修JL 本私年 補充 219374 A6 B6 五、創作説明（） 本發明係鼷於一種重姐的微生物，可用於生產疫苗的成 份。特定言之，本發明係關於一種流行性慼冒晴血桿菌b 型之菌株，可生產.不，尋常大量的莢膜聚合體聚核糖一核糖 酵一碟酸酷(POLYRIBOSYL-RIBITOL-PHOSPHATE, PRP)。 發明背晷 ,:. 流行性感菌唯血桿菌b型（Hib)為一種類型肺炎的病因， 其對年幼小孩特別具有危險性。若干疫苗目前據稱可保護 不同年舲的小孩於對抗Hib之感染。這種疫苗的一種重要 成份為多_類聚核耱一核糖酵一磷酸酯，或PRP，為Hib之 莢膜聚合體。雖然PRP本身為相當差的免疫原*但已証明 其接合型可提供高的免疫性。作為一届有價值的疫苗成份 *故對PRP有實霣上的霈要，但目前僅能藉由培養分雕與 純化來獲得。由於缺乏合成方法來產生PRP ，因此有必要 擁有一種具PRP高產量的微生物來源。 一種普通的Hib菌株，諸如Eagon(PBCC200)，通常於檷 準培養條件下（腦心浸液，HAD與血晶質）可產生約100-200 微克/毫升之PRP°Hib染色體之莢膜b (capsule b. Cap b)區域乃涉及於埴種莢膜多醣之生物合成，並包括一個 18kb的去氧核耱核酸片段的啣接重複（荷西等人.，PNAS USA 83:1106-1110,1986)。這兩套至少有一部份是必要的 ，因為已証明精密的刪除tb啣接重複的一個複本*可導致 喪失莢膜的表現（荷西等人，同前）。在此區域之自發性刪 除作用發生頻率為0.1-0.3X,並成為已報導的b型莢膜表現 ................................i ..................5t..............................ir:….......................0- {請先閏讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央搮準扃印装 对 Wrw 90*7/，、餐〉 ί3'^374 Α6 Β6 經濟部中央標準局w工消費合作社印製 五'發明説明（2 ) 的基因不穩定性之基礎（匹特曼，M., J. Exp. Med. 53: 47卜492, 1931)。克洛爾等人(Cell §J:347, 1988) 並辨認一個基因（B e x A )為莢膜表現所必需者，並於介於 兩個複本間重叠於這種新穎的連结區域中定位（圖1, 4.4與9.9 kb RI Η段的連合處），因此，可部份解釋重 複之必要性》 失前已由荷西（倨（人連絡）所觀察到，當Hib染色體Cap b區域的一個9 kb E10RIH段（含有一涸Τη5(ΚίΤ)插入） 藉由轉形作用導人Eagan菌種（PBCC 2 00>的染色體時，一 小比率可抵抗5微克/毫升康嫌素，之轉形畑胞當其生長 於固體培養基上時，可顯示一種黏液吠之表現型。有趣的 証據顯示這些分離物可比菌種產生更多的PRP ，雖然對這 些分離物未曾描述遇其特徴，也未對此一觀察得到具體的 定量。並沒有其他關於增加流行性感冒嗜血桿菌PRP的產 生之報告。 本發明現在可提供一種新穎而穩定的流行性感冒晴血桿 菌重姐菌種，可較其他已知的流行性感冒嗜血桿菌菌種產 生實質上更高量的PRP ，而這些PRP並具與其他菌種·所產 生者相同的免疫原性。這棰新穎的菌棰有助於產生PRP ， 其逋合作為疫苗調和物的一棰成份。 發明摘要 . 本發明係關於一種新穎的流行性感冒嗜血桿菌菌種，其 能生產至少2倍於所衍生之母菌種的PRP量，在相當的培 養與细胞密度條件下。對此一新穎菌種較佳的具體實施例 -4- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 裝， 訂· 線， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公； 319374 A6 B6 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（5) 為衍生自E a g a η種P B C C 2 0 0。 最好此一新穎菌種有能力產 生至少400微克/毫升之PRP ，其中Eagan種PBCC2 0 0僅能 產生約100-200微克/毫升。在一項較佳的具體實拖洌中， 這種新穎菌種所產生之PRP具有實質上與母株相同的生物 學特澂，特別在考慮P R P之免疫原上。此外，並提供一種 方法Μ生產一種有能力生產顯著增量的P R P之微生物，這 種方法包括之步驟為培養含有可選擇標記基因之流行性感 冒嗜血桿菌佃菌，（諸如抗生素抵抗能力），並插人Cap b 基因座之基因中*在有利選擇標記的條件下，並選取於選 擇劑存在下可存活的這些细菌；再Μ增量之選擇劑重複這 些步猱，如此這些存活的细菌即有能力產生至少2倍於起 始細菌的P R Ρ 。 