TW383337B - Process of making (2S,5S)-5-fluoromethylornithine - Google Patents

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附件 £ 82109808 號專利申請案中文说明書修正頁 —__ 民國84年11月晏 五、發明説明 64. Π. 〇 ! 一補充 的狀況。OAT抑制劑的使用確實提供了一種特別有效之 治療DAT的方法，因爲大多數的阿齊莫氏症病人的肝功 能係正常的。因此，本發明化合物的使用乃提供了 一種極 需要之治療D A T的新方法。 本發明的目的即係提供本發明化合物用於治療DAT 的新用途。本發明的另一個目標在於提供本發明化合物之 鏡像異構物的合成方法；再一個目的係提供可用於治療D A T的合併療法。 本發明之總論 本發明係涉及以0 A T鈍化劑治療D A T，該〇 A T 鈍化劑宜爲經取代的鳥胺酸衍生物，更佳爲如下式所示之 5 -經取代的鳥胺酸衍生物：

R

C02H 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 式中，R 爲一CH2F、CHF2、一 CHC 1 F、 -C = CH、CH = CH2 或 CH = C = CH2, 其立體異構物，或其藥學上可接受的酸加成鹽。DAT 治療可爲合併療法，即包含投服0 A T抑制劑及可用於 低患者之腦中氨量的其它藥劑。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（2丨0X 297公釐） 11 ^濟邡中夬標"局Η工消φτ合-社印私 A6 ____ _B6_ 五、發明説明（1 ) · 本發明係關於鳥胺酸胺基轉移酶之某些抑制劑的用途 :詳而言之，本發明係關於某些5 -經取代的鳥胺酸衍生 物，彼等可單獨用於治療阿齊莫氏型痴呆症及與其它藥劑 併用以供治療阿齊莫氏型痴呆症。 本發明之背景 銨離子（NH4+)在維持酸一鹸的平衡上，扮演主角 ，但其在高濃度時，卻是有毒的，藉由人體，銨離子可由 多種前驅物（核酸，蛋白質，胺基酸，己醣胺，一級胺） ，經由各種不同的反應製得，其並可由外源，如腸內細菌 對飲食之蛋白質的破壤，而被導入體內。 體內所產生之脲〔CO (NH2) 2〕中，有大約2 0 %會擴散至腸，而在此藉助細菌的作用，轉化爲氨及二氧 化碳。在肝內，氨會被吸收且藉由鳥胺酸（脲）循環，轉 換回去爲脲，此乃去除氨的主要途徑。因此，肝的急性及 慢性病會損害肝去除體內之氨的能力。 多量的氨易於通過血腦阻礙（blood brain barrier )，導致產生腦病（腦的變性疾病）。神經性腦病的病因 之一爲尿道的細菌感染（例如神經發生性膀胱）。另一個 病因爲因急性或慢性肝病所導致的氨解毒不充分，而產生 肝原性腦病。此疾病之致病性的重要因素之一已經確認爲 外源性（胃腸）氨。 長久以來，蛋白質，核酸，胺基酸及己醣胺業已被認 定爲腦中氨的其它來源。一級胺類（單胺類，二胺類及多 ................................................... ........................裝.............. 訂.............^ (請先閲讀背面之：工意事項再填寫本頁) 本紙‘:長尺度通用中围國家標準（CXS)甲4规格（210x297公釐1 附件一A :第821〇98〇8號專利申請案中文說明書修市百 雇,,,τ- 民國86年11月呈 ， 五、發明説明（18) 年月曰 86. 1丨.03補充 苯基乙醯基）胺某一2 _六瓿吡啶酮及(2 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 6 —氟甲基一 3 _胺基_ 2 _六氣吡啶酮

將濕的青徽素乙醯化酶（0. 040g)加至（2R ，5R)及（2S，5S) —6 —氟甲基一 3 —(苯基乙 醯基）一胺基—2 —六氫吡啶酮（0· 0 9 7g， 0 · 3 7mmol)於磷酸鹽緩衝劑（pH7 ，1 ， 〇 . 1M)所成之溶液中，攪拌3 0分鐘後，濾除酶；用 二氯甲烷清洗該溶液，以便移除（2 R，5R) — 6 —氟 甲基一3 —（苯基乙醯基）胺基一 2 —六氫吡啶酮（ 〇. 〇 5 7 g )，將含水相蒸發，即得呈白色固體之（ 2S，5S) — 6 —氟甲基—3 —胺基一 2 —六氫吡啶酮 (〇 . 0 2 3 g ) 〇 HPLC :Chiralpak AD ， 2 5 0X4 . 6mm ， 2 1 °C，Et〇 H /庚烷：60/40:0. 5 m 1 / m i n » 2 1 0 n m ° 1個峰：1 4 . 8分鐘。 (2S，5，S) — 6 —氟—2，5 —二胺基己酸，二氣务 化物及（2S，5S) — 5_氟甲基鳥胺酸，二氫氯仆^ 令（2S，5S) 氟甲基一3 —胺基一2 —六 氫吡啶酮（0. 0 2 0g，0· 17mmol)於鹽酸（1 m又，6N)的溶液回流2. 5小時。用水（2m又）稀 釋該溶液並用二氯甲烷（4 mj?)予以清洗四次，將含水 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21 〇 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 20 A6 B6 五、發明説明（2 ) 胺類）的氧化性脫氨反應，經甘胺酸裂解系統所進行之甘 胺酸分解代謝，噤呤類及嘧啶還有葡糖胺- 6 -磷酸酯的 脫氨反應等等皆爲已知的氨產生反應，彼等對於腦中氨的 恒穩水平有所貢獻。 阿齊莫氏型痴呆症（DAT )爲另一種病因未知的變 性腦病（雖已有多種假說被提出）。最近的硏究報告指出 DAT病人的腦內的氨濃度昇高，且氨係於腦中產生並過 量0 Hoyer，S. , e t a 1 . , Neurosci. Lett. 117: 358-362 (1990)。另有二份報告指出，D AT患者的動脈內氨量較適配之對照個體者明顯較高。 Fisman, Μ . , e t a 1 . , Am· J. Psychiatry 14 2 2 7 1 —7 3 ( 1 9 8 5 ) JFisinan, M., et al., J . Am. Ger. Soc. 37:1102 (1989)。符合 DAT 之 診斷標準但既未患肝病又未有尿道感染的患者，其1 0 0 血漿中的氨量爲2 0 8 土 1 3 6# g ;且有8 3%之 此類患者的血中氨濃度高於正常的限制。Branconnier, R . J .，e t a 1 . , Am . J. Psychiatry 14 3:1313 (1 9 8 6 )。亦有報告發表患有嚴重DAT之患者體內 的動脈-靜脈間的氨差別。以及臨床上被診斷爲患有初期 痴呆症之患者體內之動脈一靜脈間氨差別，還有剛開始發 作而極可能成爲DAT之患者體內的動脈一靜脈間氨差別 。健康志願者呈現出之腦的平均攝氨量爲7 2 土 7 g · kg-1· niiiT1 。與之有驚人對比的是，由患有嚴重DAT 之病人的腦釋出之氣爲2 7 ± 3 # g . kg'1· rain — 1 。患 .............................................................................^......................、訂............. Μ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸诔尺度违用中固Θ家標準（CNSI甲4規格！ 210X 297公釐1 附件 二 第82109808 號專利申請案中文說明書修正頁 民國83·年11另修正 補无 ' 五、發明説明（19 ) ---- 相蒸發並令殘留自甲醇/乙醚再結晶。可得呈白色晶體之 檁題化合物（15mg，產率82%) °(2S，5S) — .5 〜氟甲基鳥胺酸，二氫氯化物之旋光度aD= + 2 6 .7。 ’相關之SS二胺基己酸二氫氯化物aD=+26.5。。 .參考資料：T 〇 i，K ;丨 z u m i，Y ; N i ρρ ο n Kag 〇 ku Zauk i J^9 6 Q ， 8 1，6 5 2 ° 1 H NMR ( 36 0MH z » CDsOD ) ¢51 ppm ： 4 . 4 ( m , 2H , CHzF) ； 3.8( m，1 Η，H - 2 ) ; 3 . 3 ( m，1 H，.H - 5 ) ; 1 . 7 ( m，4 H , C H 2 C H 2 )。 l9F _NMR ( 338.8MHz，CHCl3)d ppm: -69.15(dt,3J = 2 3.Hz ’ 2J = 47Hz )。 實例2 爲試驗本發明的化合物的治療效果，可依照H. F. Proless, et al., Clin. C h e π . 19:1162 — 1169 (1973)的方法，採用對氨有專一性的電極 ，於靜脈血測量血中氨濃度，該文獻茲併於本文爲參考。 爲減少因水解作用所產生之結合氨的釋離，血液樣品將立 即被冷卻至0°C，並藉由與等體積之0. 4M過氯酸混合 ，以進行去蛋白作用。用0 . 2 Μ過氯酸，以1 : 1比例 稀釋該混合液後，藉離心法去除蛋白質。依下列之方式測 定澄清上清液內的氨溴度。於室溫下，令以0. 5m又爲 —份之上清液與2 0 p θ 1 0M之氫氧化鈉混合。將對 氣具專一性的電極（如可購自Orion Research Inc.,

Cambridge, M ass.者）插入該混合液中，並測量氨所產生 .........................................................................隹 U^κιί4·ΓΓ而之：ίχ'δ私項"Μ，*ί 本"ί κ ii ι·ϊ ；ii t a ty ι.ί ,ΐ'- ( cns I f ί m iiv 1210x291 ^ 1—---- 适濟部办夬砍弘^:?!工"赍合:?社印51 A6 , B6 ' 五、發明説明（3 ) 有推測之剛發病之DAT的患者，其釋離至循環系統的氨 爲2 5 6±16 2Aig.kg-1.rain-1 。這些發現指示不 論氨的解毒機構是否充分，腦內的氨都會有過量的現象產 生0 Hoyer, S . , e t a 1 . N e 11 r o s c i . Lett. 117： 358-368 (1990)。 本發明確認高氨症至少在DAT之症狀學及進展上， 爲一重要因素。如下文將進一步敘明者，腦的高氨血症對 於被認定爲DAT之檢驗標記的因素，可能有所影響。 腦的高氨血症及DAT a)氨中毒情況下之突觸傳導 氨能夠干擾脊椎中樞神經系統之主要激動性（ glutamatergic )及主要抑制性（GABAergic )神經元系 統的功能，而該脊椎中樞神經系統在患有DAT之患者體 內係遭損害的。 根據實驗結果，可計算得知當氨增加至約〇. 5 μ mol · g — 1 (腦），亦即增加2至5倍時，即足以擾亂 激動性及抑制性突觸傳導及引發與急性氨中毒有關的腦病 0 Raabe, W., Neurochem. Pathol. 6 : 145—166 (1987)。因此，似乎明顯的是，即使在腦內氨濃度 僅稍高於生理水平的情況下，亦會引發緩慢地進展的致病 機轉。 由麩胺酸鹽媒介之激動性突觸傳導會因氨而減少。但 是，此一效應與突觸繽絡前的終端（presynaptic .........................................................-...........-::…裝......................訂............. # (請先閔讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準ICXS)甲4規格（210 X 297公釐） 五、發明説明（35)

表1 ·胺基酸以及相關化合物單獨及與5 Mmol · kg-1 5 —氟甲基鳥胺酸 (5 FMO r η )保護鼠以對抗 1 3mmol · kg—1 ( i · P ·)乙酸 銨引起之中毒的保護效果 經濟部中央梯準局員工消費合作社印製 藥劑 劑量（ mmol * kg-1) 直立反射喪失 之動物百分比 有陣攣性發作 之動物百分比 活存百分比 Α.單-藥劑治療 賦形劑(3%NaHC〇3) - 100 100 0 L-鳥胺酸 10 -90 20 90 L-精胺酸 10 80 10 90 L-瓜胺酸 5 70 10 100 3 70 10 90 0.75 90 70 40 N-乙醯基-L-麩胺酸鹽 5 ' 100 90 10 L-肉鹼 15 90 90 10 L-乙醯基肉鹼 15 100 70 30 B.與5wmol · kg_ 1 5FMorn合併治療 生理食鹽水 - 60 60 40* L-瓜胺酸 0.75 90 30 80* N-乙醯基-L-麩胺酸鹽 5 90 40 20 L-肉鹼 15 100 50 60* L-乙醯基肉鹼 15 90 40 100* (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 37 - 經濟部中央橒芈工消ΐ合-^:社印¾ A6 B6 五、發明説明（4 ) terminals )中的截胺酸的耗竭是否有關，目前尙不明朗 0 抑制性突觸傳導亦會因氨而減少，此乃藉由過度極化 依賴的抑制性（GABAergic )神經元而達成。此一 效應與因氨而造成之來自神經元之CP—的擠出（ extrusion )的鈍化有關。藉由相同的作用，氨亦可降低 Ca2 + —及依存於電壓之—電流的過度極化用。由 於有相當大比例的GABAergic及其它抑制性神經元控制了 抑制性輸入（inputs )，所以氨會藉由「不抑制（ disiuhibition )」，而增加神經元激動。 b)葡萄糖利用性降低 在帶有高氨血症狀態（即指腦中葡萄糖利用性受損且 伴隨能量代謝速率降低及星細胞變質而被稱爲「阿齊莫氏 Π型神經樣變形」者）之實驗性及人類疾病上所發現的大 數顯著發現，同時亦爲DAT腦的特徵：在PET〔陽電 子放出局部 X 射線檢法（ρ 〇 s i t r ο n e m i s s i 〇 n t 〇 m 〇 g r a p h y )硏究中，發現到頂骨與益I骨皮質內的腦中葡萄糖利用性 壓倒性地降低。整個腦中葡萄糖利用性被發現在DAT剛 開始發病時（DAT發病之早期），氧消耗量正常下，降 低約5 0% ;但同樣降低5 0%.，在DAT發病期之晚期 時，氧消耗量則降低。後來又有幾個硏究者發表了 DAT 之腦能量代謝的損害情形，以及能量代謝作用所涉及之酶 的損害情形。 ............................................................................f......................•玎.............^ {請先閱讀背面之注意事項再填窝本頁) 本纸張尺度適用中国國家標準（CNS)甲4規格（210乂 297公釐:| A7 B7 , 五、發明説明（37) Lie献 表2 . 1 5咖〇1，竑―1 ( i · P ·)乙酸銨引起的中毒•以0 · 1 mmol · 1¾-1 5 —氟甲基烏胺酸（5 FMO r η)及其它已知可拮抗急性氨中毒之薬 劑的功效 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 治療 在喪失直立反射前有 在喪失直立反射後又 喪失直立反射但未 存活著 陣孿性發作的動物％ 有陣筆性發作者％ 有陣擊性發作者％ 無 100 0 0 0 5FMorn 35(20-50)a 63(50-80)= 2(0-10)~ 2(0-10)- L-瓜胺酸(5mmol. kg_1) 70 30 0 0 5FMorn + L-瓜胺酸 30 70 0 0 L-鳥胺酸(10咖ol.kg-1) 0 100 0 10 5FMorn + L-鳥胺酸 0 80 20 20 L-精胺酸（lOmmol.kg-1) 40 60 0 0 5FMorn + L-精胺酸 30 70 0 0 L-肉驗(5mmol. kg_1) 100 ' 0 0 0 5FMorn + L-肉驗 0 60 40 60* L-乙醯基肉驗（15mmol. kg一” 0 100 0 0 5FMorn + L-乙酸基_驗 0 50 50 60" N-乙醯基-L-麩胺酸鹽(5mmol. kg-1 ) 30 70 0 0 5FM0rn + N-乙醯基-L-麩胺酸鹽 30 70 0 0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 39 A6 _B6 五、發明説明（5 ) c)對於神經膠質功能的干擾 星形細胞異常乃DAT的特徴之一。反應性星形細胞 可媒介D AT之神經病理事件（events)，包括加速/0 -類澱粉蛋白蛋白質之細胞外沈稹，此一概念已獲已發表的 硏究觀察所支持。Frederickson，Neurobiol. Aeintf 13:239 - 253(1992)° 因氨所造成之星形細胞損害接著會造成麩胺醯胺合成 酶活性的降低，這可由帶有門腔靜脈分流之鼠體內，此酶 之活性降低15%的現象獲證實，3111^61^〇1'(:11,1?.1:'., e t a 1 . , J. Neurochem. 51:486-910 ( 1 9 8 8 )。然而，此一合成酶活性降低的現象會進一步 對星形細胞造成傷害。麩胺醯胺合成酶與細胞內氨及酶-鹸平衡的調解有極密切之關係，乃早已習知的事實。此酶 之功能上的任何障礙將伴隨氨毒性的擴大。因此，在高氨 血症鼠體內會觀察到細胞內P Η增加以及星形細胞腫大等 現象，乃不足爲奇：Swain, Μ. S.，et al. Am.__L. Phvs i o 1 . 261 ：R1491-51496 (1991 )0 愈來愈多的證據顯示小神經膠質在D A T的病理上亦 有其舞台，McGeer，P. L . , et a 1 . G_an J· Neurol. Sc i . 18：376-379 (1991)。此等細胞可 在許多變性的細胞中見及，而且，幾乎每—個老年血小板 皆具有小神經膠質細胞或是在血小板中具有細胞突（

.......................................................-..................^......................-可.............% (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁J 本线尺度適用中a國家標準（CNS )甲4規格I.210X 297公釐1 B6 五、發明説明（6 ) cell processes)。人們確信，小神經膠質的入侵表示腦 企圖使其本身擺脫廢物堆。由於々一類澱粉蛋白前驅蛋白 質可能在小神經膠質內形成，此等細胞可以二種方式對於 卢一類澱粉蛋白蛋白質沈積的產生有所貢獻，一是藉由神 經終端膜的呑噬作用，另一是藉由彼等所固有之β -類澱 粉蛋白前驅蛋白質。 d )高氨血症及刺激毒性的胺基酸（excitotoxic amino acids ) 硬變患者及D AT患者間之胺基酸種類的最明顯差異 ，被推測爲硬變患者之腦中所有區域內的麩胺醢胺增加了 好幾倍，而在DAT患者腦中的此等胺基酸卻無未有變化 。同樣地，在患有DAT之患者的腦脊髓液（CSF)中 未偵測得有麩胺醯胺的增加，而在帶有門靜脈-全身性腦 病之實驗動物的C S F中，此胺基酸的水平卻昇高了，此 等發現指示，DAT病人的腦無能力提高麩胺醢胺的生產 至某一程度，此外，此等發現可被視爲即使在氨的形成速 率僅少量增加時，DAT腦之敏感性亦相當大的指示。由 於氨量增加，2 _酮戊二酸的還原性胺化（藉由麩胺酸脫 氣酶所催化）不論在DAT或肝原性腦病皆會發生。人們 推測，由於其麩胺醯胺合成酶活性有限，故該 ' 多餘的| 魅胺酸鹽僅在後者的疾病狀況下，以麩胺醯胺的形式，自 腦除去。因2 _酮戊二酸在三羧酸循環中的濃度減低，由 2 —酮戊二酸產生麩胺酸鹽的生成會與能量代謝同時遭損 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 木纸張尺度適用中园國家標準iOiSl甲4規格（210X297公釐1 A6 B6 五、發明説明（7 ) 害。 D A T患者腦中的麩胺酸鹽濃度較年齡相適配之對照 組者的腦中麩胺酸鹽濃度來得低，此乃因爲麩胺酸鹽激發 性神經元的損失所產生的結果，但是，不論是DAT或門 靜脈全身性腦病，CSF中的麩胺酸鹽董皆提高，N., et a 1 . Am J. Psychiatry 1491251 — 254 ( 1 9 9 2 )，及 Therrien, G., et al., Metabolic Brain Pis. 6 : 65 — 74 (1991)，此表示此胺 基酸之細胞外濃度增加。暫且不論前面所述之麩胺酸鹽可 藉助2 —酮戊二酸之還原性胺化而增加生產的可能性，細 胞外麩胺酸鹽濃度的增加，最有可能爲因氨造成之星形細 胞功能障礙所產生之神經周圍星形細胞之攝入麩胺酸鹽作 用損害的結果。由於麩胺酸鹽之神經毒性效應會因攝入位 置的抑制而增强，所以神經膠質攝入機轉可能爲DAT之 刺激毒性細胞損傷的主要原因。 患有剛開始發病之DAT患者的腦天冬胺酸鹽釋離， 乃在該疾病之某段時期刺激毒性損傷的另一個原因。平均 6 0歲的患者之CSF中天冬胺酸鹽量正常。Pomara, N. ,e t a 1 . , Am . J. Psychiatry 149:251 — 254 ( 1 9 9 2 )° 已有證據顯示D AT患者之皮質及海馬中的麩胺酸鹽 受體遭選擇性損失。在患有過氨血症之鼠的小腦中，可觀 察得麩胺酸鹽之高及低親和性結合位置的數目皆減少了。 此一減少僅發生在對N -甲基一 D —天冬氨酸鹽有專一性

