2-B-C-A-D-COOH區域的單一鏈多胜肽，在 成熟的胜肽中是不含訊號和E區域胜肽。在已經發表的 不同動物包括雞、羊、小白鼠、人類和大白鼠的IGF-ii cDNA皆有很高的保留性。動物的IGIMI在胎盤催乳素 本紙張尺度適用中國國家標準（Cns ) Α4規格（21〇Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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554044 A7 B7 五、發明説明（3 ) 的控制下，於胎兒發育期間主要是由肝臟產生（Gray W al (1987), PNA?6:283-295) 〇 由於 IGF-II 在調節胎兒生 長上扮演一關鍵角色，故IGF-II亦稱為’’胎兒生長因 子”。 IGF-II含有一複雜的基因結構。在人類中，IGF-II 基因包含10個表現序列（exon)，去氧核醣核酸（DNA) 全長約三萬驗基對（kb)。IGF-II的成熟胜脊是由三個表 現序列8、9和10所產生。而在大小白鼠中，IGF-II基 因包含6個表現序列，DNA全長約12kb，其前胜肽原 是由表現序列4、5和6所產生。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 直到現在，魚類IGF-II的基因結構與蛋白質功能 尚未鑑定完全，已有報告提出軟骨魚的IGF-II類似胜 肽在於胰臟的内分泌性騰島素細胞（Reinneke以 a/.(1994), Histochemistry, 102:365-371)，至今 IGF-II 的 旁分泌或自分泌功能尚未清楚。另外在兩種魚種： Sparus aurata(Dugueiy et ^/.(1996) J.Mol.EdQcrinol. 16:123-132)和彩虹鱒魚（Shamblott and Chen(1993)，Supra) 的肝臟已發現兩種IGF-II的cDNA。關於魚類IGF-II 在細胞中的表現及IGF-II在魚體内的生理活性仍無報 告或研究。此外，在吳郭魚 的IGF-II cDNA及由此cDNA產生具生物活性之IGF-II 多胜肽也尚未有報告。這項發明包括魚類IGF-II基因 的選殖和定序以及魚類IGF-II具生物活性之重組胜肽 的產生會在以下文章中闡述。一個基因表現系統的建立 7 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 554044 A7 --B7 五、發明説明（4 ) 疋重要的，因為它提供一個表現蛋白質研究其功能活性 的多基因的管道。本發明就是成功地發展出一套魚類 IGF-II的基因表現系統，不但可產生高品質的魚類 IGF-II蛋白質，對於免疫'组織化學促進抗體產生的研 究上（如RIA、ELISA等）有著重要貢獻外，同時也提供 大量的魚類IGF-II蛋白質作為研究igf_h在魚體中的 生理功能，特別是決定刺激幼魚生長的影響亦是重要。 發明概要： 本發明描述：（1)由cDNA庫鑑定完整的魚類igF-II 基因密碼子範圍；（2)魚類IGF-IIcDNA之序列分析；（3) 構築魚類IGF-II —重組表現載體；（4)在大腸桿菌 〇£：· co/z)、酵母菌、桿狀病毒（bacui〇virus)和魚細胞中表 現魚類IGF-II重組蛋白質；（5)魚類igf-II重組蛋白質 的生物功能。 圖式之簡單說明： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 第1圖顯示吳郭魚（雜交）IGF_II CDNA的核I酸序 列以及此激素預測的胺基酸序列。核苷酸的數目是由5, 端的第一個核苷酸開始。第二列的數字指示示依序之核 苷酸位置。符號（*)表示開始的密碼子；（#)表示停止的 密碼子；（η)表示不確定的cDNA密碼子。 第2圖是吳郭魚、、彩虹鱒魚、人類、 大白鼠、小白鼠、羊和雞的IGF-II胺基酸序列之比較。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 554044 A7
發明説明（5 ) 序列開始於第一個甲硫胺酸，IGF-II的胜肽原分裂成為 訊號胜肽、B、C、A、D區域胜肽和E區域胜肽。符號 (·)表示缺口或縮減。 b 第3圖是羊和吳郭魚組織的IGJMI密碼子範圍的 結構比較。表現序列以小隔間表示，插入序列和側序列 以細線表示。每個結構底下是表現序列和插入序列分界 之相關位置。 第4圖顯示在離体外，吳郭魚IGF-II之重組胜肽 對吳郭魚卵巢細胞（T0_2細胞株）的刺激影響。 較佳實施例： 以下的實施例指出（丨）魚類IGF-II cDNA的發現； (2)魚類IGF_II重組多胜肽的表現和（3)魚類IGF-II重自 多胜肽的生物活性。 實施例 I類IGF-II cDNA的發琨 請 先 閲 讀- 背 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁
I 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 發明之一是魚類IGF-II cDNA密碼子範圍的發 現。下列步驟是發現吳郭魚魚種的實施例，但並非用以 限定吳郭魚的種類： 例1 :魚類IGF-II cDNA選殖株的分離 利用嗤菌體雜交法，以 IGF-I CDNA S到E區域（使用聚合酶鏈反應（PCR)放大） 當作探針，進行魚類iGF-IIcDNA選殖株的筛選。以下 9 本紙張尺^適用中國國家標準（CNS ) M規格（210X297公釐） 一 一一"
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 554044 A7 B7 五、發明説明（6 ) 敘述是以吳郭魚（雜交）的腦cDNA庫為例，詳細說明噬 菌體雜交法（請注意以下的cDNA庫篩選亦適用於其他 魚類cDNA庫，如It魚、經魚）。
首先，將 sc/z/ege//IGF-I cDNA 之 S 到E區域範圍以PCR方式放大。這個產物長度約為551 個鹼基對，可再利用電泳溶離法將其純化並製成雜交用 探針。 其次，將取自吳郭魚（雜交）的腦cDNA庫的約一百 萬個重組噬菌體，種在12個LB培養基。然後，再將 這些種在培養基上的噬菌體轉移至耐綸膜上。 然後，利用PCR所得之探針與耐綸膜上的重組噬 菌體進行雜交反應。含有噬菌體的耐綸膜先經變性、回 復以及相互連接等步驟後，再置於雜交緩衝液[(含SDS (7g/100mL )、0.5M EDTA (ρΗ8·0) (100 pL/100mL )、50〇/〇 PEG8000 (20mL/100mL)> 40% formamide (40mL/100mL)] 中於37°C反應16小時。 最後在室溫、37°C、40°C分別經由2XSSC，0.1% SDS; 0.5XSSC，0.1% SDS; 0.1XSSC，0.1% SDS 沖洗轉印 膜後得到正反應之噬菌體選殖株。附帶說明以上之步驟 是利用Uni_ZAP載體產生pBluescript之質體，活體内 進行刪除來幫助重組DNA之製備和鑑定。 經過噬菌體雜交法，得到一個IGF-II cDNA正反 應株，因這選殖株含有雙股pBluescript質體，故以大 量製備法得到含插入基因之質體。 10 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 554044 A7 B7 五、發明説明（7 ) 例2 :魚類IGF-II基因庫選殖株的分離 利用放射性磷32(32P)標定魚類IGF-II cDNA片 斷，篩選近一百萬個重組噬菌體的基因庫（魚類的基因 庫用噬菌體charon 40為構築載體），分離出魚類IGF-II的基因選殖株。吳郭魚IGF-II cDNA以放射性磷32 標定作為探針，再經由南方轉印法在42°C的雜交緩衝 液中反應16小時，得到的正反應株。將其純化並進行 DNA限制酶圖譜分析。 例3 :核苷酸序列分析 為分析魚類IGF-II cDNA (此cDNA由一種魚種得 到，如吳郭魚、鮭魚和鯉魚）之核苷酸序列，首先以限 制酶尸d I切割cDNA，再以pUC18為載體，次選殖這 些切割後的cDNA片斷，然後再轉植入大腸桿菌JM 109。以Sanger末端去雙氧鍵法和定序套組（USB， version 2.0)完成定序。為了分析魚類IGF-II基因庫 DNA，先以限制酶仏c I切割IGF-II噬菌體DNA。再用 pBluescript為載體次選殖這些切割後基因庫DNA，而 後植到大腸桿菌XLl-Blue内。 最後，利用QIAGEN質體萃取套組萃取DNA， 再以單股DNA進行ABI自動定序儀定序。將核苷酸序 列利用電腦基因庫（Genetic Computer Group)的軟體與 所有已發表的序列進行比對工作。 11 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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554044 A7 B7 五、發明説明（8 ) 結果： 第1圖顯示吳郭魚（雜交）IGF-IIcDNA的核苷酸序 列及此激素預測的胺基酸序列。在5’未轉譯區序列長度 共含76個核苷酸，3’未轉譯區序列長度共含1247個核 苷酸。整個編碼範圍共含^^個_核苷酸。吳郭魚IGF-II 多胜肽是由下列胜肽所組成： (1) 47個胺基酸殘基形成訊號胜或領導胜（1-47)。 這個訊號胜之cDNA編碼序列為：
5f ATGGAAACCCAGCAAAGATACGGACATCACTCACTTTGCCACCAGTGCCGGAGAACGC AGAACAGCAGAATGAAGGTCCAGAGGATGTCTTCGACGAGTCGGGCGCTGCTCTTTGCAC TGGCCCTGACGCTCTACGTAGTG 此訊號胜之胺基酸序列為：
Met-Gln-Thr-Gln-Gln-Arg-Tyr-Gly-His-His-Ser-Leu-Cys-His-Thr-Cys-Arg-Arg-Thr-Gln-Asn-Ser-Arg-Met-Lys-Val-Gln-Arg-Met-Ser-Ser-Thr-Ser-Arg-Ala-Leu-Leu-Phe-Ala-Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Tyr-Val-Val 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (2) A，B到D的區域多胜肽（如IGF-II成熟胜肽，其 B區域胜肽有32個胺基酸殘基（48-79)，C區域胜肽有11 個胺基酸殘基（80-90)，A區域胜肽有21個胺基酸殘基 (91-111)以及D區域胜肽6個胺基酸殘基（112-117))。此 成熟的IGF-II胜肽之cDNA編碼序列為： 12 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇><297公釐） 554044 A7 B7 五、發明説明（9 )
5f GAAATGGCCTCGGCGGAGACGCTGTGTGGGGGAGAACTGGTGGATGCGCTGCAGTTTG TCTGTGAAGACAGAGGCTTTTATTTCAGTAGGCCAACCAGCAGGGGTAACAACCGACGCC CCCAGACCCGTGGGATCGTAGAGAGTGTTGTTTCCGTAGCTGTGACCTCAACCTACTGGA GCAGTACTGTGCAAACCTGCCAAGTCCGAAAG 此成熟胜肽（長度約為70個胺基酸）之胺基酸序列 為·
Gin-Met - Ala-Ser-Ala-Glu - Thr - Leu-Cys-Gly-Gly - Glu - Leu-Val-Asp-Ala-Leu-Gln-Phe-Val-Cys-Glu-Asp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Phe-Ser-Arg-Pro-Thr-Ser-Arg-Gly-Asn-Asn-Arg-Arg-Pro-Gln-Thr-Arg-Gly-lie-Val-Glu-Glu-Cys-Cyd-Phe-Arg-Ser-Cys-Asp-Leu-Asn-Leu-Leu-Glu-Gln-Tyr-Cys-Ala-Lys-Pro-Ala-Lys-Ser-Glu (3)—含有98個胺基酸殘基（118-216)的E區域胜 肤’此E區域胜狀之cDNA編碼序列為：
5Λ AGGGACGTGTCAGCCACCTCTCTACAGGTCATACCGGTGATGCCCGCACTAAAACAGG AAGTTCCGAAGAAGCAACATGTGACCGTGAAGTATTCCAAATACGAGGTGTGGCAGAGGA AGGCGGCCCAGCGGCTCCGGAGGGGTGTCCCCGCCATTCTGAGGGCCAGAAAGTATAAGA GGCACGCGGAGAAGATTAAAGCCAAGGAGCAGGCTATCTTCCACAGGCCCCTGATCAGCC TTCCTAGCAAGCTGCTGCCTCCCGTGTTACTCACCACGGACAACTTTGTCAGTCACAAA 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
此E區域胜肽之胺基酸序列為：
Arg-Asp-Val-Ser-Ala-Thr-Ser-Leu-Gln-Val-Ile-Pro-Val-Met-Pro-Ala-Leu-Lys-Gln-Glu-Val-Pro-Lys-Lys-Gln-His-Val-Thr-Val-Lys-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Gln-Val-Trp-Gln-Arg-Lys-Ala-Ala-Gln-Arg-Leu-Arg-Arg-Gly-Val-Pro-Ala-Ile-Leu-Arg-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Arg-His-Ala-Glu-Lys-工 le-Lys-Ala-Lys-Glu-Gln-Ala-Ile-Phe-His-Arg-Pro-Leu-Ile-Ser-Leu-Pro-Ser-Lys-Leu-Pro-Pro-Val-Leu-Leu-Thr-Thr-Asp-Asn-Phe-Val-Ser-His-Lys 13 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 554044 A7 ---- B7 五、發明説明（10 ) - 第2圖顯示的是不同種動物之IGF_n胺基酸序列比 較。在魚種之間，吳郭魚與彩虹鱒魚的成熟IGF_n胜肽 (B到C區域）有95.7%相似性及92.9%鑑定性。此外， 在吳邾魚和彩虹鳟魚IGF-II的前胜肽原（s到E區域）相 車乂’有90.7%相似性和μ 8%鑑定性。 吳郭魚成熟IGF-II胜肽與雞、人類、大白鼠、小白 鼠和羊比較，相似性分別為83.1%、79 1%、8〇 6%、83 6% 和 80.6%，鑑定性分別為 78 5%、77 6%、79 1%、791% 和79.1 /〇吳郭魚成熟IGF-n胜肽與動物成熟胜 脊比較，在C區域插人3㈣碼子，在B區域縮減2個 推碼子特別疋吳郭魚的IGF_n在B區域胜月太第個 胺基酸為穀胺酸（Gh〇,同位置在大小白鼠為為絲胺酸 (Ser)，在人類為甘胺酸（Gly) 區域的第^個胺基酸 Ser(大小白昧气中）、Gly(人類中）的位置在魚㈣Giu的真 正機制尚不清楚。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 第2圖也表示在吳郭魚成熟_形胜狀與已發表 的魚種（如办㈣"赠α和彩虹縛魚）有五個胺基酸不 同，這五個胺基酸分別為··⑴在Β區域第二個胺基酸 (吳郭魚··甲硫胺酸Met J α_和彩虹鱒魚：吉貝胺酸 Val);⑺在C區域第三個胺基酸（吳郭魚和&贈_ :甘 胺酸Gly ;彩虹鱒魚··絲胺酸Ser) ; (3)在C區域第五個 胺基酸（吳郭魚和& ：天冬酿胺—；彩㈣ 魚：絲胺酸Ser)，·（4)在C區域第八個胺基酸（吳郭魚和 &••脯胺酸Pro ;彩紅縛魚：絲胺酸^…⑺在 X氏張尺度適财關家縣（CNS ) A4規格（21Gx297;^y 554〇44 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 i、發明説明（11 ) C區域第十個胺基酸（吳郭魚：蘇胺酸Thr ; & 和 彩虹鱒魚：天冬胺酸Asn)。 第3圖顯示吳郭魚和羊的基因DNA序列。吳郭魚 基因序列含有四個表現序列（exons 1-4)長度約為 12.9kb，動物IGF-II基因有三個表現序列。吳郭魚IGF-II 基因的密碼子範圍預測是215個胺基酸前胜肽原，包括 一 47個胺基酸之訊號胜、一 70個胺基酸之成熟胜肽以 及一 98個胺基酸的E區域胜狀。吳郭魚IGF-II所預測 的胺基酸序列與cDNA序列所決定的胺基酸序列是一致 的。 IGF-II基因的表現序列l(exonl)是從5’未轉譯區 (與cDNA序列比較）到訊號胜的一部份（至S區域第25 個胺基酸）；表現序列2(exon2)由剩下的訊號胜到B區域 胜肽（至B區域第28個胺基酸）；表現序列3(exon3)從C 區域胜肽第一個胺基酸到E區域（至E區域第20個胺基 酸）；表現序列4(exon4)從E區域到3 ’未轉譯區一部份。 換言之，表現序列1有25個胺基酸；表現序列2有51 個胺基酸；表現序列3有60個胺基酸以及表現序列4 有80個胺基酸。 表現序列1、2之間有一長度為0.8 kb的插入序列 (intron);表現序列2、3間有一長度為2.8 kb的插入序 列和表現序列3、4間有一長度為1.3 kb的插入序列。 表現序列-插入序列序列的接合處是根據GTAG規則。吳 郭魚IGF-II密碼子範圍的基因結構與其他不同魚種有很 15 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 554044 A7 B7 五、發明説明（12 ) 高的保留性。與動物比較IGF-II基因組成所顯示的變 化，這基因結構的差異可能是脊椎動物演化所發生的。 實施例2 :魚類IGF-II重組多胜肽的表現 魚類IGF-II cDNA經由噬菌體雜交法分離與鑑定後 (如實施例1所示），能夠在不同細胞中表現產生具有生 物活性的IGF-II多胜肽。以下步驟使用吳郭魚為模型， 建立產生魚類IGF-II重組多胜肽的基因表現系統（請注 意，其他魚種如鮭魚、鯉魚皆可用相同步驟構築IGF-II 重組表現載體）。 例4 ·· IGF-II重組表現載體的構築 利用PCR的方法放大魚類IGF-II包含B到D區域 的cDNA。其中PCR中所用的兩條引子之核苷酸為： 引子 1 : 5f-CGGAATTCATATGGAAATGGCCTCGGGCGGAGACGC ;
弓| 子 2 : 5f-CGGAATTCCTCATTCGGACTTGGCAGGTTTGGCAC 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 這兩條引子皆含有限制酶五coR I位置。起始密碼 子ATG位於魚類IGF-II B區域的開頭，停止密碼子位於 魚類IGF_II D區域的最終序列。 魚類IGF-II cDNA可在四種細胞中表現。分別是大 腸桿菌、酵母菌、桿狀病毒和魚細胞。利用大腸桿菌選 殖及表現，使用含有榖胱甘胺酸-硫-轉化酶 (glutathione-S-transferase; GST)基因融合系統（Pharmacia Biotech Co.)的IGF-II重組cDNA表現系統。二種表現用 16 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 554044 A7 B7 五、發明説明（13 ) 之大腸桿菌菌種，一為五· kl2菌株（如HMS174、 HB101、JM109、DH5a 和 NovaBlue)，一為 B 菌種（如 BL21、BL21(DE3)、B834、B834(DE3))。而 BL21(DE3) 可產生高品質且大量的IGF-II多胜肽，故選擇它最適 當。使用酵母菌尸pasiorzXa methylotrophic yeast) 表現套組來選殖和表現魚類IGF-II。這個表現系統有三 種不同套組（分別命名為the Original Expression kit ; the EasySelect Pichea Expression kit 和 the Multi· copy Expression vectors)，每一種套組皆含有設計 好的載體、户k/nh 菌種以及試劑以供轉形 (transformation)。此外，在酵母菌 S· cerev/we 菌種 INVScl適用pYES2載體進行表現。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 為了在桿狀病毒中進行魚類IGF-II的選殖與表 現，選用MaxBac 2.0套組（Invitrigen公司）。這套組含有 桿狀病毒轉移載體（pBlueBac4.5、pBlueBacHis2、 pBlueBac4.5/CAT [控制組]、pVL1392 及 pVL1393)和 /rwg7>er(ia(Sf9)昆蟲細胞。一般建議使用 而pkra 卵巢細胞（Sf21)及 High Five cells(BTl_TN-5B1-4)來表現IGF-II。在這篇文章為表現IGF-II基因是 使用 High Five cells 載體。 為了在鮭魚（salmon)細胞中選殖和表現魚類IGF-II，IGF-II cDNA構築可被轉植到一表現載子p91023(B) 内，並受到線病毒主要晚期啟動子的控制。此表現載子 可經由轉形（transfection)被送入Chinook鮭魚的胚胎細 17 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 554044 Α7 Β7 五、發明説明（14 ) 胞中（CHSE-214)。IGF-IIcDNA構築也可利用相同的法被 送入吳郭魚卵巢細胞中（TO-2 cells)。 例5 :純化在大腸桿菌中的魚類IGF-II重組胜肽 可經由下列步驟將大腸桿菌表現系統中的魚類 IGF-II重組蛋白質純化出來： (1) 挑含含有pGEX-IGF-II重組質體的單一菌株 BL21(DE3)大腸桿菌細胞，培養在lOOmL的2x YTA培 養基中（tryptone 16g/L、Yeast extract 10g/L、NaCl 5g/L) 和安匹西林（ampicillin) 100pg/mL)，並使此細胞在37°C 的環境中搖盪培養10小時； (2) 由上述培養菌液中取5mL，再加入於500mL 2x YTA培養基中，並在37°C環境中搖盪培養，直到培養菌 液的吸光值在波長600nni為1 · 1， (3) 加入O.lmM異丙基-硫-D-乳糖苷（isopropyl-thio-D-galactoside; IPTG)於培養菌液中，置於 25°C搖 盪3小時； 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
(4) 將培養菌液以7700 xg的離心速度，在4°C環境 中離心10分鐘。取得的菌體，再以5〇4冰磷酸緩衝液 /1 ml培養菌液的比例，加入冰醋酸缓衝液使函體回溶’ (5) 在回溶懸浮細胞中加入triton X-100使最終濃度 為1%，並利用細胞振碎機將懸浮細胞打破； (6) 打破後之細胞，以12000 xg的離心速度’在4 °C環境中離心10分鐘後，再將上清液以〇·45μηι過濾、膜 18 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇X297公釐） 554044 A7 B7 五、發明説明（15) 過濾； (7) 通過過滤膜之液體至入管柱中（Pharmacia Biotech公司），以IX碗酸緩衝液沖洗，然後再加入凝血 酶（thrombin)溶液，置於25°C環境中16小時； (8) 收集含有IGF-II蛋白質的反應混合物；以及 (9) 利用15%SDS-聚丙烯醯胺膠體電泳分離GST蛋 白質和重組的IGF-II多胜肽。 電泳片中的蛋白質可轉印至PVDF膜上，進行胺基 酸序列分析。吳郭魚IGF-II重組多胜肽和GST蛋白質經 15% SDS-聚丙烯醯胺膠體電泳分離後，蛋白質可被轉印 至 Hybond ECL 纖維轉印膜（Amersham Life Science 公 司），並以抗-IGF單株抗體進行偵測。 結果： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 為了在大腸桿菌BL21(DE3)中表現魚類IGF-II重組 多胜肽，將含重組IGF-II質體的大腸桿菌培養於22°C的 環境中，其間並以O.lmM的IPTG誘導3小時。由上述 方法所萃取得到的全蛋白，經SDS-聚丙烯醯胺膠體電泳 分離後，可在電泳膠上得到一位置在36kDa的清晰帶。 (在IPTG誘導30分鐘至180分鐘後）。此大小為36kDa 的蛋白質包含一在IPTG誘導過程中所產生的結合於 GST融合蛋白質的成熟IGF-II多胜肽。當利用凝血酶切 割此36 kDa蛋白質時，會產生一 7 kDa大小的單一蛋白 質。由ECL西方轉印法證明這7 kDa大小的蛋白質可與 19 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 554044 A7 五、發明説明（16) 抗-IGF的單株抗體進行相互作用。這7kDa大小的蛋白 質經過胺基酸序列分析後，可知此蛋白質比預期成熟 IGF-II多胜肽多了 7個胺基酸，這7個胺基酸的其中6 個是載體PGEX-2T多選殖位上的DNA序列產生，剩下 的一個胺基酸是開始密碼ATG。 f施例3 :魚類IGF-TT重組多胜肽的决舲法怦 以吳郭魚卵巢細胞株T0_2和幼吳郭魚為例，測定 魚類IGF-II重組多胜肽在活體外（μ ㈠和活體内（〜 Wvc〇的生物活性。 例6 :在吳郭魚T0-2細胞株中吳郭魚IGIMI重組多胜肽 的生物活性 由以下步驟測定在吳郭魚卵巢細胞株（τ〇-2)中吳郭 魚IGF-II重組多胜肽的活體外生物活性[τ〇_2細胞株是 由健康成熟的雜交吳郭魚（7"叩以χ ⑽ca)的卵巢細胞所建立]: 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ⑴將T0-2細胞（3xl〇4細胞/凹槽）種在一含24凹槽 的培養jiii中’培養24小時（培養時不含血清），其中凹槽 内的培養基為含10%小牛血清的MEM/F12; (2) 將細胞株於有/無不同量的IGF_II(〇_12〇 nM)的 環境下培養18小時； (3) 將上述的細胞以[3H]胸腺嘧啶（2㈣^“在25〇c 環境中標定2小時； 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 554044 A7 ^^-____ 67 ____ 五、發明説明（I7) (4)加入0.5ml的〇·3Ν氫氧化鈉溶液後，靜置五分 鐘，然後將此細胞混合物轉移至一含有5mlaquas〇1的閃 燦計數瓶中。 結果： 實驗結果如第4圖所示，以吳郭魚jgf—h重組蛋白 質〇至120 nM/mL的進行濃度測試，其結果顯示[3H]併 入的比例正比於IGF-II蛋白質的增加量（AN〇VA ; F=4.46 ; df.=6.14 ; p<〇.〇5)。本實驗認為有關 IGF_n 重 組蛋白質的刺激效果是劑量依賴式（d〇se_dependent)。 例7:吳郭魚IGF-II重組蛋白質對魚類生長的影響 為鑑定由大腸桿菌所產生的吳郭魚IGF_n重組蛋 白質是否具有生物活性，隨意選擇平均體重l 3±〇 31g 和平均長度4·15±0·38 cm的吳郭魚，飼養在新鮮的水 中。每餐以溼重的5%比例來餵食（粗蛋白32% •，粗脂肪 5% ;纖維2〇/〇 ;水份9〇/〇 ;台灣Amaz〇n Feed公司）。所 有魚群維持在室溫、12小時光照、12小時黑暗循環的 條件下生長。 在十個星期的實驗期間，一組吳郭魚（每組含2〇條 吳郭魚）每星期經體壁注射IGF-Π，另一組控制組不注射 IGF-II。注射濃度是以每條魚重每克給予〇ι、〇·5、1和 2Pg的IGF-II。每兩星期測量一次魚的溼重和全長。备 體重和體長的百分率計算方式是（WT-wt) X wt_ix 1QQ，; (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、言
21 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 554044 一-----^____ 五、發明説明（18) ~ 裏的wt和WT分別表示開始的平均溼度和最後的平均溼 重（魚體長的測量是從魚下顎的尖端至f〇rk (cm))。所有 數據變化皆利用1-Way變異分析法加以分析。 為測量大腸桿菌所表現的吳郭魚〖GF-II重組蛋白 質是否具有生物活性，設計一實驗純化由大腸桿菌所表 現的吳郭魚IGF-II多胜肽，將其注射到幼魚體内並仔細 測量幼魚生長時體重百分率及長度百分率。 數據顯示除了注射〇· 1 pg的IGF-II於魚體内，其體 重與控制組無明顯差異外，注射較高劑量的IGF_H多胜 肽於魚體中會使其生長速率增加。同樣地，在體長測量 上’注射O.lpg IGF-II亦無顯著差異。 幼魚處理十星期結束後，每組吳郭魚經不同量 IGF-II注射邊，其體重百分率如下： (1) 注射 2pg IGF-II : 259% (2) 注射 lpg IGF-II : 242% (3) 注射 〇·5 pg IGF-II : 231% (4) 注射 〇.ΐμβ igF-ΙΙ : 200% (5) 控制組：153% 此結果指出吳郭魚經由最高劑量IGF-ΙΙ注射後（如 2pg IGF-II )，可得到最大重量百分率。 每組吳郭魚的實際溼重和長度（測量值=平均值土 平均誤差）結果如下： (A)溼重： 22 本^氏張尺度適用中國國家標準（€奶）八4規格（210'/297公釐）一" "' (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T
554044 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 五、發明説明（19) (1) 注射 2pg IGF-II : 4.67±1.50g (2) 注射 ΐμ^ι〇Ρ-ΙΙ:4·45±1.8β (3) 注射 〇.5pg IGF-II : 4.33±1.30g (4) 注射 〇.bg IGF-II : 3.9±0.81g (5) 控制組：3.41±0.72g (B)全長： (1) 注射 2pg IGF-II : 6·78±0.73 cm (2) 注射 lpg IGF_II : 6·63±0·76 cm (3) 注射 〇·5μ§ IGF-II : 6·59±0.66 cm (4) 注射 〇e^g IGF-II : 5·88±0·47 cm (5) 控制組：5·81±0·41 cm 依據前述，本發明並未曾有雷同或近似的製造方法 揭露或使用於此一技術領域上，固本發明具有新穎性、 進步性及產業之價值性等專利要件，爰依專利法之規定 提出申請。 雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用 以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之 精神和範圍内，所作的各種更動與潤飾，均落在本發明 的保護範圍内。此外，本發明之保護範圍當視後附之申 請專利範圍所界定者為準。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁}
23
Claims (1)
- 554044 第 871001傪正本合|92.7.29 六、申請專利範圍 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1. 一種含有編碼類胰島素生長因子II(IGF-II)胜肽的吳 郭魚DN A序列，其係由一編碼有一段訊號胜的S序列，一 編碼類胰島素生長因子II(IGF-II)胜肽的序列，以及一 E序 列所組成，上述吳郭魚DNA序列係由以下序列所組成： ATGGAAACCCAGCAAAGATACGGACATCACTCACTTTGCCACCAGTGCCGGAGAACGCAGAAC AGCAGAATGAAGGTCCAGAGQATGTCTTCGACGAGTCGGGCGCTGCTCTTTGCACTGGCCCTG ACGCTCTACGTAGTGGAAATGGCCTCGGCGGAGACGCTGTGTGGGGGAGAACTGGTGGATGCG CTGCAGTTTGTCTGTGAAGACAGAGGCTTTTATTTCAGTAGGCCAACCAGCAGGGGTAACAAC CGACGCCCCCAGACCCGTGGGATCGTAGAGAGTGTTGTTTCCGTAGCTGTGACCTCAACCTAC TGGAGCAGTACTGTGCAAACCTGCCAAGTCCGAAAGAGGGACGTGTCAGCCACCTCTCTACAG GTCATACCGGTGATGCCCGCACTAAAACAGGAAGTTCCGAAGAAGCAACATGTGACCGTGAAG TATTCCAAATACGAGGTGTGGCAGAGGAAGGCGGCCCAGCGGCTCCGGAGGGGTGTCCCCGCC ATTCTGAGGGCCAGAAAGTATAAGAGGCACGCGGAGAAGATTAAAGCCAAGGAGCAGGCTATC TTCCACAGGCCCCTGATCAGCCTTCCTAGCAAGCTGCCTCCCGTGTTACTCACCACGGACAAC TTTGTCAGTCACAAA。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2. 如申請專利範圍第1項所述之吳郭魚DNA序列，其 中該IGF-II胜狀係由以下序列所編碼組成： GAAATGGCCTCGGCGGAGACGCTGTGTGGGGGAGAACTGGTGGATGCGCTGCAGTTTGTC TGTGAAGACAGAGGCTTTTATTTCAGTAGGCCAACCAGCAGGGGTAACAACCGACGCCCC CAGACCCGTGGGATCGTAGAGAGTGTTGTTTCCGTAGCTGTGACCTCAACCTACTGGAGC AGTACTGTGCAAACCTGCCAAGTCCGAAAG ° 3·如申請專利範圍第1項所述之吳郭魚DNA序列，其 中該S序列係由以下序列所組成： ATGGAAACCCAGCAAAGATACGGACATCACTCACTTTGCCACCAGTGCCGGAGAACGCAG 24 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 554044 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 AACAGCAGAATGAAGGTCCAGAGGATGTCTTCGACGAGTCGGGCGCTGCTCTTTGCACTG GCCCTGACGCTCTACGTAGTG 0 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 4·如申請專利範圍第1項所述之吳郭魚DNA序列，其 中該E序列係由以下序列所組成： AGGGACGTGTCAGCCACCTCTCTACAGGTCATACCGGTGATGCCCGCACTAAAACAGGAA GTTCCGAAGAAGCAACATGTGACCGTGAAGTATTCCAAATACGAGGTGTGGCAGAGGAAG GCGGCCCAGCGGCTCCGGAGGGGTGTCCCCGCCATTCTGAGGGCCAGAAAGTATAAGAGG O^CGCGGAGAAGATTAAAGCCAAGGAGCAGGCTATCTTCCACAGGCCCCTGATCAGCCTT CCTAGCAAGCTGCCTCCCGTGTTACTCACCACGGACAACTTTGTCAGTCACAAA。 5. 如申請專利範圍第1項所述之吳郭魚DNA序列，其 中該DNA序列是在大腸桿菌中選殖並且表現。 6. —種具有生物活性之吳郭魚IGF-II的重組多胜肽， 其係由一作為訊號胜的S序列，一類胰島素生長因子 II(IGF-II)胜肽，以及一 E胜肽所組成，上述重組多胜肽之 序列係由以下序列所組成： 線· Met Glu Thr Gin Gin Arg Tyr Gly His His Ser Leu Cys His Thr Cys Arg Arg Thr Gin Asn Ser Arg Met Lys Val Gin Arg Met Ser Ser Thr Ser Arg Ala Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu Tyr Val Val Glu Met Ala Ser Ala Glu 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Ala Leu Gin Phe Val Cys Glu Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Thr Ser Arg Gly Asn Asn Arg Arg Pro Gin Thr Arg Gly lie Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Asn Leu Leu Glu Gin Tyr Cys Ala Lys Pro Ala Lys Ser Glu Arg Asp Val Ser Ala Thr Ser Leu Gin Val Ila Pro Val Met Pro Ala Leu L»ys Gin Glu Val Pro Lys Lys Gin His Val Thr Val Lys Tyr Ser Lys Tyr Gin Val Trp Gin 25 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 554044 A8B8C8D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 Arg Lys Ala Ala Gin Arg Leu Arg Arg Gly Val Pro Ala lie Leu Arg Ala Arg Lys Tyr Lys Arg Ala Ala Gin Arg Leu Arg Arg Gly Val Pro Ala lie Arg Ala Arg Lys Tyr Lys Arg His Ala Glu Lys lie Lys Ala Lys Glu Gin Ala lie Phe His Arg Pro Leu lie Ser Leu Pro Ser Lys Leu Pro Pro Val Leu Leu Thr Thr Asp Asn Phe Val Ser His Lys ° 7.如申請專利範圍第6項所述之具生物活性的吳郭魚 IGF-II重組多胜肽，其中IGFII胜肽係由以下序列所組成： Glu Met Ala Ser Ala Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Ala Leu Gin Phe Val Cys Glu Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Thr Ser Arg Gly Asn Asn Arg Arg Pro Gin Thr Arg Gly De Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Asn Leu Leu Glu Gin Tyr Cys Ala Lys Pro Ala Lys Ser Glu 〇 · 8 ·如申請專利範圍第6項所述之具生物活性的吳郭魚 IGF-II重組多胜肽，其中該訊號胜係由以下序列所組成： Met Glu Thr Gin Gin Arg Tyr Gly His His Ser Leu Cys His Thr Cys Arg Arg Thr Gin Asn Ser Arg Met Lys Val Gin Arg Met Ser Ser Thr Ser Arg Ala Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu Tyr Val Val o 9.如申請專利範圍第6項所述之具生物活性的吳郭魚 IGF-II重組多胜肽，其中該E胜肽係由以下序列所組成： Arg Asp Val Ser Ala Thr Ser Leu Gin Val I la Pro Val Met Pro Ala Leu Lys Gin Glu Val Pro Lys Lys Gin His Val Thr Val Lys Tyr Ser Lys Tyr Gin Val Trp Gin Arg Lys Ala Ala Gin Arg Leu Arg Arg Gly Val Pro Ala lie Leu Arg Ala Arg Lys Tyr Lys Arg Ala Ala Gin Arg Leu Arg Arg Gly Val Pro Ala lie Arg Ala Arg Lys Tyr Lys Arg His Ala Glu Lys lie Lys Ala Lys Glu Gin Ala lie Phe His Arg Pro Leu 26 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 閱 讀 背 面 之 注 項 再 Ipk 頁i 訂 線 A8B8C8D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印？农 554044 六、申請專利範圍 He Ser Leu Pro Ser Lys Leu Pro Pr〇 Val Leu Leu Thr Thr Asp Asn Phe Val Ser His Lys。 ι〇·—種製備具有生物活性的吳郭魚IGF II重組多胜 月太的方法，其步驟包括·· (a) 利用PCR方法放大吳郭魚的IGF_n cDNA，其中 該cDNA具有如申請專利範圍第i項所示之核苷酸序列； (b) 使用一表現載體，建立一重組構築； (c) 將β重組構築轉殖到細胞内；以及 (d) 举取由該轉植細胞所產生的IGF-II多胜肽。 11 ·如申請專利範圍第1 〇項所述之製備方法，其中 該細胞是來自大腸桿菌。 27 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 言 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
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