匯例簡诚 圖1構築可過量產生PRP之Hib菌種。R〗與RV分別表示限 制晦EcoR〗與EcoRV 。所有的DNA Η段大小Μ千鹼基對表 示。標出Τη5分別插入ρΡΧ2. 3, 4, 5與7之位置。 圖2比較PBCC200 *181與197之生長（培養於攝氏37度 下）生長以克列特比色計（線色濾鏡）監測。 圖3 EcoR I水解物（1-3列）或EcoRV水解物（4-6列）之南方 吸三覓圖， A.其染色體DNA係分離自PBCC200 t第1及第4條） PBCC181(第2及第5條）或PBCC197(第3及第6條），並Μ 由pPXl得到之經32Ρ第一檷記之9kb EcoRl片段作為探計 尋找。Η段大小Μ λ - H i n d I I I Η段作為標準，並Μ千鹼 -5- ------------------------^------,玎-----^ 線 (請先閲^背面之注意事項再塡寫本頁} 本紙張尺度適用t國國家標準（CNS>甲4規格（210 X 297公釐） 經濟部尹兴標準局员工消费合作社印製 219374 A6 ____B6_五、.發明説明（4 ) 基對報告。 B.瓊脂糖凝膠，含有經EcoRI水解之染色體DNA,係來自 PBCC200, PBCC181 與 PBCC197(2-4條）。第 1 條含有入 -Hind Β大小檷準。於右脚之箭頭與數目字表示被擴大之 CapbDNAH 段0 圖4比較PRP之13C核磁共振光譜PRP係由PBCC200 (A)與PBCC197(B)所產生=核糖，r =核糖酵。 發明誅沭 本發明菌種之構築乃藉由插入一段可煸碼可選擇特質之 基因至H i b染色膀Capb區域之9 kb EcoR I片段上，並引導 此Η段進入一偁正常產生PRP -之Hib菌種内。用於下述實 例之母菌棰為Easan(PBCC200 )菌種’但任何其他的Hib菌 種亦可用於此一目的上（馬瑟等人，Rev. Infect. Pis. 12 ： 75 , 1990卜 根據例所提供之菌種可如下述製備：自含有Hip染色體 DNA之基因庫中，基於其可轉形b -突變株成為b +之能力而 選出一涠重姐噬菌體。賴由轉形作用產生之PRP則藉由與 抗-PRP抗血清反應而確認。所選擇噬菌體之DNA限制.酶分 析可顯示存在有4.4 kb與9 kb之EcoRI Η段。將9 kb之片 段純化出並選殖入一個適當的質體内。依此構築之質體再 轉形進入一個適當的宿主细胞内，諸如大腺桿菌°此一宿 主细胞則與第二個含有可置換單的可相容株交 ffi，其含有抗康黴素之基因’或其他含有可選擇檷記之可 置換單元，而此一置換單元係可與所選擇的宿主相容的。 -6- ------------------------裝------、玎----^ 痒 (請先閱讀背面之注念事項再塡寫本頁) 本紙張尺度適用_國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 2耵公釐） 219374 A6 B6 經濟部中央標準局S工消費合作杜印製 五、發明説明（5 ) 此一混合物再塗覆於培養基上，K選擇插人至質體中之可 置換單元。這種插入可產生在9 k b Η段上具有數涸插入點 之質體。EcoRI内可置換單元之插入可賴限制酶分析而確 認。由Τη 5插入所造之不同質體的實例則摘要於表2。 取已分離的，經限制酶水解之質體混合物用於傳形於流 行性感冒嗜血桿菌菌種，其係可正常生產PRP 。經轉形的 细胞培養於含10微克/奄升康徽素之培養基；雖然在選擇 後保有數涸小集落，但僅有大的粘液狀集菌被純化Μ進一 步培養。分離一個單一集種，PBCC181 ，Μ產生2-5倍於 其母菌種之PRP。 P B C C 1 8 1乃用於創造可產生大量P R Ρ之衍生物。將此 1 8 1菌種塗覆於含有1 00微克/毫升康臌素的培養基上。經 4 8小時培養後，可親察到一個極帖液狀之集落。將此集落 純化，並保留一個單獨之分離物Μ做進一步之研究；此分 離物命名為PBCC197 。 進一步的比較197菌種及181菌種與200 (原）菌種顯示 每一個的生長特激均相同。無疑地，這兩涸衍生菌種可產 生較對照菌種顯著高濃度的PRP 。對每一菌種均測量·其混 濁度與細胞數|而決定出所增加之量不是因為衍生之菌種 细胞數量的增加。197菌種特別具有生產性，可生產約 3 . 5倍於母菌種的PRP量，或約500微克/毫升。 將197菌棰純化，可顯示與PBCC200實質相同。197多 醣符合母菌種製成疫苗的相同化學特異性。特言之。