CN1157829A - 生产血小板因子-4的方法 - Google Patents

Abstract

本发明以易于获得的硫酸化壳多糖为吸附剂，通过专一性吸附可从含有血小板因子-4的溶液中回收该因子，与利用肝素固定的亲和柱相比，产率可大大提高，并提供了用于通过提纯血小板因子-4的方法，它是适合于商业规模的大量生产方法，其优点是可利用更易于获得的硫酸化壳多糖、简化的方法和改进的产量获得目的产物。

Description

生产血小板因子-4的方法

本发明涉及一种通过提纯生产血小板因子-4的方法。

在开心的外科手术，如心脏分流外科手术中，必须在一有限的时间内把血流吸入或引导至心脏内和引出心脏，并将一台心肺机械用于暂时代替心和肺的功能。为了防止血液在该心肺机械中凝固，要向流入其中的血液里加入肝素，而在外科手术之后，要给患者使用硫酸鱼精蛋白，以恢复其凝血功能。在对有肾功能缺陷的患者进行血透析治疗时，肝素和硫酸鱼精蛋白被用于相同的目的。然而，已知使用硫酸鱼精蛋白含产生多种副作用，如过敏反应、血小板和白血球数量减少、低血压、心动过缓、呼吸困难、发热、瞬时发红、恶心/呕吐和肺水肿，因此，使用时要加以小心(Japanese Pharmacopoeia，第12次修订版；Viera，J.，等，J.O.Amer.Surgeon，50，151，1984)。

另一方面，根据导在发现取决于血小板数量的血小板肝素中和活性的可变性的基础上，发现血小板中存在一种肝素中和物质(Conley，Co L.等，Proc.Sol.Exp.Biol. Med.，69，284-287，1948)。作为血小板中的肝素中和物质，在后来的报导中不仅有血小板因子-4(以下简称为“PF4”)，而且还有β-血小板球蛋白、低亲和性PF4，碱性血小板蛋白、纤链蛋白、血小板反应蛋白等，而且还发现，其中PF4与肝素的亲和力最大。DF4是一种分子量为7.8KDa的蛋白质，据报道它能产生肝素中和活性而又不会出现使用硫酸鱼精蛋白时(Cook，J.J.等，Circulation，85，3.1992)所发生的副作用(白血球减少症、低血压、肺水肿)。实际上，期望PF4能起到肝素中和剂的作用，可代替硫酸鱼精蛋白。

除了肝素中和作用以外，预计DF4还具有血管生成抑制作用。血管生成是指新毛细血管的形成，在健康个体的异常情况下可以观察到，并可在月经周期的特殊阶段在卵巢和子宫中出现，它的发生在多数情况下对活的机体来说是有害的，对于伤口愈合过程例外(重糖尿病性视网膜炎，早熟视网膜病，普通牛皮癣、恶性肿瘤等)。特别是，恶性肿瘤细胞完全没有接触抑制，这种抑制需要提供对其生长很关键并诱发血管生成发生的氧气和营养，从而保证了一条供应这些营养和氧气的途径。因此，抑制血管生成被认为可以有效抑制恶性肿瘤。据报导，PF4可以诱发血管生成的抑制活性(Marione，T.E.，等，Science，247，77-79，1990)，而在另一篇有关动物实验的文章中，PF4能有效抑制恶性肿瘤细胞(Shape，R.J.，等，J.Natl.Cancer Inst.，82，848～853，1990)。

在此之前，人体PF4的提纯一直是通过肝素固定化亲和柱层析方法进行的，以含有通过凝血酶等激活而从血小板中释放的蛋白质的溶液或通过使血小板经冰冻、解冻低渗处理等而发生溶血所产生的血小板提取液为原料(Levine，S.P.，J.Biol. Chem.，251，2，324-328，1976)。然而，该方法的缺陷是，要使用昂贵的肝素固定化亲和柱和复杂繁锁的方法，而且，至今尚未形成一种可以以低成本大规模生产PF4的工业化方法。在这种情况下，本发明人寻求一种适合于大规模、大量生产的新的PF4生产方法。

结果，本发明人发现，含有PF-4的溶液，如血小板提取液可以接触硫酸化壳多糖，从而形成专一性吸附，并使PF4结合在硫酸化壳多糖上，而且，这样吸附的PF4可通过提高盐的浓度而被洗脱。

本发明就是基于上述发现而完成的，并涉及一种生产血小板因子-4的方法，其特征在于所述方法包括将一种含有血小板因子-4的溶液与硫酸化壳多糖接触，从而吸附所述因子，随后从吸附体上洗脱该因子。

作为可用于本发明的一种含有血小板因子-4的溶液的原材料，举例来说可以是血小板提取液，它是通过对经离心从人血中获得的血小板进行冰冻和解冻、低渗处理或匀浆细碎而产生的，以及含有通过用凝血酶等激活而从血小板中释放出的PF-4的溶液。

硫酸化壳多糖是通过对由甲壳动物的外壳进行硫酸化而制成的，并投放市场。

硫酸化壳多糖可以有被部分地或完全硫酸化的壳多糖羟基，在2-位上还可以有被部分地脱乙酰化或硫酸化的乙酰氨基。

最好让一种含PF4溶液接触硫酸化壳多糖，同时将溶液的pH保持在中性左右，或pH值约为6～9，最好为7.5，而溶液中盐的浓度最好低于1.5M，最好约为0.4M。作为盐，通常可以采用NaCl和KCl，也可以采用其它盐，如Na₂SO₄，只要它不妨碍PF4的吸附即可。

含有PF4的溶液与硫酸化壳多糖的混合比例没有特殊的限定，但最好是以10～100ml的硫酸化壳多糖与从1升人血中产生的血小板提取液配合。

含有PF4的溶液与硫酸化壳多糖的接触时间也没有特别的限制，尽管这一接触过程既可用柱方法又可用分批方法来实现。上述接触过程是为了让溶液里的PF4被吸附并专一地结合到硫酸化壳多糖上。

吸附在硫酸化壳多糖上的PF4在下列条件下可被洗脱：pH在中性左右或约为6～9，最好约为7.5，采用其盐浓度高于用于吸附的含有PF4的溶液的浓度的溶液，或盐的浓度不低于0.5M，最好不低于1M。所述盐的优选例子包括NaCl、KCl等，这是因为被吸附的PF4实际上是由于离子强度的改变而被洗脱的。只要能达到洗脱的目的，其它的盐也可以使用。

按上述方法获得的PF4，还可通过Sephaeryl S-100(由瑞典的Pharmacia生产)，TSK-GEL G2000(由日本的Tohsoh Inc.生产)进一步脱盐提纯。

下面的实施例将对本发明做更详地说明，但是本发明并不受这些实施例的局限。其中的附图有：

图1是通过本发明的方法和常规方法生产的PF4的Western印迹分析的再现(照片)；和

图2是表示用本发明方法生产的PF4的肝素中和活性的曲线图。

例1按照本发明的方法生产PF4：

将抽取的人血在22℃以3500×g的离心力离心6分钟，以分离出血浆，残余的血细胞与9倍体积的0.155M NH₄Cl溶液混合并在室温下静置10分钟。然后在4℃以220×g的离心力离心7分钟，除去沉淀的白血球。在除去白血球以后，将所得上清液在4℃以1200×g的速度再离心10分钟，除去沉淀的血小板，随后用等渗盐溶液洗涤，并在-20℃温度下冰冻。将冰冻的血小板解冻，与4倍体积的15mM Tris-HCl缓冲液(pH7.6)混合，并在4℃以700×g的离心力离心10分钟，其中分离出的上清液被制成血小板提取液。将该血小板提取液同NaCl混合，使其最终浓度为0.4M，并加入用15mM Tris-HCl/0.4M NaCl溶液平衡的硫酸化壳多糖(由日本的Fuji公司以Sulfonated Chitopal为商品名提供)中。结合的PF4用15mM Tris-HCl/1.0M NaCl溶液洗脱。

另外，按照常规方法，血小板提取液在与NaCl混合并使其最终浓度达到1M之后，以1∶1的比例加入用15mM Tris-HCl/1.0M NaCl溶液以与上述硫酸化壳多糖相同的体积平衡的肝素-Sepharose(由瑞典的Pharmacia公司生产)中，结合的PF4用由1.5mM Tris-HCl缓冲的2.0MNaCl溶液洗脱。