本纸朱尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210X297公釐I ............................................................................裝......................、玎.............^ (請先閱讀背面之：!£意事項再填寫本頁) A6 B6 五、發明説明（8 ) 結合位置上，而對於紅藻胺酸鹽及使君子酸鹽的結合位置 未造成任何障礙，當得自正常動物的細胞膜製劑以乙酸截 予以培養時，即可模擬此等效應。在同樣的實驗條件下， 目斯西莫（muscimol，一種GAB A受體作用劑）的結合 可獲加强，Raghavendra Rao, V.L., et al. N e u r n s r. i Lett. 130 : 251 — 254 (1991)。此等觀察 再次顯示氨影響麩胺酸鹽激發性及GABAergic神經元之功 能的能力。 本發明的化合物已記述於歐洲專利申請案號第 88400275. 9 (1988 年 2 月 5 日申請），公 告號碼：0 326 766，名稱爲：「5-. S u b s t i t u t e d 0 r n i t h i n e D e r i v a t i v e s 」，此案併入本案 爲參考。在前述申請案，此等化合物被揭示爲可有效治療 鳥胺酸之有條件的缺乏症以及氨中毒的情形。 鳥胺酸乃脲循環中的受質之一。脲循環可將銨離子併 入脲中，以便其能自體內去除。本發明的化合物可鈍化鳥 胺酸：2_含氧酸胺基轉化酶（OAT)。人們相信，藉 由因對OAT進行鈍化歷一段增長的時間而產生之組織鳥 胺酸濃度的增加，將導致脲在肝中生成及推測之在某些其 它組織中生成，而降低血液及腦脊髓液中的氨濃度。這些 化合物可用於治療無數已知與血液及腦脊髓液中氨濃度昇 高有關的人類疾病，其中有例如，肝硬化，暴發性肝衰竭 及尿道/膀胱感染。 即使如此，DAT從未被視爲可藉由降低氨量而受益 本扠法尺度通用中國闺家標準(CNS;甲4規格ί 210x297公ϋ ：~ΓΠ二 ~ ~ ............................................................................裝..................…-訂............. t (諳先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 附件 £ 82109808 號專利申請案中文说明書修正頁 —__ 民國84年11月晏 五、發明説明 64. Π. 〇 ! 一補充 的狀況。OAT抑制劑的使用確實提供了一種特別有效之 治療DAT的方法，因爲大多數的阿齊莫氏症病人的肝功 能係正常的。因此，本發明化合物的使用乃提供了 一種極 需要之治療D A T的新方法。 本發明的目的即係提供本發明化合物用於治療DAT 的新用途。本發明的另一個目標在於提供本發明化合物之 鏡像異構物的合成方法；再一個目的係提供可用於治療D A T的合併療法。 本發明之總論 本發明係涉及以0 A T鈍化劑治療D A T，該〇 A T 鈍化劑宜爲經取代的鳥胺酸衍生物，更佳爲如下式所示之 5 -經取代的鳥胺酸衍生物：

R

C02H 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 式中，R 爲一CH2F、CHF2、一 CHC 1 F、 -C = CH、CH = CH2 或 CH = C = CH2, 其立體異構物，或其藥學上可接受的酸加成鹽。DAT 治療可爲合併療法，即包含投服0 A T抑制劑及可用於 低患者之腦中氨量的其它藥劑。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（2丨0X 297公釐） 11 A6 B6 五、發明説明（10 ) 本發明的詳述 在本文中，、DAT#或 '阿齊莫氏型痴呆症〃係指 進行性退化器質性心智徵候簇，其中帶有短期及長期的記 億損害。此變性的痴呆症可爲輕度的（工作或社交活動遭 損害，但仍能單獨生活），中度的（需要某些程度的照顧 )或是嚴重者（需持續的照顧）。 短期記憶的損害係指無法學習新的資訊，且其例證爲 ，例如，患者無法在5分鐘後記得三個物件。長期記憶損 害乃指無法記起過去已知的資訊，所指者爲，例如，患者 無法記起過去的個人資料，如其出生地，職業，昨天發生 的事等：或患者無法記起屬常識之事實。典型之損害有純 思考的損害，判斷上的損害，個性上的變化或較高皮質功 能的其它障礙。 在此所用之「患者」係指溫血動物，例如，鼠，小鼠 »狗，貓，天竺鼠，靈長類動物及人類。「治療」或其形 式係指預防或減輕患者的疾病或症狀。 「立體異構物」係指僅在其原子於空間之指向上有所 差異之各分子的所有異構物。其包括鏡像異構物，幾何（ 順式/反式）異構物，以及具有一個以上不對稱中心之化 合物的異構物（彼等互相不爲鏡像，非鏡像異構物）。在 本發明中，式I化合物的消旋混合物可具有四個鏡像異構 物，且這四個鏡像異構物僅有一個較其它三者爲佳。 「合併療法」可指同時或先後投服二或多種藥劑。例 如，同時投服係指其內含有二或多種藥劑的劑型，而先後 .........................................................-..................-裝......................訂.............. ¥ (請先閱請背面之注意事項再填寫本頁) 本紙-張尺度適用中is固家標準I CN'S i甲4規格（210 X 297公釐_丨 A6 B6 五、發明説明（11 ) 投服可指將各劑型於不同的時間投與患者，甚至可以各種 不同的投服途徑進行。 任何藥劑皆有可能與可用於治療D AT之本發明化合 物併用於合併療法。較佳的是使用可用於降低DAT患者 之腦中氨量的藥劑，例如，可使用可藉脲循環而促進氨排 泄的藥劑，例如，鳥胺酸，瓜胺酸及精胺酸。較佳的是， 使用可不依賴脲循環即可降低腦中氨量的藥劑，如L —乙 醯基肉及L —肉驗。 如大多數之發明，本發明亦有較佳的體系，在本發明 中，R爲CH2F 者（EP 3 2 6 766之實例1) 乃較佳者，而最佳者係該化合物的鏡像異構物，（S/S )—2 ，5 —二胺基一6 —氟一己酸。 實例1 2，5 —二胺基—6 —氟一己酸係如EP 3 2 6 7 6 6所述者製得。利用任何適當的方法，如 HPLC，或其它可用的方法，分離出鏡像異構物。如下 所示。 本紙張尺度遝用中國國家標準ί CNS I甲4規格（210 X 297公^ ~ 13 - ...............…：，......................................................裝......................訂.............. ^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 0 A6 B6 五、發明説明（12 ) 2S，5S) — 6—氟一2，5 —二胺某己酸，二氣，氣, Η 0 化物的不對稱合成法H2N\V\,

Η 1. MeOH, HCI 2. Ag2C03 (97%) 0

^N^COOM

PhCH2CH2COCl, DCC, DMAP, Py, CH2CI2

PhCH2COHN

H (93%) 2R,5R) + (2S,5S) (2R,5R) + (2S,5S) PhCH2C0HN

LiBH4, LiEt3BH, Et20 0 ^N^COOMe (97%) 0

H

I H

(2R,5R) + (2S,5S) PhCH,COHN 2R,5R) + (2S,5S)

MeDAST, CH2CI3 (45%) 0

H 2R,5R) + (2S,5S)

PhCH2COHN *

0

H .................................................::-........................裝......................訂.............. Μ {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

.F HCI 6N

青徽素乙醯化酶 2R,5R

COOH

Η2ΝνΛ^、人N 0

.F HCI6N (82%)

Ph = 苯基

H

2S,5S

2R,5R

本纸法尺度適用中a S3宋楳準（C.N’S)笮4规格(210x297公釐I -14 - A6 B6 五、發明説明（13 ) (2R，5R)及（2S，5S) -3 —胺某一9 ==1^；L^ 吡啶酮一 6 —羧酸甲酯 將2，5-二氮雜環（2. 2. 2)辛烷-3， 二酮〔J. Med. Chem. 1 9 7 4，17 ， 4 8 1 - 4 8 7 ，P.A. Sturm, D. W. Henry,抗絲蟲劑。二氮雜環辛焼及 二氮雜環庚焼爲N，N —二乙基一 4 一甲基一1 —呢瞭甲 醯胺之橋接類似物〕（10. 75g，0. 0768 m〇i )溶於鹽酸在無水甲醇中所形成的溶液（5 6 Omj?， 0. 2 7M)。在2 0 °C下，將此混合液攪拌18小時， 然後用碳酸銀（21. 5g，0. 082 mol )予以中和 ，並令其過濾通過塞里塑料埜。將溶劑蒸發，並令殘留物 乾燥至隔夜。即得呈白色固體之檫題化合物（丨2 · 8 g ，產率9 7 % )。 1 H NMR (3 6 0 Μ H z »CD3〇D) ά ppm: 3, 85(m，lH，CHCOO) ； 3 . 55(m， 1 H » C Η N H 2 ) :3. 40 (s，3H，CH3); 1 9 及 1. 4 ( 2 in » 2 X 2 H CH2CH2) ° MS :mon oTFA 衍生物：m/e = 2 6 9 (MH + ..............................................................................裝....................訂.............. %. (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁j •3濟部女央""^肖工消赍合作社印災 掌 2 2 G 峰 ; 性個 6 8

C 巴及 } 1 鐘 ，分 h°c3 N 5 6 Μ 4 /V 1 5 2 Η 6 1 物. 生。 衍鐘 A 分 F 4 τ 6 2_

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3 I \—/ SI 5 ， S 基 醯 乙 基 苯 格 規 4 f 's cl 標 家 a 中 用 適 度 Λ 張 H. -ΐ

公 7 9 2 X

Ao B6___ 五、發明説明（14 ) 胺基一 2 —六氣tltt陡嗣一 6 —翔酸甲醋 將（2R，5R)及（2S，5S) — 3_ 胺基 _2 一六氫吡啶酮一6 —羧酸甲酯（12. 8g， 0. 0744mol )加入由苯基乙酸（10. 2g， 0. 075 rao 1 )，二環己基碳化二亞胺（13. 5g， 0. 0 7 5 mol )，吡啶（7. 2 τη 2 * 0 . 0 6 1 mol )及4 —二甲基胺基吡啶（0· 9g，0. 0073raol )於無水二氯甲烷（4 0 Omi?)所成之混合液中。於 2 0°C下，將此混合液搅拌2 4小時，然後濾出所生成之 二環己基脲並將濾液蒸發。利用快速餍析法，在矽膠上純 化殘留物，以甲醇/乙酸乙酯5/9 5爲洗提劑。可得呈 白色固體之標題化合物（19.6lg，產率93%)。 1 H NMR (2 0 0MHz > CD3〇D) δ ppm: 7 . 87(m，5H，Ph) ； 6 . 55(d，lH， N H ) ； 6 . 40(s，lH，NH-l) ； 4 . 35( m，lH，H-3) ； 4 . 12(m，lH，H-6)； 3 . 77(s，3H，COOMe) :3. 54 (s， 2H，COCH2Ph) ； 2 . 5(m，lH，H—4A )；2 . 2(m，2H，H-5) ； 1 . 5(m，lH， H - 4 B ) ° HPLC :Chiralpak AD ， 2 5 0X4 · 6mm ， 2 1 °C，EtOH/MeOH /庚烷：25/45/30， lml//min»210nm, 本紙張尺度適用中a 1家標準（CNS) f 4規格（ 210x 297公紫Ί - 16 _ ' :::................................................................……裝......................訂.................β (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A6 ____B6 五、發明説明（15 ) 2個峰：7. 26分鐘及12. 51分鐘。 元素分析：CisHi8N2〇4( 2 9 0. 3 1 )，理論値： C » 6 2 . 06;H，6, 25;N，9. 65。 實測値：C，62· 50;H，6. 26;N，9. 73 Ο m . P · 1 3 8 °C 0 (2R，5R)及（2S，5S) — 3 -(茉某乙醯某） 脾基一 2 —六氫吡啶酮一 fi —甲酵 將硼氫化鋰（0. 109m芡，0· 005raol )以 及三第二丁基硼氫化鋰（〇 . 5mi?，1M， 〇· 〇〇〇5raol )加至由（2R，5R)及（2S， 5 S ) — 3—(苯基乙醯基）胺基一 2 —六氫吡啶酮一6 一羧酸甲基（1. 451g，0. 005m〇l )於無水乙 醚（50m芡）及四氫呋喃（0. 109mJ?， Q. 〇〇 5m〇l )所成之漿狀物。令反應混合液回流12 小時，然後，將甲醇（)加入其中並蒸發溶劑。用 快速層析法，在矽膠上，純化殘留物，所用之洙提劑爲甲 醇/乙酸乙酯（8/9 2)。於再結晶後，可得呈白色固 .........................................................-..................裝......................訂 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 物 合 化 題 標 之 體 g 5 7 2 % 7 9 率 產 )/ Dο 3 D C,z ΗΜ ο ο 2 /V RΜ Ν Η τχ 7 m 5 Η h ρ m /ι\ 5 ο