摻雜 的核酸，蛋白質與内毒素液度，與其大小（Μ千道爾舌計 -7 - -----------------------^------,玎----‘ ^ (請先閱讀背面之注念事項再場寫衣頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 219374 A6 B6 經濟部中央螵準局貝工消费合作社印製 五、發·明説明（6〉 )，均與200菌棰類似。將這兩種產物之核磁共振光譜為 重β，則指出其结構的相同性（圖4 ) °藉R 〇 c k e t免疫電泳 法與E L I S A法進行免疫化學比較’則顧示這兩個多明為免 疫化學上不可區別者。當CRM197與來自197與200之PRP接 合用於免疫接種老鼠，這兩個接合物之免疫原性則實際上 一致。因此，其顫示在197 M棰及200 M棰之PRP之間均 無明顯差異。 以上之敍述與下述之實例特別翡於PBCC 197之生產。無 論如何，要瞭解本發明之實行並不限於此菌種’而類似的 菌種亦可藉使用普遍而可用的起始物質來製備。舉例說明 ，依照於此所揭示的步琢’任何Hib菌種均可作為母菌種 •而任何含有可選擇標記的可置換單元均可用於將這個標 記插入Cap b片段。所產生的菌種應具有與母株實質上相 同的生物學與化學特激之PRP ’但懕產生較母菌種至少2 倍Μ上的PRP量，此係當於相同的條件下培養時。用於偵 澍如此所產生之PRP的生物學上與/或化學上等質的方法 *將於以下實例敘述。較佳地，這種微生物維持在逋當選 擇劑存在之下。 本發明進一步於下述非一限制簧例中明示。 實例說明 I .材料雎方法 ， 下述描述的基本技術可參考於後述的實例中。 A . 着某與生县條件 流行性感冒嗜血桿菌菌種可在攝氐37度下，含有微克 ~ 8 - <請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 丨裝- 訂· 線. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS>甲4規格（210 X 297公缝） 374 A6 B6 經濟部中央櫟準局S工消費合作杜印製 五、發·明説明（7 ) /毫升血晶質及2微克/奄升乃-菸草醣胺腺嘌呤二核脊 酸（NAD) (BHI-XV)之腦心浸液（BHI)内生長。大腸桿菌貝丨J 可於攝氏37度下，之LB培養基内生長（馬奈提斯等人’ Molecular C 1 ο n i n g : A Laboratory M a n v a 1 » (SHL， 1982)，而當生長菌株已含有霣體時，則添加100微克/ 毫升之安比西林（Ap)與/或30微克/奄升之康徽素（K«)° B. Q1A.之製備 一棰快速而小規横之分雕噬菌體入DHA之步驟，藉先前 之平板溶胞產物方法而進行（馬奈提斯，JS-E.) ° 質體NDA由1毫升之大腸桿菌培養物而製備’使用_(性 一溶解法如 Ish-Horowitz與 Burke (Nucl. Acids Res. 旦：298 9, 1 98 9)所描述者。一種大規摸分離步驟本質上依 所述執行（Ish-Horowitz與Burke,同前)，但有下述之改 變。在以異丙酵沉澱DHA後，將這些小團W 1XTE UOraM Tris，pH8, lmM EDTA)再懸浮，並M10微克/毫升 RNaseA於攝氏37度下水解20分。這些混合物以酚萃取兩次 再Μ氛仿一異戊基酵（24:1)萃取一次。樣品Μ酺酸納製成 0. 3Μ，而DHA藉加人2.5倍體橫之95¾乙酵沉澱*並置-於攝 氏-70度下15分鐮。在攝氏20度下M12,000rp·離心30分 鐘後（SS7 4轉子），將這些小圈於ΙχΤΕ内再懸浮。這些DHA Μ氣化筢梯度離心而進一步純化（馬奈提斯，同前)。 大分子量之染色體DNA自流行性感冒嚕血桿菌菌種分離 ，乃藉由奠松等人(J. Infect. Dis. 143:51 7-523 , 1981)所描述之步驟進行。 -9- ------------------------^------TT----i^ (請先閲讀背面之;i意事項再填寫本頁) · 本紙張尺度通用中國國家櫟準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） 219374 A6 B6 五、發明説明（8 ) C .勝ff细胞之脚備 嗜菌體入之高效價溶胞產物之製備乃使用大腸桿菌由馬 奈提斯等人(同前）所描述者製蔺。
經濟部中央標準局負工消费合作社印製 將大腸桿菌K氮化鈣造成勝任狀態以使質體DNA進行轉 形作用（曼得爾與茜沙，J. Mol. Biol. §1:154，1970)。 製備勝任之流行性感冒嗜血桿菌係於腦心浸液肉湯（Η I , 狄夫可（Difco))並添加NAD與血晶原培養至早對數期 (A 〇 〇 〇 = 0 . ：1 - 0 . 1 5 )。 清洗這些细胞，再以1 / 2量懸浮於荷 里特（H e r r ί 〇 11 ’ s ) Μ I V培養基（荷里特等人-J . Mol. Biol. 11=1 54 * 1 970 ) · 並於攝氏37度下培養100分鐘。 轉形作用之執行係加入1/4微克之轉形DNA或50微克之高 效價入溶胞產物於1毫升之勝任細胞中，繼之培養於攝氏 37度下30分鐘而不震盪。培養此培養物，並於攝氏3 7度下 再溫和的震盪額外的一小時後，取0 . 1奄升之樣品塗覆於 適當的培養基上。 E .限制豳分析班撰瑭抟銜 Μ限制酶水解分析DNA ，所使用的條件為由供應者.所建 議者。經限制之D Ν Α則於0 . 7或1 . 0 5Κ之瓊脂耱凝膠進行電 泳，並使用含0 . 5微克/毫升溴化乙錠之T 2 B -锄酸鹽E D T/\緩 衡系統，如馬奈提斯等人(同前）所描述者。DNA可藉紫夕卜 光穿透一照明看見。為自低熔點溫度之瓊脂耱凝膠纯化經 限制之片段，乃藉由加熱經切割的瓊脂至攝氏70度直至其 完全溶化，加入2倍體積之TE後，再Μ酚萃取。於水相之 ------------------------^------.玎----> 線 (請先閱i4背面之：;i意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公；¢) 219374 A6 B6 經濟部中央櫺準局WC工消费合作社印製 五、發·明説明（9 ) DNA則Μ乙酵沉澱。以70S；之乙酵冲洗一次這些小球，於 ΤΕ内再懸浮。DNA之連接則如已描述者（馬奈提斯， 同前）執行。 F .南方謂終雎鎗交作用 將DNA片段轉移至硝基'級维素，如史密斯與桑瑪 (Anal. Biochem. 109 = 1 23-1 29. 1 980)所描述進行。將濂 紙進行前雜交，雜交並冲洗如已描述者（馬奈提斯等人* 同前）。經32P -檷記之探針之製備乃使用一種缺口位移 試劑（BRL)與[ct -32P]dATP (亞馬漢）。 G . P R P 之純 fh 以微量纯化步驟來評估P R P存在於培養上清液之量。將 —牽升之培養液_移至1 . 5奄升之微量離心管，且離心 10分鐘10,〇〇〇xg除去细胞。將400微升之培養上清液轉移 至清潔的微量離心管，並加入200微升之0.5M溴化十六院 基三甲銨（HB)。將樣本於室溫中搖動一小時並如上述離心 10分鐘。將小球M0.2奄升之0.04M氣化納水溶液再懸浮 ，再加入0.6奄升之95X乙酵，並將樣本於室溫中搖動1 小時。P R P則以離心1 0分鐘回收，並再懸浮於〇 . 4橐·升之 dH20 中0 P R P之濃度則Μ 5 -甲基間笨二酚區耱分析法偵測（西奈 爾，G. Heth . E u z y π ο 1 , 3J ： 73 , 1957)。 I ,结_星_ A.分離含有Capb DNA之重姐噬菌體 自含有流行性感冒嘈血桿菌菌種KW20b染色煽DNA之基 -Π - ---------------;--------裝------訂----1.^. (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) · 本紙張尺度通用中國國家揲準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 319374 A6 經濟部中央襻準局3工消費合作社印製 __B6_ 五、發明説明（10) 因庫中分離一個重姐噬菌體（λ 4 - 8 0 )，（莫松與瓦格，J . Infect. 143 :517-523, 1981)如下述：這種基因庫之樓 築在以前曾描述過（箅松H * J . Clin. Invest. 11:298- 306, 1984)。將此基因庫（5χ10β pfu/毫升）稀釋 成10個，每10微升含有將近103個噬菌體之匯集。每一匯 集Μ K802菌種擴大並試驗其將sec-Ι菌種轉形成b +的能力 。轉形细胞之驗証乃藉其虹彩表型。此十匯集中有二份有 能力紈行這種轉形作用。將一者稀釋並塗覆Μ產生單獨的 溶菌斑。擴大含10個噬菌斑之繼代匯集物並測試V轉形 DNA ，如前所述。最後，基於Μ嗜菌體DNA轉形 H i ( S e c - 1 )菌種b —突變種為b *之能力偵測單獨的溶菌斑可 產生b型莢膜之集落則目視含有500-1 00 0cfU之BHI-XV 盤中所存之可表現b型微生物虹彩表型特激者而決定。這 種分離物所產生含有Cap b DNA的噬菌體鑑知為λ 4-80( 圖1卜 進一步証明轉形细胞所產生之PRP可藉使用抗-PRP抗血 清進行1? 〇 c k e t免疫電泳法來得到。S e c - 1菌種於C a p b基 因座之4.4 kb EcoRI片段内含有一個突變（艾里^， J . Bacter i ο 1 . 1_67 :44-48, 1986)(見 _1>。因此，可預 期λ4-80含有至少4.4kb片段的一部份，為經由轉形作用 矯正這種突變所必要的。由λ 4 - 8 0 D N A的限制酶分析可証 實存在有完整的4.4kb片段，並可顯示鄰接野生型Capb區 域4.4 1(1)片段之91^也存在將91^片段純化並選殖人{> BR322之EcoRI位置，Μ形成ρΡΧΙ(圖1 )。含有可置換單元 -12- ---------------1--------裝------灯-----ί 線 (請先"讀背面之注意事項再螟寫本頁) · 本紙張尺度適用中國國家標华（CNS)甲4规格（210 X 297公釐）
五 '發明説明（11 ) 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 ΤΝ5(ΚπΤ丨之ρΡΧΙ的5個衍生物，其在9kb Η段有不同位置 ，如 下 述 構 築並 列於 表 2 ( pPX2 , 3 , 5 與 7 ) ··將 TN5 插 入 pPX 之 構 築 ，乃 藉由 將 HB 1 01 (P PX 1 )與 HU735 之 隔夜 培 養 物稀 釋 於 10 毫升 LB培 養 基中( )培 養 每一 個培 養物 (HU 735 於攝 氏 32度 下） 直至 细 胞密度達 到 中一- 對數 相 (A 5 〇 Ο : 0 . 4 ) 。取 每一 個 培養物1 奄 升樣 本混 合’ 並於 攝 氏 32度 下 不 搖 動培 養1 小 時，再Μ 溫 和的 旋轉 搖動 2小 時 〇 交配 混 合 物 Ml: 20稀 釋 入含有100微克/ 毫升 安比 西林 與 300微克/ 毫 升康 徽素 之 LB培養基 y 随後 於攝 氏42度下 隔 夜 培養 0 這 些 條件 乃為 選 擇將ΤΝ5 插 至多 套數 質體 與喪 失 含 有會 於 攝 氏 42度 下抑 制 複製的突 變 之F ' ts單 元0 質體 DN A 乃製 備 白 隔 夜培 養物 並 用於轉形 HB101 使成 為具 有與 km 抗 性。 表1 爾 棰列弄 菌種 表型 /註釋 來源/參 考 大腸 桿 菌 HB101 h s d S20 ( Γ " ,Μ ~ ), 拜爾與羅蘭. -達 孛西 r e c A1 3 J . Mol. B i ο 1 . a r a - 14 , 2J： ο A 2 , 1 a c Y1 i A1: 459 , 1969 -s_a_Ll , L· p S 1 20 丨 s tr1" ) (R . Hoi 1 ) X y 丨-5, m t 1 - 1 Sup E 4 4 H u 7 3 5 t h i - 1 . t h r - 1 , 1 e u B 6 . ] a η Y 1 -13- (請先閱請背面之注意事項再塡寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 219374 A6 B6 五、發明説明（12 K802
t ο n A 2 > s u p E 4 4 , t r p.E 5 , 厂 e c A 56, F'(ts, lac", trp 2 2 f f 2 8 ： T H 5 ) h s d R * , h s d M "，gal-, met"· su_e E 流行性嗜血桿菌 PBCC200 type b, CSF分離物（Eagam) 無莢膠之b型突變物 伍德，J . Μ ο 1 . Biol. j_6 ： 1 1 8 , 1 9 6 6 安德生等人， J . Clin, Invest , 5J ： 2 9 8 - 3 0 6 , 1984 奠松, J . Clin, Invest, 11:298-306, -----------------------裝------.玎------^ (請先閲讀背面之注意事項再塡S本頁) . PBCC181 PBCC197 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 質賭 1984 黏液吠，對10微克/ ¾升之 本研究 km有柢抗力 黏液狀，對100微克/¾升之 本研究 k in有抵抗力 ， 表2 質體列表 表型/註釋 來源/參考 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS>甲4规格（210 X 297公釐） Λ6 五、發明説明（15 ) PBR322 b la* , te t" 包 «SlA * Ge 2 :95 s 1 977 〇 ρΡΧΙ 含 9ltb R1 Ca p b H 段來自入4 -80 本 研 究 pPX2 b 1 a' apt * , pPXl ：TH5-1 本 研 究 pPX3 b la* , apt' pPXI ：TN5-2 本 研 究 pPX4 b 1 a* . apt' pPXl ：TN5-3 本 研 究 pPX5 b 1 a' apt* t pPXl ：TH5-4 本 研 究 pPX7 b la* , apt * , pPXl ：TH5-8 本 研 究 pPX12 bla*. apt' tet~ ,PBR322: TH5 本 研 究 pPX13 b 1 a * , apt' 9 kb EcoRI片段來 白 PBCC197 本 研 究 B .分離有遇量產製P R P之菌棰P B C C 181與P B C C19 7 菌種PBCC181之構築乃藉由K含被Puvl水解之PPX2, 3, 4,5與7 DHA(表2)之涓合物來轉形勝任之Hib菌種 PBCC200 。將已轉形之细胞塗覆於含10微克/毫升康徽素 之BHI-XV之培養基上並於攝氏37度下培養。在2天後，許 多小集落（<1奄米）將會出現。無論如何，將存在有兩涸大 的黏液狀集落。將埴些純化於BHI-XV k«u〇培養基p在隔 夜培餐後，這些分離物的其中一髑將非常具有黏性。排出 一偁單獮的集落分離物命名為PBCC181 Μ進行進一步的特 激描述。這些菌種需要血晶質與NAtK供生長，並可輿b 型專一性抗血清反應（但不與a, c, d, e或f型反懕 > 。菌 種？088181可產生2.5倍於菌種|^(：0200之卩1^,表示這 種黏吠表型可為PRP生產過量之顯示。 藉PBCC181加強PRP合成的機轉尚未清楚。提出兩個可 -*15- "γ":¥ι.,;:,:而>/注念枣項再填寫本頁) ------一 -------裝------訂----- 經濟部中央橒準局S工消费合作社印·控 本纸張又度適用中國圃家樣準（CNS>甲4規格（210 X 297公釐） 81.9.20,000 經濟部中央襻準局員工消费合作社印製 ^19374 A6 ______B6_ 五、發明説明（U ) 接受的不同解釋：是Tn5之插入阻斷了對莢膜生產有負面 效果的基因或者是圍繞於Τη5插人周圍之部份Cap b基因 ’由康鼴素之選擇觸發進行遺傳擴大事件。若後者為真· 則應可能分離PBCC181之衍生物*其含有額外的Tn5套數 ’並郫接Cap b序列，係將其塗佈於含有>10微克/毫升康 it素的培養基上。為試驗此點* PCBB181的隔夜培養物塗 佈於含100微克/ ¾升BHI-XV之培養基上。在48小時的培養 後’可覼察到一靨單獨*而非常具有黏性的集落。將此集 落純fb，並將一個單獮的集落分黻物保存Μ供進一步的研 究（PBCC197)。這髑分離物亦需要X與V因子（血晶質與 NAD1並僅與b型一專一性抗血清反應。 C .生_畏班P I? P少Φ齑 比較菌種PBCC200, 181與197之生長與PRP生產。培養 物培養於攝氏37度下。以克列特比色計（綠色濾鏡）監視（ 圖2 )且PRP之生產於培養23小時後分析。由這些菌種所生 產之PRP示於表3。這種遇量製備菌種的生長特徼與 PBCC200非常類似，但它們產生較對照株多2. 5 (PBCC181 )與3.5(PBCC197)倍之PRP Μ貞澜混灞度與存活的妞胞數 顯示額外的PRP並不是因為细胞數量的增多，而是因為增 強的合成能力。基於這些结果，挑選PBCC197 ，Κ進一步 的評估。 . 表3 PBCC181 , 197與 200之 PRP 產量 M-fi. 置驗 P 8 P (微克 平询PRP 增加倍數 ----------------^-------^------,玎------^ (請先閱讀背面之注5事項再塡".冬頁) = 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公缝） 219374 A6 B6 五、發明説明（15 ) 姐別 /奄升）s PBCC200 1 126 2 183 3 172 4 160 ' 160 PBCC181 1 315 2 412 3 408 4 434 392 PBCC197 1 571 2 549 3 588 4 56 0 567 附註： 經濟部中央樓準局貝工消費合作社印製 *每一個PRP值乃基於對分離自雙重培養物之PRP樣本進 行三次五碳糖分析的平均值。 較PBCC200增加之倍數。 D. PBCC181與PBCC197之Cap b基因座的逍傳結構. 檢査這些菌種過量生產PRP的遺傳基礎。如果其機轉乃 肇因於基因擴大作用，則南方雜交實驗中當使用同質探針 來分析這些菌種的染色體DNA ，懕顯《示9kb EcoRI Cap b H段的套數之增加。取來自PBCC200, 181與197相同量的 染色體DNA MEcoRI或EcoRV水解，並於0.7¾瓊脂糖上電泳 再轉移至硝基纖維素上。吸·漬物則Μ來自ρΡ5Π之缕32P - -17- ----------------T -------裝------訂-----T 線 (請先閱汸背面之注-事項再塡寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 219374 A6 B6 五、發明説明（16 ) 標記之9kb EcoRlH段探尋。结果顯示於圖3。如預期的 ，探針與9, 10.2與20kb之EcoRI Η段及二個來自 PBCC200之18kb EcoRV雜交（荷西等人，同前）。探針也可 與來自PBCC181與PBCC197的這些大小片段雜交。無論如何 ，與來自PRP生產過量菌棰的9kb片段雜交程度更高。雜 交最高程度見於來自PBCC197之DHA。這些資料顯示Cap b 區域的擴大作用發生於過量產製株，而這棰掮大作用的程 度與對康臌素的抵抗力及PRP生產之水平有相關。這棰擴 大作用亦可見於經溴化乙錠染色之瓊脂糖凝膠内（圖3B)。 事實上，這些資料顯示除了 9kb片段外，PBCC 197之Cap b重複區域的2.1, 2.7與4.4 EcoRI片段亦被擴大（圖 3B，見箭頭所示）。因此，PBCC197中Cap b基因座中完 整的18kb重覆子均被擴大。其顯示Cap b區域的擴大構成 PRP過量生產的基因基礎。 G .由PBCC1Q7分雜之PRP的恃激 經濟部中央標準局"K工消費合作社印製 由PBCC197純化而來的PRP與由PBCC300而來者進行化 學與免疫學比較，以決定其相似性的程度。 1 .化擧分析 . 兩個P R P樣本分別K小與大規模方法（同前）純化。樣本 乃接受品質控制實驗室之分析。並使用評估他棰PRP疫苗 的一整套試驗。结果顯示於表4内。"由PBCC所分離之兩批 PRP均符合作為疫苗所需之化學條件。摻雜的核酸*蛋白 質與内毒素等澹度均與由菌種PBCC200得到的PRP樣本類 似。此外，由菌棰PBCC200而來的PRP大小（W千道爾頓 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公發） ---------------„ --------裝------ΤΓ----,,J-^ (請先閲讀背面之;±意事項再場寫本頁) 219374 A6 B6 經濟部中央標準局S工消费合作社印製 五、發明説明（17 ) 計）與由菌種PBCC197純化而來之PRP類M。 表4 取自PBCC197之品質控制試驗 P R P批次 試驗 條件 大規模 小規横 五碳糖 Μ毫克/毫升 5.96毫克/毫升 3.84毫克/毫升 磷酸酯>1毫克/毫升 5.97毫克/牽升3.56奄克/毫升 核酸 <0.8% 0.28¾ 0.54¾ 蛋白質 <0.8% 0.29% 0.29¾ kd <0.6 0.473 0.466 内毒素 <0.2Eu/Ug 0.01Eu/Ug 0 . 02Eu/Ug 2 . 1 3 (:核磁共振hh較 分離自PBCC197與PBCC200之PRP的核磁共振光譜乃使用 瓦里安XL-100-15分光光度計進行偵測。其光譜（圖4>重 合，因此可提供這兩個多_類為結构上相同的証據。 3 .免.疮彳h璺卜之hh較 免疫電泳法： 由PBCC197與PBCC200所分離之PRP ，其免疫化學性質依 方法一節内所描寫的免疫電泳法進行比較。這兩種多醣類 的kd值分別為0.466輿0.5 。並使用於越子中生成的抗一 P R P多株抗血清。 ’ PRP樣本之比較乃使用搮準的Rocket免疫電泳法。凝成 一個1UW/V)的瓊脂糖凝膠，並含1SUV/V)之抗血清。含 3.75. 1 7.5, 35與70毫微克PRP之樣品於70伏特/公分下 -1 9 - (請"間边背面之注念事項再鳩寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 經濟部中央揉準局3工消费合作社印製 219374 a6 _______B6_ 五 '發明説明（18 ) 進行雷泳30分鑌，並使用l〇mM之TMs巴比妥酸鹽媛衝液 (PH8.6) *随後再Μ銀染色。若由PBCC197與200所產生的 PRP在多株抗體辨認下相同，則相當PRP量的Rocket型態 與高度也應是相同的。實驗的结果顯示PBCC197 PRP Uocket型態上是相同的*但在高度上覼察到較PBCC200之 PRP稍高：39.6公分比34 . 5公分。既然Rocket的高度直接 的與Μ此方法所形成抗原一抗睹複合物的量成比例，則來 自PBCC197的PRP至少可被多種抗體（多株抗體）辨認為抗原 ，如來自PBCC200的PRP。 4 . RL TSA研究： 來自PBCC197與PBCC200的PRP亦藉由使用ELISA法比較 其競爭鐽结不同的抗-PRP抗體之能力。聚苯乙烯96孔 ELISA盤（HDNC广塗覆Ml微克/毫升之酪胺化PRP(PBCC200 >其係於預定量抗體濃度與不同澹度之PRP樣本中，並且 盤於潮濕的攝氐37度培養箱中培養18小時。抗-PRP抗體最 初於這些盤上测定力價，以決定可得透光度為0.5至0.6的 最適宜抗體瀵度。结合之抗體Μ偶合至_性磷酸酶的山羊 抗一老鼠抗體予以偵測。 於表5的資料展示PBCC197之PRP和PBCC200之PRP和天然 的PRP(PBCC200)均可競爭與老鼠單株及多株抗一 PRP抗體 與人類多株抗- PRP抗體之结合，且抗’原漉度很大。這些資 料可用於偵測這兩種抗原抑制天然抗原與抗體結合50¾之 霖要量（表6 >。這些结果可進一步的支持所申請之專利範 圍，即來自PBCC197之PRP與由菌種PBCC200所產生者為免 -20- 本紙張又度通用中國國家標準（CMS)甲4规格（210 X 297公* ) ---------------...I-------装------ίτ------ ^ (請先閱讀背面之;£意事項冉填寫本頁) 219374 A6 B6 五、發明説明（19 ) 疫化學上不可區分的。 表5 Μ抗- PRP競爭性ELISA法比較來自 PBCC200與 PBCC197之 PRP 抑制百分率 HAB E - 11 7 - 5 b 老鼠多選殖b人類多選殖（BOB) b 抗厚 濃度· 200 197 200 197 200 .19? 10 99 99 99 99 94 96 5 98 98 99 99 94 96 2 . 5 97 97 99 99 88 93 1.25 93 93 97 96 84 82 0.625 88 88 94 91 81 78 0.313 78 77 85 84 67 66 0.156 64 62 76 62 65 65 0 .078 48 47 65 60 58 59 0.039 3 1 28 55 53 46 52 0.020 24 23 46 58 44 39 ------------------------裝------.玎----- (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 經濟部中央標準局R工消費合作社印製 附記： •'抗膊為顆PBCC197或PBCC200之PRP 。抗體量Μ微克/ 毫升表示。 - b每一孔装盛約1.9仟克/奄升之老鼠mabE117-5 ， 150仟克/ ¾升之老鼠多株抗體，或4.4仟克/毫升之人類 抗-PRP(BOB)抗體，依法爾分析估計。 -21 - 本紙張尺度適用宁國國家標準（C.NS)甲4规格（210 X 297公釐） 219374 a6 _______B6 五、發明説明（20 ) 經濟部中央標準居R工消费合作杜印® 表6 比較來自PBCC200與PBCC197之多釀 其吸附至老鼠或人類抗- PRP抗體 50¾抑制所需之抗原濃度（纖克/毫升） IM. 老鼠nab 老鼠多株抗鶄 人镅多秩杭髑 200 78 29 58 197 78 29 39 5 .免疮照件狃宑： 為評估免疫原性，使用來自PBCC197之PRPM製備寡醣類 ，其可藉堪原胺化作用（美國專利案第4,902,506號）連结 於CRM197。這棰疫苗（HbOC-197)的免疫原性之評估*乃藉 由於第0遇輿第4遇注射1液克H bOC疫苗於10隻8遇大之 瑞士聿佰斯特小鼠。血清樣本分別於第0，2, 3, 4與5週 取得。结果顯示於表8並比較W HbOC-197獲得之结果與使 用檷準Hboc製劑（由PBCC200來之PRP)的類似實驗之结果。 得自197之PRP於此分析中其免疫原性同來自PBCC200者。 表8 老鼠免疫原性分析 - 於不同遇別抗體力價（微克/毫升 疫苗 〇_ 2 L 4 5 HbOC-197 0.1 2.03 4.33 4.62 ^21.66 Hb0C-200 <0.1 3.08 4.51 4.47 22.58 附註： 抗- PRP力價乃藉由RIA偵潮旦0BRR檷準=70微克/奄升 -22- -------------------------裝------.玎-----^線 (諳先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 本紙張尺度適用中國®家橾準（CNS〉甲4規格（210 X 297公釐〉 219374 A6 B6 五、發明説明（21 ) 下述生物學物質存放於美國標準菌棰收榘所，12301 Parklawn Drive, Rocrville， Maryland,於 1991年 Ί2月 4 曰： Μ___g 煽號 流行性感冒晴血桿菌b 菌種 Eagan ATCC55257 ------------------------裝------訂----~'!.^ (諳先《讀背面之注意事項再塡寫衣頁) 經濟部中央標準局8工消费合作社印製 衣紙張尺度通用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐）