TW202409278A - 包含MicroRNA靶位點的調節序列 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種單離之核酸序列,其包含miR183家族之miRNA靶位點的至少兩個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中任一者具有至少90%同一性的序列。本發明亦關於包含調節元件之載體,該調節元件包含miR183家族之該miRNA靶位點的至少一個複本。該單離之核酸序列及載體特別可用於調控目標基因之表現,例如當設計及開發基因療法時。
Description
本發明係關於包含microRNA靶位點,特定而言,miR183家族之miRNA靶位點的調節序列,以及其等用於調控目標核酸序列諸如目標基因之表現的用途。
MicroRNAs(miRNA或miR)係一類長度為約20個核苷酸之豐富的、短的、天然出現的非編碼RNA,其在調節基因表現中扮演重要角色。大多數miRNA藉由RNA聚合酶II或III從DNA序列轉錄為大的RNA前驅物,其稱為原代miRNA(或pri-miRNA)。該pri-miRNA經處理為長度為約70至約120個核苷酸之髮夾前驅物miRNA(或pre-miRNA),其等自身經進一步處理為長度為約20個核苷酸之成熟miRNA。在大多數情況下,在辨識其等之靶位點後,通常定位在3'-未轉譯之經轉錄區域(UTR)內,成熟miRNA達成完全或不完全之鹼基互補配對,這導致mRNA切割以及對mRNA轉譯為蛋白質的抑制。因此,miRNA在以序列特異性模式調節轉錄後基因表現中扮演重要角色。
據此,基於使用包含可操作地鏈接至或插入目標基因之核苷酸序列中的miRNA靶位點之一個或數個複本之載體的選擇性基因緘默化策略業經研
發並於本領域中揭示。於此等策略中,miRNA靶位點由與特異性成熟miRNA之互補的短核苷酸序列組成。當將載體引入表現特異性地辨識該miRNA靶位點的miRNA之細胞內時,該miRNA透過其與miRNA靶位點之交互作用來阻遏目標基因於該等細胞中之表現。
業經在多種有機體中發現了數千種miRNA,其中在智人(Homo sapiens)中鑑定了超過2000種成熟miRNA。miRNA可聚集成簇,定義為彼此鄰近地定位在染色體上之若干miR基因,該等基因經轉錄為一個長的初代miRNA,隨後經處理為個別髮夾前驅物miRNA。此外,簇中之miRNA之間的高序列同一性將它們分類為家族,並且允許針對該家族之miRNA的共有及獨有mRNA標靶兩者。在經鑑定之miRNA家族中,miR183家族由3種同源miRNA組成:miR183、miR96及miR182。miR183家族之miRNA在眼、鼻及內耳之感覺細胞中高度表現,且對於其等之發育至關重要。
大量感覺損傷,特別是盲及聾,係基因起源者,換言之,係由基因中之突變的存在所致。此類感覺損傷一般稱為遺傳性或先天性感覺損傷。目前,正在開發大量旨在治療由單個基因突變所致之感覺損傷的基因療法。基於基因療法的治療依賴於提供完整基因以補償導致先天性感覺損傷的缺陷性基因。注意,最重要的是,透過基因療法引入的基因僅在該基因之表現天然地發生之處的細胞及組織內特異性地表現。特定而言,關鍵是確保透過基因療法引入的基因不在該基因之表現可能引入任何有害效應之處的細胞及組織內表現。因此,對於使得能夠調控目標基因之表現的調節序列及載體存在需求。特定而言,對於使得能夠防止或壓制目標基因在該表現可能引入任何有害效應之處的細胞及組織內的表現的調節序列及載體存在需求。
本發明人等令人驚奇地證明,將包含基因及「前驅物miR183靶位點」之至少一個複本的載體引入表現miR183的細胞內顯著壓制該基因於該等細胞內之表現。如本文所用,所謂「前驅物miR183靶位點」指代具有與前驅物miR183之人類序列互補之序列的miR183靶位點。使用miR183家族之其他「前驅物miRNA靶位點」,亦即指代具有與前驅物miR182之人類序列互補之序列的miR182靶位點的所謂「前驅物miR182靶位點」以及指代具有與前驅物miR96之人類序列互補之序列的miR96靶位點的所謂「miR96靶位點」,觀察到類似之調節效應。引人注目的是,所謂前驅物miR183靶位點在壓制表現miR183之細胞內的基因表現方面比具有與成熟miR183之人類序列互補之序列的較短miR183靶位點顯著地更有效。本發明人等亦證明,向小鼠內耳內注射包含基因及所謂前驅物miR183靶位點之至少一個複本的載體顯著地壓制該基因在耳蝸之內毛細胞及外毛細胞內的表現。
因此,此等結果表明,包含miR183家族之所謂前驅物miRNA靶位點之至少一個複本的載體可能係可用之工具,用於選擇性地且有效地壓制感覺細胞內的不希望之基因表現。此類載體可能在尋求治療先天性感覺損傷之基因療法中尤其受到關注。
因此,本發明係關於一種單離之核酸序列,其包含miR183家族之miRNA靶位點的至少兩個複本,其中該靶位點具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中任一者具有至少90%同一性的序列。於一些態樣中,本發明係
關於一種單離之核酸序列,其包含miR183靶位點之至少兩個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的序列。於一些態樣中,單離之核酸序列包含miR183家族之miRNA靶位點的兩個至六個複本,例如,具有如SEQ ID NO:1中闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的序列之miR183靶位點的兩個至六個複本。於一些態樣中,單離之核酸序列包含miR183家族之miRNA靶位點的三個複本,例如,具有如SEQ ID NO:1中闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的序列之miR183靶位點的三個複本。於一些態樣中,單離之核酸序列包含如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26中所闡述之序列或與SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26中之任一者具有至少90%同一性的序列。於一些態樣中,單離之核酸序列包含如SEQ ID NO:7中所闡述之序列或與SEQ ID NO:7具有至少90%同一性的序列。於一些態樣中,miR183家族之miRNA靶位點之複本,例如,miR183靶位點之複本,係藉由間隔序列分隔。
本發明亦關於一種表現匣,其包含啟動子、目標基因及調節元件,該調節元件包含miR183家族之miRNA靶位點的至少一個複本,其中該miRNA靶位點具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中任一者具有至少90%同一性的序列。本發明亦係關於一種載體,其包含調節元件,該調節元件包含miR183家族之miRNA靶位點的至少一個複本,其中該靶位點具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:2中任一者具有至少90%同一性的序列。於一些態樣中,調節元件包含,miR183靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ
ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的序列。於一些態樣中,調節元件包含miR183家族之miRNA靶位點(例如,具有如SEQ ID NO:1中闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的序列之miR183靶位點)的兩個至六個複本,較佳三個複本,該複本視需要藉由間隔序列分隔。於一些態樣中,調節元件包含如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26中所闡述之序列或與SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26中之任一者具有至少90%同一性的序列。於一些態樣中,調節元件包含如SEQ ID NO:7中所闡述之序列或與SEQ ID NO:7具有至少90%同一性的序列。於一些態樣中,調節元件進一步包含另一miRNA靶位點之至少一個複本,較佳地,miR183家族之另一miRNA靶位點之至少一個複本。於一些態樣中,調節元件包含:具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少90%同一性之序列的miR183靶位點;以及另一miRNA靶位點之至少一個複本,較佳地,miR183家族之另一miRNA靶位點之至少一個複本,更佳地,miR182靶位點。
於一些態樣中,包含在如本文所揭示的表現匣內或如本文所揭示之復包含目標基因之載體內的調節元件係可操作地鏈接至或插入目標基因內,較佳地插入目標基因之3'-UTR內。
本發明亦關於一種醫藥組成物,其包含如本文所揭示的單離之核酸序列、或如本文所揭示的表現匣或如本文所揭示的載體,以及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。
本發明亦關於如本文所揭示的單離之核酸序列、或如本文所揭示的表現匣、或如本文所揭示的載體或如本文所揭示的醫藥組成物,用於作為藥物使用。
本發明亦關於如本文所揭示的單離之核酸序列、如本文所揭示的表現匣、或如本文所揭示的載體之用途,用於在不表現miR183家族之miRNA的細胞內,例如在不表現miR183的細胞內,特異性地表現目標基因。
定義
於本發明中,下列術語具有下列意義:
術語「一」指代該冠詞之語法賓語的一者或超過一者(亦即,至少一者)。舉例而言,「一元件」意指一個元件或超過一個元件。
數字前方之「約」涵蓋加上或減去所述數字之值的10%或更少。應理解,術語「約」所指代之值係其本身亦經具體地且較佳地揭露。
「編碼」,如在編碼序列中,指代核酸中的核苷酸之具體序列(諸如基因、互補性DNA(cDNA)或信使RNA(mRNA))的固有特性,其充當生物製程中具有限定之核苷酸序列(例如,核糖體RNA(rRNA)、轉運RNA(tRNA)及mRNA)或限定之胺基酸序列(例如,多肽或蛋白質)以及由其導致之生物特性的其他聚合物合成模板及大分子。
「表現」指代特定核苷酸序列諸如基因之轉錄及/或轉譯。
如本文中所用,術語「基因」廣義上指代一種可經轉錄為RNA分子的編碼核酸序列,或為可後續轉譯為多肽或蛋白質的編碼RNA分子諸如mRNA,或為非編碼RNA分子諸如rRNA或tRNA。特定而言,「轉殖基因」指代起源於一物種的基因,其待經引入屬於不同物種之有機體內。因此,應注意,基因可涵蓋或不涵蓋編碼序列(或CDS),換言之,實際上編碼蛋白質之核酸序列。基因,特定而言涵蓋CDS之基因,亦可較佳地涵蓋未轉譯的經轉錄之區域(UTR)諸如3'-UTR及/或5'-UTR以及其他序列諸如調節元件及/或內含子,其等
係經轉錄但不經轉譯。因此,如本文中所用,術語「基因」可指代編碼核酸序列,其包含編碼序列(或CDS)及至少一個經轉錄但不經轉譯的調節元件諸如3'UTR、5'-UTR及/或內含子。
如本文中所用,當指代給定序列(諸如miRNA靶位點)時,表述「具有如SEQ ID NO:X中所闡述之序列」意指該給定序列(諸如miRNA靶位點)包含如SEQ ID NO:X中所闡述之序列或由其組成。
「同一性」或「相同」,當在本文中用於兩個或更多個核酸之序列之間的關係時,指代該等核酸之間的序列相關性之程度,如藉由兩個或更多個核苷酸之串之間的匹配數量所確定。「同一性」量測兩個或更多個序列中之較小者之間的相同匹配之百分比,其中間隙比對(如果有)藉由特定數學模型或電腦程式(亦即,「演算法」)解決。相關核酸序列之同一性可藉由已知方法輕易地計算。此類方法包括但不限於彼等於下列中揭示者:Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,編,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,編,Academic Press,New York,1993;Computer Analysis of Sequence Data,第1部分,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,編,Humana Press,New Jersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987;Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,編,M.Stockton Press,New York,1991;以及Carillo et al.,SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)。用於確定同一性的較佳方法經設計為給出所測試之序列之間的最大匹配。確定同一性的方法揭示於公共可獲得之電腦程式中。用於確定兩個序列之間的同一性的較佳之電腦程式包括GCG套裝程式,包括GAP(Devereux et al.,Nucleic Acids Res.1984 Jan 11;12(1 Pt 1):387-95;Genetics Computer Group,
University of Wisconsin,Madison,Wis.)、BLASTP、BLASTN及FASTA(Altschul et al.,J.MoI.Biol.215,403-410(1990))。BLASTX程式可從國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information(NCBI))及其他來源(BLAST手冊,Altschul et al.NCB/NLM/NIH Bethesda,Md.20894;Altschul et al.,J.MoI.Biol.215,403-410(1990))公開獲得。