m Η ρ ， PH rH 3 ο 2 Η C Η C， Η 3，τη /V 5 2 5 5 本紙張尺度適用中國國家標準丨CNS)甲4規格（210><297公釐） A6 B6 五、發明説明（16 ) (m，4H，H-4 ，H—5)。 HPLC :Chiralpak AD ， 2 5 0X4. 6mm ， 2 1 °C，EtOH /庚烷：60/40，lml/min， 2 1 0 n m， 2個峰：5. 37分鐘及6. 48分鐘。 元素分析：C14H18N2〇2( 2 6 2. 3 1 1 )，理論値 ：C » 6 4 . 11:Η，6. 92:Ν，1〇·. 68° 實測値：C，64. 12;H，6. 86;N， 1 0 . 6 8 〇 m . p . 1 5 8 °C 0 (2R，5R)及（2S，5 S i — 6 —氟甲某一3 -」 ..........-....................................................................裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -濟部，ty夬標準工消汉合-让.5;-发 苯基乙醯基）胺基一 2 —六氣吡啶酮 令（2R，5R)及（2S，5S)— 3 —（苯基乙 酸基）胺基一2 —六氫吡啶酮—6 —甲醇（52_ 4mg， 0 . 2 mmo 1 )於5 m 5無水二氯甲烷所成之懸浮液冷卻至 一 7 8°C。將二甲基胺基硫三氟化物（5 3. 2mg， 0.4111又，0.4 111111〇1)緩慢地加至該混合液中。於 一 7 8°C待3 5分鐘後，令混合液達至室溫，並予以另外 * 再攪拌1 6小時。用冰水驟熄反應。以二氯甲烷（2 5 mj?)稀釋有機相，並用水予以清洗，令有機相經硫酸鈉 乾燥，予以過濾並蒸發溶劑。利用快速層析法，在中性的 氧化鋁活性 III (aluminum oxyde activity III)上，純化 殘留物，所用之洗提劑爲甲醇/乙酸乙酯：8/9 2 ，於 本紙法又度適用中國1家標準（CNS)甲4規格（210x297公釐丨 · 18 - A6 B6 ^濟部"夬浮^局^工消^合：-社';''「.31 五、發明説明（17 ) 氯仿/戊烷再結晶後，標題化合物即以白色晶體的形式生 成（0· 024g，產率45%)。 1 H NMR (360MHz ，CD3〇D) ppm： 7. 3(m，5H，C6H5) ； 6 . 47(d，lH， NHCOCHzPh ) ； 6 . 27 ( s ， 1H，NH)； 4. 35(dAB，HA，JHAF=4 6. 4 H z )， 4 . 33(dAB，lH，JHBF=47· 3 3 H z ) ；4 . 24(m，lH，H—3) ； 3 . 75(m，lH ，H— 6) ； 3 . 6 (s，2H，CH2Ph)； 2 . 42 (m，1H，H2)。 19 F N M R ( 3 3 8. 8MHz »CHC13) ά ppm:— 62. 82 (dt，jHF 二 46. 8 H z ) O HPLC :Chiralpak AD ， 2 5 0X4 . 6mm ， 2 1 °C，EtOH /庚烷：60/40，0. 5 m 1 / m ί n ，2 1 0 n m， 2個峰：12. 8分鐘及14_ 8分鐘。 元素分析：C14H17N2〇2F ( 2 6 4 . 3 0 )，理論値 :C，63. 62;Η，6· 48;Ν，10. 60° 實測値：C，6 3 · 1 7 ; Η，6 . 5 6 ; Ν， 10. 52° (2R，5R)及（2S，5S)— 6 -氟甲基一 3—( 本纸張尺度適用中围國家標準；CNS)甲4規格（210x 297公釐) -19 - ...........................................................................裝................-訂............. ％ {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 附件一A :第821〇98〇8號專利申請案中文說明書修市百 雇,,,τ- 民國86年11月呈 ， 五、發明説明（18) 年月曰 86. 1丨.03補充 苯基乙醯基）胺某一2 _六瓿吡啶酮及(2 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 6 —氟甲基一 3 _胺基_ 2 _六氣吡啶酮

將濕的青徽素乙醯化酶（0. 040g)加至（2R ，5R)及（2S，5S) —6 —氟甲基一 3 —(苯基乙 醯基）一胺基—2 —六氫吡啶酮（0· 0 9 7g， 0 · 3 7mmol)於磷酸鹽緩衝劑（pH7 ，1 ， 〇 . 1M)所成之溶液中，攪拌3 0分鐘後，濾除酶；用 二氯甲烷清洗該溶液，以便移除（2 R，5R) — 6 —氟 甲基一3 —（苯基乙醯基）胺基一 2 —六氫吡啶酮（ 〇. 〇 5 7 g )，將含水相蒸發，即得呈白色固體之（ 2S，5S) — 6 —氟甲基—3 —胺基一 2 —六氫吡啶酮 (〇 . 0 2 3 g ) 〇 HPLC :Chiralpak AD ， 2 5 0X4 . 6mm ， 2 1 °C，Et〇 H /庚烷：60/40:0. 5 m 1 / m i n » 2 1 0 n m ° 1個峰：1 4 . 8分鐘。 (2S，5，S) — 6 —氟—2，5 —二胺基己酸，二氣务 化物及（2S，5S) — 5_氟甲基鳥胺酸，二氫氯仆^ 令（2S，5S) 氟甲基一3 —胺基一2 —六 氫吡啶酮（0. 0 2 0g，0· 17mmol)於鹽酸（1 m又，6N)的溶液回流2. 5小時。用水（2m又）稀 釋該溶液並用二氯甲烷（4 mj?)予以清洗四次，將含水 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21 〇 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 20 附件 二 第82109808 號專利申請案中文說明書修正頁 民國83·年11另修正 補无 ' 五、發明説明（19 ) ---- 相蒸發並令殘留自甲醇/乙醚再結晶。可得呈白色晶體之 檁題化合物（15mg，產率82%) °(2S，5S) — .5 〜氟甲基鳥胺酸，二氫氯化物之旋光度aD= + 2 6 .7。 ’相關之SS二胺基己酸二氫氯化物aD=+26.5。。 .參考資料：T 〇 i，K ;丨 z u m i，Y ; N i ρρ ο n Kag 〇 ku Zauk i J^9 6 Q ， 8 1，6 5 2 ° 1 H NMR ( 36 0MH z » CDsOD ) ¢51 ppm ： 4 . 4 ( m , 2H , CHzF) ； 3.8( m，1 Η，H - 2 ) ; 3 . 3 ( m，1 H，.H - 5 ) ; 1 . 7 ( m，4 H , C H 2 C H 2 )。 l9F _NMR ( 338.8MHz，CHCl3)d ppm: -69.15(dt,3J = 2 3.Hz ’ 2J = 47Hz )。 實例2 爲試驗本發明的化合物的治療效果，可依照H. F. Proless, et al., Clin. C h e π . 19:1162 — 1169 (1973)的方法，採用對氨有專一性的電極 ，於靜脈血測量血中氨濃度，該文獻茲併於本文爲參考。 爲減少因水解作用所產生之結合氨的釋離，血液樣品將立 即被冷卻至0°C，並藉由與等體積之0. 4M過氯酸混合 ，以進行去蛋白作用。用0 . 2 Μ過氯酸，以1 : 1比例 稀釋該混合液後，藉離心法去除蛋白質。依下列之方式測 定澄清上清液內的氨溴度。於室溫下，令以0. 5m又爲 —份之上清液與2 0 p θ 1 0M之氫氧化鈉混合。將對 氣具專一性的電極（如可購自Orion Research Inc.,