结果发现，用本发明的方法可从每升人血中生产出20mg PF4，而常规方法从每升人血中仅能生产出10mg PF4。测试例1SDS-聚丙烯酰胺电泳

将例1中所获PF4与十二烷基磺化剂(由2％SDS、10M尿素、1mM EDTA、0.1M蔗糖、5％β-巯基乙醇和10mM Tris-HCl组成，pH7.4)以等体积混合，并将混合物在100℃加热5分钟，然后在存在0.1％SDS的条件下以15％～25％的浓度梯度在聚丙烯酰胺凝胶(由日本的Dai-Ichi Kagaku Yakuhin公司生产)上电泳。在凝胶上分离的蛋白质用0.25％的考马斯亮兰R-250(由美国的Bio-Rad公司生产；溶于50％乙醇和10％乙酸)染色，在7.8KDa处出现了一条带(见图1)。试验例2Wester印迹法：

将以与例1所述方法相同的方式在聚丙烯酰胺凝胶上展开的蛋白质电转移(加200mA电流30分钟，采用含有20％乙醇的Tris-甘氨酸缓冲液)到PVDF膜(由Dai-Ichi Kagaku Yakuhin公司生产)上，在一台Salz Blot装置(由德国的Sartrius公司制造)上进行，用TBS(20mMTris和500mM NaCl，pH7.5)对该膜进行彻底清洗，然后在含有50％脱脂牛奶的TBS中保持1小时，以便封堵未被吸附的部分。随后将该膜同羊的抗人体PF4抗血清(由美国的ATAB公司生产)的500倍稀释液在室温下反应1小时，稀释液是用含有1％BSA的TTBS(0.05％Tween20，TBS)稀释的。然后用TTBS进行彻底洗涤，并同用含有1％BSA的TTBS稀释的、由碱性磷酸酶(由美国的BioMaker公司生产)标记的抗羊IgG的500倍稀释液反应。在上述反应结束之后，与含有氮蓝四唑和溴氯吲哚酸的染色反应在与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时相同的分子量区域现出一条带(见图1)。试验例3氨基酸序列

按上述方法把在例1中获得的PF4转移到PVDF膜上，接着用TBS洗涤并用含有0.1％Bonsoh S的1％乙酸染色，相继用去离子水和甲醇对该膜进行洗涤，并干燥。切下被染色的部分，用一台氨基酸序列分析装置对9N-末端残基进行测定，所得结果与以前报道的序列(Dueo，T.F.等，Droc.Natl.Acad.Sci.USA，74，6，2256-2258，1977)相符合。试验例4PF4的肝素中和活性：

抗凝血酶III通过与凝血酶结合而抑制其活性，而这种抑制作用在存在肝素的情况下会得到明显加强。通过向由抗凝血酶III、凝血酶和肝素混合的溶液中添加PF4，在凝血酶对合成底物的初始降解速度的基础上分析并测定所恢复的凝血酶活性，随后计算PF4的肝素中和活性。

将肝素(终浓度为7.2×10^-3单位/ml；由日本的Wako PureChemicals Ind.，Ltd.生产)、PF4(在例1中获得或由常规方法生产)、抗凝血酶III(终浓度为2.9μg/ml；由日本的Seikagaku Kogyo公司生产)和40mM HEPES(pH7.4)混合在一起，使总体积为2ml，将所得到的混合物在室温下放置30秒，并与15μl的凝血酶(终浓度0.18μg/ml：由美国的Sigma公司生产)，接着在室温下放置1分钟。在加入Coloring Snbstrate S-2238(终浓度0.1mM/ml：由日本的Dai-IchiKagaku公司生产)之后，通过按时间顺序测定在波长405nm处的光吸收确定凝血酶对该染色底物的降解。

结果表明，按照本发明方法所获得的PF4具有与用常规方法(肝素-Sepharose法)所生产的PF4相同的比活性(见图2)。

Claims (5)

1.一种生产血小板因子-4的方法，其特征在于该方法包括将一种含有血小板因子-4的溶液与硫酸化壳多糖结合，以便吸附所述因子，随后将该因子从吸附体上洗脱。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于硫酸化壳多糖是一种其羟基至少有一部分被硫酸化且其乙酰氨基完好如初或被部分脱乙酰化和硫酸化的壳多糖。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于向与硫酸化壳多糖接触的含有血小板因子-4的溶液中掺入低浓度盐，并用含有较高浓度盐的溶液将血小板因子-4从硫酸化壳多糖中洗脱。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于向含有血小板因子-4的溶液中混入浓度低于1.5M，最好是约0.4M的盐，并用盐浓度至少为0.5M，最好为1M的含有较高浓度盐的溶液将血小板因子-4从硫酸壳多糖中洗脱。

5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于血小板因子-4与硫酸化壳多糖的接触及将所述因子从吸附体上洗脱是在接近中性的pH下进行的。

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