KR20210010549A - 스플라이싱이상을 감소시키고 rna 우성 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

스플라이싱이상을 감소시키고 rna 우성 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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유니버시티 오브 워싱톤
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Abstract

본 개시는 스플라이싱 인자 단백질에 결합하고 이를 격리시키는 비정상적으로 확장된 반복부 영역을 함유하는 리보핵산(RNA) 전사체의 핵 보유를 특징으로 하는 질환을 포함하는, 부절적한 RNA 스플라이싱과 관련된 질환을 치료하는 조성물 및 방법을 특징으로 한다. 본원은 확장된 반복부 영역을 함유하는 RNA 전사체의 발현을 억제하는 간섭 RNA 구축물뿐만 아니라, 이러한 간섭 RNA 분자를 코딩하는 바이러스 벡터, 예컨대, 아데노 관련 바이러스 벡터도 개시한다. 예를 들면, 본 개시는 근긴장성 이영양증 단백질 키나제(DMPK) RNA 전사체에 어닐링하고 확장된 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부를 함유하는 DMPK RNA의 발현을 약화시키는 간섭 RNA 분자, 예컨대, siRNA, miRNA 및 shRNA 구축물을 특징으로 한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법을 이용하여 간섭 RNA 구축물 또는 이를 함유하는 벡터를, 본원에 기재된 다른 질병들 중에서 RNA 우성 질환을 갖는 환자, 예컨대, 근긴장성 이영양증을 갖는 인간 환자에게 투여하여, 상기 환자에서 스플라이싱이상(spliceopathy)의 발생을 감소시킴으로써 질환의 기저 병인을 치료할 수 있다.

Description

스플라이싱이상을 감소시키고 RNA 우성 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법
정부 실시권
본 발명은 국립보건원에 의해 부여된 승인번호 R03 AR056107 하에서 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 대한 일부 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 핵산 생명공학의 분야에 관한 것이고 부적절한 리보핵산 스플라이싱과 관련된 유전 장애를 치료하는 조성물 및 방법을 제공한다.
비정상적으로 확장된 반복부 영역을 함유하는 내생성 리보핵산(RNA) 전사체의 발현 및 핵 보유는 특히 근긴장성 이영양증 1형을 포함하는 다양한 유전성 유전 장애들의 기저를 이루는 병리인 RNA 우성의 발병을 유발한다. 근긴장성 이영양증은 가장 흔한 형태의 근이영양증이고, 7,500명의 인간 성인들 중 약 1명의 추정 빈도로 발생한다. RNA 우성은 원치 않는 생물학적 활성을 이 분자에게 부여하는, RNA 전사체의 기능 획득 돌연변이로부터 비롯된다. 근긴장성 이영양증에서, RNA 우성은 RNA 스플라이싱을 조절하는 RNA 단백질, 예컨대, 근육맹인(muscleblind) 유사 단백질을, 이러한 스플라이싱 인자 단백질에 대한 이 확장 영역의 상승된 결합력을 통해 격리시키는, 근긴장성 이영양증 단백질 키나제(DMPK)를 코딩하는 RNA 전사체에서의 확장된 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부의 존재에 의해 달성된다. RNA 우성과 관련된 다른 장애들 중에서 근긴장성 이영양증의 증상을 성공적으로 치료하고 완화시키기 위해 이용될 수 있는 전략은 부족하고, 이 질환들에 효과적인 치료제에 대한 필요성은 남아 있다.
스플라이싱이상(spliceopathy)의 발생을 감소시키고, 스플라이싱 인자 단백질에 결합하고 이를 격리시킴으로써, 다양한 메신저 RNA(mRNA) 전사체들의 적절한 스플라이싱을 방해하는 확장된 반복부 영역을 함유하는 mRNA 전사체의 발현 및 핵 보유에 의해 유도되는 병리인 핵산(RNA) 우성과 관련된 질환을 치료하는 데 유용한 조성물 및 방법이 본원에 기재되어 있다. 이러한 질환을 치료하는 데 사용될 수 있는, 본원에 기재된 조성물은 비정상적으로 확장된 반복부 영역을 함유하는 RNA 전사체의 발현을 억제하는 간섭 RNA 구축물, 예컨대, 핵에 보유된, 반복부 확장된 RNA 전사체의 부분에 어닐링하고 다양한 세포 과정들을 통해 이 병리학적 전사체의 분해를 촉진하는 siRNA, miRNA 및 shRNA 구축물을 함유하는 핵산을 포함한다. 본 개시는 추가로 이러한 간섭 RNA 구축물을 코딩하는 벡터, 예컨대, 바이러스 벡터를 특징으로 한다. 비정상적으로 확장된 반복부 영역을 함유하는 RNA 전사체의 발현을 억제하는 간섭 RNA 구축물(예를 들면, siRNA, miRNA 또는 shRNA)을 코딩하는, 본원에 기재된 예시적 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 예컨대, 슈도타이핑된(pseudotyped) AAV2/8 및 AAV2/9 벡터이다.
확장된 반복부 영역을 함유하는 RNA 전사체의 발현을 감소시키고 반복부 확장된 RNA에 의해 격리된 스플라이싱 인자 단백질을 방출시키기 위해, 본원에 기재된 조성물 및 방법을 이용하여, 간섭 RNA 구축물을 함유하는 핵산 또는 이를 코딩하는 벡터를, 특히 스플라이싱이상을 경험하고/하거나 RNA 우성과 관련된 질환, 예컨대, 근긴장성 이영양증을 갖는 환자에게 투여할 수 있다. 예를 들면, 간섭 RNA 구축물 또는 이러한 구축물을 코딩하는 바이러스 벡터, 예컨대, AAV 벡터를, 근긴장성 이영양증을 갖는 환자에게 투여함으로써, 근긴장성 이영양증 단백질 키나제(DMPK)를 코딩하는 RNA 전사체의 발현을 감소시킬 수 있기 때문에, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 이러한 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 야생형 DMPK RNA 구축물은 전형적으로 이러한 전사체의 3' 비번역 영역(UTR)에서 약 5개 내지 약 37개의 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부를 함유한다. 그러나, 근긴장성 이영양증을 갖는 환자는 50개 이상의 CUG 반복부를 함유하는 DMPK RNA 전사체를 발현한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 이 돌연변이체 DMPK RNA를 발현하는 환자를 치료함으로써, 스플라이싱 인자를 방출하여 근육 기능과 관련된 단백질의 적절한 스플라이싱을 조정하고, 근긴장성 이영양증의 기저 원인을 치료하는 데 사용될 수 있다. 유사하게, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 RNA 우성 및 반복부 확장된 RNA 전사체의 발현과 관련된 다양한 다른 장애들에서 스플라이싱이상을 감소시키고 이 장애들의 하나 이상의 기저 원인을 치료하는 데 사용될 수 있다.
본 개시는 부분적으로, 확장된 반복부 영역으로부터 멀리 떨어진 부위에서 반복부 확장된 RNA 표적에 어닐링하는 간섭 RNA 구축물을 사용하여, 이러한 RNA 전사체의 발현을 억제할 수 있고 이 분자에 의해 격리될 스플라이싱 인자 단백질을 효과적으로 방출시킬 수 있다는 놀라운 발견에 근거한다. 따라서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 상보적 뉴클레오타이드 반복부 모티프를 함유할 필요 없이 병리학적 RNA 전사체의 발현 및 핵 보유를 약화시킬 수 있다. 이 성질은 중요한 임상적 이익을 제공한다. 뉴클레오타이드 반복부는 포유동물 게놈, 예컨대, 인간 환자의 게놈에 편재되어 있다. 뉴클레오타이드 반복부를 갖지 않으나 오히려 표적 RNA 전사체의 다른 영역에 어닐링하는 간섭 RNA 구축물의 사용은 다른 전사체, 예컨대, 뉴클레오타이드 반복부 영역을 함유하도록 생성되나 스플라이싱 인자 단백질을 비정상적으로 격리시키지 않는 다른 유전자를 코딩하는 전사체의 발현을 파괴하지 않으면서 RNA 우성 질환을 발생시키는 전사체의 선택적 억제를 가능하게 한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법을 이용하여, 중요한 건강한 RNA 전사체들(예를 들면, 뉴클레오타이드 반복부를 함유하도록 생성된 비-표적 유전자를 코딩하는 RNA 전사체)의 발현뿐만 아니라 이들의 다운스트림 단백질 생성물의 발현도 보존하면서, 병리학적 뉴클레오타이드 반복부 확장을 함유하는 RNA 전사체의 발현을 감소시킬 수 있다.
제1 양태에서, 본 발명은 간섭 RNA를 코딩하는 하나 이상의 전이유전자를 함유하는 바이러스 벡터를 특징으로 한다. 예를 들면, 바이러스 벡터는 1개 내지 5개의 이러한 전이유전자, 1개 내지 10개의 이러한 전이유전자, 1개 내지 15개의 이러한 전이유전자, 1개 내지 20개의 이러한 전이유전자, 1개 내지 50개의 이러한 전이유전자, 1개 내지 100개의 이러한 전이유전자, 1개 내지 1,000개의 이러한 전이유전자, 또는 더 많은 수의 전이유전자(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 100개, 1,000개 이상의 이러한 전이유전자)를 함유할 수 있다. 간섭 RNA(들)는 길이가 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 17개, 적어도 19개, 또는 더 많은 수의 뉴클레오타이드(예를 들면, 길이가 적어도 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 더 많은 수의 뉴클레오타이드, 예컨대, 길이가 17개 내지 24개, 18개 내지 23개, 또는 19개 내지 22개의 뉴클레오타이드)일 수 있다.
간섭 RNA(들)는 예를 들면, 각각 독립적으로 길이가 10개 내지 35개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 10개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 11개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 12개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 13개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 14개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 15개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 16개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 17개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 18개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 19개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 20개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 21개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 22개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 23개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 24개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 25개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 26개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 27개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 28개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 29개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 30개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 31개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 32개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 33개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 34개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 길이가 35개의 뉴클레오타이드이다.
일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)는 확장된 반복부 영역을 함유하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링하는 부분을 함유한다. 각각의 간섭 RNA(들)의 상기 부분은 확장된 반복부 영역과 중첩되지 않는 내생성 RNA 전사체의 분절에 어닐링할 수 있다.
일부 실시양태에서, 내생성 RNA 전사체는 인간 DMPK를 코딩하고 확장된 반복부 영역을 함유한다. 확장된 반복부 영역은 예를 들면, 50개 이상의 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부, 예컨대, 약 50개 내지 약 4,000개의 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부(예를 들면, 특히 약 50개의 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부, 약 60개의 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부, 약 70개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 80개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 90개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 100개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 110개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 120개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 130개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 140개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 150개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 160개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 170개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 180개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 190개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 200개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 210개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 220개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 230개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 240개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 250개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 260개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 270개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 280개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 290개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 300개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 310개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 320개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 330개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 340개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 350개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 360개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 370개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 380개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 390개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 400개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 410개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 420개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 430개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 440개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 450개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 460개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 470개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 480개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 490개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 500개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 510개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 520개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 530개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 540개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 550개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 560개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 570개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 580개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 590개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 600개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 610개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 620개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 630개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 640개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 650개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 660개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 670개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 680개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 690개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 700개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 710개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 720개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 730개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 740개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 750개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 760개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 770개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 780개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 790개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 800개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 810개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 820개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 830개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 840개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 850개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 860개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 870개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 880개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 890개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 900개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 910개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 920개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 930개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 940개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 950개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 960개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 970개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 980개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 990개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,000개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,100개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,200개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,300개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,400개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,500개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,600개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,700개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,800개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,900개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,000개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,100개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,200개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,300개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,400개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,500개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,600개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,700개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,800개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,900개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,000개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,100개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,200개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,300개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,400개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,500개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,600개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,700개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,800개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,900개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 또는 4,000개의 트리뉴클레오타이드 반복부)를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 내생성 RNA 전사체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열에 대한 적어도 85% 서열 동일성(예를 들면, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 부분을 함유한다. 일부 실시양태에서, 내생성 RNA 전사체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열에 대한 적어도 90% 서열 동일성(예를 들면, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 부분을 함유한다. 일부 실시양태에서, 내생성 RNA 전사체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열에 대한 적어도 95% 서열 동일성(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 부분을 함유한다. 내생성 RNA 전사체는 예를 들면, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는 부분을 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 전사 시 간섭 RNA에 어닐링하지 않는 인간 DMPK, 예컨대, 코돈 최적화된 인간 DMPK를 코딩하는 전이유전자를 추가로 포함한다. 예를 들면, 인간 DMPK를 코딩하는 전이유전자에 의해 발현된 DMPK 전사체는 간섭 RNA에 85% 미만으로 상보적(예를 들면, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만으로 상보적)일 수 있다. 예를 들면, 간섭 RNA(들)와 DMPK가 동일한 프로모터로부터 발현되도록, 인간 DMPK를 코딩하는 전이유전자를, 간섭 RNA를 코딩하는 전이유전자(들)에 작동 가능하게 연결할 수 있다. 이것은 예를 들면, 간섭 RNA(들)를 코딩하는 전이유전자(들)와 인간 DMPK를 코딩하는 전이유전자 사이에 내부 리보좀 진입 부위(IRES)를 배치함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA(들)를 코딩하는 전이유전자(들)와 인간 DMPK를 코딩하는 전이유전자는 별개의 프로모터에 각각 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 서열번호 3 내지 39 중 어느 한 서열번호의 핵산 서열을 갖는 내생성 RNA 전사체의 분절에 어닐링한다.
일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK RNA의 엑손 1 내지 15 중 어느 한 엑손 내에서 내생성 RNA 전사체의 분절(예를 들면, 인간 DMPK RNA의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14 또는 엑손 15 내의 분절)에 어닐링한다. 각각의 간섭 RNA의 부분은 예를 들면, 인간 DMPK의 엑손들 중 어느 한 엑손 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 85% 상보적인(예를 들면, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 엑손 1 내지 15 중 어느 한 엑손 내의 분절의 핵산에 적어도 90% 상보적인(예를 들면, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 갖는다. 예를 들면, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 엑손 1 내지 15 중 어느 한 엑손 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 95% 상보적인(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 엑손 1 내지 15 중 어느 한 엑손 내의 분절의 핵산 서열에 완전히 상보적인 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK RNA의 인트론 1 내지 14 중 어느 한 인트론 내에서 내생성 RNA 전사체의 분절(예를 들면, 인간 DMPK RNA의 인트론 1, 인트론 2, 인트론 3, 인트론 4, 인트론 5, 인트론 6, 인트론 7, 인트론 8, 인트론 9, 인트론 10, 인트론 11, 인트론 12, 인트론 13 또는 인트론 14 내의 분절)에 어닐링한다. 각각의 간섭 RNA의 부분은 예를 들면, 인간 DMPK의 인트론 1 내지 14 중 어느 한 인트론 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 85% 상보적인(예를 들면, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 인트론 1 내지 14 중 어느 한 인트론 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 90% 상보적인(예를 들면, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 갖는다. 예를 들면, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 인트론 1 내지 14 중 어느 한 인트론 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 95% 상보적인(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 인트론 1 내지 14 중 어느 한 인트론 내의 분절의 핵산 서열에 완전히 상보적인 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK 내의 엑손-인트론 경계를 포함하는 내생성 RNA 전사체의 분절(예를 들면, 엑손 1과 인트론 1 사이, 인트론 1과 엑손 2 사이, 엑손 2와 인트론 2 사이, 인트론 2와 엑손 3 사이, 엑손 3과 인트론 3 사이, 인트론 3과 엑손 4 사이, 엑손 4와 인트론 4 사이, 인트론 4와 엑손 5 사이, 엑손 5와 인트론 5 사이, 인트론 5와 엑손 6 사이, 엑손 6과 인트론 6 사이, 인트론 6과 엑손 7 사이, 엑손 7과 인트론 7 사이, 인트론 7과 엑손 8 사이, 엑손 8과 인트론 8 사이, 인트론 8과 엑손 9 사이, 엑손 9와 인트론 9 사이, 인트론 9와 엑손 10 사이, 엑손 10과 인트론 10 사이, 인트론 10과 엑손 11 사이, 엑손 11과 인트론 11 사이, 인트론 11과 엑손 12 사이, 엑손 12와 인트론 12 사이, 인트론 12와 엑손 13 사이, 엑손 13과 인트론 13 사이, 인트론 13과 엑손 14 사이, 엑손 14와 인트론 14 사이, 또는 인트론 14와 엑손 15 사이의 경계를 포함하는 분절)에 어닐링한다. 각각의 간섭 RNA의 부분은 예를 들면, 인간 DMPK 내의 엑손-인트론 경계를 포함하는 분절의 핵산 서열에 적어도 85% 상보적인(예를 들면, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK 내의 엑손-인트론 경계를 포함하는 분절의 핵산 서열에 적어도 90% 상보적인(예를 들면, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 갖는다. 예를 들면, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK 내의 엑손-인트론 경계를 포함하는 분절의 핵산 서열에 적어도 95% 상보적인(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK 내의 엑손-인트론 경계를 포함하는 분절의 핵산 서열에 완전히 상보적인 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 5' UTR 또는 3' UTR 내의 내생성 RNA 전사체의 분절에 어닐링한다. 각각의 간섭 RNA의 부분은 예를 들면, 인간 DMPK의 5' UTR 또는 3' UTR 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 85% 상보적인(예를 들면, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 5' UTR 또는 3' UTR 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 90% 상보적인(예를 들면, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 갖는다. 예를 들면, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 5' UTR 또는 3' UTR 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 95% 상보적인(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 5' UTR 또는 3' UTR 내의 분절의 핵산 서열에 완전히 상보적인 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 인간 DMPK 내의 분절은 길이가 약 10개 내지 약 80개의 뉴클레오타이드이다. 예를 들면, 상기 분절은 길이가 10개의 뉴클레오타이드, 11개의 뉴클레오타이드, 12개의 뉴클레오타이드, 13개의 뉴클레오타이드, 14개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드, 16개의 뉴클레오타이드, 17개의 뉴클레오타이드, 18개의 뉴클레오타이드, 19개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드, 21개의 뉴클레오타이드, 22개의 뉴클레오타이드, 23개의 뉴클레오타이드, 24개의 뉴클레오타이드, 25개의 뉴클레오타이드, 26개의 뉴클레오타이드, 27개의 뉴클레오타이드, 28개의 뉴클레오타이드, 29개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드, 31개의 뉴클레오타이드, 32개의 뉴클레오타이드, 33개의 뉴클레오타이드, 34개의 뉴클레오타이드, 35개의 뉴클레오타이드, 36개의 뉴클레오타이드, 37개의 뉴클레오타이드, 38개의 뉴클레오타이드, 39개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드, 41개의 뉴클레오타이드, 42개의 뉴클레오타이드, 43개의 뉴클레오타이드, 44개의 뉴클레오타이드, 45개의 뉴클레오타이드, 46개의 뉴클레오타이드, 47개의 뉴클레오타이드, 48개의 뉴클레오타이드, 49개의 뉴클레오타이드, 50개의 뉴클레오타이드, 51개의 뉴클레오타이드, 52개의 뉴클레오타이드, 53개의 뉴클레오타이드, 54개의 뉴클레오타이드, 55개의 뉴클레오타이드, 56개의 뉴클레오타이드, 57개의 뉴클레오타이드, 58개의 뉴클레오타이드, 59개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드, 61개의 뉴클레오타이드, 62개의 뉴클레오타이드, 63개의 뉴클레오타이드, 64개의 뉴클레오타이드, 65개의 뉴클레오타이드, 66개의 뉴클레오타이드, 67개의 뉴클레오타이드, 68개의 뉴클레오타이드, 69개의 뉴클레오타이드, 70개의 뉴클레오타이드, 71개의 뉴클레오타이드, 72개의 뉴클레오타이드, 73개의 뉴클레오타이드, 74개의 뉴클레오타이드, 75개의 뉴클레오타이드, 76개의 뉴클레오타이드, 77개의 뉴클레오타이드, 78개의 뉴클레오타이드, 79개의 뉴클레오타이드 또는 80개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 DMPK 내의 분절은 길이가 약 15개 내지 약 50개의 뉴클레오타이드이고, 예컨대, 길이가 15개의 뉴클레오타이드, 16개의 뉴클레오타이드, 17개의 뉴클레오타이드, 18개의 뉴클레오타이드, 19개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드, 21개의 뉴클레오타이드, 22개의 뉴클레오타이드, 23개의 뉴클레오타이드, 24개의 뉴클레오타이드, 25개의 뉴클레오타이드, 26개의 뉴클레오타이드, 27개의 뉴클레오타이드, 28개의 뉴클레오타이드, 29개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드, 31개의 뉴클레오타이드, 32개의 뉴클레오타이드, 33개의 뉴클레오타이드, 34개의 뉴클레오타이드, 35개의 뉴클레오타이드, 36개의 뉴클레오타이드, 37개의 뉴클레오타이드, 38개의 뉴클레오타이드, 39개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드, 41개의 뉴클레오타이드, 42개의 뉴클레오타이드, 43개의 뉴클레오타이드, 44개의 뉴클레오타이드, 45개의 뉴클레오타이드, 46개의 뉴클레오타이드, 47개의 뉴클레오타이드, 48개의 뉴클레오타이드, 49개의 뉴클레오타이드 또는 50개의 뉴클레오타이드인 분절이다. 일부 실시양태에서, 인간 DMPK 내의 분절은 길이가 약 17개 내지 약 23개의 뉴클레오타이드, 예컨대, 길이가 17개의 뉴클레오타이드, 18개의 뉴클레오타이드, 19개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드, 21개의 뉴클레오타이드, 22개의 뉴클레오타이드 또는 23개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 상기 분절은 길이가 18개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 상기 분절은 길이가 19개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 상기 분절은 길이가 20개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 상기 분절은 길이가 21개의 뉴클레오타이드이다.
일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 1개 내지 8개의 뉴클레오타이드 불일치(예를 들면, 1개의 뉴클레오타이드 불일치, 2개의 뉴클레오타이드 불일치, 3개의 뉴클레오타이드 불일치, 4개의 뉴클레오타이드 불일치, 5개의 뉴클레오타이드 불일치, 6개의 뉴클레오타이드 불일치, 7개의 뉴클레오타이드 불일치 또는 8개의 뉴클레오타이드 불일치)를 가지면서, 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링한다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 1개 내지 5개의 뉴클레오타이드 불일치, 예컨대, 1개의 뉴클레오타이드 불일치, 2개의 뉴클레오타이드 불일치, 3개의 뉴클레오타이드 불일치, 4개의 뉴클레오타이드 불일치 또는 5개의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링한다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 1개 내지 3개의 뉴클레오타이드 불일치, 예컨대, 1개의 뉴클레오타이드 불일치, 2개의 뉴클레오타이드 불일치 또는 3개의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링한다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 2개 이하의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링한다. 예를 들면, 간섭 RNA는 뉴클레오타이드 불일치를 갖지 않거나, 1개의 뉴클레오타이드 불일치 또는 2개의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링할 수 있다.
일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 서열번호 3 내지 161 중 어느 한 서열번호의 핵산 서열에 대한 적어도 85% 서열 동일성(예를 들면, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 부분을 함유한다. 간섭 RNA는 예를 들면, 서열번호 3 내지 161 중 어느 한 서열번호의 핵산 서열에 대한 적어도 90% 서열 동일성(예를 들면, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 부분을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 서열번호 3 내지 161 중 어느 한 서열번호의 핵산 서열에 대한 적어도 95% 서열 동일성(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 부분을 함유한다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 서열번호 3 내지 161 중 어느 한 서열번호의 핵산 서열을 갖는 부분을 함유한다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 본원에서 표 5에 표시된 패신저(passenger) 가닥과 가이드(guide) 가닥의 조합을 갖는 miRNA이다.
일부 실시양태에서, 내생성 RNA 전사체는 인간 9번 염색체 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 72(C9ORF72) 및 확장된 반복부 영역을 함유한다. 확장된 반복부 영역은 예를 들면, 25개 초과의 GGGGCC(서열번호 162) 헥사뉴클레오타이드 반복부, 예컨대 약 700개 내지 약 1,600개의 GGGGCC(서열번호 162) 헥사뉴클레오타이드 반복부를 함유할 수 있고, 예를 들면, 확장된 반복부 영역은 특히 700개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 710개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 720개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 730개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 740개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 750개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 760개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 770개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 780개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 790개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 800개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 810개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 820개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 830개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 840개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 850개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 860개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 870개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 880개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 890개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 900개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 910개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 920개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 930개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 940개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 950개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 960개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 970개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 980개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 990개의 헥사뉴클레오타이드 반복부 또는 1,000개의 헥사뉴클레오타이드 반복부를 함유할 수 있다. 확장된 반복부 영역은 30개 이상의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 예컨대 30개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 40개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 50개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 60개의 CUG 헥사뉴클레오타이드 반복부, 70개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 80개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 90개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 100개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 110개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 120개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 130개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 140개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 150개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 160개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 170개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 180개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 190개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 200개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 210개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 220개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 230개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 240개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 250개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 260개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 270개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 280개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 290개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 300개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 310개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 320개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 330개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 340개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 350개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 360개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 370개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 380개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 390개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 400개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 410개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 420개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 430개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 440개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 450개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 460개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 470개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 480개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 490개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 500개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 510개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 520개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 530개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 540개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 550개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 560개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 570개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 580개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 590개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 600개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 610개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 620개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 630개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 640개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 650개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 660개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 670개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 680개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 690개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 700개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 710개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 720개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 730개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 740개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 750개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 760개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 770개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 780개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 790개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 800개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 810개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 820개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 830개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 840개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 850개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 860개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 870개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 880개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 890개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 900개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 910개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 920개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 930개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 940개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 950개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 960개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 970개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 980개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 990개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 1,000개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 1,100개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 1,200개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 1,300개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 1,400개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 1,500개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 1,600개의 헥사뉴클레오타이드 반복부, 또는 더 많은 수의 헥사뉴클레오타이드 반복부를 함유할 수 있다 .
일부 실시양태에서, 내생성 RNA 전사체는 서열번호 163의 핵산 서열에 대한 적어도 85% 서열 동일성(예를 들면, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 부분을 함유한다. 내생성 RNA 전사체는 서열번호 163의 핵산 서열에 대한 적어도 90% 서열 동일성(예를 들면, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 부분을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 내생성 RNA 전사체는 서열번호 163의 핵산 서열에 대한 적어도 95% 서열 동일성(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 부분을 함유한다. 일부 실시양태에서, RNA 전사체는 서열번호 163의 핵산 서열을 갖는 부분을 함유한다.
일부 실시양태에서, 내생성 RNA 전사체는 서열번호 165의 핵산 서열에 대한 적어도 85% 서열 동일성(예를 들면, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 부분을 함유한다. 내생성 RNA 전사체는 예를 들면, 서열번호 165의 핵산 서열에 대한 적어도 90% 서열 동일성(예를 들면, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 부분을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 내생성 RNA 전사체는 서열번호 165의 핵산 서열에 대한 적어도 95% 서열 동일성(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 부분을 함유한다. 일부 실시양태에서, RNA 전사체는 서열번호 165의 핵산 서열을 갖는 부분을 함유한다.
일부 실시양태에서, 내생성 RNA 전사체는 서열번호 166의 핵산 서열에 대한 적어도 85% 서열 동일성(예를 들면, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 부분을 함유한다. 내생성 RNA 전사체는 예를 들면, 서열번호 166의 핵산 서열에 대한 적어도 90% 서열 동일성(예를 들면, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 부분을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 내생성 RNA 전사체는 서열번호 166의 핵산 서열에 대한 적어도 95% 서열 동일성(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 부분을 함유한다. 일부 실시양태에서, RNA 전사체는 서열번호 166의 핵산 서열을 갖는 부분을 함유한다.
일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 C9ORF72 내의 분절의 핵산 서열, 예컨대, 서열번호 163, 165 또는 166 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 85% 상보적인(예를 들면, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 C9ORF72 내의 분절의 핵산 서열, 예컨대, 서열번호 163, 165 또는 166 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 90% 상보적인(예를 들면, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 갖는다. 예를 들면, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 C9ORF72 내의 분절의 핵산 서열, 예컨대, 서열번호 163, 165 또는 166 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 95% 상보적인(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 C9ORF72 내의 분절의 핵산 서열, 예컨대, 서열번호 163, 165 또는 166 내의 분절의 핵산 서열에 완전히 상보적인 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 인간 C9ORF72 내의 분절은 길이가 약 10개 내지 약 80개의 뉴클레오타이드이다. 예를 들면, 상기 분절은 길이가 10개의 뉴클레오타이드, 11개의 뉴클레오타이드, 12개의 뉴클레오타이드, 13개의 뉴클레오타이드, 14개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드, 16개의 뉴클레오타이드, 17개의 뉴클레오타이드, 18개의 뉴클레오타이드, 19개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드, 21개의 뉴클레오타이드, 22개의 뉴클레오타이드, 23개의 뉴클레오타이드, 24개의 뉴클레오타이드, 25개의 뉴클레오타이드, 26개의 뉴클레오타이드, 27개의 뉴클레오타이드, 28개의 뉴클레오타이드, 29개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드, 31개의 뉴클레오타이드, 32개의 뉴클레오타이드, 33개의 뉴클레오타이드, 34개의 뉴클레오타이드, 35개의 뉴클레오타이드, 36개의 뉴클레오타이드, 37개의 뉴클레오타이드, 38개의 뉴클레오타이드, 39개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드, 41개의 뉴클레오타이드, 42개의 뉴클레오타이드, 43개의 뉴클레오타이드, 44개의 뉴클레오타이드, 45개의 뉴클레오타이드, 46개의 뉴클레오타이드, 47개의 뉴클레오타이드, 48개의 뉴클레오타이드, 49개의 뉴클레오타이드, 50개의 뉴클레오타이드, 51개의 뉴클레오타이드, 52개의 뉴클레오타이드, 53개의 뉴클레오타이드, 54개의 뉴클레오타이드, 55개의 뉴클레오타이드, 56개의 뉴클레오타이드, 57개의 뉴클레오타이드, 58개의 뉴클레오타이드, 59개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드, 61개의 뉴클레오타이드, 62개의 뉴클레오타이드, 63개의 뉴클레오타이드, 64개의 뉴클레오타이드, 65개의 뉴클레오타이드, 66개의 뉴클레오타이드, 67개의 뉴클레오타이드, 68개의 뉴클레오타이드, 69개의 뉴클레오타이드, 70개의 뉴클레오타이드, 71개의 뉴클레오타이드, 72개의 뉴클레오타이드, 73개의 뉴클레오타이드, 74개의 뉴클레오타이드, 75개의 뉴클레오타이드, 76개의 뉴클레오타이드, 77개의 뉴클레오타이드, 78개의 뉴클레오타이드, 79개의 뉴클레오타이드 또는 80개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 C9ORF72 내의 분절은 길이가 약 15개 내지 약 50개의 뉴클레오타이드이고, 예컨대, 길이가 15개의 뉴클레오타이드, 16개의 뉴클레오타이드, 17개의 뉴클레오타이드, 18개의 뉴클레오타이드, 19개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드, 21개의 뉴클레오타이드, 22개의 뉴클레오타이드, 23개의 뉴클레오타이드, 24개의 뉴클레오타이드, 25개의 뉴클레오타이드, 26개의 뉴클레오타이드, 27개의 뉴클레오타이드, 28개의 뉴클레오타이드, 29개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드, 31개의 뉴클레오타이드, 32개의 뉴클레오타이드, 33개의 뉴클레오타이드, 34개의 뉴클레오타이드, 35개의 뉴클레오타이드, 36개의 뉴클레오타이드, 37개의 뉴클레오타이드, 38개의 뉴클레오타이드, 39개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드, 41개의 뉴클레오타이드, 42개의 뉴클레오타이드, 43개의 뉴클레오타이드, 44개의 뉴클레오타이드, 45개의 뉴클레오타이드, 46개의 뉴클레오타이드, 47개의 뉴클레오타이드, 48개의 뉴클레오타이드, 49개의 뉴클레오타이드 또는 50개의 뉴클레오타이드인 분절이다. 일부 실시양태에서, 인간 C9ORF72 내의 분절은 길이가 약 17개 내지 약 23개의 뉴클레오타이드이고, 예컨대, 길이가 17개의 뉴클레오타이드, 18개의 뉴클레오타이드, 19개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드, 21개의 뉴클레오타이드, 22개의 뉴클레오타이드 또는 23개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 상기 분절은 길이가 18개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 상기 분절은 길이가 19개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 상기 분절은 길이가 20개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 상기 분절은 길이가 21개의 뉴클레오타이드이다.
일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 1개 내지 8개의 뉴클레오타이드 불일치(예를 들면, 1개의 뉴클레오타이드 불일치, 2개 뉴클레오타이드 불일치, 3개의 뉴클레오타이드 불일치, 4개의 뉴클레오타이드 불일치, 5개의 뉴클레오타이드 불일치, 6개의 뉴클레오타이드 불일치, 7개의 뉴클레오타이드 불일치, 또는 8개의 뉴클레오타이드 불일치)를 가지면서, 인간 C9ORF72를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링한다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 1개 내지 5개의 뉴클레오타이드 불일치, 예컨대, 1개의 뉴클레오타이드 불일치, 2개의 뉴클레오타이드 불일치, 3개의 뉴클레오타이드 불일치, 4개의 뉴클레오타이드 불일치 또는 5개의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 C9ORF72를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링한다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 1개 내지 3개의 뉴클레오타이드 불일치, 예컨대, 1개의 뉴클레오타이드 불일치, 2개의 뉴클레오타이드 불일치 또는 3개의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 C9ORF72를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링한다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 2개 이하의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 C9ORF72를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링한다. 예를 들면, 간섭 RNA는 뉴클레오타이드 불일치를 갖지 않거나, 1개의 뉴클레오타이드 불일치 또는 2개의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 C9ORF72를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링할 수 있다.
일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 마이크로 RNA(miRNA), 예컨대, U6 miRNA이다. 예를 들면, 표적 mRNA(예를 들면, 본원에 기재된 표적 mRNA)에 대한 상보성을 위해 필요한 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 miRNA는 내생성 인간 miR30a 핵산 서열에 기반할 수 있다. miRNA의 경우, 바이러스 벡터는 예를 들면, 성숙 miRNA를 코딩하는 일차 miRNA(pri-miRNA) 전사체를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 성숙 miRNA를 코딩하는 pre-miRNA 전사체를 함유한다.
일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 근육 세포 또는 신경에서 간섭 RNA의 발현을 유도하는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 상기 프로모터는 예를 들면, 데스민(desmin) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터, 근육 크레아틴 키나제 프로모터, 미오신 경쇄 프로모터, 미오신 중쇄 프로모터, 심장 트로포닌(troponin) C 프로모터, 트로포닌 I 프로모터, myoD 유전자 패밀리 프로모터, 액틴 알파 프로모터, 액틴 베타 프로모터, 액틴 감마 프로모터, 또는 눈 페어링 유사 호메오도메인(ocular paired like homeodomain) 3(PITX3)의 인트론 1 내의 프로모터일 수 있다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 AAV, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 백시니아 바이러스, 또는 합성 바이러스이다. 바이러스 벡터는 예를 들면, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10 또는 AAVrh74 혈청형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 슈도타이핑된 AAV, 예컨대, AAV2/8 또는 AAV/29 벡터이다. 바이러스 벡터는 재조합 캡시드 단백질을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 합성 바이러스, 예컨대 키메라 바이러스, 모자이크 바이러스 또는 슈도타이핑된 바이러스, 및/또는 외래 단백질, 합성 중합체, 나노입자 또는 소분자를 함유하는 합성 바이러스이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 3 내지 161 중 어느 한 서열번호의 핵산 서열에 대한 적어도 85% 서열 동일성(예를 들면, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 부분을 함유하는 간섭 RNA를 코딩하거나 함유하는 핵산을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 서열번호 3 내지 161 중 어느 한 서열번호의 핵산 서열에 대한 적어도 90% 서열 동일성(예를 들면, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 부분을 함유한다. 간섭 RNA는 예를 들면, 서열번호 3 내지 161 중 어느 한 서열번호의 핵산 서열에 대한 적어도 95% 서열 동일성(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 부분을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 서열번호 3 내지 161 중 어느 한 서열번호의 핵산 서열을 갖는 부분을 함유한다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 본원에서 표 5에 표시된 패신저 가닥과 가이드 가닥의 조합을 갖는 miRNA이다.
일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK RNA의 엑손 1 내지 15 중 어느 한 엑손 내에서 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체의 분절(예를 들면, 인간 DMPK RNA의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 엑손 12, 엑손 13, 엑손 14 또는 엑손 15 내의 분절)에 어닐링한다. 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 엑손 1 내지 15 중 어느 한 엑손 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 85% 상보적인(예를 들면, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 엑손 1 내지 15 중 어느 한 엑손 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 90% 상보적인(예를 들면, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 갖는다. 예를 들면, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 엑손 1 내지 15 중 어느 한 엑손 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 95% 상보적인(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 엑손 1 내지 15 중 어느 한 엑손 내의 분절의 핵산 서열에 완전히 상보적인 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK RNA의 인트론 1 내지 14 중 어느 한 인트론 내에서 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체의 분절(예를 들면, 인간 DMPK RNA의 인트론 1, 인트론 2, 인트론 3, 인트론 4, 인트론 5, 인트론 6, 인트론 7, 인트론 8, 인트론 9, 인트론 10, 인트론 11, 인트론 12, 인트론 13 또는 인트론 14 내의 분절)에 어닐링한다. 각각의 간섭 RNA의 부분은 예를 들면, 인간 DMPK의 인트론 1 내지 14 중 어느 한 인트론 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 85% 상보적인(예를 들면, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 인트론 1 내지 14 중 어느 한 인트론 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 90% 상보적인(예를 들면, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 갖는다. 예를 들면, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 인트론 1 내지 14 중 어느 한 인트론 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 95% 상보적인(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 인트론 1 내지 14 중 어느 한 인트론 내의 분절의 핵산 서열에 완전히 상보적인 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK 내의 엑손-인트론 경계를 포함하는, 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체의 분절(예를 들면, 엑손 1과 인트론 1 사이, 인트론 1과 엑손 2 사이, 엑손 2와 인트론 2 사이, 인트론 2와 엑손 3 사이, 엑손 3과 인트론 3 사이, 인트론 3과 엑손 4 사이, 엑손 4와 인트론 4 사이, 인트론 4와 엑손 5 사이, 엑손 5와 인트론 5 사이, 인트론 5와 엑손 6 사이, 엑손 6과 인트론 6 사이, 인트론 6과 엑손 7 사이, 엑손 7과 인트론 7 사이, 인트론 7과 엑손 8 사이, 엑손 8과 인트론 8 사이, 인트론 8과 엑손 9 사이, 엑손 9와 인트론 9 사이, 인트론 9와 엑손 10 사이, 엑손 10과 인트론 10 사이, 인트론 10과 엑손 11 사이, 엑손 11과 인트론 11 사이, 인트론 11과 엑손 12 사이, 엑손 12와 인트론 12 사이, 인트론 12와 엑손 13 사이, 엑손 13과 인트론 13 사이, 인트론 13과 엑손 14 사이, 엑손 14와 인트론 14 사이, 또는 인트론 14와 엑손 15 사이의 경계를 포함하는 분절)에 어닐링한다. 각각의 간섭 RNA의 부분은 예를 들면, 인간 DMPK 내의 엑손-인트론 경계를 포함하는 분절의 핵산 서열에 적어도 85% 상보적인(예를 들면, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK 내의 엑손-인트론 경계를 포함하는 분절의 핵산 서열에 적어도 90% 상보적인(예를 들면, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 갖는다. 예를 들면, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK 내의 엑손-인트론 경계를 포함하는 분절의 핵산 서열에 적어도 95% 상보적인(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK 내의 엑손-인트론 경계를 포함하는 분절의 핵산 서열에 완전히 상보적인 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 5' UTR 또는 3' UTR 내에서 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체의 분절에 어닐링한다. 각각의 간섭 RNA의 부분은 예를 들면, 인간 DMPK의 5' UTR 또는 3' UTR 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 85% 상보적인(예를 들면, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 5' UTR 또는 3' UTR 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 90% 상보적인(예를 들면, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 갖는다. 예를 들면, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 5' UTR 또는 3' UTR 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 95% 상보적인(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 5' UTR 또는 3' UTR 내의 분절의 핵산 서열에 완전히 상보적인 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 인간 DMPK 내의 분절은 길이가 약 10개 내지 약 80개의 뉴클레오타이드이다. 예를 들면, 상기 분절은 길이가 10개의 뉴클레오타이드, 11개의 뉴클레오타이드, 12개의 뉴클레오타이드, 13개의 뉴클레오타이드, 14개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드, 16개의 뉴클레오타이드, 17개의 뉴클레오타이드, 18개의 뉴클레오타이드, 19개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드, 21개의 뉴클레오타이드, 22개의 뉴클레오타이드, 23개의 뉴클레오타이드, 24개의 뉴클레오타이드, 25개의 뉴클레오타이드, 26개의 뉴클레오타이드, 27개의 뉴클레오타이드, 28개의 뉴클레오타이드, 29개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드, 31개의 뉴클레오타이드, 32개의 뉴클레오타이드, 33개의 뉴클레오타이드, 34개의 뉴클레오타이드, 35개의 뉴클레오타이드, 36개의 뉴클레오타이드, 37개의 뉴클레오타이드, 38개의 뉴클레오타이드, 39개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드, 41개의 뉴클레오타이드, 42개의 뉴클레오타이드, 43개의 뉴클레오타이드, 44개의 뉴클레오타이드, 45개의 뉴클레오타이드, 46개의 뉴클레오타이드, 47개의 뉴클레오타이드, 48개의 뉴클레오타이드, 49개의 뉴클레오타이드, 50개의 뉴클레오타이드, 51개의 뉴클레오타이드, 52개의 뉴클레오타이드, 53개의 뉴클레오타이드, 54개의 뉴클레오타이드, 55개의 뉴클레오타이드, 56개의 뉴클레오타이드, 57개의 뉴클레오타이드, 58개의 뉴클레오타이드, 59개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드, 61개의 뉴클레오타이드, 62개의 뉴클레오타이드, 63개의 뉴클레오타이드, 64개의 뉴클레오타이드, 65개의 뉴클레오타이드, 66개의 뉴클레오타이드, 67개의 뉴클레오타이드, 68개의 뉴클레오타이드, 69개의 뉴클레오타이드, 70개의 뉴클레오타이드, 71개의 뉴클레오타이드, 72개의 뉴클레오타이드, 73개의 뉴클레오타이드, 74개의 뉴클레오타이드, 75개의 뉴클레오타이드, 76개의 뉴클레오타이드, 77개의 뉴클레오타이드, 78개의 뉴클레오타이드, 79개의 뉴클레오타이드 또는 80개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 DMPK 내의 분절은 길이가 약 15개 내지 약 50개의 뉴클레오타이드이고, 예컨대, 길이가 15개의 뉴클레오타이드, 16개의 뉴클레오타이드, 17개의 뉴클레오타이드, 18개의 뉴클레오타이드, 19개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드, 21개의 뉴클레오타이드, 22개의 뉴클레오타이드, 23개의 뉴클레오타이드, 24개의 뉴클레오타이드, 25개의 뉴클레오타이드, 26개의 뉴클레오타이드, 27개의 뉴클레오타이드, 28개의 뉴클레오타이드, 29개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드, 31개의 뉴클레오타이드, 32개의 뉴클레오타이드, 33개의 뉴클레오타이드, 34개의 뉴클레오타이드, 35개의 뉴클레오타이드, 36개의 뉴클레오타이드, 37개의 뉴클레오타이드, 38개의 뉴클레오타이드, 39개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드, 41개의 뉴클레오타이드, 42개의 뉴클레오타이드, 43개의 뉴클레오타이드, 44개의 뉴클레오타이드, 45개의 뉴클레오타이드, 46개의 뉴클레오타이드, 47개의 뉴클레오타이드, 48개의 뉴클레오타이드, 49개의 뉴클레오타이드 또는 50개의 뉴클레오타이드인 분절이다. 일부 실시양태에서, 인간 DMPK 내의 분절은 길이가 약 17개 내지 약 23개의 뉴클레오타이드, 예컨대, 길이가 17개의 뉴클레오타이드, 18개의 뉴클레오타이드, 19개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드, 21개의 뉴클레오타이드, 22개의 뉴클레오타이드 또는 23개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 상기 분절은 길이가 18개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 상기 분절은 길이가 19개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 상기 분절은 길이가 20개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시양태에서, 상기 분절은 길이가 21개의 뉴클레오타이드이다.
일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 1개 내지 8개의 뉴클레오타이드 불일치(예를 들면, 1개의 뉴클레오타이드 불일치, 2개의 뉴클레오타이드 불일치, 3개의 뉴클레오타이드 불일치, 4개의 뉴클레오타이드 불일치, 5개의 뉴클레오타이드 불일치, 6개의 뉴클레오타이드 불일치, 7개의 뉴클레오타이드 불일치, 또는 8개의 뉴클레오타이드 불일치)를 가지면서, 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링한다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 1개 내지 5개의 뉴클레오타이드 불일치, 예컨대, 1개의 뉴클레오타이드 불일치, 2개의 뉴클레오타이드 불일치, 3개의 뉴클레오타이드 불일치, 4개의 뉴클레오타이드 불일치 또는 5개의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링한다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 1개 내지 3개의 뉴클레오타이드 불일치, 예컨대, 1개의 뉴클레오타이드 불일치, 2개의 뉴클레오타이드 불일치, 또는 3개의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링한다. 일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 2개 이하의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링한다. 예를 들면, 간섭 RNA는 뉴클레오타이드 불일치를 갖지 않거나, 1개의 뉴클레오타이드 불일치 또는 2개의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링할 수 있다.
일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 siRNA, shRNA 또는 miRNA, 예컨대, U6 miRNA이다. 예를 들면, 표적 mRNA(예를 들면, 본원에 기재된 표적 mRNA)에 대한 상보성을 위해 필요한 하나 이상의 핵산 치환을 갖는 miRNA는 내생성 인간 miR30a 핵산 서열에 기반할 수 있다. miRNA의 경우, 핵산은 예를 들면, 성숙 miRNA를 코딩하는 pri-miRNA 전사체를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 성숙 miRNA를 코딩하는 pre-miRNA 전사체를 함유한다.
일부 실시양태에서, 간섭 RNA는 근육 세포 또는 신경에서 간섭 RNA의 발현을 유도하는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 상기 프로모터는 예를 들면, 데스민 프로모터, PGK 프로모터, 근육 크레아틴 키나제 프로모터, 미오신 경쇄 프로모터, 미오신 중쇄 프로모터, 심장 트로포닌 C 프로모터, 트로포닌 I 프로모터, myoD 유전자 패밀리 프로모터, 액틴 알파 프로모터, 액틴 베타 프로모터, 액틴 감마 프로모터, 또는 눈 PITX3의 인트론 1 내의 프로모터일 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 상기 양태들 또는 실시양태들 중 임의의 양태 또는 실시양태의 핵산을 함유하는 벡터를 특징으로 한다. 상기 벡터는 예를 들면, AAV(예를 들면, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10 또는 AAVrh74 혈청형, 또는 슈도타이핑된 AAV, 예컨대, AAV2/8 또는 AAV/29 벡터), 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 백시니아 바이러스, 또는 합성 바이러스(예를 들면, 키메라 바이러스, 모자이크 바이러스, 또는 슈도타이핑된 바이러스, 및/또는 외래 단백질, 합성 중합체, 나노입자 또는 소분자를 함유하는 합성 바이러스)일 수 있고, 하나 이상의 재조합 캡시드 단백질을 함유할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 양태들 또는 실시양태들 중 임의의 양태 또는 실시양태의 핵산을 함유하는 조성물을 특징으로 한다. 상기 조성물은 예를 들면, 리포좀, 소포, 합성 소포, 엑소좀, 합성 엑소좀, 덴드리머 또는 나노입자일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 양태들 또는 실시양태들 중 임의의 양태 또는 실시양태의 핵산을 함유하는 약학 조성물을 특징으로 한다. 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 스플라이싱이상의 발생 감소를 필요로 하는 환자, 예컨대, 인간 환자에서 스플라이싱이상(예를 들면, 스플라이싱이 부분적으로 근육맹인 유사 단백질의 활성에 의해 조절되는 mRNA 전사체의) 발생을 감소시키는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 상기 양태들 또는 실시양태들 중 임의의 양태 또는 실시양태의 백터 또는 조성물을 치료 유효량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자는 근긴장성 이영양증을 갖는다. 상기 벡터 또는 조성물을 환자에게 투여할 때, 상기 환자는 근육맹인 유사 단백질의 하나 이상의 RNA 전사체 기질의 정확한 스플라이싱의 증가를 나타낼 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 확장된 반복부 영역을 함유하는 RNA의 핵 보유를 특징으로 하는 질환의 치료를 필요로 하는 환자, 예컨대, 인간 환자에서 상기 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 양태들 또는 실시양태들 중 임의의 양태 또는 실시양태의 벡터 또는 조성물을 치료 유효량으로 상기 환자에게 투여함으로써 치료하는 방법을 특징으로 한다. 상기 장애는 예를 들면, 근긴장성 이영양증일 수 있고, 핵에 보유된 RNA는 DMPK RNA일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 장애는 근위축성 측삭 경화증이고, 핵에 보유된 RNA는 C9ORF72 RNA이다.
상기 벡터 또는 조성물을 환자에게 투여할 때, 상기 환자는 근육맹인 유사 단백질의 하나 이상의 RNA 전사체 기질의 정확한 스플라이싱의 증가를 나타낼 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터 또는 조성물을 환자에게 투여할 때, 상기 환자는 예를 들면, 본원에 기재된 RNA 또는 단백질 검출 어세이를 이용함으로써 평가될 때, 엑손 22를 함유하는 근세포질/소포체 칼슘 ATPase 1(SERCA1) mRNA의 발현의 증가, 예컨대, 약 1.1배 내지 약 10배 증가, 또는 더 많은 증가(예를 들면, 엑손 22를 함유하는 SERCA1 mRNA의 발현의 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3배, 3.1배, 3.2배, 3.3배, 3.4배, 3.5배, 3.6배, 3.7배, 3.8배, 3.9배, 4배, 4.1배, 4.2배, 4.3배, 4.4배, 4.5배, 4.6배, 4.7배, 4.8배, 4.9배, 5배, 5.1배, 5.2배, 5.3배, 5.4배, 5.5배, 5.6배, 5.7배, 5.8배, 5.9배, 6배, 6.1배, 6.2배, 6.3배, 6.4배, 6.5배, 6.6배, 6.7배, 6.8배, 6.9배, 7배, 7.1배, 7.2배, 7.3배, 7.4배, 7.5배, 7.6배, 7.7배, 7.8배, 7.9배, 8배, 8.1배, 8.2배, 8.3배, 8.4배, 8.5배, 8.6배, 8.7배, 8.8배, 8.9배, 9배, 9.1배, 9.2배, 9.3배, 9.4배, 9.5배, 9.6배, 9.7배, 9.8배, 9.9배, 10배 이상의 증가)를 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 벡터 또는 조성물을 환자에게 투여할 때, 상기 환자는 예를 들면, 본원에 기재된 RNA 또는 단백질 검출 어세이를 이용함으로써 평가될 때, 엑손 7a를 함유하는 클로라이드 전압 개폐성 채널 1(CLCN1) mRNA의 발현의 감소, 예컨대, 약 1% 내지 약 100%의 감소(예를 들면, 엑손 7a를 함유하는 CLCN1 mRNA의 발현의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 감소)를 나타낼 수 있다
예를 들면, 상기 벡터 또는 조성물을 환자에게 투여할 때, 상기 환자는 예를 들면, 본원에 기재된 RNA 또는 단백질 검출 어세이를 이용함으로써 평가될 때, 엑손 11을 함유하는 ZO-2 관련 스펙클(speckle) 단백질(ZASP)의 발현의 감소, 예컨대, 약 1% 내지 약 100%의 감소(예를 들면, 엑손 11을 함유하는 ZASP mRNA의 발현의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 감소)를 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 벡터 또는 조성물을 환자에게 투여할 때, 상기 환자는 예를 들면, 본원에 기재된 RNA 또는 단백질 검출 어세이를 이용함으로써 평가될 때, 인슐린 수용체, 리아노딘 수용체 1(RYR1), 심근 트로포닌 및/또는 골격근 트로포닌을 코딩하는 RNA 전사체의 정확한 스플라이싱의 증가, 예컨대, 약 1.1배 내지 약 10배 증가, 또는 더 많은 증가(예를 들면, 인슐린 수용체, RYR1, 심근 트로포닌 및/또는 골격근 트로포닌을 코딩하는 정확히 스플라이싱된 RNA 전사체의 발현의 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3배, 3.1배, 3.2배, 3.3배, 3.4배, 3.5배, 3.6배, 3.7배, 3.8배, 3.9배, 4배, 4.1배, 4.2배, 4.3배, 4.4배, 4.5배, 4.6배, 4.7배, 4.8배, 4.9배, 5배, 5.1배, 5.2배, 5.3배, 5.4배, 5.5배, 5.6배, 5.7배, 5.8배, 5.9배, 6배, 6.1배, 6.2배, 6.3배, 6.4배, 6.5배, 6.6배, 6.7배, 6.8배, 6.9배, 7배, 7.1배, 7.2배, 7.3배, 7.4배, 7.5배, 7.6배, 7.7배, 7.8배, 7.9배, 8배, 8.1배, 8.2배, 8.3배, 8.4배, 8.5배, 8.6배, 8.7배, 8.8배, 8.9배, 9배, 9.1배, 9.2배, 9.3배, 9.4배, 9.5배, 9.6배, 9.7배, 9.8배, 9.9배, 10배 이상의 증가)를 나타낸다.
상기 두 이전 양태들 중 어느 한 양태의 일부 실시양태에서, 상기 벡터 또는 조성물은 정맥내, 수막공간내, 뇌실내, 뇌실질내, 수조내, 피내, 경피, 비경구, 근육내, 비내, 피하, 침피, 기관내, 복강내, 동맥내, 혈관내, 흡입, 관류, 세척 또는 경구 투여에 의해 환자에게 투여된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 양태들 또는 실시양태들 중 임의의 양태 또는 실시양태의 벡터 또는 조성물을 함유하는 키트를 특징으로 한다. 상기 키트는 환자에서 스플라이싱이상, 예컨대, 스플라이싱이 부분적으로 근육맹인 유사 단백질의 활성에 의해 조절되는 mRNA 전사체의 스플라이싱이상의 발생을 감소시키기 위해 상기 벡터 또는 조성물을 환자에게 투여하도록 키트의 사용자에게 지시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 상기 양태들 또는 실시양태들 중 임의의 양태 또는 실시양태의 벡터 또는 조성물, 및 환자에서 스플라이싱이상의 발생을 감소시켜 확장된 반복부 영역을 포함하는 RNA의 핵 보유를 특징으로 하는 질환을 치료하기 위해 상기 벡터 또는 조성물을 환자에게 투여하도록 키트의 사용자에게 지시하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트를 특징으로 한다. 상기 질환은 예를 들면, 근긴장성 이영양증일 수 있고, 핵에 보유된 RNA는 DMPK RNA일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 질환은 근위축성 측삭 경화증이고, 핵에 보유된 RNA는 C9ORF72 RNA이다.
정의
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 기재된 값의 10% 위 또는 아래 이내에 있는 값을 지칭한다. 예를 들면, 어구 "약 100개의 핵산 잔기들"은 90개 내지 110개의 핵산 잔기들이라는 값을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "어닐링한다"는 예를 들면, 와슨-크릭(Watson-Crick) 염기 페어링에 따라 가닥 사이의 수소결합에 의해 매개된 하이브리드화에 의한 핵산의 안정한 이중체의 형성을 지칭한다. 이중체의 핵산은 예를 들면, 서로 적어도 50% 상보적(예를 들면, 서로 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적)일 수 있다. 한 핵산과 또 다른 핵산의 어닐링 시 형성된 "안정한 이중체"는 엄격한 세척에 의해 변성되지 않는 이중체 구조물이다. 예시적 엄격한 세척 조건은 당분야에서 공지되어 있고 이중체의 개별 가닥의 용융 온도보다 약 5℃ 더 낮은 온도 및 저농도의 1가 염, 예컨대, 0.2 M 이하(예를 들면, 0.2 M, 0.19 M, 0.18 M, 0.17 M, 0.16 M, 0.15 M, 0.14 M, 0.13 M, 0.12 M, 0.11 M, 0.1 M, 0.09 M, 0.08 M, 0.07 M, 0.06 M, 0.05 M, 0.04 M, 0.03 M, 0.02 M, 0.01 M 이하)의 1가 염 농도(예를 들면, NaCl 농도)를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "보존적 돌연변이", "보존적 치환" 또는 "보존적 아미노산 치환"은 유사한 물리화학적 성질, 예컨대, 극성, 정전하 및 입체적 부피를 나타내는 하나 이상의 상이한 아미노산에 의한 하나 이상의 아미노산의 치환을 지칭한다. 이 성질들은 하기 표 1에서 20종의 천연 생성 아미노산들 각각에 대해 요약되어 있다.
Figure pct00001
보존적 아미노산 패밀리는 예를 들면, (i) G, A, V, L, I, P 및 M; (ii) D 및 E; (iii) C, S 및 T; (iv) H, K 및 R; (v) N 및 Q; 및 (vi) F, Y 및 W를 포함한다는 것이 이 표로부터 인식된다. 따라서, 보존적 돌연변이 또는 치환은 한 아미노산을 동일한 아미노산 패밀리의 구성원으로 치환시키는 돌연변이 또는 치환이다(예를 들면, Thr에 의한 Ser의 치환 또는 Arg에 의한 Lys의 치환).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "근긴장성 이영양증 단백질 키나제" 및 이의 약어 "DMPK"는 예를 들면, 인간 대상체에서 골격근 구조 및 기능의 조절에 관여하는 세린/쓰레오닌 키나제 단백질을 지칭한다. 용어 "근긴장성 이영양증 단백질 키나제" 및 "DMPK"는 본원에서 교환 가능하게 사용되고, 야생형 형태의 DMPK 유전자뿐만 아니라, 야생형 DMPK 단백질의 변이체 및 이를 코딩하는 핵산도 지칭한다. 인간 DMPK mRNA의 두 이소폼들의 핵산 서열들은 각각 진뱅크(GenBank) 등록번호 BC026328.1 및 BC062553.1에 상응하는 서열번호 1 및 2로서 본원에서 제공되어 있다(3' UTR은 포함되지 않음). 이 핵산 서열들은 하기 표 2에 제공되어 있다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
본원에서 사용된 용어 "근긴장성 이영양증 단백질 키나제" 및 "DMPK"는 예를 들면, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열에 적어도 85% 동일한(예를 들면, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열에 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 동일한) 핵산 서열을 갖는 인간 DMPK 유전자의 형태, 및/또는 야생형 DMPK 단백질에 비해 하나 이상(예를 들면, 최대 25개)의 보존적 아미노산 치환을 갖는 DMPK 단백질을 코딩하는 인간 DMPK 유전자의 형태를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "근긴장성 이영양증 단백질 키나제" 및 "DMPK"는 야생형 DMPK mRNA 전사체의 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부 영역의 길이에 비해 확장된 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부 영역을 함유하는 DMPK RNA 전사체도 포함한다. 확장된 반복부 영역은 예를 들면, 50개 이상의 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부, 예컨대, 약 50개 내지 약 4,000개의 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부(예를 들면, 특히 약 50개의 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부, 약 60개의 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부, 약 70개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 80개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 90개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 100개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 110개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 120개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 130개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 140개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 150개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 160개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 170개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 180개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 190개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 200개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 210개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 220개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 230개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 240개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 250개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 260개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 270개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 280개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 290개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 300개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 310개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 320개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 330개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 340개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 350개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 360개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 370개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 380개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 390개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 400개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 410개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 420개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 430개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 440개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 450개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 460개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 470개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 480개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 490개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 500개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 510개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 520개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 530개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 540개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 550개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 560개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 570개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 580개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 590개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 600개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 610개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 620개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 630개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 640개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 650개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 660개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 670개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 680개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 690개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 700개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 710개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 720개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 730개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 740개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 750개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 760개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 770개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 780개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 790개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 800개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 810개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 820개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 830개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 840개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 850개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 860개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 870개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 880개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 890개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 900개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 910개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 920개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 930개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 940개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 950개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 960개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 970개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 980개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 990개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,000개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,100개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,200개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,300개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,400개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,500개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,600개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,700개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,800개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,900개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,000개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,100개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,200개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,300개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,400개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,500개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,600개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,700개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,800개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,900개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,000개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,100개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,200개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,300개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,400개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,500개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,600개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,700개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,800개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,900개의 트리뉴클레오타이드 반복부 또는 4,000개의 트리뉴클레오타이드 반복부)를 함유할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "간섭 RNA"는 (i) 표적 RNA 전사체에 어닐링함으로써, 핵산 이중체를 형성하고, (ii) RNA 전사체의 뉴클레아제 매개 분해를 촉진하고/하거나, (iii) RNA 전사체의 번역을 늦추거나, 억제하거나 방해함으로써, 예컨대, 기능성 리보좀-RNA 전사체 복합체의 형성을 입체적으로 방해하거나 표적 RNA 전사체로부터의 기능성 단백질 생성물의 형성을 약화시킴으로써 표적 RNA 전사체의 발현을 억제하는 RNA, 예컨대, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA(miRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 지칭한다. 본원에 기재된 간섭 RNA는 예를 들면, 단일 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드의 형태, 또는 간섭 RNA를 코딩하는 전이유전자를 함유하는 벡터(예를 들면, 바이러스 벡터, 예컨대, 본원에 기재된 아데노 관련 바이러스 벡터)의 형태로 환자, 예컨대, 근긴장성 이영양증을 갖는 인간 환자에게 제공될 수 있다. 예시적 간섭 RNA 플랫폼은 예를 들면, 문헌[Lam et al., Molecular Therapy - Nucleic Acids 4:e252 (2015)]; 문헌[Rao et al., Advanced Drug Delivery Reviews 61:746-769 (2009)]; 및 문헌[Borel et al., Molecular Therapy 22:692-701 (2014)]에 기재되어 있고, 이 문헌들 각각의 개시는 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 핵산의 "길이"는 핵산의 5' 말단부터 3' 말단까지 뉴클레오타이드의 양을 측정함으로써 평가된 핵산의 선형 크기를 지칭한다. 관심 있는 핵산의 길이를 측정하는 데 이용될 수 있는 예시적 분자생물학 기법은 당분야에서 공지되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "근긴장성 이영양증"은 DMPK를 코딩하는 RNA 전사체의 핵 보유 및 3' 비번역 영역(UTR)에서의 확장된 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부 영역, 예컨대, 50개 내지 4,000개의 CUG 반복부를 갖는 확장된 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부 영역의 함유를 특징으로 하는 유전성 근육 소모 장애를 지칭한다. 비교하건대, 야생형 RMPK RNA 전사체는 3' UTR에서 전형적으로 5개 내지 37개의 CUG 반복부를 함유한다. 근긴장성 이영양증을 갖는 환자에서, 확장된 CUG 반복부 영역은 RNA 결합 스플라이싱 인자, 예컨대, 근육맹인 유사 단백질과 상호작용한다. 이 상호작용은 돌연변이체 전사체가 핵내 포커스에 보유되게 하고 다른 pre-mRNA 기질로부터의 RNA 결합 단백질의 격리를 유발하여, 근육 구조 및 기능을 조절하는 데 관여하는 단백질의 스플라이싱이상을 촉진한다. I형 근긴장성 이영양증(DM1)에서, 골격근은 종종 가장 심각하게 영향을 받는 조직이나, 상기 질환은 심근, 평활근, 수정체 및 뇌에도 독성 효과를 부여한다. 두개골근, 말단 수족근 및 횡경막근은 우선적으로 영향을 받는다. 맨손 기민성이 초기에 손상되어, 수십 년의 중증 장애를 야기한다. 근긴장성 이영양증 환자의 평균 사망 연령은 55세이고, 이것은 통상적으로 호흡 부전에 의해 야기된다(de Die-Smulders C E, et al., Brain 121:1557-1563 (1998)).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 제2 분자(예를 들면, 제2 핵산)에 연결된 제1 분자(예를 들면, 제1 핵산)을 지칭하고, 이때 상기 분자들은 제1 분자가 제2 분자의 기능에 영향을 미치도록 정렬된다. 상기 2개의 분자들은 단일 연속 분자의 부분일 수 있거나 이러한 부분이 아닐 수 있고, 서로 인접할 수 있거나 인접하지 않을 수 있다. 예를 들면, 프로모터는 프로모터가 세포에서 관심 있는 전사 가능한 폴리뉴클레오타이드 분자의 전사를 조절하는 경우 전사 가능한 폴리뉴클레오타이드 분자에 작동 가능하게 연결된다. 추가로, 전사 조절 요소의 2개의 부분들은 한 부분의 전사 활성화 기능이 다른 부분의 존재에 의해 불리한 영향을 받지 않도록 이들이 연결된 경우 서로 작동 가능하게 연결되어 있다. 2개의 전사 조절 요소들은 링커 핵산(예를 들면, 개재 비코딩 핵산)에 의해 서로 작동 가능하게 연결될 수 있거나, 존재하는 개재 뉴클레오타이드 없이 서로 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 핵산 분자의 한 분절은 2개의 분절들이 하나 이상의 성분 뉴클레오타이드를 공유한 경우 동일한 핵산 분자의 또 다른 분절과 "중첩되는" 것으로 간주된다. 예를 들면, 동일한 핵산 분자의 2개의 분절들은 이 2개의 분자들이 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 100개 이상의 성분 뉴클레오타이드를 공유하는 경우 서로 "중첩되는" 것으로 간주된다. 상기 2개의 분절들은 이 2개의 분절들이 성분 뉴클레오타이드를 공유하지 않는 경우 서로 "중첩되는" 것으로 간주되지 않는다.
기준 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 "퍼센트(%) 서열 상보성"은 서열들을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 상보성을 달성한 후 기준 폴리뉴클레오타이드 서열의 핵산에 상보적인 후보 서열의 핵산의 퍼센트로서 정의된다. 소정의 뉴클레오타이드는 2개의 뉴클레오타이드들이 정규 와슨-크릭 염기 쌍을 형성한 경우 본원에 기재된 바와 같이 기준 뉴클레오타이드에 "상보적"인 것으로 간주된다. 의심의 여지를 없애기 위해, 본 개시의 맥락에서 와슨-크릭 염기 쌍은 아데닌-타이민, 아데닌-우라실 및 사이토신-구아닌 염기 쌍을 포함한다. 적절한 와슨-크릭 염기 쌍은 이 맥락에서 "일치"로서 지칭되는 반면, 각각의 페어링되지 않은 뉴클레오타이드 및 각각의 부정확하게 페어링된 뉴클레오타이드는 "불일치"로서 지칭된다. 퍼센트 핵산 서열 상보성을 측정하기 위한 정렬은 당분야에서 숙련된 자의 능력 내에 있는 다양한 방식들로, 예를 들면, 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2 또는 Megalign 소프트웨어를 이용함으로써 달성될 수 있다. 당분야에서 숙련된 자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 상보성을 달성하기 위해 요구된 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 예시로서, 소정의 핵산 서열 B에 대한 소정의 핵산 서열 A의 퍼센트 서열 상보성(대안적으로, 소정의 핵산 서열 B에 대한 특정 퍼센트 상보성을 갖는 소정의 핵산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
100 곱하기 (분수 X/Y)
상기 식에서, X는 (예를 들면, BLAST와 같은 컴퓨터 소프트웨어에 의해 실행된) 정렬 시 그 프로그램의 A와 B의 정렬에서 상보적 염기 쌍의 수이고, Y는 B의 핵산의 총수이다. 핵산 서열 A의 길이가 핵산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 퍼센트 서열 상보성은 A에 대한 B의 퍼센트 서열 상보성과 동일하지 않을 것임이 인식될 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 질의(query) 핵산 서열이 기준 핵산 서열에 대한 100% 서열 상보성을 갖는 경우 질의 핵산 서열은 기준 핵산 서열에 "완전히 상보적"인 것으로 간주된다.
기준 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열에 대한 "퍼센트(%) 서열 동일성"은 서열들을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성한 후 기준 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 핵산 또는 아미노산과 동일한 후보 서열의 핵산 또는 아미노산의 퍼센트로서 정의된다. 퍼센트 핵산 또는 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위한 정렬은 당분야에서 숙련된 자의 능력 내에 있는 다양한 방식들로, 예를 들면, 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2 또는 Megalign 소프트웨어를 이용함으로써 달성될 수 있다. 당분야에서 숙련된 자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 요구된 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 예를 들면, 퍼센트 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 BLAST를 이용함으로써 생성될 수 있다. 예시로서, 소정의 핵산 또는 아미노산 서열 B에 대한 소정의 핵산 또는 아미노산 서열 A의 퍼센트 서열 동일성(대안적으로, 소정의 핵산 또는 아미노산 서열 B에 대한 특정 퍼센트 서열 동일성을 갖는 소정의 핵산 또는 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
100 곱하기 (분수 X/Y)
상기 식에서, X는 서열 정렬 프로그램(예를 들면, BLAST)에 의해 그 프로그램의 A와 B의 정렬에서 동일한 일치로서 점수화된 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 수이고, Y는 B의 핵산의 총수이다. 핵산 또는 아미노산 서열 A의 길이가 핵산 또는 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 퍼센트 서열 동일성은 A에 대한 B의 퍼센트 서열 동일성과 동일하지 않을 것임이 인식될 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학 조성물"은 대상체에게 영향을 미치거나 미칠 수 있는 특정 질환 또는 질병을 예방하거나, 치료하거나 조절하기 위해 대상체, 예컨대, 포유동물, 예를 들면, 인간에게 투여될, 임의적으로 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 및/또는 담체와 함께, 본원에 기재된 핵산 또는 벡터와 같은 치료제를 함유하는 혼합물을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 적당한 이익/위험 비에 비례하는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 및 다른 문제 합병증 없이 대상체, 예컨대, 포유동물(예를 들면, 인간)의 조직과 접촉되기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 제형을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "반복부 영역"은 인간 DMPK 유전자의 3' UTR 내의 폴리 CTG 서열(또는 이의 RNA 전사체의 3' UTR 내의 폴리 CUG 서열)과 같은 핵산 반복부를 함유하는, 관심 있는 유전자 또는 이의 RNA 전사체 내의 분절을 지칭한다. 반복부 영역 내의 뉴클레오타이드 반복부의 수가 야생형 형태의 상기 유전자 또는 이의 RNA 전사체의 반복부 영역에서 통상적으로 발견되는 반복부의 양을 초과하는 경우, 반복부 영역은 "확장된 반복부 영역", "반복부 확장" 등인 것으로 간주된다. 예를 들면, 야생형 인간 DMPK 유전자의 3' UTR은 전형적으로 5개 내지 37개의 CTG 또는 CUG 반복부를 함유한다. 따라서, DMPK 유전자 또는 이의 RNA 전사체의 맥락에서 "확장된 반복부 영역" 및 "반복부 확장"은 37개 초과의 CTG 또는 CUG 반복부, 예컨대, 약 50개 내지 약 4,000개의 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부(예를 들면, 특히 약 50개의 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부, 약 60개의 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부, 약 70개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 80개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 90개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 100개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 110개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 120개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 130개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 140개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 150개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 160개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 170개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 180개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 190개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 200개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 210개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 220개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 230개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 240개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 250개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 260개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 270개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 280개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 290개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 300개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 310개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 320개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 330개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 340개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 350개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 360개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 370개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 380개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 390개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 400개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 410개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 420개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 430개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 440개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 450개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 460개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 470개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 480개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 490개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 500개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 510개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 520개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 530개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 540개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 550개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 560개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 570개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 580개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 590개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 600개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 610개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 620개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 630개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 640개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 650개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 660개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 670개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 680개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 690개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 700개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 710개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 720개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 730개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 740개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 750개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 760개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 770개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 780개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 790개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 800개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 810개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 820개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 830개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 840개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 850개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 860개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 870개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 880개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 890개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 900개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 910개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 920개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 930개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 940개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 950개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 960개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 970개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 980개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 990개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,000개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,100개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,200개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,300개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,400개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,500개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,600개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,700개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,800개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 1,900개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,000개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,100개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,200개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,300개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,400개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,500개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,600개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,700개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,800개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 2,900개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,000개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,100개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,200개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,300개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,400개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,500개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,600개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,700개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,800개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 3,900개의 트리뉴클레오타이드 반복부, 또는 4,000개의 트리뉴클레오타이드 반복부)를 함유하는 반복부 영역을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "RNA 우성"은 야생형 형태의 관심 있는 RNA 전사체에 함유된 반복부 영역이 존재한다면 이 반복부 영역의 양에 비해 확장된 반복부 영역을 함유하는 RNA 전사체의 발현 및 핵 보유에 의해 유도된 병리를 지칭한다. RNA 우성의 독성 효과는 예를 들면, pre-mRNA 전사체로부터의 스플라이싱 인자의 격리를 촉진함으로써, 이러한 기질들 사이에 스플라이싱이상을 불러일으키는, 병리학적 돌연변이체 RNA 전사체의 확장된 반복부 영역과 스플라이싱 인자 단백질 사이의 결합 상호작용의 징후이다. RNA 우성과 관련된 예시적 장애는 특히 본원에 기재된 바와 같이 근긴장성 이영양증 및 근위축성 측삭 경화증이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "샘플"은 대상체로부터 단리된 표본(예를 들면, 혈액, 혈액 성분(예를 들면, 혈청 또는 혈장), 소변, 타액, 양수, 뇌척수액, 조직(예를 들면, 태반 또는 피부), 췌장액, 융모막 융모 샘플 또는 세포)을 지칭한다. 대상체는 예를 들면, 본원에 기재된 질환, 예컨대, 유전성 근육 소모 장애(예를 들면, 근이영양증, 예컨대, 근긴장성 이영양증(예를 들면, 근긴장성 이영양증 I형))를 앓고 있는 환자일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "특이적으로 결합한다" 및 "결합한다"는 예를 들면, 리간드 또는 수용체, 예컨대, 구체적으로 RNA 결합 스플라이싱 인자 단백질에 의해 인식되는 이온, 염, 소분자 및/또는 단백질의 불균질한 집단에서 특정 분자, 예컨대, RNA 전사체의 존재를 확인시켜주는 결합 반응을 지칭한다. 종(예를 들면, RNA 전사체)에 특이적으로 결합하는 리간드(예를 들면, 본원에 기재된 RNA 결합 단백질)는 예를 들면, 1 mM 미만의 KD로 상기 종에 결합할 수 있다. 예를 들면, 종에 특이적으로 결합하는 리간드는 100 μM 이하(예를 들면, 1 pM 내지 100 μM)의 KD로 상기 종에 결합할 수 있다. 또 다른 분자에의 특이적 결합을 나타내지 않는 리간드는 그 특정 분자 또는 이온에 대한 1 mM 이상(예를 들면, 1 μM, 100 μM, 500 μM, 1 mM 이상)의 KD를 나타낼 수 있다. 다양한 어세이 포맷들을 이용하여 특정 단백질에 대한 리간드의 친화성을 측정할 수 있다. 예를 들면, 고체 상 ELISA 어세이는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드를 확인하는 데 관용적으로 이용된다. 특정 단백질 결합을 확인하는 데 이용될 수 있는 어세이 포맷 및 조건의 설명에 대해서는, 예를 들면, 문헌[Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1988)] 및 문헌[Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1999)]을 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "스플라이싱이상"은 야생형 형태의 관심 있는 mRNA 전사체에 비해 하나 이상의 대안적 스플라이스 생성물의 발현을 유발하는, mRNA 전사체의 스플라이싱 패턴의 변화를 지칭한다. 스플라이싱이상은 예를 들면, 코딩된 단백질의 활성에 필요한 하나 이상의 엑손이 번역 시 mRNA 전사체에 더 이상 존재하지 않는 방식으로 mRNA 전사체가 스플라이싱되는 경우 기능 상실이라는 독성을 유발할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 기능 상실이라는 독성은 예를 들면, 코딩된 단백질의 적절한 폴딩을 방해하는 방식으로 하나 이상의 인트론의 비정성적 포함으로 인해 일어날 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에 기재된 특정 질환 또는 질병(예컨대, 유전성 근육 소모 장애, 예를 들면, 근긴장성 이영양증)에 대한 치료를 받는 유기체를 지칭한다. 대상체 및 환자의 예는 본원에 기재된 질환 또는 질병에 대한 치료를 받는 포유동물, 예컨대, 인간을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "전사 조절 요소"는 적어도 부분적으로 관심 있는 유전자의 전사를 조절하는 핵산을 지칭한다. 전사 조절 요소는 유전자 전사를 조절하거나 조절을 돕는 프로모터, 인핸서 및 다른 핵산(예를 들면, 폴리아데닐화 신호)을 포함할 수 있다. 전사 조절 요소의 예는 예를 들면, 문헌[Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990)]에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료한다" 또는 "치료"는 원치 않는 생리학적 변화 또는 장애, 예컨대, 유전성 근육 소모 장애, 예를 들면, 근긴장성 이영양증 및 구체적으로 I형 근긴장성 이영양증의 진행을 예방하거나 늦추는(경감시키는) 것을 목적으로 하는 치료적 치료를 지칭한다. 근긴장성 이영양증 치료의 맥락에서, 성공적인 치료를 표시하는 유리한 또는 원하는 임상적 결과는 검출 가능한 또는 검출 불가능한 증상의 완화, 질환의 정도의 감소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 늦춤, 질환 상태의 완화 또는 경감, 및 (부분적 또는 전체적) 관해를 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 근긴장성 이영양증(예를 들면, I형 근긴장성 이영양증)을 갖는 환자의 치료는 본원에 기재된 벡터 또는 핵산과 같은 치료제의 투여 전 환자에 의한 확장된 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부 영역을 함유하는 DMPK RNA 전사체의 발현에 비해 하나 이상의 검출 가능한 변화, 예컨대, 확장된 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부 영역을 함유하는 DMPK RNA 전사체의 발현의 감소(예를 들면, 확장된 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부 영역을 함유하는 DMPK RNA 전사체의 발현의 1% 이상의 감소, 예컨대, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 감소)로 나타날 수 있다. RNA 발현 수준을 평가하는 데 이용될 수 있는 방법은 당분야에서 공지되어 있고, 본원에 기재된 RNA-seq 어세이 및 중합효소 연쇄 반응 기법을 포함한다. CPVT 환자의 성공적인 치료의 추가 임상적 표시는 예를 들면, 근육맹인 유사 단백질에 의존하는 방식으로 스플라이싱되는 RNA 전사체의 스플라이싱이상의 완화를 포함한다. 예를 들면, 근긴장성 이영양증을 갖는 환자의 성공적인 치료를 시사하는 관찰결과는 환자가 치료제, 예컨대, 본원에 기재된 치료제의 투여 후 근육맹인 유사 단백질의 하나 이상의 RNA 전사체 기질의 정확한 스플라이싱의 증가를 나타낸다는 발견을 포함한다. 예를 들면, 근긴장성 이영양증의 성공적인 치료를 시사하는 지표는 예를 들면, 본원에 기재된 RNA 또는 단백질 검출 어세이를 이용함으로써 평가될 때, 환자가 엑손 22를 함유하는 근세포질/소포체 칼슘 ATPase 1(SERCA1) mRNA의 발현의 증가, 예컨대, 약 1.1배 내지 약 10배 증가, 또는 더 많은 증가(예를 들면, 엑손 22를 함유하는 SERCA1 mRNA의 발현의 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3배, 3.1배, 3.2배, 3.3배, 3.4배, 3.5배, 3.6배, 3.7배, 3.8배, 3.9배, 4배, 4.1배, 4.2배, 4.3배, 4.4배, 4.5배, 4.6배, 4.7배, 4.8배, 4.9배, 5배, 5.1배, 5.2배, 5.3배, 5.4배, 5.5배, 5.6배, 5.7배, 5.8배, 5.9배, 6배, 6.1배, 6.2배, 6.3배, 6.4배, 6.5배, 6.6배, 6.7배, 6.8배, 6.9배, 7배, 7.1배, 7.2배, 7.3배, 7.4배, 7.5배, 7.6배, 7.7배, 7.8배, 7.9배, 8배, 8.1배, 8.2배, 8.3배, 8.4배, 8.5배, 8.6배, 8.7배, 8.8배, 8.9배, 9배, 9.1배, 9.2배, 9.3배, 9.4배, 9.5배, 9.6배, 9.7배, 9.8배, 9.9배, 10배 이상의 증가)를 나타낸다는 것을 확인하는 것을 포함한다. 근긴장성 이영양증의 치료는 예를 들면, 본원에 기재된 RNA 또는 단백질 검출 어세이를 이용함으로써 평가될 때, 엑손 7a를 함유하는 클로라이드 전압 개폐성 채널 1(CLCN1) mRNA의 발현의 감소, 예컨대, 약 1% 내지 약 100%의 감소(예를 들면, 엑손 7a를 함유하는 CLCN1 mRNA의 발현의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 감소)로 나타날 수도 있다. 추가로, 성공적인 치료는 예를 들면, 본원에 기재된 RNA 또는 단백질 검출 어세이를 이용함으로써 평가될 때, 환자가 엑손 11을 함유하는 ZO-2 관련 스펙클 단백질(ZASP)의 발현의 감소, 예컨대, 약 1% 내지 약 100%의 감소(예를 들면, 엑손 11을 함유하는 ZASP mRNA의 발현의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 감소)를 나타낸다는 것을 확인함으로써 시사될 수 있다. 근긴장성 이영양증의 성공적인 치료는 치료 후, 예를 들면, 본원에 기재된 RNA 또는 단백질 검출 어세이를 이용함으로써 평가될 때, 환자가 인슐린 수용체, 리아노딘 수용체 1(RYR1), 심근 트로포닌, 및/또는 골격근 트로포닌을 코딩하는 RNA 전사체의 정확한 스플라이싱의 증가, 예컨대, 약 1.1배 내지 약 10배 증가, 또는 더 많은 증가(예를 들면, 인슐린 수용체, RYR1, 심근 트로포닌, 및/또는 골격근 트로포닌을 코딩하는 정확히 스플라이싱된 RNA 전사체의 발현의 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3배, 3.1배, 3.2배, 3.3배, 3.4배, 3.5배, 3.6배, 3.7배, 3.8배, 3.9배, 4배, 4.1배, 4.2배, 4.3배, 4.4배, 4.5배, 4.6배, 4.7배, 4.8배, 4.9배, 5배, 5.1배, 5.2배, 5.3배, 5.4배, 5.5배, 5.6배, 5.7배, 5.8배, 5.9배, 6배, 6.1배, 6.2배, 6.3배, 6.4배, 6.5배, 6.6배, 6.7배, 6.8배, 6.9배, 7배, 7.1배, 7.2배, 7.3배, 7.4배, 7.5배, 7.6배, 7.7배, 7.8배, 7.9배, 8배, 8.1배, 8.2배, 8.3배, 8.4배, 8.5배, 8.6배, 8.7배, 8.8배, 8.9배, 9배, 9.1배, 9.2배, 9.3배, 9.4배, 9.5배, 9.6배, 9.7배, 9.8배, 9.9배, 10배 이상의 증가)를 나타낸다는 발견에 의해 시사될 수도 있다. 근긴장성 이영양증의 성공적인 치료의 추가 임상적 표시는 근육 기능, 예컨대, 두개골근, 말단 수족근 및 횡경막근의 개선을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 코딩된 전이유전자를 발현시킬 목적으로 관심 있는 유전자를 세포(예를 들면, 포유동물 세포, 예컨대, 인간 세포), 조직, 장기 또는 유기체, 예컨대, 본원에 기재된 질환 또는 질병을 위한 치료를 받는 환자 내로 전달하기 위한 비히클로서 작용할 수 있는 핵산, 예를 들면, DNA 또는 RNA를 지칭한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 유용한 예시적 벡터는 플라스미드, DNA 벡터, RNA 벡터, 비리온 또는 다른 적합한 레플리콘(예를 들면, 바이러스 벡터)이다. 외생성 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 원핵 또는 진핵 세포 내로 전달하기 위한 다양한 벡터들이 개발되었다. 이러한 발현 벡터의 예는 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 1994/11026호에 개시되어 있고, 이의 개시는 본원에 참고로 포함된다. 본원에 기재된 발현 벡터는 폴리뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라, 예를 들면, 단백질을 발현시키고/시키거나 이 폴리뉴클레오타이드 서열을 포유동물 세포의 게놈 내로 통합시키는 데 사용되는 추가 서열도 함유한다. 본원에 기재된 전이유전자의 발현을 위해 사용될 수 있는 특정 벡터들은 유전자 전사를 유도하는 조절 서열, 예컨대, 프로모터 및 인핸서 영역을 함유하는 플라스미드를 포함한다. 전이유전자의 발현에 유용한 다른 벡터는 이 유전자의 번역 속도를 향상시키거나 유전자 전사로부터 생성된 mRNA의 안정성 또는 핵 이출을 개선하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 이 서열 요소는 발현 벡터에 담지된 유전자의 효율적인 전사를 유도하기 위해, 예를 들면, 5' 비번역 영역 및 3' 비번역 영역, 내부 리보좀 진입 부위(IRES) 및 폴리아데닐화 신호 부위를 포함한다. 본원에 기재된 발현 벡터는 이러한 벡터를 함유하는 세포의 선택을 위한 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드도 함유할 수 있다. 적합한 마커의 예는 항생제, 예컨대, 앰피실린, 클로람페닐콜, 카나마이신 또는 노우르세오쓰리신(nourseothricin)에 대한 내성을 코딩하는 유전자를 포함한다.
도 1은 (음영 직사각형 상자로 표시된) 엑손의 배열 및 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부 영역의 부위를 포함하는, 인간 근긴장성 이영양증 단백질 키나제(DMPK) RNA의 구조를 보여주는 도면이다. 도면의 아래를 따라 600 내지 12,600의 수치 값은 DMPK RNA 전사체의 길이를 따라 뉴클레오타이드 위치를 표시한다. 도면은 본원에 기재된 다양한 예시적 간섭 RNA 구축물들이 서열 상보성에 의해 어닐링되는 DMPK RNA 전사체 내의 영역을 보여준다.
도 2a 내지 2c는 관심 있는 여러 유전자들, 예컨대, RNA 우성과 관련된 유전자들을 표적화하는 간섭 RNA 분자를 코딩하는 rAAV 벡터(rAAV-RNAi 벡터)의 3 세대들의 개략도를 보여주는 도면이다. rAAV 플라스미드 pARAP4는 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터로부터 발현되는 인간 알칼리성 포스파타제 리포터 유전자(Hu Alk Phos) 리포터 유전자 및 SV40 폴리아데닐화 서열인 pA를 포함한다. 역위 말단 반복부(ITR)는 rAAV2로부터 유래하고, 게놈은 rAAV6 캡시드 내에 팩키징된다. 최신 벡터 변형은 근육 세포 독성으로 인해 고용량에서 rAAV-RNAi 효능을 제한하는 Hu Alk Phos 발현을 방지하기 위해 RSV 프로모터 서열을 제거한다.
도 3a는 RNA 우성 질환, 예컨대, 근긴장성 이영양증의 뮤린 모델 내로의 rAAV-RNAi 벡터의 예시적 투여 경로를 보여주는 도면이다.
도 3b 및 3c는 근긴장성 이영양증 I형(DM1)의 다양한 특성 및 이 질환의 뮤린 HSALR 모델을 비교하는 도면이다. HSALR 마우스는 인간의 DM과 유사한 근긴장성 이영양증의 특성을 보여준다. HSALR 전이유전자는 인간 골격 액틴(HSA) 유전자의 3' UTR 내로의 (CTG)250 반복부의 삽입으로부터 유도된다. 상기 전이유전자가 마우스 골격근에서 발현될 때, 근긴장성 방전은 분명히 나타나고, 스플라이싱 변경은 다양한 mRNA들에서 일어나고, 확장된 전이유전자 mRNA 및 스플라이싱 인자를 함유하는 핵내 포커스가 존재한다.
도 4는 하기 실시예 1에 기재된 바와 같이, rAAV6 HSA miR DM10이 형질도입된 HSALR 마우스의 특성을 보여주는 도면이다. 인간 태반 알칼리성 포스파타제(AP) 염색은 활성 리포터 유전자 발현을 갖는 바이러스 게놈의 존재를 표시한다. 치료받은 마우스의 냉동박편의 H&E 염색. 시점, 주사 후 8주, 4주령 HSALR 마우스.
도 5a 및 5b는 하기 실시예 1에 기재된 바와 같이, 형질도입된 7마리의 개별 HSALR 마우스들에서의 HSA mRNA의 정량 및 HSA miR DM10의 발현을 보여주는 그래프이다. 표시된 mRNA 발현은 rAAV 주사 후 8주에서 qPCR에 의해 평가되었다.
도 6a 내지 6e는 하기 실시예 1에 기재된 바와 같이, rAAV6 HSA miR DM10 전신 주사가 전경골근(TA)에서 Atp2a(SERCA1) 및 CLCN1의 스플라이싱을 개선함을 입증하는 도면이다. 대조적으로, 상이한 RNAi 헤어핀인 miR DM4는 이 스플라이싱 결함을 반전시키는 데 있어서 그다지 효과적이지 않다.
도 7a 내지 7c는 생체내에서 평가된 재조작된 rAAV-miR DM10 및 rAAV-miR DM4의 구조 및 활성을 보여주는 도면이다. Hu Alk Phos 발현을 방지함으로써 앞서 시험된 Alk Phos 발현 벡터에 비해 유전자 침묵의 효능을 평가하기 위해 RSV 프로모터를 갖지 않은 벡터의 근육내 주사. 도 7a는 도 7b의 겔 상에서 표지부착된 '신규 DM10' 및 '신규 DM4'로서, RSV 프로모터 서열을 결여하는 rAAV 게놈의 개략도를 보여준다. 도 7b는 Alk Phos 발현 '종래 DM10'에 비해 TA 근육 내로의 '신규 DM10' 및 '신규 DM4'의 IM 주사 후 Atp2a1/Serca1에 대한 스플라이싱 패턴의 분석을 보여준다. L= 저용량인 5x109개의 벡터 게놈; H= 고용량인 5x1010개의 벡터 게놈. -, RSV 프로모터 부재; +, 벡터 게놈에 존재하는 RSV. 고용량은 Hu Alk Phos 발현 벡터의 IM 주사 시 중심 핵(CN)의 존재에 의해 표시된 일부 근육 재생을 이끌어내었기 때문에 선택되었다. 그러나, 고용량의 RSV 결여 rAAV DM10, 신규 DM10 및 신규 DM4에서 근육 교체의 증거는 관찰되지 않았다.
도 8a는 DMPK 표적화 miRNA를 발현하는 정제된 플라스미드를 어떻게 HEK293 세포 내로 형질감염시켰고 RISC 복합체 및 다이서(Dicer) 절단으로 DMPK 전사체 개입을 평가하기 위해 어떻게 RNA를 단리하고 RT-qPCR로 처리하였는지를 보여주는 도면이다.
도 8b는 U6 DMPK miRNA의 유전자 침묵 활성의 평가를 보여주는 그래프이다. 후보 치료제 miRNA 발현 카세트 a 및 b는 miRNA 발현 카세트를 갖지 않은 플라스미드에 비해 1.5 ㎍의 플라스미드 DNA로 HEK293 세포를 형질감염시킨 지 48시간 후 내생성 DMPK mRNA의 감소를 보였다. 플라스미드 및 대조군당 8개의 생물학적 복제물들을 어세이하였다. x-축을 따라, "a"는 서열번호 42의 핵산 서열을 갖는 패신저 가닥 및 서열번호 79의 핵산 서열을 갖는 가이드 가닥을 함유하는 miRNA를 표시하고; "b"는 서열번호 44의 핵산 서열을 갖는 패신저 가닥 및 서열번호 81의 핵산 서열을 갖는 가이드 가닥을 함유하는 miRNA를 표시하고; "c"는 서열번호 46의 핵산 서열을 갖는 패신저 가닥 및 서열번호 83의 핵산 서열을 갖는 가이드 가닥을 함유하는 miRNA를 표시하고; "d"는 서열번호 47의 핵산 서열을 갖는 패신저 가닥 및 서열번호 84의 핵산 서열을 갖는 가이드 가닥을 함유하는 miRNA를 표시하고; "없음"은 항-DMPK miRNA로 처리되지 않은 세포를 표시한다.
도 9는 하기 실시예 4에 기재된 바와 같이, HEK293 세포에서 DMPK 발현을 하향조절하는 본원에 기재된 다양한 siRNA 분자들의 능력을 보여주는 그래프이다. y-축 상의 값은 정규화된 DMPK 발현을 표시하고, x-축은 시험된 항-DMPK siRNA 분자를 보여준다. x-축 상의 첫 번째 항목은 형질감염 비히클만을 사용한 HEK293 세포의 처리에 상응하고, x-축 상의 두 번째 항목은 음성 대조군으로서 스크램블링된(scrambled) 핵산 서열을 갖는 siRNA를 사용한 처리를 표시한다. 특정된 서열 식별번호를 갖는 siRNA 분자는 본원, 예를 들면, 하기 표 4에 기재되어 있다. "항-DMPK"에 이은 알파벳숫자 식별번호로 표지부착된 siRNA 분자는 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)으로부터 시판된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 스플라이싱이상의 발생의 감소, 및 리보핵산(RNA) 우성과 관련된 질환, 예컨대, 특히 근긴장성 이영양증 및 근위축성 측삭 경화증의 치료에 유용하다. 본원에 기재된 조성물은 비정상적으로 확장된 반복부 영역을 함유하는 RNA 전사체의 발현을 억제하는 간섭 RNA 구축물을 함유하는 핵산을 포함한다. 이러한 반복부 확장을 갖는 다양한 RNA 전사체들이 RNA 스플라이싱 인자에 대한 높아진 결합력을 나타내기 때문에, 이 활성은 중요한 생리학적 이익을 제공한다. 이 결합력은 다른 pre-mRNA 기질로부터의 RNA 스플라이싱 인자의 격리로 나타남으로써, 이 전사체의 적절한 스플라이싱을 파괴한다. 기작에 의해 제한되지 않지만, 본원에 기재된 조성물은 확장된 뉴클레오타이드 반복부를 갖는 RNA 전사체의 발현을 감소시킴으로써, 스플라이싱 인자들이 다양한 다른 pre-mRNA 전사체들의 스플라이싱을 적절히 조절할 수 있도록 격리된 스플라이싱 인자들을 방출시킴으로써 이 병리를 완화시킬 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 확장된 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부 영역을 함유하는 근긴장성 이영양증 단백질 키나제(DMPK) RNA 전사체의 발현과 관련된 장애, 예컨대, 근긴장성 이영양증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 유사하게, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 GGGGCC(서열번호 162) 헥사뉴클레오타이드 반복부를 함유하는 C9ORF72 RNA 전사체의 상승된 발현을 특징으로 하는 근위축성 측삭 경화증을 치료하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 간섭 RNA 구축물은 다양한 형태들 중 임의의 형태, 예컨대, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 마이크로 RNA(miRNA)일 수 있다. 본원에 기재된 간섭 RNA는 바이러스 벡터와 같은 벡터에 의해 코딩될 수도 있다. 예를 들면, 확장된 뉴클레오타이드 반복부를 갖는 RNA 전사체의 발현을 약화시키는 전이유전자 코딩 간섭 RNA 구축물을 함유하는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 예컨대, 슈도타이핑된 AAV 벡터(예를 들면, AAV2/8 및 AAV2/9 벡터)가 본원에 기재되어 있다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 다른 이익들 중에서 확장된 뉴클레오타이드 반복부 영역을 함유하는 다른 RNA들 중에서 병리학적 RNA 전사체의 발현을 선택적으로 억제할 수 있다는 유리한 특징을 제공한다. 이 성질은 뉴클레오타이드 반복부가 포유동물 게놈, 예컨대, 인간 환자의 게놈에 널리 분포되어 있다는 점에 비추어 볼 때 특히 유리하다. 본원에 기재된 조성물 및 방법을 이용하여, 중요한 건강한 RNA 전사체 및 이의 코딩된 단백질 생성물의 발현을 보존하면서 병리학적 뉴클레오타이드 반복부 확장을 함유하는 RNA 전사체의 발현을 감소시킬 수 있다.
이 유리한 특징은 부분적으로, 확장된 반복부 영역으로부터 멀리 떨어진 부위에서 반복부 확장된 RNA 표적에 어닐링하는 간섭 RNA 구축물이 이 RNA 전사체의 발현을 억제하고 이 분자에 의해 격리될 스플라이싱 인자 단백질을 방출시키는 데 사용될 수 있다는 놀라운 발견에 근거한다. 따라서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 상보적 뉴클레오타이드 반복부 모티프를 함유할 필요 없이 병리학적 RNA 전사체의 발현 및 핵 보유를 약화시킬 수 있다.
하기 단락들은 본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 예시적 간섭 RNA 구축물의 설명뿐만 아니라, 스플라이싱이상과 관련된 장애, 예컨대, 근긴장성 이영양증 및 근위축성 측삭 경화증을 치료하는 데 사용될 수 있는 이러한 구축물을 코딩하는 벡터 및 절차의 설명도 제공한다.
RNA 우성을 치료하고 스플라이싱이상을 정정하는 방법
확장된 반복부 영역을 함유하는 RNA 전사체의 발현을 감소시키기 위해, 본원에 기재된 조성물 및 방법을 이용하여 간섭 RNA 구축물을 함유하는 핵산 또는 이를 코딩하는 벡터를, 스플라이싱이상을 겪고/겪거나 RNA 우성과 관련된 질환, 예컨대, 특히 근긴장성 이영양증을 갖는 환자에게 투여할 수 있다. 기작에 의해 제한되지 않지만, 이 활성은 병리학적 RNA 전사체의 반복부 확장 영역에 높은 결합력으로 결합하는 RNA 결합 단백질의 방출이라는 유리한 효과를 제공한다. 반복부 확장된 RNA 전사체에 결합함으로써 격리된 단백질이 다양한 pre-mRNA 전사체들의 적절한 스플라이싱을 조절하는 데 통상적으로 이용될 수 있는 스플라이싱 인자를 포함하기 때문에, 이러한 RNA 결합 단백질의 방출은 중요하다. RNA 우성 질환, 예컨대, 근긴장성 이영양증을 갖는 환자에서, 근육 기능을 조절하는 데 있어서 중요한 역할을 하는 단백질을 코딩하는 다양한 전사체들의 스플라이싱을 조절하는 스플라이싱 인자, 예컨대, 근육맹인 유사 단백질은 중요한 pre-mRNA 기질로부터 격리된다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 확장된 뉴클레오타이드 반복부 영역을 함유하는 RNA 전사체의 분해를 촉진함으로써, 이러한 전사체로부터의 중요한 RNA 결합 단백질의 방출을 달성함으로써 RNA 우성 질환을 치료할 수 있다.
근긴장성 이영양증 I형
근긴장성 이영양증 I형은 성인에서 가장 흔한 형태의 근이영양증이고, 7,500분의 1의 추정된 빈도로 발생한다(Harper P S., Myotonic Dystrophy. London: W.B. Saunders Company; 2001). 이 질환은 인간 DMPK1 유전자 내의 비코딩 CTG 반복부의 확장에 의해 야기된 상염색체 우성 질환이다. DMPK1은 세포질 세린/쓰레오닌 키나제를 코딩하는 유전자이다(Brook et al., Cell. 68:799-808 (1992)). 확장된 CTG 반복부는 DMPK1의 3' 비번역 영역(UTR)에 위치한다. 이 돌연변이는 확장된 CUG 반복부(CUGexp)를 함유하는 RNA의 발현이 세포 기능장애를 유도하는 과정인 RNA 우성을 유발한다(Osborne R J and Thornton C A., Human Molecular Genetics. 15:R162-R169 (2006)).
큰 CUG 반복부를 갖는 돌연변이체 형태의 DMPK mRNA는 전체적으로 전사되고 폴리아데닐화되나, 핵에 갇힌 상태로 남아 있다(Davis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 94:7388-7393 (1997)). 핵에 보유된 이 돌연변이체 mRNA는 근긴장성 이영양증 I형의 가장 중요한 병리학적 특징들 중 하나이다. DMPK 유전자는 정상적으로 3' UTR 내에 약 5개 내지 약 37개의 CTG 반복부를 갖는다. 근긴장성 이영양증 I형에서, 이 숫자는 상당히 커지고, 예를 들면, 50개 내지 4,000개, 또는 더 큰 수의 반복부의 범위 내에 있을 수 있다. 결과로서 생성된 RNA 전사체 내의 CUGexp 트랙(tract)은 근육맹인 유사 단백질을 포함하는 RNA 결합 스플라이싱 인자 단백질과 상호작용한다. 확장된 CUG 반복부 영역에 의해 야기된 향상된 결합력은 돌연변이체 전사체가 이러한 스플라이싱 인자 단백질을 핵내 포커스 내에 보유하게 한다. 이 돌연변이체 RNA의 독성은 근육 기능을 조절하는 데 있어서 중요한 역할을 하는 단백질을 코딩하는 pre-mRNA 기질들을 비롯한 다른 pre-mRNA 기질들로부터의 RNA 결합 스플라이싱 인자 단백질의 격리로부터 비롯된다.
근긴장성 이영양증 I형에서, 골격근은 가장 심각하게 영향을 받는 조직이나, 상기 질환은 심근, 평활근, 수정체 및 뇌에도 중요한 영향을 미친다. 근육 조직들 중에서 두개골근, 말단 수족근 및 횡경막근은 종종 우선적으로 영향을 받는다. 맨손 기민성이 초기에 손상되어, 수십 년의 중증 장애를 야기한다. 평균 사망 연령은 55세이고, 이것은 통상적으로 호흡 부전으로부터 비롯된다(de Die-Smulders C E, et al., Brain 121(Pt 8):1557-1563 (1998)). 근긴장성 이영양증의 증상은 근긴장증, 근육 경직, 불능 원위 약화, 안면 및 턱 근육의 약화, 삼킴 곤란, 눈꺼풀 처짐(안검하수), 목 근육의 약화, 팔 및 다리 근육의 약화, 지속적인 근육 통증, 과다수면증, 근육 소모, 연하곤란, 호흡 불충분, 불규칙한 심박동, 심근 손상, 무감각증, 인슐린 내성 및 백내장을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 소아에서, 증상은 발달 지연, 학습 문제, 언어 및 말하기 어려움, 및 성격 발달 문제도 포함할 수 있다.
병원성 DMPK 전사체
본원에 기재된 조성물 및 방법을 이용함으로써 치료될 수 있는 근긴장성 이영양증 환자는 근긴장성 이영양증 I형을 갖고 CUG 반복부 확장을 갖는 DMPK RNA 전사체를 발현하는 환자, 예컨대, 인간 환자를 포함한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법으로 치료를 받는 환자에 의해 발현될 수 있는 예시적 DMPK RNA 전사체는 진뱅크 등록번호 NM_001081560.1, NT_011109.15(뉴클레오타이드 18540696부터 18555106까지), NT_039413.7(뉴클레오타이드 16666001부터 16681000까지), NM_032418.1, AI007148.1, AI304033.1, BC024150.1, BC056615.1, BC075715.1, BU519245.1, CB247909.1, CX208906.1, CX732022.1, 560315.1, 560316.1, NM_001081562.1 및 NM_001100.3에 기재되어 있다.
병리학적 DMPK RNA 발현의 억제
본원에 기재된 조성물 및 방법을 이용하여, 병리학적 DMPK mRNA 전사체에 어닐링하고 이의 발현을 억제하는 간섭 RNA를 코딩하는 벡터, 또는 이러한 간섭 RNA를 함유하는 조성물을 환자, 예컨대, 근긴장성 이영양증(예를 들면, 근긴장성 이영양증 I형)을 앓고 있는 환자에게 투여할 수 있다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 확장된 CUG 반복부를 함유하는 DMPK mRNA 전사체, 예컨대, 약 50개 내지 약 4,000개, 또는 더 많은 수의 CUG 반복부를 함유하는 DMPK mRNA 전사체의 발현을 선택적으로 약화시킬 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 간섭 RNA 분자는 CUG 반복부 확장을 가진, 핵에 보유된 DMPK 전사체를 특이적으로 분해하는 리보뉴클레아제, 예컨대, 핵 리보뉴클레아제를 활성화시킬 수 있다. 돌연변이체 DMPK mRNA 발현의 감소는 본원에 기재된 치료제, 예컨대, 본원에 기재된 벡터 또는 핵산의 투여 전 환자에 의한 확장된 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부 영역을 함유하는 DMPK mRNA 전사체의 발현에 비해 예를 들면, 약 1% 이상의 감소, 예컨대, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 감소일 수 있다. RNA 발현 수준을 평가하는 데 이용될 수 있는 방법은 당분야에서 공지되어 있고, 본원에 기재된 RNA-seq 어세이 및 중합효소 연쇄 반응 기법을 포함한다.
스플라이싱이상의 정정
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 환자, 예컨대, 근긴장성 이영양증(예를 들면, 근긴장성 이영양증 I형)을 앓고 있는 환자에서 하나 이상의 스플라이싱이상을 보정하는 데 사용될 수 있다. 기작에 의해 제한되지 않지만, 병리학적 DMPK 전사체(예를 들면, 확장된 CUG 반복부 영역을 함유하는 DMPK 전사체)에 어닐링하고 이의 발현을 억제하는 본원에 기재된 간섭 RNA 분자의 능력은 CUG 반복부에 결합함으로써 격리될 스플라이싱 인자, 예컨대, 근육맹인 유사 단백질을 방출시킬 수 있다. 스플라이싱 인자의 이 방출은 결과적으로 이 스플라이싱 인자의 하나 이상의 RNA 전사체 기질의 정확한 스플라이싱을 유발할 수 있다. 예를 들면, 벡터 또는 조성물을, 근긴장성 이영양증을 앓고 있는 환자에게 투여할 때, 상기 환자는 예를 들면, 전경골근, 비복근 및/또는 사두근에서 엑손 22를 함유하는 근세포질/소포체 칼슘 ATPase 1(SERCA1) mRNA의 발현의 증가를 나타낼 수 있다. 엑손 22를 함유하는 SERCA1 mRNA 전사체의 발현의 증가는 예를 들면, 본원에 기재된 RNA 또는 단백질 검출 어세이를 이용함으로써 평가될 때, 예를 들면, 약 1.1배 내지 약 10배 증가, 또는 더 많은 증가(예를 들면, 엑손 22를 함유하는 SERCA1 mRNA의 발현의 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3배, 3.1배, 3.2배, 3.3배, 3.4배, 3.5배, 3.6배, 3.7배, 3.8배, 3.9배, 4배, 4.1배, 4.2배, 4.3배, 4.4배, 4.5배, 4.6배, 4.7배, 4.8배, 4.9배, 5배, 5.1배, 5.2배, 5.3배, 5.4배, 5.5배, 5.6배, 5.7배, 5.8배, 5.9배, 6배, 6.1배, 6.2배, 6.3배, 6.4배, 6.5배, 6.6배, 6.7배, 6.8배, 6.9배, 7배, 7.1배, 7.2배, 7.3배, 7.4배, 7.5배, 7.6배, 7.7배, 7.8배, 7.9배, 8배, 8.1배, 8.2배, 8.3배, 8.4배, 8.5배, 8.6배, 8.7배, 8.8배, 8.9배, 9배, 9.1배, 9.2배, 9.3배, 9.4배, 9.5배, 9.6배, 9.7배, 9.8배, 9.9배, 10배 이상의 증가)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 벡터 또는 조성물을, 근긴장성 이영양증을 앓고 있는 환자에게 투여할 때, 상기 환자는 예를 들면, 전경골근, 비복근, 및/또는 사두근에서 엑손 7a를 함유하는 클로라이드 전압 개폐성 채널 1(CLCN1) mRNA의 발현의 감소를 나타낼 수 있다. 엑손 7a를 함유하는 CLCN1 mRNA 전사체의 발현의 감소는 예를 들면, 본원에 기재된 RNA 또는 단백질 검출 어세이를 이용함으로써 평가될 때, 예를 들면, 약 1% 내지 약 100%의 감소(예를 들면, 엑손 7a를 함유하는 CLCN1 mRNA의 발현의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 감소)일 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 본원에 기재된 벡터 또는 조성물을, 근긴장성 이영양증을 앓고 있는 환자에게 투여할 때, 상기 환자는 예를 들면, 전경골근, 비복근 및/또는 사두근에서 엑손 11을 함유하는 ZO-2 관련 스펙클 단백질(ZASP)의 발현의 감소를 나타낼 수 있다. 엑손 11을 함유하는 ZASP mRNA 전사체의 발현의 감소는 예를 들면, 본원에 기재된 RNA 또는 단백질 검출 어세이를 이용함으로써 평가될 때, 예를 들면, 약 1% 내지 약 100%의 감소(예를 들면, 엑손 11을 함유하는 ZASP mRNA의 발현의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 감소)일 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 본원에 기재된 벡터 또는 조성물을, 근긴장성 이영양증을 앓고 있는 환자에게 투여할 때, 상기 환자는 예를 들면, 본원에 기재된 RNA 또는 단백질 검출 어세이를 이용함으로써 평가될 때, 인슐린 수용체, 리아노딘 수용체 1(RYR1), 심근 트로포닌, 및/또는 골격근 트로포닌을 코딩하는 RNA 전사체의 정확한 스플라이싱의 증가, 예컨대, 약 1.1배 내지 약 10배 증가, 또는 더 많은 증가(예를 들면, 인슐린 수용체, RYR1, 심근 트로포닌, 및/또는 골격근 트로포닌을 코딩하는 정확히 스플라이싱된 RNA 전사체의 발현의 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3배, 3.1배, 3.2배, 3.3배, 3.4배, 3.5배, 3.6배, 3.7배, 3.8배, 3.9배, 4배, 4.1배, 4.2배, 4.3배, 4.4배, 4.5배, 4.6배, 4.7배, 4.8배, 4.9배, 5배, 5.1배, 5.2배, 5.3배, 5.4배, 5.5배, 5.6배, 5.7배, 5.8배, 5.9배, 6배, 6.1배, 6.2배, 6.3배, 6.4배, 6.5배, 6.6배, 6.7배, 6.8배, 6.9배, 7배, 7.1배, 7.2배, 7.3배, 7.4배, 7.5배, 7.6배, 7.7배, 7.8배, 7.9배, 8배, 8.1배, 8.2배, 8.3배, 8.4배, 8.5배, 8.6배, 8.7배, 8.8배, 8.9배, 9배, 9.1배, 9.2배, 9.3배, 9.4배, 9.5배, 9.6배, 9.7배, 9.8배, 9.9배, 10배 이상의 증가)를 나타낼 수 있다.
근육 기능의 개선
본원에 기재된 조성물 및 방법의 유리한 치료 효과, 예컨대, (i) 병리학적 DMPK RNA 발현을 억제하고/하거나 (ii) 근육 기능을 조절하는 데 관여하는 단백질의 정확한 스플라이싱을 회복시키는 본원에 기재된 간섭 RNA 분자 및 이를 코딩하는 벡터의 능력은 다양한 방식으로 임상적으로 나타날 수 있다. 예를 들면, 근긴장성 이영양증, 예컨대, 근긴장성 이영양증 I형을 갖는 환자는 두개골근, 말단 수족근 및 횡경막근 기능의 개선을 나타낼 수 있다. 근육 기능의 상기 개선은 예를 들면, 근육 질량, 근육 수축의 빈도 및/또는 근육 수축의 크기의 증가로서 관찰될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 조성물 및 방법을 이용할 때, 근긴장성 이영양증(예를 들면, 근긴장성 이영양증 I형)을 앓고 있는 환자는 두개골근, 말단 수족근 및/또는 횡경막근 질량, 근육 수축 빈도 및/또는 근육 수축 크기의 증가를 나타낼 수 있다. 근육 질량, 근육 수축 빈도 및/또는 근육 수축 크기의 증가는 예를 들면, 1% 이상의 증가, 예컨대, 1% 내지 25%, 1% 내지 50%, 1% 내지 75%, 1% 내지 100%, 1% 내지 500%, 1% 내지 1,000%, 또는 더 많은 증가, 예컨대, 근육 질량, 근육 수축 빈도 및/또는 근육 수축 크기의 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 80%, 900%, 1,000% 이상의 증가일 수 있다.
구체적으로, 근긴장성 이영양증(예를 들면, 근긴장성 이영양증 I형)을 갖는 환자에서, 본원에 기재된 간섭 RNA 분자 및 이를 코딩하는 벡터의 유리한 치료 효과는 근긴장증의 감소로 나타날 수 있다. 따라서, 근육 이완을 용이하게 하고/하거나 가속화하기 위해, 본원에 기재된 조성물 및 방법을 이용하여 간섭 RNA 분자 또는 이를 코딩하는 벡터를, 근긴장성 이영양증(예를 들면, 근긴장성 이영양증 I형)을 갖는 환자에게 투여할 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 클로라이드 이온 농도의 변동에 의해 야기된 자발적 활동 전위의 발생을 억제함으로써 근육 이완을 가속화하는 데 사용될 수 있다. 기작에 의해 제한되지 않지만, 이 유리한 활성은 예를 들면, 환자에서 엑손 7a를 함유하는 CLCN1 mRNA의 발현이 감소되도록 CLCN1 mRNA의 정확한 스플라이싱을 회복시킴으로써 야기될 수 있다. CLCN1 채널 단백질이 클로라이드 이온 농도를 조절하기 때문에, CLCN1 mRNA 전사체의 스플라이싱 패턴의 보정은 자발적 활동 전위의 발생의 감소 및 근육 이완 속도의 개선을 유발함으로써, 근긴장증을 완화시킬 수 있다.
근긴장증의 억제는 당분야에서 공지된 다양한 기법들, 예를 들면, 근전도검사를 이용함으로써 평가될 수 있다. 구체적으로, 환자, 예컨대, 근긴장성 이영양증을 갖는 인간 환자에서 근긴장증에 대한 본원에 기재된 조성물 및 방법의 효과를 평가하기 위해 좌측 및 우측 사두근, 좌측 및 우측 비복근, 좌측 및 우측 전경골근, 및/또는 요추 척추주위근에 대한 근전도검사를 수행할 수 있다. 근전도검사 프로토콜은 예를 들면, 문헌[Kanadia et al., Science 302:1978-1980 (2003)]에 기재되어 있다. 예를 들면, 근전도검사는 각각의 근육에 대해 30-게이지 동심형 바늘 전극 및 최소 10회의 바늘 삽입을 이용함으로써 수행될 수 있다. 이 방식으로, 대상체, 예컨대, 인간 환자 또는 모델 유기체(예를 들면, 본원에 기재된 근이영양증의 뮤린 모델)에 대해 평균 근긴장증 등급을 측정할 수 있다. 그 다음, 이 등급을 본원에 기재된 치료제(예를 들면, 간섭 RNA 분자 또는 이를 코딩하는 벡터)의 투여 전 측정된 환자 또는 모델 유기체의 평균 근긴장증 등급과 비교할 수 있다. 치료제의 투여 후 평균 근긴장증 등급이 감소되었다는 소견은 근긴장성 이영양증의 성공적인 치료의 지표, 및 근긴장증의 증상의 성공적인 완화의 지표로서 사용될 수 있다.
추가 근긴장성 이영양증 증상의 완화
근긴장성 이영양증의 하나 이상의 증상을 약화시키거나 함께 제거하기 위해, 본원에 기재된 조성물 및 방법을 이용하여 간섭 RNA 분자 또는 이를 코딩하는 벡터를, 근긴장성 이영양증, 예컨대, 근긴장성 이영양증 1형을 갖는 환자에게 투여할 수 있다. 전술된 근긴장증 이외에, 근긴장성 이영양증의 증상은 근육 경직, 불능 원위 약화, 안면 및 턱 근육의 약화, 삼킴 곤란, 안검하수, 목 근육의 약화, 팔 및 다리 근육의 약화, 지속적인 근육 통증, 과다수면증, 근육 소모, 연하곤란, 호흡 불충분, 불규칙한 심박동, 심근 손상, 무감각증, 인슐린 내성 및 백내장을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 소아에서, 증상은 발달 지연, 학습 문제, 언어 및 말하기 어려움, 및 성격 발달 문제도 포함할 수 있다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 상기 증상들 중 하나 이상의 증상, 또는 이들 모두를 완화시키는 데 사용될 수 있다.
치료 효과의 지속
본원에 기재된 조성물 및 방법은 연장된 기간 동안 지속될 수 있는 유리한 임상적 효과를 제공한다. 예를 들면, 본원에 기재된 하나 이상의 간섭 RNA 분자 및/또는 이를 코딩하는 벡터(들)를 사용할 때, 근긴장성 이영양증(예를 들면, 근긴장성 이영양증 I형)을 갖는 환자는 (i) 병리학적 DMPK RNA 발현의 감소(예를 들면, 약 50개 내지 약 4,000개, 또는 더 많은 수의 CUG 반복부를 갖는 DMPK RNA의 발현의 감소), (ii) 근육 기능의 개선(예컨대, 근육 질량 및/또는 근육 활성의 개선, 예를 들면, 두개골근, 말단 수족근 및 횡경막근에서의 근육 질량 및/또는 근육 활성의 개선), 및/또는 1일, 1주, 1개월 또는 1년 이상의 기간 동안 근긴장성 이영양증의 하나 이상의 증상의 완화를 나타낼 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 조성물 및 방법을 이용하여, 본원에 기재된 유리한 치료 효과를 적어도 30일, 적어도 35일, 적어도 40일, 적어도 45일, 적어도 50일, 적어도 55일, 적어도 60일, 적어도 65일, 적어도 70일, 적어도 75일, 적어도 76일, 적어도 77일, 적어도 78일, 적어도 79일, 적어도 80일, 적어도 85일, 적어도 90일, 적어도 95일, 적어도 100일, 적어도 105일, 적어도 110일, 적어도 115일, 적어도 120일 또는 적어도 1년의 기간 동안 달성할 수 있다.
근긴장성 이영양증의 뮤린 모델
본원에 기재된 간섭 RNA 분자의 치료 효과, 또는 이를 코딩하는 벡터의 치료 효과를 조사하기 위해, 적절한 마우스 모델을 사용할 수 있다. 예를 들면, HSA(인간 골격 액틴)LR (긴 반복부) 마우스 모델은 근긴장성 이영양증 1형에 대한 확립된 모델이다(예를 들면, 문헌[Mankodi et al., Science 289:1769 (2000)] 참조, 이 문헌의 개시는 HSALR 마우스에 관한 것이기 때문에 본원에 참고로 포함됨). 이 마우스는 확장된 CTG 영역을 함유하는 인간 골격 액틴(hACTA1) 전이유전자를 보유한다. 구체적으로, HSALR 마우스의 hACTA1 전이유전자는 유전자의 3' UTR에 삽입된 220개의 CTG 반복부를 함유한다. 전사 시, hACTA1-CUGexp RNA 전사체는 골격근 내의 핵내 포커스에서 축적되고, 예를 들면, CUG 반복부 확장과 스플라이싱 인자의 결합, 및 근육 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 유전자를 코딩하는 pre-mRNA 전사체로부터의 이 스플라이싱 인자의 격리로 인해 인간 근긴장성 이영양증 1형에서 관찰된 근긴장증과 유사한 근긴장증을 초래한다(예를 들면, 문헌[Mankodi et al., Mol. Cell 10:35 (2002)] 및 문헌[Lin et al., Hum. Mol. Genet. 15:2087 (2006)] 참조, 이 문헌들 각각의 개시는 HSALR 마우스에 관한 것이기 때문에 본원에 참고로 포함됨). 따라서, CUG 확장된 반복부 영역을 갖는 hACTA1 RNA 전사체의 발현의 억제에 의한 HSALR 마우스의 근긴장성 이영양증 I형 증상의 완화는 병리학적 DMPK RNA 전사체의 발현의 억제에 의한 인간 환자의 유사한 증상의 완화의 예측자일 수 있다. HSALR 근긴장성 이영양증 I형 마우스는 당분야에서 공지되어 있는 방법을 이용함으로써, 예를 들면, 인간 골격 액틴의 3' UTR 내에 250개의 CUG 반복부를 갖는 hACTA1 전이유전자를 FVB/N 마우스의 게놈 내로 삽입함으로써 생성될 수 있다. 그 후, 상기 전이유전자는 hACTA1 RNA에서의 CUG 반복부 확장으로서 상기 마우스에서 발현된다. 이 반복부 확장된 RNA는 핵에 보유되어, 근긴장성 이영양증을 갖는 환자의 인간 조직 샘플에서 관찰된 핵 봉입체와 유사한 핵 봉입체를 형성한다.
전술된 바와 같이, HSALR 마우스 모델에서, 핵 내에서의 확장된 CUG RNA의 축적은 폴리(CUG) 결합 스플라이싱 인자 단백질, 예컨대, 근육맹인 유사 단백질의 격리를 유발한다(Miller et al., EMBO J. 19:4439 (2000)). 따라서, SERCA1 유전자의 대안적 스플라이싱을 조절하는 이 스플라이싱 인자는 HSALR 마우스에서 확장된 CUG 포커스 내에 격리된다. 이 격리는 SERCA1 유전자의 대안적 스플라이싱의 조절이상을 유발한다. 본원에 기재된 간섭 RNA 분자 및/또는 이를 코딩하는 벡터의 치료 효과를 평가하기 위해, 이 조성물은 예를 들면, CUG 반복부 확장으로부터 멀리 떨어진 부위에서 hACTA1 RNA 전사체의 영역에 어닐링하도록 디자인될 수 있다. 이것은 예를 들면, CUG 반복부 확장 영역과 중첩되지 않는 hACTA1 RNA의 분절에 적어도 85% 상보적인(예를 들면, 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9% 또는 100% 상보적인) 간섭 RNA 분자를 디자인함으로써 달성될 수 있다. 그 다음, 당분야에서 공지되어 있고 본원에 기재되어 있는 RNA 및 단백질 검출 방법을 이용하여 반복부 확장된 hACTA1 RNA의 억제, 및 정확히 스플라이싱된 SERCA1 mRNA(및 이에 따라 기능성 SERCA1 단백질)의 수반된 증가를 평가할 수 있다. 예를 들면, 병리학적 hACTA1 RNA에 어닐링하고 이 RNA의 발현을 억제하도록 디자인된 간섭 RNA 분자의 투여 후, 정확히 스플라이싱된 SERCA1 mRNA 전사체(예를 들면, 엑손 22를 함유하는 SERCA1 mRNA 전사체)의 발현의 증가를 모니터링하기 위해, 제조사의 설명서에 따라 RNeasy 지질 조직 미니 키트(Qiagen®)를 사용하여 전경골근, 비복근 및 사두근 중 하나 이상의 근육 또는 이들 모두에서 HSALR 마우스로부터 총 RNA를 정제할 수 있다. cDNA 합성 및 PCR 증폭을 위한 유전자 특이적 프라이머를 사용하여, SuperScript III 원-스텝 RT-PCR 시스템 및 백금 Taq 중합효소(Invitrogen®)로 RT-PCR을 수행할 수 있다. SERCA1에 대한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 예를 들면, 문헌[Bennett and Swayze, Annu Rev. Pharmacol. 50:259-293 (2010)]에 기재되어 있다. PCR 생성물을 아가로스 겔 상에서 분리할 수 있고 SybrGreen I 핵산 겔 염료(Invitrogen®)로 염색할 수 있고 후지필름(Fujifilm) LAS-3000 지능형 다크 박스를 이용하여 영상화할 수 있다. 예를 들면, HSALR 마우스의 전경골근, 비복근 및/또는 사두근에서 간섭 RNA 분자 또는 이를 코딩하는 벡터에 의한 SERCA1 유전자의 정확한 스플라이싱의 회복은 인간 DMPK RNA 상의 유사한 부위에 어닐링하는 간섭 RNA 분자 또는 이를 코딩하는 벡터의 치료 효능의 예측자일 수 있다.
근긴장성 이영양증의 추가 뮤린 모델은 전체 인간 DMPK 3' UTR을 함유하는 형질전환 마우스인 LC15 마우스, 계통 A를 포함한다(로체스터 대학의 휠러(Wheeler) 연구진에 의해 개발됨). 이 마우스는 FVB 배경에 역교배된 마우스의 제2 세대이다. DMPK 전이유전자는 핵 내에 보유됨으로써, 근긴장성 이영양증을 갖는 환자의 인간 조직 샘플에서 관찰된 핵 봉입체와 유사한 핵 봉입체를 형성하는, DMPK RNA 전사체 내의 CUG 반복부로서 이 마우스에서 발현된다. LC15 마우스는 약 350개 내지 약 400개의 CUG 반복부를 함유하는 DMPK RNA 전사체를 발현할 수 있다. 이 마우스는 근긴장성 이영양증 I형의 초기 징후를 나타내고 그의 근육 조직에서 어떠한 근긴장증도 나타내지 않는다.
본원에 기재된 간섭 RNA 분자 또는 이를 코딩하는 벡터의 치료 효능을 평가하는 데 사용될 수 있는 근긴장성 이영양증의 또 다른 뮤린 모델은 DMSXL 모델이다. DMSXL 마우스는 고수준의 CTG 반복부 불안정성을 갖는 마우스의 연속 육종에 의해 생성되고, 결과적으로 DMSXL 마우스는 3' UTR 내에서 1,000개 초과의 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부를 함유하는 DMPK RNA 전사체를 발현한다. DMSXL 마우스 및 이를 생성하는 방법은 예를 들면, 문헌[Gomes-Pereira et al., PLoS Genet. 3:e52 (2007)] 및 문헌[Huguet et al., A, PLoS Genet. 8:e1003043 (2012)]에 상세히 기재되어 있고, 이 문헌들 각각의 개시는 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
반복부 확장된 RNA의 핵 보유를 특징으로 하는 추가 장애
근긴장성 이영양증 I형 이외에, 확장된 반복부 영역을 갖는 RNA 전사체의 발현 및 핵 보유를 특징으로 하고 본원에 기재된 조성물 및 방법을 이용함으로써 치료될 수 있는 장애는 특히 근긴장성 이영양증 II형 및 근위축성 측삭 경화증을 포함한다. 근긴장성 이영양증 II형의 경우, 환자는 CCUG(서열번호 164) 반복부 확장을 갖는 세포 핵산 결합 단백질(CNBP) 유전자(징크 핑거 단백질 9(ZNF9) 유전자로서도 공지되어 있음)의 돌연변이체 버전을 발현할 수 있다. 근위축성 측삭 경화증을 갖는 환자의 경우, 환자는 확장된 GGGGCC(서열번호 162) 반복부를 갖는 C9ORF72의 돌연변이체 버전을 발현할 수 있다. C9ORF72 mRNA의 여러 이소폼들의 핵산 서열은 하기 표 3에 제시되어 있다. 모든 경우, 이 장애를 갖는 환자는 돌연변이체 RNA 전사체에 어닐링하고 이의 발현을 억제함으로써, 통상적으로 다른 기질에 결합할 것이나 그 대신에 이러한 환자에 의해 발현된 돌연변이체 전사체의 반복부 확장 영역에 높은 결합력으로 결합함으로써 격리되는 RNA 결합 단백질을 방출시키는 간섭 RNA 분자(또는 이를 코딩하는 벡터)를 투여함으로써 치료될 수 있다. 핵에 보유된 RNA 전사체, 예컨대, 각각 CCUG(서열번호 164) 및 GGGGCC(서열번호 162) 반복부를 갖는 병리학적 CNBP 및 C9ORF7 전사체의 발현의 감소를 모니터링하는 방법은 당분야에서 공지되어 있고 본원에 기재되어 있는 다양한 분자생물학 기법들을 포함한다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
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간섭 RNA
확장된 반복부 영역을 함유하는 돌연변이체 RNA 전사체의 발현을 억제하기 위해, 본원에 기재된 조성물 및 방법을 이용하여, 간섭 RNA 분자, 이를 함유하는 조성물 또는 이를 코딩하는 벡터를, 스플라이싱이상 및/또는 RNA 우성을 특징으로 하는 질환을 갖는 환자에게 투여할 수 있다. 예를 들면, 근긴장성 이영양증 I형의 경우, 억제될 표적 RNA 전사체는 전사체의 3' UTR에서 확장된 CUG 반복부 영역을 함유하는 인간 DMPK RNA이다. 근긴장성 이영양증 II형의 경우, 억제될 표적 RNA 전사체는 확장된 CCUG(서열번호 164) 반복부 영역을 함유하는 인간 ZNF9 RNA이다. 근위축성 측삭 경화증의 경우, 억제될 표적 RNA 전사체는 확장된 GGGGCC(서열번호 162) 반복부 영역을 함유하는 인간 C9ORF72 RNA이다.
RNA 우성 질환, 예컨대, 근긴장성 이영양증 I형 등의 치료를 위해 본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 예시적 간섭 RNA 분자는 특히 siRNA 분자, miRNA 분자 및 shRNA 분자이다. siRNA 분자의 경우, siRNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 대조적으로, miRNA 분자는 헤어핀을 형성함으로써, 핵산 이중체를 연상시키는 수소결합된 구조를 채택하는 단일 가닥 분자이다. 어느 경우든, 간섭 RNA는 반복부 확장된 돌연변이체 RNA 표적에 (예를 들면, 상보성에 의해) 어닐링하는 안티센스 또는 "가이드" 가닥을 함유할 수 있다. 간섭 RNA는 가이드 가닥에 상보적임으로써, RNA 표적과 동일한 핵산 서열을 가질 수 있는 "패신저" 가닥도 함유할 수 있다.
확장된 CUG 반복부 모티프를 함유하는 돌연변이체 DMPK에 어닐링하고 근긴장성 이영양증 I형의 치료를 위해 본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 예시적 간섭 RNA 분자는 하기 표 4에 제시되어 있다. 하기 간섭 RNA 분자가 서열 상보성에 의해 어닐링하는 표적 DMPK RNA 전사체 상의 부위의 그래픽 표시는 도 1에 제시되어 있다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
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본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 예시적 miRNA 구축물은 하기 표 5에 제시된 패신저 가닥과 가이드 가닥의 조합을 갖는 구축물이다.
Figure pct00019
Figure pct00020
간섭 RNA의 전달을 위한 벡터
간섭 RNA 전달을 위한 바이러스 벡터
바이러스 게놈은 관심 있는 유전자를 환자 내의 표적 세포(예를 들면, 포유동물 세포, 예컨대, 인간 세포)의 게놈 내로 효율적으로 전달하기 위해 사용될 수 있는 벡터의 풍부한 공급원을 제공한다. 바이러스 게놈은 이러한 게놈 내에 함유된 폴리뉴클레오타이드가 전형적으로 일반화된 또는 전문화된 형질도입에 의해 표적 세포의 게놈 내로 혼입되기 때문에 유전자 전달에 특히 유용한 벡터이다. 이 과정은 천연 바이러스 복제 주기의 부분으로서 일어나고 유전자 통합을 유도하기 위해 첨가되는 단백질 또는 시약을 요구하지 않는다. 본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 예는 AAV, 레트로바이러스, 아데노바이러스(예를 들면, Ad5, Ad26, Ad34, Ad35 및 Ad48), 파르보바이러스(parvovirus)(예를 들면, 아데노 관련 바이러스), 코로나바이러스(coronavirus), 음성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대, 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus)(예를 들면, 인플루엔자 바이러스), 라브도바이러스(rhabdovirus)(예를 들면, 광견병 및 수포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스(paramyxovirus)(예를 들면, 홍역 및 센다이), 양성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대, 피코르나바이러스(picornavirus) 및 알파바이러스(alphavirus), 및 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(herpesvirus)(예를 들면, 헤르페스 심플렉스 바이러스 1형 및 2형, 엡스테인-바(Epstein-Barr) 바이러스, 사이토메갈로바이러스) 및 폭스바이러스(예를 들면, 백시니아, 변형된 백시니아 안카라(Ankara)(MVA), 파울폭스(fowlpox) 및 카나리폭스(canarypox))를 포함하는 이중 가닥 DNA 바이러스이다. 본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 다른 바이러스는 예를 들면, 노르워크(Norwalk) 바이러스, 토가바이러스(togavirus), 플라비바이러스(flavi바이러스), 레오바이러스(reovirus), 파포바바이러스(papovavirus), 헤파드나바이러스(hepadnavirus) 및 간염 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스의 예는 조류 백혈증-육종, 포유동물 C형 바이러스, B형 바이러스, D형 바이러스, HTLV-BLV 군, 렌티바이러스, 스푸마바이러스(spumavirus)를 포함한다(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996). 다른 예는 뮤린 백혈병 바이러스, 뮤린 육종 바이러스, 마우스 유선 종양 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 육종 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 인간 T 세포 백혈병 바이러스, 개코원숭이 내생성 바이러스, 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스, 메이슨 화이자(Mason Pfizer) 원숭이 바이러스, 원숭이 면역결핍 바이러스, 원숭이 육종 바이러스, 라우스 육종 바이러스 및 렌티바이러스를 포함한다. 벡터의 다른 예는 예를 들면, 미국 특허 제5,801,030호에 기재되어 있고, 이 특허의 개시는 유전자 요법에 사용될 바이러스 벡터에 관한 것이기 때문에 본원에 참고로 포함된다.
간섭 RNA 전달을 위한 AAV 벡터
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 간섭 RNA 구축물은 환자 내의 세포, 예컨대, 표적 심장 세포(예를 들면, 근육 세포) 내로 그의 도입을 용이하게 하기 위해 재조합 AAV(rAAV) 벡터 내로 혼입된다. 본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 rAAV 벡터는 (1) 본원에 기재된 간섭 RNA 구축물(예컨대, 본원에 기재된 siRNA, shRNA 또는 miRNA)을 코딩하는 전이유전자, 및 (2) 이종 유전자의 발현을 용이하게 하는 핵산을 함유하는 재조합 핵산 구축물을 포함한다. 바이러스 핵산은 DNA의 복제 및 비리온 내로의 DNA의 팩키징(예를 들면, 기능성 ITR)을 위해 시스로(in cis) 요구되는 AAV의 서열을 포함할 수 있다. 이러한 rAAV 벡터는 마커 또는 리포터 유전자도 함유할 수 있다. 유용한 rAAV 벡터는 하나 이상의 천연 생성 AAV 유전자가 전체적으로 또는 부분적으로 결실되어 있으나 기능성 플랭킹 ITR 서열을 보유하는 rAAV 벡터를 포함한다. AAV ITR은 특정 적용에 적합한 임의의 혈청형의 AAV ITR일 수 있다(예를 들면, 혈청형 2로부터 유래할 수 있다). rAAV 벡터를 사용하는 방법은 예를 들면, 문헌[Tal et al., J. Biomed. Sci. 7:279-291 (2000)] 및 문헌[Monahan and Samulski, Gene Delivery 7:24-30 (2000)]에 기재되어 있고, 이 문헌들 각각의 개시는 유전자 전달을 위한 AAV 벡터에 관한 것이기 때문에 본원에 참고로 포함된다.
본원에 기재된 핵산 및 벡터는 세포 내로의 이 핵산 또는 벡터의 도입을 용이하게 하기 위해 rAAV 비리온 내로 혼입될 수 있다. AAV의 캡시드 단백질은 비리온의 외부 비-핵산 부분을 구성하고 AAV cap 유전자에 의해 코딩된다. 상기 cap 유전자는 비리온 어셈블리를 위해 요구되는 3종의 바이러스 코트 단백질인 VP1, VP2 및 VP3을 코딩한다. rAAV 비리온의 구축은 예를 들면, 미국 특허 제5,173,414호, 제5,139,941호, 제5,863,541호, 제5,869,305호, 제6,057,152호 및 제6,376,237호뿐만 아니라, 문헌[Rabinowitz et al., J. Virol. 76:791-801 (2002)] 및 문헌[Bowles et al., J. Virol. 77:423-432 (2003)]에도 기재되어 있고, 이들의 각각의 개시는 유전자 전달을 위한 AAV 벡터에 관한 것이기 때문에 본원에 참고로 포함된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 rAAV 비리온은 AAV 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9를 포함하는 다양한 AAV 혈청형들로부터 유래한 rAAV 비리온을 포함한다. 상이한 혈청형의 AAV 벡터 및 AAV 단백질의 구축 및 사용은 예를 들면, 문헌[Chao et al., Mol. Ther. 2:619-623 (2000)]; 문헌[Davidson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3428-3432 (2000)]; 문헌[Xiao et al., J. Virol. 72:2224-2232 (1998)]; 문헌[Halbert et al., J. Virol. 74:1524-1532 (2000)]; 문헌[Halbert et al., J. Virol. 75:6615-6624 (2001)]; 및 문헌[Auricchio et al., Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081 (2001)]에 기재되어 있고, 이 문헌들 각각의 개시는 유전자 전달을 위한 AAV 벡터에 관한 것이기 때문에 본원에 참고로 포함된다.
슈도타이핑된 rAAV 벡터도 본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 슈도타이핑된 벡터는 소정의 혈청형(예를 들면, AAV2) 이외의 혈청형(예를 들면, 특히 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 또는 AAV9)으로부터 유래한 캡시드 유전자로 슈도타이핑된 상기 소정의 혈청형의 AAV 벡터를 포함한다. 예를 들면, 대표적인 슈도타이핑된 벡터는 AAV 혈청형 8 또는 AAV 혈청형 9로부터 유래한 캡시드 유전자로 슈도타이핑된 치료 단백질을 코딩하는 AAV2 벡터이다. 슈도타이핑된 rAAV 비리온의 구축 및 사용을 포함하는 기법은 당분야에서 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[Duan et al., J. Virol. 75:7662-7671 (2001)]; 문헌[Halbert et al., J. Virol. 74:1524-1532 (2000)]; 문헌[Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167 (2002)]; 및 문헌[Auricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081 (2001)]에 기재되어 있다.
비리온 캡시드 내에 돌연변이를 갖는 AAV 비리온은 돌연변이되지 않은 캡시드 비리온보다 더 효과적으로 특정 유형의 세포를 감염시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 적합한 AAV 돌연변이체는 AAV를 특정 유형의 세포로 표적화하는 것을 용이하게 하기 위해 리간드 삽입 돌연변이를 가질 수 있다. 삽입 돌연변이체, 알라닌 스크리닝 돌연변이체 및 에피토프 태그 돌연변이체를 포함하는 AAV 캡시드 돌연변이체의 구축 및 특징규명은 문헌[Wu et al., J. Virol. 74:8635-45 (2000)]에 기재되어 있다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 다른 rAAV 비리온은 바이러스의 분자 육종에 의해 생성된 캡시드 하이브리드뿐만 아니라 엑손 셔플링에 의해 생성된 캡시드 하이브리드도 포함한다. 예를 들면, 문헌[Soong et al., Nat. Genet., 25:436-439 (2000)] 및 문헌[Kolman and Stemmer, Nat. Biotechnol. 19:423-428 (2001)]을 참조한다.
간섭 RNA를 전달하는 추가 방법
형질감염 기법
전이유전자, 예컨대, 본원에 기재된 간섭 RNA 구축물을 코딩하는 전이유전자를 표적 세포(예를 들면, RNA 우성을 앓고 있는 인간 환자로부터의 표적 세포 또는 이러한 인간 환자 내의 표적 세포) 내로 도입하는 데 이용될 수 있는 기법은 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 전기천공은 정전기 전위를 관심 있는 세포에 적용함으로써 포유동물 세포(예를 들면, 인간 표적 세포)를 투과 가능하게 만드는 데 이용될 수 있다. 이 방식으로 외부 전기장에 노출된 포유동물 세포, 예컨대, 인간 세포는 나중에 외생성 핵산을 흡수하는 성향을 갖는다. 포유동물 세포의 전기천공은 예를 들면, 문헌[Chu et al., Nucleic Acids Research 15:1311 (1987)]에 상세히 기재되어 있고, 이 문헌의 개시는 본원에 참고로 포함된다. 유사한 기법인 NucleofectionTM은 진핵 세포의 핵 내로의 외생성 폴리뉴클레오타이드의 흡수를 자극하기 위해 적용된 전기장을 이용한다. NucleofectionTM 및 이 기법을 수행하는 데 유용한 프로토콜은 예를 들면, 문헌[Distler et al., Experimental Dermatology 14:315 (2005)]뿐만 아니라, 미국 특허출원 공개 제2010/0317114호에도 상세히 기재되어 있고, 이들 각각의 개시는 본원에 참고로 포함된다.
표적 세포의 형질감염에 유용한 추가 기법은 스퀴즈-포레이션(squeeze-poration) 방법을 포함한다. 이 기법은 적용된 응력에 반응하여 형성되는 막 공극을 통한 외생성 DNA의 흡수를 자극하기 위해 세포의 신속한 기계적 변형을 유도한다. 이 기술은 벡터가 핵산을 세포, 예컨대, 인간 표적 세포 내로 전달하기 위해 요구되지 않는다는 점에서 유리하다. 스퀴즈-포레이션은 예를 들면, 문헌[Sharei et al., Journal of Visualized Experiments 81:e50980 (2013)]에 상세히 기재되어 있고, 이 문헌의 개시는 본원에 참고로 포함된다.
리포펙션은 표적 세포의 형질감염에 유용한 또 다른 기법을 대표한다. 이 방법은 리포좀 외부를 향해 양이온성 작용기, 예컨대, 사차 또는 양성자화된 아민을 종종 제시하는 리포좀 내로의 핵산의 로딩을 포함한다. 이것은 궁극적으로, 예를 들면, 리포좀과 세포막의 직접적 융합 또는 복합체의 세포내이입(endocytosis)에 의한 외생성 핵산의 흡수를 유발하는, 세포막의 음이온성으로 인해 리포좀과 세포의 정전기 상호작용을 촉진한다. 리포펙션은 예를 들면, 미국 특허 제7,442,386호에 상세히 기재되어 있고, 이의 개시는 본원에 참고로 포함된다. 세포막과의 이온성 상호작용을 활용하여 외래 핵산의 흡수를 유발하는 유사한 기법은 세포를 양이온성 중합체-핵산 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 세포막과의 상호작용에 유리한 양전하를 부여하도록 폴리뉴클레오타이드와 결합하는 예시적 양이온성 분자는 활성화된 덴드리머(예를 들면, 문헌[Dennig, Topics in Current Chemistry 228:227 (2003)]에 기재됨, 이의 개시는 본원에 참고로 포함됨) 및 디에틸아미노에틸(DEAE)-덱스트란이고, 형질감염제로서의 이의 사용은 예를 들면, 문헌[Gulick et al., Current Protocols in Molecular Biology 40:I:9.2:9.2.1 (1997)]에 상세히 기재되어 있고, 이의 개시는 본원에 참고로 포함된다. 자기 비드는 온화한 효율적인 방식으로 표적 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수 있는 또 다른 수단인데, 이는 이 방법이 핵산의 흡수를 유도하기 위해 적용된 자기장을 이용하기 때문이다. 이 기술은 예를 들면, 미국 특허출원 공개 제2010/0227406호에 상세히 기재되어 있고, 이의 개시는 본원에 참고로 포함된다.
표적 세포에 의한 외생성 핵산의 흡수를 유도하는 데 유용한 또 다른 수단은 세포를 약하게 투과 가능하게 만들고 폴리뉴클레오타이드가 세포막을 침투할 수 있게 하기 위해 세포를 특정 파장의 전자기 방사선에 노출시키는 단계를 포함하는 기법인 레이저펙션(laserfection)이다. 이 기법은 예를 들면, 문헌[Rhodes et al., Methods in Cell Biology 82:309 (2007)]에 상세히 기재되어 있고, 이의 개시는 본원에 참고로 포함된다.
마이크로소포는 본원에 기재된 방법에 따라 표적 세포의 게놈을 변형시키는 데 사용될 수 있는 또 다른 잠재적 비히클을 대표한다. 예를 들면, 당단백질 VSV-G와, 예를 들면, 게놈 변형 단백질, 예컨대, 뉴클레아제의 공과다발현에 의해 유도된 마이크로소포를 사용하여 나중에 내생성 폴리뉴클레오타이드 서열의 부위 특이적 절단을 촉매작용하는 단백질을 세포 내로 효율적으로 전달함으로써, 관심 있는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, 유전자 또는 조절 서열의 공유 혼입을 위해 세포의 게놈을 준비할 수 있다. 진핵 세포의 유전적 변형을 위한, 게지클(Gesicle)로서도 지칭되는 이러한 소포의 사용은 예를 들면, 문헌[Quinn et al., Genetic Modification of Target Cells by Direct Delivery of Active Protein [abstract]. In: Methylation changes in early embryonic genes in cancer [abstract], in: Proceedings of the 18th Annual Meeting of the American Society of Gene and Cell Therapy; 2015 May 13, Abstract No. 122]에 상세히 기재되어 있다.
유전자 편집에 의한 간섭 RNA를 코딩하는 유전자의 혼입
전술된 수단들 이외에, 전이유전자, 예컨대, 본원에 기재된 간섭 RNA 구축물을 코딩하는 전이유전자를 표적 세포, 특히 인간 세포 내로 혼입하는 데 이용될 수 있는 다양한 수단들이 개발되었다. 간섭 RNA 구축물을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 표적 세포 내로 혼입하는 데 이용될 수 있는 이러한 한 방법은 트랜스포존의 사용을 포함한다. 트랜스포존은 트랜스포자제(transposase) 효소를 코딩하고 5' 절개 부위 및 3' 절개 부위에 의해 플랭킹된 관심 있는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오타이드이다. 일단 트랜스포존이 세포 내로 전달되면, 트랜스포자제 유전자의 발현이 시작되고 트랜스포존으로부터 관심 있는 유전자를 절단하는 활성 효소를 야기한다. 이 활성은 트랜스포자제에 의한 트랜스포존 절개 부위의 부위 특이적 인식에 의해 매개된다. 일부 경우, 이 절개 부위들은 말단 반복부 또는 역위 말단 반복부일 수 있다. 일단 관심 있는 전이유전자가 트랜스포존으로부터 절개되면, 이 전이유전자는 세포의 핵 게놈 내에 존재하는 유사한 절개 부위의 트랜스포자제 촉매작용 절단에 의해 포유동물 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 이것은 관심 있는 전이유전자가 상보적 절개 부위에서 절단된 핵 DNA 내로 삽입될 수 있게 하고, 관심 있는 유전자를 포유동물 세포 게놈의 DNA에 연결하는 포스포디에스테르 결합의 후속 공유 라이게이션은 혼입 과정을 완료한다. 일부 경우, 트랜스포존은 표적 유전자를 코딩하는 유전자가 먼저 RNA 생성물로 전사된 후, 포유동물 세포 게놈 내로의 혼입 전에 DNA로 역전사되도록 레트로트랜스포존일 수 있다. 예시적 트랜스포존 시스템은 piggybac 트랜스포존(예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 2010/085699호에 상세히 기재됨) 및 슬립핑 뷰티(sleeping beauty) 트랜스포존(예를 들면, 미국 특허출원 공개 제2005/0112764호에 상세히 기재됨)이고, 이 특허출원들 각각의 개시는 유전자를 관심 있는 세포에게 전달하는 데 사용될 트랜스포존에 관한 것이기 때문에 본원에 참고로 포함된다.
표적 전이유전자를 표적 세포의 게놈 내로 통합시키기 위한 또 다른 수단은 처음에 바이러스 감염에 대한 세균 및 고세균의 후천성 방어 기작으로서 진화된 시스템인 클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 팔린드로믹 반복부(CRISPR)/Cas 시스템이다. CRISPR/Cas 시스템은 플라스미드 DNA 내의 팔린드로믹 반복부 서열 및 관련 Cas9 뉴클레아제를 포함한다. DNA와 단백질의 이 앙상블은 먼저 외래 DNA를 CRISPR 좌위 내로 혼입함으로써 표적 서열의 부위 특이적 DNA 절단을 유도한다. 그 결과, 이 외래 서열 및 CRISPR 좌위의 반복부-스페이서 요소를 함유하는 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포에서 전사되어, 나중에 표적 서열에 어닐링할 수 있고 Cas9 뉴클레아제를 이 부위에 위치시킬 수 있는 가이드 RNA를 생성한다. 이 방식으로, cas9가 표적 DNA 분자에 가깝게 인접하게 하는 상호작용이 RNA:DNA 하이브리드화에 의해 좌우되기 때문에, 고도 부위 특이적 cas9 매개 DNA 절단이 외래 폴리뉴클레오타이드에서 유발될 수 있다. 결과적으로, 관심 있는 임의의 표적 DNA 분자를 절단하는 CRISPR/Cas 시스템을 디자인할 수 있다. 이 기법은 진핵 게놈을 편집하기 위해 활용되고 있고(Hwang et al., Nature Biotechnology 31:227 (2013)), 표적 유전자를 코딩하는 유전자의 혼입 전에 DNA를 절단하기 위해 표적 세포 게놈을 부위 특이적으로 편집하는 효율적인 수단으로서 사용될 수 있다. 유전자 발현을 조절하기 위한 CRISPR/Cas의 사용은 예를 들면, 미국 특허 제8,697,359호에 기재되어 있고, 상기 특허의 개시는 게놈 편집을 위한 CRISPR/Cas 시스템의 사용에 관한 것이기 때문에 본원에 참고로 포함된다. 관심 있는 전이유전자를 표적 세포 내로 혼입하기 전에 게놈 DNA를 부위 특이적으로 절단하는 대안적 방법은 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN) 및 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)의 사용을 포함한다. CRISPR/Cas 시스템과 달리, 이 효소는 특정 표적 서열에 위치시키기 위한 가이드 폴리뉴클레오타이드를 함유하지 않는다. 그 대신, 표적 특이성은 이 효소 내의 DNA 결합 도메인에 의해 조절된다. 게놈 편집 적용에 있어서 ZFN 및 TALEN의 사용은 예를 들면, 문헌[Urnov et al., Nature Reviews Genetics 11:636 (2010)]; 및 문헌[Joung et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology 14:49 (2013)]에 기재되어 있고, 이 문헌들 각각의 개시는 게놈 편집을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이기 때문에 본원에 참고로 포함된다.
표적 전이유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 표적 세포의 게놈 내로 혼입하는 데 이용될 수 있는 추가 게놈 편집 기법은 게놈 DNA를 부위 특이적으로 절단하도록 합리적으로 디자인될 수 있는 ARCUSTM 메가뉴클레아제(meganuclease)의 사용을 포함한다. 표적 유전자를 코딩하는 유전자를 포유동물 세포의 게놈 내로 혼입하기 위한 이 효소의 사용은 이러한 효소에 대해 확립된, 규명된 구조-활성 관계에 비추어 볼 때 유리하다. 단일 쇄 메가뉴클레아제는 원하는 위치에서 DNA를 선택적으로 절단하여, 표적 전이유전자가 표적 세포의 핵 DNA 내로 부위 특이적으로 혼입될 수 있게 하는 뉴클레아제를 생성하기 위해 특정 아미노산 위치에서 변형될 수 있다. 이 단일 쇄 뉴클레아제는 예를 들면, 미국 특허 제8,021,867호 및 제8,445,251호에 광범위하게 기재되어 있고, 이 특허들 각각의 개시는 게놈 편집을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이기 때문에 본원에 참고로 포함된다.
RNA 전사체 발현을 검출하는 방법
병리학적 RNA 전사체, 예컨대, 확장된 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부를 갖는 DMPK RNA 전사체 또는 확장된 GGGGCC(서열번호 162) 헥사뉴클레오타이드를 갖는 C9ORF72 RNA 전사체의 발현 수준은 예를 들면, 다양한 핵산 검출 기법들에 의해 확인될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, RNA 전사체 발현은 RNA 전사체의 번역에 의해 생성된 코딩된 단백질의 농도 또는 상대적 존재도를 평가함으로써 추정될 수 있다. 단백질 농도도 예를 들면, 기능 어세이를 이용함으로써 평가될 수 있다. 이 기법들을 이용할 때, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 반응하여 병리학적 RNA 전사체의 농도의 감소가 코딩된 단백질의 발현을 모니터링하는 동안 관찰될 수 있다. 하기 단락은 병리학적 RNA 전사체 및 이의 다운스트림 단백질 생성물의 발현 수준을 측정하는 데 이용될 수 있는 예시적 기법을 기술한다. RNA 전사체 발현은 핵산 서열분석, 마이크로어레이 분석, 프로테오믹스(proteomics), 제자리 하이브리드화(예를 들면, 형광 제자리 하이브리드화(FISH)), 증폭 기반 어세이, 제자리 하이브리드화, 형광 활성화 세포 분류(FACS), 노던 분석 및/또는 RNA의 PCR 분석을 포함하나 이들로 제한되지 않는, 당분야에서 공지되어 있는 다수의 방법들에 의해 평가될 수 있다.
핵산 검출
RNA 전사체 발현을 검출하는 핵산 기반 방법은 본원에 기재된 간섭 RNA를 코딩하는 벡터 또는 이러한 간섭 RNA 구축물을 함유하는 조성물의 투여 후 환자로부터 수득된 세포와 함께 사용될 수 있는 영상화 기반 기법(예를 들면, 노던 블롯팅 또는 서던 블롯팅)을 포함한다. 노던 블롯 분석은 당분야에서 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[Molecular Cloning, a Laboratory Manual, second edition, 1989, Sambrook, Fritch, Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 10 Skyline Drive, Plainview, NY 11803-2500]에 기재되어 있는 보편적인 기법이다. 유전자 및 유전자 생성물의 상태를 평가하는 전형적인 프로토콜은 예를 들면, 문헌[Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) and 18 (PCR Analysis)]에서 발견된다.
확장된 뉴클레오타이드 반복부 영역을 갖는 RNA 전사체, 예컨대, 확장된 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부를 갖는 DMPK RNA 전사체 및 확장된 GGGGCC(서열번호 162) 헥사뉴클레오타이드 반복부를 갖는 C9ORF72 RNA 전사체의 억제를 평가하기 위해 본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 이용될 수 있는 RNA 검출 기법은 마이크로어레이 서열분석 실험(예를 들면, 생거 서열분석, 및 고처리율 서열분석 또는 딥 서열분석으로서도 공지되어 있는 차세대 서열분석 방법)을 추가로 포함한다. 예시적 차세대 서열분석 기술은 일루미나(Illumina) 서열분석, 이온 토렌트(Ion Torrent) 서열분석, 454 서열분석, SOLiD 서열분석 및 나노공극 서열분석 플랫폼을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 당분야에서 공지되어 있는 추가 서열분석 방법도 이용될 수 있다. 예를 들면, RNA-Seq(예를 들면, 문헌[Mortazavi et al., Nat. Methods 5:621-628 (2008)]에 기재됨, 이의 개시는 전체적으로 본원에 참고로 포함됨)를 이용하여 mRNA 수준에서 전이유전자 발현을 측정할 수 있다. RNA-Seq는 샘플에서 RNA 분자를 직접 서열분석함으로써 발현을 모니터링하는 강력한 기술이다. 요약하건대, 이 방법은 평균 길이 200개의 뉴클레오타이드로의 RNA의 단편화, 랜덤 프라이밍에 의한 cDNA로의 전환, 및 이중 가닥 cDNA의 합성(예를 들면, 아질런트 테크놀로지(Agilent Technology)®로부터의 저스트(Just) cDNA 이중 가닥 cDNA 합성 키트를 사용함)을 포함할 수 있다. 그 다음, (예를 들면, 일루미나(Illumina)®/솔렉사(Solexa)로부터의) 각각의 라이브러리에 대한 서열 어댑터를 첨가함으로써 cDNA를 서열분석용 분자 라이브러리로 전환시키고, 생성된 50개 내지 100개의 뉴클레오타이드 리드(read)를 게놈에 맵핑한다.
마이크로어레이 기술이 고해상을 제공하기 때문에, 마이크로어레이 기반 플랫폼(예를 들면, 단일 뉴클레오타이드 다형성 어레이)을 이용하여 RNA 발현 수준을 측정할 수 있다. 다양한 마이크로어레이 방법들의 상세한 설명은 문헌에서 확인될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제6,232,068호 및 문헌[Pollack et al., Nat. Genet. 23:41-46 (1999)]을 참조하고, 이들 각각의 개시는 전체적으로 본원에 참고로 포함된다. 핵산 마이크로어레이를 이용하여 mRNA 샘플을 역전사하고 표지부착시켜 cDNA를 생성한다. 그 다음, 프로브는 고체 지지체 상에 정렬되고 고정된 하나 이상의 상보적 핵산에 하이브리드화될 수 있다. 어레이는 예를 들면, 어레이의 각각의 구성원의 서열 및 위치가 알려지도록 배열될 수 있다. 표지부착된 프로브와 특정 어레이 구성원의 하이브리드화는 프로브의 기원이 된 샘플이 그 유전자를 발현한다는 것을 시사한다. 발현 수준은 하이브리드화된 프로브-샘플 복합체로부터 검출된 신호의 양에 따라 정량될 수 있다. 전형적인 마이크로어레이 설험은 하기 단계들을 포함한다: 1) 샘플로부터 단리된 RNA로부터 형광 표지부착된 표적을 제조하는 단계, 2) 표지부착된 표적을 마이크로어레이에 하이브리드화시키는 단계, 3) 어레이를 세척하고 염색하고 스캐닝하는 단계, 4) 스캐닝된 영상을 분석하는 단계, 및 5) 유전자 발현 프로파일을 생성하는 단계. 마이크로어레이 프로세서의 일례는 시판되고 있고 유리 표면 상에서의 올리고뉴클레오타이드의 직접 합성에 의해 제작된 어레이를 포함하는 아피메트릭스(Affymetrix) GENECHIP® 시스템이다. 다른 시스템은 당분야에서 숙련된 자에게 공지된 바와 같이 사용될 수 있다.
증폭 기반 어세이도 특정 RNA 전사체, 예컨대, 확장된 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부를 갖는 DMPK RNA 전사체 또는 확장된 GGGGCC(서열번호 162) 헥사뉴클레오타이드 반복부를 갖는 C9ORF72 RNA 전사체의 발현 수준을 측정하는 데 이용될 수 있다. 이러한 어세이에서, 전사체의 핵산 서열은 증폭 반응(예를 들면, PCR, 예컨대, qPCR)에서 주형으로서 작용한다. 정량 증폭에서, 증폭 생성물의 양은 원래의 샘플 중의 주형의 양에 비례한다. 적절한 대조군과의 비교는 본원에 기재된 원리에 따라, 사용된 특정 프로브에 상응하는 관심 있는 전사체의 발현 수준의 측정치를 제공한다. TaqMan 프로브를 사용하는 실시간 qPCR 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있다. 실시간 qPCR을 위한 상세한 프로토콜은 예를 들면, 문헌[Gibson et al., Genome Res. 6:995-1001 (1996)] 및 문헌[Heid et al., Genome Res. 6:986-994 (1996)]에 제공되어 있고, 이 문헌들 각각의 개시는 전체적으로 본원에 참고로 포함된다. 본원에 기재된 RNA 전사체 발현의 수준은 예를 들면, RT-PCR 기술에 의해 측정될 수 있다. PCR을 위해 사용되는 프로브는 검출 가능한 마커, 예를 들면, 방사성동위원소, 형광 화합물, 생체발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소에 의해 표지부착될 수 있다.
단백질 검출
RNA 구축물의 발현은 상기 구축물에 의해 코딩된 단백질의 발현을 분석함으로써 추정될 수도 있다. 단백질 수준은 당분야에서 공지되어 있는 표준 검출 기법을 이용함으로써 평가될 수 있다. 본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용되기에 적합한 단백질 발현 어세이는 프로테오믹스 방법, 면역조직화학적 및/또는 웨스턴 블롯 분석, 면역침전, 분자 결합 어세이, ELISA, 효소 연결 면역여과 어세이(ELIFA), 질량 분광측정, 질량 분광측정 면역어세이, 및 생화학적 효소 활성 어세이를 포함한다. 구체적으로, 프로테오믹스 방법은 대규모 단백질 발현 데이터세트를 멀티플렉스로 생성하는 데 이용될 수 있다. 프로테오믹스 방법은 질량 분광측정을 이용하여 폴리펩타이드(예를 들면, 단백질)을 검출하고 정량할 수 있고/있거나, 표적 단백질의 패널에 특이적인 포획 시약(예를 들면, 항체)을 사용하는 펩타이드 마이크로어레이를 이용하여 샘플(예를 들면, 단일 세포 샘플 또는 다중세포 집단)에서 발현된 단백질의 발현 수준을 확인하고 측정할 수 있다.
예시적 펩타이드 마이크로어레이는 기판에 결합된 복수의 폴리펩타이드들을 갖고, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 또는 단백질과 복수의 결합된 폴리펩타이드들 각각의 결합은 따로 검출될 수 있다. 대안적으로, 펩타이드 마이크로어레이는 특정 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 또는 단백질의 결합을 특이적으로 검출할 수 있는 단일클론 항체, 다중클론 항체, 파지 디스플레이 결합제, 효모 투-하이브리드 결합제, 앱타머를 포함하나 이들로 제한되지 않는 복수의 결합제들을 포함할 수 있다. 펩타이드 어레이의 예는 미국 특허 제6,268,210호, 제5,766,960호 및 제5,143,854호에서 확인될 수 있고, 이 특허들 각각의 개시는 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
질량 분광측정(MS)을 본원에 기재된 방법과 함께 이용하여, 전이유전자의 전달 후 환자(예를 들면, 인간 환자)로부터의 세포에서 전이유전자 발현을 확인하고 특징규명할 수 있다. 당분야에서 공지되어 있는 임의의 MS 방법, 예를 들면, LC-MS, ESI-MS, ESI-MS/MS, MALDI-TOF-MS, MALDI-TOF/TOF-MS, 탠덤 MS 등을 이용하여 관심 있는 단백질 또는 펩타이드 단편을 확인할 수 있고/있거나, 검출할 수 있고/있거나 측정할 수 있다. 질량 분광측정기는 일반적으로 이온 공급원 및 광학장치, 질량 분석기 및 데이터 프로세싱 전자장치를 함유한다. 스캐닝 및 이온 빔 질량 분광측정기, 예컨대, 비행시간(TOF) 및 사중극자(Q), 및 포획 질량 분광측정기, 예컨대, 이온 포획(IT), 오비트랩(Orbitrap) 및 푸리에(Fourier) 변환 이온 사이클로트론 공명(FT-ICR)을 포함하는 질량 분석기가 본원에 기재된 방법에서 이용될 수 있다. 다양한 MS 방법들의 상세한 설명은 문헌에서 발견될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Yates et al., Annu. Rev. Biomed. Eng. 11:49-79, 2009]을 참조하고, 이의 개시는 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
MS 분석 전, 환자로부터 수득된 샘플 중의 단백질은 먼저 화학적(예를 들면, 브롬화시아노겐 절단을 통해) 또는 효소(예를 들면, 트립신) 분해에 의해 더 작은 펩타이드로 분해될 수 있다. 복잡한 펩타이드 샘플도 프론트-엔드(front-end) 분리 기법, 예를 들면, 2D-PAGE, HPLC, RPLC 및 친화성 크로마토그래피의 이용으로부터 이익을 얻는다. 그 다음, 분해되고 임의적으로 분리된 샘플은 이온 공급원의 이용을 통해 이온화되어 추가 분석될 하전된 분자를 생성한다. 샘플의 이온화는 예를 들면, 전기분무 이온화(ESI), 대기압 화학적 이온화(APCI), 광이온화, 전자 이온화, 신속 원자 포격(FAB)/액체 이차 이온화(LSIMS), 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI), 필드 이온화, 필드 탈착, 열분무/플라스마분무 이온화, 및 입자 빔 이온화에 의해 수행될 수 있다. 이온화 방법의 선택에 관한 추가 정보는 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있다.
그 다음, 이온화 후, 분해된 펩타이드를 단편화하여, 시그니처 MS/MS 스펙트럼을 생성할 수 있다. MS/MS로서도 공지되어 있는 탠덤 MS는 복잡한 혼합물을 분석하는 데 특히 유리할 수 있다. 탠덤 MS는 공간적으로 분리된 개별 질량 분광측정기 요소들을 사용하거나 시간적으로 분리된 MS 단계를 이용하는 단일 질량 분광측정기를 이용함으로써 달성될 수 있는 다수의 MS 선택 단계들을 포함하고, 이때 일부 형태의 이온 단편화는 단계들 사이에 일어난다. 공간적으로 분리된 탠덤 MS에서, 요소들은 높은 진공을 유지하기 위해 요소들 사이의 물리적 연결을 가지면서 물리적으로 분리되어 있고 구별된다. 시간적으로 분리된 탠덤 MS에서, 분리는 동일한 장소에 포획된 이온에 의해 달성되고, 이때 다수의 분리 단계들은 시간에 따라 일어난다. 그 다음, 시그니처 MS/MS 스펙트럼은 펩타이드 서열 데이터베이스(예를 들면, SEQUEST)와 비교될 수 있다. 펩타이드에 대한 번역 후 변형도 예를 들면, 특정 펩타이드 변형을 허용하면서 데이터베이스에 대해 스펙트럼을 검색함으로써 확인될 수 있다.
약학 조성물
간섭 RNA 구축물뿐만 아니라, 이 구축물을 코딩하거나 함유하는 벡터 및 조성물도 본원에 기재된 바와 같이 환자, 예컨대, RNA 우성을 앓고 있는 인간 환자에게 투여될 비히클 내로 혼입될 수 있다. 본원에 기재된 간섭 RNA 구축물을 코딩하는 벡터, 예컨대, 바이러스 벡터를 함유하는 약학 조성물은 당분야에서 공지되어 있는 방법을 이용함으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 이러한 조성물은 예를 들면, 생리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980); 본원에 참고로 포함됨)를 사용함으로써 원하는 형태, 예를 들면, 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 제조될 수 있다.
본원에 기재된 핵산과 바이러스 벡터의 혼합물은 하나 이상의 부형제, 담체 또는 희석제와 적절히 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액도 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물, 및 오일에서 제조될 수 있다. 통상의 저장 및 사용 조건 하에서, 이 제제들은 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유할 수 있다. 주사 사용에 적합한 약학 제형은 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다(미국 특허 제5,466,468호에 기재됨, 이의 개시는 본원에 참고로 포함됨). 임의의 경우, 제제는 멸균될 수 있고, 용이한 주사 가능성이 존재할 정도로 유체일 수 있다. 제제는 제조 및 저장 조건 하에서 안정할 수 있고 미생물, 예컨대, 세균 및 진균의 오염 작용으로부터 보존될 수 있다. 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및/또는 식물유를 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 코팅제, 예컨대, 레시틴의 사용, 분산액의 경우 요구된 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제들 및 항진균제들, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예를 들면, 당 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에서 사용함으로써 달성될 수 있다.
예를 들면, 본원에 기재된 약학 조성물을 함유하는 용액은 필요한 경우 적절하게 완충될 수 있고, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코스와 등장성을 갖게 된다. 이 특정 수용액은 정맥내, 수막공간내, 뇌실내, 뇌실질내, 수조내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시에 비추어 볼 때 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들면, 1회 용량은 1 ㎖의 등장성 NaCl 용액에 용해될 수 있고 1000 ㎖의 대량피하주사액에 첨가될 수 있거나 제안된 주입 부위에 주사될 수 있다. 치료되는 대상체의 상태에 따라 약간의 용량 변경이 반드시 일어날 것이다. 투여를 담당하는 사람은 어떠한 경우든 개별 대상체에 적절한 용량을 결정할 것이다. 나아가, 인간 투여의 경우, 제제는 FDA 생물제제 표준 부서에 의해 요구된 멸균성, 발열원성, 일반적 안전성 및 순도 표준을 충족시킬 수 있다.
투여 경로 및 투약
본원에 기재된 간섭 RNA 구축물을 코딩하는 전이유전자를 함유하는 바이러스 벡터, 예컨대, 본원에 기재된 AAV 벡터 등은 다양한 투여 경로들에 의해 환자(예를 들면, 인간 환자)에게 투여될 수 있다. 투여 경로는 예를 들면, 질환의 발병 및 중증도에 따라 달라질 수 있고, 예를 들면, 정맥내, 수막공간내, 뇌실내, 뇌실질내, 수조내, 피내, 경피, 비경구, 근육내, 비내, 피하, 침피, 기관내, 복강내, 동맥내, 혈관내, 흡입, 관류, 세척, 및 경구 투여를 포함할 수 있다. 혈관내 투여는 환자의 혈관 내로의 전달을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 투여는 정맥인 것으로 간주된 혈관 내로의 투여이고(정맥내), 일부 실시양태에서, 상기 투여는 동맥인 것으로 간주된 혈관 내로의 투여이다(동맥내). 정맥은 내경 정맥, 말초 정맥, 관상 정맥, 간 정맥, 문맥 정맥, 대복재 정맥, 폐 정맥, 상대 정맥, 하대 정맥, 위 정맥, 비장 정맥, 하장간막 정맥, 상장간막 정맥, 요측피 정맥 및/또는 대퇴 정맥을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 동맥은 관상 동맥, 폐 동맥, 상완 동맥, 내경 동맥, 대동맥궁, 대퇴 동맥, 말초 동맥 및/또는 섬모체 동맥을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 전달은 세동맥 또는 모세혈관을 통한 전달, 또는 세동맥 또는 모세혈관에게의 전달일 수 있다는 것이 예상된다.
치료 처방은 달라질 수 있고, 종종 질환 중증도, 및 환자의 연령, 체중 및 성별에 의해 좌우될 수 있다. 치료는 전이유전자를 표적 세포 내로 도입하는 데 유용한 것으로서 본원에 기재된 벡터(예를 들면, 바이러스 벡터) 또는 다른 작용제를 다양한 유닛 용량으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 각각의 유닛 용량은 통상적으로 소정의 양의 치료 조성물을 함유할 것이다.
실시예
하기 실시예는 본원에 기재된 조성물 및 방법을 어떻게 사용하고 제조하고 평가할 수 있는지에 대한 설명을, 당분야에서 통상의 기술을 갖는 자에게 제공하기 위해 기재되고, 순전히 본 발명을 예시하기 위한 것이고 본 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.
실시예 1. RNA 우성과 관련된 질환의 치료를 위한 miRNA 구축물을 코딩하는 아데노 관련 바이러스 벡터의 개발 및 평가
목적
이 실시예는 RNA 우성 질환인 근긴장성 이영양증의 마우스 모델에서 발현되는 인간 DMPK 및 뮤린 HSALR에 대한 miRNA 구축물을 코딩하는 rAAV 벡터의 개발 및 평가를 특징규명하기 위해 수행된 일련의 실험들을 기술한다. 근긴장성 이영양증(DM)은 독성 확장된 반복부 mRNA의 발현을 유발하는 마이크로세틀라이트(microsatellite) 반복부의 확장에 의해 야기된다. 또 다른 RNA 우성 질환인 얼굴어깨팔 근이영양증(FSHD)은 성체 근육에서 독성 단백질인 DUX4의 발현을 유발하는 D4Z4 마이크로세틀라이트 반복부의 수축에 의해 야기된다. 이 실시예에 기재된 실험들의 목적은 질환을 갖는 개체에서 근육 기능장애 및 손실을 예방하도록 근육 DM 및 FSHD 관련 mRNA를 표적화하는 miRNA 구축물을 코딩하는 AAV 벡터를 개발하는 것이다.
재료 및 방법
근긴장성 이영양증 1형(DM1)에 대한 rAAV-RNAi 요법을 개발하기 위해, 인간 골격 액틴 유전자(HSA)에 대해 유도된 간섭 RNA 헤어핀을, DM1의 HSALR 마우스 모델에서 그의 효능이 시험될 수 있도록 디자인하고 생성하였다. 인간에서의 DMPK 유전자 내의 질환 야기 반복부 확장과 유사한 유전적 상황인, 확장된 CTG 반복부가 HSA 유전자의 3' UTR 내에 삽입된 HSALR 마우스를 생성하였다. HSALR 마우스는 근긴장증, 다양한 mRNA들의 스플라이싱 변화 및 핵 봉입체(포커스)를 포함하는, 골격근 내의 DM1과 관련된 많은 유전적 및 표현형적 변화를 나타낸다. 이 연구의 목적들 중에는 인간 질환 표적 유전자인 DMPK를 억제하기 위한 패러다임을 개발하기 위해 확장된 CUG 반복부 영역을 함유하는 비정상적 HSALR RNA 전사체의 발현을 감소시키는 방법을 이해하는 것이었다.
이를 위해, 19 내지 22 bp 표적 인식 서열을 갖는 RNAi 발현 카세트를 다양한 적용에 대해 시험하였다. RNAi 헤어핀은 miR30a 내생성 서열에 기반하였다. 근육을 표적화하기 위해 단일 가닥 rAAV 게놈을 rAAV6 캡시드 내에 팩키징하였다. 미리 정맥내 주사(IV)를 통해 rAAV6 HSA RNAi 구축물을 4주령의 HSALR 마우스(n=7 내지 9)의 꼬리 정맥 내로 전달하였다.
결과
도 2a 내지 2c에 나타낸 바와 같이, 치료 RNAi의 시험 및 개발을 위해 여러 유전자들을 표적화하도록 3 세대의 rAAV-RNAi 벡터들을 개발하였다. rAAV 플라스미드 pARAP4는 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터로부터 발현되는 인간 알칼리성 포스파타제 리포터 유전자(Hu Alk Phos) 리포터 유전자, 및 SV40 폴리아데닐화 서열인 pA를 포함한다. 역위 말단 반복부(ITR)는 rAAV2로부터 유래하고 게놈은 rAAV6 캡시드 내에 팩키징된다. 최신 벡터 변형은 근육 세포 독성으로 인해 더 높은 용량에서 rAAV-RNAi 효능을 제한하는 Hu Alk Phos 발현을 방지하기 위해 RSV 프로모터 서열을 제거한다.
도 3a 내지 3c에 나타낸 바와 같이, HSALR 마우스는 인간의 DM과 유사한 근이영양증의 특성을 보인다. HSALR 전이유전자는 HSA 유전자의 3' UTR 내로의 (CTG)250 반복부의 삽입으로부터 유도된다. 전이유전자가 마우스 골격근에서 발현될 때, 근긴장성 방전이 분명히 나타나고, 스플라이싱 변경이 다양한 mRNA들에서 일어나고, 확장된 형질전환 mRNA 및 스플라이싱 인자를 함유하는 핵내 포커스가 존재한다.
도 4에 나타낸 바와 같이, rAAV6 HSA miR DM10을 HSALR 마우스 내로 형질도입하였다. 인간 태반 알칼리성 포스파타제(AP) 염색은 활성 리포터 유전자 발현을 갖는 바이러스 게놈의 존재를 표시하고, 치료받은 마우스의 냉동박편의 H&E 염색도 확인된다. 시점, 주사 후 8주, 4주령 HSALR 마우스.
도 5a 및 5b, 도 6a 내지 6e, 및 도 7a 내지 7c에 나타낸 바와 같이, HSALR 전사체에 상보적인 miRNA 구축물을 코딩하는 rAAV-RNAi 벡터는 병리학적 HSALR RNA의 발현을 감소시켰고, SERCA1 mRNA의 정확한 스플라이싱의 회복에 의해 입증된 바와 같이, CUG 반복부 확장에 의해 격리될 RNA 결합 스플라이싱 인자의 방출을 달성하였다(도 6c 및 6d). rAAV6 HSA miR DM10 전신 주사는 전경골근(TA)에서 SERCA1 및 CLCN1의 스플라이싱을 개선한다. 대조적으로, 상이한 RNAi 헤어핀인 miR DM4는 이 스플라이싱 결함을 반전시키는 데 있어서 그다지 효과적이지 않았다.
RNAi에 대한 DMPK 영역의 선택
siRNA 디자인에 대한 지침을 이용하여 miRNA 기반 헤어핀 내로 혼입될 DMPK RNA 표적 서열의 선택을 수행하였다. 다른 좌위 또는 대안적으로 스플라이싱된 영역에서 예측된 시드(seed) 서열 일치에 기반하여 후보 표적 서열을 제거하였다. 추가 스크리닝은 짧은 서열을 인간 게놈에 정렬하기 위해 Bowtie를 사용하는 분석, 및 광범위한 BLAST 검색을 포함하였다. 인간 DMPK에 대한 예시적 간섭 RNA 구축물은 상기 표 4에 제시되어 있고, 도 1에 그래프로 표시되어 있다.
결론
이 실험들에서 입증된 바와 같이, 근육에서 Hu Alk Phos 프로모터를 결여하는 벡터의 국소 주사는 SERCA1 mRNA 성숙 스플라이싱 생성물의 양의 증가에 의해 측정될 때, HSALR 마우스의 스플라이싱 관련 표현형을 개선한다. SERCA1 mRNA에 대한 스플라이싱은 대략 95% 보정되었고, 기술의 개선이 이 방법의 효능을 증가시킬 잠재력을 가짐을 입증한다.
추가로, 이 결과들은 HSA 헤어핀의 rAAV6 매개 전달이 근긴장증, 질환 관련 스플라이싱 변화 및 스플라이싱 인자의 격리를 포함하는, HSALR 마우스에서 모델링된 DM1의 많은 분자적 특성 및 표현형적 특성을 개선한다는 것을 입증한다. 나아가, 본원에 기재된 조성물 및 방법을 이용할 때, U6-발현된 DMPK miRNA를 보유하는 벡터는 형질감염 후 HEK293 세포에서 내생성 DMPK mRNA를 감소시킬 수 있다. 이 데이터는 DM1을 치료하는 데 있어서 RNAi 매개 유전자 요법의 유용성을 시사한다.
rAAV 매개 요법은 척수 근위축증에 효과적이고 뒤센(Duchenne) 근이영양증에 대한 임상 시험이 진행되고 있다. 비인간 영장류에서의 연구는 AAV가 국부 사지 전달로 근육을 효율적으로 형질도입시킬 수 있고 10년만큼 긴 기간 동안 지속될 수 있음을 입증한다. 이 연구들은 인간의 우성 근육 질환, 예컨대, 특히 본원에 기재된 근긴장성 이영양증 I형의 치료를 위한 rAAV 매개 RNAi 유전자 요법의 개발을 뒷받침한다.
실시예 2. DMPK에 대한 miRNA를 코딩하는 바이러스 벡터의 투여에 의한 인간 환자의 근긴장성 이영양증의 치료
당분야에서 숙련된 의사는 본원에 기재된 조성물 및 방법을 이용하여, 확장된 CUG 반복부 영역을 함유하는 돌연변이체 DMPK RNA 전사체에 어닐링하고 이의 발현을 감소시키는 miRNA를 코딩하는 바이러스 벡터를, 근긴장성 이영양증 I형을 갖는 환자에게 투여할 수 있다. 상기 벡터는 AAV 벡터, 예컨대, 슈도타이핑된 AAV2/8 또는 AAV2/9 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 본원에 기재된 하나 이상의 투여 경로, 예컨대, 정맥내, 수막공간내, 뇌실내, 뇌실질내, 수조내, 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 코딩된 miRNA는 본원에서 특징규명된 miRNA, 예컨대, 서열번호 40 내지 161 중 어느 한 서열번호의 핵산 서열을 갖는 miRNA일 수 있다.
벡터의 투여 후, 의사는 예를 들면, 본원에 기재된 RNA 검출 기법을 이용하여 SERCA1, CLCN1 및/또는 ZASP를 코딩하는 정확히 스플라이싱된 mRNA 전사체의 농도를 평가함으로써 장애의 진행 및 치료의 효능을 모니터링할 수 있다. 의사는 정확히 스플라이싱된 전사체로부터 생성된 기능적 SERCA1, CLCN1 및/또는 ZASP 단백질 생성물의 농도도 모니터링할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 의사는 환자에 의해 발현된 돌연변이체 DMPK RNA 전사체, 구체적으로 약 50개 내지 약 4,000개, 또는 더 많은 수의 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부를 갖는 DMPK 전사체의 농도를 모니터링할 수 있다. (i) 정확히 스플라이싱된 SERCA1, CLCN1 및/또는 ZASP mRNA 전사체의 농도가 증가하였고/하였거나, (ii) 정확히 스플라이싱된 mRNA 전사체의 번역으로부터 생성된 기능적 SERCA1, CLCN1 및/또는 ZASP 단백질 생성물의 농도가 증가하였고/하였거나, (iii) 확장된 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부 영역을 갖는 돌연변이체 DMPK RNA 전사체의 농도가 감소하였다는 소견은 환자가 성공적으로 치료되었음을 시사하는 지표로서 사용될 수 있다. 의사는 질환의 하나 이상의 증상, 예컨대, 근긴장증, 근육 경직, 불능 원위 약화, 안면 및 턱 근육의 약화, 삼킴 곤란, 눈꺼풀 처짐(안검하수), 목 근육의 약화, 팔 및 다리 근육의 약화, 지속적인 근육 통증, 과다수면증, 근육 소모, 연하곤란, 호흡 불충분, 불규칙한 심박동, 심근 손상, 무감각증, 인슐린 내성 및 백내장의 진행도 모니터링할 수 있다. 소아에서, 증상은 발달 지연, 학습 문제, 언어 및 말하기 어려움, 및 성격 발달 문제도 포함할 수 있다. 상기 증상들 중 하나 이상의 증상 또는 모든 증상들이 완화되었다는 소견도 성공적인 치료의 임상적 지표로서 사용될 수 있다.
실시예 3. DMPK에 대한 siRNA 올리고뉴클레오타이드의 투여에 의한 인간 환자의 근긴장성 이영양증의 치료
당분야에서 숙련된 의사는 본원에 기재된 조성물 및 방법을 이용하여, 확장된 CUG 반복부 영역을 함유하는 돌연변이체 DMPK RNA 전사체에 어닐링하고 이의 발현을 감소시키는 siRNA 올리고뉴클레오타이드를, 근긴장성 이영양증 I형을 갖는 환자에게 투여할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면, 서열번호 3 내지 39 중 어느 한 서열번호의 핵산 서열을 가질 수 있다.
상기 올리고뉴클레오타이드의 투여 후, 의사는 예를 들면, 본원에 기재된 RNA 검출 기법을 이용하여 SERCA1, CLCN1 및/또는 ZASP를 코딩하는 정확히 스플라이싱된 mRNA 전사체의 농도를 평가함으로써 장애의 진행 및 치료의 효능을 모니터링할 수 있다. 의사는 정확히 스플라이싱된 전사체로부터 생성된 기능적 SERCA1, CLCN1 및/또는 ZASP 단백질 생성물의 농도도 모니터링할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 의사는 환자에 의해 발현된 돌연변이체 DMPK RNA 전사체, 구체적으로 약 50개 내지 약 4,000개, 또는 더 많은 수의 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부를 갖는 DMPK 전사체의 농도를 모니터링할 수 있다. (i) 정확히 스플라이싱된 SERCA1, CLCN1 및/또는 ZASP mRNA 전사체의 농도가 증가하였고/하였거나, (ii) 정확히 스플라이싱된 mRNA 전사체의 번역으로부터 생성된 기능적 SERCA1, CLCN1 및/또는 ZASP 단백질 생성물의 농도가 증가하였고/하였거나, (iii) 확장된 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부 영역을 갖는 돌연변이체 DMPK RNA 전사체의 농도가 감소하였다는 소견은 환자가 성공적으로 치료되었음을 시사하는 지표로서 사용될 수 있다. 의사는 질환의 하나 이상의 증상, 예컨대, 근긴장증, 근육 경직, 불능 원위 약화, 안면 및 턱 근육의 약화, 삼킴 곤란, 눈꺼풀 처짐(안검하수), 목 근육의 약화, 팔 및 다리 근육의 약화, 지속적인 근육 통증, 과다수면증, 근육 소모, 연하곤란, 호흡 불충분, 불규칙한 심박동, 심근 손상, 무감각증, 인슐린 내성 및 백내장의 진행도 모니터링할 수 있다. 소아에서, 증상은 발달 지연, 학습 문제, 언어 및 말하기 어려움, 및 성격 발달 문제도 포함할 수 있다. 상기 증상들 중 하나 이상의 증상 또는 모든 증상들이 완화되었다는 소견도 성공적인 치료의 임상적 지표로서 사용될 수 있다.
실시예 4. 배양된 HEK293 세포에서 DMPK1 발현을 억제하는 항-DMPK siRNA 분자의 능력
이 실시예는 항-DMPK siRNA 분자, 예컨대, 본원의 표 4에 기재된 다양한 siRNA 분자들이 배양된 인간 세포에서 DMPK1 mRNA의 발현을 약화시키는 능력을 평가하기 위해 수행된 실험의 결과를 기술한다. 비교를 위해, 상기 표 4에 기재된 siRNA 분자들의 시험 이외에, 스크램블링된 siRNA 분자 및 시판되는 항-DMPK siRNA 분자도 시험하였다.
이 실험을 수행하기 위해, 1 ㎕ Lipofectamine™ RNAiMAX(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 HEK293 세포(2 x 105개 세포/웰)를 5 pM의 후보 항-DMPK siRNA 분자(예컨대, 상기 표 4에 기재된 siRNA 분자) 또는 5 pM의 스크램블링된 음성 siRNA 대조군(Silencer® Select siRNA, Ambion by Life Technologies)으로 삼중으로 형질감염시켰다. 정규화를 위해 1 ㎕ Lipofectamine™ RNAiMAX만으로 처리된 세포의 모의 형질감염을 포함시켰다. 48시간 후 RNeasy 플러스 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 RNA를 수거하였다. 그 후, 샘플당 150 ng의 RNA를 사용하고 SuperScript™ III 역전사효소(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 cDNA를 생성하였다. DMPK1 넉다운을 검출하기 위해 qPCR을 수행하였다. TaqMan™ 패스트 어드밴스드 마스터(Fast Advanced Master) 혼합물을 사용하여 qPCR 실험을 삼중으로 설정하였고, 콴트스튜디오(QuantStudio) 3 RT-PCR 기계(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 반응을 수행하였다. 콴트스튜디오 3 소프트웨어를 이용하여 DMPK1 발현 값을 GAPDH(TaqMan™ 유전자 발현 어세이 ID Hs02786624_g1)로 정규화하였다.
이 실험의 결과는 도 9에 표시되어 있다. 이 도면에 의해 입증된 바와 같이, 상기 표 4에 기재된 다양한 siRNA 분자들은 살아있는 인간 세포에서 DMPK1 발현을 하향조절할 수 있다. 도 9에 그래프로 표시된 데이터는 하기 표 6에 숫자 형태로 제공되어 있다.
Figure pct00021
다른 실시양태
본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌들, 특허들 및 특허출원들은 각각의 독립적 공개문헌 또는 특허출원이 참고로 포함되는 것으로 구체적 및 개별적으로 표시된 것처럼 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 이의 구체적인 실시양태들과 관련하여 기재되어 있지만, 더 변형될 수 있고, 본원은 일반적으로 본 발명의 원리를 따르는 본 발명의 임의의 변경, 용도 또는 개조를 커버하고, 본 발명이 속하는 분야 내의 공지된 또는 통상의 관행 내에 있고 본원에서 전술된 필수 특징에 적용될 수 있는, 본 발명의 이러한 변경을 포함하기 위한 것이고, 하기 청구범위를 따른다는 것을 이해할 것이다.
다른 실시양태는 청구범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY OF WASHINGTON <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR REDUCING SPLICEOPATHY AND TREATING RNA DOMINANCE DISORDERS <130> 51311-004WO2 <150> US 62/671,769 <151> 2018-05-15 <160> 166 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2888 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggcuggacca aggggugggg agaaggggag gaggccucgg ccggccgcag agagaagugg 60 ccagagaggc ccaggggaca gccagggaca ggcagacaug cagccagggc uccagggccu 120 ggacaggggc ugccaggccc ugugacagga ggaccccgag cccccggccc ggggaggggc 180 cauggugcug ccuguccaac augucagccg aggugcggcu gaggcggcuc cagcagcugg 240 uguuggaccc gggcuuccug gggcuggagc cccugcucga ccuucuccug ggcguccacc 300 aggagcuggg cgccuccgaa cuggcccagg acaaguacgu ggccgacuuc uugcaguggg 360 ccccaaaucc aggguuuucc aaaguguggu ucaagaacca ccugcaucug aaucuagagc 420 ggagcccauc guggugaggc uuaaggaggu ccgacugcag agggacgacu ucgagauucu 480 gaaggugauc ggacgcgggg cguucagcga gguagcggua gugaagauga agcagacggg 540 ccagguguau gccaugaaga ucaugaacaa gugggacaug cugaagaggg gcgagguguc 600 gugcuuccgu 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agcggccggg gagggagggg ccggguccgc ggccggcgaa 2340 cggggcucga aggguccuug uagccgggaa ugcugcugcu gcugcugggg ggaucacaga 2400 ccauuucuuu cuuucggcca ggcugaggcc cugacgugga ugggcaaacu gcaggccugg 2460 gaaggcagca agccgggccg uccguguucc auccuccacg cacccccacc uaucguuggu 2520 ucgcaaagug caaagcuuuc uugugcauga cgcccugcuc uggggagcgu cuggcgcgau 2580 cucugccugc uuacccggga aauuugcuuu ugccaaaccc gcuuuuucgg ggaucccgcg 2640 ccccccuccu cacuugcgcu gcucucggag ccccagccgg cuccgcccgc uucggcgguu 2700 uggauauuua uugaccucgu ccuccgacuc gcugacaggc uacaggaccc ccaacaaccc 2760 caauccacgu uuuggaugca cugagacccc gacauuccuc gguauuuauu gucugucccc 2820 accuaggacc cccacccccg acccucgcga auaaaaggcc cuccaucugc ccaaaaaaaa 2880 aaaaaaaa 2888 <210> 2 <211> 2768 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 gggacagcca gggacaggca gacaugcagc cagggcucca gggccuggac aggggcugcc 60 aggcccugug acaggaggac cccgagcccc cggcccgggg aggggccaug gugcugccug 120 uccaacaugu cagccgaggu gcggcugagg cggcuccagc agcugguguu ggacccgggc 180 uuccuggggc uggagccccu gcucgaccuu 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cgcagcacau auggacuauc 540 aauuauacuu ccacagacag aacuuaguuu cuaccuccca cuucauagag uguguguuga 600 uagauuaaca cauauaaucc ggaaaggaag aauauggaug cauaaggaaa gacaagaaaa 660 uguccagaag auuaucuuag aaggcacaga gagaauggaa gaucaggguc agaguauuau 720 uccaaugcuu acuggagaag ugauuccugu aauggaacug cuuucaucua ugaaaucaca 780 caguguuccu gaagaaauag auauagcuga uacaguacuc aaugaugaug auauugguga 840 cagcugucau gaaggcuuuc uucucaaugc caucagcuca cacuugcaaa ccuguggcug 900 uuccguugua guagguagca gugcagagaa aguaaauaag auagucagaa cauuaugccu 960 uuuucugacu ccagcagaga gaaaaugcuc cagguuaugu gaagcagaau caucauuuaa 1020 auaugaguca gggcucuuug uacaaggccu gcuaaaggau ucaacuggaa gcuuugugcu 1080 gccuuuccgg caagucaugu augcuccaua ucccaccaca cacauagaug uggaugucaa 1140 uacugugaag cagaugccac ccugucauga acauauuuau aaucagcgua gauacaugag 1200 auccgagcug acagccuucu ggagagccac uucagaagaa gacauggcuc aggauacgau 1260 caucuacacu gacgaaagcu uuacuccuga uuugaauauu uuucaagaug ucuuacacag 1320 agacacucua gugaaagccu uccuggauca ggucuuucag cugaaaccug gcuuaucucu 1380 cagaaguacu uuccuugcac aguuucuacu uguccuucac agaaaagccu ugacacuaau 1440 aaaauauaua gaagacgaua cgcagaaggg aaaaaagccc uuuaaaucuc uucggaaccu 1500 gaagauagac cuugauuuaa cagcagaggg cgaucuuaac auaauaaugg cucuggcuga 1560 gaaaauuaaa ccaggccuac acucuuuuau cuuuggaaga ccuuucuaca cuagugugca 1620 agaacgagau guucuaauga cuuuuuaaau guguaacuua auaagccuau uccaucacaa 1680 ucaugaucgc ugguaaagua gcucaguggu guggggaaac guuccccugg aucauacucc 1740 agaauucugc ucucagcaau ugcaguuaag uaaguuacac uacaguucuc acaagagccu 1800 gugaggggau gucaggugca ucauuacauu gggugucucu uuuccuagau uuaugcuuuu 1860 gggauacaga ccuauguuua caauauaaua aauauuauug cuaucuuuua aagauauaau 1920 aauaggaugu aaacuugacc acaacuacug uuuuuuugaa auacaugauu caugguuuac 1980 augugucaag gugaaaucug aguuggcuuu uacagauagu ugacuuucua ucuuuuggca 2040 uucuuuggug uguagaauua cuguaauacu ucugcaauca acugaaaacu agagccuuua 2100 aaugauuuca auuccacaga aagaaaguga gcuugaacau aggaugagcu uuagaaagaa 2160 aauugaucaa gcagauguuu aauuggaauu gauuauuaga uccuacuuug uggauuuagu 2220 cccugggauu cagucuguag aaaugucuaa uaguucucua uaguccuugu uccuggugaa 2280 ccacaguuag gguguuuugu uuauuuuauu guucuugcua uuguugauau ucuauguagu 2340 ugagcucugu aaaaggaaau uguauuuuau guuuuaguaa uuguugccaa cuuuuuaaau 2400 uaauuuucau uauuuuugag ccaaauugaa augugcaccu ccugugccuu uuuucuccuu 2460 agaaaaucua auuacuugga acaaguucag auuucacugg ucagucauuu ucaucuuguu 2520 uucuucuugc uaagucuuac cauguaccug cuuuggcaau cauugcaacu cugagauuau 2580 aaaaugccuu agagaauaua cuaacuaaua agaucuuuuu uucagaaaca gaaaauaguu 2640 ccuugaguac uuccuucuug cauuucugcc uauguuuuug aaguuguugc uguuugccug 2700 caauaggcua uaaggaauag caggagaaau uuuacugaag ugcuguuuuc cuaggugcua 2760 cuuuggcaga gcuaaguuau cuuuuguuuu cuuaaugcgu uuggaccauu uugcuggcua 2820 uaaaauaacu gauuaauaua auucuaacac aauguugaca uuguaguuac acaaacacaa 2880 auaaauauuu uauuuaaaau ucuggaagua auauaaaagg gaaaauauau uuauaagaaa 2940 gggauaaagg uaauagagcc cuucugcccc ccacccacca aauuuacaca acaaaaugac 3000 auguucgaau gugaaagguc auaauagcuu ucccaucaug aaucagaaag auguggacag 3060 cuugauguuu uagacaacca cugaacuaga ugacuguugu acuguagcuc agucauuuaa 3120 aaaauauaua aauacuaccu uguagugucc cauacugugu uuuuuacaug guagauucuu 3180 auuuaagugc uaacugguua uuuucuuugg cugguuuauu guacuguuau acagaaugua 3240 aguuguacag ugaaauaagu uauuaaagca uguguaaaca uuguuauaua ucuuuucucc 3300 uaaauggaga auuuugaaua aaauauauuu gaaauuuuaa aaaaaaaaaa aaaaaa 3356 <210> 164 <211> 4 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 164 ccug 4 <210> 165 <211> 3261 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 165 gggcggggcu gcgguugcgg ugccugcgcc cgcggcggcg gaggcgcagg cgguggcgag 60 uggauaucuc cggagcauuu ggauaaugug acaguuggaa ugcagugaug ucgacucuuu 120 gcccaccgcc aucuccagcu guugccaaga cagagauugc uuuaaguggc aaaucaccuu 180 uauuagcagc uacuuuugcu uacugggaca auauucuugg uccuagagua aggcacauuu 240 gggcuccaaa gacagaacag guacuucuca gugauggaga aauaacuuuu cuugccaacc 300 acacucuaaa uggagaaauc cuucgaaaug cagagagugg ugcuauagau guaaaguuuu 360 uugucuuguc ugaaaaggga gugauuauug uuucauuaau cuuugaugga aacuggaaug 420 gggaucgcag cacauaugga cuaucaauua uacuuccaca gacagaacuu aguuucuacc 480 ucccacuuca uagagugugu guugauagau uaacacauau aauccggaaa ggaagaauau 540 ggaugcauaa ggaaagacaa gaaaaugucc agaagauuau cuuagaaggc acagagagaa 600 uggaagauca gggucagagu auuauuccaa ugcuuacugg agaagugauu ccuguaaugg 660 aacugcuuuc aucuaugaaa ucacacagug uuccugaaga aauagauaua gcugauacag 720 uacucaauga ugaugauauu ggugacagcu gucaugaagg cuuucuucuc aaugccauca 780 gcucacacuu gcaaaccugu ggcuguuccg uuguaguagg uagcagugca gagaaaguaa 840 auaagauagu cagaacauua ugccuuuuuc ugacuccagc agagagaaaa ugcuccaggu 900 uaugugaagc agaaucauca uuuaaauaug agucagggcu cuuuguacaa ggccugcuaa 960 aggauucaac uggaagcuuu gugcugccuu uccggcaagu cauguaugcu ccauauccca 1020 ccacacacau agauguggau gucaauacug ugaagcagau gccacccugu caugaacaua 1080 uuuauaauca gcguagauac augagauccg agcugacagc cuucuggaga gccacuucag 1140 aagaagacau ggcucaggau acgaucaucu acacugacga aagcuuuacu ccugauuuga 1200 auauuuuuca agaugucuua cacagagaca cucuagugaa agccuuccug gaucaggucu 1260 uucagcugaa accuggcuua ucucucagaa guacuuuccu ugcacaguuu cuacuugucc 1320 uucacagaaa agccuugaca cuaauaaaau auauagaaga cgauacgcag aagggaaaaa 1380 agcccuuuaa aucucuucgg aaccugaaga uagaccuuga uuuaacagca gagggcgauc 1440 uuaacauaau aauggcucug gcugagaaaa uuaaaccagg ccuacacucu uuuaucuuug 1500 gaagaccuuu cuacacuagu gugcaagaac gagauguucu aaugacuuuu uaaaugugua 1560 acuuaauaag ccuauuccau cacaaucaug aucgcuggua aaguagcuca gugguguggg 1620 gaaacguucc ccuggaucau acuccagaau ucugcucuca gcaauugcag uuaaguaagu 1680 uacacuacag uucucacaag agccugugag gggaugucag gugcaucauu acauugggug 1740 ucucuuuucc uagauuuaug cuuuugggau acagaccuau guuuacaaua uaauaaauau 1800 uauugcuauc uuuuaaagau auaauaauag gauguaaacu ugaccacaac uacuguuuuu 1860 uugaaauaca ugauucaugg uuuacaugug ucaaggugaa aucugaguug gcuuuuacag 1920 auaguugacu uucuaucuuu uggcauucuu ugguguguag aauuacugua auacuucugc 1980 aaucaacuga aaacuagagc cuuuaaauga uuucaauucc acagaaagaa agugagcuug 2040 aacauaggau gagcuuuaga aagaaaauug aucaagcaga uguuuaauug gaauugauua 2100 uuagauccua cuuuguggau uuagucccug ggauucaguc uguagaaaug ucuaauaguu 2160 cucuauaguc cuuguuccug gugaaccaca guuagggugu uuuguuuauu uuauuguucu 2220 ugcuauuguu gauauucuau guaguugagc ucuguaaaag gaaauuguau uuuauguuuu 2280 aguaauuguu gccaacuuuu uaaauuaauu uucauuauuu uugagccaaa uugaaaugug 2340 caccuccugu gccuuuuuuc uccuuagaaa aucuaauuac uuggaacaag uucagauuuc 2400 acuggucagu cauuuucauc uuguuuucuu cuugcuaagu cuuaccaugu accugcuuug 2460 gcaaucauug caacucugag auuauaaaau gccuuagaga auauacuaac uaauaagauc 2520 uuuuuuucag aaacagaaaa uaguuccuug aguacuuccu ucuugcauuu cugccuaugu 2580 uuuugaaguu guugcuguuu gccugcaaua ggcuauaagg aauagcagga gaaauuuuac 2640 ugaagugcug uuuuccuagg ugcuacuuug gcagagcuaa guuaucuuuu guuuucuuaa 2700 ugcguuugga ccauuuugcu ggcuauaaaa uaacugauua auauaauucu aacacaaugu 2760 ugacauugua guuacacaaa cacaaauaaa uauuuuauuu aaaauucugg aaguaauaua 2820 aaagggaaaa uauauuuaua agaaagggau aaagguaaua gagcccuucu gccccccacc 2880 caccaaauuu acacaacaaa augacauguu cgaaugugaa aggucauaau agcuuuccca 2940 ucaugaauca gaaagaugug gacagcuuga uguuuuagac aaccacugaa cuagaugacu 3000 guuguacugu agcucaguca uuuaaaaaau auauaaauac uaccuuguag ugucccauac 3060 uguguuuuuu acaugguaga uucuuauuua agugcuaacu gguuauuuuc uuuggcuggu 3120 uuauuguacu guuauacaga auguaaguug uacagugaaa uaaguuauua aagcaugugu 3180 aaacauuguu auauaucuuu ucuccuaaau ggagaauuuu gaauaaaaua uauuugaaau 3240 uuuaaaaaaa aaaaaaaaaa a 3261 <210> 166 <211> 1957 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 166 acguaaccua cggugucccg cuaggaaaga gaggugcguc aaacagcgac aaguuccgcc 60 cacguaaaag augacgcuug auaucuccgg agcauuugga uaaugugaca guuggaaugc 120 agugaugucg acucuuugcc caccgccauc uccagcuguu gccaagacag agauugcuuu 180 aaguggcaaa ucaccuuuau uagcagcuac uuuugcuuac ugggacaaua uucuuggucc 240 uagaguaagg cacauuuggg cuccaaagac agaacaggua cuucucagug auggagaaau 300 aacuuuucuu gccaaccaca cucuaaaugg agaaauccuu cgaaaugcag agaguggugc 360 uauagaugua aaguuuuuug ucuugucuga aaagggagug auuauuguuu cauuaaucuu 420 ugauggaaac uggaaugggg aucgcagcac auauggacua ucaauuauac uuccacagac 480 agaacuuagu uucuaccucc cacuucauag aguguguguu gauagauuaa cacauauaau 540 ccggaaagga agaauaugga ugcauaagga aagacaagaa aauguccaga agauuaucuu 600 agaaggcaca gagagaaugg aagaucaggg ucagaguauu auuccaaugc uuacuggaga 660 agugauuccu guaauggaac ugcuuucauc uaugaaauca cacaguguuc cugaagaaau 720 agauauagcu gauacaguac ucaaugauga ugauauuggu gacagcuguc augaaggcuu 780 ucuucucaag uaagaauuuu ucuuuucaua aaagcuggau gaagcagaua ccaucuuaug 840 cucaccuaug acaagauuug gaagaaagaa aauaacagac ugucuacuua gauuguucua 900 gggacauuac guauuugaac uguugcuuaa auuuguguua uuuuucacuc auuauauuuc 960 uauauauauu ugguguuauu ccauuugcua uuuaaagaaa ccgaguuucc aucccagaca 1020 agaaaucaug gccccuugcu ugauucuggu uucuuguuuu acuucucauu aaagcuaaca 1080 gaauccuuuc auauuaaguu guacuguaga ugaacuuaag uuauuuaggc guagaacaaa 1140 auuauucaua uuuauacuga ucuuuuucca uccagcagug gaguuuagua cuuaagaguu 1200 ugugcccuua aaccagacuc ccuggauuaa ugcuguguac ccgugggcaa ggugccugaa 1260 uucucuauac accuauuucc ucaucuguaa aauggcaaua auaguaauag uaccuaaugu 1320 guaggguugu uauaagcauu gaguaagaua aauaauauaa agcacuuaga acagugccug 1380 gaacauaaaa acacuuaaua auagcucaua gcuaacauuu ccuauuuaca uuucuucuag 1440 aaauagccag uauuuguuga gugccuacau guuaguuccu uuacuaguug cuuuacaugu 1500 auuaucuuau auucuguuuu aaaguuucuu cacaguuaca gauuuucaug aaauuuuacu 1560 uuuaauaaaa gagaaguaaa aguauaaagu auucacuuuu auguucacag ucuuuuccuu 1620 uaggcucaug auggaguauc agaggcauga guguguuuaa ccuaagagcc uuaauggcuu 1680 gaaucagaag cacuuuaguc cuguaucugu ucagugucag ccuuucauac aucauuuuaa 1740 aucccauuug acuuuaagua agucacuuaa ucucucuaca ugucaauuuc uucagcuaua 1800 aaaugauggu auuucaauaa auaaauacau uaauuaaaug auauuauacu gacuaauugg 1860 gcuguuuuaa ggcucaauaa gaaaauuucu gugaaagguc ucuagaaaau guagguuccu 1920 auacaaauaa aagauaacau ugugcuuaua aaaaaaa 1957

Claims (130)

  1. 길이가 적어도 17개의 뉴클레오타이드인 간섭 리보핵산(RNA)을 각각 코딩하는 하나 이상의 전이유전자(transgene)를 포함하는 바이러스 벡터로서, 각각의 간섭 RNA가 확장된 반복부 영역을 포함하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링하는 부분을 포함하고, 각각의 간섭 RNA의 부분이 확장된 반복부 영역과 중첩되지 않는 내생성 RNA 전사체의 분절에 어닐링하는 것인 바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 내생성 RNA 전사체는 인간 근긴장성 이영양증 단백질 키나제(DMPK)를 코딩하는 것인 바이러스 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 확장된 반복부 영역은 50개 이상의 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  4. 제2항에 있어서, 확장된 반복부 영역은 약 50개 내지 약 4,000개의 CUG 트리뉴클레오타이드 반복부를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 간섭 RNA에 어닐링하지 않는 인간 DMPK RNA 전사체를 코딩하는 전이유전자를 추가로 포함하는 바이러스 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 인간 DMPK RNA 전사체는 간섭 RNA에 85% 미만으로 상보적인 것인 바이러스 벡터.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 내생성 RNA 전사체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열에 대한 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 부분을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 내생성 RNA 전사체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열에 대한 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 부분을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 내생성 RNA 전사체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열에 대한 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 부분을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 내생성 RNA 전사체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는 부분을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 엑손 1 내지 15 중 어느 한 엑손 내에서 내생성 RNA 전사체의 분절에 어닐링하는 것인 바이러스 벡터.
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 엑손 1 내지 15 중 어느 한 엑손 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 85% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 바이러스 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 엑손 1 내지 15 중 어느 한 엑손 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 90% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 바이러스 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 엑손 1 내지 15 중 어느 한 엑손 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 95% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 바이러스 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 엑손 1 내지 15 중 어느 한 엑손 내의 분절의 핵산 서열에 완전히 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 바이러스 벡터.
  16. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 인트론 1 내지 14 중 어느 한 인트론 내에서 내생성 RNA 전사체의 분절에 어닐링하는 것인 바이러스 벡터.
  17. 제2항 내지 제10항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 인트론 1 내지 14 중 어느 한 인트론 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 85% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 바이러스 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 인트론 1 내지 14 중 어느 한 인트론 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 90% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 바이러스 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 인트론 1 내지 14 중 어느 한 인트론 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 95% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 바이러스 벡터.
  20. 제19항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 인트론 1 내지 14 중 어느 한 인트론 내의 분절의 핵산 서열에 완전히 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 바이러스 벡터.
  21. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK 내의 엑손-인트론 경계를 포함하는 내생성 RNA 전사체의 분절에 어닐링하는 것인 바이러스 벡터.
  22. 제2항 내지 제10항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK 내의 엑손-인트론 경계를 포함하는 분절의 핵산 서열에 적어도 85% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 바이러스 벡터.
  23. 제22항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK 내의 엑손-인트론 경계를 포함하는 분절의 핵산 서열에 적어도 90% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 바이러스 벡터.
  24. 제23항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK 내의 엑손-인트론 경계를 포함하는 분절의 핵산 서열에 적어도 95% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 바이러스 벡터.
  25. 제24항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK 내의 엑손-인트론 경계를 포함하는 분절의 핵산 서열에 완전히 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 바이러스 벡터.
  26. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 5' 비번역 영역(UTR) 또는 3' UTR 내에서 내생성 RNA 전사체의 분절에 어닐링하는 것인 바이러스 벡터.
  27. 제2항 내지 제10항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 5' UTR 또는 3' UTR 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 85% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 바이러스 벡터.
  28. 제27항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 5' UTR 또는 3' UTR 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 90% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 바이러스 벡터.
  29. 제28항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 5' UTR 또는 3' UTR 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 95% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 바이러스 벡터.
  30. 제29항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 5' UTR 또는 3' UTR 내의 분절의 핵산 서열에 완전히 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 바이러스 벡터.
  31. 제12항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 분절은 길이가 약 10개 내지 약 80개의 뉴클레오타이드인 바이러스 벡터.
  32. 제31항에 있어서, 분절은 길이가 약 15개 내지 약 50개의 뉴클레오타이드인 바이러스 벡터.
  33. 제32항에 있어서, 분절은 길이가 약 17개 내지 약 23개의 뉴클레오타이드인 바이러스 벡터.
  34. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 서열번호 3 내지 39 중 어느 한 서열번호의 핵산 서열을 갖는 내생성 RNA 전사체의 분절에 어닐링하는 것인 바이러스 벡터.
  35. 제2항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 간섭 RNA는 1개 내지 8개의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링하는 것인 바이러스 벡터.
  36. 제35항에 있어서, 간섭 RNA는 1개 내지 5개의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링하는 것인 바이러스 벡터.
  37. 제36항에 있어서, 간섭 RNA는 1개 내지 3개의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링하는 것인 바이러스 벡터.
  38. 제2항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 간섭 RNA는 2개 이하의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링하는 것인 바이러스 벡터.
  39. 제2항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 간섭 RNA는 서열번호 3 내지 161 중 어느 한 서열번호의 핵산 서열에 대한 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 부분을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  40. 제39항에 있어서, 간섭 RNA는 서열번호 3 내지 161 중 어느 한 서열번호의 핵산 서열에 대한 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 부분을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  41. 제40항에 있어서, 간섭 RNA는 서열번호 3 내지 161 중 어느 한 서열번호의 핵산 서열에 대한 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 부분을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  42. 제41항에 있어서, 간섭 RNA는 서열번호 3 내지 161 중 어느 한 서열번호의 핵산 서열을 갖는 부분을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  43. 제1항에 있어서, 내생성 RNA 전사체는 인간 9번 염색체 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 72(C9ORF72) 및 확장된 반복부 영역을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  44. 제43항에 있어서, 확장된 반복부 영역은 약 25개 내지 약 1,600개의 GGGGCC 헥사뉴클레오타이드 반복부를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  45. 제43항에 있어서, 확장된 반복부 영역은 30개 초과의 GGGGCC 헥사뉴클레오타이드 반복부를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 내생성 RNA 전사체는 서열번호 163, 165 또는 166의 핵산 서열에 대한 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 부분을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  47. 제46항에 있어서, 내생성 RNA 전사체는 서열번호 163, 165 또는 166의 핵산 서열에 대한 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 부분을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  48. 제47항에 있어서, 내생성 RNA 전사체는 서열번호 163, 165 또는 166의 핵산 서열에 대한 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 부분을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  49. 제48항에 있어서, 내생성 RNA 전사체는 서열번호 163, 165 또는 166의 핵산 서열을 갖는 부분을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  50. 제43항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 C9ORF72 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 85% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 바이러스 벡터.
  51. 제50항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 C9ORF72 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 90% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 바이러스 벡터.
  52. 제51항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 C9ORF72 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 95% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 바이러스 벡터.
  53. 제52항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 C9ORF72 내의 분절의 핵산 서열에 완전히 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 바이러스 벡터.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 분절은 길이가 약 10개 내지 약 80개의 뉴클레오타이드인 바이러스 벡터.
  55. 제54항에 있어서, 분절은 길이가 약 15개 내지 약 50개의 뉴클레오타이드인 바이러스 벡터.
  56. 제55항에 있어서, 분절은 길이가 약 17개 내지 약 23개의 뉴클레오타이드인 바이러스 벡터.
  57. 제43항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 간섭 RNA는 1개 내지 8개의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 C9ORF72를 포함하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링하는 것인 바이러스 벡터.
  58. 제57항에 있어서, 간섭 RNA는 1개 내지 5개의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 C9ORF72를 포함하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링하는 것인 바이러스 벡터.
  59. 제58항에 있어서, 간섭 RNA는 1개 내지 3개의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 C9ORF72를 포함하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링하는 것인 바이러스 벡터.
  60. 제43항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 간섭 RNA는 2개 이하의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 C9ORF72를 포함하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링하는 것인 바이러스 벡터.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 간섭 RNA는 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 마이크로 RNA(miRNA)인 바이러스 벡터.
  62. 제61항에 있어서, 간섭 RNA는 miRNA이고, 임의적으로 miRNA는 U6 miRNA인 바이러스 벡터.
  63. 제62항에 있어서, 성숙 miRNA를 코딩하는 일차 miRNA(pri-miRNA) 전사체를 포함하는 바이러스 벡터.
  64. 제62항에 있어서, 성숙 miRNA를 코딩하는 pre-miRNA 전사체를 포함하는 바이러스 벡터.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 간섭 RNA는 근육 세포 또는 신경 내에서 간섭 RNA의 발현을 유도하는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 것인 바이러스 벡터.
  66. 제65항에 있어서, 프로모터는 데스민(desmin) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터, 근육 크레아틴 키나제 프로모터, 미오신 경쇄 프로모터, 미오신 중쇄 프로모터, 심장 트로포닌(troponin) C 프로모터, 트로포닌 I 프로모터, myoD 유전자 패밀리 프로모터, 액틴 알파 프로모터, 액틴 베타 프로모터, 액틴 감마 프로모터, 또는 눈 페어링 유사 호메오도메인(ocular paired like homeodomain) 3(PITX3)의 인트론 1 내의 프로모터인 바이러스 벡터.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노 관련 바이러스(AAV), 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 백시니아 바이러스 및 합성 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 바이러스 벡터.
  68. 제67항에 있어서, AAV인 바이러스 벡터.
  69. 제68항에 있어서, AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10 또는 AAVrh74 혈청형인 바이러스 벡터.
  70. 제68항에 있어서, 슈도타이핑된(pseudotyped) AAV인 바이러스 벡터.
  71. 제70항에 있어서, 슈도타이핑된 AAV는 AAV2/8인 바이러스 벡터.
  72. 제70항에 있어서, 슈도타이핑된 AAV는 AAV2/9인 바이러스 벡터.
  73. 제72항에 있어서, AAV는 재조합 캡시드 단백질을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  74. 제67항에 있어서, 합성 바이러스는 키메라 바이러스, 모자이크 바이러스 또는 슈도타이핑된 바이러스이고/이거나, 외래 단백질, 합성 중합체, 나노입자 또는 소분자를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  75. 서열번호 3 내지 161 중 어느 한 서열번호의 핵산 서열에 대한 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 부분을 포함하는 간섭 RNA를 코딩하거나 포함하는 핵산.
  76. 제75항에 있어서, 간섭 RNA는 서열번호 3 내지 161 중 어느 한 서열번호의 핵산 서열에 대한 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 부분을 포함하는 것인 핵산.
  77. 제76항에 있어서, 간섭 RNA는 서열번호 3 내지 161 중 어느 한 서열번호의 핵산 서열에 대한 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 부분을 포함하는 것인 핵산.
  78. 제77항에 있어서, 간섭 RNA는 서열번호 3 내지 161 중 어느 한 서열번호의 핵산 서열을 갖는 부분을 포함하는 것인 핵산.
  79. 제75항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 엑손 1 내지 15 중 어느 한 엑손 내에서 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체의 분절에 어닐링하는 것인 핵산.
  80. 제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 엑손 1 내지 15 중 어느 한 엑손 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 85% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 핵산.
  81. 제80항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 엑손 1 내지 15 중 어느 한 엑손 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 90% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 핵산.
  82. 제81항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 엑손 1 내지 15 중 어느 한 엑손 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 95% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 핵산.
  83. 제82항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 엑손 1 내지 15 중 어느 한 엑손 내의 분절의 핵산 서열에 완전히 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 핵산.
  84. 제75항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 인트론 1 내지 14 중 어느 한 인트론 내에서 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체의 분절에 어닐링하는 것인 핵산.
  85. 제75항 내지 제78항 및 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 인트론 1 내지 14 중 어느 한 인트론 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 85% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 핵산.
  86. 제85항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 인트론 1 내지 14 중 어느 한 인트론 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 90% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 핵산.
  87. 제86항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 인트론 1 내지 14 중 어느 한 인트론 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 95% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 핵산.
  88. 제87항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 인트론 1 내지 14 중 어느 한 인트론 내의 분절의 핵산 서열에 완전히 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 핵산.
  89. 제75항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK 내의 엑손-인트론 경계를 포함하는 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체의 분절에 어닐링하는 것인 핵산.
  90. 제75항 내지 제78항 및 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK 내의 엑손-인트론 경계를 포함하는 분절의 핵산 서열에 적어도 85% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 핵산.
  91. 제90항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK 내의 엑손-인트론 경계를 포함하는 분절의 핵산 서열에 적어도 90% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 핵산.
  92. 제91항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK 내의 엑손-인트론 경계를 포함하는 분절의 핵산 서열에 적어도 95% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 핵산.
  93. 제92항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK 내의 엑손-인트론 경계를 포함하는 분절의 핵산 서열에 완전히 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 핵산.
  94. 제75항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 5' UTR 또는 3' UTR 내에서 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체의 분절에 어닐링하는 것인 핵산.
  95. 제75항 내지 제78항 및 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 5' UTR 또는 3' UTR 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 85% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 핵산.
  96. 제95항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 5' UTR 또는 3' UTR 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 90% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 핵산.
  97. 제96항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 5' UTR 또는 3' UTR 내의 분절의 핵산 서열에 적어도 95% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 핵산.
  98. 제97항에 있어서, 각각의 간섭 RNA의 부분은 인간 DMPK의 5' UTR 또는 3' UTR 내의 분절의 핵산 서열에 완전히 상보적인 핵산 서열을 갖는 것인 핵산.
  99. 제80항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 분절은 길이가 약 10개 내지 약 80개의 뉴클레오타이드인 핵산.
  100. 제99항에 있어서, 분절은 길이가 약 15개 내지 약 50개의 뉴클레오타이드인 핵산.
  101. 제100항에 있어서, 분절은 길이가 약 17개 내지 약 23개의 뉴클레오타이드인 핵산.
  102. 제75항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 간섭 RNA는 1개 내지 8개의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링하는 것인 핵산.
  103. 제102항에 있어서, 간섭 RNA는 1개 내지 5개의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링하는 것인 핵산.
  104. 제103항에 있어서, 간섭 RNA는 1개 내지 3개의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링하는 것인 핵산.
  105. 제75항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 간섭 RNA는 2개 이하의 뉴클레오타이드 불일치를 가지면서, 인간 DMPK를 코딩하는 내생성 RNA 전사체에 어닐링하는 것인 핵산.
  106. 제75항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 간섭 RNA는 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 마이크로 RNA(miRNA)인 핵산.
  107. 제106항에 있어서, 간섭 RNA는 miRNA이고, 임의적으로 miRNA는 U6 miRNA인 핵산.
  108. 제107항에 있어서, 성숙 miRNA를 코딩하는 일차 miRNA(pri-miRNA) 전사체를 포함하는 핵산.
  109. 제107항에 있어서, 성숙 miRNA를 코딩하는 pre-miRNA 전사체를 포함하는 핵산.
  110. 제75항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 간섭 RNA는 근육 세포 또는 신경에서 간섭 RNA의 발현을 유도하는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 것인 핵산.
  111. 제110항에 있어서, 프로모터는 데스민 프로모터, PGK 프로모터, 근육 크레아틴 키나제 프로모터, 미오신 경쇄 프로모터, 미오신 중쇄 프로모터, 심장 트로포닌 C 프로모터, 트로포닌 I 프로모터, myoD 유전자 패밀리 프로모터, 액틴 알파 프로모터, 액틴 베타 프로모터, 액틴 감마 프로모터, 또는 눈 PITX3의 인트론 1 내에 존재하는 근육 특이적 프로모터인 핵산.
  112. 제75항 내지 제111항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  113. 제112항에 있어서, 간섭 RNA에 어닐링하지 않는 인간 DMPK RNA 전사체를 코딩하는 전이유전자를 추가로 포함하는 벡터.
  114. 제113항에 있어서, 인간 DMPK RNA 전사체는 간섭 RNA에 85% 미만으로 상보적인 것인 벡터.
  115. 제75항 내지 제111항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 조성물로서, 리포좀, 소포, 합성 소포, 엑소좀, 합성 엑소좀, 덴드리머 또는 나노입자인 조성물.
  116. 제1항 내지 제74항 및 제112항 내지 제114항 중 어느 한 항의 벡터 또는 제115항의 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  117. 스플라이싱이상(spliceopathy)의 발생의 감소를 필요로 하는 인간 환자에서 스플라이싱이상의 발생을 감소시키는 방법으로서, 제1항 내지 제74항 및 제112항 내지 제114항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제115항 또는 제116항의 조성물을 치료 유효량으로 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  118. 제117항에 있어서, 환자는 근긴장성 이영양증을 갖는 것인 방법.
  119. 제117항 또는 제118항에 있어서, 벡터 또는 조성물을 환자에게 투여할 때, 상기 환자는 근육맹인 유사 단백질의 RNA 전사체 기질의 정확한 스플라이싱의 증가를 나타내는 것인 방법.
  120. 제117항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 또는 조성물을 환자에게 투여할 때, 상기 환자는 엑손 22를 포함하는 근세포질/소포체 칼슘 ATPase 1(SERCA1) mRNA의 발현의 증가를 나타내는 것인 방법.
  121. 제117항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 또는 조성물을 환자에게 투여할 때, 상기 환자는 엑손 7a를 포함하는 클로라이드 전압 개폐성 채널 1(CLCN1) mRNA의 발현의 감소를 나타내는 것인 방법.
  122. 제117항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 또는 조성물을 환자에게 투여할 때, 상기 환자는 엑손 11을 포함하는 ZO-2 관련 스펙클(speckle) 단백질(ZASP)의 발현의 감소를 나타내는 것인 방법.
  123. 제119항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 또는 조성물을 환자에게 투여할 때, SERCA1, CLCN1 및/또는 ZASP mRNA의 발현은 약 1.1배 내지 약 10배까지 증가하는 것인 방법.
  124. 제117항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 또는 조성물을 환자에게 투여할 때, 상기 환자는 인슐린 수용체, 리아노딘(ryanodine) 수용체 1, 심근 트로포닌, 및/또는 골격근 트로포닌을 코딩하는 RNA 전사체의 정확한 스플라이싱의 증가를 나타내는 것인 방법.
  125. 확장된 반복부 영역을 포함하는 RNA의 핵 보유를 특징으로 하는 질환의 치료를 필요로 하는 인간 환자에서 이러한 질환을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제74항 및 제112항 내지 제114항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제115항 또는 제116항의 조성물을 치료 유효량으로 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  126. 제125항에 있어서, 질환은 근긴장성 이영양증 또는 근위축성 측삭 경화증인 방법.
  127. 제117항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 또는 조성물을 정맥내, 수막공간내, 뇌실내, 뇌실질내, 수조내, 피내, 경피, 비경구, 근육내, 비내, 피하, 침피, 기관내, 복강내, 동맥내, 혈관내, 흡입, 관류, 세척 또는 경구 투여로 환자에게 투여하는 것인 방법.
  128. 제1항 내지 제74항 및 제112항 내지 제114항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제115항 또는 제116항의 조성물을 포함하는 키트로서, 인간 환자에서 스플라이싱이상의 발생을 감소시키기 위해 상기 벡터 또는 조성물을 상기 환자에게 투여하도록 키트의 사용자에게 지시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함하는 키트.
  129. 제1항 내지 제74항 및 제112항 내지 제114항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제115항 또는 제116항의 조성물을 포함하는 키트로서, 확장된 반복부 영역을 포함하는 RNA의 핵 보유를 특징으로 하는 질환을 치료하기 위해 상기 벡터 또는 조성물을 인간 환자에게 투여하도록 키트의 사용자에게 지시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함하는 키트.
  130. 제129항에 있어서, 질환은 근긴장성 이영양증 또는 근위축성 측삭 경화증인 키트.
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