Cambridge, M ass.者）插入該混合液中，並測量氨所產生 .........................................................................隹 U^κιί4·ΓΓ而之：ίχ'δ私項"Μ，*ί 本"ί κ ii ι·ϊ ；ii t a ty ι.ί ,ΐ'- ( cns I f ί m iiv 1210x291 ^ 1—---- ^濟部中央桴準局只工消^^-:钍印" A6 B6 五、發明説明（20 ) 之電壓。使用其氯化銨濃度已知的溶液作爲對氨具專一性 之m極的校正。 實例3 藉由各種體外及髋內之一類澱粉蛋白斑形成的模式 ，可驗證本發明化合物預防或減少一類澱粉蛋白斑之累 稹的活性以及因此所產生之本發明化合物在治療阿齊莫氏 型老年痴呆症以及其它已知與/3 —類澱粉蛋白斑之形成有 關的疾病（如唐氏症）上的有用性。例如，本發明化合物 預防或減少類澱粉蛋白沈稹物之累積的能力，可由下 文所提供之分析法1至3所述的幾種細胞的及非細胞的體 外方法所證寅。這些分析法採用了天然yS _AP P係由細 胞所表現且被處理（processed)以產製1 1 一 1 2 KD a (P —終端片段及/?_類澱粉蛋白的事實。/5—APP表現 的內源程度（endogenous level)視需要可藉由轉染/?— A P P c D N A序列予以强化，例如，利用檫準方法， 將卢一APP ( 7 5 1 )轉染至細胞中。 體外分析法 分析法井1 :免疫沈澱法（i m m u n 〇 p r e c i p i t a t i 〇 n ) 細胞：將CHO — K1 (中國蒼鼠卵巢：源自 ATCC)細胞系穗定地轉染以表現大量的/?APP — 6 9 5，並予以稱作'CP— 6 — 3 6';將之用於篩選 一 A P p。其它晡乳動物之培養的細胞系亦可使用且已 ..........................................................-.................裝......................訂.............. t (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 本线張尺度適用中围國家標準{CNS)甲4規格1.210X 297公釐丨 -22 - ^濟部"夬標"^:."工消^合---'.吐.印 A 6 , B6 五、發明説明（21 ) 被使用。例如，人類神經元細胞系SK — N- ML (源自 ATCC )在相同的分析條件下，可得好的結果。用 /?APP — 6 9 5所進行之感染並非製造々A4的必要條 件：其僅是加强々A4的訊號。在準備實驗時，茲於1 〇 cm培養皿中，以低密度播散CP— 6 — 3 6細胞，並令 其於3 7°C/5%C〇2培養器中生長2至4天，達企融 合性的單層（〜1. 5X107細胞/皿）：生長基質係 由 DMEM 21/Coon，s F12 (1:1)+10% FBS (胎牛血清）+ 5 OU/mi青徽素及5 0// g/ m又鍵徽素。 處理：所有的化合物皆先在2 Ο Ο //M劑量之CP — 6 — 3 6細胞上篩選。試驗前，以細胞培養級的DMSO 爲溶劑，製備各受試化合物之2 OmM儲料。然後，將 2 OmM儲料化合物稀釋於不含血清且缺少胺基酸半胱胺 酸及甲硫胺酸的EMEM培養基（、Cys — IMet — Ε Μ Ε Μ ^ )，稀釋1 Ο Ο倍，致培養基中之化合物最終 濃度爲2 Ο 0//Μ。欲開始實驗，需用3m$ /皿之 C y s — IMe t — EMEM清洗細胞單層三次，令細胞 、渴望#半胱胺酸及甲硫胺酸，然後，用3mi?/皿相同 的培養基培育（3 7°C/5%C〇2 ) 15分鐘，由培養 皿吸走該培養基，然後，加入含有2 Ο Ο //M受試化合物 的培養基（3 mi/皿）。如前所述地將這些培養平盤及 |對照，培養皿（3m芡/皿之Cy s t-lMe t — EMEM，其含有1 %DMSO，但無化合物），培養 本线張尺度適用中！ S家標準（CN’S)甲4規格（210X 297公笼丨 -23.—- " {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 _、可. 經濟部Φ夬β毕局Μ工消'-'又3 :-社印3i A6 . B6 五、發明説明（22 ) 1 5分鐘。吸走該培養基，然後，將額外之如前一步驟的 培養基加至各培養皿，但這次的培養基含有〜1 5 0 p C i / 之35S— Tr a n s標記（經35-S標記的 半胱胺酸及甲硫胺酸）。如前述，將這些細培育4小時 0 收取：在四小時之標記期間結束時，於顯微鏡下觀察 細胞的整體外觀以及檢視化合物之肉眼可見的毒性效應， 然後，將細胞培養皿置於冰上，由各皿將經條件控制的培 養基轉置於1 5mj?有螺旋蓋的圓錐形試管中，以 2 0 0 0 r pm予以離心1 0分鐘並再轉置於一組相似的 試管中，留下任何丸狀細胞，用2mj? /皿經磷酸鹽緩衝 的鹽水（PB S )清洗經標記的細胞單層三次，然後，將 lmi之促進細胞溶胞的緩衝劑（5% Triton X- 1 1 4 ； 2 0 τη M Tris，pH7. 5 : 300mM N a C 1 ;蛋白酶抑制劑）加至各皿，接著於冰上培育 1 0分鐘。由培養皿刮取細胞溶胞產物，並將其轉置於 1. 之微離心管，然後，在冰上將溶胞產物以超音 波振盪4小時，於微離心機中，以高速旋轉1 0分鐘，然 後轉置於1 5mi有螺旋蓋之圓錐形試管中，但留下細胞 廢物丸粒。 免疫沈澱：在準備進行免疫沈澱時，需將前面所收取 之溶胞產物稀釋於5mj?之1 XR I PA緩衝劑（1 0 m M Tris，pH8.0;150mM N a C 1 i 0. 1 25%NaN3 ； 1% Triton X-l 0 0 ； 1% .............................................................................裝......................訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（C N S!甲4規格（210 X 2 9 7公釐丨 -24 - 沒濟部令央標"局Η V 一消^八乂'=吐.印,¾ A6 . ' B6 _ 五、發明説明（23 ) 脫氧膽酸鹽；在未稀釋的條件下，將經條件控制之培養基 試樣免疫沈澱。藉由添加5 A又正常兔子血清至各試樣， 先將經條件控制的培養基及溶胞產物預清除（prec丨eared );於室溫下，予以搖動1 〇分鐘，接著添加1 〇 〇 #艾 1 0%之蛋白質A —瓊脂糖（PAS )〔於R ϊ PA緩衝 劑中〕，並於室溫下搖動1. 5小時。然後，以3000 r pm離心試樣，並將上清液轉置於新的1 5mJ2試管中 。然後，將3 0 $之能夠辨識/?APP之羧基終端的抗 體加入各試管，令預清除的溶胞產物免疫沈澱，於室溫下 ，予以搖動1 0分鐘，接著加入1 0 0 P j 1 0%PAS 並於室溫下搖動1. 5小時。依與前述相同的方式，將預 清除之經條件控制的培養基試樣免疫沈澱，但是使用4 5 P又之能夠辨識ΘΑ4的抗體，而非針對於羧基終端的抗 體。然後，以3 0 0 0 rpm將所有的試樣離仓1分鐘， 期黎P A S _抗體複合物粒化，並徹底清洗所得之粒狀物 :以高鹽緩衝劑（50mM Tris，pH7.5; 5 0 0 m M NaCl:5mM Ε D Τ A ； 0 . 5 % Nonidet Ρ - 4 0 )清洗四次；以低鹽緩衝劑（5 OmM Tris，pH7. 5;150mM N a C 1 ； 5 m M E D T A ； 0 . 5 % Nonidet P - 4 0 )清洗三次，及 以lOmM Tris緩衝劑（pH7. 5)清洗二次。 凝膠電泳：於5 0 ρ j?之2 X Lae mm 1 i裝塡（ loading )凝膠的緩衝液中，將經過清洗的丸粒狀煮沸5 分鐘。將這些試樣以及分子量標記裝塡於含有Tris/ 本纸張尺度適用中1國家標準（CNS!甲4規格（210X297公釐) -25 _ ................................................................-.........裝......................訂 (請先閔讀背面之注意事項再填寫本頁) A6 B6 五、發明説明（24 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Tricine儲存緩衝劑之16. 5%SDS —聚丙烯醯胺凝 膠上。凝膠在9 0V下，跑1 8至2 0小時，將之固定於 甲醇/ 2 0%乙酸中，並令其於6 5 °C下，在濾紙上乾燥 2小時，用自動射線照相術（autoradiography )，觀察 結果。 分析：結果可由分析自動射線照片而得。有正面作用 之化合物係相對於對照試樣，能夠抑制4KDa β A 4 蛋白質帶區者，且相對於對照試樣，其增加9 一 1 2 K D a C 一終端蛋白質帶區的量。藉由以密度計掃描各 帶區（標準化至對照帶區），以定量化々A4之抑制或C 一終端之增加的帶區，負面作用之化合物係其4 KD a 々A4產量或9 一 1 2KDa C —終端蛋白質帶區（相 對於對照試樣）無變化者。 額外試驗：若某一化合物被發現係具活性的（即藉凝 膠分析法，發現其實質制了 4KDa /?A4的形成且伴 隨C一終端片段的增加者），則進行劑量反應實驗，以測 定化合物能夠展現前述效果所需之最低劑量。所用之劑量 通常在12. 5至3 0 0 之間，且除了劑量上的變化 化，實驗皆是如前所述地進行，若化合物被發現爲僅稍具 活性或完全無活性，則以較高的劑量重覆實驗，一般爲 4 0 0 pM。若化合物被發現係有毒者（即，在顯微鏡下 觀察得細胞係不健康者，或是在凝膠分析後，溶胞產物未 標記得很好），則以較低的劑量，例如，2 5，5 0及 1 0 0 ，再次測試化合物，以測定化合物在無毒性劑 本纸張尺度適用中S國家標準（CNS)甲4規格!. 210 X 297公釐) -26 — A6 . ___B6_ 五、發明説明（25 ) 量下的效果。 法#2 :放射免疫分析法 R I A之培養基的製備及Sepak濃度： 培養的哺乳類動物細胞，如中國蒼鼠卵巢（CHO) 細胞或人類神經元S K — N — ML細胞會產製—類澱粉 蛋白並將此肽分泌至培養基。若用/?—類澱粉蛋白形成之 具潛力抑制劑處理該細胞，則在經處理過細胞的培養基中 ，不會發現有溶解的一類澱粉蛋白。如分析法井1 一般 ，以2 Ο Ο V Μ開始進行各種劑量之抑制化合物的試驗， 就CHO細胞而言，不論是野牛型或經一 ΑΡΡ6 9 5 感染者，皆在有或無待評估之化合物存在下，於3 7°C， 在2mj? EMEM (不含血清）中，培育1 0 cm平盤 ，取出培養基並在1 5 0 0 r pm下（Sorvall RT6000B )，離心10分鐘，以去除任何細胞/廢物。培養基可立 即使用或儲存於_2 0°C。 進行Sepak C 1 8步驟，以去除鹽類或任何不想要 的污染物且濃縮類澱粉蛋白肽。令培養基試樣（2 m芡）通過C 1 8 Sepak圓筒（cartridge )並用2m芡 之於0. 1%TFA中的5%CH3CN 清洗寧圓筒。將 貫通物及洗液丟棄。用2mJ?於0 1 %TFA內的2 5 % C H 3C N 洗提該圓筒，接著再用2m$之於0· 1% TFA內的5 0%CH3CN 洗提液洗提。將二次的洗出 液皆收集起來並置於加速眞空器（speedvac)中乾燥，並 ...........................................................................裝.......................耵-........ 冰 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國1家標準；CNS;甲4規格（210X 297公笼） A6 . ‘ B6 五、發明説明（26 ) 予以吸收至1 2 5 P义〜2 5 0 # j? 1 0%異丙醇溶液中 ，以供於RIA中進行分析。2 5%CH3CN部分含有 幾乎所有來自培養基的酚紅，但無一類澱粉蛋白肽。 5 0%CH3CN部分含有一類澱粉蛋白肽。 經125 I 標記之卢一類澱粉蛋白1 一 4 0的製備及純化： 利用 Chloramine T 方法，用 125I ( lmC i )標 記合成的/? 一類澱粉蛋白1 — 4 0 ( 1 〇 " g )。於室溫 下進行該反應。於Eppendorf試管中，將1 0 p i?125I (lmC ί ，於NaOH溶液中）加至1 —類澱 粉蛋白1 — 4 0 (lJBg/mj?，於2 0%異丙醇中）及 8 0 ^ 0 . 1M磷酸鈉，ρΗ7· 4，並予以混合。藉 添加 3 0#j? Chloramine-T (lmg/mj?，於 0. 1M Ρ Η 7 . 4磷酸鈉中起始反應，予以混合並培育1分鐘。 添加150//J?偏亞硫酸氫鈉（2mg/mj?，於0. 1M Ρ Η 7 . 4磷酸鈉中，以終止反應。 用等量的水稀釋反應混合液（28 ，並令其 跑Sepak Cl 8圓筒，以分離經標記的肽，於5% CH3CN 中（各lm5)，清洗Sepak二次，並於5 0 % C H 3C N (各lmi?)中，洗提三次；然後，再於 9 5%CH3CN (各Ιπιβ)中，再清洗二次，幾乎所 有的標記肽皆洗提至第一份5 0 %CH3CN洗出液中。 將此洗出液儲存於—7 0°C，並視需要，予以純化，以供 R I A之需。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝 本紙乐尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210父297公釐） Γ28^ 經濟，印".夬结"1^:<工"^4':;?-.,;'災 A6 . B6 五、發明説明（27 ) 利用逆相HPLC，於C8圓筒（4. 6 m m X 3 cm，Brownlee)，進行標記肽的純化。以0. 5m5/ mi η的流速，於30分鐘期間，用5 0%至4 5% C H a C Ν (於0. 1%TFA中）的線性梯度，來跑該 層柱*收集洗出份（fractions ) (0. 5mj?)並予以 計數。將含有標記肽之峰洗出份儲存於- 2 0°C並於三天 內用於R I A。 放射免疫分析法： 用於RIA的緩衝劑有：1) RIA緩衝劑一0. 1 Μ磷酸鈉，pH7_ 4，其含有0. 1%BSA及0. 1 # Triton-X-1 0 0 ; 2 )試樣緩衝劑一1 〇%異丙醇水 _液：3)追踪物緩衝劑—0. 2M磷酸鈉，ρΗ7· 4 ，其含有 〇· 1%BSA (於 0. 1% Triton-X-10〇 中）。所用之對類澱粉蛋白具專一性的抗體係以稀釋 液的形式，其中，在未有競爭配位體存在下，有大約3 0 %之標記肽會結合。抗體稀釋液係用RIA緩衝劑來製備 。用於R I A的抗體包括由人類類澱粉蛋白1 一 4 0 合成肽所引起的三種不同血清（BA#1，BA#2及 6 5 1 4 )。所用BA#1之最終稀釋倍數爲1/9 0 0 ，BA# 2 爲 1/600 ，而 6514 則爲 1/2500 。令經HP L C純化之經標記的肽稀釋於追踪物緩衝劑， 致在5 0"芡中產生7 0 0 0至9 0 0 0 cpm。整個取 代在高濃度（2. 5^M)/? —類澱粉蛋白1 — 40存在 木坟張尺度遇用中召國家標準（CMS)?4規格（210父297公釐I ~ 29 ~ ί請先閱讀背面之注意事項再場宵本頁) .裝