參照核酸的「單離」指代從天然狀態改變或移出的核酸。例如,天然地存在於活有機體內之核酸不是「單離的」,但與其天然狀態之共存物質部分或完全分隔的核酸是「單離的」。因此,「單離之核酸」為一種核酸,其與其他核酸序列諸如基因體DNA或RNA以及天然地伴隨原生序列之蛋白質或複合物諸如核糖體及聚合酶實質上分開。單離之核酸可以實質上純化之形式存在,或可於非原生環境諸如,舉例而言,宿主細胞中存在。典型地,單離之核酸的製劑可包含至少約80%純、至少約85%純、至少約90%純、至少約95%純、大於約95%純、大於約96%純、大於約97%純、大於約98%純、或大於約99%純的核酸。因此,單離之核酸包括藉由標準純化方法純化之核酸,並且涵蓋業經自其等天然存在之環境中移出的核酸序列。單離之核酸亦包括化學合成之核酸以及藉由異源系統生物合成之核酸。
「MicroRNA」或「miRNA」指代約18至約24個核苷酸的內源性小非編碼RNA分子,其在真核細胞中基因表現之轉錄後調節中扮演角色。單一miRNA可調節多達數百種不同mRNA,並且大多數mRNA係預期由多種miRNA所靶向。miRNA基因係藉由RNA聚合酶II或III轉錄且後續經處理,產出單股成熟miRNA,該等成熟miRNA併入RNA誘導緘默化複合物(RISC)中。作為RISC複合物之中心部分,miRNA引導RISC至其mRNA標靶,其中miRNA
往往藉由部分互補鹼基配對而結合mRNA轉錄本之3'未轉譯區域(3'UTR)。注意,完全鹼基配對必須發生在7個或8個之短長度的核苷酸序列,該核苷酸序列與定位在從成熟miRNA 5'末端起位置2至8處的所謂miRNA「種子」互補。基因緘默化可透過argonaute-2(AG02)媒介之mRNA裂解或透過由AG01至4促進的轉譯壓制而發生,其中兩種方式最終皆導致相對應蛋白質水準之降低。如本文中所用,「miRNA」,例如,「miR183」,指代成熟miRNA,例如指代成熟miR183。相比之下,「前驅物miRNA」或「pre-miRNA」,例如,「前驅物miR183」指代自其處理成熟miRNA的髮夾前驅物序列。
如本文中所用,「MicroRNA靶位點」或「miRNA靶位點」或「miR靶位點」指代可結合miRNA(亦即,成熟miRNA)的核酸序列。如本文中所用,術語「microRNA靶位點」或「miRNA靶位點」或「miR靶位點」涵蓋可見於原生轉錄本中的內源性靶位點以及可作為調節元件(或調節序列)插入載體(特定而言表現載體)中的人工或工程化靶位點(亦即,不是天然存在之靶位點)兩者,用於調控目標核酸序列諸如目標基因之表現。特定而言,在載體中,miRNA靶位點可為可操作地鏈接至或插入基因序列中,特定而言插入基因的經轉錄之序列中。藉由定義,miRNA靶位點必須包含與相對應miRNA至少部分地互補之核酸序列,例如在至少5個核苷酸,往往6至7個核苷酸之長度與相對應之miRNA互補的核酸序列。因此,miR183靶位點必須包含與miR183至少部分地互補的核酸序列,例如,在至少7至8個核苷酸之長度與miR183互補的核酸序列。類似地,miR182靶位點必須包含與miR182至少部分地互補的核酸序列,例如,在至少7至8個核苷酸之長度與miR182互補的核酸序列;並且miR96靶位點必須包含與miR96至少部分地互補的核酸序列,例如,在至少7至8個核
苷酸之長與miR96互補的核酸序列。miRNA靶位點,特定而言人工或工程化miRNA靶位點(亦即,不是天然存在的靶位點)亦可包含在miRNA之全長(亦即,在miRNA之18至24個核苷酸)與miRNA互補的核酸序列或由其組成。當插入載體中時,miR靶位點允許相對應miRNA的結合,並因此能夠在將載體引入表現該miRNA之宿主細胞中之後,媒介目標核酸諸如目標基因之表現的miRNA誘導之緘默化。例如,當插入載體中時,miR183靶位點允許miR183的結合,並因此能夠在將載體引入表現miR183之宿主細胞中之後,媒介目標核酸諸如目標基因之表現的miR183誘導之緘默化。類似地,當插入載體中時,miR182靶位點允許miR182的結合,並因此能夠在將載體引入表現miR182的宿主細胞中之後,媒介miR182誘導的目標核酸諸如目標基因之表現的緘默化;以及當插入載體中時,miR96靶位點允許miR96的結合,並因此能夠在將載體引入表現miR96的宿主細胞中之後,媒介miR96誘導的目標核酸諸如目標基因之緘默化。用於評估核酸序列是否可係合適之miRNA靶位點(例如miR183靶位點、miR182靶位點或miR96靶位點)的方法係本領域中習知者。此類方法之實例揭示於後文之實驗部分中。
如本文中所使用,「miR183家族之MicroRNA靶位點」或「miR183家族之miRNA靶位點」或「miR183家族之miR靶位點」指代一種核酸序列,其可結合屬於miR183家族(有時亦稱為miR183簇)之miRNA(亦即,成熟miRNA)。因此,術語「miR183家族之MicroRNA靶位點」或「miR183家族之miRNA靶位點」或「miR183家族之miR靶位點」指代一種核酸序列,其可結合miR183、miR182及/或miR96。
「核酸」指代藉由磷酸二酯鍵共價鏈接的核苷酸之聚合物(亦即,多核苷酸),諸如去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA),為單股形式或雙股形式。如本文中所使用,核酸因此可係單股、部分雙股或完全雙股。構成本揭露之核酸的核苷酸可係未經修飾之(天然)核苷酸或者非天然或經修飾之核苷酸。未經修飾之(或者天然或天然存在之)核苷酸包括單磷酸腺苷(AMP)、單磷酸去氧腺苷(dAMP)、單磷酸胞苷(CMP)、單磷酸去氧胞苷(dCMP)、單磷酸鳥苷(GMP)、單磷酸去氧鳥苷(dGMP)、單磷酸胸苷(TMP)、單磷酸去氧胸苷(dTMP)及單磷酸尿苷(UMP)。術語「核酸」亦涵蓋含有天然核苷酸之已知類似物的核酸,其具有與參考核酸類似之結合特性並且經類似於天然存在之核苷酸的方式代謝。
「核酸序列」或「核苷酸序列」指代單一核酸中的核苷酸之接續序列。除非另外指示,否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其經保留式修飾的變異體(例如,簡併密碼子取代)、對偶基因、直系同源物、SNP(單核苷酸多型性)及互補序列以及明確指示的序列。值得注意的是,本文所揭示的特定核酸序列隱含地包含其相對應互補序列。應注意,本文所揭示的特定核酸序列隱含地包含DNA序列及相對應RNA序列。
「可操作地鏈接」指代介於調節序列與異源核酸序列例如基因之間的功能性鍵聯,其導致由前者對後者之表現進行調節。例如,當第一核酸序列放置為與第二核酸序列呈功能關係時,第一核酸序列與第二核酸序列可操作地鏈接。特定而言,如果啟動子影響基因之轉錄或表現,則該啟動子可操作地鏈接至該基因。類似地,如果調節序列影響(亦即,誘導或抑制(或壓制))基因之表現,則該調節序列可操作地鏈接至該基因。可操作地鏈接至序列可彼此接續。
「醫藥上可接受之賦形劑」或「醫藥上可接受之載劑」指代當投予至哺乳動物,較佳地投予至人類時,不產生負面、過敏或其他不期望之反應的賦形劑或載劑。其包括任意及全部溶劑,諸如舉例而言分散介質、塗層、抗細菌劑及抗真菌劑、等張及吸收延遲劑。醫藥上可接受之賦形劑或載劑指代非毒性固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、膠囊化材料或任何類型之製劑佐劑。對於人類投予,製劑應符合管理機構諸如FDA(美國食品藥品管理局)或EMA(歐洲藥監局)所要求的無菌性、熱原性、一般安全性及純度標準。
「載體」指代一種媒介物,可藉由其將核酸序列(例如,DNA或RNA分子),例如編碼目標RNA或多肽或蛋白質的核酸,引入宿主細胞內,從而轉化、轉染或轉導該宿主細胞並促進經引入之核酸序列的表現(例如,轉錄及/或轉譯)。
「表現載體」指代一種載體,其包含可操作地鏈接至或待可操作地鏈接至待表現之核酸序列諸如目標基因的調節元件(或調節序列)。因此,表現載體包含足夠的順式作動調節元件用於調控目標核酸序列(存在於或待插入表現載體中)的表現;調控目標核酸序列之表現可能需要的其他元件可以由宿主細胞或活體外表現系統(諸如舉例而言,將結合至miR靶位點的miRNA)供應。順式作動調節元件包括例如啟動子及miR靶位點諸如本文所揭示的miR183靶位點、miR182靶位點及miR96靶位點。
詳細說明
人類微小RNA 183(miR183或miR-183)屬於miR183家族(有時亦稱為miR183簇),其由3種同源miRNA組成:miR183(或miR-183)、miR96(或miR-96)及miR182(或miR-182)。感覺器官之適當發育明顯需要miR183家族之
miRNA。特定而言,miR183家族之miRNA在脊椎動物之感覺神經元及毛細胞中以及全部動物物種之感覺細胞中表現。在脊椎動物中,miR183家族之miRNA在嗅覺上皮、眼、神經丘及耳中表現。
人類miR-183基因由染色體7q32.2之一個外顯子組成。成熟miR183由被稱為前驅物miR183或pre-miR183的髮夾前驅物之處理所造成。人類前驅物miR183為110個核苷酸長度,並且具有如SEQ ID NO:2中闡述之序列,其在NCBI資料庫中指代為NR_029615.1。
對折疊為莖環結構之髮夾前驅物miR183的處理獲得成熟miR183。被稱為miR183-5p(或hsa-miR183-5p或hsa-miR-183-5p)的人類成熟miR183為22個核苷酸長度,並且具有如SEQ ID NO:3中所闡述之序列,其在miRBase(https://www.mirbase.org)中稱為MIMAT0000261。miR183-5p之序列對應於SEQ ID NO:2之人類前驅物miR183之核苷酸27至48。被稱為miR183-3p(或hsa-miR183-3p或hsa-miR-183-3p)的人類成熟miR183亦為22個核苷酸長度,並且具有如SEQ ID NO:4中所闡述之序列,其在miRBase中稱為MIMAT0004560。miR183-3p之序列對應於SEQ ID NO:2之人類前驅物miR183之核苷酸66至87。如本文中所用,術語「成熟miR183」(或「成熟miR-183」)涵蓋miR183-5p及miR183-3p兩者。
於活體內,成熟miR183可結合至標靶mRNA,該標靶mRNA包含與該成熟miR183之種子區域互補的短序列。例如,hsa-miR183-5p之種子區域為AUGGCAC,對應於hsa-miR183-5p(SEQ ID NO:3)之核苷酸2至8。
人類miR-182基因由染色體7q32.2之一個外顯子組成。成熟miR182由被稱為前驅物miR182或pre-miR182的髮夾前驅物之處理所造成。人
類前驅物miR182為110個核苷酸之長度,並且具有如SEQ ID NO:22中闡述之序列,其在NCBI資料庫中指代為NR_029614.1。
對折疊為莖環結構之髮夾前驅物miR182的處理獲得成熟miR182。被稱為miR182-5p(或hsa-miR182-5p或hsa-miR-182-5p)的人類成熟miR182為24個核苷酸之長度,並且具有如SEQ ID NO:11中所闡述之序列,其在miRBase(https://www.mirbase.org)中稱為MIMAT0000259。miR182-5p之序列對應於SEQ ID NO:22之人類前驅物miR182之核苷酸23至46。被稱為miR182-3p(或hsa-miR182-3p或hsa-miR-182-3p)的人類成熟miR182亦為21個核苷酸長度,並且具有如SEQ ID NO:13中所闡述之序列,其在miRBase中稱為MIMAT0000260。miR182-3p之序列對應於SEQ ID NO:22之人類前驅物miR182之核苷酸67至87。如本文中所用,術語「成熟miR182」(或「成熟miR-182」)涵蓋miR182-5p及miR182-3p兩者。
於活體內,成熟miR182可結合至標靶mRNA,該標靶mRNA包含與該成熟miR182之種子區域互補的短序列。例如,hsa-miR182-5p之種子區域為UUGGCAA,對應於hsa-miR182-5p(SEQ ID NO:11)之核苷酸2至8。
人類miR-96基因由染色體7q32.2之一個外顯子組成。成熟miR96由被稱為前驅物miR96或pre-miR96的髮夾前驅物之處理所造成。人類前驅物miR96為78個核苷酸之長度,並且具有如SEQ ID NO:25中闡述之序列,其在NCBI資料庫中指代為NR_029512.1。
對折疊為莖環結構之髮夾前驅物miR96的處理獲得成熟miR96。被稱為miR96-5p(或hsa-miR96-5p或hsa-miR-96-5p)的人類成熟miR96為23個核苷酸長度,並且具有如SEQ ID NO:28中所闡述之序列,其在miRBase
(https://www.mirbase.org)中稱為MIMAT0000095。miR96-5p之序列對應於SEQ ID NO:25之人類前驅物miR96之核苷酸9至31。被稱為miR96-3p(或hsa-miR96-3p或hsa-miR-96-3p)的人類成熟miR96亦為22個核苷酸長度,並且具有如SEQ ID NO:30中所闡述之序列,其在miRBase中稱為MIMAT0004510。miR96-3p之序列對應於SEQ ID NO:25之人類前驅物miR96之核苷酸52至73。如本文中所用,術語「成熟miR96」(或「成熟miR-96」)涵蓋miR96-5p及miR96-3p兩者。
於活體內,成熟miR96可結合至標靶mRNA,該標靶mRNA包含與該成熟miR96之種子區域互補的短序列。例如,hsa-miR96-5p之種子區域為UUGGCAC,對應於hsa-miR96-5p(SEQ ID NO:28)之核苷酸2至8。
如後文實驗部分中所詳述,本發明人業經令人驚奇地證明,當插入載體中時,與前驅物miR183(亦即,SEQ ID NO:2)之人類序列互補的具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列的110個核苷酸長之miR183靶位點可成功地用作調節元件以調控目標核酸於表現miR183之細胞中的表現。如上所指示,具有與前驅物miR183(亦即,SEQ ID NO:2)之人類序列互補之序列的miR183靶位點在本文中有時稱為「前驅物miR183靶位點」。當引入細胞中後,表現載體內所包含的mirR183靶位點隨著目標核酸一起經轉錄並且因此存在於所得mRNA中。具有如SEQ ID NO:1中所產生之核酸的110個核苷酸長度之mir183靶位點係預期折疊為莖環結構。本發明人業經令人驚奇地證明,與預期相反,該莖環結構不阻止miR183與SEQ ID NO:1之mir183靶位點的結合。
類似地,本發明人業經證明,當插入載體中時,與前驅物miR182(亦即,SEQ ID NO:22)之人類序列互補的具有如SEQ ID NO:21中所闡述之序
列的110個核苷酸長度之miR182靶位點可成功地用作調節元件以調控目標核酸於表現miR182之細胞中的表現。如上所指示,具有與前驅物miR182(亦即,SEQ ID NO:22)之人類序列互補之序列的miR182靶位點在本文中有時稱為「前驅物miR182靶位點」。當引入細胞中後,表現載體內所包含的mirR182靶位點隨著目標核酸一起經轉錄並且因此存在於所得mRNA中。本發明人亦業經證明,當插入載體中時,與前驅物miR96(亦即,SEQ ID NO:25)之人類序列互補的具有如SEQ ID NO:24中所闡述之序列的78個核苷酸長度之miR96靶位點可成功地用作調節元件以控制目標核酸於表現miR96之細胞中的表現。如上所指示,具有與前驅物miR96(亦即,SEQ ID NO:25)之人類序列互補之序列的miR96靶位點在本文中有時稱為「前驅物miR96靶位點」。當引入細胞中後,表現載體內所包含的mirR96靶位點隨著目標核酸一起經轉錄並且因此存在於所得mRNA中。具有如SEQ ID NO:21中所闡述之序列的110個核苷酸長度之mir182靶位點以及具有如SEQ ID NO:24中所闡述之序列的78個核苷酸長度之mir96靶位點亦預期折疊為莖環結構。本發明人業經令人驚奇地證明,與預期相反,莖環結構既不阻止miR182與SEQ ID NO:21之mir182靶位點的結合也不阻止miR96與SEQ ID NO:24之mir96靶位點的結合。
本發明人亦業經證明,插入SEQ ID NO:1之miR183靶位點之若干複本導致對核酸之表現的更強烈抑制。出乎意料的是,透過使用SEQ ID NO:1之miR183靶位點誘導的對核酸表現的壓制顯著強於透過使用較短靶位點(諸如具有如SEQ ID NO:5中所闡述之序列的miR183靶位點)所誘導的壓制,其與hsa-miR183-5p(亦即,SEQ ID NO:3)之序列互補。
如後文實驗部分中所示,用於評估核酸序列是否可係合適之miR靶位點(例如合適之miR183靶位點)的方法包括在啟動子諸如遍在型或組成型啟動子的調控下將所評估的核酸序列插入包含報告基因諸如編碼GFP蛋白質(綠色螢光蛋白)之基因的載體中。所評估的核酸序列可操作地鏈接至基因或插入基因中,例如基因之3'-UTR中。隨後,將包含所評估之核酸序列及報告基因的載體(例如質體)引入表現miR183的宿主細胞諸如HEK293細胞中。對報告基因於宿主細胞中之表現的抑制,特定而言與載體中僅包含處於啟動子調控之下的報告基因的對照條件相比,指示所評估的核酸序列為合適之miR183靶位點。類似之方法可用於評估核酸序列是否可係合適之miR182靶位點或合適之miR96靶位點。
因此,本發明之第一方面為一種單離之核酸序列,其包含miR183家族之miR靶位點的至少兩個複本或由其組成,該靶位點具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列。
如本文所揭示的單離之核酸包含miR183靶位點之至少兩個複本或由其組成,該靶位點具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列。於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的mirR183靶位點為功能性mirR183靶位點,換言之,其允許miR183之結合。
於一些態樣中,具有與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的mirR183靶位點具有至少100個核苷酸之長度。於一些態樣中,具有與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的mirR183靶位點具有至少60、65、70、75、80、85、90、95、100或105個核苷酸之長度。於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的mirR183靶位點具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109或110個核苷酸之長度。
於一些態樣中,mirR183具有如SEQ ID NO:1中闡述之序列,其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個或更多個核苷酸由參考SEQ ID NO:1之對應核苷酸的不同核苷酸取代。於一些態樣中,mirR183具有如SEQ ID NO:1中闡述之序列,其中至多60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個核苷酸由參考SEQ ID NO:1之對應核苷酸的不同核苷酸取代。於一些態樣中,此類具有帶有核苷酸取代的如SEQ ID NO:1中所闡述之序列的mirR183靶位點為功能性mirR183靶位點,換言之,其允許miR183之結合。
如本文所揭示的單離之核酸包含miR182靶位點之至少兩個複本或由其組成,該靶位點具有如SEQ ID NO:21中所闡述之序列或與SEQ ID NO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列。於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的mirR182靶位點為功能性mirR182靶位點,換言之,其允許miR182之結合。
於一些態樣中,具有與SEQ ID NO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的mirR182靶位點具有至少100個核苷酸之長度。於一些態樣中,具有與SEQ ID NO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的mirR182靶位點具有至少60、65、70、75、80、85、90、95、100或105個核苷酸之長度。於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的mirR182靶位點具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109或110個核苷酸之長度。
於一些態樣中,mirR182具有如SEQ ID NO:21中闡述之序列,其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個或更多個核苷酸由參考SEQ ID NO:21之對應核苷酸的不同核苷酸取代。於一些態樣中,mirR182具有如SEQ ID NO:21中闡述之序列,
其中至多60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個核苷酸由參考SEQ ID NO:21之對應核苷酸的不同核苷酸取代。於一些態樣中,此類具有帶有核苷酸取代的如SEQ ID NO:21中所闡述之序列的mirR182靶位點為功能性mirR182靶位點,換言之,其允許miR182之結合。
如本文所揭示的單離之核酸包含mi96靶位點之至少兩個複本或由其組成,該靶位點具有如SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列。於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的mirR96靶位點為功能性mirR183靶位點,換言之,其允許miR96之結合。
於一些態樣中,具有與SEQ ID NO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的mirR96靶位點具有至少70個核苷酸之長度。於一些態樣中,具有與SEQ ID NO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的mir96靶位點具有至少40、45、50、55、60或65個核苷酸之長度。於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的mir96靶位點具有58、59、
60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78個核苷酸之長度。
於一些態樣中,mirR96具有如SEQ ID NO:24中闡述之序列,其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個或更多個核苷酸由參考SEQ ID NO:24之對應核苷酸的不同核苷酸取代。於一些態樣中,mirR96具有如SEQ ID NO:24中闡述之序列,其中至多35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個核苷酸由參考SEQ ID NO:24之對應核苷酸的不同核苷酸取代。於一些態樣中,此類具有帶有核苷酸取代的如SEQ ID NO:24中所闡述之序列的mirR96靶位點為功能性mirR96靶位點,換言之,其允許miR96之結合。
如本文中所用,表述「至少兩個複本」包括如本文所揭示的miR183家族之miR靶位點(諸如,舉例而言,具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列的miR183靶位點)之兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個複本。
於一些態樣中,單離之核酸序列包含如本文所揭示的miR183家族之miR靶位點(諸如,舉例而言,具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列的miR183靶位點,如本文中所揭示)之兩個至六個複本或由其組成。因此,單離之核酸序列可包含如本文所揭示的miR183家族之
miR靶位點(諸如,舉例而言,具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列的miR183靶位點,如本文中所揭示)之兩個、三個、四個、五個或六個複本或由其組成。
於一些態樣中,單離之核酸序列包含如本文所揭示的miR183家族之miR靶位點之三個複本或由其組成。因此,單離之核酸序列可包含如EQ ID NO:7、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26中所闡述之序列或與SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26中之任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,或由其組成。
特定而言,單離之核酸序列可包含miR183靶位點之三個複本或由其組成,該靶位點具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示。因此,單離之核酸序列可包含如EQ ID NO:7中所闡述之序列或與SEQ ID NO:7具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,或由其組成。於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:7具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的單離之核酸序列對應於功能性mirR183靶位點,換言之,其允許miR183之結合。
於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:7具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的單離之核酸序列具有至少300個核苷酸之長度。於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:7具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、
97%、98%或99%或更大同一性之序列的單離之核酸序列具有至少180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、305、310、315、320、325或330個核苷酸之長度。於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:7具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的單離之核酸序列具有300、305、310、315、320、325或330個核苷酸之長度。
於一些態樣中,單離之核酸序列具有如SEQ ID NO:7中闡述之序列,其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個或更多個核苷酸由參考SEQ ID NO:7之對應核苷酸的不同核苷酸取代。於一些態樣中,單離之核酸序列具有如SEQ ID NO:7中闡述之序列,其中至多30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個核苷酸由參考SEQ ID NO:7之對應核苷酸的不同核苷酸取代。於一些態樣中,此類具有帶有核苷酸取代的如SEQ ID NO:7中所闡述之序列的單離之核酸序列對應於功能性mirR183靶位點,換言之,其允許miR183之結合。
單離之核酸序列可包含miR182靶位點之三個複本或由其組成,該靶位點具有如SEQ ID NO:21中所闡述之序列或與SEQ ID NO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示。因此,單離之核酸序列可包含如EQ ID NO:23中所闡述之序列或與SEQ ID NO:23具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,或由其組成。於一些態樣中,如本文所
揭示之具有與SEQ ID NO:23具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的單離之核酸序列對應於功能性mirR182靶位點,換言之,其允許miR182之結合。
於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:23具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的單離之核酸序列具有至少300個核苷酸之長度。於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:23具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的單離之核酸序列具有至少180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、305、310、315、320、325或330個核苷酸之長度。於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:23具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的單離之核酸序列具有300、305、310、315、320、325或330個核苷酸之長度。
於一些態樣中,單離之核酸序列具有如SEQ ID NO:23中闡述之序列,其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個或更多個核苷酸由參考SEQ ID NO:23之對應核苷酸的不同核苷酸取代。於一些態樣中,單離之核酸序列具有如SEQ ID NO:23中闡述之序列,其中至多30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個核苷酸由參考SEQ ID NO:23之對應核苷酸的不同核苷酸取代。於一些態樣中,此類具有帶有核苷酸取代的如SEQ ID NO:23中所闡述
之序列的單離之核酸序列對應於功能性mirR182靶位點,換言之,其允許miR182之結合。
單離之核酸序列可包含miR96靶位點之三個複本或由其組成,該靶位點具有如SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示。因此,單離之核酸序列可包含如EQ ID NO:26中所闡述之序列或與SEQ ID NO:26具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,或由其組成。於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:26具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的單離之核酸序列對應於功能性mirR96靶位點,換言之,其允許miR96之結合。
於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:26具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的單離之核酸序列具有至少210個核苷酸之長度。於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:26具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的單離之核酸序列具有至少160、170、180、190、200、205、210、215、220、225、230或234個核苷酸之長度。於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:26具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的單離之核酸序列具有200、205、210、215、220、225、230或234個核苷酸之長度。
於一些態樣中,單離之核酸序列具有如SEQ ID NO:26中闡述之序列,其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19或20個或更多個核苷酸由參考SEQ ID NO:26之對應核苷酸的不同核苷酸取代。於一些態樣中,單離之核酸序列具有如SEQ ID NO:26中闡述之序列,其中至多20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個核苷酸由參考SEQ ID NO:26之對應核苷酸的不同核苷酸取代。於一些態樣中,此類具有帶有核苷酸取代的如SEQ ID NO:26中所闡述之序列的單離之核酸序列對應於功能性mirR96靶位點,換言之,其允許miR96之結合。
於一些態樣中,於如本文所揭示的單離之核酸序列中,如本文所揭示的miR183家族之miR靶位點(諸如,舉例而言,miR183靶位點)之複本係藉由間隔序列分隔。如本文中所用,「間隔序列」指代非編碼序列。於一些態樣中,間隔序列之特徵為約5個核苷酸至約25個核苷酸、較佳約10個核苷酸至約20個核苷酸、更佳約20個核苷酸之長度。間隔序列常用於本領域中並且係熟練技術人員所習知者。例如,間隔序列係揭示於Hammarsten等人Herpes simplex virus:selection of origins of DNA replication.Nucleic Acids Res.1997 May 1;25(9):1753-60中。間隔序列之實例包括具有如SEQ ID NO:14(ATAACTAAAAGATTCGGA)中、SEQ ID NO:15(AATATATATATATTATTA)中、SEQ ID NO:16(AAAAACATATAAAATAAT)中或SEQ ID NO:17(CTTTCTTTTCCCAATTTT)中所闡述之序列的間隔序列。於一些態樣中,間隔序列具有如SEQ ID NO:14中所闡述之序列。
於一些態樣中,單離之核酸序列為單股序列。於一些態樣中,單離之核酸序列為雙股序列。
於一些態樣中,如本文所揭示的單離之核酸序列複包含另一miR靶位點之至少一個複本。於一些態樣中,單離之核酸序列包含下列或由其組成:
- miR183靶位點之至少兩個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示;或miR182靶位點之至少兩個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:21中所闡述之序列或與SEQ ID NO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示;或miR96靶位點之至少兩個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示;以及
- 另一miR靶位點之至少一個複本。
例如,其他miR靶位點可係由感覺神經元及/或毛細胞諸如內耳之毛細胞中表現的miRNA所辨識的miR靶位點。其他miR標靶可係miR182靶位點、miR96靶位點、miR194靶位點、miR140靶位點、miR18a靶位點、miR99a靶位點、miR30b靶位點、miR15a靶位點或miR210靶位點。於一些態樣中,其他miR靶位點為miR182靶位點。
miR182靶位點可係具有與成熟miR182互補之序列的miR182靶位點。例如,miR182靶位點可具有如SEQ ID NO:10中所闡述之序列,或與SEQ ID NO:10具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列。SEQ ID NO:10之序列與hsa-miR182-5p之序列互補。Hsa-miR182-5p為24個核苷酸長度,並且具有如SEQ ID NO:11中所闡述之序列,其在miRBase中指代為MIMAT0000259,如上所指示。成熟miR182靶位點可具有如SEQ ID NO:12中所闡述之序列,或與SEQ ID NO:12具有至少70%、
75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列。SEQ ID NO:12之序列與hsa-miR182-3p之序列互補。Hsa-miR182-3p為21個核苷酸之長度,並且具有如SEQ ID NO:13中所闡述之序列,其在miRBase中指代為MIMAT0000260,如上所指示。
於一些態樣中,如本文所揭示的單離之核酸序列複包含如本文所揭示的miR183家族之另一miR靶位點之至少一個複本。例如,單離之核酸序列可包含下列或由其組成:
- miR183靶位點之至少兩個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示;以及
- miR182靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:21中所闡述之序列或與SEQ ID NO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列;及/或miR96靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列。
單離之核酸序列可包含下列或由其組成:
- miR182靶位點之至少兩個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:21中所闡述之序列或與SEQ ID NO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示;以及
- miR183靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、
97%、98%或99%或更大同一性的序列;及/或miR96靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列。
單離之核酸序列可包含下列或由其組成:
- miR96靶位點之至少兩個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示;以及
- miR183靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列;及/或miR182靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:21中所闡述之序列或與SEQ ID NO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列。
本發明之另一方面為一種單離之核酸編碼序列(亦指代為單離之編碼序列),其包含miR183家族之miR靶位點的至少一個複本或由其組成,該靶位點具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列。
單離之編碼序列可包含miR183靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文
所揭示。單離之編碼序列可包含miR182靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:21中所闡述之序列或與SEQ ID NO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示。單離之編碼序列可包含miR96靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示。
於一些態樣中,單離之核酸編碼序列編碼多核苷酸或蛋白質。於一些態樣中,單離之編碼序列為cDNA序列。於一些態樣中,單離之編碼序列為RNA編碼序列。例如,於一些態樣中,單離之編碼序列為mRNA序列。於一些態樣中,將如本文所揭示的miR183家族之miR靶位點之至少一個複本插入如本文所揭示的單離之編碼序列之未轉譯區域中,諸如舉例而言的單離之編碼序列的5'-UTR或3'-UTR中。
於一些態樣中,單離之核酸編碼序列包含如本文所揭示的miR183家族之miR靶位點(諸如,舉例而言,具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列的miR183靶位點,如本文中所揭示)之至少兩個複本。
於一些態樣中,單離之核酸編碼序列包含如本文所揭示的miR183家族之miR靶位點(諸如,舉例而言,具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%
或99%或更大同一性的序列的miR183靶位點,如本文中所揭示)之兩個至六個複本。
於一些態樣中,單離之核酸編碼序列包含如本文所揭示的miR183家族之miR靶位點之三個複本。因此,單離之核酸序列可包含如EQ ID NO:7、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26中所闡述之序列或與SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26中之任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,或由其組成。
特定而言,單離之核酸編碼序列可包含miR183靶位點之三個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示。因此,單離之核酸編碼序列可包含如EQ ID NO:7中所闡述之序列或與SEQ ID NO:7具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示。
單離之核酸編碼序列可包含miR182靶位點之三個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:21中所闡述之序列或與SEQ ID NO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示。因此,單離之核酸編碼序列可包含如EQ ID NO:23中所闡述之序列或與SEQ ID NO:23具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示。
單離之核酸編碼序列可包含miR96靶位點之三個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文
所揭示。因此,單離之核酸編碼序列可包含如EQ ID NO:26中所闡述之序列或與SEQ ID NO:26具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示。
於一些態樣中,如本文所揭示的miR183家族之miR靶位點(諸如,舉例而言,miR183靶位點)之複本係藉由間隔序列分隔。於一些態樣中,間隔序列具有如SEQ ID NO:14中所闡述之序列。
於一些態樣中,單離之核酸編碼序列複包含另一miR靶位點之至少一個複本。於一些態樣中,單離之核酸編碼序列包含:
- miR183靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示;或miR182靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:21中所闡述之序列或與SEQ ID NO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示;或miR96靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示;以及
- 另一miR靶位點之至少一個複本。
例如,其他miR靶位點可係由感覺神經元及/或毛細胞諸如內耳之毛細胞中表現的miRNA所辨識的miR靶位點。其他miR標靶可係miR182靶位點、miR96靶位點、miR194靶位點、miR140靶位點、miR18a靶位點、miR99a
靶位點、miR30b靶位點、miR15a靶位點或miR210靶位點。於一些態樣中,其他miR靶位點為miR182靶位點。
miR182靶位點可具有與成熟miR182互補之序列,例如,如SEQ ID NO:10中、SEQ ID NO:12中所闡述之序列,或與SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列。
於一些態樣中,單離之核酸編碼序列複包含如本文所揭示的miR183家族之另一miR靶位點之至少一個複本。例如,單離之核酸編碼序列可包含:
- miR183靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示;以及
- miR182靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:21中所闡述之序列或與SEQ ID NO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示;及/或miR96靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示。
或者,單離之核酸編碼序列可包含miR182靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:21中所闡述之序列或與SEQ ID NO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示;以及miR96靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如
SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示。
本發明之另一方面為一種表現匣,其包含啟動子、目標核酸序列及調節元件(或調節序列),該調節元件包含miR183家族之miR靶位點之至少一個複本或由其組成,該miR靶位點具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中之任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列。
調節元件(或調節序列)可包含miR183靶位點之至少一個複本或由其組成,該靶位點具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示。調節元件(或調節序列)可包含miR182靶位點之至少一個複本或由其組成,該靶位點具有如SEQ ID NO:21中所闡述之序列或與SEQ ID NO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示。調節元件(或調節序列)可包含miR96靶位點之至少一個複本或由其組成,該靶位點具有如SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示。
如本文中所用,表述「至少一個複本」包括如本文所揭示的miR183家族之miR靶位點(諸如,舉例而言,具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%
或99%或更大同一性的序列的miR183靶位點)之一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個複本。
於一些態樣中,調節元件(或調節序列)包含如本文所揭示的miR183家族之miR靶位點(諸如,舉例而言,具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列的miR183靶位點,如本文中所揭示)之一個至六個複本或由其組成。因此,調節元件(或調節序列)可包含如本文所揭示的miR183家族之miR靶位點(諸如,舉例而言,具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列的miR183靶位點,如本文中所揭示)之一個、兩個、三個、四個、五個或六個複本或由其組成。
於一些態樣中,調節元件(或調節序列)包含如本文所揭示的miR183家族之miR靶位點(諸如,舉例而言,具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列的miR183靶位點,如本文中所揭示)之至少兩個複本或由其組成。於一些態樣中,調節元件(或調節序列)包含如本文所揭示的miR183家族之miR靶位點(諸如,舉例而言,具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列的miR183靶位點,如本文中所揭示)之兩個至六個複本或由其組成。
於一些態樣中,調節元件(或調節序列)包含如本文所揭示的miR183家族之miR靶位點之三個複本或由其組成。因此,調節元件(或調節序
列)可包含如EQ ID NO:7、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26中所闡述之序列或與SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26中之任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,或由其組成。
特定而言,調節元件(或調節序列)可包含miR183靶位點之三個複本或由其組成,該靶位點具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示。因此,調節元件(或調節序列)可包含如EQ ID NO:7中所闡述之序列或與SEQ ID NO:7具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列或由其組成,如本文所揭示。
於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:7具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的調節元件(或調節序列)具有至少300個核苷酸之長度。於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:7具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的調節元件(或調節序列)具有300、305、310、315、320、325或330個核苷酸之長度。
於一些態樣中,調節元件(或調節序列)具有如SEQ ID NO:7中闡述之序列,其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個或更多個核苷酸由參考SEQ ID NO:7之對應核苷酸的不同核苷酸取代,如本文所揭示。於一些態樣中,調節元件(或調節序列)具有如SEQ ID NO:7中闡述之序列,其中至
多30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個核苷酸由參考SEQ ID NO:7之對應核苷酸的不同核苷酸取代,如本文所揭示。
調節元件(或調節序列)可包含miR182靶位點之三個複本或由其組成,該靶位點具有如SEQ ID NO:21中所闡述之序列或與SEQ ID NO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示。因此,調節元件(或調節序列)可包含如EQ ID NO:23中所闡述之序列或與SEQ ID NO:23具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列或由其組成,如本文所揭示。
於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:23具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的調節元件(或調節序列)具有至少300個核苷酸之長度。於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:23具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的調節元件(或調節序列)具有300、305、310、315、320、325或330個核苷酸之長度。
於一些態樣中,調節元件(或調節序列)具有如SEQ ID NO:23中闡述之序列,其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個或更多個核苷酸由參考SEQ ID NO:23之對應核苷酸的不同核苷酸取代,如本文所揭示。於一些態樣中,調節元件(或調節序列)具有如SEQ ID NO:23中闡述之序列,其中至多30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、
13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個核苷酸由參考SEQ ID NO:23之對應核苷酸的不同核苷酸取代,如本文所揭示。
調節元件(或調節序列)可包含miR96靶位點之三個複本或由其組成,該靶位點具有如SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示。因此,調節元件(或調節序列)可包含如EQ ID NO:26中所闡述之序列或與SEQ ID NO:26具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列或由其組成,如本文所揭示。
於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:26具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的調節元件(或調節序列)具有至少210個核苷酸之長度。於一些態樣中,如本文所揭示之具有與SEQ ID NO:26具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性之序列的調節元件(或調節序列)具有200、205、210、215、220、225、230或234個核苷酸之長度。
於一些態樣中,調節元件(或調節序列)具有如SEQ ID NO:26中闡述之序列,其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個或更多個核苷酸由參考SEQ ID NO:26之對應核苷酸的不同核苷酸取代,如本文所揭示。於一些態樣中,調節元件(或調節序列)具有如SEQ ID NO:26中闡述之序列,其中至多20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個核苷酸由參考SEQ ID NO:26之對應核苷酸的不同核苷酸取代,如本文所揭示。
於一些態樣中,於如本文所揭示的包含如本文所揭示的miR183家族之miR靶位點(諸如,舉例而言,miR183靶位點)之複本的調節元件(或調節序列)中,該等複本係藉由間隔序列分隔,如本文所揭示。於一些態樣中,間隔序列具有如SEQ ID NO:14中所闡述之序列。
於一些態樣中,如本文所揭示的調節元件(或調節序列)複包含另一miR靶位點之至少一個複本。於一些態樣中,調節元件(或調節序列)因此包含下列或由其組成:
- miR183靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示;或miR182靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:21中所闡述之序列或與SEQ ID NO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示;或miR96靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示;以及
- 另一miR靶位點之至少一個複本。
例如,其他miR靶位點可係由感覺神經元及/或毛細胞諸如內耳之毛細胞中表現的miRNA所辨識的miR靶位點。其他miR標靶可係miR182靶位點、miR96靶位點、miR194靶位點、miR140靶位點、miR18a靶位點、miR99a靶位點、miR30b靶位點、miR15a靶位點或miR210靶位點。於一些態樣中,其他miR靶位點為miR182靶位點。
miR182靶位點可具有與成熟miR182互補之序列,例如,如SEQ ID NO:10中、SEQ ID NO:12中所闡述之序列,或與SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列。
於一些態樣中,如本文所揭示的調節元件(或調節序列)複包含如本文所揭示的miR183家族之另一miR靶位點之至少一個複本。例如,如本文所揭示的調節元件(或調節序列)可含下列或由其組成:
- miR183靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示;以及
- miR182靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:21中所闡述之序列或與SEQ ID NO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示;及/或miR96靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示。
或者,如本文所揭示的調節元件(或調節序列)可包含miR182靶位點之至少一個複本或由其組成,該靶位點具有如SEQ ID NO:21中所闡述之序列或與SEQ ID NO:21具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示;以及miR96靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:
24具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示。
如本文中所用,表述「目標核酸序列」意為指代待表現之核酸序列。特定而言,表述「目標核酸序列」意為指代待例如在引入宿主細胞中或宿主有機體中之後以受控模式表現的核酸序列。目標核酸序列可係目標基因,換言之,編碼功能性核酸(諸如RNA)或編碼多肽或蛋白質的核酸序列。
例如,目標核酸,諸如目標基因,可包括編碼多肽或蛋白質的開讀框。因此,目標核酸序列可包括目標編碼序列。或者,目標核酸序列可編碼功能性核酸,諸如非編碼RNA。
於一些態樣中,目標核酸為目標基因。如本文中所用,特定而言,術語「基因」可指代編碼核酸序列,其包含編碼序列(或CDS)及至少一個經轉錄但不經轉譯的調節元件諸如3'UTR、5'-UTR及/或內含子。
於表現匣中,調節元件可操作地鏈接至目標核酸或插入目標核酸中。較佳地,調節元件係插入目標核酸的未經轉譯之區域中。未經轉譯之區域包括,例如,5'-UTR、3'-UTR及內含子。於一些態樣中,調節元件係插入目標核酸之3'-UTR中,特定而言,目標基因之3'-UTR中。
如上所指示,表現匣包含啟動子。例如,啟動子可係遍在型及/或組成型啟動子。啟動子可係熟練技術人員所習知者,熟練技術人員將知曉如何依賴於待表現之目標核酸序列並且依賴於欲在其中表現之細胞來選擇合適之啟動子。
於表現匣中,啟動子往往插入待表現之目標核酸序列的上游,換言之,待表現之目標核酸序列的5'。
表現匣可復包含目標核酸序列之表現可能需要的任何序列或元件。此類序列或元件可包括,例如,poly(A)訊號、poly(A)位點、增強子序列、終止子序列、降解決定子、緘默子、絕緣子及/或操作子。
本發明之另一方面為一種載體,其包含如本文所揭示的調節元(或調節序列)、或如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、或如本文所揭示的表現匣。
特定而言,本發明係關於一種載體,其包含調節元件,該調節元件包含miR183家族之miR靶位點的至少一個複本或由其組成,該靶位點具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列。例如,載體可包含調節元件,該調節元件包含miR183靶位點之至少一個複本或由其組成,該靶位點具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更大同一性的序列,如本文所揭示。
於一些態樣中,包含如本文所揭示的調節元件的載體亦包含如本文所揭示的目標核酸序列,諸如目標基因。於此類載體中,調節元件可操作地鏈接至目標核酸或可插入目標核酸中。較佳地,調節元件係插入目標核酸的未經轉譯之區域中,諸如5'-UTR、3'-UTR或內含子中。於一些態樣中,調節元件係插入目標核酸之3'-UTR中,特定而言,目標基因之3'-UTR中。
載體可係熟練技術人員所習知者,熟練技術人員將知曉如何依賴於待表現之目標核酸序列(例如依賴於目標核酸序列之長度)並且依賴於欲在其中表現之細胞來選擇合適之載體。
載體之實例包括黏質體、質體、游離基因組、人工染色體、噬菌體及病毒(諸如慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒(AAV))、脂質體、脂質奈米顆粒、泡囊、基於聚合物之奈米顆粒。
於一些態樣中,載體為表現載體。
於一些態樣中,載體為脂質體、脂質奈米顆粒、泡囊或基於聚合物之奈米顆粒中的一者,並且載體包含單離之核酸編碼序列,較佳地,RNA編碼序列,如本文所揭示。
於一些態樣中,載體,特定而言表現載體,為質體。於一些態樣中,載體,特定而言表現載體,為病毒,例如腺相關病毒(AAV)。用於產生病毒載體的方法係本領域中習知者,並且包括例如轉染封裝細胞及/或使用以輔助質體或病毒進行的瞬時轉染。
本發明之另一方面為一種宿主細胞,其包含如本文所揭示的單離之序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的表現匣或如本文所揭示的載體。
於一些態樣中,宿主細胞為單離之宿主細胞。
於一些態樣中,宿主細胞可係原核細胞或真核細胞,諸如酵母細胞或動物細胞,特定而言哺乳動物細胞。
應注意,就動物及人類細胞而言,術語「宿主細胞」通常指代經培養之細胞株的細胞。業經向其引入如本文所揭示的單離之序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的表現匣或如本文所揭示的載體動物及人類明確地從「宿主細胞」之定義中排除。
本發明之另一方面為一種組成物,其包含如本文所揭示的單離之序列、如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的表現匣、如本文所揭示的載體或如本文所揭示的宿主細胞,或者基本上由其組成或由其組成。
本發明之另一方面為一種醫藥組成物,其包含如本文所揭示的單離之序列、如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的表現匣、如本文所揭示的載體或如本文所揭示的宿主細胞,以及醫藥上可接受之賦形劑或載劑,或者基本上由其組成或由其組成。
可用於如本文所揭示的醫藥組成物中的醫藥上可接受之賦形劑或載劑包括,例如,離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白諸如人血清白蛋白、緩衝物質諸如磷酸鹽、甘胺酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸之部分甘油酯混合物、水、鹽類或電解質諸如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠質氧化矽、三矽酸鎂、聚乙烯基吡咯烷酮、纖維素系物質(例如羧甲基纖維素鈉)、聚乙二醇、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇及羊毛脂。
本發明之另一方面為一種藥物,其包含如本文所揭示的單離之序列、如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的表現匣、如本文所揭示的載體或如本文所揭示的宿主細胞,或者基本上由其組成或由其組成。
如本文所用,參照組成物、醫藥組成物或藥物,「基本上由...組成」意為如本文所揭示的單離之核酸序列、如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的表現匣、如本文所揭示的載體或
如本文所揭示的宿主細胞係唯一治療劑或在該組成物、醫藥組成物或藥物內方具有生物活性之劑。
本發明之另一方面為一種套組,其包含如本文所揭示的單離之序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的表現匣、如本文所揭示的載體或如本文所揭示的宿主細胞,以及視需要之使用說明,或尤其組成。
「套組」為任何製品(例如,包裝或容器),其包含如本文所揭示的單離之序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的表現匣、如本文所揭示的載體或如本文所揭示的宿主細胞。套組可作為用於進行如本文所揭示的用途或方法之單位而推廣、分發或販售。
本發明之另一方面為一種如本文所揭示的單離之序列、如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的表現匣、如本文所揭示的載體、如本文所揭示的宿主細胞、如本文所揭示的組成物或如本文所揭示的醫藥組成物,其用作藥物。
本發明之另一方面為一種如本文所揭示的單離之序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的表現匣、如本文所揭示的載體、如本文所揭示的宿主細胞、如本文所揭示的組成物、醫藥組成物或如本文所揭示的藥物,其用於基因療法中。
本發明之另一方面為一種如本文所揭示的單離之序列、如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的表現匣、如本文所揭示的載體、如本文所揭示的宿主細胞、如本文所揭示的組成物、醫藥組成物或如本文所揭示的藥物,其用於治療感覺損傷。
本發明之另一方面為一種如本文所述的醫藥組成物,其用於治療感覺損傷或用於在感覺損傷的治療中使用。
本發明之另一方面為一種如本文所揭示的單離之序列、如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的表現匣、如本文所揭示的載體或如本文所揭示的宿主細胞,其用於製造用於治療感覺損傷的藥物。
本發明之另一方面為一種在有此需要之受試者中的基因療法的方法,該方法包含向受試者投予如本文所揭示的單離之序列、如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的表現匣或本文所揭示的載體。
本發明之另一方面為一種用於有此需要之受試者之治療感覺損傷的方法,該方法包含向受試者投予如本文所揭示的單離之序列、如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的表現匣或本文所揭示的載體。
於一些態樣中,感覺損傷為遺傳性或先天性感覺損傷,換言之,基因起源的感覺損傷。
本發明之另一方面為如本文所揭示的單離之序列、如本文所揭示的單離之核酸編碼序列或如本文所揭示的表現匣的用途,特定而言活體外或離體用途,用於產生載體,特定而言用於產生表現載體。
本發明之另一方面為如本文所揭示的載體的用途,特定而言活體外或離體用途,用於產生如本文所述的宿主細胞。
本發明之另一方面為如本文所揭示的單離之序列、如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的表現匣或如本文所揭示的載體的用途,特定而言活體外或離體用途,用於在不表現miR183家族之miRNA的細胞中,換言之在不表現miR183、miR182及/或miR96的細胞中,特異性地表現目標基因。例如,包含如本文所揭示的miR183靶位點的如本文所揭示的單離之序列、如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的表現匣或如本文所揭示的載體特定而言可用於在不表現miR183的細胞中特異性地表現目標基因。類似地,包含如本文所揭示的miR182靶位點的如本文所揭示的單離之序列、如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的表現匣或如本文所揭示的載體特定而言可用於在不表現miR182的細胞中特異性地表現目標基因;並且包含如本文所揭示的miR96靶位點的如本文所揭示的單離之序列、如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的表現匣或如本文所揭示的載體特定而言可用於在不表現miR96的細胞中特異性地表現目標基因。
本發明之另一方面為如本文所揭示的單離之序列、如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的表現匣或如本文所揭示的載體的用途,特定而言活體外或離體用途,用於調整或調控目標核酸諸如目標基因之表現。
本發明之另一方面為如本文所揭示的單離之序列、如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的表現匣或本文所揭示的載體的用途,用於降低目標核酸諸如目標基因之脫靶表現,其中目標
核酸之表現係待於表現miR183家族之至少一種miRNA的細胞及/組織中,換言之在表現miR183、miR182及/或miR96的細胞及/或組織中得到阻止(或者壓制或抑制)。
本發明之另一方面為一種用於產生如本文所揭示的載體的方法,該方法包含將如本文所揭示的調節元件插入載體中。
本發明之另一方面為一種用於調整或調控目標核酸諸如目標基因在包含至少兩種不同細胞類型之組織中之表現的方法,特定而言活體外或立體方法,該方法包含向該組織中引入如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的表現匣或如本文所揭示的載體。
本發明之另一方面為一種用於調整或調控目標核酸諸如目標基因在需要基因療法之受試者中之表現的方法,該方法包含向該受試者之組織中引入如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的表現匣或如本文所揭示的載體,其中該組織包含至少兩種不同細胞類型。
需要基因療法之受試者可係苦於感覺損傷,特定而言苦於先天性感覺損傷的受試者。
如本文中所用,表述「向受試者之組織中引入」可對應於向受試者全身性投予或對應於向受試者局部投予。
特定而言,包含至少兩種不同細胞類型的組織可包含欲在其中表現目標核酸之至少一種細胞類型以及不欲在其中表現目標核酸之至少一種細胞類型。
於一些態樣中,包含至少兩種不同細胞類型的組織包含表現miR183家族之至少一種miRNA(亦即,miR183、miR182及/或miR96)的至少一
種類型之細胞以及不表現miR183家族之任何miRNA的至少一種類型之細胞。特定而言,包含至少兩種不同細胞類型的組織可包含表現miR183的至少一種類型之細胞以及不表現miR183的至少一種類型之細胞。包含至少兩種不同細胞類型的組織可包含表現miR182的至少一種類型之細胞以及不表現miR182的至少一種類型之細胞。包含至少兩種不同細胞類型的組織可包含表現miR96的至少一種類型之細胞以及不表現miR96的至少一種類型之細胞。
如本文中所用,「不表現miR183家族之任何miRNA」意指不以足以使得miRNA發揮生物學活性質量,特定而言不以足以媒介基因緘默化之量表現miR183之任何miRNA。
本發明之另一方面為一種用於降低目標核酸諸如目標基因之脫靶表現的方法,其中目標核酸之表現係待於表現miR183家族之至少一種miRNA的細胞及/或組織中,換言之在表現miR183、miR182及/或miR96的細胞及/或組織中得到阻止(或者壓制或抑制),該方法包含向組織中(例如需要基因療法的受試者之組織中)引入如本文所揭示的單離之核酸編碼序列、如本文所揭示的調節元件、如本文所揭示的表現匣或如本文所揭示的載體,其中該組織包含至少兩種不同細胞類型,如本文所揭示。
序列之表
圖1A及圖1B為圖示呈現AAV匣,該AAV匣至少包含啟動子、轉殖基因(亦即,GFP)及多腺苷化或poly(A)訊號(pA)。當存在時,虛線框表示一種所謂「前驅物miR183靶位點」或「前驅物miRT183」(具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列的miR183靶位點)。圖1A表示一種AAV-GFP構建體,其不包含任何miR183靶位點。圖1B表示一種AAV-GFP-前驅物miRT183構建體,其包含插入GFP編碼序列之3'(亦即,下游)中的前驅物miR183靶位點之3個複本。
圖2A至圖2E為圖示呈現質體,該質體至少包含啟動子(亦即,smCBA啟動子)、轉殖基因(亦即,GFP)及多腺苷化或poly(A)訊號(pA)。當存在
時,虛線框表示一種前驅物miR183靶位點,其包含與has-miR183-5p互補之序列(「5p結合位點」或5P)及與hashsa-miR183-3p互補之序列(「3p結合位點」或3P)。當存在時,黑色框表示一個5p結合位點(5P),並且白色框表示一個3p結合位點(3P)。較小的加陰影框描繪間隔序列之存在(介於5p及/或3p結合位點之間)。圖2A表示一種質體構建體,其不包含任何miR183靶位點(0x前驅物miRT183或無miRT183)。圖2B表示一種質體構建體,其包含前驅物miR183靶位點之一個複本,位於smCBA-GFP匣之下游(1x前驅物miRT183)。圖2C表示一種質體構建體,其包含前驅物miR183靶位點之3個複本,位於smCBA-GFP匣之下游(3x前驅物miRT183)。圖2D表示一種質體構建體,其包含由5P結合位點組成的iR183靶位點之3個複本,位於smCBA-GFP匣之下游(3x miRT183 5P)。複本以間隔序列間隔開來,間隔序列藉由較小的加陰影框表示。圖2E表示一種質體構建體,其包含由串聯之5P及3P結合位點組成的iR183靶位點之3個複本,位於smCBA-GFP匣之下游(3x miRT183 5+3P)。5P及3P結合位點以間隔序列分隔,間隔序列藉由較小的加陰影框表示。
圖3A至圖3E示出前驅物miR183靶位點對於成熟小鼠之內耳中轉殖基因之表現的調節效應。圖3A至圖3D為共軛焦顯微鏡影像,其顯示用如圖1A中所示之AAV-GFP構建體(圖3A及圖3B)或用如圖1B中所示之AAV-GFP-前驅物miRT183構建體(圖3C及圖3D)治療之小鼠的柯帝器。圖3B及圖3D顯示用肌凝蛋白VIIa(MyoVIIa)對柯帝器中存在之毛細胞染色。圖3A及3C顯示柯帝器中的GFP表現。指示比例尺。圖3E為圖表,其顯示對用AAV-GFP構建體或用AAV-GFP-前驅物miRT183構建體治療的小鼠中之GFP陽性內毛細
胞(IHC)及外毛細胞(OHC)的量化。資料係顯示為均值±SD。統計學分析係藉由ANOVA進行(****=p<0.0001)。
圖4A至圖4D示出前驅物miR183靶位點對於HEK293細胞中轉殖基因之表現的調節效應。圖4A至圖4C為用含有前驅物miR183靶位點之0個複本(圖4A)、1個複本(圖4B)或3個複本(圖4C)之GFP表現質體轉染的HEK293細胞之共軛焦影像。白點表示GFP陽性細胞。圖4D為顯示對在細胞溶胞物中量測並且歸一化至對照(亦即,前驅物miR183靶位點之0個複本)的GFP螢光的量化圖。
圖5A及圖5B為將所謂前驅物miR183靶位點與所謂成熟miR183靶位點對於轉殖基因的調節效應進行比較圖。HEK293細胞係用如圖2中所描繪的包含不同miR183靶位點之不同質體構建體轉染。圖5A顯示藉由定量聚合酶連鎖反應(qPCR)量測的細胞溶胞物中之質體含量。圖5B顯示在細胞溶胞物中量測GFP螢光。統計學分析係Fisher之LSD多重比較進行:ns=不顯著;*=p<0.05。
圖6A及圖6B為將所謂前驅物miR183靶位點之2個複本及3個複本對於轉殖基因之表現的調節效應進行比較圖。HEK293細胞係用包含位於GFP表現匣下游的如所指示之前驅物miR183靶位點(2x前驅物miRT183或3x前驅物miRT183)的質體轉染。該等圖表顯示,在培養基替換之後24h(圖6A)或在培養基替換之後48h(圖6B)在細胞溶胞物中量測的以及歸一化至對照(亦即,無miR靶位點)的GFP螢光之量化。誤差條表示均值之標準誤差(SEM)。*:p<0.05,**:p<0.01;單因子變異數分析。
圖7A及圖7B為顯示所謂前驅物miR182靶位點對於轉殖基因之表現的調節效應圖。HEK293細胞係用包含位於GFP表現匣下游的前驅物miR182靶位點之3個複本(3x前驅物miRT182)的質體轉染。該等圖表顯示,在培養基替換之後24h(圖7A)或在培養基替換之後48h(圖7B)在細胞溶胞物中量測的以及歸一化至對照(亦即,無miR靶位點)的GFP螢光之量化。誤差條表示均值之標準誤差。****:p<0.0001;未配對雙尾T檢驗。
圖8A及圖8B為顯示所謂前驅物miR96靶位點對於轉殖基因之表現的調節效應圖。HEK293細胞係用包含位於GFP表現匣下游的前驅物miR96靶位點之3個複本(3x前驅物miRT96)的質體轉染。該等圖表顯示,在培養基替換之後24h(圖8A)或在培養基替換之後48h(圖8B)在細胞溶胞物中量測的以及歸一化至對照(亦即,無miR靶位點)的GFP螢光之量化。誤差條表示均值之標準誤差。*:p<0.05,***:p<0.001;未配對雙尾T檢驗。
本發明進一步藉由下列實施例予以示例性說明。
實施例1
材料及方法
小鼠及細胞株
野生型C57Bl/6小鼠係保持在下列標準條件下:12h/12h光/暗循環及環境豐富化。研究依從動物健康規定執行,特定而言:關於保護用於科學目
標之動物的2010年9月22日第2010/63/EU號理事會指令及2013年2月01日第2013-118號法國法令。
HEK293細胞(人類胚胎腎293細胞)係於具有10%胎牛血清(FBS)之DMEM中在標準條件下培養。
載體
構建AAV載體以用於向小鼠投予。AAV-GFP對照構建體包含GFP表現匣,其中GFP編碼序列係處於遍在型啟動子控制之下(參見圖1A)。於AAV-GFP-前驅物miRT183構建體中,將與前驅物miR183(亦即SEQ ID NO:2)之人類序列互補的具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列的miR183靶位點(所謂「前驅物miR183靶位點」)之3個複本插入GFP編碼序列之3'中(亦即,下游)(參見圖1B)。
質體載體係經構建以用於使用pAAV-smCBA-eGFP-bGH骨幹(Genscript)來轉染HEK293細胞。如圖2A所示,「無miRT183」對照構建體包含GFP表現匣,其中eGFP編碼序列處於遍在型啟動子smCBA(截短的嵌合巨細胞病毒(CMV)-雞β-肌動蛋白)調控之下。包含miR183靶位點的質體係藉由將微小RNA靶位點選殖至pAAV-smCBA-eGFP-bGH骨幹(Genscript)中而獲得:
- 包含位於smCBA-eGFP匣之下游的具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列的所謂前驅物miR183靶位點之一個複本的質體(1x前驅物miRT183-圖2B);
- 包含位於smCBA-eGFP匣之下游的具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列的所謂前驅物miR183靶位點之3個複本的質體(3x前驅物miRT183-圖2C);
- 包含由位於smCBA-GFP匣下游的與hsa-miR183-5p(亦即,SEQ ID NO:3)互補的SEQ ID NO:5中所產生之序列組成的miR183靶位點(所謂「5p結合位
點」)之3個複本的質體(3x miRT183 5P-圖2D);所謂「5p結合位點」之3個複本以具有如SEQ ID NO:14中所產生之序列的間隔序列間隔開;以及
- 包含位於smCBA-GFP匣下游的串聯之如SEQ ID NO:5中所闡述之序列(所謂「5p結合位點」,其與hsa-miR183-5p(亦即,SEQ ID NO:3)互補)及如SEQ ID NO:6中所闡述之序列(所謂「3p結合位點」,其與hsa-miR183-3p(亦即,SEQ ID NO:4)互補)所組成的miR183靶位點之3個複本的質體(3x miRT183 5+3P-圖2E);所謂「5p結合位點」及「3p結合位點」係藉由具有如SEQ ID NO:14中所闡述之序列的間隔序列分隔。於圖2D之質體「3x miRT183 5P」中,包含由如SEQ ID NO:5中所闡述之序列所組成的miR183靶位點(所謂「5p結合位點」)之三個複本以及兩個間隔序列的調節元件具有如SEQ ID NO:8中所闡述的序列。於圖2E之質體「3x miRT183 5+3P」中,包含由串聯之如SEQ ID NO:5中所闡述之序列(所謂「5p結合位點」)及如SEQ ID NO:6中所闡述之序列(所謂「3p結合位點」)所組成的miR183靶位點之三個複本以及五個間隔序列的調節元件具有如SEQ ID NO:9之所闡述之序列。
活體內實驗
在出生後第14天(P14),向野生型C57Bl/6小鼠投予包含編碼GFP(綠色螢光蛋白)之核苷酸序列的腺相關病毒載體(AAV)。透過圓窗膜將總體積1μl的AAV載體注射到小鼠內耳內。如圖1中所指示,將AAV-GFP構建體或AAV-GFP-前驅物miRT183構建體以5x1013vg/mL(載體基因體每mL)之濃度注射。注射之後兩週,將小鼠安樂死,收集顯骨並固定以進行組織學分析。解剖耳蝸之後,用肌凝蛋白VIIa(MyoVIIa)對柯帝器進行免疫標記。在耳蝸中,肌凝蛋白VIIa在
毛細胞中特異性地表現。隨後,藉由共軛焦顯微鏡分析柯帝器以評估MyoVIIa及GFP兩者的表現。
活體外實驗
為了評估對於包含miR183靶位點之調節元件之基因表現的效應,合成並比較了若干質體(參見圖2)。使用稀釋於OptiMEM培養基中的聚乙烯亞胺(PEI),在T75燒瓶中將質體(20μg)轉染在HEK293細胞中。7小時之後,將PEI-DNA-OptiMEM培養基替換為MEM 2% FBS。轉染之後三天,收集細胞,經PBS洗滌,並且用PBS-Tween 20(0.2%)溶胞。藉由離心將溶胞物澄清之後,使用Synergy盤式檢測儀(Agilent)量測GFP螢光,並且結果以任意單位提供。同時,蛋白質含量係使用BCA檢定套組(ThermoFisher)測定。細胞溶胞物中之質體複本數目係藉由TaqMan qPCR使用下列GFP引子及探針來量測:
- eGFP正向:5’-GAGCGCACCATCTTCTTCA(SEQ ID NO:18);
- eGFP反向:5’-TTCAGCTCGATGCGGTTC(SEQ ID NO:19);以及
- eGFP探針:5’-AGGACGACGGCAACTACAAGACC(SEQ ID NO:20)。
結果
為了評估所謂前驅物miR183靶位點(亦即,具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列的miR183靶位點)對於轉殖基因之表現的調節效應,用包含由前驅物miR183靶位點之3個複本所組成之調節元件的AAV-GFP-前驅物miRT183構建體(參見圖1A)對小鼠進行注射。作為對照,用不包含任何調節元件的AAV-GFP構建體(參見圖1B)對小鼠進行注射。在注射之後兩天,將小鼠安樂死,收集其等之耳蝸,針對肌凝蛋白VIIA及GFP進行染色,並藉由共軛焦顯微鏡進行分析。對來自注射AAV-GFP對照構建體的小鼠之耳蝸的分析表明GFP
及MyoVIIA在內毛細胞層中的共定位(圖3A及圖3B),顯示該等毛細胞中之有效GFP表現(內毛細胞,IHC;以及外毛細胞,OHC)。相比之下,包含前驅物miR183靶位點之3個複本的調節元件的存在抑制來自注射AAV-GFP-前驅物miR183構建體之小鼠的耳蝸之內毛細胞中的GFP表現,如藉由GFP與MyoVIIa之間共定位的不存在以及持續存在於底層支持細胞中的剩餘GFP訊號所表明(圖3C及圖3D)。在將來自注射AAV-GFP構建體或注射AAV-GFP-前驅物miRT183構建體的小鼠之耳蝸的GFP陽性毛細胞進行量化之後,亦表明了前驅物miR183靶位點之調節效應。如圖3E中所示,對於注射AAV-GFP構建體之小鼠的內毛細胞(IHC)及外毛細胞(OHC)兩者,換言之在包含miR183靶位點之調節元件不存在下,GFP陽性細胞之比例顯著較高(圖3E)。
此等資料表明,位於GFP表現匣下游的具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列的所謂前驅物miR183靶位點的存在顯著地抑制用AAV-GFP-前驅物miRT183治療之小鼠的毛細胞中之GFP表現。
為了進一步評估前驅物miR183靶位點對於轉殖基因之表現的調節效應,將HEK293細胞用不含miR183靶位點(如圖2A中所揭示)或者含有位於GFP表現匣下游的前驅物miR183靶位點之1個複本(如圖2B中所揭示)或前驅物靶位點之3個複本(如圖2C中所揭示)的質體構建體轉染。在將細胞溶胞後,使用螢光盤式檢測儀來評估經轉染之細胞中的GFP表現。如圖4A至圖4C中所示,增加質體構建體中的前驅物miR183靶位點之複本數目導致GFP陽性細胞數目減少。圖4D顯示對經轉染之HEK293細胞溶胞物中的GFP螢光之量化,並且證實(i)一種前驅物miR183靶位點的存在足以強烈地抑制GFP表現,以及(ii)增加前驅物miR183靶位點數目強化了對GFP表現的抑制。
此等資料表明,對轉殖基因的有效抑制可使用載體獲得,該等載體包含由具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列的一種所謂前驅物miR183靶位點所組成的調節元件。此外,此等資料表明,包含具有前驅物miR183靶位點之若干複本的調節元件的載體展示對於轉殖基因表現的甚至更強烈之抑制效應。
為了將前驅物miR183靶位點與由與成熟miR183之序列互補的序列所組成的所謂「成熟miR183靶位點」之調節效應進行比較,將HEK293細胞用下列質體構建體轉染:不包含miR183靶位點(如圖2A中所揭示)或者包含位於GFP表現匣下游的前驅物miR183靶位點之3個複本(如圖2C中所揭示);由如SEQ ID NO:5中所闡述之序列(所謂「5p結合位點」,其與hsa-miR183-5p互補)所組成的所謂「成熟miR183靶位點」之3個複本(如圖2D中所揭示);或串聯之如SEQ ID NO:5中所闡述之序列(所謂「5p結合位點」,其與hsa-miR183-5p互補)及如SEQ ID NO:6中所闡述之序列(所謂「3p結合位點」,其與hsa-miR183-3p互補)所組成的所謂「成熟miR183靶位點」之3個複本(如圖2E中所揭示)。首先,藉由定量PCR來評估轉染功效,並且顯示,類似之轉染功效係使用四種質體構建體中之各者獲得(圖5A)。隨後,使用螢光盤式檢測儀量測細胞溶胞物中的GFP螢光,並且表明,相較於在用不含任何miR183靶位點的對照構建體轉染的細胞中之GFP表現,在用包含前驅物miR183靶位點之3個複本的質體轉染的細胞中之GFP表現顯著降低(圖5B)。引人注目的是,相較於在用不含任何miR183靶位點的對照構建體轉染的細胞中之GFP表現,包含所謂「成熟miR183靶位點」之3個複本的兩種質體皆未能成功誘導GFP表現的顯著降低(圖5B)。
此等資料出乎意料地表明,相較於具有與成熟miR183之序列互
補的序列的所謂「成熟miR183靶位點」,具有如SEQ ID NO:1中所闡述(換言之與前驅物miR183互補)之序列的前驅物miR183靶位點在轉殖基因緘默化中的傑出效應。
實施例2
材料及方法
載體
質體載體係經構建以用於使用pAAV-smCBA-eGFP-bGH骨幹(Genscript)來轉染HEK293細胞。如實施例1中所示,「無miRT」對照構建體包含GFP表現匣,其中eGFP編碼序列處於遍在型啟動子smCBA(截短的嵌合巨細胞病毒(CMV)-雞β-肌動蛋白)調控之下。包含miRNA靶位點的質體係藉由將微小RNA靶位點選殖至pAAV-smCBA-eGFP-bGH骨幹(Genscript)中而獲得:
- 包含位於smCBA-eGFP匣之下游的具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列的所謂前驅物miR183靶位點之2個複本的質體(3x前驅物miRT183);
- 包含位於smCBA-eGFP匣之下游的具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列的所謂前驅物miR183靶位點之3個複本的質體;
- 包含位於smCBA-eGFP匣之下游的具有如SEQ ID NO:21中所闡述之序列(其與前驅物miR182之人類序列(亦即,SEQ ID NO:22)互補)的所謂前驅物miR182靶位點之3個複本的質體(3x前驅物miRT182);
- 包含位於smCBA-eGFP匣之下游的具有如SEQ ID NO:24中所闡述之序列(其與前驅物miR96之人類序列(亦即,SEQ ID NO:25)互補)的所謂前驅物miR182靶位點之3個複本的質體.
活體外實驗
為了證實如本文所揭示的包含miR183家族之miR靶位點的調節元件對於基因表現的效應,合成了若干種質體。使用稀釋於OptiMEM培養基中的聚乙烯亞胺(PEI),在6孔平盤中將質體(2μg)轉染至HEK293細胞中。12小時之後,將PEI-DNA-OptiMEM培養基替換為MEM 2% FBS(胎牛血清)。轉染之後兩天或三天(培養基替換之後24h或48h),收集細胞,經PBS洗滌,並且用PBS-Tween20(0.2%)溶胞。藉由離心將溶胞物澄清之後,使用Synergy盤式檢測儀(Agilent)量測GFP螢光。同時,蛋白質含量係使用BCA檢定套組(ThermoFisher)確定並用於將資料歸一化。
結果
HEK293細胞用不含有miR靶位點或含有位於GFP表現匣下游的前驅物miR183靶位點之2個複本、前驅物miR183靶位點(對應於SEQ ID NO:7)之3個複本、前驅物miR182靶位點(對應於SEQ ID NO:23)之3個複本、或前驅物miR96靶位點(對應於SEQ ID NO:26)之3個複本的質體轉染。經轉染之細胞中的GFP表現係使用螢光盤式檢測儀在溶解該等細胞後評估,或在培養基替換後24h(亦即,轉染後兩天)或在培養基替換後48h(亦即,轉染後三天)。
圖6顯示經轉染之HEK293細胞溶胞物中GFP螢光的量化,並且證實,前驅物miR183靶位點之存在顯著抑制GFP表現。注意,對GFP表現的抑制隨著時間推移而得以維持,在培養基替換後24h(圖6A)及培養基替換後48h(圖6B)觀察到類似之抑制水準。圖6亦證實,前驅物miR183靶位點之2個複本的存在足以顯著抑制GFP表現。
圖7顯示經轉染之HEK293細胞溶胞物中GFP螢光的量化,並且
證明,前驅物miR182靶位點之存在顯著抑制GFP表現。注意,對GFP表現的抑制隨著時間推移而得以維持,在培養基替換後24h(圖7A)及培養基替換後48h(圖7B)觀察到類似之抑制水準。
圖8顯示經轉染之HEK293細胞溶胞物中GFP螢光的量化,並且證明,前驅物miR96靶位點之存在顯著抑制GFP表現。注意,對GFP表現的抑制隨著時間推移而得以維持,在培養基替換後24h(圖8A)及培養基替換後48h(圖8B)觀察到類似之抑制水準。
此等資料提供證據表明,類似於所謂前驅物miR183靶位點(SEQ ID NO:1),所謂前驅物miR182靶位點(SEQ ID NO:21)及所謂前驅物miR96靶位點(SEQ ID NO:24)能夠顯著地抑制基因於分別表現miR182或miR96之細胞中的表現。因此,可使用如本文所揭示的miR183家族之所謂前驅物miR靶位點,例如,插入表現匣或載體中,以調節目標核酸之表現,特定而言防止目標核酸於表現miR183家族之miRNA的細胞中的表現。
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Claims (16)
- 一種單離之核酸序列,其包含miR183家族之miRNA靶位點的至少兩個複本,其中該miRNA靶位點具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中任一者具有至少90%同一性的序列。
- 如請求項1所述之單離之核酸序列,其中該miR183家族之miRNA靶位點為miR183靶位點,其具有如SEQ ID NO:1中闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的序列。
- 如請求項1或2所述之單離之核酸序列,其中該單離之核酸序列包含miR183家族之miRNA靶位點的兩個至六個複本,較佳三個複本。
- 如請求項1至3中任一項所述之單離之核酸序列,其中該單離之核酸序列包含如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26中所闡述之序列或與SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26中之任一者具有至少90%同一性的序列。
- 如請求項1至3中任一項所述之單離之核酸序列,其中該miR183家族之miRNA靶位點的複本係藉由間隔序列分隔。
- 一種表現匣,其包含啟動子、目標基因及調節元件,該調節元件包含miR183家族之miRNA靶位點的至少一個複本,其中該miRNA靶位點具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中任一者具有至少90%同一性的序列。
- 一種載體,其包含調節元件,該調節元件包含miR183家族之miRNA靶位點的至少一個複本,其中該miRNA靶位點具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:24中任一者具有至少90%同一性的序列。
- 如請求項6所述之表現匣或如請求項7所述之載體,其中該調節元件包含miR183靶位點之至少一個複本,該靶位點具有如SEQ ID NO:1中所闡述之序列或與SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的序列。
- 如請求項6或8所述之表現匣或如請求項7或8所述之載體,其中該調節元件包含miR183家族之miRNA靶位點的兩個至六個複本,較佳三個複本,該等複本視需要藉由間隔序列分隔。
- 如請求項6或8至9中任一項所述之表現匣或如請求項7至9中任一項所述之載體,其中該調節元件包含如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26中所闡述之序列或與SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:26中之任一者具有至少90%同一性的序列。
- 如請求項6或8至10中任一項所述之表現匣或請求項7至10中之任一項所述之載體,其中該調節元件進一步包含另一miRNA靶位點之至少一個複本,較佳地,miR183家族之另一miRNA靶位點之至少一個複本。
- 如請求項6或8至11中任一項所述之表現匣或如請求項7至11中任一項所述之載體,其中該載體包含目標基因,以及其中該調節元件係可操作地鏈接至或插入該目標基因內,較佳地插入該目標基因之3'-UTR內。
- 一種醫藥組成物,其包含如請求項1至5中任一項所述之單離之核酸序列、或如請求項6或8至12中任一項所述之表現匣、或如請求項7至12中任一項所述之載體,及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。
- 一種藥物,其包含如請求項1至5中任一項所述之單離之核酸序列、或如請求項6或8至12中任一項所述之表現匣、或如請求項7至12中任一項所述之載體。
- 一種如請求項1至5中任一項所述之單離之核酸序列、或如請求項6或8至12中任一項所述之表現匣、或如請求項7至12中任一項所述之載體、或如請求項13之醫藥組成物在製造藥物中之用途,該藥物用於治療有此需要之受試者的先天性感覺受損。
- 一種如請求項1至5中任一項所述之單離之核酸序列、或如請求項6或8至12中任一項所述之表現匣、或如請求項12所述之載體的用途,用於在不表現miR183家族之miRNA的細胞中特異性地表現目標基因。
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