TW408128B - Process for obtaining platelet factor-IV - Google Patents

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TW408128B
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Yoshikazu Komurasaki
Chihiro Shindoh
Takashi Hirose
Keihide Koh
Satoshi Nishimuro
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Description

經濟部中央標準局員工消費合作社印f. 408128 ^ ο 7五、發明説明ί:ι ) 產業h夕利用镅城 本發明係有關血小板因子-IV之精製方法。 翌知枋兹 於目視下進行心臟分流手術等心臟內手術時,有必要 於一定時間内阻斷進出心臟的血液,而暫Μ人工心肺機代 行心臟與肺臓之機能。為了防止該人工心肺機内發生血液 凝固現象|通常會於流入的血液中施用肝磷脂;手術後為 恢復患者之血液凝固能力,則對患者投與魚精蛋白硫酸塩 。此外•對有腎機能障礙之患者進行血液透析療法時,為 了同樣目的亦常使用肝磷β旨及魚精蛋白硫酸塩。但是已知 投用魚精蛋白硫酸塩可能引發過敏性反應、血小板或白血 球減少、血壓降低、脈搏減緩、呼吸困難、躁熱感、短期 性皮麻紅腫、噁心、曜吐、肺水腫等各種副作用,使用時 必需特別留意(參照日本藥局方修正12版;Viera J. ,et al.,J.0.Amer.Surgeon, 50,151,1 9 84) 0 另一方面,基於血小板對肝磷脂之中和作用隨血小板 數而異之事實,血小板中存有肝磷脂中和物質之事已被提 出報告(C.L.Conley· et al.,Proc.Sol.Exp.Biol,Med., .69,284-287,1943)。陲後陸續有報告指出包括血小板因子 -IV(簡稱PP4)、yS-凝血球蛋白、低親和性PF4、血小板鹼 性蛋白、纖維黏連蛋白、自發凝血蛋白等均為血小板中之 肝磷脂中和物質,而其中KPF4對肝磷脂之親和性最強。 該PF4係分子畺為7.8kDa之蛋白質*已有報告指出其肝磷 脂中和活性不會引發使用魚精蛋白硫酸塩時發生之白血球 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中画國家標準(CNS )八4規格(2丨OX297公釐) 3 3 35 1 5 A7 ^〇Sl2fi B7________ 五、發明説明(2 ) 減少、血壓降低、肺水腫等副作用(Cook,J.J.,et ai., Circulation,85,3,1992)。因此* PF4可被期待用作取代 魚精蛋白之肝磷脂中和劑。 PF 4除了被期待作為肝磷脂中和劑外,亦被期待具有 阻止血管新生之作用。所謂血管斩生係指由既存的血管生 成新的毛细血管,在正常生物體內,一般僅於卵巢、子宮 等會因應性週期而發生變化的特殊處所始會被發現,除了 創傷治癒過程K外,血管新生之促進現象對生物體而言, 通常由嚴重糖尿網膜症、早產兒網膜症、尋常性乾癬、惡 性腫瘤等不利狀況引發者較多,尤其是無法接觸阻止的惡 性腫瘤細跑,其成長過程中氧氣及營養成分之補給不可或 缺•因此在其發生處所常進行旺盛的血管新生作為養份補 給路線.。所Μ血管新生之抑制被認為有抑制惡性腫瘤之效 果。PF4之血管新生抑制作用已被提出報告(Maione,T.E. et al.,Science,2 47,77 -79,1990),亦有報告指出在動物 實驗中能夠有效抑制惡性腫瘤(Shape,K.J.,et Nati.Cancer Inst .,82, 848 -8 5 3, 1 990 ) ° 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) 發明指拙解決夕間頴 Μ往*人類來源的PF4之精製過程*係將含有經凝血 _等之剌激而由血小板放出的蛋白質溶液,或使血小板經 凍結一解凍或低滲處理造成溶血而得之血小板提取液等材 料作為原料,再使用肝磷脂固定化親和層析管柱進行之( Levine,S.P. ,J.Biol.Chera. ,251,2,3 2 4- 328,1976) ° 但是 此種方法有使用高價之肝磷脂固定化親和層析管柱,从及 本紙張尺度逍用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X29?