’、1T A6 B6 沒濟部申夬桴毕局^工消"合：=:社印3ί 五、發明説明（28 ) 下完成，於試樣緩衝劑中製備一類滅：粉蛋白1 — 4 0標 準物。分析體稹爲2 0 0 #义，依下列順序，加入各成份 1 0 0 ^ ^ Ab (於RIA緩衝劑中） 5 0 〃 5 未知試樣或標準物或TD (於試樣 緩衝劑中） 5 0 u il 經標記肽（7000-9000 c pm，於追踪物緩衝劑中） 將試樣混合並於41，予以培育至隔夜。爲分離結合 的計數與自由的計算，用聚乙醇（PEG )終止分析。於 各分析試管中，加入5 0 〃 i?正常兔子血清，接著加入 800# 芡 PEG(MW6000 — 8000 , 15. 8 %，於RIA緩衝劑中）。於4 °C，將試樣培育1〇分鐘 ，然後，以3 2 0 0 r pm離心2 0分鐘（Sorvall, RT600B)。吸取上清液，然後，於伽瑪計數器內， 對丸狀物進行計數。 分析：根據經標記之Θ -類澱粉蛋白追踪物的取代情 形，說明由抗體結合所得的結果。正面結果係未觀察得有 追踪物被取代的情形，亦即，培養基未含有分泌的~類 澱粉蛋白，表示受試化合物可有效抑制一類澱粉蛋白的 產製。負面結果係指可見及追踪物取代抗體結合，且該取 代相當於未經處理的對照細胞。 酶連結的免疫插入分析法（enzyme linked iramunosandwich assay) (E L I S A )亦可用於鐘定活 木枝朵尺度適用中：a _國家標準I cNS)甲4規格（210χ 297公釐丨 _ 3ϋ _ — ....................…：-................................................裝......................訂 <諳先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A6 B6 五、發明説明（29 ) 性化合物。製備能夠產生々一類澱粉蛋白蛋白質之培養的 晡乳類動物細胞（如CHO CP — 6或SK — N— MC )，並如分析法井1所述，用化合物予以處理，但省卻細 胞蛋白質之放射標記的程序。由經處理之細胞培養物，收 取經條件抑制的培養基，並藉低速離心，清除細胞廢物。 然後，在使用對一類澱粉蛋白具專一性之抗體的9 6孔 EL I SA模式，分析經條件控制的培養基，一個/3 —類 澱粉蛋白抗體作爲培養基內所出現之々一類澱粉蛋白的捕 捉試劑，第二個對yS —類澱粉蛋白具單一性的抗體（其係 供辨識一類澱粉蛋白蛋白質上的另一個抗原決定基）， 係作爲偵測複合體的組份。第二個/5 —類澱粉蛋白抗體係 與可被鏈抗生素蛋白（scrept-avidin )所偵得之生物素 併合，第三個抗體（其係偶合至辣根過氧化酶），係用於 偵測/?—類澱粉蛋白：抗體：鏈抗生物素蛋白複合體。添 加苯二胺受質加上H2〇2及檸檬酸鹽磷酸鹽p Η 5，可令 過氧化酶活性顯現，這可利用讀取在0D 49 下混合物 的比色變化，予以定量。一般而言，除了標準物，合成的 類澱粉蛋白1 — 4 0蛋白質之外，在9 6孔平盤內， 有各培養基試樣之連續的三倍稀釋液。正面的結果係指小 或無反應器，亦即在0D 4 9°nm所得之吸收顯示因受試化 合物之抑制作用，培養基試樣內無/?—類澱粉蛋白蛋白質 。部分活性之抑制劑在0 D 49C)nI"會產生一些但非與未經 處理細胞之對照培養基試樣者相等的吸收。精確的定量可 由比較試樣値與標準物而達成。 本纸沒尺度適；51中园國家標準（CNS)甲4規格（210X297公釐) '31 - ..........—................................................................裝......................訂 {請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) A 6 ( ' B6 五、發明説明（30 ) 體內分析 本發明化合物預防或減少々一類澱粉蛋白斑累稹的活 性，可在涉及/3 -類澱粉蛋白斑累稹之導入外來基因的鼠 模式，以及在狗模式（使用對於-類澱粉蛋白斑有天然 ，基因的預素因（predisposition)的狗），獲驗證。在 PCT/US9 1/0 4 4 4 7中，記述了 一種導入外來 基因的鼠，其在神經元細胞內，過度表現（overexpress )人類卢一APP(751)或 /?— APP(770)， 且呈現出與阿齊莫氏型有關的組織病理。於如是之動物模 式中，與/?—類澱粉蛋白澱稹有關之組織病理及/或徵候 簇（如記憶喪失）之減少，可用來驗證化合物治療因召一 類澱粉蛋白斑形成所產生之治療症狀（如阿齊寞氏型及與 唐氏症有關之記憶損害）的能力。 由於導入外來基因之鼠的組織病理會隨著動物年齡的 增長，而變得頻繁，故以二個月大的鼠較佳、二個月大的 動具有最低限度的病理，病理在未有抑制藥物存在下，會 隨時間而增加，實驗所用之動物皆係來自單一的純繁殖血 統，有一組鼠（n = 1 2 )僅收受賦形劑；第二組（n = 1 2)收受低劑量藥劑；第三組（n = 2)收受中等劑量 :而第四組（11 = 1 2 )則收受高劑。劑量係由前述之分 析，再加上體重，化合物之半生期等因素的考虜，決定之 ，理想的是，對鼠進行幾個月的治療。化合物之投服方式 依化合物之性質，可注射、口服、定時釋離植入物等形式 。治療結果的評估係使用免疫一化學病理學，測定办-類 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本饫诔尺度適用t S國家標芈（CNS)甲4規格（210X 297公釐I -32 - ^湾-占夬桴^局^:工消^合---1..- A6 . B6 五、發明説明（31 ) 澱粉蛋白免疫反應性澱積物在腦的冠狀中線部份的頻率進 行之，此乃由對實驗治療不知情的硏究員來評分。病理上 之另一個標記，A 1 z 5 0免疫反應性，亦是以實驗中所 有鼠之相同數目的腦組織部份的發生頻率，評分之。藥劑 作用之正面結果係指兩種病理記號皆不存在或頻率皆降低 的情形。導入卢一類澱粉蛋白此外來基因之鼠所特有之生 理及/或行爲上相關聯事件，亦可用於驗證藥物的作用。 某些犬科物品種已經發表具有/? -類澱粉蛋白累稹（ Giaccone e t al., Neuroscience Letters V o 1 . 1 1 4 ， PP178 — 183 (1990)。年老的非人瀝長動物 展現；3 —類澱粉蛋白病理，以及記憶損傷（Cork et al.， American Journal of Pathalogv. V〇 1 . 137 ，p p 1383—1392 (1990) ;p〇dlisnyetal., American Jounnal of Pathology. V〇 1 . 138 > p p 1423—1425 (1991)。對犬科動物及非人璽 長類動物所進行之實驗將非常可能以有所不同的之實驗設 計來進行（藥物施用時間較長）。 實例4 爲測試本發明化合物用於治療DAT病人之認知性及 非認知性行爲官能障礙，可根據W.G. Rosen, et al., Am. J . Psychiatry 1 4 1 : 1356 - 1364 ( 1 9 8 4 )〔併入本文爲參考〕之方法，將用ADAS ( 阿齊莫氏型評斷標準，A 1 z h e i m e r ; s D i s e a s e A s s e s s ra e n t (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝 .、訂 木扠法又度適用中囚國家標準吒沾）甲4規格（'210父297公釐1 -33 - 經濟部令.央砭卑局Η工^^合：:?-;1印災 A6 . ___ B6 五、發明説明（32)

