TW202417511A - 包含抗ｖｅｇｆｒ２抗體的製劑 - Google Patents

Abstract

本發明關於包含抗VEGFR2抗體的製劑。具體而言，本發明關於抗VEGFR2抗體、包含抗VEGFR2抗體的製劑及其用途，尤其是包含抗VEGFR2抗體、緩衝劑、穩定劑和表面活性劑的藥物製劑。此外，本發明關於這些製劑或抗體在預防或治療疾病中的用途。

Description

包含抗VEGFR2抗體的製劑

本發明關於抗體製劑領域，尤其關於包含抗VEGFR2抗體的藥物製劑。更具體而言，本發明關於含有緩衝劑、穩定劑和表面活性劑的抗VEGFR2抗體的製劑，其能夠穩定傾向於在鉸鏈區發生非酶裂解的抗體。此外，本發明還關於該製劑的製備方法以及其在預防或治療疾病中的用途。

血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)是III型酪胺酸激酶，其可以被血管內皮生長因子(VEGF)(例如VEGF-A、VEGF-C和VEGFF-D)刺激。與VEGF-A結合後，VEGFR2增加了表達並且變為二聚體形式。VEGFR2的二聚化誘導VEGFR2的酪胺酸磷酸化，然後激活參與增殖、遷移、分化、管形成、維持血管完整性和增加內皮細胞的血管滲透性的下游途徑。VEGFR2的異常的高表達和/或活性破壞了血管生成的穩態，並導致各種癌症和/或血管生成疾病。因此，本領域對新的抗人VEGFR2(hVEGFR2)抗體具有需求，該抗體可用於治療人VEGFR2表達陽性的疾病，例如癌症以及其他血管生成疾病。

抗體通常配製為適合施用的醫藥組成物形式，例如液體製劑形式進行給藥。然而，液體製劑中的抗VEGFR2抗體對多種化學和物理因素敏感， 包括凍乾、水解、蛋白聚集、氧化以及在鉸鏈區發生片段斷裂等。這種片段斷裂是非酶解過程，可以是溫度或pH依賴性的，通常發生於重鏈鉸鏈區靠近木瓜蛋白酶裂解位點處。該化學和物理因素常常可以降低抗體的利用度或改變其與抗原的親和性，從而嚴重影響抗體的臨床效力。此外，為了臨床施用的方便，抗體製劑中所包含的抗體濃度希望在從低到高的一定範圍內，尤其是當開發皮下注射液或眼內注射液時，往往需要相對高的濃度的抗體製劑，而這種抗體濃度的變化範圍對製劑的穩定性也提出了要求。因此，本領域中有提供穩定性良好且包含適宜濃度的抗VEGFR2抗體的液體製劑的需求。

CN101495136A揭露了一種抗VEGFR2抗體的製劑，但是該製劑的配方不能使本發明的抗VEGFR2抗體達到符合穩定性要求，因此仍然需要開發針對本發明抗體的液體製劑。

本發明滿足了上述需求，提供了新的抗VEGFR2抗體、包含該抗VEGFR2抗體的穩定的液體製劑。

一、本發明的抗VEGFR2抗體

在第一方面，本發明提供了抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈HCDR1、HCDR2和HCDR3和輕鏈LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中，

該HCDR1序列包含X ₁ YGMS(SEQ ID NO：11)；

該HCDR2序列包含SISX ₂ GGSYTYYADSVX ₄ G(SEQ ID NO：12)；

該HCDR3序列包含EX ₃ DGNYDY(SEQ ID NO：13)；

該LCDR1序列包含RSSKSLLYKDGKTYLN(SEQ ID NO：4)；

該LCDR2序列包含LMSTRAS(SEQ ID NO：5)；

該LCDR3序列包含QQLVEYPFT(SEQ ID NO：6)；

其中X₁是I或M，X₂是V或I,X₃是L或M，且X₄是E或K。

在一個較佳的實施方案中，該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：1所示的HCDR1，如SEQ ID NO：2所示的HCDR2以及如SEQ ID NO：3所示的HCDR1；和如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，如SEQ ID NO：5所示的HCDR1以及如SEQ ID NO：6所示的HCDR1；或該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：8所示的HCDR2以及如SEQ ID NO：9所示的HCDR1；和如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，如SEQ ID NO：5所示的HCDR1以及如SEQ ID NO：6所示的HCDR1；或該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：10所示的HCDR2以及如SEQ ID NO：9所示的HCDR1；和如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，如SEQ ID NO：5所示的HCDR1以及如SEQ ID NO：6所示的HCDR1；或該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：8所示的HCDR2以及如SEQ ID NO：3所示的HCDR1；和如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，如SEQ ID NO：5所示的HCDR1以及如SEQ ID NO：6所示的HCDR1；或該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：10所示的HCDR2以及如SEQ ID NO：3所示的HCDR1；和如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，如SEQ ID NO：5所示的HCDR1以及如SEQ ID NO：6所示的HCDR1。

在一個較佳的實施方案中，該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：27的重鏈可變區序列。

在一個較佳的實施方案中，該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的輕鏈可變區序列。

在一個較佳的實施方案中，該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：14的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：15的輕鏈可變區；或該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：16的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：17的輕鏈可變區；該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：18的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：19的輕鏈可變區；該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：21的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：24的輕鏈可變區；該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：21的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：25的輕鏈可變區；該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：22的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：24的輕鏈可變區；該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：22的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：25的輕鏈可變區；該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：27的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：24的輕鏈可變區；該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：27的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：25的輕鏈可變區。

在一個更佳的實施方案中，該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37的重鏈；和包含SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：36的輕鏈。

在一個更佳的實施方案中，該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：33的重鏈和包含SEQ ID NO：34的輕鏈；或該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：35的重鏈和包含SEQ ID NO：34的輕鏈；或該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：33的重鏈和包含SEQ ID NO：36的輕鏈；或該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：35的重鏈和包含SEQ ID NO：36的輕鏈；或該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：37的重鏈和包含SEQ ID NO：34的輕鏈；或該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：37的重鏈和包含SEQ ID NO：36的輕鏈。

二、本發明的抗體製劑

在第二方面，本發明提供醫藥組成物，其包含本文所述的抗體或其抗原結合片段以及一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑。

在一個實施方案中，本發明提供一種液體的抗體製劑，其包含：

(i)抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段；

(ii)緩衝劑；

(iii)穩定劑；和

(iv)表面活性劑。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段的濃度為約10mg/mL至約200mg/mL。在另一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段的濃度為約 10mg/mL至約150mg/mL。在另一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段的濃度為約10mg/mL至約100mg/mL。在另一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段的濃度為約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200mg/mL。在另一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段的濃度為約10mg/mL至約50mg/mL。在另一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段的濃度為約10mg/mL至約30mg/mL。在一個較佳的實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段的濃度為約20mg/mL。在另一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段的濃度為約50mg/mL至約100mg/mL。在另一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段的濃度為約70mg/mL至約90mg/mL。在一個較佳的實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段的濃度為約80mg/mL。

在一些實施方案中，該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段如上文第一方面所述。

在一個特別佳的實施方案中，該抗VEGFR2抗體的胺基酸序列如上文所示。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約0.1-50mg/ml。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約0.1-20mg/ml。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約0.2-10mg/ml。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的 濃度為約0.5-5mg/ml。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約0.5-2mg/ml。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0mg/ml。在一個較佳的實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約1-2mg/ml。

在一個實施方案中，該緩衝劑選自組胺酸、精胺酸、谷胺酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽和三羥甲基胺基甲烷。在一個實施方案中，該緩衝劑為組胺酸/鹽酸組胺酸、檸檬酸/檸檬酸鈉、組胺酸/鹽酸組胺酸/氯化鈉。

在一個較佳的實施方案中，該緩衝劑為組胺酸/鹽酸組胺酸。在一個實施方案中，該組胺酸和鹽酸組胺酸的用量分別為約0.2-1.0mg/ml和約0.5-1.5mg/ml。在一個實施方案中，該組胺酸和鹽酸組胺酸的用量分別為約0.5-1.0mg/ml和約0.8-1.2mg/ml。在一個較佳的實施方案中，該組胺酸和鹽酸組胺酸的用量分別為約0.7-0.8mg/ml和約1-1.2mg/ml。在一個特別佳的實施方案中，該組胺酸和鹽酸組胺酸的用量分別為約0.75mg/ml和約1.08mg/ml。

在一個較佳的實施方案中，該緩衝劑形成的緩衝液為鹽酸-組胺酸緩衝液，該緩衝液的濃度為1-100mmol/L，較佳2-50mmol/L，更佳5-20mmol/L，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mmol/L。在一個特別佳的實施方案中，該鹽酸-組胺酸緩衝液的濃度為8-12mmol/L，較佳10mmol/L。

在一個實施方案中，該緩衝劑形成的緩衝液的pH值為5.0-7.0，較佳pH 5.0-6.5，更佳pH 5.5-6.5，例如pH 5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、 5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5。在一個較佳的實施方案中，該緩衝劑形成的緩衝液的pH值為6.0。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的穩定劑的濃度為約10mmol/L-1000mmol/L。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的穩定劑的濃度為約20mmol/L-500mmol/L。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的穩定劑的濃度為約50mmol/L-300mmol/L。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的穩定劑的濃度為約100mmol/L-250mmol/L。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的穩定劑的濃度為約50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300mmol/L。在一個較佳的實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的穩定劑的濃度為約200mmol/L。在另一個較佳的實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的穩定劑的濃度為約220mmol/L。

該穩定劑包括但不限於多羥基糖、糖醇和胺基酸。在一個實施方案中，該穩定劑選自：糖類例如蔗糖或海藻糖，多元醇例如山梨醇、甘露醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、赤蘚糖醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇等，胺基酸例如精胺酸、脯胺酸、甘胺酸或谷胺酸或其鹽。

在一個實施方案中，該穩定劑是蔗糖。在一個實施方案中，該穩定劑是蔗糖，其濃度為約10-200mg/ml。在一個實施方案中，該穩定劑是蔗糖，其濃度為約50-100mg/ml，並且該液體製劑不包含其它穩定劑。在一個實施方案中，該穩定劑是蔗糖，其濃度為約50-80mg/ml，並且該液體製劑不包含其它穩定劑。在一個較佳實施方案中，該穩定劑是蔗糖，其濃度為約60-70mg/ml，並 且該液體製劑不包含其它穩定劑。在另一個較佳實施方案中，該穩定劑是蔗糖，其濃度為約70-80mg/ml，並且該液體製劑不包含其它穩定劑。

在一個實施方案中，該穩定劑是蔗糖。在一個實施方案中，該液體製劑中的蔗糖濃度為約50mmol/L-300mmol/L，並且該液體製劑不包含其它穩定劑。在一個實施方案中，該蔗糖的濃度為約100mmol/L-250mmol/L，並且該液體製劑不包含其它穩定劑。在一個實施方案中，該蔗糖的濃度為約50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300mmol/L，並且該液體製劑不包含其它穩定劑。在一個較佳的實施方案中，該蔗糖的濃度為約200mmol/L，並且該液體製劑不包含其它穩定劑。在另一個較佳的實施方案中，該蔗糖的濃度為約220mmol/L，並且該液體製劑不包含其它穩定劑。

在另一個實施方案中，該穩定劑是蔗糖與脯胺酸的組合。在一個實施方案中，該穩定劑是蔗糖與脯胺酸的組合，其中蔗糖的濃度為約50mmol/L-200mmol/L，較佳約80mmol/L-150mmol/L，例如約80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150mmol/L，更佳約110mmol/L，並且其中脯胺酸的濃度為約50mmol/L-200mmol/L，較佳約80mmol/L-150mmol/L，例如約80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150mmol/L，更佳約115mmol/L。在一個較佳實施方案中，該穩定劑是蔗糖與脯胺酸的組合，其中蔗糖的濃度為約110mmol/L，脯胺酸濃度為約115mmol/L，並且該液體製劑不包含其它穩定劑。

在另一個實施方案中，該穩定劑是脯胺酸。在一個實施方案中，該穩定劑是脯胺酸，其中脯胺酸的濃度為約50mmol/L-300mmol/L，並且該液 體製劑不包含其它穩定劑。在一個實施方案中，該穩定劑是脯胺酸，其中脯胺酸的濃度為約80mmol/L-300mmol/L，較佳150mmol/L-250mmol/L，更佳約200-250mmol/L，例如約50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300mmol/L，最佳約230mmol/L，並且該液體製劑不包含其它穩定劑。

在一個實施方案中，該表面活性劑的濃度為約0.01-5g/L。在一個實施方案中，該表面活性劑的濃度為約0.05-1g/L。在一個實施方案中，該表面活性劑的濃度為約0.1-0.5g/L。在一個實施方案中，該表面活性劑的濃度為約0.1、0.2、0.3、0.4或0.5g/L。在一個較佳實施方案中，該表面活性劑的濃度為約0.2g/L。

在一個實施方案中，該表面活性劑是非離子型表面活性劑。在一個實施方案中，該表面活性劑例如是普洛尼克(pluronics)、聚山梨酯-80、聚山梨酯-60、聚山梨酯-40、或聚山梨酯-20等。在一個較佳的實施方案中，該表面活性劑是聚山梨酯-80(PS-80)或聚山梨酯-20(PS-20)。

在一個實施方案中，該液體製劑的pH值為約5.0~7.0。在一個實施方案中，該液體製劑的pH值為約5.0-6.5。在一個實施方案中，該液體製劑的pH值為約5.5-6.5。在一個實施方案中，該液體製劑的pH值為約5.8-6.2。在一個實施方案中，該液體製劑的pH值為約6.0。

在一個實施方案中，本發明的液體製劑包含溶媒，較佳地，該溶媒選自注射用水、注射用有機溶劑，包括但不限於注射用油、乙醇、丙二醇等，或其組合。

在一個較佳實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含：

●20.0mg/mL抗VEGFR2抗體，

●0.7515mg/mL組胺酸，

●1.081mg/mL鹽酸組胺酸，

●68.46mg/mL蔗糖，和

●0.2g/L聚山梨酯80

其中該液體製劑的pH為約6.0。

在一個更佳的實施方案中，本發明的液體抗體製劑還包含注射用水。

在另一個較佳實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含：

●80.0mg/mL抗VEGFR2抗體，

●0.7515mg/mL組胺酸，

●1.081mg/mL鹽酸組胺酸，

●75.31mg/mL蔗糖，和

●0.2g/L聚山梨酯80

其中該液體製劑的pH為約6.0。

在另一個較佳實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含：

●20.0mg/mL抗VEGFR2抗體，

●10mM鹽酸-組胺酸緩衝液，pH 6.0，

●200mM蔗糖，和

●0.02%(w/v)聚山梨酯80。

在另一個較佳實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含：

●80.0mg/mL抗VEGFR2抗體，

●10mM鹽酸-組胺酸緩衝液，pH 6.0，

●220mM蔗糖，和

●0.02%(w/v)聚山梨酯80。

在一個更佳的實施方案中，本發明的該液體抗體製劑還包含注射用水。

在另一個較佳實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含：

●80mg/mL抗VEGFR2抗體，

●10mM鹽酸-組胺酸緩衝液，pH 6.0，

●110mM蔗糖和115mM脯胺酸，和

●0.02%(w/v)的聚山梨酯80。

在一個更佳的實施方案中，本發明的該液體抗體製劑還包含注射用水。

在另一個較佳實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含：

●80mg/mL抗VEGFR2抗體，

●10mM鹽酸-組胺酸緩衝液，pH 6.0，

●230mM脯胺酸，和

●0.02%(w/v)的聚山梨酯80。

在一個更佳的實施方案中，本發明的該液體抗體製劑還包含注射用水。

在一個實施方案中，本發明的包含抗VEGFR2抗體的液體製劑在約-80℃至約45℃，例如-80℃、約-30℃、約-20℃、約0℃、約5℃、約25℃、約35℃、約37℃、約42℃或約45℃的條件下儲存至少14天、至少28天、至少 1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月，至少36個月，或更長時間後，用SEC-HPLC法檢測，抗VEGFR2抗體的純度下降不超過10%，例如不超過5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%。

在一個實施方案中，本發明的包含抗VEGFR2抗體的液體製劑在約-80℃至約45℃，例如-80℃、約-30℃、約-20℃、約0℃、約5℃、約25℃、約35℃、約37℃、約42℃或約45℃的條件下儲存至少14天、至少28天、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月，至少36個月，或更長時間後，用非還原型CE-SDS法檢測，抗VEGFR2抗體的純度下降不超過10%，例如不超過5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%。

在一個實施方案中，本發明的包含抗VEGFR2抗體的液體製劑在約-80℃至約45℃，例如-80℃、約-30℃、約-20℃、約0℃、約5℃、約25℃、約35℃、約37℃、約42℃或約45℃的條件下儲存至少14天、至少28天、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月，至少36個月，或更長時間後，用CEX-HPLC法檢測，抗VEGFR2抗體的電荷異質性變化不超過10%，例如不超過5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%。

在一些實施方案中，本發明的抗體配製為液體製劑形式施用。可用的載體和溶媒包括水、林格液、磷酸緩衝鹽溶液和等滲氯化鈉溶液等。此外，在適宜時也可用無菌、不揮發的油作為溶劑或懸浮介質。為此目的，可以利用任意混合的非揮發性礦物油或非礦物油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。此外，諸如油酸的脂肪酸也可用於製備注射劑。

在一些實施方案中，包含本發明的抗體的醫藥組成物為注射用溶液劑。

在一些實施方案中，本發明的抗體製劑藉由局部施用。在一些實施方案中，本發明的抗體製劑藉由靜脈內輸注施用。在一些實施方案中，本發明的抗體製劑藉由靜脈內注射施用。在一些實施方案中，本發明的抗體製劑在病灶內施用。

在一個較佳的實施方案中，該液體製劑為靜脈輸注給藥或者注射給藥的製劑，較佳為注射液，更佳為皮下注射液或眼內注射液。

在一些實施方案中，對眼或眼組織直接施用包含本發明的醫藥組成物。在一些實施方案中，對眼局部施用醫藥組成物。在一些實施方案中，藉由對眼(眼內注射)或與眼結合的組織注射來施用醫藥組成物。可以例如藉由眼內注射、眼周注射、視網膜下注射、玻璃體內注射、跨隔膜注射、鞏膜下注射、脈絡膜內注射、前房內注射、結膜下注射、眼球筋膜下注射、眼球後注射、眼球周注射或後鞏膜旁遞送來施用組成物。還可以例如對個體的玻璃體、視神經、房水、鞏膜、結膜、鞏膜和結膜之間的區域、視網膜脈絡膜組織、黃斑或眼中或靠近眼的其他區域施用組成物。

在一些實施方案中，本發明的抗體製劑的給藥頻率為每天三次、每天兩次、每天一次、每兩天一次、每週兩次、每週一次、每兩週一次、每週一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次、每八週一次、或每月一次、每兩月一次或更長時間。本發明的抗體製劑的給藥週期可以為一週、二週、三週、一月、兩月、三月或更長時間，而且每個給藥週期之間的間隔可以相同或不同。在一個實施方案中，在每個給藥週期給藥一次或兩次，例如給藥一次，給藥方式是每個週期的第一天給藥。

在一些實施方案中，本發明的醫藥組成物可以單獨施用，也可以聯合其他藥物共同施用。

在一個實施方案中，本發明的製劑具有高的抗體濃度，適合於皮下注射或眼內注射，並且具有高的物理和化學穩定性，存放時不易產生聚集體和顆粒並且較不易發生電荷異質性變化。這些優點對於生產完全、有效、均一性高的臨床藥品是十分有益的。

此外，本發明提供了本發明的液體製劑的製備方法，其包括以下步驟：

a.提供抗VEGFR2抗體；

b.加入緩衝劑和穩定劑；

c.加入表面活性劑；

d.視需要地無菌過濾，得到本發明的液體製劑。

在一個實施方案中，步驟a.中的抗VEGFR2抗體是經過分離純化的抗VEGFR2抗體。

在一個實施方案中，步驟a.中的抗VEGFR2抗體以溶液、較佳水溶液形式提供。

在一個實施方案中，在步驟b.之前使用超濾離心管離心濃縮抗VEGFR2抗體。

在一個實施方案中，步驟b.的緩衝劑和穩定劑可以以水溶液形式提供。

在一個實施方案中，在步驟b.後，超濾離心濃縮並再用緩衝劑和穩定劑溶液較佳水溶液稀釋，如此重複，直到置換完全。

在一個實施方案中，在步驟c.前，調整抗VEGFR2抗體或其片段的濃度。

在一個實施方案中，本發明的液體製劑的製備方法包括以下步驟：

i.提供分離純化的抗VEGFR2抗體，並視需要地將其加入到超濾離心管中，離心濃縮；

ii.加入緩衝劑和穩定劑溶液，較佳水溶液，稀釋後繼續濃縮，如此重複，直至置換完全；

iii.調整置換後的蛋白質濃度到對本發明的液體製劑所定義的濃度；

iv.加入表面活性劑或其溶液，較佳水溶液，使表面活性劑的終濃度至對本發明的液體製劑中所定義的濃度；

v.視需要地步驟iv的溶液無菌過濾；和

vi.視需要地分裝至注射劑瓶中，加蓋橡膠塞和鋁塑蓋，獲得成品。

該抗VEGFR2抗體、緩衝劑、穩定劑和表面活性劑如上文所述，其用量和/或濃度如上文對本發明液體製劑所述或可由其適當地確定。

三、使用本發明抗體或包含其的製劑的治療方法和用途

在第三方面，本發明提供了治療個體中VEGFR2相關疾病或病症、降低其嚴重性和/或減緩其進展的方法，包括向個體施用治療有效量的本文所提供的抗體或其抗原結合片段或本文提供的醫藥組成物，例如液體抗體製劑。

在一個實施方案中，該抗體或其抗原結合片段如上文第一方面所述，在另一個實施方案中，該醫藥組成物如上文第二方面所述。

在某些實施方案中，與VEGFR2相關的疾病或狀況是腫瘤或血管生成疾病。

在某些實施方案中，腫瘤產生VEGF(如VEGF-a)和/或對其微環境中存在的VEGF(如VEGF-a)敏感。

在某些實施方案中，腫瘤為實體瘤或非實體瘤。

在某些實施方案中，實體瘤是乳腺癌、肺癌、大腸癌、胰腺癌、膠質瘤和淋巴瘤、頭頸部腫瘤、神經內分泌腫瘤、結直腸腫瘤、前列腺腫瘤、乳腺腫瘤、肺腫瘤，如小細胞和非小細胞肺腫瘤、胰腺腫瘤、甲狀腺腫瘤、卵巢腫瘤、宮頸腫瘤、腎臟腫瘤、腦瘤、肝臟腫瘤、卡波濟氏肉瘤、中樞神經系統腫瘤、成神經細胞瘤，毛細血管母細胞瘤，腦膜瘤，腦轉移瘤，黑色素瘤，胃腸道和腎臟癌和肉瘤(如胃癌)，橫紋肌肉瘤，膠質母細胞瘤，較佳是多形性膠質母細胞瘤，平滑肌肉瘤，鱗狀細胞癌，基底細胞癌和皮膚癌，可以藉由抑制惡性角質形成細胞的生長來治療，如人惡性角質形成細胞。

在某些實施方案中，腫瘤從胃癌、非小細胞肺癌(如大細胞肺癌)組成的組中選擇。

在某些實施方案中，非實體瘤是從白血病、多發性骨髓瘤和淋巴瘤組成的組中選擇的，例如，急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、紅細胞性白血病、單核細胞性白血病、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。

在某些實施方案中，血管生成疾病從以下組中選擇：動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎(RA)、新生血管性青光眼、增殖性視網膜病變(包括增殖性糖尿病視網膜病變、黃斑變性、血管瘤、血管纖維瘤、銀屑病、早產兒視網膜病變(如晶狀體後纖維增生)、角膜移植排斥反應、胰島素依賴性糖尿病、多發性硬化、重症肌無力、Chron氏病、自身免疫性腎炎，原發性膽汁性肝硬化、急性胰腺炎、異體排斥反應、過敏性炎症、接觸性皮炎和遲發性超敏反應、炎症性腸病、膿毒性休克、骨質疏鬆、骨關節炎、神經元炎症引起的認知缺陷、奧斯勒-韋伯綜合症、再狹窄、真菌、寄生蟲和病毒感染，如巨細胞病毒感染。

本發明還涵蓋上文所述的任何實施方案的任意組合。本文所述的任何實施方案或其任何組合可適用於本文所述的任何和所有製劑或抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段、方法和用途。

發明詳述

定義

本發明中所使用的術語具有如下所列定義。如果在文中沒有給出定義，則本發明中所使用的術語具有本領域所通常理解的含義。

為了解釋本說明書，將使用以下定義，並且只要適當，以單數形式使用的術語也可以包括複數，並且反之亦然。要理解，本文所用的術語僅是為了描述具體的實施方案，並且不意欲是限制性的。

如本文所用，術語“和/或”意指可選項中的任一項或可選項的兩項或更多項。

如本文所用，術語“包含”或“包括”意指包括該要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中，當使用術語“包含”或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由所述及的要素、整數或步驟組成的情形。例如，當提及“包含”某個具體序列的抗體重鏈、輕鏈、可變區或CDR時，也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體重鏈、輕鏈、可變區或CDR。

如本文所用，“抗體”一詞包括任何與特定抗原結合的免疫球蛋白、單株抗體、多株抗體、多價抗體、雙價抗體、單價抗體、多特異性抗體或雙特異性抗體。天然完整抗體包括兩個重(H)鏈和兩個輕(L)鏈。哺乳動物重鏈分為alpha、delta、epsilon、gamma和mu，每個重鏈由一個可變區(VH)和第一、第二、第三個恆定區(分別為CH1、CH2、CH3)組成；哺乳動物的輕鏈被分類為λ或κ，而每個輕鏈由一個可變區域(VL)和一個恆定區域組成。該抗體呈“Y”形，Y的主 乾由兩條重鏈的第二和第三個恆定區藉由二硫鍵連接在一起組成。Y的每一臂都包括單個重鏈的可變區和第一恆定區，連接到單個輕鏈的可變區和恆定區。輕鏈和重鏈的可變區域負責抗原的結合。兩條鏈上的可變區通常包含三個高度可變的環，稱為互補決定區(CDRs)(輕鏈CDRs包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈CDRs包括HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本發明中揭露的抗體和抗原結合結構域的CDR邊界可藉由Kabat、IMGT、AbM、Chothia或Al-Lazikani命名法命名或識別(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.,273(4),927(1997)；Chothia,C.等人，J Mol Biol.Dec 5；186(3)：651-63(1985)；Chothia,C.和Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.,196,901(1987)；N.R.Whitelegg等人，ProteinEngineering,v13(12),819-824(2000)；Chothia,C.等人，Nature.Dec 21-28；342(6252)：877-83(1989)；Kabat E.A.等人，National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Marie-Paule Lefranc等人，Developmental and Comparative Immunology,27：55-77(2003)；Marie-Paule Lefranc等人，Immunome Research,1(3),(2005)；Marie-Paule Lefranc,Molecular Biology of B cells(第二版),chapter 26,481-514,(2015))。三個CDR由被稱為框架區(FR)的側翼部分間隔開，框架區比CDR更加高度保守，並形成一個支架支撐高變環。重鏈和輕鏈的恆定區與抗原結合無關，但具有多種效應功能。抗體依據其重鏈恆定區的胺基酸序列可以分成幾類。根據是否含有α、δ、ε、γ和μ重鏈，抗體可分別分為五個主要的分類或同種型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。幾個主要的抗體分類還可分為亞類，如IgG1(γ1重鏈)、IgG2(γ2重鏈)、IgG3(γ3重鏈)、IgG4(γ4重鏈)、IgA1(α1重鏈)或IgA2(α2重鏈)等。在某些實施方式中，本文提供的該抗體包含其任何抗原結合片段。

如本文使用的，術語“抗原結合片段”是指由含有一個或多個CDR的抗體的片段形成的抗體片段，或者與抗原結合但不具有完整的天然抗體結構的任何其他抗體部分。抗原結合片段的例子包括但不限於，如雙功能抗體(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、雙特異性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定的雙功能抗體(ds diabody)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚體(雙價的雙功能抗體)、多特異性抗體、駱駝化單域抗體(camelized single domain antibody)、奈米抗體(nanobody)、域抗體(domain antibody)和雙價域抗體(bivalent domain antibody)。抗原結合片段能夠與親本抗體結合相同的抗原。在某些實施方式中，抗原結合片段可以包含來自特定人抗體的一個或多個CDR。

關於抗體的“Fab”是指抗體的單價抗原結合片段，其由單條輕鏈(包含可變區和恆定區)與單條重鏈的可變區和第一恆定區經二硫鍵結合起來組成的。“Fab”可以在鉸鏈區的重鏈之間二硫鍵的N-末端附近的殘基處，藉由對抗體進行木瓜蛋白酶消化來獲得。“Fab'”是指包含了部分鉸鏈區的Fab片段，其可以在鉸鏈區重鏈之間二硫鍵C-末端附近的殘基處藉由對抗體進行胃蛋白酶消化而獲得，因此其鉸鏈區的少量殘基(包含一個或多個半胱胺酸)不同於Fab。

“F(ab’)2”是指Fab’的二聚體，其包含兩條輕鏈和兩條重鏈的一部分。

關於抗體的“Fc”是指由第一重鏈的第二和第三恆定區經由二硫鍵與第二重鏈的第二和第三恆定區結合組成的抗體的一部分。IgG和IgM Fc區包含三個重鏈恆定區(每條鏈中的第二、第三和第四重鏈恆定區)。它可以藉由木瓜 蛋白酶消化抗體而獲得。抗體的Fc部分負責各種效應子功能，例如ADCC、ADCP和CDC，但在抗原結合中不起作用。

關於抗體的“Fv”是指攜帶完整抗原結合位點的抗體的最小片段。Fv片段由單條輕鏈的可變區與單條重鏈的可變區結合組成。“dsFv”是指藉由二硫鍵穩定的Fv片段，其中單個輕鏈的可變區和單個重鏈的可變區之間的連接是二硫鍵。

“單鏈Fv抗體”或“scFv”是指由直接或藉由肽接頭序列相互連接的輕鏈可變區與重鏈可變區組成的工程化抗體(Huston JS等人，Proc Natl Acad Sci USA,85：5879(1988))。“scFv二聚體”是指包含具有接頭的兩個重鏈可變區和兩個輕鏈可變區的單鏈。在某些實施方式中，“scFv二聚體”是雙價的雙功能抗體或雙價ScFv(BsFv)，其包含與另一個VH-VL部分二聚化的VH-VL(藉由肽接頭連接)，使得一個部分的VH與另一部分的VL配位並形成兩個結合位點，它們可以靶向相同的抗原(或表位)或不同的抗原(或表位)。在其他實施方式中，“scFv二聚體”是雙特異性雙功能抗體，其包含VH1-VL2(藉由肽接頭連接)與VL1-VH2(也藉由肽接頭連接)相結合，使得VH1和VL1配位並且VH2和VL2配位且每個配位對具有不同的抗原特異性。

“單鏈Fv-Fc抗體”或“scFv-Fc”是指由與抗體的Fc區連接的scFv組成的工程化抗體。

“駱駝化單域抗體”、“重鏈抗體”、“奈米抗體”或“HCAb”是指包含兩個VH結構域且無輕鏈的抗體(Riechmann L.和Muyldermans S.,J Immunol Methods.Dec 10；231(1-2)：25-38(1999)；Muyldermans S.,J Biotechnol.Jun；74(4)：277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；U.S.專利號6,005,079)。重 鏈抗體最初來自駱駝科(駱駝、單峰駱駝和美洲駝)。儘管沒有輕鏈，但駱駝抗體具有真正的抗原結合庫(authentic antigen-binding repertoire)(Hamers-Casterman C.等人，Nature.Jun 3；363(6428)：446-8(1993)；Nguyen VK.等人，“Heavy-chain antibodies in Camelidae；a case of evolutionary innovation,”Immunogenetics.Apr；54(1)：39-47(2002)；Nguyen VK.等人，Immunology.May；109(1)：93-101(2003))。重鏈抗體的可變結構域(VHH結構域)代表由適應性免疫應答產生的最小的已知抗原結合單元(Koch-Nolte F.等人，FASEB J.Nov；21(13)：3490-8.Epub 2007 Jun 15(2007))。“雙功能抗體”包含具有兩個抗原結合位點的小抗體片段，其中該片段包含在單個多肽鏈中連接到VL結構域的VH結構域(VH-VL或VL-VH)(參見例如Holliger P.等人，Proc Natl Acad Sci U S A.Jul 15；90(14)：6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161)。由於接頭過短，同一條鏈上的兩個結構域無法配對，因此，這些結構域被迫與另一條鏈的互補結構域配對，從而創建了兩個抗原結合位點。抗原結合位點可以靶向相同或不同抗原(或表位)。“域抗體”是指僅包含重鏈的可變區或輕鏈的可變區的抗體片段。在某些實施方式中，兩個或更多個VH結構域與肽接頭共價連接以形成雙價或多價結構域抗體。雙價結構域抗體的兩個VH結構域可以靶向相同或不同的抗原。

在某些實施方式中，“(dsFv)2”包含三個肽鏈：藉由肽接頭連接並藉由二硫鍵與兩個VL部分結合的兩個VH部分。

在某些實施方式中，“雙特異性ds雙功能抗體”包含經由VH1和VL1之間的二硫鍵與VL1-VH2(藉由肽接頭連接)結合的VH1-VL2(也藉由肽接頭連接)。

在某些實施方式中，“雙特異性dsFv”或“dsFv-dsFv'”包含三個肽鏈：VH1-VH2部分，其中重鏈由肽接頭(例如，長的柔性接頭)結合並藉由二硫鍵分別與VL1和VL2部分配對。每個二硫鍵配對的重鏈和輕鏈具有不同的抗原特異性。

如本文所使用的，術語“人源化的”是指抗體或抗原結合片段，其包含源於非人動物的CDR、源於人的FR區、以及在適用的情況下，源於人的恆定區。在某些實施方式中，人源化CLDN18.2抗體的可變區框架的胺基酸殘基被取代以進行序列優化。在某些實施方式中，人源化CLDN18.2抗體鏈的可變區框架序列與相應的人可變區框架序列至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%相同。如本文所使用的，術語“嵌合”是指抗體或抗原結合片段，其重鏈和/或輕鏈的一部分源於一個物種，而重鏈和/或輕鏈的其餘部分源於不同的物種。在說明性實例中，嵌合抗體可包含源於人的恆定區和源於非人物種(例如，小鼠)的可變區。

術語“種系序列”是指編碼可變區胺基酸序列或子序列的核酸序列，與由種系免疫球蛋白可變區序列編碼的所有其他已知的可變區胺基酸序列相比，其與參考可變區胺基酸序列或子序列具有最高確定的胺基酸序列同一性。與所有其他評估的可變區胺基酸序列相比，種系序列還可以指與參考可變區胺基酸序列或子序列具有最高胺基酸序列同一性的可變區胺基酸序列或子序列。種系序列可以僅是框架區、僅是互補決定區、框架和互補決定區、可變區段(如上所定義)，或包含可變區的序列或子序列的其他組合。序列同一性可以使用本文描述的方法來確定，例如，使用BLAST、ALIGN或本領域已知的另一種比對算法比對兩個序列。種系核酸或胺基酸序列可與參考可變區核酸或胺基酸序列 具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。種系序列可以例如藉由揭露可獲得的國際ImMunoGeneTics數據庫(IMGT)和V-base確定。

如本文所使用的，“抗hVEGFR2抗體”或“針對hVEGFR2的抗體”是指能夠以足夠的親和力與VEGFR2(例如，人或非人VEGFR2)特異性結合的抗體，例如以提供診斷和/或治療用途。

如本文所使用的，術語“親和力”是指免疫球蛋白分子(即抗體)或其片段和抗原之間的非共價相互作用的強度。

如本文所使用的，術語“特異性結合”或“特異性地結合”是指兩個分子之間，例如抗體和抗原之間的非隨機結合反應。在某些實施方式中，本文提供的抗體或抗原結合片段以

10^-6M(例如，

5x10^-7M、

2x10^-7M、

10^-7M、

5x10^-8M、

2x10^-8M、

10^-8M、

5x10^-9M、

4x10^-9M、

3x10^-9M、

2x10^-9M、或

10^-9M的結合親和力(KD))與人和/或非人VEGFR2特異性結合。本文所使用的KD是指解離率與結合率的比率(koff/kon)，其可藉由使用本領域已知的任何常規方法來確定，包括但不限於表面電漿共振法、微尺度熱泳法、HPLC-MS法和流式細胞術(例如FACS)法。在某些實施方式中，可以藉由使用流式細胞術法適當地確定KD值。可以使用多種免疫分析形式來選擇與特定蛋白質發生特異性免疫反應的抗體。例如，常規地使用固相ELISA免疫分析來選擇與蛋白質特異性免疫反應的抗體(參見，例如Harlow & Lane,Using Antibodies,A Laboratory Manual(1998)，可用於確定特異性免疫反應性的免疫分析形式和條件的描述)。通常，特異性或選擇性結合反應產生的信號是背景信號的至少兩倍，更通常是背景信號的至少10至100倍。

關於胺基酸序列(或核酸序列)的“序列同一性百分比(%)”定義為在比對序列並且(如有必要)引入缺口以實現最大對應性後，候選序列中與參考序列中胺基酸(或核酸)殘基相同的胺基酸(或核酸)殘基的百分比。例如，可以使用揭露可獲得的工具如BLASTN、BLASTp(可在美國國家生物技術信息中心(NCBI)的網站上獲得，也參見Altschul S.F.等人，J.Mol.Biol.,215：403-410(1990)；Stephen F.等人，Nucleic Acids Res.,25：3389-3402(1997))，ClustalW2(可在歐洲生物信息學研究所的網站上獲得，也參見Higgins D.G.等人，Methods in Enzymology,266：383-402(1996)；Larkin M.A.等人，Bioinformatics(Oxford,England),23(21)：2947-8(2007))和ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體，來實現用於確定胺基酸(或核酸)序列同一性百分比的比對。所屬技術領域具有通常知識者可以使用工具提供的默認參數，或者可以例如藉由選擇合適的算法來自定義適合比對的參數。在某些實施方式中，不完全相同的殘基位置可以藉由保守胺基酸取代而不同。“保守胺基酸取代”是指其中胺基酸殘基被具有相似化學性質(例如，電荷或疏水性)的側鏈(R基團)的另一個胺基酸殘基取代。通常，保守的胺基酸取代基本上不會改變蛋白質的功能特性。如果兩個或更多個胺基酸序列之間由於保守取代而彼此不同，可以向上調整相似性的百分比或程度以校正取代的保守性。進行這種調整的手段是所屬技術領域具有通常知識者公知的(參見，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331)，其藉由引用併入本文。

如本文所使用的，“同源序列”和“同源性序列”可互換使用，並且是指當可選地比對時，與另一序列具有至少80%(例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)的序列同一性的多核苷酸序列(或其互補鏈)或胺基酸序列。

“分離的”物質已從自然狀態被人為改變。如果自然界出現了“分離的”成分或物質，則說明其已從其原始環境中被更改或去除，或兩者均有。例如，天然存在於活體動物中的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但是如果已經從天然狀態的共存材料中充分分離以使其以基本純淨的狀態存在，則該多核苷酸或多肽是“分離的”。分離的“核酸”或“多核苷酸”可互換使用，並且是指分離的核酸分子的序列。在某些實施方式中，“分離的抗體或其抗原結合片段”是指藉由電泳方法(例如SDS-PAGE、等電聚焦、毛細管電泳)或色譜方法(例如離子交換色譜或反相HPLC)測定的純度至少為60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的抗體或抗原結合片段。

如本文所使用的，“阻斷結合”或“競爭相同表位”的能力是指抗體或抗原結合片段以任何可檢測的程度抑制兩個分子之間(例如人CLDN18.2和抗CLDN18.2抗體)的結合作用的能力。在某些實施方式中，阻斷兩個分子之間結合的抗體或抗原結合片段將兩個分子之間的結合作用抑制至少50%。在某些實施方式中，該抑制可大於60%、大於70%、大於80%或大於90%。

如本文所使用的，術語“載體”是指可以將遺傳因子可操作地插入其中以引起該遺傳因子的表達(例如產生由該遺傳因子編碼的蛋白質、RNA或DNA)或複製遺傳因子的載體。載體可用於轉化、轉導或轉染宿主細胞，以使遺傳因子在攜帶其的宿主細胞內表達。載體的實例包括質粒、噬菌粒、黏粒、人工染色體(例如，酵母菌人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)、或P1來源的人工染色體(PAC))、噬菌體(諸如λ噬菌體或M13噬菌體)和動物病毒。載體可包含多種用於控制表達的因子，包含啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選 擇因子和報告基因。另外，載體可以包含複製起點。載體還可以包括有助於其進入細胞的材料，包含但不限於病毒顆粒、脂質體或蛋白質衣殼。載體可以是表達載體或選殖載體。本揭露提供了載體(例如表達載體)，其包含編碼抗體或其抗原結合片段的本文提供的核酸序列，與該核酸序列可操作地連接的至少一個啟動子(例如SV40、CMV，EF-1α)，和至少一個選擇標記。

如本文所使用的，“宿主細胞”是指已向其中引入外源多核苷酸和/或載體的細胞。

術語“VEGFR2”，可與術語“VEGF受體2”、“激酶插入域含受體(KDR)”、“CD309”或“胎兒肝激酶1(FLK1)”互換使用，是一種類型的VEGF受體(VEGFRs)，這是一種III型受體酪胺酸激酶，其特徵是在其胺基末端細胞外受體配體結合域中通常有5或7個免疫球蛋白樣環。以及一個跨膜區域和一個羧基端胞內催化結構域，該結構域被稱為激酶插入結構域的可變長度親水性互激酶序列插入所中斷(Kaipainen et al.，J.Exp Med.，178：2077-88(1993)；Termanet al.，癌基因，6：1677-83(1991))。其他類型的VEGFR包括鰭樣酪胺酸激酶受體(fit-1)或VEGFR1和VEGFR3(fit-4)(Shibuya等人，致癌基因，5：519-24(1990))。胺基末端細胞外受體配體結合結構域負責配體(如血管內皮生長因子A(VEGF-A))與結構域之間的親和。細胞內的羧基端催化結構域負責信號通路的啟動，例如細胞生長。在胚胎發生和腫瘤形成過程中，VEGFR的表達可以在內皮細胞上找到。(細胞，72：835-46(1993)；Plate,K.等人(1993))。VEGFR的表達也可以在非內皮細胞上發現，如腫瘤細胞，特別是產生VEGF的腫瘤細胞，如白血病細胞(Fielder等人，Blood 89：1870-5(1997)和Bellamy等人，Cancer Res.59728-33(1999).)。本文使用的人VEGFR2(hVEGFR2)由NCBI數據庫中登錄號為AAI31823.1的胺基酸 序列或SEQ ID NO：30

(

).

本文使用的小鼠VEGFR2由NCBI數據庫中可藉由登錄號P35918.1訪問的胺基酸序列或SEQ ID NO：31

(

)的胺基 酸序列組成。

本文使用的Rhesus VEGFR2包含NCBI數據庫中可藉由登錄號XP_014994176.1訪問的胺基酸序列或SEQ ID NO：32

(

)的胺基酸序列組成。

本文所使用的“hVEGFR2相關”疾病或狀況是指由hVEGFR2表達或活性的增加或減少引起、加重或與之相關的任何疾病或狀況。在一些實施例中，hVEGFR2相關的情況是，例如，癌症或血管生成疾病。

“VEGF-A”與術語“血管內皮生長因子A”互換使用，是指高度保守的二聚糖蛋白或其轉錄拼接變體，如VEGFA206、VEGFA189、VEGFA165和VEGFA121分別含有206、189、165和121個胺基酸。VEGF-a是VEGF家族的一員，它還包括其他成員，如VEGF-b、VEGF-c和VEGF-d。

本文使用的“癌症”是指以惡性細胞生長或腫瘤、異常增殖、浸潤或轉移為特徵的任何醫學疾病，包括實體腫瘤和非實體癌症(如血液惡性腫瘤)，如白血病。這裡所使用的“實體腫瘤”是指腫瘤和/或惡性細胞的實體團塊。

本文所使用的“血管生成疾病”是指與血管生成異常相關的任何醫療狀況，血管生成是一種新血管生長的過程。這些異常包括但不限於血管生成過度、血管生成不足、血管生成不當和損傷性血管生成。以過度或破壞性血管生成為特徵的疾病包括但不限於癌症、糖尿病視網膜病變、老年性黃斑變性和動脈粥樣硬化、中風和心肌梗死、類風濕性關節炎。

“互補決定區”或“CDR區”或“CDR”是抗體可變結構域中在序列上高變並且形成在結構上確定的環(“超變環”)和/或含有抗原接觸殘基(“抗原接觸點”)的區域。CDR主要負責與抗原表位結合。重鏈和輕鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3，從N-端開始順序編號。位於抗體重鏈可變結構域內的CDR被稱作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位於抗體輕鏈可變結構域內的CDR被稱作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一個給定的輕鏈可變區或重鏈可變區胺基酸序列中，各CDR的精確胺基酸序列邊界可以使用許多公知的抗體CDR指派系統的任一種或其組合確定，該指派系統包括例如：基於抗體的三維結構和CDR環的拓撲學的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342：877-883，Al-Lazikani等人，“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基於抗體序列可變性的Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987))，AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，國際 ImMunoGeneTics database(IMGT)(在www.imgt.cines.fr/上)，以及基於利用大量晶體結構的近鄰傳播聚類(affinity propagation clustering)的North CDR定義。

然而，應該注意，基於不同的指派系統獲得的同一抗體的可變區的CDR的邊界可能有所差異。即不同指派系統下定義的同一抗體可變區的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本發明定義的具體CDR序列限定抗體時，該抗體的範圍還涵蓋了這樣的抗體，其可變區序列包含該具體CDR序列，但是由於應用了不同的方案(例如不同的指派系統規則或組合)而導致其所聲稱的CDR邊界與本發明所定義的具體CDR邊界不同。

具有不同特異性(即，針對不同抗原的不同結合位點)的抗體具有不同的CDR。然而，儘管CDR在抗體與抗體之間是不同的，但是CDR內只有有限數量的胺基酸位置直接參與抗原結合。使用Kabat、Chothia、AbM、Contact和North方法中的至少兩種，可以確定最小重疊區域，從而提供用於抗原結合的“最小結合單位”。最小結合單位可以是CDR的一個子部分。正如所屬技術領域具有通常知識者明瞭，藉由抗體的結構和蛋白折疊，可以確定CDR序列其餘部分的殘基。因此，本發明也考慮本文所給出的任何CDR的變體。例如，在一個CDR的變體中，最小結合單位的胺基酸殘基可以保持不變，而根據Kabat或Chothia定義的其餘CDR殘基可以被保守胺基酸殘基替代。

“個體”或“受試者”包括哺乳動物。哺乳動物包括但不限於，家養動物(例如，牛、羊、貓、狗和馬)，靈長類動物(例如，人和非人靈長類動物如猴)，兔，以及齧齒類動物(例如，小鼠和大鼠)。在一些實施方案中，個體或受試者是人。

術語“組合產品”是指一種劑量單位形式的固定組合或非固定組合或用於組合施用的部分的試劑盒，其中兩種或更多種治療劑可以獨立地在同一時間或在時間間隔內分開施用，尤其是在這些時間間隔允許組合伴侶展示協作，例如協同效應時。術語“固定組合”是指本發明抗體和組合伴侶(例如其他治療劑)以單一實體或劑量的形式同時施用於患者。術語“非固定組合”意指本發明抗體和組合伴侶(例如其他治療劑)作為分開的實體同時、並行或依次施用於患者，沒有特定的時間限制，其中這樣的施用提供了患者體內兩種化合物的治療有效水平。後者也適用於雞尾酒療法，例如施用三種或更多種治療劑。在一個較佳的實施方案中，藥物組合是非固定組合。

用於本文時，“治療”指減緩、中斷、阻滯、緩解、停止、降低、或逆轉已存在的症狀、病症、病況或疾病的進展或嚴重性。

用於本文時，“預防”包括對疾病或病症或特定疾病或病症的症狀的發生或發展的抑制。在一些實施方式中，具有家族病史的受試者是預防性方案的候選。通常，術語“預防”是指在病徵或症狀發生前，特別是在具有風險的受試者中發生前的藥物施用。

術語“有效量”指本發明的製劑、抗體或片段這樣的量或劑量，其以單一或多次劑量施用患者後，在治療的患者中產生預期效果。有效量可以由作為所屬技術領域具有通常知識者的主治醫師藉由考慮以下多種因素來容易地確定：諸如哺乳動物的物種；它的大小、年齡和一般健康；涉及的具體疾病；疾病的程度或嚴重性；個體患者的應答；施用的具體抗體；施用模式；施用製劑的生物利用率特徵；選擇的給藥方案；和任何伴隨療法的使用。

“治療有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需治療結果的量。本發明的製劑、抗體或抗體片段或其綴合物或組成物的治療有效量可以根據多種因素如疾病狀態、個體的年齡、性別和重量和抗體或抗體部分在個體中激發所需反應的能力而變動。治療有效量也是這樣的一個量，其中製劑、抗體或抗體片段或其綴合物或組成物的任何有毒或有害作用不及治療有益作用。

“預防有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需預防結果的量。通常，由於預防性劑量在對象中在疾病較早階段之前或在疾病較早階段使用，故預防有效量將小於治療有效量。

術語“宿主細胞”、“宿主細胞系”和“宿主細胞培養物”可交換地使用且是指其中引入外源核酸的細胞，包括這種細胞的後代。宿主細胞包括“轉化體”和“轉化的細胞”，其包括初級轉化的細胞和來源於其的後代，而不考慮傳代的數目。後代在核酸內容上可能與親本細胞不完全相同，而是可以包含突變。本文中包括在最初轉化的細胞中篩選或選擇的具有相同功能或生物學活性的突變體後代。

如文中所用，術語“醫藥組成物”或“製劑”意指適合於向動物較佳哺乳動物(包括人)施用的包含至少一種活性成分和至少一種非活性成分的組成物。“液體製劑”是指液體形式的製劑。本發明的液體製劑可包含：(i)抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段；(ii)緩衝劑；(iii)穩定劑；(iv)表面活性劑；和(v)溶媒。本發明的製劑的組成可如上面液體製劑實施方案中所示。本發明的液體製劑較佳為注射劑，更佳為皮下注射劑。

“藥學上可接受的載體或賦形劑”指藥物製劑中除活性成分以外的成分，其對施用對象無毒性，包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑、表面活性劑或防腐劑。

如文中所用，“緩衝劑”是指pH緩衝劑。例如，該緩衝劑能夠使本發明的液體製劑的pH保持在約5.0~7.0，較佳約5.5-6.5，更佳約5.8-6.2，最佳約6.0。較佳地，緩衝劑選自組胺酸、谷胺酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽和三羥甲基胺基甲烷。

如文中所用，“穩定劑”是指一類能夠穩定液體抗體製劑和/或保護抗體免於多種物理過程例如凍乾造成的相關應激的化合物。該物理過程例如凍乾過程或者儲存過程可能遇到各種應激，導致蛋白質或多肽的變性。該應激包括溫度降低、冰晶形成、離子強度增大、pH變化、濃度變化等。穩定劑包括但不限於多羥基糖、糖醇和胺基酸。例如，穩定劑可選自：糖類例如蔗糖或海藻糖，多元醇例如山梨醇、甘露醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、赤蘚糖醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇等，胺基酸例如精胺酸、脯胺酸、甘胺酸或谷胺酸或其鹽。更佳地，穩定劑是蔗糖或脯胺酸，或者穩定劑是蔗糖與脯胺酸的組合。

如文中所述，“表面活性劑”是指加入少量後，能使溶液體系的界面狀態發生明顯變化的物質。例如，表面活性劑是非離子型表面活性劑，例如普洛尼克(pluronics)、聚山梨酯-80、聚山梨酯-60、聚山梨酯-40或聚山梨酯-20等。

如文中所用，術語“溶媒”是指用於溶解或懸浮活性成分和非活性成分以形成液體製劑的液體。可用於本發明的溶媒包括但不限於注射用水、注射用有機溶劑包括但不限於注射用油、乙醇、丙二醇等，或其組合。

術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小10%的下限和比指定數字數值大10%的上限的範圍內的數字數值，例如具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值，具有比指定數字數值小2%的下限和比指定數字數值大2%的上限的範圍內的數字數值，具有比指定數字數值小1%的下限和比指定數字數值大1%的上限的範圍內的數字數值。

如文中所用，“w/v”是指“重量/體積”，例如“1% w/v”為1g/100ml=0.01g/ml=10mg/ml。

治療方法或用途

本發明還提供治療方法，包括：向有需要的受試者施用治療有效量的如本文提供的抗體或抗原結合片段和/或本文提供的醫藥組成物，從而治療VEGFR2相關疾病或病症、降低其嚴重性和/或減緩其在受試者中的進展。

在一些實施方案中，該VEGFR2相關疾病或病症是腫瘤或血管生成疾病。

腫瘤

在某些實施方案中，與VEGFR2相關的疾病或狀況為腫瘤，如實體瘤或非實體瘤。在某些實施方案中，腫瘤產生VEGF(如VEGF-a)和/或對其微環境中存在的VEGF(如VEGF-a)敏感。有研究觀察到在實體瘤或非實體瘤中，如人類白血病、VEGF的產生和VEGFR2的表達(Sato,K.et al.，Tohoku J.Exp Med.，185：173-84(1998)；石井，Y.，日本Sanka Fujinka Gakkai Zasshi：4I：133-40(1995)；和Ferrer,F.A.等，泌尿學，54：567-72(1999)；Fielder等人，血液89：1870-5(1997)和Bellamy等人，癌症Res.59728-33(1999))。在不希望被理論束縛的情況下， VEGF/hVEGFR2自分泌環可調節腫瘤細胞在體內的生存和遷移，已有研究進一步證實，VEGFR1單株抗體可抑制某些實體腫瘤細胞(如乳腺癌細胞)中的自分泌VEGF/VEGFR1環，並抑制VEGF刺激的人白血病細胞的遷移(見US7498414(B2))。

在某些實施方案中，實體瘤是從乳腺癌、肺癌、大腸癌、胰腺癌、膠質瘤和淋巴瘤組成的組中選擇的，例如頭頸部腫瘤、大腸癌、前列腺腫瘤、乳腺腫瘤、肺腫瘤，如小細胞和非小細胞肺腫瘤、胰腺腫瘤、甲狀腺腫瘤、卵巢腫瘤、宮頸腫瘤、腎臟腫瘤、腦瘤和肝臟腫瘤、卡波濟氏肉瘤、中樞神經系統腫瘤、成神經細胞瘤，毛細血管母細胞瘤，腦膜瘤，腦轉移瘤，黑色素瘤，胃腸道和腎臟癌和肉瘤(如胃癌)，橫紋肌肉瘤，膠質母細胞瘤，較佳是多形性膠質母細胞瘤，平滑肌肉瘤，鱗狀細胞癌，基底細胞癌和皮膚癌，可以藉由抑制惡性角質形成細胞的生長來治療，如人惡性角質形成細胞。在某些實施方案中，實體瘤從胃癌、非小細胞肺癌(如大細胞肺癌)組成的組中選擇。

在某些實施方案中，非實體瘤是從白血病、多發性骨髓瘤和淋巴瘤組成的組中選擇的，例如，急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、紅細胞性白血病、單核細胞性白血病、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。

血管生成疾病

在某些實施方案中，與VEGFR2相關的疾病或狀況是血管生成疾病。血管生成疾病與未控制的血管生成有關，可由VEGF調節，如VEGF-a。VEGF的表達可以在胚胎組織、巨噬細胞和傷口癒合過程中增殖的表皮角化細胞中發現(Breier等人，Development,114：521-32(1992)；布朗等，J.實驗醫學，176：1375-9 (1992)；和Ferrara等人，endoc.Rev.,13：18-32(1992))。腫瘤中也可發現VEGF的高表達，如多形性膠質母細胞瘤、成血管母細胞瘤、中樞神經系統腫瘤和艾滋病相關卡波西肉瘤；在動脈粥樣硬化病變、斑塊和炎症細胞中(Nakamura,S.等人，艾滋病週刊，13(1)(1992)；Plate,K.等人，自然，359：845-8(1992)；Plate,K.等人，Cancer Res.，53：5822-7(1993))。腫瘤細胞附近表達VEGF的內皮細胞一般表現為VEGF受體的上調表達，如VEGFR2。腫瘤釋放VEGF刺激鄰近內皮細胞血管生成，導致增殖、遷移、分化、管的形成、血管完整性的維持和內皮細胞血管通透性的增加。因此，參與血管生成疾病的VEGF/VEGFR2信號異常可以藉由本發明提供的抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段進行治療。

在某些實例中，血管生成性疾病包括動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎(RA)、新生血管性青光眼、增殖性視網膜病變，包括增殖性糖尿病視網膜病變、黃斑變性、血管瘤、血管纖維瘤、銀屑病、早產兒視網膜病變(例如，晶狀體後纖維增生)、角膜移植排斥、胰島素依賴性糖尿病、多發性硬化、重症肌無力、Chron氏病、自身免疫性腎炎、原發性膽汁性肝硬化、急性胰腺炎，異體排斥、過敏性炎症、接觸性皮炎和遲發性超敏反應、炎症性腸病、感染性休克、骨質疏鬆、骨關節炎、神經元炎症引起的認知缺陷、奧斯勒-韋伯綜合症、再狹窄以及真菌、寄生蟲和病毒感染，如巨細胞病毒感染。

在某些實施方案中，個體是人。

本文提供的抗體或抗原結合片段和/或本文提供的醫藥組成物可以藉由口服、鼻腔、靜脈、皮下、舌下、瘤內或肌肉給藥給藥。

在一些實施方案中，本文提供的方法進一步包括施用治療有效量的第二治療劑，例如，抗癌治療，可選的抗癌治療是從化療劑、放射治療、免疫 治療劑、抗血管生成劑(例如VEGFR的拮抗劑，如VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3)、EGFR拮抗劑、PDGFR拮抗劑、IGFR拮抗劑、NGFR拮抗劑、FGFR拮抗劑，靶向治療劑，細胞治療劑，基因治療劑，激素治療劑，細胞因子，姑息治療，癌症治療的手術(如腫瘤切除術)，一種或多種抗吐劑，化療引起的併發症的治療，或癌症患者的飲食補充劑(如吲哚-3-甲醇)。

在一些實施方案中，本發明提供了包含本文所述抗體或抗原結合片段的試劑盒，可選地與可檢測的片段結合。該試劑盒可用於檢測生物樣品中hVEGFR2的存在或數量，或可用於本文所規定的診斷方法。

在一些實施方案中，本發明提供了包含本實施方案中所規定的抗體或抗原結合片段的試劑盒和第二治療劑。該試劑盒可用於治療、預防和/或改善VEGFR2相關疾病或狀況。

本發明還提供了一種檢測樣品中VEGFR2的存在或數量的方法，包括將樣品與本發明提供的抗體或其抗原結合片段接觸，並確定樣品中VEGFR2的存在或數量。

在一些實施方案中，本發明還提供了使用本實施方案中所規定的抗體或抗原結合片段來製造用於治療、減輕和/或減緩受試者中VEGFR2相關疾病或狀況的嚴重性或進展的藥物。

圖1描述了實施例4的抗體的EC50實驗結果。

圖2描述了實施例5的抗體阻斷人VEGF-A(hVEGF-A)與hVEGFR2結合的實驗結果。

圖3和4描述了293T細胞中產生的人源化抗體結合人VEGFR2-his的結果。

圖5和6描述了CHO細胞中產生的人源化抗體結合人或恆河猴VEGFR2-his的結果。

圖7描述了特異性結合VEGFR2的人源化抗體。

圖8和9描述了阻斷VEGF-A與人或恆河猴VEGFR2結合的人源化抗體。

圖10描述了結合HUVEC細胞的人源化抗體。

圖11描述了人源化抗體054抑制VEGF-A誘導的VEGFR2磷酸化。

圖12描述了阻斷VEGF-A介導的細胞增殖的人源化抗體。

圖13描述了實施例8的實驗1的A350檢測結果。

圖14描述了實施例8的實驗1的SEC單體結果統計柱狀圖。

圖15描述了實施例8的實驗1的cIEF主峰結果統計柱狀圖。

圖16描述了實施例8的實驗3的SEC單體結果統計柱狀圖。

圖17描述了實施例9的實驗1的各處方蛋白濃度與擴散係數關係圖。

圖18描述了實施例9的實驗1的各處方粒徑-溫度關係圖。

圖19描述了實施例9的最優的3個處方與低濃度製劑處方熱穩定性結果比較圖。

圖20描述了實施例9的最優的3個處方與低濃度製劑處方光照穩定性結果比較圖。

圖21描述了實施例9的最優的3個處方與低濃度製劑處方凍融穩定性結果比較圖。

以下結合實施例進一步說明本發明，下列實施例不應被理解為對本發明的限制。

縮寫：

SEC-HPLC：體積排阻高效液相色譜

CE-SDS：十二烷基硫酸鈉毛細管凝膠電泳

NR-CE-SDS：非還原性十二烷基硫酸鈉毛細管凝膠電泳

CZE：毛細管區帶電泳

CEX-HPLC：陽離子交換高效液相色譜

實施例1：VEGFR2蛋白的製備和表徵

人VEGFR2/KDR-his：重組人VEGFR/KDR蛋白(hVEGFR2-his,Accession#AAI31823.1)在人293細胞(HEK293)中表達。簡單地用C端帶有6×his標簽的Ala20-Glu764人VEGFR2基因編碼區進行轉染。用His-tag親和管柱純化上清。用SDS page凝膠對純化的蛋白進行了表徵。該蛋白購自ACRO生物系統公司(Cat#KDR-H5227)。

恆河猴VEGFR2/KDR-his：重組恆河猴VEGFR2/KDR蛋白胞外結構域Ala20~Glu764(Accession#XP_014994176.1)在C端與多組胺酸標記融合，在人293細胞(HEK293)中表達。HEK293細胞轉染上清採用His-tag親和管柱純化。用SDS page凝膠對純化的蛋白進行了表徵。該蛋白購自ACRO生物系統公司(Cat#VE2-C52H3)。

上述VEGFR2蛋白用於以下試驗。

實施例2：抗體的製備

1.抗原結合與免疫

在免疫方面，重組hVEGFR2-his蛋白與多種MabSpace免疫增強肽結合。即將2-8倍莫耳量的多肽與磺基-smcc(磺基琥珀醯亞基4-[n-馬來胺甲基]環己烷-1- 羧酸鹽，Peirce#22322)激活的hVEGFR2蛋白混合，在室溫下孵育1小時。停止反應，用SDS-PAGE凝膠分析和QCed結合蛋白。

將上述結合的hVEGFR2-his蛋白分別用完全弗氏佐劑(Pierce)按1：1比例乳化，然後皮下和腹腔免疫C57B/L6小鼠。使用CpG和明礬進行額外的免疫以保存蛋白質的原生構象。至少每2週進行一次免疫，第一次免疫後從小鼠中提取抗血清，用ELISA法分析抗hvegfr2滴度。

為了測定血清滴度，每隻免疫小鼠製備20μl的小鼠血清。高結合性的透明聚苯乙烯96孔板(Nunc)用100μl/孔的1μg/ml的人VEGFR2-his高pH包覆緩衝液(0.16% Na2CO3,0.3% NaHCO3,pH9.8)包覆。在4℃下孵育一夜，然後在自動洗碟機上使用洗滌緩衝液PBS+0.1%吐溫20(西格瑪)清洗一次。每孔加入200μl阻斷緩衝液(PBS+1% BSA+1%山羊血清+0.05%吐溫20)，室溫孵育2小時。吸取阻斷緩衝液，將100μl的稀釋緩衝液(PBS+1% BSA+1%山羊血清+0.01%吐溫20)連續稀釋血清轉移到ELISA板的每孔，室溫孵育60min，然後按上述方法洗滌3次。將HRP偶聯山羊抗小鼠Fc抗體(Abcam,Cat#Ab98808)溶液在稀釋緩衝液中稀釋100μl/孔，然後加入到板的每孔中。ELISA培養板在RT孵育60min後，用250μl/孔洗緩衝液清洗3次。最後在每個孔中加入100μl/孔的TMB，以0.64M H2SO4結束反應。在450nM的Thermo Multiscan FC上讀取印版。

2.融合

融合前4天，每隻小鼠腹腔注射PBS中未結合的hVEGFR2蛋白。融合當天無菌摘除脾臟，將器官加工成單細胞懸液。裂解紅細胞，用DMEM(Gibco)清洗脾細胞。活的、對數期生長骨髓瘤細胞(SP2/0)與小鼠脾細胞以1：4的比例混合。 細胞在與PEG融合前洗滌2次。融合後細胞用DMEM清洗，懸浮在添加10%FBS+HFCS+OPI+1X HAT的細胞生長培養基中。每孔200μl的細胞懸液被鍍到96孔細胞培養板中，在37℃濕度10% CO₂培養箱中培養一夜。培養7天後，將培養基從孔中抽出，換取新的培養基。培養基更換後2-3天開始篩選融合瘤上清。

3. ELISA法抗體篩選

與上述測定血清效價的方法相同。簡單地說，0.5μg/ml的hVEGFR2-his在4℃下包被一夜。洗淨後，加入100μl融合瘤細胞上清，使其完全結合。加入HRP偶聯山羊抗小鼠Fc抗體檢測結合VEGFR2抗體。最後，在TMB反應和H2SO4終止後，在450nM的Thermo Multiscan FC上讀取平板。來自ELISA陽性融合瘤細胞孔的細胞隨後在細胞培養中擴大，以進行進一步的特性研究。

實施例3：陽性融合瘤株的亞選殖和抗體生產

1.陽性融合瘤株的亞選殖

從ELISA陽性融合瘤細胞孔中選擇具有所需結合譜和阻斷活性的細胞，用有限稀釋法將每個細胞鍍於96個孔板中。這些細胞生長了7天。一旦達到足夠的細胞質量，從每個孔收集上清並重新篩選抗原結合能力(見示例2中的篩選)。

從96孔板中篩選出抗原結合活性最高的無性系，用有限稀釋法進一步擴增到96孔板中，每孔添加200μl融合瘤生長培養基。7天後，96孔板的細胞進行抗原結合測試。亞選殖2次以上。當90個以上孔顯示陽性結合信號時，鑑定出兩個抗原結合活性最高的無性系，並將其轉移到24孔培養皿中，再培養2天。一旦24孔板匯合，細胞被轉移到6孔板。孵育5天後，一部分細胞被冷凍下來。其餘的細胞被轉移到一個燒瓶中，讓其膨脹。一旦燒瓶匯合，一半 的細胞被冷凍(每個株3瓶)作為額外的備份。另一半細胞在有抗體產生介質的燒瓶中進一步膨脹。用標準方法測定同型。

2.抗體生產

融合瘤細胞接種於滾筒瓶中，用200-300ml融合瘤培養基(Invitrogen)培養14 d。從融合瘤細胞培養中純化VEGFR2單株抗體(maabs)。所有的淨化過程都在室溫下進行。一種純化方案用於純化各種單株抗體，並使用親和層析。

將宿主細胞培養液(CCF)離心以去除細胞碎片。然後將CCF上清過濾、稀釋，然後以管柱的形式加載到蛋白G層析介質中，蛋白G高性能(Bio-Rad)並進行平衡。

加載後，清洗蛋白G管柱，直到280nm處的吸光度恢復到基線值。然後用pH值為2.5的甘胺酸從管柱中沖提VEGFR2單抗，並在每mL沖提體積中加入50μL的1M Tris Base原液立即中和。監測沖提物在280nm處的吸光度，並收集含有蛋白質的組分製成protein A池。

純化後，用10,000 MWCO膜(Pierce Slide-A-Lyzer或透析管)在PBS中透析製備抗VEGFR2單抗。按照配方，過濾得抗VEGFR2單抗。

實施例4：純化的抗VEGFR2抗體結合分析

同實施例2的ELISA法抗體篩選方案。

簡單地說，將0.5μg/ml的hVEGFR2-his包被，連續稀釋純化的抗體與包被抗原結合。利用HRP偶聯山羊抗小鼠Fc抗體可以檢測各抗體的結合信號。

使用Graphpad Prism軟體對數據進行計算和擬合，抗體的EC50結果如圖1和表1所示。篩選的融合瘤抗體對人有類似親和力。

表1

實施例5：評價純化抗體抑制hVEGF-A與hVEGFR2結合的阻斷活性

高結合透明聚苯乙烯96孔板在4℃下用100μl/孔的1μg/ml hVEGFR2-his包覆過夜。洗淨封閉後，加入10μg/ml至0.0006μg/ml的序列稀釋抗體，室溫孵育1小時，加入0.3μg/ml的hVEGF-A(Acrobiosystem,Cat#VE5-H4210)，室溫孵育2小時，然後加入0.25μg/ml的生物素化兔抗人VEGF-A(Peprotech,Cat#400-P10Bt)100μl/孔，檢測結合VEGF-A。然後依次加入HRP偶聯的Neutravidin抗體(Pierce,Cat#31001)和TMB溶液100μl/孔。最後，用0.64M H2SO4終止反應，在450nM讀取板。1121B是一種基準抗體(Ramucirumab)，美國專利號：US7498414。

如圖2所示，042、048、054和1121B的阻斷活性相似，IC50相近，說明3種抗體也可能像1121B一樣，藉由阻斷VEGF-A/VEGFR2相互作用來抑制VEGF-A的活性。

實施例6：人源化抗體的生成和表徵

1.人源化抗體的生成、表達和純化

下表為小鼠抗體或人源化抗體的CDR、VH/VL序列。用小鼠抗體054和048的可變結構域序列鑑定與小鼠框架同源性最高的種系序列。利用計算機建模，藉由CDR嫁接和反向突變設計人源化變異株。

Ab-54

採用人種系框架序列VK/2D-40(輕鏈)和VH/3-21(重鏈)分別進行CDR嫁接。

Mab54 HC的germline序列：

VH/3-21(Mab54-germline,SEQ ID NO：20)：

H1：VH/3-21 variant 1(Mab54-Hzd-HC-V1,SEQ ID NO：21)：

H2：VH/3-21 variant 2(Mab54-HC-V2,SEQ ID NO：22)：

Mab54 LC的germline序列：

VK/2D-40(Mab54 LC germline,SEQ ID NO：23)：

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYTLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQRIEFP

L1：VK/2D-40 variant 3(Mab54-Hzd-LC-V1,SEQ ID NO：24)：

DIVITQDELSLPVTFGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCQQLVEYPFTFGSGTKLEIK

L2：VK/2D-40 variant 4(Mab54-Hzd-LC-V2,SEQ ID NO：25)：

DIVITQTPLSLPVTPGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPFTFGSGTKLEIK

Ab-48

採用人種系框架序列VK/2D-40(輕鏈)和VH/3-21(重鏈)分別進行CDR嫁接。

Mab48 HC的germline序列：

VH/3-21(Mab48-HC germline,SEQ ID NO：26)：

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR

H3：VH/3-21變體5(Mab48-Hzd-HC-V3,SEQ ID NO：27)：

Mab48的種系和輕鏈序列與Mab54相同。

因此，人源化Mab54有4個變體，簡稱54-H1L1、54-H2L1、54-H1L2、54-H2L2；人源化Mab48有2個變體，簡稱48-H3L1、48-H3L2。VH/3-21變異5與VH/3-21變異2幾乎相同，除了HCDR3中的一個胺基酸。

上述重鏈和輕鏈cDNA在Fc區合成並與人類IgG1的恆定區融合((重鏈恆定區SEQ ID NO：28

(

)和輕鏈恆定區SEQ ID NO：29(RTVAAPSVF IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC))(本文描述的重鏈殘基編號根據EU Kabat指數(見Kabat等人，“免疫興趣蛋白”，美國衛生與公眾服務部(1983))。下表為上述人源化抗體的重鏈輕鏈序列。

將所選抗體基因的重鏈和輕鏈可變區域合成並選殖到表達載體中，使用Promega公司的PureYield^TM質粒Maxiprep系統製備大規模DNA。根據製造商的協議，使用Invitrogen公司的ExpiFectamine^TM293試劑進行轉染。當細胞活力在50%左右時收集上清。蛋白A珠和清潔上清在4℃搖動孵育2小時後藉由管柱。用PBS洗滌管柱內的蛋白A珠，用100mM甘胺酸緩衝液(pH3.0)沖提抗體，抗體與PBS緩衝液(137mM NaCl,2.7mM KCl 10mM Na2HPO4,2mM KH2PO4,pH7.4)在4℃下透析過夜。最後，使用Pierce高容量內毒素去除樹脂(Invitrogen，目錄編號：88271)去除內毒素。用SDS-PAGE和SEC-HPLC對純化的抗體進行了表徵。

2.人源化抗體與hVEGFR2和恆河猴VEGFR2的結合

和實施例2相同的試驗方法。ELISA檢測293T細胞表達的人源化054和048抗體，人源化抗體展現相似的結合活性(見圖3和4)。

然後在CHO細胞中表達54-H2L1和48-H3L1兩種人源抗體進行進一步評估，分別標記為54-H2L1(CHO)和48-H3L1(CHO)。結果顯示抗體和對照抗體Ramucirumab一樣，與恆河猴VEGFR2-his的跨物種結合是保持的，這是治療性抗體開發的非常重要的特徵(見圖5和6)。

3.人源化VEGFR2抗體結合的特異性

簡單地說，1μg/ml人VEGFR1(Sino Biological,cat#10136-H08H)、VEGFR2(Acrobiosystem,cat#KDR-H5227)和VEGFR3(Sino Biological,cat#10806-H08H)蛋白在4℃下包被一夜。添加1μg/ml人源化抗體(48-H3L1和54-H2L1，產自CHO細胞或來自德國禮來公司的Ramucirumab，批號#20150819)與包被抗原結合。加入HRP偶聯山羊抗人Fc抗體檢測結合信號。

如圖7所示，VEGFR2抗體48-H3L1、54-H2L1和Ramucirumab只與VEGFR2結合，而不與VEGFR1和VEGFR3結合，說明這些抗體具有較高的特異性。

4. ELISA中hVEGF-A與hVEGFR2和恆河猴VEGFR2結合的阻斷

0.25μg/ml VEGF-A在4℃包被一夜。阻斷後，同時加入系列稀釋54-H2L1、48-H3L1、Ramucirumab和1μg/ml人VEGFR2或恆河猴VEGFR2孵育2小時。洗淨後，加入含有多株VEGFR2抗體和HRP偶聯山羊抗小鼠Fc抗體的小鼠血清，檢測包被板上的游離VEGF-A(見圖8和圖9)。

如圖8和9所示，兩種人源化抗體可以阻斷VEGF-A與人VEGFR2或恆河猴VEGFR2的相互作用。48-H3L1和54-H2L1的中和活性與Ramucirumab相似，甚至可能更好。

5.人源化抗體與hVEGFR2在HUVEC上的結合(FACS檢測)

收集Log相HUVEC細胞並添加到每個試管中。然後加入100μl/管的FACS緩衝液系列稀釋人源化抗體，4℃保存1小時。在第1抗體之後加入第2抗體(anti-hIgG(H+L)-PE)的PE信號檢測抗體與HUVEC的結合(見圖10)。

6.阻斷hVEGF-A可誘導HUVEC中hVEGFR2磷酸化

將HUVEC細胞在含10%胎牛血清的培養基中接種到12孔板中，孵育16h，然後無血清饑餓4h。每孔加入稀釋的人源化抗體孵育30min，然後加入VEGF-A 40ng/ml孵育15min。最後，製備細胞裂解液，用Western Blot方法檢測phospho-VEGFR2和β-actin，如例13所示。(見圖11)。

如圖11所示，人源化的54的兩種變體可以減少VEGF-A誘導的磷酸化VEGFR2的數量。54-H2L1的抑制作用強於54-H1L1。

實施例7：純化的人源化抗體抑制HUVEC增殖和微管形成能力的評價

對數期HUVEC細胞在含10%胎牛血清的培養基中，以5×10³細胞/孔的密度播種於96孔板中，在37℃、5% CO₂培養箱中孵育過夜，然後以50μl/孔的無血清培養基饑餓4h。系列稀釋人源化抗體加入50μl/孔孵育30min，再加入VEGF-A 50μl/孔(終濃度：20ng/ml)孵育72h。在細胞培養結束時，加入20μl/well的cell Titer-Glo®Luminescent kit，將上清轉移到新的白色板上進行發光信號讀取。被VEGF家族刺激的HUVEC細胞會被激活並增殖。阻斷VEGFR2和VEGF可逆 轉刺激作用。如圖12所示，人源化54和48抗體與Ramucirumab一樣具有抑制增殖的作用，且呈劑量依賴性，說明它們阻斷了HUVEC細胞的VEGF/VEGFR2信號通路。

實施例8：本發明抗VEGFR2抗體的低濃度液體製劑

材料與方法

1.下述試驗中所使用的抗VEFGR2抗體為54-H2L1。

2.下述試驗中所用的設備、試劑、儀器即方法見下。

表8-1設備

表8-2試劑

表8-3耗材

所用方法如下：

1.外觀：採用目視法，將樣品瓶擦拭乾淨，在1500Lx的光照強度下，置於澄明度檢測儀黑背景和白背景前觀察樣品顏色、澄清度以及是否有可見顆粒。

2.pH值：採用電位法，將pH計用標準液校準後，取100μL樣品測定pH值，重複測定2次，取平均值為最終結果。

3.蛋白質含量：採用紫外分光光度法，用超純水將樣品稀釋至約1mg/mL，藉由NanoDrop 2000測定樣品在280nm波長吸收並計算樣品濃度，消光係數為1.401 AU* mL* mg-1 *cm-1，樣品濃度由儀器根據消光係數直接得出。重複測定兩次取其均值並乘上稀釋倍數，作為最終結果。

4.蛋白溶液濁度測試(A350)：取100μL樣品溶液加入到96孔板，以對應的緩衝液作為空白對照，採用酶標儀SpectraMax測定樣品和緩衝液在不 同考察點350nm波長下的吸收值，取樣品與空白對照的差值為樣品350nm的OD值。

5.滲透壓：採用冰點下降法，確認滲透壓儀經過校準。取20μL樣品用滲透壓儀檢測，平行檢測290mOsm/kg標準品以確認檢測結果是否準確。

6.差示量熱掃描(DSC)：本實驗按照DSC測試系統測試樣品標準操作規程對樣品進行掃描，測定Tm值。樣品用對應的緩衝溶液稀釋至1mg/mL，取400μL樣品加入到96孔板的偶數孔，相應的緩衝液取400μL加入到奇數孔，掃描溫度設置為10~110℃，掃描速率為200℃/hr。數據分析採用MicroCalVP-Capillary DSC自動分析軟體。

7.不溶性微粒測試(HIAC)：參照SOP文件：FFF-EQU-030-03，啟動HACH顆粒計數儀，用超純水清洗管路和系統。待測試環境藉由後，測試純水中不溶性微粒，待顆粒數檢測為零，則開始上樣測試。測試參數如下：進樣體積：0.60mL，4次進樣測試，檢測通道為2μm、10μm、25μm，舍去第一次結果後，取後三次結果平均值作為最終結果。

8.不溶性微粒測試(MFI)：啟動MFI5200儀器和MVSS軟體，用已過濾的超純水和Decon 90沖洗管路和系統，待清洗結束之後測試標準粒子，若標準粒子檢測藉由，開始測試樣品中不溶性微粒，進樣體積1.5mL，待測試結束則採用MVAS處理數據並分析結果。

9.動態光散射(DLS)：動態光散射奈米粒度檢測法是基於樣品中粒子布朗運動產生動態光強變化計算得到粒子的粒徑和分佈。取40μL樣品加入微量樣品池中，採用Malvern公司的Nano ZS粒度儀對樣品進行檢測，樣品無需稀 釋和過濾，經Zetasizer Nano軟體進行分析後，測定出樣品的粒徑(Z-averagesize)及多分散係數(PdI)。

10.體積排阻高效液相色譜(SEC-HPLC)：採用凝膠色譜管柱對樣品的各組分進行分離，以中性pH的緩衝液作為流動相，各組分按照體積由大到小的順序依次被洗出，在280nm下進行檢測。採用峰面積歸一化法得到高聚體、單體和低分子量含量。具體方法為：將樣品稀釋至10mg/mL，採用TSKgelG3000SWXL色譜管柱，流動相為50mM PB，300mM NaCl，pH6.8±0.1，進樣體積為10μL，在1.0mL/min的流速下，等度沖提20分鐘，280nm波長下進行檢測，採用峰面積歸一化法計算得到單體的含量。

11.陽離子交換高效液相色譜(CEX-HPLC)：CEX-HPLC檢測採用Agilent1260或同類系統，BioLC ProPac WCX-10色譜管柱(4×250mm)。流動相組成為：A：20mM MES，pH 6.1±0.1；B：20mM MES+500mM NaCl，pH6.1±0.1，流速為1.0mL/min。管柱溫30℃，自動進樣器溫度2~8℃，梯度沖提，分析時間60分鐘，檢測波長為280nm，樣品濃度稀釋至1.0mg/mL，進樣量100μL，採用峰面積歸一化法計算樣品的主峰，酸性峰和鹼性峰的含量。

12.毛細管等電聚焦電泳(cIEF)：毛細管等電聚焦電泳是藉由蛋白在pH梯度內電荷的不同來分離蛋白的一項技術。配製預混液：0.5μL PI標記物6.14，0.5μL PI標記物9.46，1μL兩性電解質3-10，3μL兩性電解質8-10.5，40μL高純水，35μL 1% MC(羥甲基纖維素)。將樣品用高純水稀釋到1mg/mL，然後取20μL樣品加入到80μL預混液中，混合均勻後上樣檢測，測試按照SOP設置參數，聚焦參數為1500V 1分鐘，3000V 8分鐘。儀器使用的是ProteinSimpleiCE 3毛細管等電聚焦分析儀配置PrinCE自動進樣器。

13.非還原性十二烷基硫酸鈉毛細管凝膠電泳(非還原性CE-SDS)：非還原性十二烷基硫酸鈉毛細管凝膠電泳是藉由蛋白分子量大小的不同來檢測樣品中不同蛋白組分的一項技術。將樣品用稀釋液(PB-CA Buffer)稀釋到4.0mg/mL；取25μL至離心管中，再加入75μL SDS樣品緩衝液(1%SDS PB-CA Buffer)及5μL烷基化試劑(100mM NEM)混勻；6000rpm離心1分鐘；轉移至金屬浴60℃反應10分鐘。取出室溫水浴冷卻至少3分鐘。將樣品置於離心機中約6000rpm離心1分鐘。然後取90μL樣品加入到200μL塑料管中後上樣檢測。設置電壓進樣-5kV持續20秒，-15kV分離35分鐘。儀器使用的是Beckman PA800 Plus毛細管電泳儀。

14.還原性十二烷基硫酸鈉毛細管凝膠電泳(還原性CE-SDS)：還原性十二烷基硫酸鈉毛細管凝膠電泳是藉由蛋白分子量大小的不同來檢測樣品中被還原後不同蛋白組分的一項技術。將樣品用稀釋液(PB-CA Buffer)稀釋到4.0mg/mL；取25μL至離心管中，再加入75μL SDS樣品緩衝液(1%SDS PB-CA Buffer)及5μL還原劑(BME)混勻；6000rpm離心1分鐘；轉移至金屬浴65℃反應10分鐘。取出室溫水浴冷卻至少3分鐘。將樣品置於離心機中約6000rpm離心1分鐘。然後取90μL樣品加入到200μL塑料管中後上樣檢測。設置電壓進樣-5kV持續20秒，-15kV分離30分鐘。儀器使用的是Beckman PA800 Plus毛細管電泳儀。

15.生物學活性檢測：HUVEC細胞是人臍靜脈內皮細胞株，血管內皮生長因子VEGF藉由與血管內皮細胞表面受體VEGFR2特異性結合調控內皮細胞增殖、血管生成等功能。WBP2061單株抗體藉由與VEGFR2特異性結合，阻斷VEGFR2與VEGF的相互作用，從而抑制人臍靜脈內皮細胞HUVEC 的增殖。因此藉由考察藥物抑制人臍靜脈內皮細胞HUVEC細胞的增殖來檢測其生物學活性。取2~5代且融合率為75%~85%的HUVEC細胞，吸去培養基後用DPBS洗滌，再用胰酶室溫消化1-3分鐘後加入TNS終止，用EBM-2基礎培養基對殘留細胞吹洗，200g離心6分鐘後棄上清，用1mLEBM-2基礎培養基重新懸浮細胞，在用EBM-2基礎培養基補齊至30mL，200G離心6分鐘後棄上清，如此洗滌1~2次；之後用5~20mL EBM-2分析培養基重新懸浮細胞，細胞計數後將細胞調整到指定密度；將細胞以100μL/孔鋪入96孔細胞培養板，37℃、5%二氧化碳培養箱中培養3~4h；之後將稀釋好的參考品、質控品、供試品以50μL/孔鋪入96孔細胞培養板所對應的孔中，其餘孔以50μL/孔EBM-2分析培養基補齊至150μL/孔，輕拍混勻；再將稀釋好的VEGF工作液以50μL/孔加入到96孔細胞培養板所對應的孔中，其餘孔以50μL/孔EBM-2分析培養基補齊至200μL/孔，輕拍混勻後37℃、5%二氧化碳培養箱中培養68-74h；之後取出培養板，300g離心3分鐘，每孔棄去100μL上清，平衡至室溫後加入100μL/孔Celltiter Glo，避光震盪10分鐘，常溫避光靜置5-20分鐘後將96孔細胞培養板中液體混勻後轉入96孔白板中，置於酶標儀中讀板。用四參數對WBP2061抗體濃度(x)和Luminescence值(y)進行擬合，得到S型曲線的A、B、C及D值。x為自變量，四參數中，A是曲線左平臺值，B是曲率參數，C為半數有效量(IC50)，D為曲線右平臺值。在滿足方法系統適應性和供試品適應性可接收標準的前提下，根據標準品和供試品的IC50值可以計算供試品當相對活性，公式如下：供試品相對活性(%)=(標準品的IC50值/供試品的IC50值)×100%。

結果與討論

實驗1：pH篩選實驗

1.實驗設計

根據國內外單株抗體藥物常用緩衝體系的應用情況，結合抗VEGFR2單株抗體等電點為7.9的自身特性，選擇枸櫞酸/枸櫞酸鈉、組胺酸/鹽酸組胺酸、組胺酸/鹽酸組胺酸/氯化鈉3個緩衝體系，從pH值5.0到6.5設計了8個不同待考察緩衝體系。此外，考慮到可能在後期採用高濃度的劑型，因此在組胺酸/鹽酸組胺酸緩衝體系中增加60mg/mL的篩選條件。具體參見表8-4。在料液製備過程中，首先將抗VEGFR2抗體原液超濾換液至8個目標緩衝體系中，分別按照預設計劃調節蛋白質含量至約10mg/mL或約60mg/mL，待換液結束，進行除菌過濾，取1mL樣品灌裝於2R中硼矽玻璃管製注射劑瓶，加塞軋蓋後放置於5±3℃、25±2℃、40±2℃三個不同溫度條件下進行考察，按照表8-4計劃在預設時間點進行取樣分析，結合分析檢測結果對8種緩衝體系進行篩選和評估。

表8-4 pH篩選實驗設計

2.實驗結果

根據預先設計的實驗條件對8個不同的緩衝體系進行了相應的考察，並取樣檢測。結果如下：其中，8個製劑緩衝體系樣品的DSC掃描結果統計見表8-5。其它檢測結果統計見表8-6、表8-7和表8-8，以及圖13、圖14和圖15。

表8-5緩衝體系篩選檢測結果匯總-T0取樣點DSC檢測結果

表8-6緩衝體系篩選檢測結果匯總(5±3℃)

表8-7緩衝體系篩選檢測結果匯總(25±2℃/60±5%RH)

表8-8緩衝體系篩選檢測結果匯總(40±2℃/75±5%RH)

3.分析討論

(1)DSC的掃描結果顯示，抗VEGFR2抗體的F1、F2和F4的Tm Onset、Tm1值相對較低，F6和F8的Tm Onset值相對較高，其餘緩衝體系基本一致。

(2)外觀、蛋白質含量、pH和A350濁度考察結果顯示，8種緩衝體系在不同考察條件和取樣點的檢測結果基本一致，表明這四個考察項均較穩定。但在A350濁度考察項中(圖13)，由於F5中蛋白濃度較其他緩衝體系的高，因此表現出較高的OD值。

(3)純度考察項(SEC-HPLC)結果顯示，抗體蛋白在40℃考察4週後，F1-F8緩衝體系中單體純度均有所下降，除F5單體純度降低趨勢較大外(降低到96.3%)，而其餘緩衝體系單體純度下降趨勢較一致。F5單體純度下降趨勢 較大，主要是因為由於高蛋白濃度(60mg/ml)料液在強制條件下具有更易形成聚體的傾向。

(4)電荷異質體(cIEF)的考察結果顯示，樣品在40℃考察4週後，F1、F7和F8的主峰含量相對其他緩衝體系降低較多，分別降低到46.2%、43.4%和48.3%，說明抗VEGFR2抗體在枸櫞酸/枸櫞酸鈉緩衝體系以及低pH的組胺酸/鹽酸組胺酸緩衝體系中穩定性較差；而F2、F3、F4、F5和F6中主峰下降趨勢較小，分別比T0降低了17.9%、15.7%、14.3%、16.9%和17.6%，故pH 5.5-6.5都滿足要求，其中F3、F4和F5的主峰下降幅度略優於F2和F6，說明抗VEGFR2抗體的電荷異質性在pH 6.0的組胺酸/鹽酸組胺酸緩衝體系(pH 6.0)中相對更穩定。

綜合以上考察結果，可以看出：抗VEGFR2抗體在枸櫞酸/枸櫞酸鈉緩衝體系中表現出較差的電荷異質體穩定性，因此選擇穩定性較強的組胺酸/鹽酸組胺酸緩衝體系；而在組胺酸/鹽酸組胺酸緩衝體系中，pH 6.0的組胺酸/鹽酸組胺酸緩衝體系在各考察項中表現均較為良好，因此選擇該緩衝體系作為抗VEGFR2抗體的最終緩衝體系，進行後續的輔料和表面活性劑篩選實驗。

實驗2：溶解性能研究

1.實驗設計

根據緩衝體系篩選結果，對抗VEGFR2抗體在pH 6.0組胺酸/鹽酸組胺酸緩衝體系中的溶解度進行了研究。首先，將抗VEGFR2抗體的原液換液至pH6.0組胺酸/鹽酸組胺酸緩衝體系中，分別將原液超濾濃縮至表8-9中的三個不同濃度，除菌過濾後取1mL樣品灌裝於已經滅菌的2 R中硼矽玻璃管製注射劑瓶中，加塞軋蓋後進行考察，本次考察條件為25±2℃考察3天。考察計劃詳見表8-9。

表8-9溶解性能研究方案

2.結果分析

抗VEGFR2抗體的溶解性能研究結果見表8-10：其中，黏度結果顯示，在pH 6.0的組胺酸/鹽酸組胺酸緩衝體系中，隨抗VEGFR2抗體蛋白濃度的升高，處方整體黏度逐漸增加；純度(SEC-HPLC)結果顯示，三種不同濃度的抗VEGFR2抗體在pH 6.0組胺酸/鹽酸組胺酸中純度沒有明顯差異，說明抗體蛋白不會在濃縮過程中隨著濃度增加而發生明顯聚集，且60mg/mL抗體蛋白在25±2℃條件下放置3天，SEC-HPLC純度無顯著變化，由此可以看出高濃度的抗VEGFR2抗體在組胺酸/鹽酸組胺酸緩衝體系中具有一定的短期穩定性。

表8-10溶解性能研究方案

實驗3：輔料和表面活性劑篩選實驗

1.實驗設計

將抗VEGFR2抗體注射液的蛋白質含量設置為約20mg/ml。同時，綜合考慮前期緩衝液體系篩選和溶解性能研究結果，設計並實施了以下6個製劑處方進行輔料和表面活性劑篩選試驗，包括不同濃度的PS80和不同的輔料組成。

將抗體原液(編號：2061SD170112H01X01I01-4)換液至不同處方中，調節蛋白質含量至約20mg/ml，除菌過濾後取1ml樣品灌裝於已經滅菌的2R中硼矽玻璃管製注射劑瓶，加塞軋蓋後進行考察，本次考察條件為25℃條件下300rpm振搖、-70±10℃至室溫重複凍融考察和40±2℃高溫考察，藉由考察各處方在不同條件下的穩定性篩選出較優處方。考察計劃詳見表8-11。

表8-11輔料和表面活性劑篩選研究方案

2.結果分析

按照預先設計的實驗計劃，在不同的實驗條件以及不同的時間點進行考察，實驗結果如下：6個製劑處方樣品的DSC掃描結果統計見表8-12。其他檢測結果統計表分別見表8-13、表14和圖16、圖17。

(1)DSC考察結果顯示(表8-12)，抗VEGFR2抗體在F10和F12處方中的Tm Onset值相對較高，分別為67.9℃和68.0℃，F11處方的Tm Onset值 較低，為64.5℃，F9、F13和F14處方中抗體的Tm Onset值基本一致，表明不同含量PS80對於抗VEGFR2抗體的熱穩定性影響較小。

(2)抗VEGFR2抗體在強制條件(40±2℃/75±5%RH)下經過2週和4週的考察結果顯示(表8-13)，被考察處方F9-F12中的蛋白質含量、pH值基本一致，表明抗VEGFR2抗體在F9-F12四個處方中蛋白質含量和pH值均較穩定。藉由DLS測定的粒徑數據表明，抗體在F11處方中的平均粒徑較大，與其外觀觀察中乳光較嚴重的結果一致，表明抗VEGFR2抗體在F11處方中的穩定性較差。

(3)在純度(SEC-HPLC)考察項中，樣品在強制條件(40±2℃/75±5% RH)下考察4週後，抗體在處方F10、F11和F12中單體純度降低程度比較一致，分別降低到95.1%、94.9%和95.1%，處方F9中的單體純度下降程度相對較小，為95.7%。

(4)在電荷異質體(cIEF)的考察項中，樣品在強制條件(40±2℃/75±5%RH)下考察4週後，4種處方中抗體的電荷異質體變化趨勢較為一致，無明顯區別。

(5)振搖和凍融結果顯示(表8-14)，在300rpm的振搖速度下經過7天的振搖和5個循環重複凍融(-70℃至25℃)，蛋白的外觀、含量、pH、SEC-HPLC、DLS、cIEF等考察指標無明顯變化。不溶性微粒考察結果顯示，凍融和振搖後處方F9、F13、F14三個樣品

10μm的顆粒數均有所增加，

25μm的顆粒數無明顯變化。

綜合以上實驗結果可以看出，在輔料篩選中，抗VEGFR2抗體在F9處方(20mg/ml抗VEGFR2抗體、10mM組胺酸/鹽酸組胺酸、200mM蔗糖、 0.01% PS 80、pH 6.0)中的純度(SEC-HPLC)、電荷異質體(cIEF)和顆粒粒徑這三個檢測指標較F10-F12三個備選處方具有較好的穩定性，因此選擇F9中的200mM蔗糖作為抗VEGFR2抗體的最優輔料組成；而在表面活性劑濃度選擇上，F9、F13和F14的實驗結果(見表8-12，表8-14)顯示不同的表面活性劑濃度對於蛋白的穩定性並沒有明顯的區別，因此選擇中間濃度即0.02%的PS80濃度作為本製劑處方的表面活性劑濃度。綜上所述，最終選擇F13(10mM組胺酸/鹽酸組胺酸、200mM蔗糖、0.02% PS 80，pH 6.0)處方作為抗VEGFR2抗體的最優處方，並進行後續的處方確認實驗。

表8-12 T0取樣點DSC檢測結果匯總表

表8-13 F9~F12不同取樣點的檢測結果匯總表(40±2℃/75±5% RH)

表8-14 F9/F13/F14不同取樣點的檢測結果匯總表(25℃，300rpm振搖和凍融)

實驗4：製劑處方確認試驗

1.實驗設計

為了驗證抗VEGFR2抗體在最優處方F13(10mM組胺酸/鹽酸組胺酸、200mM蔗糖、0.02%PS 80，pH 6.0)中是否具有較好的穩定性，於低溫(-70±10℃)條件、長期(5±3℃)條件、加速(25±2℃/60±5%RH)以及強制條件(40±2℃/75±5%RH)對該製劑處方進行了確認研究。

將抗體原液灌裝於已經滅菌的8R中硼矽玻璃管製注射劑瓶中，每瓶灌裝9.5ml，加塞軋蓋後進行考察，考察條件為低溫(-70±10℃)條件、長期(5±3℃)條件、加速(25±2℃/60±5%RH)條件和強制條件(40±2℃/75±5%RH)，藉由考察該處方在不同條件下的穩定性來進行處方確認。考察計劃詳見表15。

表8-15製劑處方確認研究方案

x=外觀、pH、蛋白質含量、不溶性微粒(HIAC)、SEC-HPLC、CEX-HPLC、CE-SDS(還原和非還原)

y=滲透壓莫耳濃度

z=活性

M=month(月)

2.結果分析

(1)低溫(-70±10℃)穩定性試驗結果

抗VEGFR2抗體低溫(-70±10℃)穩定性試驗主要藉由考察樣品在-70±10℃存放下相關指標的變化，來初步判定樣品在低溫(-70±10℃)條件下的穩定性，低 溫(-70±10℃)穩定性考察結果匯總參見表8-16。本試驗結果顯示，抗體製劑處方樣品在-70±10℃、避光貯存3個月後，所有檢測項目穩定性良好，初步說明了在低溫(-70±10℃)條件下，抗VEGFR2抗體在所選擇的製劑處方裡具有良好的穩定性。

表8-16製劑處方確認低溫(-70±10℃)穩定性考察結果匯總表

(2)長期(5±3℃)穩定性試驗結果

抗VEGFR2抗體長期(5±3℃)穩定性試驗主要是藉由考察樣品在5±3℃長期貯存條件下相關指標的變化，來初步判定樣品的長期貯存溫度下的穩定性，該穩定性研究結果匯總參見表8-17。

本試驗結果顯示抗體製劑處方樣品在5±3℃、避光貯存6個月後所有檢測項目穩定性良好，初步說明了在長期(5±3℃)條件下，抗VEGFR2抗體在所選定的製劑處方裡具有良好的穩定性。

表8-17製劑處方確認長期(5±3℃)穩定性結果匯總表

(3)加速(25±2℃/60±5%RH)穩定性試驗結果

抗VEGFR2抗體加速(25±2℃/60±5%RH)穩定性主要藉由考察樣品在25±2℃加速存放下相關指標的變化，來初步判定樣品在該溫度條件下的穩定性，加速試驗研究結果匯總參見表8-18。

加速(25±2℃/60±5%RH)穩定性考察結果表明：抗體製劑處方樣品在25±2℃條件下，考察3個月，樣品蛋白質含量、外觀、pH、不溶性微粒測試結果都呈現了良好的穩定性；純度(SEC-HPLC、還原性和非還原性CE-SDS)略有下降；電荷異質體(CEX-HPLC)的主峰含量下降了10.6%；生物學活性也呈現下降趨勢，但結果都在可接受範圍內，說明本品在加速(25±2℃/60±5%RH)條件下能夠短期貯存，但不如在(5±3℃)穩定，故長期仍需要貯存在長期(5±3℃)條件下。

表8-18製劑處方確認加速(25±2℃/60±5%RH)穩定性結果總表

(4)強制條件(40±2℃/75±5%RH)穩定性試驗結果

抗VEGFR2抗體強制條件(40±2℃/75±5%RH)穩定性實驗主要藉由考察樣品在40±2℃存放下相關指標的變化，來初步判定樣品在強制條件下的穩定性，強制條件(40±2℃/75±5%RH)穩定性考察結果匯總參見表8-19。

強制條件(40±2℃/75±5%RH)穩定性考察結果表明，抗體在強制條件(40±2℃/75±5%RH)下，雖然其樣品蛋白質含量、pH、不溶性微粒測試結果都呈現了良好的穩定性，但是由於蛋白分子本身的理化和結構特性的影響，一些關鍵指標如純度(SEC-HPLC、CE-SDS)、電荷異質體(CEX-HPLC)均呈現了一定的下降趨勢。其中，在強制條件(40±2℃/75±5%RH)下貯存4週和8週，純度(SEC-HPLC、還原性CE-SDS、非還原性CE-SDS)、電荷異質體(CEX-HPLC)的主峰含量和生物學活性均下降尤為嚴重。由此可以看出抗VEGFR2抗體對於強制條件表現出較差的穩定性，在後續生產、運輸和儲存的過程中需要避免強制條件環境。

表8-19製劑處方確認加速(25±2℃/60±5%RH)穩定性結果總表

(5)總結

綜合上述穩定性試驗數據可以看出：抗VEGFR2抗體在處方F13中的熱穩定性、蛋白質含量、pH、滲透壓莫耳濃度、不溶性微粒、純度上都表現出了較好的穩定性。

i.純度(SEC-HPLC、還原和非還原性CE-SDS)的考察結果顯示低溫(-70±10℃)和長期(5±3℃)條件下考察不同時間後，抗VEGFR2抗體在處方F13中的純度均比較穩定，無明顯變化；加速(25±2℃/60±5%RH)條件下考察3個月，單體純度(SEC-HPLC)下降了2.0%，還原性CE-SDS和非還原性CE-SDS檢測的純度分別下降了1.8%和1.4%；強制條件(40±2℃/75±5%RH)下考察8週，單體純度(SEC-HPLC)下降了5.6%，還原性CE-SDS和非還原性CE-SDS檢測的純度分別下降了4.9%和6.8%。

ii.在電荷異質體(CEX-HPLC)的考察結果顯示，在處方F13中，T0時抗VEGFR2抗體的主峰含量為65.5%；在低溫(-70±10℃)和長期(5±3℃)條件下分別考察3個月和6個月之後，抗體的主峰含量分別為66.2%和65.8%；在加速(25±2℃/60±5%RH)條件下考察3個月之後，抗體的主峰含量為54.9%；強制條件(40±2℃/75±5%RH)下考察8週之後，抗體的主峰含量為33.2%。由此可以看 出，抗體在低溫(-70±10℃)和長期(5±3℃)條件下主峰含量無明顯的變化；在加速(25±2℃/60±5%RH)和強制條件(40±2℃/75±5%RH)下主峰含量下降較快。

低濃度製劑處方開發總結

綜上所述，F13製劑處方能夠保證抗VEGFR2抗體在低溫(-70±10℃)和長期(5±3℃)條件下質量穩定，在加速條件(25±2℃/60±5%RH)3個月和強制條件(40±2℃/75±5%RH)短期2週時蛋白質量變化較小。因此，選擇F13的製劑處方(10mM組胺酸/鹽酸組胺酸、200mM蔗糖、0.02% PS 80，pH 6.0)作為抗VEGFR2抗體的製劑處方。

表8-20抗VEGFR2抗體製劑處方組成

實施例9：本發明抗VEGFR2抗體的高濃度液體製劑

材料與方法

以下所使用的抗VEFGR2抗體為54-H2L1。

表9-1儀器設備

表9-2耗材

表9-3試劑

所使用的方法如下：

1.通用緩衝液製備方法：所有緩衝液的製備均使用特定緩衝液的酸對和鹼基對進行。在目標pH值下，藉由逐漸將其中一對緩衝對(如酸對)加入另一對緩衝試劑(如鹼基對)製備緩衝液。然後用水或其他穩定劑將儲備液稀釋到目標輔料濃度。如果pH值需要上升或下降到目標pH，則使用合適的緩衝液重新調整pH值。

2.樣品製備方法：用透析法將DS緩衝液置換到目標製劑處方中，或者直接將高濃度輔料、表面活性劑加入高濃度DS中，然後將DS稀釋至目標濃度。透析方法根據使用的耗材可以分為以下兩種：(1)如果目標製劑的處方與DS中的緩衝液不同，則使用透析方法將DS緩衝液置換為目標製劑處方(表面活性劑不可藉由透析方法加入)。將樣品裝入SnakeSkin^®透析袋，密封後，放入體積大約是樣品量100到200倍的緩衝液中。透析進行3次，持續時間分別為4小 時，4小時和過夜，攪拌速度為200rpm。然後移取適量的表面活性劑和其他輔料儲備液加入樣品溶液中，並將樣品溶液稀釋至目標濃度。(2)還可使用Slide-A-Lyzer透析卡進行透析。使用帶針注射器將3-12ml樣品裝入透析卡內，浸入100到200倍的目標緩衝液中，在室溫下以300轉/分攪拌將透析卡持續透析三次，時間分別為4小時、4小時和過夜。

3.外觀：藉由YB-2澄明度檢測儀檢查黑色和白色背景的外觀。報告透明度，顏色和可見顆粒。

4.pH：藉由安裝有Inlab^®ExpertPro電極的Seven Compact pH計測量樣品pH。在使用前校準pH計。

5.蛋白濃度：藉由Nano Drop 2000分光光度計在280nm處的吸光度測定蛋白質濃度。在整個研究中使用的消光係數(E1%)為14.01mL/mg/cm。每個樣品在2.0μL的加載體積下測量兩次，報告平均濃度。

6.動態光散射儀(DLS)：藉由DLS使用以下測量條件測定蛋白質大小分佈：採集時間：5s，每次測量採集：20次，溫度：25℃。

7.利用DLS測定k _D 值：將樣品用相應的緩衝液稀釋至濃度為1、2、4、8、12、16、20mg/mL，利用DLS對其k _D 值進行分析，採集時間：5s，每次測量採集：20次，溫度：25℃。

8.利用DLS測定黏度：將待測樣品與直徑為100nm的標準粒子混合，標準粒子的終濃度為1%，利用DLS測得標準粒子的表觀粒徑，採集時間：5s，每次測量採集：20次，溫度：25℃，並藉由軟體計算出體系的黏度。

9.利用DLS測定T_onset值：將樣品用相應緩衝體系稀釋至目標濃度並加入樣品孔中，並加入適量矽油覆蓋住孔內的樣品，設置DLS線性升溫， 得到粒徑-溫度曲線，藉由軟體計算樣品的T_onset。溫度範圍：25~80℃，測量頻率：1℃/次，採集時間：3s，每次測量採集5次。

10.體積排阻色譜(SEC)：蛋白聚集情況使用Waters H Class超高效液相色譜儀和Waters BEH Protein SEC管柱(150×4.6mm，1.7μm)藉由SEC方法測定。流動相為50mM磷酸鈉緩衝液，300mM NaCl，pH 6.8±0.1。流速為0.4mL/min。將樣品稀釋至2mg/mL，檢測體積10μL，檢測波長為280nm。

11.陽離子交換色譜(CEX)：蛋白的電荷異質性藉由CEX方法進行測定。液相系統為Agilent 1260 Infinity，色譜管柱為Thermo Mabpac SCX-10 BioLC column(4×250mm,10μm)。樣品混合均勻，離心並轉移上清，然後用流動相A稀釋至2.0mg/mL。色譜條件如下表所示。

12.非還原毛細管電泳(NR-CE-SDS)：蛋白碎片情況藉由NR-CE-SDS方法進行測定。將標準品或供試樣品用磷酸-檸檬酸緩衝液稀釋至4mg/mL，然後取25μL與75μL SDS樣品緩衝液和5μL NEM(100mM N-乙基馬來醯亞胺)渦旋混合進行變性處理。變性的樣品經離心後，在70±2℃下孵育10±2min，在室溫下冷卻，然後再次離心。樣品的分離包括進樣前的鹼性、酸性沖洗、Milli-Q水沖洗和沖洗後的SDS凝膠灌注。樣品採用電壓進樣，5kV持續20秒。樣品採用恆電壓分離，本方法加正向電壓15kV。用冷凝液使毛細管溫度保持在25 ℃。系統每12次分離更換一瓶新的鹼性沖洗液，每12次分離更換1瓶新的蘸洗用Milli-Q水，每12次分離更換一瓶新的酸性沖洗液和毛細管清洗用Milli-Q水，每12次分離更換一瓶新的SDS凝膠。

13.蛋白溶液濁度測試(OD405)：藉由Envision多功能微孔板檢測儀對樣品濁度進行檢測。以緩衝液為空白對照，測得樣品與空白對照的差值為樣品405nm的OD值。

14.微流成像系統(MFI)：藉由微流動成像5200測定指定尺寸(1-10μm，10-25μm和>25μm)的亞可見顆粒的數量。簡言之，根據儀器手冊注射500μL每種樣品至MFI儀器中。報告了每毫升平均顆粒數以及顆粒圖像。

結果與討論

實驗1：輔料篩選實驗

1.實驗設計

樣品處方信息和檢測方法如表9-4所示。UFDF樣品用相應的輔料儲備液稀釋至約80mg/mL，最後用0.22μm PES膜過濾製備得到。樣品製備完成後對其外觀，濃度，滲透壓，黏度，k_D，T_onset進行測定。

表9-4輔料篩選實驗設計方案

2.實驗結果

(1)外觀、濃度，滲透壓和黏度結果

各組樣品的外觀、濃度，滲透壓和黏度結果如表9-5所示，其中F15、F20和F23三組樣品乳光比其他樣品的乳光更重。F21和F22的黏度最低，而F15、F20和F23三組樣品由於在檢測過程中表觀粒徑過大而無法準確計算出黏度。

表9-5外觀、濃度、滲透壓和黏度結果

(2)k_D值結果

各組處方的k _D 值結果如表9-6所示，各組處方中蛋白濃度和擴散係數的關係如圖17所示。k _D值是一種相互作用參數，反應了體系內分子之間的相互作用關係，由結果可知，F15、F20和F23三組樣品k _D 值為負數，表明在這三種處方中，蛋白分子之間的作用力為淨吸引力，不利於蛋白的長期穩定性。

表9-6 k_D值結果

(3)T_onset結果

各組處方的T_onset結果如表9-7所示，各組處方中粒徑和溫度的關係如圖6所示。由結果可知，F20和F232組處方T_onset值最低，其餘處方中的樣品T_onset均超過70℃，表明除F20和F處方以外，其餘處方均具有良好的熱穩定性。

表9-7 T_onset值結果

3.總結

其中F15、F20和F23，3組樣品乳光比其他樣品的乳光更重，同時，該3組樣品黏度無法準確測量，且k _D 值為負數。除F20和F23兩組處方以外，其餘處方均具有良好的熱穩定性。9組處方中，F21和F22的黏度值最低，給後續設計成為眼內注射劑提供了便利。F16和F17黏度值也符合要求，且其熱穩定性較好。

實驗2：表面活性劑篩選實驗

1.實驗設計

樣品處方信息，穩定性實驗放置條件和檢測項目如表9-8所示。在原液中加入緩衝液儲備液，1M的L-脯胺酸儲備液和不同種類的表面活性劑，將蛋白濃度稀釋至約80mg/mL，將緩衝液、L-脯胺酸和表面活性劑調整至目標濃度，最後用0.22μm PES膜過濾製備得到。取2mL至6R西林瓶中進行攪拌和凍融試驗。

表9-8表面活性劑篩選實驗設計方案

2.實驗結果

(1)攪拌實驗結果

如表9-9所示，各組樣品T0均為澄清溶液。在100rpm攪拌15小時和300rpm攪拌2小時後，F24和F25的樣品均觀察到可見微粒，F26、F27和F28的樣品呈現輕微乳光。樣品濃度無明顯變化。T0樣品的pH值符合要求。

表9-9外觀、濃度和pH結果_攪拌實驗

如表9-10所示，5組樣品在100rpm攪拌15小時和300rpm攪拌2小時後，蛋白粒徑增加明顯，單體的質量分佈百分比降低。但是F25在攪拌後單體質量分佈百分比下降最少，總體粒徑也最小，表現出更好的對抗攪拌的物理穩定性。

表9-10 DLS結果_攪拌實驗

如表9-11至9-13所示，5個處方的樣品在100rpm攪拌15小時和300rpm攪拌2小時後，SEC、NR-CE-SDS和CEX的純度均無明顯變化。

表9-11 SEC結果_攪拌實驗

表9-12 NR-CE-SDS結果_攪拌實驗

表9-13 CEX結果_攪拌實驗

如表9-14所示，100rpm攪拌15小時的5個樣品由於乳光較重，F24在300rpm攪拌2小時有較多沉澱，為避免損壞儀器，因此不做MFI檢驗。4個處方的樣品在300rpm攪拌2小時後，不溶性微粒的數量均有明顯的增加，其中F28樣品形成的大於10μm和25μm的亞可見顆粒最少。

表9-14 CEX結果_攪拌實驗

(2)凍融實驗結果

如表9-15所示，在凍融3次和5次後，F24樣品變渾濁，其餘各組樣品均為澄清溶液。樣品蛋白含量無明顯變化。

表9-15 CEX結果_凍融實驗

如表9-16所示，5組樣品在凍融5次後，蛋白總體粒徑略微有些增加。其中F24組的單體的質量分佈百分比降低，顯示其凍融穩定性較低。

表9-16 DLS結果_凍融實驗

如表9-17至9-19所示，5個處方的樣品在凍融5次後，SEC、NR-CE-SDS和CEX純度均無明顯變化。

表9-17 SEC結果_凍融實驗

表9-18 NR-CE-SDS結果_凍融實驗

表9-19 CEX結果_凍融實驗

由於F24凍融後的樣品變渾濁，為避免損壞儀器，因此不對F24樣品進行MFI檢測。如所示，4個處方的樣品在凍融3次和5次後，粒徑大於10μm和25μm的不溶性微粒的數量增加並不明顯。

表9-20 MFI結果_凍融實驗

3.總結

由攪拌實驗可知，攪拌對所有樣品的粒徑、可見異物、亞可見異物的數量均有影響，但樣品的SEC、NR-CE-SDS和CEX結果均沒有明顯變化。MFI結果表明F24和F25在攪拌下產生較多的亞可見微粒，而F28結果最好，其次為F26和F27。

實驗3：組合篩選實驗

1.實驗設計

樣品處方信息，穩定性實驗放置條件和檢測項目如表9-21所示。該方案以F36(10mM Histidine,pH6.0,230mM Prolin,0.02% PS80)作為固定處方，藉由控制單因素變量考察了緩衝體系(F29/30/31/32/36)，輔料(F33/34/35/36/37)，表面活性劑(F36/38/39/40)對處方穩定性的影響，因此F36(His,6.0,Pro,0.02PS80)同時出現在三組變量中進行組內比較。在原液中加入Buffer儲備液、輔料儲備液和不同種類、濃度的表面活性劑，將蛋白稀釋至約80mg/mL，最後用0.22μm PES膜過濾製備。分別取1mL至2R西林瓶中以進行凍融試驗，取1.5mL樣品至6R西林瓶中進行攪拌試驗，取0.3mL樣品至1.5mL EP管中進行加速和強制降解實驗。

表9-21組合篩選實驗設計方案

2.實驗結果

(1)攪拌實驗結果

如表9-22所示，在100rpm攪拌4小時和8小時後，所有樣品均變渾濁，但其中pH組中F29，F36，F31渾濁程度較輕，輔料組中各組無差異，表面活性劑組中，F39和F40渾濁程度較輕。OD405和蛋白含量無明顯變化。

表9-22外觀、蛋白含量和OD405結果_攪拌實驗

如表9-23所示，12組樣品在100rpm攪拌4小時和8小時後，蛋白總體粒徑增加明顯，單體的質量分佈百分比普遍降低。其中F36和F39在攪拌後在攪拌後單體質量分佈百分比下降最少，總體粒徑也較小，表現出更好的對抗攪拌的物理穩定性。

表9-23 DLS結果_攪拌實驗

如表9-24和9-25所示，12個處方的樣品在100rpm攪拌8小時後，SEC和CEX純度均無明顯變化。

表9-24 SEC結果_攪拌實驗

表9-25 CEX結果_攪拌實驗

如表9-26所示，12個處方的樣品在100rpm攪拌8小時後，F33、F34、F35、F37、F40的NR-CE-SDS結果比其他處方更好。

表9-26 NR-CE-SDS結果_攪拌實驗

攪拌8H的樣品由於乳光較重，為避免損壞儀器，因此不做MFI檢驗。如表9-27所示，12個處方的樣品在攪拌4小時後，不溶性微粒的數量均有明顯的增加，其中F34、F35、F36、F37樣品中大於10μm、25μm和50μm的可見顆粒最少，其次是F39和F40。

表9-27 MFI結果_攪拌實驗

(2)凍融實驗結果

如表9-28所示，在凍融3次和5次後，F37由澄清變為微乳光狀態，說明該處方不耐受凍融壓力。

表9-28外觀、蛋白含量和OD405結果_凍融實驗

如表9-29所示，12組樣品在凍融3次和5次後，蛋白總體和單體的粒徑未發生顯著性變化。與其他處方相比，F37在凍融後單體質量分佈百分比出現下降，其對凍融的穩定性較差。

表9-29 DLS結果_凍融實驗

如表9-30所示，12個處方的樣品在凍融5次後，除F37的SEC和NR-CE-SDS主峰純度有下降外，其餘處方均無明顯變化。

表9-30 SEC結果_凍融實驗

表9-31 NR-CE-SDS結果_凍融實驗

如表31-32所示，12個處方的樣品在凍融5次後，CEX純度均無明顯變化。

表9-32 CEX結果_凍融實驗

如表9-33所示，12個處方的樣品在凍融3次和5次後，不溶性微粒的數量均有明顯的增加，其中F33、F35樣品中大於10μm、25μm和50μm的可見顆粒最少。

表9-33 MFI結果_凍融實驗

(3)光照實驗結果

如表9-34所示，在光照3天和5天後，各組處方各項指標無顯著性差異。

表9-34外觀、蛋白含量和OD405結果_光照實驗

如表9-35所示，12組樣品在光照3天和5天後，蛋白總體和單體的粒徑，單體質量分佈百分比均未發生顯著性變化。

表9-35 DLS結果_光照實驗

如表9-36至9-38所示，12個處方的樣品在光照3天和5天後，所有處方的SEC、CEX、NR-CE-SDS主峰純度均有所下降，其中F29、F30、F31、F32下降程度較大。

表9-36 SEC結果_光照實驗

表9-37 CEX結果_光照實驗

表9-38 NR-CE-SDS結果_光照實驗

(4)加速和強制降解實驗結果

如表9-39所示，在25℃和40℃分別放置2週和4週後，所有處方樣品的外觀、蛋白含量、OD405均未發生變化。

表9-39外觀、蛋白含量和OD405結果-加速和強制降解實驗

如表9-40所示，9組樣品在25℃和40℃放置2週和4週後，蛋白總體和單體的粒徑未發生顯著性變化。

表9-40 DLS結果-加速和強制降解實驗

如表9-41所示，9個處方的樣品在25℃和40℃放置2週和4週後，SEC主峰純度均無明顯變化。

表9-41 SEC結果-加速和強制降解實驗

如表9-42所示，9個處方的樣品在25℃放置2週和4週後，NR-CE-SDS主峰純度均無明顯變化；在40℃放置2週和4週後，F30、F31、F32和F374組樣品的主峰純度均發生中等程度的下降。

表9-42 NR-CE-SDS結果-加速和強制降解實驗

如表9-43所示，9個處方的樣品在25℃和40℃放置2週和4週後，所有處方的主峰純度均發生了下降，其中F30、F31、F37與其他處方相比，CEX純度下降較大。

表9-43 CEX結果-加速和強制降解實驗

3.總結

(1)在攪拌實驗中，各組樣品在攪拌後外觀、不溶性微粒的數量、DLS各項參數和NR-CE-SDS結果均有所變化，而在SEC，CEX等方面未發現顯著變化。綜合考慮，F29、F33、F34、F35、F36、F37、F39和F40在攪拌實驗中表現出較高的穩定性。

(2)在凍融實驗中，F37處方的各項結果均比其他處方差，因此F37對凍融條件不穩定。

(3)在光照實驗中，各組樣品在光照後外觀、DLS結果沒有明顯變化，但SEC、CEX、NR-CE-SDS的主峰純度均有不同程度的下降。其中，F30、F31和F32的SEC主峰純度下降最多，F29、F30、F31和F32的NR-CE-SDS和CEX主峰下降最多，因此推斷，可能緩衝對和pH對光照的結果會產生影響，當緩衝體系為組胺酸-鹽酸組胺酸，pH為6.0時的處方對光照最穩定。

(4)在加速和強制降解實驗中，樣品在25℃和40℃條件下放置2週和4週時，其外觀，蛋白含量，DLS粒徑和SEC沒有發生明顯變化，處方之間的差異不明顯。但在40℃下NR-CE-SDS和CEX變化較大。其中，F30、F31、F32和F37的NR-CE-SDS主峰下降較多，F30、F31和F37的CEX主峰下降最 多。由此可知，當緩衝體系為組胺酸-鹽酸組胺酸，pH為6.0時的處方加速和強制降解穩定性最好。

綜上所述，在組合篩選中，當pH為6.0時，輔料為蔗糖、蔗糖+脯胺酸、脯胺酸時結果更好，表面活性劑的種類和濃度對結果沒有顯著影響，因此組合篩選中，3組最優處方為F33、F35和F36。

然後將最優的3個處方與低濃度製劑F13處方進行數據對比，如圖19、20、21所示，在熱穩定性實驗中，高濃度的3個處方SEC和CEX結果均優於低濃度處方，但NR-CE-SDS結果稍遜於低濃度處方；在光照穩定性實驗中，高濃度的3個處方的SEC、CEX和NR-CE-SDS結果均優於低濃度處方；在凍融穩定性實驗中，高濃度和低濃度沒有顯著差別。

高濃度製劑處方開發總結

高濃度眼內注射抗體製劑以低濃度製劑的製劑處方為基礎，在已將低濃度製劑開發成穩定的靜脈注射液的前提下，進一步進行全面但初步的眼內注射劑處方研究，研究內容包括輔料篩選、表面活性劑篩選和組合篩選。為了滿足眼內注射製劑的需求，篩選得到的製劑處方提高了抗體濃度，滿足製劑的可見異物、不溶性微粒和黏度等要求，並且初步的穩定性結果與低濃度製劑相似，可用於後期的處方和工藝開發。最優處方包括80mg/mL抗體濃度，pH 6.0的10mM組胺酸和鹽酸組胺酸緩衝液，220mM的蔗糖和0.02%(w/v)的聚山梨酯80。備選處方包括80mg/mL抗體濃度，pH 6.0的10mM組胺酸和鹽酸組胺酸緩衝液，110mM蔗糖+115mM脯胺酸和0.02%(w/v)的聚山梨酯80。另一個備選處方包括80mg/mL抗體濃度，pH 6.0的10mM組胺酸和鹽酸組胺酸緩衝液，230mM脯胺酸和0.02%(w/v)的聚山梨酯80。

以上描述了本發明的示例性實施方案，所屬技術領域具有通常知識者應當理解的是，這些揭露內容僅是示例性的，在本發明的範圍內可以進行各種其它替換、適應和修改。因此，本發明不限於文中列舉的具體實施方案。

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Claims (19)

1. 一種液體抗體製劑，其包含

   (i)抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段；

   (ii)緩衝劑；

   (iii)穩定劑；和

   (iv)表面活性劑。
2. 如請求項1所述的液體抗體製劑，其中該製劑中的抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段的濃度為約10mg/mL至約200mg/mL，例如約10mg/mL至約150mg/mL，約10mg/mL至約100mg/mL，或者為約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200mg/mL，較佳地，該抗體或其抗原結合片段的濃度為約10mg/mL至約50mg/mL、或者約10mg/mL至約30mg/mL、或者約50mg/mL至約100mg/mL、或者約70mg/mL至約90mg/mL，例如約20mg/mL、或者約80mg/mL。
3. 如請求項1或2所述的液體抗體製劑，其中該製劑中的緩衝劑的濃度為約0.1-50mg/ml，例如約0.1-20mg/ml、約0.2-10mg/ml、約0.5-5mg/ml、或約0.5-2mg/ml，例如約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0mg/ml，較佳地，該緩衝劑的濃度為約1-2mg/ml。
4. 如請求項1至3中任一項所述的液體抗體製劑，其中該緩衝劑選自組胺酸、精胺酸、谷胺酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽和三羥甲基胺基甲烷，更佳為組胺酸/鹽酸組胺酸、檸檬酸/檸檬酸鈉、組胺酸/鹽酸組胺酸/氯化鈉，最佳為組胺酸/鹽酸組胺酸。
5. 如請求項1至4中任一項所述的液體抗體製劑，其中該緩衝劑形成的緩衝液為鹽酸-組胺酸緩衝液，該緩衝液的濃度為1-100mmol/L，較佳2-50mmol/L，更佳5-20mmol/L，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mmol/L，最佳該鹽酸-組胺酸緩衝液的濃度為8-12mmol/L，例如10mmol/L。
6. 如請求項1至5中任一項所述的液體抗體製劑，其中該液體抗體製劑的pH值為5.0-7.0，較佳pH 5.0-6.5，更佳pH 5.5-6.5，例如pH 5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5，最佳該液體抗體製劑的pH值為6.0。
7. 如請求項1至6中任一項所述的液體抗體製劑，其中該穩定劑的濃度為約10mmol/L-1000mmol/L，例如約20mmol/L-500mmol/L、約50mmol/L-300mmol/L、或約100mmol/L-250mmol/L，例如約50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300mmol/L，較佳地，該穩定劑的濃度為約200mmol/L，或者約220mmol/L。
8. 如請求項1至7中任一項所述的液體抗體製劑，其中該穩定劑選自糖類例如蔗糖或海藻糖，多元醇例如山梨醇、甘露醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、赤蘚糖醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇等，胺基酸例如精胺酸、脯胺酸、甘胺酸或谷胺酸或其鹽，較佳地，該穩定劑選自蔗糖、脯胺酸或者蔗糖與脯胺酸的組合。
9. 如請求項1至8中任一項所述的液體抗體製劑，其中該穩定劑是蔗糖，並且視需要地該液體製劑不包含其它穩定劑，該液體製劑中的蔗糖濃度為約50mmol/L-300mmol/L，較佳約100mmol/L-250mmol/L，例如約50、60、 70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300mmol/L，更佳地，該蔗糖濃度為約200mmol/L或約220mmol/L。
10. 如請求項1至9中任一項所述的液體抗體製劑，其中該表面活性劑的濃度為約0.01-5g/L，例如約0.05-1g/L、約0.1-0.5g/L，或者約0.1、0.2、0.3、0.4或0.5g/L，較佳地，該表面活性劑的濃度為約0.2g/L。
11. 如請求項1至10中任一項所述的液體抗體製劑，其中該表面活性劑是非離子型表面活性劑，例如普洛尼克(pluronics)、聚山梨酯-80、聚山梨酯-60、聚山梨酯-40、或聚山梨酯-20。
12. 如請求項1至11中任一項所述的液體抗體製劑，其中該液體製劑是注射用溶液劑。
13. 如請求項1至12中任一項所述的液體抗體製劑，其中該液體製劑是靜脈輸注給藥或者注射給藥的製劑，較佳為注射液，更佳為皮下注射液或眼內注射液。
14. 如請求項1至13中任一項所述的液體抗體製劑，其中該液體製劑用於對眼或眼組織直接施用，例如，對眼局部施用或者對眼或與眼結合的組織注射來施用，例如藉由眼內注射、眼周注射、視網膜下注射、玻璃體內注射、跨隔膜注射、鞏膜下注射、脈絡膜內注射、前房內注射、結膜下注射、眼球筋膜下注射、眼球後注射、眼球周注射或後鞏膜旁遞送來施用，或者對玻璃體、視神經、房水、鞏膜、結膜、鞏膜和結膜之間的區域、視網膜脈絡膜組織、黃斑或眼中或靠近眼的其他區域施用。
15. 如請求項1至14中任一項所述的液體抗體製劑，其中該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含重鏈HCDR1、HCDR2和HCDR3和/或輕鏈LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中，

    該HCDR1序列包含X ₁ YGMS(SEQ ID NO：11)；

    該HCDR2序列包含SISX ₂ GGSYTYYADSVX ₄ G(SEQ ID NO：12)；

    該HCDR3序列包含EX ₃ DGNYDY(SEQ ID NO：13)；

    該LCDR1序列包含RSSKSLLYKDGKTYLN(SEQ ID NO：4)；

    該LCDR2序列包含LMSTRAS(SEQ ID NO：5)；

    該LCDR3序列包含QQLVEYPFT(SEQ ID NO：6)；

    其中X₁是I或M，X₂是V或I，X₃是L或M，且X₄是E或K；

    較佳地，其中該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：1所示的HCDR1，如SEQ ID NO：2所示的HCDR2以及如SEQ ID NO：3所示的HCDR1；和如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，如SEQ ID NO：5所示的HCDR1以及如SEQ ID NO：6所示的HCDR1；或該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：8所示的HCDR2以及如SEQ ID NO：9所示的HCDR1；和如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，如SEQ ID NO：5所示的HCDR1以及如SEQ ID NO：6所示的HCDR1；或該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：10所示的HCDR2以及如SEQ ID NO：9所示的HCDR1；和如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，如SEQ ID NO：5所示的HCDR1以及如SEQ ID NO：6所示的HCDR1；或該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：8所示的HCDR2以及如SEQ ID NO：3所示的HCDR1；和如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，如SEQ ID NO：5所示的HCDR1以及如SEQ ID NO：6所示的HCDR1；或該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：10所示的HCDR2以及如SEQ ID NO：3所示的HCDR1；和如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，如SEQ ID NO：5所示的HCDR1以及如SEQ ID NO：6所示的HCDR1；

    更佳地，其中該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：27的重鏈可變區序列；

    更佳地，其中該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的輕鏈可變區序列；

    更佳地，其中該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：14的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：15的輕鏈可變區；或該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：16的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：17的輕鏈可變區；該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：18的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：19的輕鏈可變區；該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：21的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：24的輕鏈可變區；該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：21的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：25的輕鏈可變區；該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：22的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：24的輕鏈可變區；該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：22的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：25的輕鏈可變區；該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：27的重鏈 可變區和包含SEQ ID NO：24的輕鏈可變區；該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：27的重鏈可變區和包含SEQ ID NO：25的輕鏈可變區；

    更佳地，其中該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37的重鏈；和包含SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：36的輕鏈；

    更佳地，其中該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：33的重鏈和包含SEQ ID NO：34的輕鏈；或該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：35的重鏈和包含SEQ ID NO：34的輕鏈；或該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：33的重鏈和包含SEQ ID NO：36的輕鏈；或該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：35的重鏈和包含SEQ ID NO：36的輕鏈；或該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：37的重鏈和包含SEQ ID NO：34的輕鏈；或該抗VEGFR2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：37的重鏈和包含SEQ ID NO：36的輕鏈。
16. 如請求項1至15中任一項所述的液體抗體製劑，其用於在個體中治療人VEGFR2表達陽性的疾病，例如腫瘤或血管生成疾病。
17. 一種如請求項至15中任一項所述的液體抗體製劑在製備用於治療人VEGFR2表達陽性的疾病，例如腫瘤或血管生成疾病的藥物中的用途。
18. 一種治療個體中VEGFR2相關疾病或病症例如腫瘤或血管生成疾病、降低其嚴重性和/或減緩其進展的方法，包括向個體施用治療有效量的如請求項1至15中任一項所述的液體抗體製劑。
19. 一種製備如請求項1至15中任一項所述的液體抗體製劑的方法，其包括以下步驟：

    a.提供抗VEGFR2抗體；

    b.加入緩衝劑和穩定劑；

    c.加入表面活性劑；

    d.視需要地無菌過濾，得到液體製劑。

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