公釐) 4 38 5 1 5 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明'(3 ) ^ 操作煩雜等缺點。至於能夠廉價並且大量生產PF4之工業 方法則尚未確立,因此本發明人等乃深入探討適合量產 PF4之新穎製造法。 鲤決間頴而槭夕丰段 經悉心研究结果,本發明人等發現例如血小板抽出液 等含有PF4之溶液若與幾丁質硫酸塩接觸,PF4能夠特異的 被幾丁質硫酸塩吸附結合,陲後提高塩濃度即能使被吸著 的PF4溶離出。 本發明乃基於此一新發現,Μ使含有血小板因子-[V 之溶液與幾丁質硫酸塩接觸使該因子被吸附,然後再使該 因子由吸附體溶雛出而成者為特徵之血小板因子-IV製造 法。 本發明中用之作原料之血小板因子溶液,可列舉 例如由人類血液經離心分離回收之血小板經凍結•解凍、 低滲處理、或均質化等予Μ破碎而得的血小板提取液1或 含有Μ凝血_等剌激血小板而放出PF4之溶液。 幾丁質硫酸塩係使由甲殻類原料製得的幾丁質經硫酸 化而製成,已有市售商品。 幾丁質硫酸塩可為幾丁質之構造式中一部分或全部羥 基經予硫酸化而成者,亦可為第2碳上之乙醯胺基之一部 分經予脫乙醢化或硫酸化而成者。 含有ΡΡ4之溶液與幾丁質硫酸塩接觸時,溶液之性質 K pH約6〜9之中性附近為宜,而ΚρΗ約7.5時較佳;溶液 之塩濃度Μ低於約1.5Μ,較宜為約0.4Μ。塩之種類通常使 ό— (請先聞讀背面之注$項再填寫本頁) 訂' 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 5 38515 A7 40R12B_b7_______ 五、發明説明(4 ..)· 用氯化鈉、氯化鉀等,只要不妨礙PF4之吸附,硫酸納等 其他塩類亦珂採用。 含有PF4之溶液對幾丁質硫酸塩之比例並未予特別限 制,例如對由1L人類血液而得的血小板抽出液*以使用幾 丁質硫酸塩1 0〜1 0 0 in 1為宜。 幾丁質硫酸塩與含有PF4之溶液接觸時間並未予特別 限制,接觸操作可Μ採用管柱法或批式法之任何一種方法 進行。溶液中之PF4經由上述接觸即可特異的被吸附結合 於幾丁質硫酸塩分子上。 結合於幾丁質硫酸塩上之PF4*在pH約6〜9之中性附 近,較佳者pH約7.5時,可Μ使用比吸附時含有PF4溶液之 填濃度較髙的塩濃度,亦即0.5ΜΜ上或宜為1ΜΜ上之溶液 使之溶離。塩類Μ使用例如氯化鈉、氯化鉀等為宜,但是 只要能夠達成以離子強度之變化使其溶出的目的*其他塩 類亦可採用。
經濟部中央標準局員4消費合作社印I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 如此而得的ΡΡ4*可’以使用Pharmacia公司製造的 Sephacry] S-100或東曹公司製造的TSK-GEL G2000等材料 ,進行更進一步之脫塩、精製。 Μ下列舉實施例K進步詳细說明本發明*但是本發明 並不受此等實施例所限制。 審廉例1 依昭太链明靱備PF4 採得的人類血液於22Τ以3500xg雛心6分鐘除去血漿 ,殘餘之血球成分加入9倍量之0.155M氯化銨溶液並於室 本紙張尺度適用中國國家襟準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 6 38 5 1 5 A7 __40R128 B7_ _ 五、發明説明(5 .… ,· 溫放置10分鐘。然後於4tM2 20xg離心7分鐘,去除沉毅 之白血球。已去除白血球之上澄液再度於41C以1 2 00xg雛 心1 0分鐘,收集沉澱之血小板。採得的血小板Μ生理食塩 水洗淨後,於-20 υ凍结。使已凍結的血小板解凍,加人 4倍量之Tris-HCl媛衝液(ρΗ7,6)使混合,再於 700xg離心10分鐘,以所得上澄液作為血小板提取液。對 血小板提取液添加氯化納使其終濃度成為0.4M,然後導入 事先Tris-HCi· 0.4M氯化鈉溶液平衡過的幾丁質 硫酸塩(商品名Sulfonate Chitopearl、富士坊織公司製 造)中。結合的PF4則K15mM Tris-HCl· 1.0M氯化納溶液 溶出之。 ' 另一方面將已添加氮化鈉使終濃度為1.0M之血小板提 取液,依上述相同數量添加入依照習知方法K與上述幾丁 質硫酸塩同量之15mM Tris-HCl· 10M氯化納溶液平衡後 之Heparin-Sepharose( Pharmacia公司製造)内。结合之 PF4Kl5mM Tris-HCl鍰衝化後之2.0M氛化鈉溶液溶出之。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事頃再填寫本頁) 結果依照本發明之方法坷由1L人類血液製得20mgPF4 ;依照習知方法則僅能由1L人類血液製得lOntg之PF4。 .試酴例1 (SDS -聚丙烯脑胺膘體雷泳) 實施例1製得之PF4與SDS化試劑(2%SDS、10M尿素、 ImMEDTA、0.1M 蔴糖、5% Θ -醃基乙醇、10mM Tris-HCl pH7.4)等量混合,並於1006C加熱處理5分鐘。然後於15% 〜25¾濃度梯度之聚丙烯_胺膠體(第一化學藥品公司製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) ~ ΓΤ777 7 38515 經濟部中央標準扃員工消費合作社印裝 A7__40R128 B7____五、發明説明(6 ) 造)上*於0.1¾ SDS存在下進行電泳。膠體上分離後之蛋 白質以0.25%庫瑪錫燦藍-1?-250(810-1?40公司製造、溶於 50%乙酵· 10%醋酸)染色*於7.8kDa處確認有單一色帶 (第1圖)。 試賒例2 (西方庄昽清法) 與試驗例1同樣經聚丙烯醢胺膠體展開後之蛋白質, 在Zalts吸潰裝置Ualtrius公司製造)中Μ電力使移轉至 PVDP膜(第一化學藥品公司製造)後(使用含20 %乙醇之 Tris-甘胺酸緩衝液,M200mA電流強度通電30分鐘> * PVDF膜先以 TBS(20raM Tris、 500mM Nacl、 PH7.5)徹底洗 " 淨後,置於含5¾脫脂奶粉之TBS中維持1小時Μ封蔽非吸 S. 附部分。然後在含有 1¾ BSA 之 TTBS(0,05% Tween 2 0.TBS) 中使稀釋500倍之山羊抗人類PF 4抗血清(ATAB公司製造)與 瞑在室溫下反應1小時。反應後之膜以TTBS徹底洗淨後, 使之與經含1% BSA之TTBS稀釋500倍並經碱性磷酸酶標識 之抗山羊UGUioMakor公司製造)進行反應。反應後以含 有硝基藍四氮二烯伍國•溴氯吲睬基磷酸之基質溶液使呈 .色,結果在與SDS -聚丙烯醯胺膠體電泳之相同分子量範圍 確定有單一色帶(第1_)。 試驗例3 (防某酸序刟分析) 實施例1製得之PF4依照上述方法轉印至PVDP膜後,Μ TBS洗淨,再Μ含有1¾葡萄酒紅(Ponceau)-S之1¾醋酸溶 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A<t規格(210X 297公釐) 8 38515
408128 B?7 經濟部中央標準局貞工消費合作社印製 五、發明説明 ( 7 ) ϊ 液 染 色 0 >χ 去 離 子 水 及 甲 酵 洗 淨 後 » 使 膜 乾 燥 並 切 取 染 色 部 位 t >λ A p pl i e d B i 0 S y s t e ms 公 司 製 造 之 胺 基 酸 序 列 分 析 裝 置 測 定 H " 末 端 之 9 個 胺 基 酸 殘 基 1 结 果 flyi 與 已 被 提 出 報 告 之 序 列 (D υ e 1 , T · F . e t a 1 . ,P Γ 0 C * Ha t 1 .A c a d . Sc 1 . USA, 74 9 6 , 22 5 6 -225 8 , 1977)完全- -致c 試 職 例 4 (PF4 肝 Μ, m 中 和 活 Τΐ ) 抗 凝 血 m I 與 凝 血 m 結 合 時 將 阻 礙 凝 血 酶 之 活 性 » 肝 磷 脂 之 存 在. 則 顯 著 促 進 該 阻 礙 作 用 〇 在 添 加 抗 凝 血 m 1 ·% 凝 血 m >λ 及 肝 瞵 脂 之 溶 液 中 加 人 PF4 * 再 由 該 溶 液 對 凝 血 m 之 合 成 基 質 的 分 解 初 速 度 統 計 出 已 恢 復 的 凝 血 酶 活 性 » 即 能 計 算 PF4之肝磷脂中和活性= 將 肝 磷 脂 (終濃度7 .2 X 10 -3 U/ ml 和 光 純 藥 公 司 製 造 ) 實施例1 中 依 照 本 發 明 方 法 或 習 知 方 法 製 得 之 PF4 抗 凝 血 m 1 (终濃度2 .9 %/ ml 生 化 學 工 業 公 司 製 造 ) 以 及 40 m Μ HEPES P H7 • 4互 相 混 合 (總量2 m 1 ) 於 37 靜 置 30 秒 後 加 入 1 5 U 1凝血酶( 終 濃 度 0 . 1 δ JU g/ ml 1 S I g ra a 公 司 製 造 ) 於3 7 υ靜置1分 鐘 再 加 人 呈 色 基 質 S- 2 238 ( 終 濃 度 0 . 11 Μ/ ml 第 一 化 學 公 司 製 造 ) 然 後 測 定 凝 血 酶 分 解 圼 色 基 質 而 引 起 40 5 η a吸光值上昇之經時變化 結 果 證 實 依 昭 本 發 明 方 法 製 得 之 PF4 •與習知法 :肝 磷 脂 -藻類多釀) 製 得 者 具 有 相 同 的 比 活 性 (第2 圖 ) D 發 明 功 效 依 昭 本 發 明 採 用 容 易 取 得 的 幾 丁 質 硫 酸 塩 作 為 吸 附 劑 頁 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 9 3 8 5 1 5 請 先 閲 讀 背 © 之 注 意 事 項 再 訂 _____11)8128_五、發明説明I: 8 ). ,可Μ由含有血小板因子-IV之溶液中特異的吸附出、取 柱横 管規 性業 和 Η 親合 化適 定係 固確 脂法 磷方 肝之 用明 使發 於本 高明 遠證 亦可 率此-1 產由子 其。因 。 法板 子方小 囪知.血 該習產 得之量 法 方 的 明 說 厘 簡 之 式 圃 血 得 製 所 法 知 習 及 法 方 明 發 本 Μ 中 IX 例 豳 實 .為 画 X 第 本 影 之 片 相 漬 吸 氏 方 西 之 子 因 板 小 血 得 製 法 方 明 發 本 照 依 示 表 ΤΧ no I 圖 子 2 因第 板 小 阡 之 形 圖 作 和 中 脂 隣 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 3 8 5 1 5

Claims (1)

  1. 修戽7- 12-03] 4M12S | 年 Λ er| H3補充 I 附件二 — 第8 5 1 1 425 1號專利申請案 補充實施例1 (87年12月3日) g淪俐1 f補右銳明) 嵌暇太發明予PP4分雜 將於檸樣酸納存在下抽得之80b1人類血液於22X3M 3,500 X g離心6分鐘Μ分離去除血漿,殘餘之血液细胞與 720ral0.155M氮化銨溶液混合,睡後於室溫放置10分鐘。 然後於413M200 X s雔心7分鐘,收集生成之上澄液,再 度於4tlMl,200 X g雛心10分鐘。收集沈澱之血小板*以 生理食塩水洗淨後*於-20¾凍結。使已凍结之血小板解 凍*加人80ml 15mM Tris-HCl鍰衝液(PH7.6)使混合,再 於41CM700 X g離心10分鐘,得到IOObI上澄液(血小板提 収液)。使此100ml血小板提取液與2.3克氯化納混合使其 终澹度成為0.4M,並添加至装填有事先M0.4M氯化納/ 15niM Tris-HCl緩衝硖(ρΗ7·6)平衡過的幾丁質磙酸塩(商 品名為Sulfonated Chitopal*日本富士纺绷公司製造)之 管柱。經吸附之PF4以1.0M氯化納/15·Μ Tris-HCI鑀衡液( PH7.6)溶出之。 經濟部中央標準局員工福利委員會印製 另一方面,依照習知方法,於使lOOnl血小板提取液 與5.8克氛化納混合後,將其添加至裝填著與上面所用嫌 丁質硫酸塩相同容積之事先M1.0M氣化納溶液/15nM Tris -HC1 媛·衝液平衡過的 Heparin-Sepharose(瑞典 Pharmacia 公司製造)之管柱。經吸附之PF4M2.0H氛化納/15mM Tris -HC1鍰衝液(pH7.6)溶出之。 結果,依照本發明之方法可由每升人類血液製得2 0 rag PF4,而習知方法則僅由每升人類血液獲得l〇mgPF4。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS )A4規格(210 X 297公發) 修戽7- 12-03] 4M12S | 年 Λ er| H3補充 I 附件二 — 第8 5 1 1 425 1號專利申請案 補充實施例1 (87年12月3日) g淪俐1 f補右銳明) 嵌暇太發明予PP4分雜 將於檸樣酸納存在下抽得之80b1人類血液於22X3M 3,500 X g離心6分鐘Μ分離去除血漿,殘餘之血液细胞與 720ral0.155M氮化銨溶液混合,睡後於室溫放置10分鐘。 然後於413M200 X s雔心7分鐘,收集生成之上澄液,再 度於4tlMl,200 X g雛心10分鐘。收集沈澱之血小板*以 生理食塩水洗淨後*於-20¾凍結。使已凍结之血小板解 凍*加人80ml 15mM Tris-HCl鍰衝液(PH7.6)使混合,再 於41CM700 X g離心10分鐘,得到IOObI上澄液(血小板提 収液)。使此100ml血小板提取液與2.3克氯化納混合使其 终澹度成為0.4M,並添加至装填有事先M0.4M氯化納/ 15niM Tris-HCl緩衝硖(ρΗ7·6)平衡過的幾丁質磙酸塩(商 品名為Sulfonated Chitopal*日本富士纺绷公司製造)之 管柱。經吸附之PF4以1.0M氯化納/15·Μ Tris-HCI鑀衡液( PH7.6)溶出之。 經濟部中央標準局員工福利委員會印製 另一方面,依照習知方法,於使lOOnl血小板提取液 與5.8克氛化納混合後,將其添加至裝填著與上面所用嫌 丁質硫酸塩相同容積之事先M1.0M氣化納溶液/15nM Tris -HC1 媛·衝液平衡過的 Heparin-Sepharose(瑞典 Pharmacia 公司製造)之管柱。經吸附之PF4M2.0H氛化納/15mM Tris -HC1鍰衝液(pH7.6)溶出之。 結果,依照本發明之方法可由每升人類血液製得2 0 rag PF4,而習知方法則僅由每升人類血液獲得l〇mgPF4。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS )A4規格(210 X 297公發) 408128 H3 修 |7-12-03 本年* a - 附 件 四
    第85114251號專利申請案 申請專利範圍修正本 (87年12月3日) 1. 一種血小板因子-IV之分離方法,其特徵在於使含有 血小板因子-IV之溶液與幾丁質硫酸塩接觸Μ吸附該 因子,然後使該因子由吸附體溶雔出而成者,其中幾 丁質硫酸塩係幾丁質之至少一部分羥基經硫酸化,而 乙釀胺基則維持不變或者部分經脫乙醢化後及硫酸化 而成者。 2. 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中使與幾丁質 硫酸塩接觸之含血小板因子-IV之溶液含有低濃度之 塩,然後Μ含有較高濃度塩之溶液使該因子由幾丁質 上溶離出而成者。 3. 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中使含血小板 因子-IV之溶液含有約1.5ΜΚ下,較佳為約0.4Μ之塩 *由幾丁質硫酸塩溶雜該因子時則以含有較高塩濃度 之溶液進行之,所用之塩濃度至少為0.5Μ,較佳則至 經濟部中央標準局員工福利委員會印製 小 血 中 其 法 方 之 述 所 項 3 第 或 項 1—1 第 圍 範 。 利 者專 1Μ請 為申 少如 觸之 接近 塩附 酸性 硫中 質於 丁均 幾 , 與程 V 過 1 - 之 子子 因 因 板該 離 溶 體 附 吸. 由 及 Μ 者 行 進 下 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS )Α4規格(210X297公楚) 1 408128 H3 修 |7-12-03 本年* a - 附 件 四
    第85114251號專利申請案 申請專利範圍修正本 (87年12月3日) 1. 一種血小板因子-IV之分離方法,其特徵在於使含有 血小板因子-IV之溶液與幾丁質硫酸塩接觸Μ吸附該 因子,然後使該因子由吸附體溶雔出而成者,其中幾 丁質硫酸塩係幾丁質之至少一部分羥基經硫酸化,而 乙釀胺基則維持不變或者部分經脫乙醢化後及硫酸化 而成者。 2. 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中使與幾丁質 硫酸塩接觸之含血小板因子-IV之溶液含有低濃度之 塩,然後Μ含有較高濃度塩之溶液使該因子由幾丁質 上溶離出而成者。 3. 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中使含血小板 因子-IV之溶液含有約1.5ΜΚ下,較佳為約0.4Μ之塩 *由幾丁質硫酸塩溶雜該因子時則以含有較高塩濃度 之溶液進行之,所用之塩濃度至少為0.5Μ,較佳則至 經濟部中央標準局員工福利委員會印製 小 血 中 其 法 方 之 述 所 項 3 第 或 項 1—1 第 圍 範 。 利 者專 1Μ請 為申 少如 觸之 接近 塩附 酸性 硫中 質於 丁均 幾 , 與程 V 過 1 - 之 子子 因 因 板該 離 溶 體 附 吸. 由 及 Μ 者 行 進 下 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS )Α4規格(210X297公楚) 1
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