Scale )，認知性功能係於17個項目上評斷，包括有： 記憶功能，語言功能以及聯想行爲工作及建設性行爲。非 認知性行爲則係於2 3個項目上評分。包括：心情狀態（ 沮喪、焦慮）、生長徵狀、社交技巧、合群、日常生活活 動之主動性、心理徵候狀、運動活力、·精神激昂情形、注 意力及夜間精神紊亂。 窗例5 此實例記述之步驟係供決定可用於與本發明化合物併 用於合併療法或單獨使用的其它藥劑。 材料及方法： 化學品：一般性的實驗性化學係得自Baker C h e m i c a 丨（D e v e n t e r , T h e N e t h e r 1 a n d s )或 M e r c k ( Darmstadt, Germany) 。L —肉驗，L —乙酿基肉驗，N 一乙醯基一L —麩胺酸鹽及胺基酸L 一鳥胺酸，L —精胺 酸以及L—瓜胺酸皆係得自Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo ) 。5— 氟甲基鳥胺酸· 2HC1 ·Η2〇 ( 5卩1^1〇1'11)爲本發明的化合物之一。〔（+ )— 5 — 甲基一1 0，1 1—二氣一 5H —二苯並〔a，d〕環庚 嫌一 5，1 〇 — 亞胺〕係得自 Bioblock Scientific ( lllkirch，France) ，（R) — 4 —氧基一5 —膦酸基正 纈胺酸（Whitten et a 丨.，J. Med. Chem. ( 1 9 9 0 ) ll:2961— 2963)乃 M a r i ο η M e r r e 1 1 D o w .......................................................................-袭.....................，訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 適用t ：S國家標準（CN'S )甲4規格I 210 X 297公坌I ~ 34 _ A6 B6 經濟部-.夬5::1::;'工汸没合-社.:;:" 五、發明説明（33 ) ' I nc .的產品。 寅驗動-物-:令1 0隻成一組的雌CD 1鼠（Charles River, St· Aubin-les-Elbeuf, France )處於標準化的 條件下（水及檩準的鼠食，吃到飽爲止，2 2 Ό，6 〇 % 相對濕度’ 1 2小時照光及1 2小時黑暗的循環）。 $物g夂以乙酸鉉產生的中審；令老鼠經腹膜投 服5 -氣甲基烏胺酸，以進行預處理，通常是在實驗前 1 6小時’經腹膜注射1 3或1 5 „01 . kg -1乙酸銨（分 別爲1· 〇〇8及1.15层於1〇111芡水中；每1〇公 斤體重0·Imj)。胺基酸及其它化合物通常係在乙酸 敍中毒前1小時，經皮下（s. C .)給藥（與此不同的 處理記載於各表之註解部份）。 在以乙酸銨使中毒後，記錄陣攀性發作，直立反射的 喪失，昏迷及緊張性後肢伸張等是否出現。 組織製劑：將鼠斷頭並迅速（<10秒）取出腦，冷 凍於液態氮內，並儲存於一 8 0°C，直到分析時爲止。爲 測定氨，麩胺醯胺及麩胺酸鹽，將腦均化於10倍體積之 冰冷0. 2M過氯酸中。於2 °C待1小時後，將均化物離 心，並在同一天，對上清液進行分析程序，以減少麩胺醯 胺水解或其它可水解釋離形式之氨的水解現象。 胺基酸及氨：爲測定過氯酸之麩胺醯胺及麩胺酸鹽整 份部分（aliquots)，採用已知之逆相HPLC方法之平 等（isocratic )洗提模式，分離腦萃出物（Seiler and Knodgen , 1 9 8 5 )。使用對氨有選擇性的電極（Orion ............... ..................... .......................訂 t請先閱讀背面之注意事項真璜寫本頁} 本纸沒尺度適用中因國家標準（CNS;3^規格|210父297公贷1 -35 - 明説 明發 、五 溶et 準 r 標le 銨el 化 S 氯見 備參 A6 B6 製情 。 詳 定 ί 測線 的曲 氨正 行校 進之 ， 樣 }試 Α 列 US系 ，各 ge立 id建 br以 9 9 2 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁一 -裝 *?τ .¾濟亦^ί:ΐ··Λ."]Η 二;«说合：vvr;;-r 本纸朱尺度適用中S a家樣準（CSS I甲4规格1210X 297公釐I -36 - 五、發明説明（35)

表1 ·胺基酸以及相關化合物單獨及與5 Mmol · kg-1 5 —氟甲基鳥胺酸 (5 FMO r η )保護鼠以對抗 1 3mmol · kg—1 ( i · P ·)乙酸 銨引起之中毒的保護效果 經濟部中央梯準局員工消費合作社印製 藥劑 劑量（ mmol * kg-1) 直立反射喪失 之動物百分比 有陣攣性發作 之動物百分比 活存百分比 Α.單-藥劑治療 賦形劑(3%NaHC〇3) - 100 100 0 L-鳥胺酸 10 -90 20 90 L-精胺酸 10 80 10 90 L-瓜胺酸 5 70 10 100 3 70 10 90 0.75 90 70 40 N-乙醯基-L-麩胺酸鹽 5 ' 100 90 10 L-肉鹼 15 90 90 10 L-乙醯基肉鹼 15 100 70 30 B.與5wmol · kg_ 1 5FMorn合併治療 生理食鹽水 - 60 60 40* L-瓜胺酸 0.75 90 30 80* N-乙醯基-L-麩胺酸鹽 5 90 40 20 L-肉鹼 15 100 50 60* L-乙醯基肉鹼 15 90 40 100* (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 37 - A6 B6 五、發明説明（36 ) 令1 0隻成一組的CD1鼠（雌性，重2 2 土 3g) 收受5aido1-1 5FM〇rn (丨· p.)或生理食鹽水 。1 5小時後，將溶於3%NaHC〇3之前述藥劑經皮 下投至鼠，而再過一小時後，經腹膜注射i 3nm◦丨· kg-i 乙酸銨（於水中）。 (* )表示單一藥劑及合併治療間的統計上有效差（ P客〇· 〇5);(非變數性統計（siege丨，1 9 5 6 ) .................................................... ......................裝......................訂 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) :¾濟部"夬s^工消烀八乂'';-印製 尽抆張尸、戊適用中國g家標準（CN.S)甲4規格（210)^974¾1 ~ 38 ~ A7 B7 , 五、發明説明（37) Lie献 表2 . 1 5咖〇1，竑―1 ( i · P ·)乙酸銨引起的中毒•以0 · 1 mmol · 1¾-1 5 —氟甲基烏胺酸（5 FMO r η)及其它已知可拮抗急性氨中毒之薬 劑的功效 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 治療 在喪失直立反射前有 在喪失直立反射後又 喪失直立反射但未 存活著 陣孿性發作的動物％ 有陣筆性發作者％ 有陣擊性發作者％ 無 100 0 0 0 5FMorn 35(20-50)a 63(50-80)= 2(0-10)~ 2(0-10)- L-瓜胺酸(5mmol. kg_1) 70 30 0 0 5FMorn + L-瓜胺酸 30 70 0 0 L-鳥胺酸(10咖ol.kg-1) 0 100 0 10 5FMorn + L-鳥胺酸 0 80 20 20 L-精胺酸（lOmmol.kg-1) 40 60 0 0 5FMorn + L-精胺酸 30 70 0 0 L-肉驗(5mmol. kg_1) 100 ' 0 0 0 5FMorn + L-肉驗 0 60 40 60* L-乙醯基肉驗（15mmol. kg一” 0 100 0 0 5FMorn + L-乙酸基_驗 0 50 50 60" N-乙醯基-L-麩胺酸鹽(5mmol. kg-1 ) 30 70 0 0 5FM0rn + N-乙醯基-L-麩胺酸鹽 30 70 0 0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 39 A6 B6 五、發明説明（38 ) a)四個獨立實驗的平均値：範圍在括號內 以1 0隻雌CD1鼠（重2 0 土 2g)成—組。在投 用1 5 mmol · kg—1乙酸銨前1 6小時，先用〇 1 fflm〇1 . kg Mi. P. ) 5FMOrn預治療。在乙酸敍之前， 先經皮下注射胺基酸及相關化合物。 (* )表示單一藥劑治療組及與5 FM〇r n合併之 治療組間之統計上有效差（Ρ = 〇· 05):非變數性統 計（Siegel, 1956)。 乙酸銨，5FMOr η及鳥胺酸，精胺酸以及瓜胺酸 皆保溶於水；肉鹸，乙醯基肉鹸及Ν —乙醯基麩胺酸鹽則 係溶於 2%NaHC〇3 (每 lg 體重 0. lmj?)。 ..................................................... ........-...........裝....................訂 <請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁一 部 % 尽竦張尺度通用中國國家標準（CNS1甲4規格1.210x297公發1 40 A6 B6 五、發明説明（39 ) 表 3 ·在投服了乙酸銨後，鼠脚中之氨、麩胺醯胺及麩胺酸鹽。用5 _氟甲基鳥胺酸 (5 FMO r η )及其它巳知可拮抗急性氨中毒之菜劑的預治療效果 治療 氨 麩胺醯胺 麩胺酸鹽 mmmm μ mol per g 麩胺酸鹽 無 0.9土0.1 5.9土0.4 12.6±0.3 0.47士0.03 乙酸銨 2.7±0_5 10.3土0.8 10,5士0.4 0.98±0.09 SFMOrnCO.lMol.kg'1) 1.5土0.2· 8.9士0.7 10.8士0.5 0.82土0.05 鳥胺酸（ΙΟππηο] .kg_1) 1.5士0.4· 8.8±0.Y 11.5±0.5 0.77土0.03· 鳥胺酸+ 5FM0rn 1.3士0.2· 8·7±0.2* 11.3士0.2 0.77±0.03 精胺酸(lOMol.kg—1) 1.5±0.2· 8‘9土0.3* 10.2±130 0.89土0.07 精胺酸+ 5FM0rn 1.8±0·3* 8.4±0.9， 10.2土0.9 0.82土0.04 瓜胺酸(5inffl£)Lkg_1) 1.6±0.5f 7.3士0,4， 11.9土0.5 0.61土0,04 瓜胺酸+ 5FM0rn 1.3士0.2· 7.0士0.4* 11.6土0.4 0.60土0.02· N-乙醯基麩肢酸鹽(5nmol .kg—” 1.8土0.5， 9.2土0.9 11_3士0.5. 0.81士0.08 N-乙醯基麩胺酸鹽+ 5FMQrn 1.2土0.1" 8,2 土 0.3“ 11.9土0.4 0.69 土 0.04·* L-肉餘（15聊〇1 .kg·1) 1‘7±0.5* 8.8±0.4丰 11.4±0.3* 0.77士0.06 L-肉鹼 + 5FM0rn 1.2±0/厂 7.8 土 0.7" 11·9±0_3 0.65土0.04 L-乙醯基肉鹼（15讎ol.kg—1) 2_5±(?·3 8.9土0.6 11.4土0.4· 0.78土0_04 L-乙醯基肉鹼+ 5FM0rn 1.410.3·· 7.8 土 0.4" 11.5土0.8 0_67±0.03·· 張尺度適用中ϋ標準1 CNS)甲4規格1210x 297公愛1 " 41 " ........................................................... .....................裝......................訂 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) A6 B6 .'--"-D-.夬ί:ί"^'κ 工消评合：-吐印製 五、發明説明（40 ) 在投服8mmol*kg_1乙酸鉄（i. ρ·)前16小時 ，經i. P.投用5 -氟甲基鳥胺酸（0. lmraol.kg-1 )，在投服乙酸銨前1小時，經皮下注射胺基酸及相關化 合物，於投服了乙酸銨1 0分鐘後，斷頭殺死動物。 (a )除道些動物外，其它所有的動物組皆收受8 mmol • kg ―1乙酸銨 _經乙酸銨治療之「對照組」與接受藥劑預治療之 組間的統計上有效差（PS0. 05)。 …收受單一藥劑之組及接受與5 FMOr η進行之 藥劑合併之組間的統計上有效差（PS0. 05 )0 爲供藥理上的最終應用，式I化合物宜以其藥學上可 接受的酸加成鹽類的形式投藥。不可諱言，化合物之有效 劑量將依所用之各化合物之各別效力，被治療之疾病的嚴 重程度及本質以及特定患者的情形而定。一般而言，以全 身性投服來看，當投服之化合物劑量爲約0. Olmg至約 2 0mg/kg (體重）/天之式I化合物時，可得有效的結 果。治療應以低劑量開始。之後，劑量之投服可爲口服的 固態劑型，例如，囊劑、錠劑或粉劑，或液態劑型，例如 ，溶液或懸浮液。化合物亦可以無菌溶液或懸浮液的形式 ，非經腸注射，就合併治療而言，與式I化合物同時或先 後投服之治療劑的投服劑量宜爲約0. lmg至約lOOmg /kg (體重）/天。 於實施本發明之方法時，合併治療所用之式I化合物 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度通用中送S家標準（CNS1甲4規格（210x297公釐） -42 - A6 B6 五、發明説明（41 ) 及/或治療劑，宜併入包含藥用載體及/或約5至約9 0 重量％本發明化合物或其藥學上可接受之鹽的組成。所謂 ^苐用載體'係指可用於調配藥學活性化合物供動物經腸 服用且在使用的條件下係實質上無毒且不致產生過敏之已 知的藥用賦形劑。該組成物可藉已知技術，製成錠劑，襄 劑，酏劑，糖漿，乳液，分散液以及濡濕且泡騰的粉劑， 且可含有已知可用於製備所需之特定種類組成物的適當賦 形劑。 較佳的投藥途徑爲口服，就口服而言，活性化合物可 調配爲固態或液態製劑，如囊劑，丸劑，錠劑，糖錠，片 劑，熔化物，粉劑，溶液，懸浮液，或乳液，該固態的單 位劑型可爲普通之硬或軟殼明膠型的囊劑，其含有，例如 ，界面活性劑，潤滑劑，以及惰性塡料，如乳糖，蔗糖， 磷酸鈣，及玉米澱粉。於另一體系，本發明化合物可與習 用錠基（tablet base )，如乳糖，蔗糖及玉米澱粉；連 同粘合劑，如阿拉伯膠，玉米澱粉或明膠；崩解劑（其旨 在錠劑投服後，幫助其崩裂及溶解，如馬鈴薯澱粉，褐藻 酸，玉米澱粉，及瓜爾膠：潤滑劑（其旨在改善錠劑成粒 之流動性及預防錠劑材料粘附在錠劑模及穿孔器的表面） ，例如，滑石，硬脂酸，或硬脂酸鎂，鈣或鋅；顏料，著 色劑，以及調味劑（彼等旨在加强錠劑的美觀性且使錠劑 更能爲患者所接受）；一同製成錠，適用於口服劑型的賦 形劑包括稀釋劑，如水及醇類（例如，乙醇，苄醇及聚乙 二醇）；其可加或不加藥學上可接受的界面活性劑，懸浮 ….…...................................-.......... -....................裝......................訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張又度这用中纽國家標準！ cxs >甲4规格（210X 297公釐I -43 夬 經濟郭ώ夬ίί¾¾H工',·;^1eτ合：一ί^t."^^ ‘，t 4 r~， 卜 0 0〇>00 # Α6 . · _Β6 五、發明説明（42 ) 液，或乳化劑。 本發明之活性化合物亦可非經腸投薬，亦即經皮下， 經靜脈，經肌下，或經腹膜投藥，其係以化合物在生理上 可接受之稀釋劑連同藥用載體中的可注射劑型形式投藥。 該藥用藥用載體可爲無菌液體或液體混合物，如水，鹽水 ，含水的左旋糖及相關糖溶液；醇類，如乙醇，異丙醇， 或十六碳醇；二醇類，如丙二醇或聚乙二醇；甘油縮酮類 ，如2 ，2-二甲基一1 ，2-二氧茂環一4 —甲醇；醚 類，如聚乙二醇4 0 0 :油類：脂肪酸；脂肪酸酯或甘油 酯：或乙醢化之脂肪酸甘油酯；其可加或不加藥學上可接 受的界面活性劑（如肥皀或清潔劑），懸浮液（如果膠， 羧基聚甲烯，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，或羧甲基 纖維基），或乳化劑及其它藥學上可接受的佐劑。可用於 本P明之非經腸製劑的油類例證有石油，動物，植物或合 成來源的油類，例如，花生油，大豆油，芝蔴油，棉籽油 ，玉米油，橄欖油，石蠟油及確油，適合的脂肪酸包括有 油酸，硬脂酸，以及異硬脂酸，適用之脂肪酸酯爲，例如 ，油酸乙酯及肉豆蔻酸異丙酯。適合的肥岂包括脂肪鹼金 屬，銨，及三乙醇胺等鹽類；而適當的清潔劑包括陽離子 清潔劑，例如，磺酸烷酯，芳酯及烯酯，硫酸烷酯，烯酯 ，醚酯及單甘油酯，以及磺基琥珀酸酯類；非離子性清潔 劑，例如脂肪胺氧化物，脂肪酸烷醇醯胺，及聚氧乙烯-聚丙烯共聚物；以及兩性清潔劑，例如，々一胺基丙酸烷 醋，以及π -烷基咪唑啉季級銨鹽；還有彼等之混合物。 度適用中；3國家標準（CNS;甲4規格（210X 297公釐) - 44 - ....................................................................裝......................訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ^濟部"夬^^局^二消々合--':吐."^ d63〇〇V A6 ____B6 五、發明説明M3 ) 本發明之非經腸組成物通常含有約0. 5至約25重量％ 之式I化合物（於溶液中）。防腐劑及緩衝劑亦可使用。 爲降低或消除注射部位之刺激，如是之組成物可含有親水 基團一親脂基團平衡（HLB)爲約1 2至約1 7的非離 子性界面活性劑，如是製劑中的界面活性劑量爲約5至約 1 5重量％，該界面活性劑可爲具有前述HLB之單一成 分或是可爲二或三種具有所需H L B之成份的混合物。可 用於非經腸製劑之界面活性劑的範例有聚乙烯山梨糖醇酐 脂肪酸酯族的界面活性劑，例如，單油酸山梨糖醇酐酯以 及環氧乙烷與疏水性基之高分子量加成物，其保由環氧乙 烷與丙二醇縮合而得。 本發明化合物亦可局部投藥，這僅由製備欲投服化合 物之溶液即可達成，宜使用之溶劑乃已知可促進穿皮吸收 的溶劑，如乙醇或二甲亞碩（DMSO)，可加或不加賦 形劑。較佳之局部投藥係以貼布來進行，該貼布可爲儲存 及多孔膜型，或是固體基質型。 美國專利第3，7 4 2 ，9 5 1、 3，797，494'3，996，934& 4，0 3 1，8 9 4記載了 一些適合的穿皮設計。這些設 計通常含有支持的元件，以界定其表面之一，活性劑可滲 透之膠粘劑層，以界介另一表面；以及至少一個含有活性 劑的儲存部位，界於二個表面之間。另外’活性劑亦可內 含於散佈在整個可添透之膠粘劑層的許多微囊內。不論是 前述二種情形中的任何一種，活性劑皆是連續地由儲存部 ..................................................... ....................裝-................訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁> 本纸張尺度適用中舀舀家標準1: C XS丨甲4規格！ 210 X 2 9 7公堂丨 45 ^>8〇〇〇7 A6 B6 五、發明説明（44 ) . 位或微囊，通過膜，傳送至活性劑可滲透的膠粘劑，後者 與受者之皮虜或粘膜接觸。若活性劑係透過皮虜吸收，則 有經控制且預先訂定之活性劑流被投服至受者，在微襄的 情況下，成膝襄劑（encapsulating agent )亦可作爲 膜。 在另一種供穿皮投藥的設計中，本發明之化合物（即 藥學活性化合物）係含有一基質中，由此基質，以所需之 漸進，恒定且控制的速率，傳送該活性化合物。該化合物 係經由擴散或微孔流動作用，而得能釋離以滲透該基質。 該釋離之速率係經控制的，如是之無需膜的系統係記述於 美國專利第3，9 2 1 ，6 3 6號。在此等系統中，至少 可能有二種釋離情形。藉擴散作用的釋離係發生在基質非 多孔的時候。有藥效的化合物係溶於基質本身且擴散穿過 基質，藉微孔流動作用的釋離係發生在當有藥效之化合物 係透過基質孔內之液相傳輸的情況下。 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央桴沾'":^工消"合泎：；』.-·'-' 本级張尺度適用中萏國家懔準i:CNS!甲4規格（210x297公釐1 -46 -

Claims (1)

1. 383337 A8 B8 C8 六、申請專利範圍 年月日、、 88. 9. 20 8 2 1 0 9 8 Q 8號專利申請案 和文申請專利範圍修正本 民國88年9月修正

   1. 一種製備（2S ，5S) —5-氟甲基鳥胺酸的 方法，其包含 將足量之濕的青黴素乙醯化酶加至（2 R，5 R)及 (2S ，5S) — 6 —氟甲基—3— （苯基乙醯基）一胺 基—2 -六氫吡啶酮的溶液； 由該溶液回收（2S ，5S) — 6 —氟甲基一3 —胺 基- · 2 ,—六氫卩比D定酮；以及 加入足量的酸，以產製（2S，5S) - 5 —氟甲基 鳥胺酸 ---------^------訂------^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 383337 A8 B8 C8 六、申請專利範圍 年月日、、 88. 9. 20 8 2 1 0 9 8 Q 8號專利申請案 和文申請專利範圍修正本 民國88年9月修正

   1. 一種製備（2S ，5S) —5-氟甲基鳥胺酸的 方法，其包含 將足量之濕的青黴素乙醯化酶加至（2 R，5 R)及 (2S ，5S) — 6 —氟甲基—3— （苯基乙醯基）一胺 基—2 -六氫吡啶酮的溶液； 由該溶液回收（2S ，5S) — 6 —氟甲基一3 —胺 基- · 2 ,—六氫卩比D定酮；以及 加入足量的酸，以產製（2S，5S) - 5 —氟甲基 鳥胺酸 ---------^------訂------^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐）