TW202402801A - 結合egfr和b7-h3的雙特異性抗體 - Google Patents
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Abstract
本發明提供了一種新型的經人工設計的雙特異性抗體分子,特別是抗B7-H3/EGFR雙特異性抗體分子,其能同時結合B7-H3和EGFR。
Description
本發明總體上涉及免疫學和抗體工程領域。具體而言,本發明涉及新型的經人工設計的雙特異性抗體分子,特別是同時結合EGFR和B7-H3的雙特異性抗體、編碼該抗體分子或其各條鏈的多核苷酸、包含該多核苷酸的載體、包含該多核苷酸或載體的宿主細胞、包含該抗體分子的免疫綴合物和醫藥組成物、以及該抗體分子在疾病的免疫治療、預防和/或診斷上的用途。
在全球範圍內,肺癌是最常見的癌症腫瘤類型之一,在肺癌中約有80%-85%是非小細胞肺癌(NSCLC)患者,NSCLC可分為肺腺癌、肺鱗狀細胞癌和大細胞肺癌等常見類型。表皮生長因子受體(EGFR)是一種酪胺酸激酶受體,是一個巨大的跨膜糖蛋白,分子量約為170KDa,屬於ErbB受體家族的一個成員,是NSCLC最常見的癌變驅動基因,在亞洲NSCLC患者中約有40%是EGFR突變導致的,在高加索人群中約有15%是EGFR突變導致的(Gower A, Wang Y, Giaccone G. Oncogenic drivers, targeted therapies, and acquired resistance in non-small-cell lung cancer. J. Mol. Med. 2014;92: 697-707.),在其他癌症腫瘤患者,
如腎癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、結腸癌和頭頸癌等上皮源癌症,都存在著EGFR過度表達和/或異常突變激活現象。
針對NSCLC-EGFR異常激活和擴增,現已有EGFR-TKI小分子抑制劑(如吉非替尼、厄洛替尼(Erlotinib),阿法替尼、達克替尼和奧希替尼(Osimertinib)、阿美替尼等)和生物單抗大分子(西妥昔單抗、帕尼單抗、耐昔妥珠單抗和尼妥珠單抗)靶向治療方法。雖EGFR-TKI小分子抑制劑仍是現在非小細胞肺癌(NSCLC)治療的標準方法,但EGFR-TKI小分子主要針對酪胺酸激酶活性結構突變患者,常因靶點基因突變而造成耐藥失效,因此需要不斷針對新突變位點進行新的靶向藥物的研發,極大限制了該類藥物的臨床運用,這也是EGFR-TKI小分子整個行業所面臨的嚴峻挑戰。
EGFR激活突變區主要發生在EGFR外顯子18-21酪胺酸激酶結構域(Jiyeon Yun, Soo-Hwan Lee, Seok-Young Kim, et al. Antitumor activity of Amivantamab (JNJ-61186372), an EGFR-MET bispecific antibody, in diverse models of EGFR exon 20 insertion-driven NSCLC. Cancer Discov 2020;10: 1194-209.),EGFR抗體的結合區主要位於EGFR胞外配體結構域區,可避免耐藥突變的發生;同時,EGFR抗體可藉由抑制EGFR與配體的結合而抑制腫瘤細胞的生長,也可利用自身特定ADCC(抗體依賴細胞介導的細胞毒性作用)與免疫細胞共同殺傷腫瘤,這樣可藉由多種作用機制,共同發揮抗腫瘤殺傷作用。
B7-H3(又稱之為CD276)是一種I型跨膜蛋白(Picarda E, Ohaegbulam KC, Zang X. Molecular pathways: targeting B7-H3 (CD276) for human cancer immunotherapy. Clin Cancer Res. 2016;22: 3425-31. and,Yang S, Wei W, Zhao Q. B7-H3, a checkpoint molecule, as a target for cancer immunotherapy. Int J
Biol Sci. 202016: 1767-73),和PD-L1結構非常類似,同屬於B7/CD28超家族。在絕大多數正常人體組織低水平表達,在肺癌、結腸癌、頭頸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等腫瘤細胞中卻異常高表達(Lee YH, Martin-Orozco N, Zheng P, Li J, Zhang P, Tan H, et al. Inhibition of the B7-H3 immune checkpoint limits tumor growth by enhancing cytotoxic lymphocyte function. Cell Res. 2017;27: 1034-45. and,Kontos F, Michelakos T, Kurokawa T, Sadagopan A, Schwab JH, Ferrone CR, et al. B7-H3: an attractive target for antibody-based immunotherapy. Clin Cancer Res. 2020. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-20-2584. and,Seaman S, Zhu Z, Saha S, Zhang XM, Yang MY, Hilton MB, et al. Eradication of tumors through simultaneous ablation of CD276/B7-H3-positive tumor cells and tumor vasculature. Cancer Cell. 2017;31: 501-15)。B7-H3受體仍未被確認,但在腫瘤免疫中,B7-H3可參與毒性淋巴細胞的免疫功能調節(Kraan J, van den Broek P, Verhoef C, Grunhagen DJ, Taal W, Gratama JW, et al. Endothelial CD276 (B7-H3) expression is increased in human malignancies and distinguishes between normal and tumour-derived circulating endothelial cells. Br J Cancer. 2014;111: 149-56);有證據顯示,B7-H3表達可能與EGFR基因表達狀況及抗PD-1治療效果相關(Yonesaka K, Haratani K, Takamura S, Sakai H, Kato R, Takegawa N, et al. B7-H3 negatively modulates CTL-mediated cancer immunity. Clin Cancer Res. 2018;24: 2653-64)。由於B7-H3有著良好的選擇表達譜,現已有生物研發公司研發出B7-H3單株單體或B7-H3-ADC藥物,用於相關腫瘤疾病領域的研究和治療。
抗體分子能夠與其相應的抗原發生靶向性的特異性結合,正日益成為針對各種疾病(例如,癌症、自身免疫病、炎性疾病、感染性疾病等)的重要
的治療劑、預防劑和/或診斷劑。但是,僅針對一種靶點的單特異性抗體在臨床應用上存在一些侷限性。患者在接受單特異性抗體治療後可能產生耐藥性或無應答。隨著對癌症和其他多種疾病的研究,認識到了往往有多種信號轉導通路參與疾病的發生和發展,單一靶點的免疫療法在許多疾病中通常並不足以發揮對疾病的治療作用。
由於多特異性抗體(例如,雙特異性抗體)能夠特異性結合不同抗原,能夠設計為同時作用於兩種或多種不同介質的信號轉導通路。這些優勢特性為多特異性抗體(例如,雙特異性抗體)開闢了廣闊的應用前景。
本領域仍然需要可供選擇的具有改善性能的雙特異性抗體,該雙特異性抗體能夠同時結合不同的抗原,特別是EGFR和B7-H3,保持各抗原結合位點與相應的不同表位結合的結合活性,以及其他性質。同時,需要獲得具有一定穩定性的,且具有更好的生產性和可發展性的雙特異性抗體樣式是物理穩定的和生物學穩定的,這允許該抗體具有更好的生產性和可發展性。
本發明的第一方面涉及一種抗體,其包含特異性識別EGFR(例如人EGFR)的抗原結合區和特異性結合B7-H3的抗原結合區。在一些實施方案中,該抗體為多特異性抗體,例如雙特異性抗體。
本發明提供的結合EGFR和B7-H3的抗體或其抗原結合片段,藉由降低EGFR親和力,提高B7-H3親和力,提高了抗體分子的藥效和安全選擇性;同時,採用GlymaxX低岩藻糖技術,增強了抗體依賴的細胞介導的細胞毒
性作用(ADCC)。相比用於NSCLC-EGFR 20外顯子插入突變(exon20ins)的埃萬妥希單抗(Amivantamab,JNJ-372),B7-H3比cMET表達譜更廣泛,腫瘤治療適用範圍更廣;同時,在B7-H3親本的引入下,不僅提高了雙特異性抗體中EGFR抗體阻斷活性,而且提高了雙特異性抗體整體的ADCC作用。
本發明提供的結合EGFR和B7-H3的雙特異性抗體或其抗原結合片段具有以下一個或多個特性:
(a)以高親和力與一種或兩種抗原特異性結合;
(b)易於在體外的培養細胞中表達,且抗體分子的各條鏈之間能夠正確偶合或配對;
(c)具有良好的物理穩定性,特別地,具有良好的長期熱穩定性;且能長時間保持生物學活性;
(d)在與一種或兩種抗原特異性結合後,藉由調節(例如,抑制或者激活)各抗原所參與的信號傳導通路來發揮生物學功能;
(e)發揮效應子功能;
(f)具有更好的抗腫瘤活性。
在一個實施方案中,不同抗原結合位點結合相同的抗原上的相同表位,或不同表位。
在一個實施方案中,第一抗原結合區或第二抗原結合區來自人的,或人源化的,或嵌合的抗體。
在一些實施方案中,本發明的抗體,例如雙特異性抗體還包含重鏈恆定區。在一個實施方案中,該重鏈恆定結構域來自IgG1。應當理解的是,
可以對恆定結構域中的Fc進行突變,以實現穩定抗體的作用,或增強效應子功能的作用。
在一個實施方案中,第一抗原結合區對第一抗原是特異性的,在一個實施方案中,第一抗原是EGFR。
在一個實施方案中,第二抗原結合區對第二抗原是特異性的,在一個實施方案中,第二抗原是B7-H3。
本發明的抗體還可以包含結合其他抗原的其他抗原結合區以構成多特異性抗體。不特別地限制本發明的抗體分子特異性結合的其他抗原類型,抗原可以是例如細胞因子、生長因子、激素、信號傳導蛋白、炎性介質、配體、細胞表面受體或其片段。在一個實施方案中,本發明的抗體分子特異性結合的其他抗原選自腫瘤相關抗原、免疫檢查點分子、血管新生誘導因子、腫瘤壞死因子受體超家族成員和免疫系統中的共刺激分子,以及這些分子的配體和/或受體。
在一個方面,本發明提供了編碼本發明抗體分子中的任意一條或者多條多肽鏈的核酸,包含該核酸的載體,包含該核酸或載體的宿主細胞。
在一個方面,本發明提供了包含編碼本發明抗體分子中的任意一條或者多條多肽鏈的多核苷酸的載體,較佳地表達載體,例如pcDNA3.1。
在一個方面,本發明提供了用於產生本發明抗體分子或其片段的方法。
在一些實施方案中,本發明提供了包含本發明抗體的免疫綴合物、醫藥組成物、試劑盒、組合產品或製品。
在一些實施方案中,本發明的抗體、醫藥組成物或免疫綴合物或組合產品或試劑盒用於預防或治療疾病,如急性和慢性炎性疾病、感染(例如,
慢性感染)、腫瘤等。例如,該疾病是腫瘤(例如癌症)或感染。在一些實施方案中,腫瘤是腫瘤免疫逃逸。較佳地,腫瘤是胃腸道腫瘤或肺部腫瘤或皮膚腫瘤。在一些實施方案中,感染是慢性感染。
在另一方面中,本發明涉及預防或治療受試者或個體疾病的方法,該方法包括向該受試者施用有效量的本文所述的任何抗體或其片段、醫藥組成物或免疫綴合物或組合產品或試劑盒。例如,該疾病是腫瘤(例如癌症)或感染。在一些實施方案中,腫瘤是腫瘤免疫逃逸。在一個實施方案中,腫瘤是胃腸道腫瘤或肺部腫瘤或皮膚腫瘤。在一個實施方案中,感染是慢性感染。
在另一方面,本發明還涉及本文所述的任何抗體或其片段或免疫綴合物製備用於在受試者中治療腫瘤(例如癌症)或感染的藥物或醫藥組成物或試劑盒或組合產品的用途。在一些實施方案中,腫瘤是腫瘤免疫逃逸。在一個實施方案中,腫瘤是胃腸道腫瘤或肺部腫瘤或皮膚腫瘤。在一個實施方案中,感染是慢性感染。
本發明還涉及在樣品中檢測抗原的方法。
在另一個方面,本發明涉及以下的具體的實施方案:
1、結合EGFR和B7-H3的雙特異性抗體,其包含第一抗原結合區和第二抗原結合區,該第一抗原結合區特異性結合EGFR,且該第二抗原結合區特異性結合B7H3。
2、實施方案1的雙特異性抗體,其中該第二抗原結合區包含如SEQ ID NO:3、5或7所示的重鏈可變區的HCDR1、2和3序列,以及如SEQ ID NO:4、6或8所示的輕鏈可變區的LCDR1、2和3序列,較佳地,該HCDR1採
用Abm方案,該HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3採用Kabat方案。
3、實施方案1所述的雙特異性抗體,其中該第二抗原結合區包含重鏈可變區VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3,以及輕鏈可變區VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中
(i)該HCDR1、HCDR2和HCDR3為如SEQ ID NO:3所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3;且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO:4所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3;
(ii)該HCDR1、HCDR2和HCDR3為如SEQ ID NO:5所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3;且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO:6所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3;或
(iii)該HCDR1、HCDR2和HCDR3為如SEQ ID NO:7所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3;且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO:8所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3;
較佳地,該HCDR1採用Abm方案,該HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3採用Kabat方案。
4、實施方案1所述的雙特異性抗體,其中該第二抗原結合區包含重鏈可變區VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3,以及輕鏈可變區VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中
(i)HCDR1包含如SEQ ID NO:15所示的胺基酸序列或由該序列組成,HCDR2包含如SEQ ID NO:16所示的胺基酸序列或由該序列組成,HCDR3包含如SEQ ID NO:17所示的胺基酸序列或由該序列組成,
LCDR1包含如SEQ ID NO:18所示的胺基酸序列或由該序列組成,LCDR2包含如SEQ ID NO:19所示的胺基酸序列或由該序列組成,LCDR3包含如SEQ ID NO:20所示的胺基酸序列或由該序列組成;或,
(ii)HCDR1包含如SEQ ID NO:21所示的胺基酸序列或由該序列組成,HCDR2包含如SEQ ID NO:22所示的胺基酸序列或由該序列組成,HCDR3包含如SEQ ID NO:23所示的胺基酸序列或由該序列組成,
LCDR1包含如SEQ ID NO:24所示的胺基酸序列或由該序列組成,LCDR2包含如SEQ ID NO:25所示的胺基酸序列或由該序列組成,LCDR3包含如SEQ ID NO:26所示的胺基酸序列或由該序列組成;或,
(iii)HCDR1包含如SEQ ID NO:27所示的胺基酸序列或由該序列組成,HCDR2包含如SEQ ID NO:28所示的胺基酸序列或由該序列組成,HCDR3包含如SEQ ID NO:29所示的胺基酸序列或由該序列組成,
LCDR1包含如SEQ ID NO:30所示的胺基酸序列或由該序列組成,LCDR2包含如SEQ ID NO:31所示的胺基酸序列或由該序列組成,LCDR3包含如SEQ ID NO:32所示的胺基酸序列或由該序列組成。
5、實施方案1至4中任一項所述的雙特異性抗體,其中,該第二抗原結合區包含重鏈可變區VH,其中該VH包含SEQ ID NO:3、5或7所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:3、5或7所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、
90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
6、實施方案1至5中任一項所述的雙特異性抗體,其中,該第二抗原結合區包含輕鏈可變區VL,其中該VL包含SEQ ID NO:4、6或8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:4、6或8所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
7、實施方案1至6中任一項的雙特異性抗體,其中第二抗原結合區包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL,其中
(i)該VH包含SEQ ID NO:3所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:3的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,且該VL包含SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:4的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;
(ii)該VH包含SEQ ID NO:5所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:5的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,且該VL包含SEQ ID NO:6所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:6的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;或
(iii)該VH包含SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:7的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,且該VL包含SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:8的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
8、實施方案1至7中任一項的雙特異性抗體,其中第二抗原結合區包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL,其中VH和VL分別包含如下所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成:
SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4;
SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6;或
SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
9、實施方案1至7中任一項的雙特異性抗體,其中第一抗原結合區包含重鏈可變區VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3,以及輕鏈可變區VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中
該HCDR1、HCDR2和HCDR3為如SEQ ID NO:1所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3;且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO:2所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3;
較佳地,該CDR採用Kabat方案確定。
10、實施方案9的雙特異性抗體,其中第一抗原結合區的HCDR1包含SEQ ID NO:9的胺基酸序列或由該序列組成;HCDR2包含SEQ ID NO:10
的胺基酸序列或由該序列組成;HCDR3包含SEQ ID NO:11的胺基酸序列或由該序列組成;且第一抗原結合區的LCDR1包含SEQ ID NO:12的胺基酸序列或由該序列組成;LCDR2包含SEQ ID NO:13的胺基酸序列或由該序列組成;且LCDR3包含SEQ ID NO:14的胺基酸序列或由該序列組成。
11、實施方案9或10的雙特異性抗體,其中第一抗原結合區包含重鏈可變區VH,其中該VH包含SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:1的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
12、實施方案9至11中任一項的雙特異性抗體,其中第一抗原結合區包含輕鏈可變區VL,其中該VL包含SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:2的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
13、實施方案9至12中任一項的雙特異性抗體,其中第一抗原結合區包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL,其中該VH包含SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:1的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,且該VL包含SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:2的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
14、實施方案9至13中任一項的雙特異性抗體,其中第一抗原結合區包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL,其中VH和VL分別包含如下所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成:SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
15、實施方案1至14中任一項的雙特異性抗體,其中第一抗原結合區特異性結合EGFR,其包含重鏈可變區VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3,以及輕鏈可變區VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中
HCDR1包含SEQ ID NO:9的胺基酸序列或由該序列組成;
HCDR2包含SEQ ID NO:10的胺基酸序列或由該序列組成;
HCDR3包含SEQ ID NO:11的胺基酸序列或由該序列組成;
LCDR1包含SEQ ID NO:12的胺基酸序列或由該序列組成;
LCDR2包含SEQ ID NO:13的胺基酸序列或由該序列組成;且
LCDR3包含SEQ ID NO:14的胺基酸序列或由該序列組成;
且
第二抗原結合區特異性結合B7H3,其包含重鏈可變區VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3,以及輕鏈可變區VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中
(i)HCDR1包含SEQ ID NO:15的胺基酸序列或由該序列組成;
HCDR2包含SEQ ID NO:16的胺基酸序列或由該序列組成;
HCDR3包含SEQ ID NO:17的胺基酸序列或由該序列組成;
LCDR1包含SEQ ID NO:18的胺基酸序列或由該序列組成;
LCDR2包含SEQ ID NO:19的胺基酸序列或由該序列組成;且
LCDR3包含SEQ ID NO:20的胺基酸序列或由該序列組成;
(ii)HCDR1包含SEQ ID NO:21的胺基酸序列或由該序列組成;
HCDR2包含SEQ ID NO:22的胺基酸序列或由該序列組成;
HCDR3包含SEQ ID NO:23的胺基酸序列或由該序列組成;
LCDR1包含SEQ ID NO:24的胺基酸序列或由該序列組成;
LCDR2包含SEQ ID NO:25的胺基酸序列或由該序列組成;且
LCDR3包含SEQ ID NO:26的胺基酸序列或由該序列組成;或者
(iii)HCDR1包含SEQ ID NO:27的胺基酸序列或由該序列組成;
HCDR2包含SEQ ID NO:28的胺基酸序列或由該序列組成;
HCDR3包含SEQ ID NO:29的胺基酸序列或由該序列組成;
LCDR1包含SEQ ID NO:30的胺基酸序列或由該序列組成;
LCDR2包含SEQ ID NO:31的胺基酸序列或由該序列組成;且
LCDR3包含SEQ ID NO:32的胺基酸序列或由該序列組成。
16、實施方案15的雙特異性抗體,其中第一抗原結合區包含含有如SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH和含有如SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL,且第二抗原結合區包含分別含有如下所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH和VL:
SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4;
SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6;或
SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
17、實施方案1至16中任一項的雙特異性抗體,其包含Fc區,較佳地,該Fc區具有低岩藻糖基化,例如藉由GlymaxX技術處理後獲得的低岩藻糖基化。
18、實施方案17的雙特異性抗體,其包含第一Fc區和第二Fc區,其中第一Fc區和第二Fc區相同或不同。
19、實施方案17或18所述的雙特異性抗體,其中第一Fc區和第二Fc區分別為人的IgG Fc,例如,人IgG1 Fc、人IgG2 Fc、人IgG3 Fc或人IgG4 Fc,例如包含胺基酸序列SEQ ID NO:46或47或與其具有至少90%同一性,例如95%,96%,97%,99%或更高的同一性的胺基酸序列或由其組成。
20、實施方案18或19的雙特異性抗體,其中在第一Fc區和第二Fc區中引入促進第一Fc區和第二Fc區的異二聚化的突變。
21、實施方案20的雙特異性抗體,其中該突變是基於Innobody技術引入的。
22、實施方案21的多特異性抗體,其中一個Fc區的CH3包含S364R和D399K突變,且另一個Fc區的CH3突變包含Y349T、K370S和K409D突變。
23、實施方案22的雙特異性抗體,其中
a)一個Fc區多肽包含SEQ ID NO:49或50所示的胺基酸序列或由其組成,而另一個Fc區多肽包含SEQ ID NO:52或53所示的胺基酸序列或由其組成;
b)一個Fc區多肽包含與SEQ ID NO:49或50所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性的胺基酸序列,而另一個Fc區多肽包含與SEQ ID NO:52或53所示的胺基酸序列所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性的胺基酸序列;或
c)一個Fc區多肽包含與SEQ ID NO:49或50所示的胺基酸序列所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性的胺基酸序列且包含突變Y349T、K370S和K409D,而另一個Fc區包含與SEQ ID NO:
52或53所示的胺基酸序列所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性的胺基酸序列且包含突變S364R和D399K。
24、實施方案20的雙特異性抗體,其中該突變是基於Knob-into-Hole技術引入的,其中在第一Fc區和第二Fc區中引入相應的Knob突變和Hole突變。
25、實施方案24的雙特異性抗體,其中
a)一個Fc區多肽包含突變T366W,而另一個Fc區多肽包含T366S、L368A和Y407V(編號方式依照EU索引),或
b)一個Fc區包含胺基酸替代S354C和T366W,且另一個Fc區包含胺基酸替代Y349C、T366S、L368A和Y407V(編號方式依照EU索引)。
26、實施方案1至25中任一項所述的雙特異性抗體,其中第一和/或第二抗原結合區(例如其中的重鏈可變區)還可以與1個或2個重鏈恆定區(例如人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4的重鏈恆定區)連接,該重鏈恆定區包含CH1和Fc區,經由或不經由鉸鏈區連接,例如重鏈可變區的C末端與重鏈恆定區的CH1的N末端連接。
27、實施方案26所述的雙特異性抗體,其中該CH1包含SEQ ID NO:42所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:42的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
28、實施方案1至27中任一項所述的雙特異性抗體,其中第一和/或第二抗原結合區(例如其中的輕鏈可變區)還可以與輕鏈恆定區連接,例如輕鏈可變區的C末端與輕鏈恆定區的N末端連接。
29、實施方案28所述的雙特異性抗體,其中輕鏈恆定區為kappa輕鏈恆定區或lambda輕鏈恆定區。
30、實施方案20所述的雙特異性抗體,其中該輕鏈恆定區包含SEQ ID NO:54所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:54的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
31、實施方案1至30中任一項所述的雙特異性抗體,其中該雙特異性抗體為IgG樣抗體,其具有如圖1所示的構型。
32、實施方案31所述的雙特異性抗體,其中包含重鏈1和輕鏈1,以及重鏈2和輕鏈2,其中重鏈1和輕鏈1構成第一半抗體,且重鏈2和輕鏈2構成第二半抗體;其中
重鏈1包含第一抗原結合區的重鏈可變區和第一重鏈恆定區;輕鏈1包含第一抗原結合區的輕鏈可變區和第一輕鏈恆定區;且重鏈2包含第二抗原結合區的重鏈可變區和第二重鏈恆定區;輕鏈2包含第二抗原結合區的輕鏈可變區和第二輕鏈恆定區。
33、實施方案32所述的雙特異性抗體,其中重鏈1包含SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:33的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
34、實施方案32或33所述的雙特異性抗體,其中輕鏈1包含SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:34的胺基酸序列具有至少80%、
85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
35、實施方案32至34中任一項所述的雙特異性抗體,其中重鏈1包含SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:33的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,且輕鏈1包含SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:34的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
36、實施方案32至35中任一項所述的雙特異性抗體,其中重鏈2包含SEQ ID NO:35、37或39所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:35、37或39所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
37、實施方案32至36中任一項所述的雙特異性抗體,其中輕鏈2包含SEQ ID NO:36、38或40所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:36、38或40所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
38、實施方案32-至37中任一項所述的雙特異性抗體,其中
(1)重鏈2包含SEQ ID NO:35所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:35所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;且輕鏈2包含SEQ ID NO:36所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:36所示的胺基酸序列具有至
少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;
(2)重鏈2包含SEQ ID NO:37所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:37所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;且輕鏈2包含SEQ ID NO:38所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:38所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;
(3)重鏈2包含SEQ ID NO:39所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:39所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;且輕鏈2包含SEQ ID NO:40所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:40所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
39、實施方案32至38中任一項所述的雙特異性抗體,其中
重鏈1包含SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:33的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,且輕鏈1包含SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:34的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;且重鏈2和輕鏈2分別包含如下的SEQ ID NO:所示的胺基酸序列,或包含與所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、
96%、97%、98%、99%的同一性的胺基酸序列,或由如下SEQ ID NO所示的序列組成:
i)SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36;
ii)SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38;
iii)SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。
40、實施方案32至39中任一項所述的雙特異性抗體,其中,
(i)重鏈1包含SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列的重鏈或由其組成,且輕鏈1包含SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列或由其組成,
重鏈2包含SEQ ID NO:35所示的胺基酸序列或由其組成,且輕鏈2包含SEQ ID NO:36所示的胺基酸序列或由其組成;或,
(ii)重鏈1包含SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列或由其組成,且輕鏈1包含SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列或由其組成,
重鏈2包含SEQ ID NO:37所示的胺基酸序列或由其組成,且輕鏈2包含SEQ ID NO:38所示的胺基酸序列或由其組成;或,
(iii)重鏈1包含SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列或由其組成,且輕鏈1包含SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列或由其組成,
重鏈2包含SEQ ID NO:39所示的胺基酸序列或由其組成,且輕鏈2包含SEQ ID NO:40所示的胺基酸序列或由其組成。
41、實施方案1至40中任一項所述的結合EGFR和B7-H3的雙特異性抗體或其抗原結合片段,其中,該抗體或其抗原結合片段具有以下一個或多個特性:
(i)該抗體一方面可以阻斷EGFR配體與EGFR的結合,抑制生物信號傳遞,阻斷腫瘤相應生物活性;另一方面會刺激EGFR內吞而最終被細胞內溶酶體等降解;
(ii)該抗體採用對EGFR低親和力的EGFR抗體親本序列,極大降低了系列EGFR單株抗體對皮膚等正常上皮組織帶來的毒副作用;
(iii)該抗體在EGER低親和力的基礎上引用B7-H3高親和力的抗體親本序列,極大提高了EGFR信號阻斷活性,提高了本發明雙特異性抗體的藥效生物活性和藥效安全窗口;
(iv)該抗體為低岩藻糖基化的抗體;
(ii)該抗體具有較高的藥效生物活性和安全性;
(v)該抗體具有優良的腫瘤殺傷和抑制效果;
(vi)該抗體具有優良的ADCC體內外藥效活性;
(vii)該抗體與KRAS小分子抑制劑聯用具有優良的抗腫瘤協同效果。
42、分離的核酸,其編碼實施方案1至41中任一項的所述的結合EGFR和B7-H3的雙特異性抗體中的任一條鏈。
43、載體,其包含實施方案42的核酸,較佳地該載體是表達載體,較佳地,該表達載體為pcDNA,例如pcDNA3.1。
44、宿主細胞,其包含實施方案42的核酸或實施方案43的載體,較佳地,該宿主細胞是原核的或真核的,更佳的酵母細胞或哺乳動物細胞(例如293細胞或CHO細胞,例如293F細胞或293T細胞或CHO-S細胞)。
45、實施方案44的宿主細胞,其被糖工程化而表達RMD酶,較佳地,該宿主細胞是CHO細胞。
46、實施方案45的宿主細胞,其包含編碼RMD酶的核酸。
47、實施方案46的宿主細胞,其中該RMD酶包含SEQ ID NO:41所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,較佳地,該RMD酶來自銅綠假單胞菌。
48、製備結合EGFR和B7-H3的雙特異性抗體的方法,該方法包括在適於表達編碼前述實施方案1至41中任一項的雙特異性抗體的核酸的條件下培養實施方案44至47中任一項所述的宿主細胞,視需要地分離該抗體或其抗原結合片段,視需要地該方法還包括從該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體或其抗原結合片段。
49、免疫綴合物,其包含與治療劑或診斷劑綴合的前述實施方案1至41中任一項的雙特異性抗體。
50、醫藥組成物,其包含前述實施方案1至41中任一項的雙特異性抗體或實施方案49的免疫綴合物,以及視需要地藥用輔料。
51、實施方案50的醫藥組成物,其還包含第二治療劑;較佳地,該第二治療劑選自抗血管發生劑、化療劑、其它抗體、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑(例如共刺激分子的激活劑或免疫檢查點分子的抑制劑);較佳地,該第二治療劑選自KRAS小分子抑制劑,例如KRAS G12C抑制劑(例如AMG510(Sotorasib)或GFH925)、KRAS G12D(例如MRTX1133)或KRAS G12S抑制劑。
52、藥物組合產品,其包含實施方案1至41中任一項的雙特異性抗體或實施方案49的免疫綴合物或實施方案50的醫藥組成物,以及一種或多種第二治療劑,較佳地,該第二治療劑選自抗血管發生劑、化療劑、其它抗體、
細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑(例如共刺激分子的激活劑或免疫檢查點分子的抑制劑);較佳地,該第二治療劑選自KRAS小分子抑制劑,例如KRAS G12C抑制劑(例如AMG510(Sotorasib)或GFH925)、KRAS G12D(例如MRTX1133)或KRAS G12S抑制劑。
53、在受試者中預防或治療腫瘤或感染性疾病的方法,該方法包括向該受試者施用有效量的實施方案1至41中任一項所述的雙特異性抗體、或實施方案49所述的免疫綴合物、或實施方案50的醫藥組成物。
54、實施方案53所述的方法,其還包括向該受試者聯合施用一種或多種其它療法,該療法例如包括治療方式和/或其它治療劑,較佳地,該治療方式包括手術治療和/或放射療法,或者該治療劑選自抗血管發生劑、化療劑、其它抗體、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑(例如共刺激分子的激活劑或免疫檢查點分子的抑制劑);較佳地,該第二治療劑選自KRAS小分子抑制劑,例如KRAS G12C抑制劑(例如AMG510(Sotorasib)或GFH925)、KRAS G12D(例如MRTX1133)或KRAS G12S抑制劑。
55、在受試者中預防或治療腫瘤或感染性疾病的方法,該方法包括向該受試者施用有效量的實施方案51的醫藥組成物或實施方案52的藥物組合產品。
56、實施方案53至55中任一項所述的方法,其中該腫瘤為癌症,例如實體腫瘤或血液腫瘤,包括上皮來源的癌症,例如胃腸道腫瘤或肺部腫瘤或皮膚腫瘤,例如皮膚癌(例如皮膚鱗癌、頭頸癌如頭頸部鱗狀細胞癌)、食管癌(例如:食管鱗狀癌)、腸癌(例如:結腸癌、直腸癌、結直腸癌)或肺癌(例如非小細胞肺癌、肺鱗癌、肺腺癌)。
57、實施方案53至56中任一項的方法,其中該腫瘤的腫瘤細胞中
(i)相比相鄰組織正常細胞或相比健康受試者中的相同組織的正常細胞,過度表達野生型EGFR(例如具有升高的核酸或蛋白質水平的野生型EGFR),和/或表達突變的EGFR,較佳地,該突變的EGFR包含選自R521K、L858R、T790M、G719X、C797S、Y1069C、Exon19缺失(Del19)、Exon20ins(例如S768_D770dup)中的一個或多個突變,較佳地,該突變的EGFR包含R521K/Y1069C、R521K、L858R/T790M/C797S、Del19/T790M/C797S或S768_ID770dup;
(ii)相比相鄰組織正常細胞或相比健康受試者中的相同組織的正常細胞,過度表達野生型KRAS(例如具有升高的核酸或蛋白質水平的野生型KRAS),或表達突變的KRAS,較佳地,該突變的KRAS包含G12位或G13位突變,例如G12D或G12C;
(iii)相比相鄰組織正常細胞或相比健康受試者中的相同組織的正常細胞,具有升高的核酸水平或蛋白水平的B7-H3;和/或
(iv)該腫瘤細胞對於酪胺酸激酶抑制劑,例如對一代(厄洛替尼Erlotinib)和三代(奧希替尼Osimertinib)耐藥,例如對於奧希替尼耐藥。
58、實施方案57的方法,其中該腫瘤的腫瘤細胞中表達突變的EGFR和突變的KRAS,例如包含具有R521K的突變的EGFR和具有G120D的突變的KRAS。
59、檢測樣品中抗原EGFR和/或B7-H3的方法,該方法包括
(a)將樣品與實施方案1至41中任一項所述的雙特異性抗體接觸;和
(b)檢測抗體或其抗原結合片段和EGFR和/或B7-H3間的複合物的形成,視需要地,該抗體被可檢測的標記。
60、實施方案1至41中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,和/或實施方案42所述的分離的核酸,和/或實施方案43所述的載體,和/或實施方案44至47中任一項所述的宿主細胞,和/或實施方案49所述的免疫綴合物,和/或實施方案50或51所述的醫藥組成物或實施方案52的藥物組合產品,在製備用於預防和/或治療受試者疾病的藥物中的用途。
本發明還涵蓋本文所述的任何實施方案的任意組合。本文所述的任何實施方案或其任何組合適用於本文所述的發明的任何和所有抗體或其片段或免疫綴合物或醫藥組成物或組合產品或試劑盒、方法和用途。
結合以下圖式一起閱讀時,將更好地理解以下詳細描述的本發明的較佳實施方案。出於說明本發明的目的,圖中顯示了目前較佳的實施方案。然而,應當理解本發明不限於圖中所示實施方案。
圖1顯示了本發明的抗B7-H3/EGFR雙特異性抗體的結構示意圖。
圖2顯示了本發明的抗B7-H3/EGFR雙特異性抗體的篩選增殖抑制實驗圖。
圖3顯示了本發明的抗B7-H3/EGFR雙特異性抗體的篩選ADCC實驗圖。
圖4顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb的B7H3和EGFR在不同細胞系表達檢測圖。
圖5顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb在CRC腫瘤細胞系CCK-81、NCI-H508、HT-55和LS180中增殖抑制的實驗結果圖,其中抗體稀釋如下:
CCK-81,NCI-H508,HT-55:抗體稀釋終濃度中最高為125nM,4倍稀釋;
LS180:抗體稀釋終濃度中最高為300nM,4倍稀釋。
圖6顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb在HNSCC腫瘤細胞系TE-1和Colo680中增殖抑制的實驗結果圖,其中抗體稀釋如下:TE-1,Colo680:抗體稀釋終濃度中最高為300nM,3.16倍稀釋。
圖7.1顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb在不同的NSCLC-EGFRWT腫瘤細胞系中增殖抑制的實驗結果圖;
圖7.2顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb在NSCLC-EGFR經典突變腫瘤細胞系中增殖抑制的實驗結果圖;
圖7.3顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb在NSCLC-EGFR異常擴增腫瘤細胞系中增殖抑制的實驗結果圖;
圖7.4顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb在罕見NSCLC-EGFR突變型腫瘤細胞系中增殖抑制的實驗結果圖;
圖7.5顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb與gp120/Zalu和gp120/hz20G5.26聯合的藥效對比實驗結果圖;
其中抗體或小分子TKI(Osimertinim或Erlotinib)稀釋如下:
圖7.1:NCI-292,NCI-H322:抗體稀釋終濃度中最高為300nM,3.16倍稀釋;
圖7.2:NCI-H1650,NCI-H1975:抗體稀釋終濃度中最高為300nM,3.16倍稀釋;
圖7.3:NCI-H1703,SK-MES-1:抗體分子,稀釋終濃度中最高為300nM,3.16倍稀釋;小分子TKI(Osimertinim和Erlotinib),稀釋終濃度中最高為1000nM,3.16倍稀釋;
圖7.4:H1975(EGFRL858R/T790M/C797S):各種抗體分子和Osimertinib的稀釋終濃度中最高為300nM,3.16倍稀釋;H322(EGFRS768-D77dup):各種抗體分子和Osimertinib的稀釋終濃度中最高為300nM,4倍稀釋;PC9+B7H3(EGFRDel19/T790M/C79S):各種抗體分子和Osimertinib的稀釋終濃度中最高為100nM,4倍稀釋;
圖7.5:LS180和H292:抗體稀釋終濃度中最高為300nM,4倍稀釋;SK-MES-1:終濃度,最高300nM,3.16倍稀釋。
圖8顯示了在H358 NSCLC細胞系中,本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb與AMG510小分子抑制劑聯合協同用藥對比實驗結果圖,其中
圖8(A):H358體外增殖抑制實驗:各個抗體分子的最終濃度中,最高濃度為300nM,4倍稀釋;
圖8(B):Hz20G5.26/Zalu bsAb與KRAS G12C抑制劑AMG510(MedChem Expresss,HY-114277)聯合用藥實驗:AMG510+bsAb@10nm表示每個孔中加入固定的10nM Hz20G5.26/Zalu bsAb,同時又在每個孔中梯度稀釋AMG510(終濃
度,1000nM,4倍稀釋);僅有AMG510:終濃度最高1000nM,4倍稀釋;僅有Hz20G5.26/Zalu bsAb:終濃度最高10nM,5倍稀釋;共稀釋5個梯度。
圖9顯示了在LS180 CRC細胞系,本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb與KRAS G12D小分子抑制劑MRTX1133聯聯合協同用藥對比實驗結果圖,其中
圖9(A):Hz20G5.26/Zalu bsAb與G12D抑制劑MRTX1133(MCE,cat:HY-134813A-10mg)聯合用藥實驗:MRTX1133+bsAb@100nm表示每個孔中加入固定的100nM Hz20G5.26/Zalu bsAb,同時又在每個孔中梯度稀釋MRTX1133(終濃度,1000nM,4倍稀釋);僅有MRTX1133:終濃度最高1000nM,4倍稀釋;僅有Hz20G5.26/Zalu bsAb:終濃度最高100nM,4倍稀釋;共稀釋6個梯度。
圖10顯示了在H358細胞系,本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb針對EGFR磷酸化信號阻斷作用的實驗結果圖。
圖11顯示了在H358細胞系,本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb針對EGFR配體(EGF或者TGF-α)誘導的EGFR磷酸化信號阻斷作用的實驗結果圖。
圖12.1顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb在NSCLC-EGFRWT腫瘤細胞系中ADCC報告實驗結果圖;在3個細胞系中,抗體分子稀釋終濃度最高為6.25nM,4倍稀釋;
圖12.2顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb在NSCLC-EGFR突變型腫瘤細胞系中ADCC報告實驗結果圖;在H1975細胞系中,抗體分子稀釋終濃度最高為10nM,4倍稀釋;且在H1975細胞系中,抗體分子稀釋終濃度最高為6.25nM,4倍稀釋;
圖12.3顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb在NSCLC-EGFR異常擴增型腫瘤細胞系中ADCC報告實驗結果圖;在SK-MES-1細胞系中,抗體分子稀釋終濃度最高為6.25nM,4倍稀釋;且在H1703細胞系中,抗體分子稀釋終濃度最高為100nM,4倍稀釋;
圖12.4顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb在NSCLC-KRAS突變型腫瘤細胞系中ADCC報告實驗結果圖;在H358細胞系中,抗體分子稀釋終濃度最高為25nM,4倍稀釋(圖12.4(A));且在H358細胞系中,抗體分子稀釋終濃度最高為1.56nM,4倍稀釋(圖12.4(B));
圖13.1顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb在NSCLC-EGFR野生型腫瘤細胞系中huPBMCADCC報告實驗結果圖;其中,
圖13.1(A),在H292細胞系中,抗體分子稀釋終濃度最高為2.5nM,4倍稀釋;
圖13.1(B):在H322細胞系中,抗體分子稀釋終濃度最高為100nM,4倍稀釋;
圖13.1(C):在H292細胞系中,抗體分子稀釋終濃度最高為100nM,4倍稀釋;
圖13.2顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb在NSCLC-EGFR突變型腫瘤細胞系中huPBMC ADCC報告實驗結果圖;其中在H1975細胞系中,抗體分子稀釋終濃度最高為35nM,4倍稀釋;在H1650細胞系中,抗體分子稀釋終濃度最高為100nM,4倍稀釋;
圖13.3顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb在NSCLC-EGFR異常擴增型腫瘤細胞系中huPBMC ADCC報告實驗結果圖;
圖13.3(A),在SK-MES-1細胞系中,抗體分子稀釋終濃度最高為35nM,4倍稀釋;
圖13.3(B):在H1703細胞系中,抗體分子稀釋終濃度最高為25nM,4倍稀釋;
圖13.3(C):在SK-MES-1細胞系中,抗體分子稀釋終濃度最高為25nM,4倍稀釋;
圖13.4顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb在NSCLC-KRAS突變型腫瘤細胞系中huPBMC ADCC報告實驗結果圖,其中分別在兩個細胞系中,抗體分子稀釋終濃度最高為35nM,4倍稀釋。
圖14顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb藥物模擬皮膚毒性的體外研究實驗結果圖,其中應用細胞培養基稀釋抗體分子,分別在兩個人皮膚細胞系中,抗體分子稀釋終濃度最高為300nM,3.16倍稀釋。
圖15A顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb對NCl-H292荷瘤小鼠抗腫瘤作用影響的實驗結果圖;圖15B顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb對NCI-H292荷瘤小鼠抗腫瘤作用的影響-生存曲線的實驗結果圖;圖15C顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb對NCI-H292荷瘤小鼠體重的影響的實驗結果圖。
圖16A顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb對SK-MES-1荷瘤小鼠的抗腫瘤作用的影響的實驗結果圖;圖16B顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb對SK-MES-1荷瘤小鼠體重的影響的實驗結果圖。
圖17A顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb對SK-MES-1荷瘤小鼠的抗腫瘤作用的影響的實驗結果圖;圖17B顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb對SK-MES-1荷瘤小鼠體重的影響的實驗結果圖。
圖18A顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb與AMG510聯合對NCI-H358荷瘤小鼠抗腫瘤作用影響的實驗結果圖;圖18B顯示了本發明的Hz20G5.26/Zalu bsAb與AMG510聯合對NCI-H358荷瘤小鼠體重影響的實驗結果圖。
除非另外限定,否則本文中所用的全部技術與科學術語具有如本發明所屬技術領域具有通常知識者通常理解的相同含義。本文所提及的全部出版物、專利申請、專利和其他參考文獻藉由引用的方式完整地併入。此外,本文中所述的材料、方法和例子僅是說明性的並且不意在是限制性的。本發明的其他特徵、目的和優點將從本說明書及圖式並且從後附的申請專利範圍中顯而易見。
I.定義
應理解本發明不限於本文中描述的特定方法學、方案和試劑,因為這些可以變化。還應理解本文中使用的術語僅為了描述具體實施方案,而並不意圖限制本發明的範圍,其僅會由所附申請專利範圍限制。除非另外定義,本文中使用的所有技術和科學術語與本發明所屬技術領域具有通常知識者通常的理解具有相同的含義。
為了解釋本說明書,將使用以下定義,並且只要適當,以單數形式使用的術語也可以包括複數,並且反之亦然。要理解,本文所用的術語僅是為了描述具體的實施方案,並且不意欲是限制性的。
術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。
如本文所用,術語“和/或”意指可選項中的任一項或可選項的兩項或多項。
如本文所用,術語“包含”或“包括”意指包括該要素、整數或步驟,但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中,當使用術語“包含”或“包括”時,除非另有指明,否則也涵蓋由所述及的要素、整數或步驟組成的情形。例如,當提及“包含”某個具體序列的抗體可變區時,也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。
在本文中當提及“第一”“第二”時,僅為了區分兩個結構域或兩條鏈,而不以任何方式表明兩個結構域的位置。
如本文所用,重鏈和輕鏈的全部可變區的胺基酸位置根據Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD (1991)中描述的Kabat編號系統編號並且在本文中稱作“Kabat編號”。
如本文所用,用於提及抗體除可變區之外的結構域(例如恆定區,例如Fc區)中的胺基酸位置時,根據Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD (1991)中描述的EU編號系統編號並且在本文中稱作“EU編號”。
當將位置編號和/或胺基酸殘基賦予特定抗體同種型時,其旨在適用於任何其它抗體同種型的相應的位置和/或胺基酸殘基,這是所屬技術領域具有通常知識者己知的。
關於人免疫球蛋白輕鏈和重鏈的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD (1991)中給出。
術語“抗體”在本文中以最廣意義使用,指包含抗原結合位點的蛋白質,涵蓋各種結構的天然抗體和人工抗體,包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如,雙特異性抗體)、單鏈抗體、完整抗體和抗體片段。
術語“全抗體”、“全長抗體”、“完全抗體”和“完整抗體”在本文中可互換地用來指天然存在的包含由二硫鍵相互連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白。每條重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由3個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH區和VL區可以進一步再劃分為超變區(為互補決定區(CDR),其間插有較保守的區域(為構架區(FR))。每個VH和VL由三個CDR和4個FR組成,從胺基端到羧基端以如下順序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合,但是顯示出多種效應子功能。
“半抗體”或“半聚物”指單價抗原結合多肽。在一些實施方案中,半抗體或半聚物包含VH/VL單元和視需要地免疫球蛋白恆定結構域的至少一部分。在一些實施方案中,半抗體或半聚物包含與一條免疫球蛋白輕鏈締合的一條免疫球蛋白重鏈,或其抗原結合片段。在一些實施方案中,半抗體或半聚物是單
特異的,即,與單個抗原或表位結合。在一些具體的實施方案中,半抗體與EGFR結合並且不與B7-H3結合。在一些具體的實施方案中,半抗體與B7-H3結合並且不與EGFR結合。所屬技術領域具有通常知識者將會輕易地理解,半抗體可以具有由單一可變結構域組成(例如,源自駱駝屬(Camelidae))的抗原結合結構域。
術語抗體的“抗原結合片段”是與全長抗體不同的分子,其包含全長抗體的一部分,但其能結合全長抗體的抗原或與全長抗體(即與抗原結合片段所來源的全長抗體)競爭結合抗原。可以藉由重組DNA技術、或藉由酶或化學切割完整的抗體製備抗原結合片段。抗原結合片段包括但不限於Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、單鏈Fv、雙體抗體(diabody)、單域抗體(sdAb)、奈米抗體。
“Fab片段”或“Fab”在本文中可互換使用,用於指,由兩條多肽鏈組成的、包含免疫球蛋白重鏈可變區VH、重鏈恆定結構域CH1、輕鏈可變區VL和輕鏈恆定結構域CL的免疫球蛋白片段,其中,一條多肽鏈從N端到C端包含VH和選自CH1和CL的一個恆定區,另一條多肽鏈從N端到C端包含VL和選自CL和CH1的另一恆定區,其中該VH結構域和VL結構域配對形成抗原結合位點。Fab’片段因在重鏈CH1結構域的羧基末端增加了一些殘基(包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸)而與Fab片段不同。Fab’-SH是對其中恆定結構域的半胱胺酸殘基攜帶一個游離硫醇基的Fab’的稱謂。F(ab’)2抗體片段最初是作為成對Fab’片段生成的,在Fab’片段之間具有鉸鏈半胱胺酸。抗體片段的其它化學偶聯也是已知的。
在本文中,術語“雙特異性抗體”包含與兩種抗原或兩種表位特異性結合的抗原結合結構域。除非另外說明,否則列出的雙特異性抗體名稱中雙特
異性抗體結合的抗原的順序是任意的。即,在一些實施方案中,術語“抗EGFR/B7-H3雙特異性抗體”和“抗B7-H3/EGFR雙特異性抗體”可以互換使用。在一些實施方案中,雙特異性抗體包含兩個半抗體,其中每個半抗體包含單個重鏈可變區和視需要地重鏈恆定區的至少一部分以及單個輕鏈可變區和視需要地輕鏈恆定區的至少一部分。在一些實施方案中,雙特異性抗體包含兩個半抗體,其中每個半抗體包含單個重鏈可變區和單個輕鏈可變區並且不包含多於一個單個重鏈可變區且不包含多於一個單個輕鏈可變區。在一些實施方案中,雙特異性抗體包含兩個半抗體,其中每個半抗體包含單個重鏈可變區和單個輕鏈可變區,並且其中第一半抗體與第一抗原/表位結合且不與第二抗原結合並且第二半抗體與第二抗原/表位結合且不與第一抗原結合。
本發明的多特異性抗體可以包含接頭。如本文所用的術語“接頭”是指使得能夠直接連接多特異性抗體的不同部分的任何分子。在多特異性抗體不同部分之間建立共價連接的接頭的實例包括肽接頭和非蛋白質聚合物,包括但不限於聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇、聚丙二醇的共聚物。在一些實施方案中,根據本發明的術語“肽接頭”是指胺基酸的序列,其中該序列將多特異性抗體的各個部分的胺基酸序列連接在一起。較佳地,該肽接頭具有這樣的長度,其足以連接兩個實體,其方式使得它們維持它們相對於彼此的構象,使得不妨礙期望的活性。肽接頭可以主要包括或可以不主要包括以下胺基酸殘基:Gly、Ser、Ala或Thr。有用的接頭包括甘胺酸-絲胺酸聚合物,包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n、(GGGS)n和(GGGGS)nG,其中n是至少1(且較佳2、3、4、5、6、7、8、9、10)的整數。有用的接頭還包括甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物和其他柔性接頭。
術語“Fc結構域”或“Fc區”在本文中用來定義免疫球蛋白重鏈的含有至少一部分恆定區的C端區域。該術語包括天然序列Fc區和變體Fc區。天然的免疫球蛋白“Fc結構域”包含兩個或三個恆定結構域,即CH2結構域、CH3結構域和可選的CH4結構域。例如,在天然抗體中,免疫球蛋白Fc結構域包含源自IgG、IgA和IgD類抗體的兩條重鏈的第二和第三恆定結構域(CH2結構域和CH3結構域);或者包含源自IgM和IgE類抗體的兩條重鏈的第二、第三和第四恆定結構域(CH2結構域、CH3結構域和CH4結構域)。除非本文中另外說明,否則Fc區或重鏈恆定區中的胺基酸殘基編號根據如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interes,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的EU編號體系(也稱作EU索引)進行編號。然而,Fc區的C端賴胺酸(Lys447)可以存在或可以不存在。兩個Fc區可以實現二聚化以構成二聚Fc,兩個不同的Fc異二聚化形成異二聚Fc。在本文中,術語“Fc區”、“Fc部分”和“二聚Fc(例如異二聚Fc)”不包括免疫球蛋白的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL以及重鏈恆定區CH1和輕鏈恆定區CL,但在一些情況下可以包括在重鏈恆定區N端的鉸鏈區。在一個實施方案中,人IgG重鏈Fc區從Asp221或從Cys226或從Asp231延伸至重鏈的羧基端。在一個實施方案中,Fc區是人Fc區。在一個實施方案中,Fc區屬於人IgG4亞類。在一個實施方案中,Fc區屬於人IgG1亞類。
在本文中,“Fc二聚化”是指兩個Fc區二聚化後形成二聚體。“Fc異二聚化”是指兩個不同的Fc區二聚化後形成二聚體。異二聚化的Fc區在雙特異性抗體或多特異性抗體中構成Fc支架。因此,“異二聚體Fc支架”是指包含兩個不同的Fc區或由兩個不同的Fc區二聚化後形成的支架,其可以在其N末端
或C末端連接結合抗原的結構域(例如可以與靶分子結合的抗體的重鏈和/或輕鏈可變區或抗體的抗原結合片段,或可以與靶分子結合的配體或受體的可溶性部分),用於構成多特異性抗體例如雙特異性抗體。
在胺基酸突變用(原始胺基酸、胺基酸位置、突變胺基酸)來表示。例如,當突變位點位於Fc區時,“T366W”是指,位於EU編號位置366的T被W取代。當述及突變組合時,組合的突變之間用“和”或“/”連接。“R521K/Y1069C”表示同時包含突變R521K和Y1069C。應當注意,在描述突變時,具體的位置同時涵蓋其在其他多肽鏈上所對應的胺基酸位置。例如,如果提及C220,其涵蓋IgG1重鏈藉由EU編號下的第220位胺基酸,以及在其他重鏈中對應的胺基酸,例如在IgG2、IgG3或IgG4中的第131位胺基酸。在描述突變時,在一個具體位置上的原始胺基酸可以是描述的胺基酸,或者也可以是在對應位置上的其他胺基酸。
“互補決定區”或“CDR區”或“CDR”是抗體可變結構域中在序列上高變並且形成在結構上確定的環(“超變環”)和/或含有抗原接觸殘基(“抗原接觸點”)的區域。CDR主要負責與抗原表位結合。重鏈和輕鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3,從N-端開始順序編號。位於抗體重鏈可變區內的CDR被稱作HCDR1、HCDR2和HCDR3,而位於抗體輕鏈可變區內的CDR被稱作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一個給定的輕鏈可變區或重鏈可變區胺基酸序列中,各CDR的精確胺基酸序列邊界可以使用許多公知的抗體CDR指派系統的任一種或其組合確定,該指派系統包括例如:基於抗體的三維結構和CDR環的拓撲學的Chothia (Chothia等人.(1989) Nature 342: 877-883,Al-Lazikani等人,“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”, Journal of
Molecular Biology, 273, 927-948 (1997)),基於抗體序列可變性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)), AbM (University of Bath),Contact (University College London),國際ImMunoGeneTics database (IMGT)(在萬維網上imgt.cines.fr/上),以及基於利用大量晶體結構的近鄰傳播聚類(affinity propagation clustering)的North CDR定義。
例如,根據不同的CDR確定方案,每一個CDR的殘基如下所述。
CDR也可以基於與參考CDR序列(例如本發明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat編號位置而確定。
除非另有說明,否則在本發明中,術語“CDR”或“CDR序列”涵蓋以上述任一種方式確定的CDR序列。
除非另有說明,否則在本發明中,當提及抗體可變區中的殘基位置(包括重鏈可變區殘基和輕鏈可變區殘基)時,是指根據Kabat編號系統(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))的編號位置。
在一個實施方案中,本發明抗體的CDR藉由Kabat規則確定邊界,或藉由AbM規則確定,或藉由其組合確定規則。
在本發明的一個實施方案中,本發明中與B7-H3結合的抗原結合區中的VH的HCDR1是藉由AbM規則確定,HCDR2和HCDR3是藉由Kabat規則確定,VL的CDR是藉由Kabat規則確定。
在本發明的一個實施方案中,本發明中與EGFR結合的抗原結合區中的VH和VL的CDR是藉由Kabat規則確定。
術語“鉸鏈區”指抗體重鏈多肽的部分,該部分在野生型抗體重鏈中連接CH1區和CH2區,例如,IgG1鉸鏈區,例如根據EU編號,D221到P230的序列。可以藉由與IgG1亞類序列的鉸鏈區半胱胺酸殘基對齊,確定其他IgG亞類的鉸鏈區。
如本文所用的術語“結合位點”或“抗原結合位點”或“抗原結合區”表示抗體分子,例如多特異性抗體,例如雙特異性抗體的結合特定靶標或抗原的任何部分。抗原結合區可以是例如抗體或免疫球蛋白本身或抗體片段。這種抗原結合區可以具有或可以不具有獨立於BsAB的剩餘部分的三級結構,並且可以作為單獨實體結合或不結合其抗原/表位。在一些實施方案中,抗原結合區包括由抗體輕鏈可變區(VL)和抗體重鏈可變區(VH)組成的VH/VL對、衍生自駱駝科
重鏈抗體的重鏈可變區、來自鯊魚科動物的IgNAR的VH樣單結構域(v-NAR)、駱駝化的人VH結構域、人源化的駱駝科抗體重鏈可變區。
當在多特異性抗體或雙特異性抗體中提及“第一抗原結合區”時,是指結合第一抗原的結合區,而不意圖限制抗體中所含的該抗原結合區的個數,例如多特異性抗體或雙特異性抗體中可以包含1個或1個以上的第一抗原結合區。例如,雙特異性抗體包含第一抗原結合區和第二抗原結合區,但是可以包含1個或1個以上的第一抗原結合區和1個或1個以上的第二抗原結合區。
當提及“抗原結合區來源於抗體”時,是指構成該抗原結合區的結合結構域為或衍生自該抗體的特異性結合抗原的結合結構域,例如,抗原結合區的特異性結合抗原的片段例如Fab為或衍生自該抗體的相應片段例如Fab,或抗原結合區的重鏈可變區和/或輕鏈可變區為或衍生自該抗體的重鏈可變區和/或輕鏈可變區,或者該抗原結合區的1個、2個、3個、4個、5個或6個CDR為該抗體的CDR。在一些實施方案中該抗原結合區是抗體的抗原結合片段。
如本文所用,術語“多特異性”抗體指具有至少兩個抗原結合位點的抗體,該至少兩個抗原結合位點中的每一個抗原結合位點與相同抗原的不同表位或與不同抗原的不同表位結合。本文提供的抗體通常是多特異性抗體,例如雙特異性抗體。多特異性抗體是對至少兩個不同抗原表位具有結合特異性的抗體。在一個實施方案中,本文提供了這樣的雙特異性抗體,其具有針對第一抗原和第二抗原的結合特異性。
術語“免疫球蛋白分子”指具有天然存在抗體的結構的蛋白質。例如,IgG類免疫球蛋白是由二硫鍵鍵合的兩條輕鏈和兩條重鏈組成的約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白。從N端至C端,每條免疫球蛋白重鏈具有一個重鏈
可變區(VH),也稱作重鏈可變結構域,隨後是三個重鏈恆定結構域(CH1、CH2和CH3)。類似地,從N端至C端,每條免疫球蛋白輕鏈具有一個輕鏈可變區(VL),也稱作輕鏈可變結構域,隨後是一個輕鏈恆定結構域(CL)。免疫球蛋白的重鏈可以歸屬5個類別之一,稱作α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM),其中某些類別可以進一步劃分成亞類,例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的輕鏈可以基於其恆定結構域的胺基酸序列而劃分成兩種類型之一,稱作κ和λ。免疫球蛋白基本上由借助免疫球蛋白鉸鏈區連接的兩個Fab分子和一個Fc結構域組成。
術語“效應子功能”指隨免疫球蛋白同種型變動的歸因於免疫球蛋白Fc區的那些生物學活性。免疫球蛋白效應子功能的例子包括:C1q結合和補體依賴的細胞毒性(CDC)、Fc受體結合作用、抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴的細胞吞噬作用(ADCP)、細胞因子分泌、免疫複合物介導的抗原呈遞細胞攝取抗原、下調細胞表面受體(例如B細胞受體)和B細胞活化。
術語“...價”抗體指抗體分子中存在的抗原結合位點的數目。“二價”、“三價”和“四價”抗體指抗體分子中分別存在2個抗原結合位點、3個抗原結合位點和4個抗原結合位點。
如本文所用,術語“結合”或“特異性結合”意指結合作用對抗原是選擇性的並且可以與不想要的或非特異的相互作用區別。抗原結合位點與特定抗原結合的能力可以藉由酶聯免疫吸附測定法(ELISA)或本領域已知的常規結合測定法測定如藉由放射性免疫測定(RIA)或生物膜薄層干涉測定法或MSD測定法或表面電漿共振法(SPR)測定。
“親和力”或“結合親和力”指反映結合對子的成員之間相互作用的固有結合親和力。分子X對其配偶物Y的親和力可以通常由解離常數(KD)表示,解離常數是解離速率常數和締合速率常數(分別是Kdis和Kon)的比例。親和力可以由本領域已知的常見方法測量。用於測量親和力的一個具體方法是本文中的ForteBio動力學結合測定法。
“knob-in-hole”突變或“結入扣”突變在本文中用於指,利用“結入扣”技術,在第一Fc多肽和第二Fc多肽中分別引入突變,以在第一Fc多肽的界面上與在第二Fc多肽的界面上形成凸起(“結(knob)”)和互補的空穴(“扣(hole)”)。本領域已知,“結入扣”技術可在抗體分子的不同鏈之間改造界面,以促進抗體分子的各鏈正確締合。通常,該技術涉及在一條鏈的界面引入“凸起/結”,在欲與之配對的另一條鏈的界面引入相應的“空穴/扣”,使得凸起可置於空穴中。一個較佳的界面包含一條鏈的重鏈恆定結構域的CH3結構域和欲與之配對的另一條鏈的重鏈恆定結構域的CH3結構域。可藉由將來自一條鏈的重鏈恆定結構域的CH3結構域的界面的小胺基酸側鏈替換為較大的側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)來構建凸起。藉由將大胺基酸側鏈替換為較小的側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸),在欲配對的另一條鏈的重鏈恆定結構域的CH3結構域的界面構建與凸起相同或相似大小的補償性空穴。另一可選的界面是上文所述Fab片段的包含輕鏈的CL結構域和重鏈的CH1結構域,藉由構建凸起-空穴相互作用促進Fab片段的兩條鏈之間發生正確的異二聚化。
在本文中,抗體恆定區或抗體恆定結構域,包括CH1、CL和Fc結構域以及構成Fc結構域的CH2、CH3和可選的CH4結構域,可以根據抗體分子的預期功能進行選擇。例如,恆定區可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM區,
尤其是人IgG的免疫球蛋白恆定結構域,例如,人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恆定結構域,較佳人IgG1的恆定結構域。再例如,抗體的Fab片段可以包含來自IgG1的CH和CL恆定區。再例如,抗體的Fc區可以包含來自IgG1的CH2和CH3結構域。免疫球蛋白恆定區可以具有天然序列或變體序列。
術語“抗原”是指引發免疫應答的分子。這種免疫應答可能涉及抗體產生或特異性免疫細胞的活化,或兩者兼有。所屬技術領域具有通常知識者將理解,任何大分子,包括基本上所有的蛋白質或肽,都可以用作抗原。此外,抗原可以衍生自重組或基因組DNA。在本文的一些實施方案中,第一抗原、第二抗原是兩種不同的抗原。
術語“腫瘤相關抗原”或“癌症抗原”可互換地指與正常細胞相比,較佳在癌細胞表面完全或作為片段(例如,MHC/肽)表達的分子(通常為蛋白質、碳水化合物或脂質),並且該分子可用在藥劑對癌細胞的優先靶向中。
術語“免疫檢查點分子”意指免疫系統中存在的一類抑制性信號分子,藉由調節外周組織中免疫反應的持續性和強度避免組織損傷,並參與維持對於自身抗原的耐受。
術語“細胞因子”是由一種細胞群釋放,作為細胞間介質作用於另一細胞的蛋白質的通稱。
“免疫綴合物”是與一個或多個其它物質(包括但不限於細胞毒性劑或標記)綴合的抗體。
如本文中使用的,術語“EGFR”是指表皮生長因子受體,是一種酪胺酸激酶受體,是一個巨大的跨膜糖蛋白,分子量約為170KDa,屬於ErbB受體家族的一個成員,是NSCLC最常見的癌變驅動基因,EGFR激活突變區主要
發生在EGFR外顯子18-21酪胺酸激酶結構域,EGFR抗體的結合區主要位於EGFR胞外配體結構域區,可避免耐藥突變的發生;同時,EGFR抗體可藉由抑制EGFR與配體的結合而抑制腫瘤細胞的生長,也可利用自身特定ADCC(抗體依賴細胞介導的細胞毒性作用)與免疫細胞共同殺傷腫瘤,這樣可藉由多種作用機制,共同發揮抗腫瘤殺傷作用。
術語“B7-H3”、“B7H3”和“CD276”在本文中可互換使用。B7-H3是屬於B7/CD28超家族成員的I型跨膜糖蛋白,與PD-L1的胞外結構域在序列上相似。B7-H3具有316個胺基酸,其中包含一個推定的由28個胺基酸組成的信號肽,一個217個胺基酸組成的胞外區以及一個跨膜區和一個45個胺基酸組成的胞質結構域,分子量約為45-66kDa。在人體中,由於外顯子複製,B7-H3的胞外結構可以為IgV-IgC樣結構域(2Ig-B7-H3),或者為IgV-IgC-IgV-IgC樣結構域(4Ig-B7-H3)。食蟹猴B7-H3的序列與其人類對應物具有約90%的同源性。
“效應子功能”指那些可歸於抗體Fc區且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應子功能的實例包括:C1q結合和補體依賴性細胞毒性(CDC);Fc受體結合;抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC);吞噬作用;細胞表面受體(例如B細胞受體)下調;和B細胞活化。
術語“GlymaxX技術”是從ProBioGen公司開發的增加雙抗ADCC效應的技術平臺,其是一個穩定過表達細菌RMD蛋白的CHO宿主細胞,藉由干擾受質GDP-fucose的形成,最終阻斷Fc區域的岩藻糖修飾,以此增強ADCC效應(WO2011035884A1)。
術語“有效量”指本發明的抗體或片段或綴合物或組成物的這樣的量或劑量,其以單一或多次劑量施用患者後,在需要治療或預防的患者中產生預
期效果。有效量可以由作為所屬技術領域具有通常知識者的主治醫師藉由考慮以下多種因素來容易地確定:諸如哺乳動物的物種;它的大小、年齡和一般健康;涉及的具體疾病;疾病的程度或嚴重性;個體患者的應答;施用的具體抗體;施用模式;施用製劑的生物利用率特徵;選擇的給藥方案;和任何伴隨療法的使用。
“治療有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段,有效實現所需治療結果的量。抗體或抗體片段或其綴合物或組成物的治療有效量可以根據多種因素如疾病狀態、個體的年齡、性別和重量和抗體或抗體部分在個體中激發所需反應的能力而變動。治療有效量也是這樣的一個量,其中抗體或抗體片段或其綴合物或組成物的任何有毒或有害作用不及治療有益作用。相對於未治療的對象,“治療有效量”較佳地抑制可度量參數(例如腫瘤生長率)至少約20%、更佳地至少約40%、甚至更佳地至少約50%、60%或70%和仍更佳地至少約80%。可以在預示人腫瘤中的功效的動物模型系統中評價化合物抑制可度量參數(例如,癌症)的能力。可選地,可以藉由檢驗化合物抑制的能力評價組成物的這種特性,該抑制在體外藉由熟練所屬技術領域具有通常知識者已知的測定法。
“預防有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段,有效實現所需預防結果的量。通常,由於預防性劑量在對象中在疾病較早階段之前或在疾病較早階段使用,故預防有效量將小於治療有效量。
術語“可變區”或“可變結構域”是指參與抗體與抗原結合的抗體重或輕鏈的結構域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變結構域通常具有相似的結構,其中每個結構域包含四個保守的構架區(FR)和三個互補決定區(CDR)。(參見,例如,Kindt等Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.91頁(2007))。單個VH或VL結構域可以足以給予抗原結合特異性。此外,可以使用來自與特定
抗原結合的抗體的VH或VL結構域來分離結合該抗原的抗體,以分別篩選互補VL或VH結構域的文庫。
術語“宿主細胞”指已經向其中引入外源多核苷酸的細胞,包括這類細胞的子代。宿主細胞包括“轉化體”和“轉化的細胞”,這包括原代轉化的細胞和從其衍生的子代,而不考慮傳代的數目。後代在核酸內容上可能與親本細胞不完全相同,而是可以包含突變。本文中包括在最初轉化的細胞中篩選或選擇的具有相同功能或生物學活性的突變體後代。宿主細胞是可以用來產生本發明抗體分子的任何類型的細胞系統,包括真核細胞,例如,哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞;和原核細胞,例如,大腸桿菌細胞。宿主細胞包括培養的細胞,也包括轉基因動物、轉基因植物或培養的植物組織或動物組織內部的細胞。
術語“抗腫瘤作用”指可以藉由多種手段展示的生物學效果,包括但不限於例如,腫瘤體積減少、腫瘤細胞數目減少、腫瘤細胞增殖減少或腫瘤細胞存活減少。
術語“腫瘤”和“癌症”在本文中互換地使用,涵蓋實體瘤和液體腫瘤。
術語“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳動物中特徵通常為細胞生長不受調節的生理疾患。在某些實施方案中,適合於藉由本發明的抗體來治療的癌症包括上皮來源的癌症,例如皮膚癌(例如皮膚鱗癌、頭頸癌如頭頸部鱗狀細胞癌)、食管癌(例如:食管鱗狀癌)、腸癌(例如:結腸癌、直腸癌、結直腸癌)或肺癌(例如非小細胞肺癌、肺鱗癌、肺腺癌),包括那些癌症的轉移性形式。
術語“腫瘤”指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖,無論是惡性的還是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。術語“癌症”、“癌性”和“腫瘤”在本文中提到時並不互相排斥。
術語“感染性疾病”是指病原體引發的疾病,包括例如病毒感染、細菌感染、真菌感染或者原生動物例如寄生蟲感染。
術語“慢性感染”是指這樣的感染,其中傳染原(例如,病原體如病毒、細菌、原生動物例如寄生蟲、真菌或諸如此類)已經在感染的宿主中誘導了免疫應答,但尚未如在急性感染過程中一樣被從宿主中清除或消除。
本文所使用的術語“標記”是指被直接或間接綴合或融合至試劑(諸如多核苷酸探針或抗體)並且促進其所綴合或融合的試劑的檢測的化合物或組成物。標記本身可以是可檢測的(例如,放射性同位素標記或螢光標記)或在酶促標記的情況下可以催化可檢測的受質化合物或組成物的化學改變。術語旨在涵蓋藉由將可檢測物質偶聯(即,物理連接)至探針或抗體來直接標記探針或抗體,以及藉由與直接被標記的另一種試劑反應來間接標記探針或抗體。間接標記的實例包括使用螢光標記的二級抗體進行的一級抗體的檢測和具有生物素的DNA探針的末端標記,使得其可以用螢光標記的鏈黴抗生素蛋白來檢測。
“個體”或“受試者”包括哺乳動物。哺乳動物包括但不限於,家養動物(例如,牛、羊、貓、狗和馬)、靈長類動物(例如,人和非人靈長類動物如猴)、兔、以及齧齒類動物(例如,小鼠和大鼠)。在一些實施方案中,個體或受試者是人。
“分離的”抗體是這樣的抗體,其已經與其天然環境的組分分離。在一些實施方案中,將抗體純化至超過95%或99%純度,如藉由例如電泳(例
如,SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如,離子交換或反相HPLC)確定的。對於用於評估抗體純度的方法的綜述,參見,例如,Flatman等,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
“分離的”核酸是指這樣的核酸分子,其已經與其天然環境的組分分離。分離的核酸包括包含在通常包含該核酸分子的細胞中的核酸分子,但是該核酸分子存在於染色體外或在不同於其天然染色體位置的染色體位置處。
如下進行序列之間序列同一性的計算。為確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的同一性百分數,將該序列出於最佳比較目的比對(例如,可以為了最佳比對而在第一和第二胺基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以為比較目的而拋棄非同源序列)。在一個較佳實施方案中,為比較目的,所比對的參考序列的長度是至少30%、較佳地至少40%、更佳地至少50%、60%和甚至更佳地至少70%、80%、90%、100%的參考序列長度。隨後比較在對應胺基酸位置或核苷酸位置處的胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置由第二序列中對應位置處的相同胺基酸殘基或核苷酸佔據時,則該分子在這個位置處是相同的。
可以利用數學算法實現兩個序列間的序列比較和同一性百分數的計算。在一個較佳實施方案中,使用已經集成至GCG軟體包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970) J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可獲得),使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣和空位權重16、14、12、10、8、6或4和長度權重1、2、3、4、5或6,確定兩個胺基酸序列之間的同一性百分數。在又一個較佳的實施方案中,使用GCG軟體包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可獲得),使用NWSgapdna.CMP矩陣和空位權重40、50、
60、70或80和長度權重1、2、3、4、5或6,確定兩個核苷酸序列之間的同一性百分數。特別佳的參數集合(和除非另外說明否則應當使用的一個參數集合)是採用空位罰分12、空位延伸罰分4和移碼空位罰分5的Blossum 62評分矩陣。還可以使用PAM120加權餘數表、空位長度罰分12,空位罰分4),利用已經併入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法((1989)CABIOS,4:11-17)確定兩個胺基酸序列或核苷酸序列之間的同一性百分數。額外地或備選地,可以進一步使用本文所述的核酸序列和蛋白質序列作為“查詢序列”以針對公共數據庫執行檢索,以例如鑑定其他家族成員序列或相關序列。
術語“醫藥組成物”指這樣的組成物,其以允許包含在其中的活性成分的生物學活性有效的形式存在,並且不包含對施用該組成物的受試者具有不可接受的毒性的另外的成分。
術語“藥用輔料”指與活性物質一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全的))、載體、賦形劑或穩定劑等。
用於本文時,“治療”指減緩、中斷、阻滯、緩解、停止、降低、或逆轉已存在的症狀、病症、病況或疾病的進展或嚴重性。想要的治療效果包括但不限於防止疾病出現或復發、減輕症狀、減小疾病的任何直接或間接病理學後果、防止轉移、降低病情進展速率、改善或緩和疾病狀態,以及緩解或改善預後。在一些實施方案中,本發明的抗體分子用來延緩疾病發展或用來減慢疾病的進展。
用於本文時,“預防”包括對疾病或病症或特定疾病或病症的症狀的發生或發展的抑制。在一些實施方式中,具有癌症家族病史的受試者是預防性
方案的候選。通常,在癌症的背景中,術語“預防”是指在癌症的病徵或症狀發生前,特別是在具有癌症風險的受試者中發生前的藥物施用。
術語“有效量”指本發明的抗體或片段或組成物或組合的這樣的量或劑量,其以單一或多次劑量施用患者後,在需要治療或預防的患者中產生預期效果。
“治療有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段,有效實現所需治療結果的量。治療有效量也是這樣的一個量,其中抗體或抗體片段或組成物或組合的任何有毒或有害作用不及治療有益作用。相對於未治療的對象,“治療有效量”較佳地抑制可度量參數或改善可度量參數至少約40%、甚至更佳地至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%甚至100%。
“預防有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段,有效實現所需預防結果的量。通常,由於預防性劑量在對象中在疾病較早階段之前或在疾病較早階段使用,故預防有效量將小於治療有效量。
本文所述的術語“治療劑”涵蓋在預防或治療疾病,例如腫瘤(例如癌症)和感染(例如慢性感染)中有效的任何物質,包括抗血管發生劑、化療劑、細胞毒性劑、疫苗、其它抗體、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑。
“化療劑”包括在治療癌症中有用的化學化合物,包括但不限於抗腫瘤劑,包括烷化劑;抗代謝物;天然產物;抗生素;酶;雜類試劑;激素和拮抗劑;抗雌激素;抗雄激素;以及非類固醇抗雄激素等。
本文使用的術語“免疫調節劑”指抑制或調節免疫應答的天然或合成活性劑或者藥物。免疫應答可以是體液應答或細胞應答。免疫調節劑包括免疫檢查點分子抑制劑和共刺激性分子激活劑。
術語“小分子藥物”是指低分子量的能夠調節生物過程的有機化合物。
如本文所用,術語“細胞毒性劑”指抑制或阻止細胞功能和/或造成細胞死亡或破壞的物質。細胞毒性劑包括但不限於放射性同位素;化療藥或藥物;生長抑制劑;酶及其片段如溶核酶;抗生素;毒素如細菌源、真菌源、植物源或動物源的小分子毒素或酶活性毒素,包括其片段和/或變體。
“腫瘤免疫逃逸”指腫瘤逃避免疫識別和清除的過程。如此,作為治療概念,腫瘤免疫在此類逃避減弱時得到“治療”,並且腫瘤被免疫系統識別並攻擊。腫瘤識別的例子包括腫瘤結合,腫瘤收縮和腫瘤清除。
“免疫原性”指特定物質引發免疫應答的能力。腫瘤是免疫原性的,並且增強腫瘤免疫原性有助於藉由免疫應答清除腫瘤細胞。
如本文中使用的,“抗體的激動劑活性”指抗體能活化它所結合的抗原的生物學活性。
“抗血管發生劑”指阻斷或在某種程度上干擾血管發育的化合物。抗血管發生劑可以是例如結合涉及促進血管發生的生長因子或生長因子受體的小分子或抗體。
術語“藥物組合或組合產品”是指非固定組合產品或固定組合產品,包括但不限於藥盒、醫藥組成物。術語“非固定組合”意指活性成分(例如,(i)本發明的免疫綴合物、以及(ii)其他治療劑)以分開的實體被同時、無特定時間限制或以相同或不同的時間間隔、依次地施用於患者,其中這類施用在患者體內提供預防或治療有效水平的兩種或更多種活性劑。術語“固定組合”意指兩種或更多種活性劑以單個實體的形式被同時施用於患者。較佳對兩種或更多種活性劑的
劑量和/或時間間隔進行選擇,從而使各部分的聯合使用能夠在治療疾病或病症時產生大於單獨使用任何一種成分所能達到的效果。各成分可以各自呈單獨的製劑形式,其製劑形式可以相同也可以不同。
術語“組合療法”或“聯合療法”是指施用兩種或更多種治療劑以治療如本揭露所述的癌症或感染。這種施用包括以基本上同時的方式共同施用這些治療劑,例如以具有固定比例的活性成分的單一膠囊。或者,這種施用包括對於各個活性成分在多種或在分開的容器(例如片劑、膠囊、粉末和液體)中的共同施用或分開施用或依次施用。粉末和/或液體可以在施用前重構或稀釋至所需劑量。在一些實施方案中,施用還包括以大致相同的時間,或在不同的時間以順序的方式,使用每種類型的治療劑。在任一情況下,治療方案將提供藥物組合在治療本文所述的病症或病狀中的有益作用。
術語“載體”當在本文中使用時是指能夠增殖與其相連的另一個核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複製核酸結構的載體以及結合到已經引入其的宿主細胞的基因組中的載體。一些載體能夠指導與其有效相連的核酸的表達。這樣的載體在本文中被稱為“表達載體”。
“受試者/患者樣品”指從患者或受試者得到的細胞或流體的集合。組織或細胞樣品的來源可以是實體組織,像來自新鮮的、冷凍的和/或保存的器官或組織樣品或活檢樣品或穿刺樣品;血液或任何血液組分;體液,諸如腦脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或間隙液;來自受試者的妊娠或發育任何時間的細胞。組織樣品可能包含在自然界中天然不與組織混雜的化合物,諸如防腐劑、抗凝劑、緩衝劑、固定劑、營養物、抗生素等等。腫瘤樣品的例子在本文中包括但不限於腫瘤活檢、細針吸出物、支氣管灌洗液、胸膜液(胸水)、痰液、尿液、
手術標本、循環中的腫瘤細胞、血清、血漿、循環中的血漿蛋白質、腹水、衍生自腫瘤或展現出腫瘤樣特性的原代細胞培養物或細胞系,以及保存的腫瘤樣品,諸如福爾馬林固定的、石蠟包埋的腫瘤樣品或冷凍的腫瘤樣品。
II.本發明的抗體分子
本發明提供了一種新型的抗體分子,其能夠用於多種疾病的免疫治療、預防和/或診斷。本發明的抗體分子包含至少2個、3個或4個抗原結合區,其能夠作為雙特異性抗體或多特異性抗體發揮作用,較佳地,其能夠作為雙特異性抗體發揮作用。
在一些實施方案中,本發明的雙特異性抗體或多特異性抗體包含針對EGFR的第一結合特異性和針對B7H3的第二結合特異性,以及視需要地其他結合特異性。
因此,本發明的一個方面涉及一種雙特異性抗體,其包含
第一抗原結合區和第二抗原結合區,其中第一抗原結合區特異性結合EGFR,和/或第二抗原結合區特異性結合B7-H3。
可以使用本領域已知的雙特異性抗體形式或技術來製備本發明的雙特異性抗體。可以在本發明的背景下使用的具體示例性雙特異性形式參見例如,Labrijn,et al.Bispecific antibodies:a mechanistic review of the pipeline.Nature Reviews Drug Discovery,2019,18(8):1-24。在一個實施方案中,雙特異性抗體形式包含IgG樣抗體(Fan等人(2015)Journal of Hematology & Oncology.8:130)。最常見的IgG樣抗體類型包含兩個Fab區域和兩個Fc區域,每個Fab的重鏈和輕鏈可以來自單獨的單株抗體。在一些實施方案中,本發明的雙特異性抗體是IgG
樣雙特異性抗體,其包含特異性結合EGFR的Fab片段作為一個抗原結合區和特異性結合B7H3的Fab片段作為另一個抗原結合區。
在一些實施方案中,特異性結合EGFR的抗原結合區來源於特異性結合EGFR的抗體,例如WO02100348A2中揭露的EGFR抗體,例如Zalutumumab單抗。
在一些實施方案中,特異性結合EGFR的抗原結合區包含已知的特異性結合EGFR的抗體例如WO02100348A2中揭露的EGFR抗體,例如Zalutumumab單抗的1、2、3、4、5、或6個CDR。
在一些實施方案中,特異性結合EGFR的抗原結合區包含已知的特異性結合EGFR的抗體例如WO02100348A2中揭露的EGFR抗體,例如Zalutumumab單抗的1、2和3個重鏈可變區CDR,即HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些實施方案中,特異性結合EGFR的抗原結合區包含已知的特異性結合EGFR的抗體例如WO02100348A2中揭露的EGFR抗體,例如Zalutumumab單抗的1、2和3個輕鏈可變區CDR,即LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中,特異性結合EGFR的抗原結合區包含已知的特異性結合EGFR的抗體例如WO02100348A2中揭露的EGFR抗體,例如Zalutumumab單抗的3個重鏈可變區CDR和3個輕鏈可變區CDR。
在一些實施方案中,特異性結合EGFR的抗原結合區包含已知的特異性結合EGFR的抗體例如WO02100348A2中揭露的EGFR抗體,例如Zalutumumab單抗的重鏈可變區和輕鏈可變區。
在一些實施方案中,特異性結合EGFR的抗原結合區包含已知的特異性結合EGFR的抗體例如WO02100348A2中揭露的EGFR抗體,例如Zalutumumab單抗的Fab。
在一些實施方案中,特異性結合EGFR的抗原結合區包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR),HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些實施方案中,特異性結合EGFR的抗原結合區包含3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR),LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些實施方案中,特異性結合EGFR的抗原結合區包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR)和3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR)。
在一些方面中,特異性結合EGFR的抗原結合區包含重鏈可變區(VH)。在一些方面中,特異性結合EGFR的抗原結合區包含輕鏈可變區(VH)。在一些方面中,特異性結合EGFR的抗原結合區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。在一些實施方案中,該重鏈可變區包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(CDR),HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些實施方案中,該輕鏈可變區包含3個來自輕鏈可變區的互補決定區(CDR),LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中,特異性結合EGFR的抗原結合區的重鏈可變區
(i)包含與SEQ ID NO:1的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:1的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;或者
(iii)包含與SEQ ID NO:1的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個,更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換,更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成,較佳地,該胺基酸改變不發生在CDR區中。
在一些實施方案中,特異性結合EGFR的抗原結合區的輕鏈可變區
(i)包含與SEQ ID NO:2的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:2的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;或者
(iii)包含與SEQ ID NO:2的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個,更較佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換,更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成,較佳地,該胺基酸改變不發生在CDR區中。
在一些實施方案中,特異性結合EGFR的抗原結合區的3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR),HCDR1、HCDR2和HCDR3選自
(i)如SEQ ID NO:1中所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3,或
(ii)相對於(i)中任一項的序列,在該三個HCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的序列,
例如該CDR藉由Kabat方案確定。
在一些實施方案中,特異性結合EGFR的抗原結合區的3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR),LCDR1、LCDR2和LCDR3選自
(i)如SEQ ID NO:2所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3,或
(ii)相對於(i)中任一項的序列,在該三個LCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的序列,
例如該CDR藉由Kabat方案確定。
在一些實施方案中,特異性結合EGFR的抗原結合區包含3個由SEQ ID NO:1的胺基酸序列組成的重鏈可變區所含的互補決定區(HCDR)以及3個由SEQ ID NO:2的胺基酸序列組成的輕鏈可變區所含的互補決定區(LCDR)。
在一些實施方案中,HCDR1包含SEQ ID NO:9的胺基酸序列,或由該胺基酸序列組成,或者HCDR1包含與SEQ ID NO:9的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中,HCDR2包含SEQ ID NO:10的胺基酸序列,或由該胺基酸序列組成,或者HCDR2包含與SEQ ID NO:10的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中,HCDR3包含SEQ ID NO:11的胺基酸序列,或由該胺基酸序列組成,或者HCDR3包含與SEQ ID NO:11的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中,LCDR1包含SEQ ID NO:12的胺基酸序列,或由該胺基酸序列組成,或者LCDR1包含與SEQ ID NO:12的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中,LCDR2包含SEQ ID NO:13的胺基酸序列,或由該胺基酸序列組成,或者LCDR2包含與SEQ ID NO:13的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中,LCDR3包含SEQ ID NO:14的胺基酸序列,或由該胺基酸序列組成,或者LCDR3包含與SEQ ID NO:14的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的胺基酸序列。
在本發明的一些具體實施方案中,特異性結合EGFR的抗原結合區包含如上所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、和/或LCDR3。
在本發明的一些具體實施方案中,特異性結合EGFR的抗原結合區包含如上所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、和LCDR3。
在本發明的一些具體實施方案中,特異性結合EGFR的抗原結合區包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中
HCDR1包含SEQ ID NO:9的胺基酸序列或由該序列組成;
HCDR2包含SEQ ID NO:10的胺基酸序列或由該序列組成;
HCDR3包含SEQ ID NO:11的胺基酸序列或由該序列組成;
LCDR1包含SEQ ID NO:12的胺基酸序列或由該序列組成;
LCDR2包含SEQ ID NO:13的胺基酸序列或由該序列組成;且
LCDR3包含SEQ ID NO:14的胺基酸序列或由該序列組成。
在本發明的一些具體實施方案中,特異性結合EGFR的抗原結合區包含如SEQ ID NO:9所示的HCDR1、如SEQ ID NO:10所示的HCDR2、如SEQ ID NO:11所示的HCDR3;如SEQ ID NO:12所示的LCDR1、如SEQ ID NO:13所示的LCDR2和如SEQ ID NO:14所示的LCDR3。
在本發明的一些具體實施方案中,特異性結合EGFR的抗原結合區包含VH和VL,其中
該VH含有SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,和該VL含有SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在本發明的一些具體實施方案中,特異性結合EGFR的抗原結合區包含VH和VL,其中VH和VL分別包含如下所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成:SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
在一些實施方案中,特異性結合B7-H3的抗原結合區來源於特異性結合B7-H3的抗體,例如PCT/CN2021/140449中描述的B7-H3抗體,例如其中編號為Hz20G5的單抗(例如本發明實施例中提及的Hz20G5.26)。
在一些實施方案中,特異性結合B7-H3的抗原結合區包含已知的特異性結合B7-H3的抗體例如PCT/CN2021/140449中描述的B7-H3抗體,例如其中編號為Hz20G5的單抗的1、2、3、4、5、或6個CDR。
在一些實施方案中,特異性結合B7-H3的抗原結合區包含已知的特異性結合B7-H3的抗體例如PCT/CN2021/140449中描述的B7-H3抗體,例如其中編號為Hz20G5的單抗的1、2和3個重鏈可變區CDR,即HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些實施方案中,特異性結合B7-H3的抗原結合區包含已知的特異性結合B7-H3的抗體例如PCT/CN2021/140449中描述的B7-H3抗體,例如其中編號為Hz20G5的單抗的1、2和3個輕鏈可變區CDR,即LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中,特異性結合B7-H3的抗原結合區包含已知的特異性結合B7-H3的抗體例如PCT/CN2021/140449中描述的B7-H3抗體,例如其中編號為Hz20G5的單抗的3個重鏈可變區CDR和3個輕鏈可變區CDR。
在一些實施方案中,特異性結合B7-H3的抗原結合區包含已知的特異性結合B7-H3的抗體例如PCT/CN2021/140449中描述的B7-H3抗體,例如其中編號為Hz20G5的單抗的重鏈可變區和輕鏈可變區。
在一些實施方案中,特異性結合B7-H3的抗原結合區包含已知的特異性結合B7-H3的抗體例如PCT/CN2021/140449中描述的B7-H3抗體,例如其中編號為Hz20G5的單抗的Fab。
在一些實施方案中,特異性結合B7-H3的抗原結合區包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR),HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些實施方案中,特異性結合B7-H3的抗原結合區包含3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR),LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些實施方案中,特異性結合B7-H3的抗原結合區包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR)和3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR)。
在一些方面中,特異性結合B7-H3的抗原結合區包含重鏈可變區(VH)。在一些方面中,特異性結合B7-H3的抗原結合區包含輕鏈可變區(VH)。在一些方面中,特異性結合B7-H3的抗原結合區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可
變區(VL)。在一些實施方案中,該重鏈可變區包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(CDR),HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些實施方案中,該輕鏈可變區包含3個來自輕鏈可變區的互補決定區(CDR),LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中,特異性結合B7-H3的抗原結合區的重鏈可變區
(i)包含與SEQ ID NO:3、5或7的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:3、5或7的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;或者
(iii)包含與SEQ ID NO:3、5或7的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個,更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換,更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成,較佳地,該胺基酸改變不發生在CDR區中。
在一些實施方案中,特異性結合B7-H3的抗原結合區的輕鏈可變區
(i)包含與SEQ ID NO:4、6或8的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;或者
(ii)包含SEQ ID NO:4、6或8的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;或者
(iii)包含與SEQ ID NO:4、6或8的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個,更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換,更佳
胺基酸保守置換)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成,較佳地,該胺基酸改變不發生在CDR區中。
在一些實施方案中,特異性結合B7-H3的抗原結合區的3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR),HCDR1、HCDR2和HCDR3選自
(i)如SEQ ID NO:3、5或7中所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3,或
(ii)相對於(i)中任一項的序列,在該三個HCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的序列,
例如該HCDR1採用Abm方案,該HCDR2、HCDR3藉由Kabat方案確定。
在一些實施方案中,特異性結合B7-H3的抗原結合區的3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR),LCDR1、LCDR2和LCDR3選自
(i)如SEQ ID NO:4、6或8所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3,或
(ii)相對於(i)中任一項的序列,在該三個LCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的序列,
例如該CDR藉由Kabat方案確定。
在一些實施方案中,特異性結合B7-H3的抗原結合區包含3個由SEQ ID NO:3、5或7的胺基酸序列組成的重鏈可變區所含的互補決定區(HCDR)以及3個由SEQ ID NO:4、6或8的胺基酸序列組成的輕鏈可變區所含的互補決定區(LCDR)。
在一些實施方案中,HCDR1包含SEQ ID NO:15、21或27的胺基酸序列,或由該胺基酸序列組成,或者HCDR1包含與SEQ ID NO:15、21或
27的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中,HCDR2包含SEQ ID NO:16、22或28的胺基酸序列,或由該胺基酸序列組成,或者HCDR2包含與SEQ ID NO:16、22或28的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中,HCDR3包含SEQ ID NO:17、23或29的胺基酸序列,或由該胺基酸序列組成,或者HCDR3包含與SEQ ID NO:17、23或29的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中,LCDR1包含SEQ ID NO:18、24或30的胺基酸序列,或由該胺基酸序列組成,或者LCDR1包含與SEQ ID NO:18、24或30的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中,LCDR2包含SEQ ID NO:19、25或31的胺基酸序列,或由該胺基酸序列組成,或者LCDR2包含與SEQ ID NO:19、25或31的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中,LCDR3包含SEQ ID NO:20、26或32的胺基酸序列,或由該胺基酸序列組成,或者LCDR3包含與SEQ ID NO:20、26或32的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的胺基酸序列。
在本發明的一些具體實施方案中,特異性結合B7-H3的抗原結合區包含如上所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、和/或LCDR3。
在本發明的一些具體實施方案中,特異性結合B7-H3的抗原結合區包含如上所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、和LCDR3。
在本發明的一些具體實施方案中,特異性結合B7-H3的抗原結合區包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中
(i)HCDR1包含如SEQ ID NO:15所示的胺基酸序列或由該序列組成,HCDR2包含如SEQ ID NO:16所示的胺基酸序列或由該序列組成,HCDR3包含如SEQ ID NO:17所示的胺基酸序列或由該序列組成,
LCDR1包含如SEQ ID NO:18所示的胺基酸序列或由該序列組成,LCDR2包含如SEQ ID NO:19所示的胺基酸序列或由該序列組成,LCDR3包含如SEQ ID NO:20所示的胺基酸序列或由該序列組成;或,
(ii)HCDR1包含如SEQ ID NO:21所示的胺基酸序列或由該序列組成,HCDR2包含如SEQ ID NO:22所示的胺基酸序列或由該序列組成,HCDR3包含如SEQ ID NO:23所示的胺基酸序列或由該序列組成,
LCDR1包含如SEQ ID NO:24所示的胺基酸序列或由該序列組成,LCDR2包含如SEQ ID NO:25所示的胺基酸序列或由該序列組成,LCDR3包含如SEQ ID NO:26所示的胺基酸序列或由該序列組成;或,
(iii)HCDR1包含如SEQ ID NO:27所示的胺基酸序列或由該序列組成,HCDR2包含如SEQ ID NO:28所示的胺基酸序列或由該序列組成,HCDR3包含如SEQ ID NO:29所示的胺基酸序列或由該序列組成,
LCDR1包含如SEQ ID NO:30所示的胺基酸序列或由該序列組成,LCDR2包含如SEQ ID NO:31所示的胺基酸序列或由該序列組成,LCDR3包含如SEQ ID NO:32所示的胺基酸序列或由該序列組成。
在本發明的一些具體實施方案中,特異性結合B7-H3的抗原結合區包含
(i)如SEQ ID NO:15所示的HCDR1、如SEQ ID NO:16所示的HCDR2、如SEQ ID NO:17所示的HCDR3;如SEQ ID NO:18所示的LCDR1、如SEQ ID NO:19所示的LCDR2和如SEQ ID NO:20所示的LCDR3;
(ii)如SEQ ID NO:21所示的HCDR1、如SEQ ID NO:22所示的HCDR2、如SEQ ID NO:23所示的HCDR3;如SEQ ID NO:24所示的LCDR1、如SEQ ID NO:25所示的LCDR2和如SEQ ID NO:26所示的LCDR3;或
(iii)如SEQ ID NO:27所示的HCDR1、如SEQ ID NO:28所示的HCDR2、如SEQ ID NO:29所示的HCDR3;如SEQ ID NO:30所示的LCDR1、如SEQ ID NO:31所示的LCDR2和如SEQ ID NO:32所示的LCDR3。
在本發明的一些具體實施方案中,特異性結合B7-H3的抗原結合區包含VH和VL,其中
(i)該VH包含SEQ ID NO:3所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:3的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,且該VL包含SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:4的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;
(ii)該VH包含SEQ ID NO:5所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:5的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,且該VL包含SEQ ID NO:6所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:6的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;或
(iii)該VH包含SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:7的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,且該VL包含SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:8的胺基酸序列具有至少80%、85%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在本發明的一些具體實施方案中,特異性結合B7-H3的抗原結合區包含VH和VL,其中VH和VL分別包含如下所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成:
SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4;
SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6;或
SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
本發明還涉及包含上述特異性結合B7-H3的抗原結合區的特異性結合B7-H3的抗體,例如包含本發明所定義的HCDR1、HCDR2和HCDR3,以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗體;或包含本發明所定義的VH或VL的抗體,或包含本發明所定義的VH和VL的抗體。
在一些實施方案中,本發明的抗體分子,例如多特異性抗體(例如雙特異性抗體)還包含Fc區,其中所包含的Fc區可以相同或不同。
在一些實施方案中,該Fc區具有低岩藻糖基化,例如藉由GlymaxX技術處理後獲得的低岩藻糖基化。
在一些實施方案中,本發明的抗體分子包含第一Fc區和第二Fc區,其中第一Fc區和第二Fc區相同或不同。
在一些實施方案中,第一Fc區和第二Fc區不同,其能夠二聚化形成異二聚體Fc支架。
在本文中,Fc區是指含有至少一部分的恆定區的免疫球蛋白重鏈的C-端區域,並且可以包括天然序列Fc區和變體Fc區。天然序列F區涵蓋天然存在的各種免疫球蛋白Fc序列,例如各種Ig亞型以及其同種異型的Fc區(Gestur Vidarsson等,IgG subclasses and allotypes:from structure to effector functions,20 October 2014,doi:10.3389/fimmu.2014.00520)。在一些實施方案中,本發明的Fc區包含抗體CH2和CH3。在一些實施方案中,抗體Fc區還可以在N端帶有IgG鉸鏈區或部分IgG鉸鏈區,例如,IgG1鉸鏈區或部分IgG1鉸鏈區,例如根據EU編號,D221到P230的序列。在該鉸鏈區中可以含有突變。
除非本文中另外指出,Fc區中的胺基酸殘基的編號根據EU編號系統,也稱為EU索引,如Kabat,E.A.等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242中所述。
在一些實施方案中,Fc區為人的IgG Fc,例如,人IgG1 Fc、人IgG2 Fc、人IgG3 Fc或人IgG4 Fc。在一個實施方案中,Fc區包含胺基酸序列SEQ ID NO:46或47或與其具有至少90%同一性,例如95%、96%、97%、99%或更高的同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
如所屬技術領域具有通常知識者理解的,為了促進本發明的多特異性抗體作為異二聚體的形成,本發明多特異性抗體所包含的Fc區可以包含利於第一Fc區與第二Fc區異二聚化的突變。在一個實施方案中,在兩個Fc區的CH3區中引入突變。
本領域已知促進Fc區異二聚化的方法。例如,第一Fc區的CH3區和第二Fc區的CH3區以互補方式進行工程化改造使得每個CH3區(或包含它的重鏈)不再能與其自身同二聚化但被迫與互補工程化改造的其它CH3區異二聚化(使得第一和第二Fc區的CH3區異二聚化且兩個第一CH3區或兩個第二CH3區之間不形成同二聚體)。
較佳地,基於Knob-in-Hole技術,在第一Fc區和第二Fc區中引入相應的Knob突變和Hole突變。此技術參見例如US 5,731,168;US 7,695,936;Ridgway等,Prot Eng 9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)。
在一個特定的實施方案中,在一個Fc區的CH3區中,第366位的蘇胺酸殘基用色胺酸殘基替換(T366W)(knob突變);而在另一個Fc區的CH3區中,第407位的酪胺酸殘基用纈胺酸殘基替換(Y407V)(hole突變),視需要地366位的蘇胺酸殘基用絲胺酸殘基替換(T366S)且第407位的酪胺酸殘基用纈胺酸殘基替換(Y407V)(編號方式依照EU索引)。
在又一個實施方案中,在一個Fc區的CH3區中,第366位的蘇胺酸殘基用色胺酸殘基替換(T366W)且第354位的絲胺酸殘基用半胱胺酸殘基替換(S354C)或第356位的谷胺酸殘基用半胱胺酸殘基替換(E356C)(特別是,第354位的絲胺酸殘基用半胱胺酸殘基替換);而在另一個Fc區的CH3區中,第407位的酪胺酸殘基用纈胺酸殘基替換(Y407V)(hole突變),視需要地366位的蘇胺酸殘基用絲胺酸殘基替換(T366S)且第368位的亮胺酸殘基用丙胺酸殘基替換(L368A)(編號方式依照EU索引),視需要地第349位的酪胺酸殘基用半胱胺酸殘基替換(Y349C)(編號方式依照EU索引)。
在一個具體的實施方案中,一個Fc區包含胺基酸替代T366W,且另一個Fc區包含胺基酸替代T366S、L368A和Y407V(編號方式依照EU索引)。
在一個具體的實施方案中,一個Fc區包含胺基酸替代S354C和T366W,且另一個Fc區包含胺基酸替代Y349C、T366S、L368A和Y407V(編號方式依照EU索引)。
還可以基於Innobody技術,在第一Fc區和第二Fc區中引入相應的突變。此技術參見例如PCT/CN2021/143141。
在一個特定的實施方案中,
該第一CH3區包含S364R/K突變(較佳地S364R),以及視需要的一個或多個其他突變。在一些實施方案中,該第二CH3區包含K370S/T/A/V突變(較佳地K370S),以及視需要的一個或多個其他突變。在一些實施方案中,該第一CH3區包含S364R/K突變,且該第二CH3區包含K370S/T/A/V突變。在一些實施方案中,該第一CH3區包含S364R突變,且該第二CH3區包含K370S突變。
在一些實施方案中,該第一CH3區包含S364R/K(較佳地S364R)和D399K/R(較佳地D399K)突變。在一些實施方案中,該第二CH3區包含K370S/T/A/V(較佳地K370S)突變和K409D/E(較佳地K409D)突變。在一些實施方案中,該第一CH3區包含S364R/K+D399K/R,且該第二CH3區包含K370S/T/A/V+Y349T/S/A/V。在一些實施方案中,該第一CH3區包含S364R+D399K,且該第二CH3區包含K370S+Y349T。在一些實施方案中,該第一CH3區還包含E375N/Q(較佳地E375N)和/或T350V/A(較佳地T350V)。在一些實施方案中,該第二CH3區還包含K409D/E(較佳地K409D)、Q347D/E(較佳地Q347D)和/或T350V/A(較佳地T350V)。
在一些實施方案中,該第一CH3區包含S364R+D399K,且該第二CH3區包含K370S+Y349T+K409D。在一些實施方案中,該第一CH3區還包含E357N。在一些實施方案中,該第二CH3區還包含Q347D。在一些實施方案中,該第一CH3區還包含E357N,且該第二CH3區還包含Q347D。在一些實施方案中,該第一CH3區和該第二CH3區還分別包含T350V,或都包含T350V。
因此,在一些實施方案中,該第一CH3區包含S364R+D399K,且該第二CH3區包含K370S+Y349T+K409D+Q347D。在一些實施方案中,該第一CH3區包含S364R+D399K+E357N,且該第二CH3區包含K370S+Y349T+K409D+Q347D。在一些實施方案中,該第一CH3區包含S364R+D399K+E357N+T350V,且該第二CH3區包含K370S+Y349T+K409D+Q347D+T350V。
在一些實施方案中,該第一CH3區包含K409E/D(較佳地K409E)。在一些實施方案中,該第二CH3區包含D399K/R(較佳地D399K)或
K370T/S/A/V(較佳地K370T)。在一些實施方案中,該第一CH3區包含K409E/D(較佳地K409E),且該第二CH3區包含D399K/R(較佳地D399K)。在一些實施方案中,該第一CH3區還包含T411R/K(較佳地T411R)。在一些實施方案中,該第二CH3區還包含K370T/S/A/V(較佳地K370T)。在一些實施方案中,該CH3區包含K409E/D+T411R/K,且該第二CH3區包含D399K/R+K370T/S/A/V。在一些實施方案中,該CH3區包含K409E+T411R,且該第二CH3區包含D399K+K370T。
在一些具體的實施方案中,該第一和第二CH3區具有以下突變組合:
在一個實施方案中,一個Fc區的CH3包含S364R和D399K突變,且另一個Fc區的CH3突變包含Y349T、K370S和K409D突變。
因此,在一個具體的實施方案中,本發明的多特異性抗體包含的兩個Fc區異二聚化,其中
a)一個Fc區多肽包含突變T366W,而另一個Fc區多肽包含T366S、L368A和Y407V,或
b)一個Fc-區多肽包含突變S354C和T366W,而另一個Fc-區多肽包含突變Y349C、T366S、L368A和Y407V,或
c)一個Fc-區多肽包含突變S364R和D399K,而另一個Fc-區多肽包含突變Y349T、K370S和K409D。
因此,在一個具體的實施方案中,本發明的多特異性抗體包含的兩個Fc區異二聚化,其中一個Fc區多肽包含SEQ ID NO:49或50所示的胺基酸序列或由其組成,而另一個Fc區多肽包含SEQ ID NO:52或53所示的胺基酸序列或由其組成。
因此,在一個具體的實施方案中,本發明的多特異性抗體包含的兩個Fc區異二聚化,其中一個Fc區多肽包含與SEQ ID NO:49或50所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性的胺基酸序列,而另一個Fc區多肽包含與SEQ ID NO:52或53所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性的胺基酸序列。
因此,在一個具體的實施方案中,本發明的多特異性抗體包含的兩個Fc區異二聚化,其中一個Fc區多肽包含與SEQ ID NO:49或50所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性的胺基酸序列且包含突變Y349T、K370S和K409D,而另一個Fc區包含與SEQ ID NO:52或53所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性的胺基酸序列且包含突變S364R和D399K。
在一些實施方案中,Fc區還包含其他利於異二聚體純化的突變。
在本發明的一個實施方案中,本文所述的胺基酸改變包括胺基酸的置換、插入或缺失。較佳的,本文所述的胺基酸改變為胺基酸置換,較佳地保守置換。
在較佳的實施方案中,本發明所述的胺基酸改變發生在CDR外的區域(例如在FR中)。更佳地,本發明所述的胺基酸改變發生在重鏈可變區外和/或輕鏈可變區外的區域。
在一些實施方案中,置換為保守性置換。保守置換是指一個胺基酸經相同類別內的另一胺基酸置換,例如一個酸性胺基酸經另一酸性胺基酸置換,一個鹼性胺基酸經另一鹼性胺基酸置換,或一個中性胺基酸經另一中性胺基酸置換。示例性的置換如下表A所示:
在某些實施方案中,本文中所提供的抗體經改變以增加或降低抗體糖基化的程度。
可製備具有改變類型的糖基化的抗體,例如具有減小量的岩藻糖基殘基的低岩藻糖化抗體或具有增加的等分GlcNac結構的抗體。例如,可以消除恆定區(例如Fc區)中的岩藻糖基化,例如獲得低或無岩藻糖基化。
這類改變的糖基化模式已顯示可增加抗體的ADCC能力。可藉由例如在具有改變的糖基化體系的宿主細胞中表達抗體來實現這類糖類修飾。舉例而言,在α-1,6-岩藻糖基轉移酶8(Fut8)剔除的宿主細胞表達無岩藻糖基化的抗體(WO2000061739)。舉例而言,藉由在引入編碼與糖鏈修飾相關的酶RMD的宿主細胞中獲得低或者無鹽藻糖基化的抗體(GlymaxX技術,ProBioGen AG,參見專利公開號:WO2011035884A1)。備選地,可使用岩藻糖苷酶切除抗體的岩
藻糖殘基;舉例而言,岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶自抗體去除岩藻糖基殘基(Tarentino等人(1975)Biochem.14:5516-23)。
在一些實施方案中,本發明的抗B7-H3/EGFR雙特異性抗體具有如下一種或多種性質:
(1)本發明的雙特異性抗體一方面可以阻斷EGFR配體與EGFR的結合,抑制生物信號傳遞,阻斷腫瘤相應生物活性;另一方面會刺激EGFR內吞而最終被細胞內溶酶體等降解;
(2)本發明的雙特異性抗體採用了對EGFR低親和力的EGFR抗體親本序列,極大降低了系列EGFR單株抗體對皮膚等正常上皮組織帶來的毒副作用;
(3)本發明的雙特異性抗體在EGER低親和力的基礎上引用B7-H3高親和力的抗體親本序列,極大提高了EGFR信號阻斷活性,提高了本發明雙特異性抗體的藥效生物活性和藥效安全窗口;
(4)本發明的雙特異性抗體為低岩藻糖基化的抗體;
(5)本發明的雙特異性抗體具有較高的藥效生物活性和安全性;
(6)本發明的雙特異性抗體具有優良的腫瘤殺傷和抑制效果;
(7)本發明的雙特異性抗體具有優良的ADCC體內外藥效活性;
(8)本發明的雙特異性抗體與KRAS小分子抑制劑聯用具有優良的抗腫瘤效果,特別是協同效果。
在一些實施方案中,在本發明的抗體分子中,特異性結合EGFR的抗原結合區與重鏈恆定區CH連接,例如其中的重鏈可變區與重鏈恆定區CH連接,例如其中的重鏈可變區的C末端與重鏈恆定區CH的N末端連接。在一
些實施方案中,在本發明的抗體分子中,特異性結合EGFR的抗原結合區與輕鏈恆定區連接,例如其中的輕鏈可變區與輕鏈恆定區CL連接,例如其中的輕鏈可變區的C末端與輕鏈恆定區CL的N末端連接。在一些實施方案中,在本發明的抗體分子中,特異性結合EGFR的抗原結合區中,重鏈可變區與重鏈恆定區CH連接且輕鏈可變區與輕鏈恆定區CL連接。
在一些實施方案中,在本發明的抗體分子中,特異性結合B7-H3的抗原結合區與重鏈恆定區CH連接,例如其中的重鏈可變區與重鏈恆定區CH連接,例如其中的重鏈可變區的C末端與重鏈恆定區CH的N末端連接。在一些實施方案中,在本發明的抗體分子中,特異性結合B7-H3的抗原結合區與輕鏈恆定區連接,例如其中的輕鏈可變區與輕鏈恆定區CL連接,例如其中的輕鏈可變區的C末端與輕鏈恆定區CL的N末端連接。在一些實施方案中,在本發明的抗體分子中,特異性結合B7-H3的抗原結合區中,重鏈可變區與重鏈恆定區CH連接且輕鏈可變區與輕鏈恆定區CL連接。
在一些實施方案中,該重鏈恆定區包含CH1和Fc區,經由或不經由鉸鏈區連接。
在一些實施方案中,該重鏈恆定區為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區,例如人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4的重鏈恆定區。在一些方案中,該CH1包含SEQ ID NO:42所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:42的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在一些實施方案中,該輕鏈恆定區為kappa輕鏈恆定區或lambda輕鏈恆定區,例如人Kappa或人Lambda輕鏈恆定區。在一些實施方案中,該輕
鏈恆定區包含SEQ ID NO:54所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:54的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在一些較佳的實施方案中,本發明提供了一種雙特異性抗體分子,其包含一個特異性結合EGFR的Fab片段,一個特異性結合B7-H3的Fab片段,以及Fc二聚體,其中特異性結合EGFR的Fab片段與一個Fc形成特異性結合EGFR的半抗體,且特異性結合B7-H3的Fab片段與一個Fc形成特異性結合B7-H3的半抗體。
在一些實施方案中,該雙特異性抗體為IgG樣抗體,其具有如圖1所示的構型。
在一些可實施方案中,該雙特異性抗體包含重鏈1和輕鏈1,以及重鏈2和輕鏈2,其中重鏈1和輕鏈1構成第一半抗體,且重鏈2和輕鏈2構成第二半抗體;其中重鏈1包含第一抗原結合區的重鏈可變區和第一重鏈恆定區;輕鏈1包含第一抗原結合區的輕鏈可變區和第一輕鏈恆定區;且重鏈2包含第二抗原結合區的重鏈可變區和第二重鏈恆定區;輕鏈2包含第二抗原結合區的輕鏈可變區和第二輕鏈恆定區。
在一些可實施方案中,該雙特異性抗體中,重鏈1包含SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:33的胺基酸序列具有至少80%、85%。90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在一些可實施方案中,該雙特異性抗體中,輕鏈1包含SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:34的胺基酸序列具有至少90%、
91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在一些可實施方案中,該雙特異性抗體中,重鏈1包含SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:33的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,且輕鏈1包含SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:34的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在一些可實施方案中,該雙特異性抗體中,重鏈2包含SEQ ID NO:35、37或39所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:35、37或39所示的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在一些可實施方案中,該雙特異性抗體中,輕鏈2包含SEQ ID NO:36、38或40所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:36、38或40所示的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在一些可實施方案中,該雙特異性抗體中,
(1)重鏈2包含SEQ ID NO:35所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:35所示的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;且輕鏈2包含SEQ ID NO:36所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:36所示的胺基酸序列具有至少90%、
91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;
(2)重鏈2包含SEQ ID NO:37所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:37所示的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;且輕鏈2包含SEQ ID NO:38所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:38所示的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;
(3)重鏈2包含SEQ ID NO:39所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:39所示的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;且輕鏈2包含SEQ ID NO:40所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:40所示的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在一些可實施方案中,該雙特異性抗體中,
重鏈1包含SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:33的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,且輕鏈1包含SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:34的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;且重鏈2和輕鏈2分別包含如下的SEQ ID NO:所示的胺基酸序列,或包含
與所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性的胺基酸序列,或由如下SEQ ID NO所示的序列組成:
i)SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36;
ii)SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38;
iii)SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。
在一些可實施方案中,該雙特異性抗體中,
(i)重鏈1包含SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列的重鏈,且輕鏈1包含SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列,
重鏈2包含SEQ ID NO:35所示的胺基酸序列,且輕鏈2包含SEQ ID NO:36所示的胺基酸序列;或,
(ii)重鏈1包含SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列,且輕鏈1包含SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列,
重鏈2包含SEQ ID NO:37所示的胺基酸序列,且輕鏈2包含SEQ ID NO:38所示的胺基酸序列;或,
(iii)重鏈1包含SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列,且輕鏈1包含SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列,
重鏈2包含SEQ ID NO:39所示的胺基酸序列,且輕鏈2包含SEQ ID NO:40所示的胺基酸序列。
III.免疫綴合物
在一些實施方案中,本發明還涵蓋與其他物質綴合的抗體。因此,本發明涉及免疫綴合物,其包含與其他物質綴合的抗體。(“免疫綴合物”)。在一些實施方案中,其它物質例如治療劑或標記,如細胞毒性劑、免疫調節劑(例如
免疫激動劑)或化療劑。細胞毒性劑包括任何對細胞有害的藥劑。適合於形成免疫綴合物的細胞毒性劑(例如化療劑)的例子是本領域中已知的。例如,細胞毒性劑包括但不限於:放射性同位素;生長抑制劑;酶及其片段如核酸水解酶;抗生素;毒素如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物起源的酶促活性毒素,包括其片段和/或變體;和已知的各種抗腫瘤或抗癌劑。
另外,本發明的抗體分子可以與標記序列(如肽)綴合以促進純化。
在其他實施方案中,本發明的抗體分子與診斷劑或可檢測劑綴合。這類抗體可以作為臨床檢驗方法的部分(如確定特定療法的效力),用於監測或預測疾病或病症的發作、形成、進展和/或嚴重性。可以藉由將抗體與可檢測物質偶聯實現這類診斷和檢測,該可檢測物質包括但不限於多種酶;輔基;螢光物質;發光物質;放射性物質;和用於各種正電子發射成像術中的正電子發射金屬和非放射性順磁金屬離子。
另外,本發明的抗體分子可以與調節給定生物學反應的治療性部分或藥物部分綴合。治療性部分或藥物部分包括但不限於經典的化學治療藥。例如,藥物部分可以是擁有所需生物學活性的蛋白質、肽或多肽。
另外,本發明的抗體分子可以綴合至治療性部分如放射性金屬離子。
抗體也可以連接至固相支持物,該支持物特別可用於免疫測定法或靶抗原的純化。
在一些實施方案中,該免疫綴合物用於預防或治療疾病,如急性和慢性炎性疾病、感染(例如,慢性感染)、腫瘤等。例如,該疾病是腫瘤(例如癌症)或感染。在一些實施方案中,腫瘤是腫瘤免疫逃逸。較佳地,腫瘤是上皮
來源的癌症,例如胃腸道腫瘤或肺部腫瘤或皮膚腫瘤,例如皮膚癌(例如皮膚鱗癌、頭頸癌如頭頸部鱗狀細胞癌)、食管癌(例如:食管鱗狀癌)、腸癌(例如:結腸癌、直腸癌、結直腸癌)或肺癌(例如非小細胞肺癌、肺鱗癌、肺腺癌)。在一些實施方案中,感染是慢性感染。在一些實施方案中,感染是例如細菌感染、病毒感染、真菌感染、原生動物感染等。
IV.本發明的核酸以及包含其的宿主細胞
在一方面,本發明提供了編碼以上任何抗體或其片段或其任一條鏈的核酸。在一個實施方案中,提供包含該核酸的載體。在一個實施方案中,載體是表達載體。在一個實施方案中,提供包含該核酸或該載體的宿主細胞。在一個實施方案中,宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中,宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞(例如CHO細胞或293細胞)或適用於製備抗體或其抗原結合片段的其它細胞。在另一個實施方案中,宿主細胞是原核的。
例如,本發明的核酸包含編碼選自SEQ ID NO:3-8和33-40中任一項所示胺基酸序列的核酸,或編碼與選自SEQ ID NO:3-8和33-40中任一項所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列的核酸。
如所屬技術領域具有通常知識者明瞭的,因為密碼子簡併性,每一個抗體或多肽胺基酸序列可以由多種核酸序列編碼。編碼本發明分子的核酸序列可以採用本領域熟知的方法,例如藉由從頭固相DNA合成,或藉由PCR擴增而產生。
在一方面,本發明提供編碼以上任何抗體或任何抗體鏈的核酸。當從適宜的表達載體表達時,由該核酸編碼的多肽能夠顯示人EGFR/或B7-H3抗原結合能力。
在再一方面,本發明提供編碼以上任何雙特異性抗體的核酸。當從適宜的表達載體表達時,由該核酸編碼的多肽能夠顯示人EGFR/或B7-H3抗原結合能力。在一個實施方案中,編碼雙特異性抗體的各條鏈的核酸可以在相同的載體中或在不同的載體中。在另一個實施方案中,編碼雙特異性抗體的各條鏈的核酸可以引入相同或不同的宿主細胞以表達。因此,在一些實施方案中,本發明的雙特異性抗體的生產方法包括步驟:在適於表達該分子的各條鏈的條件下,培養包含編碼該各條鏈的核酸的宿主細胞,產生本發明雙特異性抗體。
在一個實施方案中,提供包含該核酸的一個或多個載體。在一個實施方案中,載體是表達載體,例如真核表達載體。載體包括但不限於病毒、質粒、黏粒、λ噬菌體或酵母人工染色體(YAC)。在一個實施方案中,載體是例如pcDNA載體,例如pcDNA3.1。
一旦已經製備了用於表達的表達載體或DNA序列,則可以將表達載體轉染或引入適宜的宿主細胞中。多種技術可以用來實現這個目的,例如,原生質體融合、磷酸鈣沉澱、電穿孔、逆轉錄病毒的轉導、病毒轉染、基因槍、基於脂質的轉染或其他常規技術。在原生質體融合的情況下,將細胞在培養基中培育並且篩選適宜的活性。用於培養所產生的轉染細胞和用於回收產生的抗體分子的方法和條件是所屬技術領域具有通常知識者已知的並且可以基於本說明書和現有技術已知的方法,根據使用的特定表達載體和哺乳動物宿主細胞變動或優化。
另外,可以藉由引入允許選擇已轉染的宿主細胞的一個或多個標記物,選出已經穩定將DNA摻入至其染色體中的細胞。
在一個實施方案中,提供了包含一種或多種本發明多核苷酸的宿主細胞。在一些實施方案中,提供了包含本發明表達載體的宿主細胞。在一個實施方案中,宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中,宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞例如CHO細胞(例如CHO-S,如ExpiCHO-S)或293細胞(例如293F或HEK293細胞))或適用於製備抗體或其片段的其它細胞。在一個實施方案中,宿主細胞是原核的,例如是細菌,例如大腸桿菌。
合適的宿主細胞包括原核微生物,如大腸桿菌。宿主細胞還可以是真核微生物如絲狀真菌或酵母,或各種真核細胞,例如昆蟲細胞等。也可以將脊椎動物細胞用作宿主。例如,可以使用被改造以適合於懸浮生長的哺乳動物細胞系。有用的哺乳動物宿主細胞系的例子包括SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7);人胚腎系(HEK 293或293F細胞)、293細胞、幼倉鼠腎細胞(BHK)、猴腎細胞(CV1)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76)、人宮頸癌細胞(HELA)、犬腎細胞(MDCK)、布法羅大鼠肝臟細胞(BRL 3A)、人肺細胞(W138)、人肝臟細胞(Hep G2)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)、CHOK1SV細胞、CHOK1SV GS-KO細胞、CHOS細胞、NSO細胞、骨髓瘤細胞系如Y0、NS0、P3X63和Sp2/0等。適於產生蛋白質的哺乳動物宿主細胞系的綜述參見例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo編著,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268頁(2003)。在一個較佳的實施方案中,該宿主細胞是CHO細胞,例如CHOS細胞CHOK1SV細胞或CHOK1SV GS-KO,或該宿主細胞是293細胞,例如HEK293細胞。在一些較佳的實施方案中,該宿主細胞是CHO細胞。在一個實施方案中,
本發明的宿主細胞為糖基化改造的宿主細胞,較佳為糖基化改造的CHO細胞。在一個實施方案中,該宿主細胞被工程化而表達RMD酶。在一個實施方案中,該宿主細胞包含編碼RMD酶的核酸。在一個實施方案中,該RMD酶包含SEQ ID NO:41所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,較佳地,該RMD酶來自銅綠假單胞菌。
在一個實施方案中,本發明的宿主細胞包含編碼本發明的抗體分子的一個或多個或全部的鏈的核酸和編碼RMD酶的核酸。
V.本發明的抗體分子的生產和純化
在一個實施方案中,本發明提供製備本發明抗體分子的方法,其中該方法包括在適於表達編碼本發明抗體分子的核酸的條件下培養該宿主細胞,以及視需要地分離該抗體。在某個實施方案中,該方法還包括從宿主細胞回收本發明抗體分子。
在一個實施方案中,提供了製備本發明抗體分子的方法,其中該方法包括,在適合抗體表達的條件下,培養包含編碼該抗體(例如任意一條多肽鏈和/或多條多肽鏈)的核酸或包含該核酸的表達載體的宿主細胞,如上文所提供的,和視需要地從該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。
為了重組產生本發明抗體分子,分離編碼抗體(例如上文所描述的抗體,例如任意一條多肽鏈和/或多條多肽鏈)的核酸,並將其插入一個或多個載體,用於在宿主細胞中進一步選殖和/或表達。此類核酸易於使用常規規程分離和測序(例如藉由使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針進行)。
如本文所述製備的抗體分子可以藉由已知的現有技術如高效液相色譜、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、大小排阻層析等純化。用來純化特定蛋白質的實際條件還取決於淨電荷、疏水性、親水性等因素,並且這些對所屬技術領域具有通常知識者是顯而易見的。可以藉由多種熟知分析方法中的任一種方法確定本發明的抗體分子的純度,該熟知分析方法包括大小排阻層析、凝膠電泳、高效液相色譜等。
VI.測定法
可以藉由本領域中已知的多種測定法對本文中提供的抗體分子鑑定,篩選,或表徵其物理/化學特性和/或生物學活性。一方面,對本發明的抗體測試其抗原結合活性,例如藉由已知的方法諸如ELISA,Western印跡等來進行。可使用本領域已知方法來測定對所結合抗原的結合,本文中揭露了例示性方法,例如生物膜層干涉技術和SPR。
本發明還提供了用於鑑定具有生物學活性的抗體的測定法。生物學活性可以包括例如結合抗原,對細胞表面抗原的結合、對抗原的抑制或激活作用等。還提供在體內和/或在體外具有此類生物學活性的抗體。
在某些實施方案中,對本發明的抗體測試此類生物學活性。
本發明還提供用於鑑定抗體的性質,例如成藥性相關性質的方法。該成藥性相關性質包括例如熱穩定性,例如長期熱穩定性。
供任何上述體外測定法使用的細胞包括天然表達抗原或經改造而表達抗原的細胞系。此類細胞還包括表達抗原的細胞系和並非正常情況下表達抗原的編碼抗原的DNA轉染的細胞系。
可以理解的是,能夠使用本發明的免疫綴合物替換或補充本發明的抗體分子來進行任何上述測定法。
可以理解的是,能夠使用本發明的抗體分子和別的活性劑來進行任何上述測定法。
在一些實施方案中,該抗原為EGFR(例如人EGFR)和/或B7-H3(例如人B7-H3)。
VII.醫藥組成物和藥物製劑
在一些實施方案中,本發明提供包含本文所述的任何抗體分子或其片段(較佳地其抗原結合片段)或其免疫綴合物的組成物,較佳地組成物為醫藥組成物。在一個實施方案中,該組成物還包含藥用輔料。在一個實施方案中,組成物,例如,醫藥組成物,包含本發明的抗體分子或其片段或其免疫綴合物,以及一種或多種其它治療劑的組合。
在一些實施方案中,其它治療劑選自抗血管發生劑、化療劑、其它抗體、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑(例如共刺激分子的激活劑或免疫檢查點分子的抑制劑);較佳地,該第二治療劑為小分子藥物,較佳地,該小分子藥物選自KRAS小分子抑制劑,例如KRAS G12C抑制劑(例如AMG510(Sotorasib)或GFH925)、KRAS G12D(例如MRTX1133)或KRAS G12S抑制劑。
在一些實施方案中,該組成物用於預防或治療疾病,如急性和慢性炎性疾病、感染(例如,慢性感染)、腫瘤等。例如,該疾病是腫瘤(例如癌症)或感染。在一些實施方案中,腫瘤是腫瘤免疫逃逸。較佳地,腫瘤是上皮來源的癌症,例如胃腸道腫瘤或肺部腫瘤或皮膚腫瘤,例如皮膚癌(例如皮膚鱗癌、頭
頸癌如頭頸部鱗狀細胞癌)、食管癌(例如:食管鱗狀癌)、腸癌(例如:結腸癌、直腸癌、結直腸癌)或肺癌(例如非小細胞肺癌、肺鱗癌、肺腺癌)。在一些實施方案中,感染是慢性感染。在一些實施方案中,感染是例如細菌感染、病毒感染、真菌感染、原生動物感染等。
本發明還包括包含本發明抗體或其免疫綴合物的組成物(包括醫藥組成物或藥物製劑)和/或包含編碼本發明抗體的多核苷酸的組成物(包括醫藥組成物或藥物製劑)。在某些實施方案中,組成物包含一種或多種本發明抗體或其片段或一種或多種編碼一種或多種本發明抗體或其片段的多核苷酸。
這些組成物還可以包含合適的藥用輔料,如本領域中已知的藥用載體、藥用賦形劑,包括緩衝劑。
如本文所用,“藥用載體”包括生理上相容的任何和全部溶劑、分散介質、等滲劑和吸收延遲劑等。適用於本發明的藥用載體可以是無菌液體,如水和油,包括那些石油、動物、植物或合成來源的,如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用醫藥組成物時,水是較佳的載體。還可以將鹽水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液體載體,特別是用於可注射溶液。
合適的賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、乾燥的脫脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。對於賦形劑的使用及其用途,亦參見“Handbook of Pharmaceutical Excipients”,第五版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。
若期望的話,該組成物還可以含有少量的潤濕劑或乳化劑,或pH緩衝劑。這些組成物可以採用溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉末、
持續釋放配製劑等的形式。口服配製劑可以包含標準藥用載體和/或賦形劑,如藥用級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精。
本發明的組成物可以處於多種形式。這些形式例如包括液體、半固體和固體劑型,如液態溶液劑(例如,可注射用溶液劑和可輸注溶液劑)、分散體劑或混懸劑、脂質體劑和栓劑。較佳的形式取決於預期的施用模式和治療用途。常見的較佳組成物處於可注射用溶液劑或可輸注溶液劑形式。較佳的施用模式是腸胃外(例如,靜脈內、皮下、腹腔(i.p.)、肌內)注射。在一個較佳實施方案中,藉由靜脈內輸注或注射施用抗體分子。在另一個較佳實施方案中,藉由肌內、腹腔或皮下注射施用抗體分子。
可以藉由將具有所需純度的本發明的抗體與一種或多種視需要的藥用輔料(Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.編(1980))混合來製備包含本文所述的抗體的藥物製劑,較佳地以凍乾製劑或水溶液的形式。
本發明的醫藥組成物或製劑還可以包含超過一種活性成分,該活性成分是被治療的特定適應證所需的,較佳具有不會不利地彼此影響的互補活性的那些活性成分。例如,理想的是還提供其它治療劑。在一些實施方案中,其它治療劑選自抗血管發生劑、化療劑、其它抗體、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑(例如共刺激分子的激活劑或免疫檢查點分子的抑制劑);較佳地,該第二治療劑為小分子藥物,較佳地,該小分子藥物選自KRAS小分子抑制劑,例如KRAS G12C抑制劑(例如AMG510(Sotorasib)或GFH925)、KRAS G12D(例如MRTX1133)或KRAS G12S抑制劑。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑的合適實例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半滲透基質,該基質呈成形物品,例如薄膜或微囊形式。
本發明的醫藥組成物適於靜脈內、肌內、皮下、腸胃外、直腸、脊髓或表皮施用(例如,藉由注射或輸注)。
治療性組成物一般應當是無菌的並且在製造和儲存條件下穩定。可以將組成物配製為溶液、微乳液、分散體、脂質體或凍乾形式。可以藉由將活性化合物(即抗體分子)以要求的量加入適宜的溶劑中,隨後過濾消毒,製備無菌可注射溶液劑。通常,藉由將該活性化合物併入無菌溶媒中來製備分散體,該無菌溶媒含有基礎分散介質和其他成分。可以使用包衣劑如卵磷脂等。在分散體的情況下,可以藉由使用表面活性劑來維持溶液劑的適宜流動性。可以藉由在組成物中包含延遲吸收的物質例如單硬脂酸鹽和明膠而引起可注射組成物的延長吸收。
包含本文所述抗體分子的試劑盒也處於本發明的範圍內。試劑盒可以包含一個或多個其他要素,例如包括:包裝插頁;其他試劑,例如標記物或用於偶聯的試劑;可藥用載體;和用於施用至受試者的裝置或其他材料。
VIII.組合產品或試劑盒
在一些實施方案中,本發明還提供了組合產品,其包含本發明的抗體或其抗原結合片段,或其免疫綴合物,以及一種或多種其它治療劑。在一些實施方案中,其它治療劑選自抗血管發生劑、化療劑、其它抗體、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑(例如共刺激分子的激活劑或免疫檢查點分子的抑制劑);較佳地,該第二治療劑為小分子藥物,較佳地,該小分子藥物選自KRAS小分子抑制劑,例如KRAS G12C抑制劑(例如
AMG510(Sotorasib)或GFH925)、KRAS G12D(例如MRTX1133)或KRAS G12S抑制劑。
在一些實施方案中,該組合產品用於預防或治療疾病,如急性和慢性炎性疾病、感染(例如,慢性感染)、腫瘤等。例如,該疾病是腫瘤(例如癌症)或感染。在一些實施方案中,腫瘤是腫瘤免疫逃逸。較佳地,腫瘤是上皮來源的癌症,例如胃腸道腫瘤或肺部腫瘤或皮膚腫瘤,例如皮膚癌(例如皮膚鱗癌、頭頸癌如頭頸部鱗狀細胞癌)、食管癌(例如:食管鱗狀癌)、腸癌(例如:結腸癌、直腸癌、結直腸癌)或肺癌(例如非小細胞肺癌、肺鱗癌、肺腺癌)。在一些實施方案中,感染是慢性感染。在一些實施方案中,感染是例如細菌感染、病毒感染、真菌感染、原生動物感染等。
在一些方案中,該組合產品中的兩種或多種成分可以依次、分開或同時聯合施用給受試者。
在一些實施方案中,本發明還提供了包含本發明的抗體、醫藥組成物、免疫綴合物或組合產品的試劑盒,以及視需要的指導施用的包裝插頁。
在一些實施方案中,本發明還提供了包含本發明的抗體、醫藥組成物、免疫綴合物、組合產品的藥物製品,視需要地,該藥物製品還包括指導施用的包裝插頁。
IX.本發明的抗體分子的用途
在另一方面中,本發明涉及預防或治療受試者的腫瘤(例如癌症)的方法,該方法包括向該受試者施用有效量的本文揭露的抗體分子或醫藥組成物或免疫綴合物或組合產品或試劑盒。在一些實施方案中,本發明受試者中的腫
瘤包括實體腫瘤和血液腫瘤。在一些實施方案中,腫瘤是腫瘤免疫逃逸。在一些實施方案中,該腫瘤是癌症。
在一些實施方案中,相比同一受試者相鄰的同一組織的正常細胞或臨近正常組織的正常細胞,或相比健康受試者相同組織的正常細胞,該腫瘤的腫瘤細胞具有以下一種或多種特徵:
(i)相比相鄰組織正常細胞或相比健康受試者中的相同組織的正常細胞,過度表達野生型EGFR(例如具有升高的核酸或蛋白質水平的野生型EGFR),和/或表達突變的EGFR,例如包含Passaro A,et al.Nat Cancer.2021中列出的突變的EGFR,較佳地,該突變的EGFR包含選自R521K、L858R、T790M、G719X、C797S、Y1069C、Exon19缺失(Del19)、Exon20ins(例如S768_D770dup)中的一個或多個突變,較佳地,該突變的EGFR包含R521K/Y1069C、R521K、L858R/T790M/C797S、Del19/T790M/C797S或S768_D770dup;
(ii)相比相鄰組織正常細胞或相比健康受試者中的相同組織的正常細胞,過度表達野生型KRAS(例如具有升高的核酸或蛋白質水平的野生型KRAS),或表達突變的KRAS,較佳地,該突變的KRAS包含G12位或G13位突變,例如G12D或G12C;
(iii)相比相鄰組織正常細胞或相比健康受試者中的相同組織的正常細胞,具有升高的核酸水平或蛋白水平的B7-H3;和/或
(iv)該腫瘤細胞對於酪胺酸激酶抑制劑,例如對一代(厄洛替尼Erlotinib)和三代(奧希替尼Osimertinib)耐藥,例如對於奧希替尼耐藥。
在另一方面中,本發明涉及預防或治療受試者的感染性疾病的方法,該方法包括向該受試者施用有效量的本文揭露的抗體分子或醫藥組成物或免疫綴合物或組合產品或試劑盒。在一個實施方案中,感染性疾病是慢性感染。
受試者可以是哺乳動物,例如,靈長類,較佳地,高級靈長類,例如,人類(例如,患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的風險的患者)。在一個實施方案中,受試者患有本文所述疾病(例如,如本文所述的腫瘤或感染或自身免疫性疾病)或具有患有本文所述疾病的風險。在某些實施方案中,受試者接受或已經接受過其它治療,例如化療治療和/或放射療法。
在其他方面,本發明提供抗體分子或其片段或其免疫綴合物或組成物或組合產品或試劑盒在生產或製備藥物中的用途,該藥物用於治療本文提及的相關疾病或病症。
在一些實施方案中,本發明的抗體或抗體片段或免疫綴合物或組成物或組合產品或試劑盒會延遲病症和/或與病症相關的症狀的發作。
在一些實施方案中,本發明的抗體或醫藥組成物或免疫綴合物或組合產品或試劑盒還能與一種或多種其它療法例如治療方式和/或其它治療劑組合施用,用於本文所述的預防和/或治療。
在一些實施方案中,治療方式包括外科手術(例如腫瘤切除術)或放射療法。
在一些實施方案中,治療劑選自抗血管發生劑、化療劑、其它抗體、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑。
在一些實施方案中,該小分子藥物選自KRAS小分子抑制劑,例如KRAS G12C抑制劑(例如AMG510(Sotorasib)或GFH925)、KRAS G12D(例如MRTX1133)或KRAS G12S抑制劑。
免疫調節劑包括免疫檢查點分子抑制劑和共刺激性分子激活劑。
在進一步的一些實施方案中,本發明的抗體或其片段與KRAS小分子抑制劑組合使用,該小分子抑制劑例如KRAS G12C抑制劑(例如AMG510(Sotorasib)或GFH925)、KRAS G12D(例如MRTX1133)或KRAS G12S抑制劑。
在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段可以與包含過繼轉移表達嵌合抗原受體(CAR)的T細胞(例如細胞毒性T細胞或CTL)的治療聯合施用。
在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段可以與抗腫瘤劑聯合施用。
在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段可以與細胞因子聯合施用。細胞因子可以作為與本發明的抗體分子的融合分子施用,或作為單獨的組成物施用。在一個實施方案中,本發明的抗體與一種、兩種、三種或更多種細胞因子(例如,作為融合分子或作為單獨組成物)組合施用。
在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段可以與本領域常規的癌症療法組合,常規的癌症療法包括但不限於:(i)放射療法;(ii)化學療法,或應用細胞毒藥物,其一般影響快速分裂的細胞;(iii)靶向療法,或特異性影響癌細胞蛋白去調節的藥劑;(iv)免疫療法,或增強宿主免疫應答(例如,疫苗);(v)
激素療法,或阻斷激素(例如,當腫瘤是激素敏感的時候),(vi)血管發生抑制劑,或阻斷血管形成和生長,和(vii)姑息護理。
在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段可以與增強宿主免疫功能的常規方法組合。
上文所述的各種組合療法可以進一步組合以用於治療。
此類組合療法涵蓋組合施用(其中兩種或更多種治療劑包含在同一配製劑或分開的配製劑中),和分開施用,在該情況中,可以在施用別的療法,例如治療方式和/或治療劑之前,同時,和/或之後發生本發明的抗體的施用。抗體分子和/或其他療法,例如治療劑或治療方式可以在活動性疾病期間或在緩解或活動度更小的疾病期間施用。抗體分子可以在其他治療前、與其他治療同時、治療後或在疾病緩解期間施用。
本發明的抗體(以及包含其的醫藥組成物或免疫綴合物,以及任何另外的治療劑)可以藉由任何合適的方法給藥,包括腸胃外給藥,肺內給藥和鼻內給藥,並且,如果局部治療需要,病灶內給藥。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下給藥。在一定程度上根據用藥是短期或長期性而定,可藉由任何適合途徑,例如藉由注射,例如靜脈內或皮下注射用藥。本文中涵蓋各種用藥時程,包括,但不限於,單次給藥或在多個時間點多次給藥、推注給藥及脈衝輸注。
為了預防或治療疾病,本發明的抗體的合適劑量(當單獨或與一種或多種其他的治療劑組合使用時)將取決於待治療疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重性和進程、該抗體是以預防目的施用還是以治療目的施用、以前的治
療、患者的臨床病史和對該抗體的應答,和主治醫師的判斷力。該抗體以一次治療或經過一系列治療合適地施用於患者。
可以由所屬技術領域具有通常知識者確定本發明抗體分子的劑量和治療方案。在一些實施方案中,調整劑量方案以提供最佳的所需反應(例如,治療反應)。
在一些實施方案中,本發明的抗體(以及包含其的醫藥組成物或免疫綴合物)(單獨或與其他治療劑組合)可以在一週兩次,或者一週一次,或者兩週一次施用。
可以理解的是,能夠使用本發明的免疫綴合物或組成物或組合產品或試劑盒替換或補充本發明的抗體來進行任何治療。
實施例1.抗B7-H3/EGFR雙特異性抗體構建
本發明的抗B7-H3/EGFR雙特異性抗體分子是藉由信達生物製藥(蘇州)有限公司蛋白科學Innobody技術平臺(申請號:PCT/CN2021/143141,發明名稱:含異二聚體抗體Fc的蛋白以及其製備方法)或者採用本領域常規方法,將抗B7-H3抗體親本和抗EGFR抗體親本組裝成IgG1的抗體形式(如圖1所示)。該雙特異性抗體形式含有四條多肽鏈,並且可以和兩種抗原結合,抗原A為EGFR,抗原B為B7-H3。
其中,用於構建雙特異性抗體的親本抗體為抗EGFR單株抗體抗Zalutumumab(後文簡稱Zalu,公開號:WO02100348A2,發明名稱:Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor(EGFR))和抗B7-H3單株抗體,其來源於信達生物融合瘤技術篩選平臺並經抗體人源化得到抗B7-H3單株抗體Hz20G5.26、Hz19A2.25的抗原結合區序列(申請號:PCT/CN2021/140449,
發明名稱:抗B7-H3抗體及其用途中的Hz20G5、Hz19A2)和來源於信達生物融合瘤技術篩選平臺並經抗體人源化得到抗B7-H3單株抗體Hz5C2.9的抗原結合區序列;同時,採用Innobody技術在Fc區進行突變提高特異性抗體異源二聚體形成(申請號:PCT/CN2021/143141,發明名稱:含異二聚體抗體Fc的蛋白以及其製備方法)。篩選獲得了三種同時結合B7H3和EGFR的雙特異性抗體,分別編號為Hz5C2.9/Zalu bsAb、Hz19A2.25/Zalu bsAb和Hz20G5.26/Zalu bsAb雙特異性抗體分子,具體的胺基酸序列編號參見表1和表A-序列信息,三種雙特異性抗體均採用IgG樣式的結構,具體結構示意圖參見圖1。
表1. B7H3/EGFR bsAb分子以及陽性對照Gp120/Zalu序列詳情
1 Zhou, T., Xu, L., Dey, B. et al. Structural definition of a conserved neutralization epitope on HIV-1 gp120. Nature 445, 732-737 (2007)
實施例2.抗B7-H3/EGFR雙特異性抗體分子的製備
1、雙特異性抗體分子質粒構建
分別將表1所列的抗EGFR抗體的重鏈序列,抗EGFR抗體的輕鏈序列,抗B7-H3抗體的重鏈序列,抗B7-H3抗體的輕鏈序列插入到載體pcDNA3.1(Invitrogen,V790-20)中,分別得到抗EGFR端的重鏈質粒、輕鏈質粒,抗B7-H3端的重鏈質粒、輕鏈質粒。
2、雙特異性抗體製備過程
利用GlymaxX技術(ProBioGen AG,參見專利公開號:WO2011035884A1,該申請的所有內容為本發明之目的完整併入本文作為參考),藉由PEI MAX(Polysciences,A804355)將RMD酶(GDP-6-deoxy-D-lyxo-4-hexylose reductase,序列:SEQ ID NO:41)質粒分別與抗EGFR親本抗體的重鏈質粒、輕鏈質粒和抗B7-H3親本抗體的重鏈質粒和輕鏈質粒共同瞬時轉染到ExpiCHO(Invitrogen,A29133)細胞中,表達低岩藻糖含量的抗EGFR和抗B7-H3端的抗體親本。7天後收穫細胞發酵液,將其過濾澄清,分別用Hitrap Mabselect Sure層析管柱(GE Healthcare,11-0034-95)進行捕獲,得到抗EGFR親本和B7H3親本的抗體。
採用A280法檢測濃度之後,將抗體親本按莫耳比例1:1混合,加入適量還原劑GSH,室溫反應過夜,超濾去除還原劑,終止反應。採用MonoS陽離子交換層析管柱(GE Healthcare,17-5168-01)進行精細純化,抗B7-H3親本液為20mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.6),抗EGFR親本液為含有1M氯化鈉的20mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.6),沖提梯度為0-50%(30管柱體積)。將沖提得到的蛋白溶液超濾並換液至PBS(Gibco,70011-044),用SEC-HPLC進行純度檢測。
實施例3. Hz20G5.26/Zalu bsAb雙特異性抗體分子親和力檢測
採用生物膜薄層干涉測定技術(BLI)測定本發明雙特異性抗體結合B7H3和EGFR的親和力(KD)。
實驗開始前半個小時,根據樣品數量,取合適數量的AHC傳感器(18-5060,Sartorius)浸泡於SD緩衝液(1x PBS,0.1% BSA,0.05% Tween-20)中。將上述製備的抗體和人B7H3(B73-H52E2,Acro Biosystem)、人EGFR(EGR-H5222,Acro Biosystem)分別稀釋至100nM。
分別將SD緩衝液、抗體溶液、人B7H3、人EGFR分別加入到96孔黑色聚苯乙烯微孔板(Greiner,655209)中。使用Fortebio Octet Red96e進行檢測,根據樣品位置布板,選擇傳感器位置。儀器設置參數如下:運行步驟:平衡基線120s、加樣固化抗體100s、平衡基線120s、結合抗原100s和解離120s,轉速為1000rpm,溫度為30℃。實驗完成後,使用ForteBio Octet分析軟體分析KD值,結果見下表2。
實施例4.抗B7-H3/EGFR雙特異性抗體分子篩選
採用Innobody技術平臺,將抗B7-H3和抗EGFR抗體親本序列表達和組裝成Hz5C2.9/Zalu bsAb、Hz19A2.25/Zalu bsAb和Hz20G5.26/Zalu bsAb雙特異性抗體分子。藉由抗體對細胞的增殖抑制實驗(Growth inhibition assay)和抗體依賴的細胞介導的細胞毒性實驗(ADCC cell report),對B7H3/Zalu bsAb雙特異性抗體分子在非小細胞肺癌(NSCLC)和頭頸鱗癌(HNSCC)進行體外活性檢測,同時在人皮膚鱗癌細胞系(A431)進行安全性驗證。
細胞系來源和培養基:
PC9(NSCLC):上海鈺博生物,YB-H3210D;培養基:MEM+10% FBS+1% Pen/strep
TE-1(HNSCC):CoBioer,CBP60655;培養基:RPMI 1640+10% FBS+1% Pen/strep
SK-MES-1(NSCLC):CoBioer,CBP60152;培養基:MEM+1% NEAA+1mM丙酮酸鈉+10% FBS+1% Pen/strep
A431:皮膚鱗癌細胞,ATCC,CRL-1555;培養基:DMEM+10% FBS+1% Pen/strep
PC9+hB7H3和CHO-S+hB7H3細胞系構建:構建和包裝Lentvirus+hB7H3慢病毒(hB7H3(UniProt,Q5ZPR3-1),Lentvirus(PPL質粒與蛋白共享庫,BC000141)),用Lentvirus+hB7H3分別感染PC9(NSCLC,上海鈺博生物,YB-H3210)和CHO-S(Thermo),藉由加壓篩選和分選獲得出PC9+hB7H3和CHO-S+hB7H3穩轉細胞系。
實驗方法:
1.增殖抑制實驗(Growth inhibition assay)
(1)、NSCLC:1500-2500 cells/100ul鋪96孔低吸附板(Corning,CLS7007-24EA),進行3D細胞培養。
HNSCC:1500-2000 cells/100ul鋪96孔白底板(NUNC,136101),進行2D細胞培養。
(2)、將提前稀釋準備好的抗體分子(最高濃度300nM,3.16倍稀釋)加到相應細胞孔板中,混合均勻,37℃ 5% CO2培養5天。
(3)、增殖抑制實驗持續培養5天後,將提前準備好的Cell-Titer試劑(Promega,G7572)加入相應細胞孔中,室溫避光靜止15-25分鐘,HNSCC細胞直接進行多功能酶標儀(Molecular Devices,Spectra MAXi3)檢測。
(4)、NSCLC:將Cell-Titer和細胞混合液轉入96孔白底板(NUNC,136101),多功能酶標儀(Molecular Devices,Spectra MAXi3)檢測。
結果見圖2。其中存活細胞百分比(% of surviving cells)(圖2A、圖2B、圖2C、圖2D和圖2F)是檢測的細胞相對存活率,相應細胞標註以及所屬類別參見圖2以及附圖說明,如PC9是NSCLC一種,TE-1是HNSCC一種。其中A431是皮膚鱗癌細胞,其不響應抗體治療,目的是用來衡量藥物副反應。
圖2E中的生長抑制百分比(Growth inhibition%)是根據圖2結果(存活細胞%(% of surviving cells))進行分析和統計後得出的,具體如下:在抗體300nM最高濃度下,藥物在每種細胞的最大細胞抑制率,計算方法:300nM,(1-% of surviving cells)×100%。
在HNSCC和NSCLC細胞系中,Hz5C2.9/Zalu bsAb、Hz19A2.25/Zalu bsAb和Hz20G5.26/Zalu bsAb三種雙抗特異性分子增值抑制實驗結果(圖
2A、B和C)顯示,三種特異性雙抗分子在HNSCC和NSCLC中均有明顯腫瘤殺傷作用,其中Hz20G5.26/Zalu bsAb這個雙抗特異性分子不僅藥效優異,而且在A431體外藥效差(圖2D),預示Hz20G5.26/Zalu bsAb可減少或降低EGFR抗體系列臨床用藥的皮膚毒性等副反應。
2.ADCC報告實驗(ADCC cell report assay)
(1)、按照效靶比(10:1),將靶細胞(上文構建的CHO-S+hB7H3或NCI-H522(CoBioer,CBP60140))和ADCC效應細胞(Promega,G7102)混合均勻至96孔白底板(NUNC,136101)。
(2)、將提前稀釋準備好的抗體分子(對於CHO-S+HB7H3的檢測:抗體稀釋後終濃度中,最高6.25nM,4倍系列稀釋;對於NCI-H522的檢測:抗體稀釋後終濃度中,最高100nM,4倍系列稀釋)加到相應細胞孔板中,混合均勻,37℃ 5% CO2培養20小時。
(3)、將提前準備好的Bio-glo試劑(Promega,G755B)加入細胞孔板中,室溫避光靜止10-15分鐘,多功能酶標儀(Molecular Devices,Spectra MAXi3)檢測。
實驗結果見圖3,其中縱坐標是以IgG1為對照獲取的針對IgG1的倍數
在NSCLC和HNSCC腫瘤細胞系中,藉由細胞增殖抑制(圖2)和ADCC報告實驗(圖3),實驗結果發現,Hz20G5.26/Zalu bsAb體外藥效整體最佳;在A431皮膚鱗癌細胞系中,Hz20G5.26/Zalu bsAb體外毒性活性最低(用於衡量EGFR抑制劑對與人體皮膚的毒性)。因此,本發明的雙抗,特別是Hz20G5.26/Zalu bsAb對人體皮膚毒性較小,且在不引起或弱引起毒副反應時,有更大的有效安全藥物劑量,即其具有更寬的藥效選擇窗口,藥效更安全。
實施例5. Hz20G5.26/Zalu bsAb雙特異性抗體分子增殖抑制體外藥效活性
EGFR配體與腫瘤細胞表面的EGFR結合後,EGFR會形成同源二聚體,將信號傳遞到細胞內,藉由各種級聯反應,將使腫瘤細胞產生增殖、侵襲、轉移和抗凋亡等生物活性。
Hz20G5.26/Zalu bsAb中抗EGFR的抗原結合部分與腫瘤細胞表面的EGFR結合後,一方面可以阻斷EGFR配體與EGFR的結合,抑制生物信號傳遞,阻斷腫瘤相應生物活性;另一方面會刺激EGFR內吞而最終被細胞內溶酶體等降解。EGFR是一個上皮源廣譜酪胺酸激酶受體,Hz20G5.26/Zalu bs Ab採用了對EGFR低親和力的EGFR抗體親本序列,極大降低了EGFR單株抗體對皮膚等正常上皮組織帶來的毒副作用。B7-H3在多種腫瘤細胞系高表達,在正常組織器官低表達,是一個選擇性極高和表達譜廣泛的TAA,Hz20G5.26/Zalu bs Ab在EGER低親和力的基礎上引用B7-H3高親和力Hz20G5.26親本,極大提高了EGFR信號阻斷活性,提高了Hz20G5.26/Zalu bs Ab藥效生物活性和藥效安全窗口。
實施例5.1.腫瘤細胞系B7-H3和EGFR表達檢測
Hz20G5.26/Zalu bsAb對腫瘤細胞系的藥物敏感性與腫瘤細胞表面的受體表達豐度有一定的正相關關係。從NSCLC(非小細胞肺癌)、HNSCC(頭頸部鱗狀細胞癌)、CRC(結腸癌)和正常細胞系中篩選部分細胞系進行B7-H3和EGFR相對表達檢測,根據B7-H3和EGFR在細胞表面的表達豐度進行體外Hz20G5.26/Zalu bsAb藥效活性檢測和驗證,實驗結果如圖4所示。
實驗方法:
1、將各種細胞用FACS緩衝液重新懸浮,取100000-200000細胞鋪96孔板(Corning,CLS3799-50EA),將10ug/ml EGFR抗體(Cetuximab)、10ug/ml B7-H3抗體(Hz20G5.26mAb)和10ug/ml IgG加入細胞孔板,4度孵育1小時。
2、PBS洗滌兩次,將準備好的APC-anti human Fc抗體(Biolegend,410712),加入相應細胞孔板,4℃孵育30-40分鐘。
3、PBS洗滌兩次,FACS檢測(BD,Celesta),結果見圖4。
圖4顯示了不同細胞系中的B7H3表達以及EGFR的表達情況,其中B7H3表達較高且依賴於EGFR信號通路的細胞系(例如後續藉由測序分析得到的包含有EGFR突變的細胞系(結果未顯示)或者EGFR過表達的細胞系)可以被選擇用於雙特異性抗體的活性檢測。
實施例5.2. Hz20G5.26/Zalu bsAb雙特異性抗體分子在多種腫瘤細胞系增殖抑制實驗
EGFR在多種實體瘤細胞表面高表達,如肺癌(30%-80%)、頭頸鱗癌(36%-100%)、結直腸癌(25%-77%)、食管癌(43%-89%)等,是一個廣譜的抗腫瘤酪胺酸激酶靶點蛋白。EGFR作為一個廣譜抗腫瘤靶點蛋白,在非小細胞肺癌患者突變類型中突變率也最高(全球平均突變率約為35%,中國達到40%),在攜帶EGFR突變的NSCLC患者中,經典突變(L858R、T790M或Exon19 deletion)占85-90%;EGFR exon 20ins、T790M原發點突變和複合突變以及以G719X為代表的位於外顯子18-21間的其他點突變及其序列重複突變等非常見突變占EGFR突變比例約為10%。
H1975-EGFRL858R/T790M/C797S、PC9+B7H3-EGFRDel19/T790M/C797S和H322-EGFRS768_D770dup細胞系構建:分別構建和包裝Lentvirus+EGFRL858R/T790M/C797S、
Lentvirus+EGFRDel19/T790M/C797S和Lentvirus+EGFRS768_D770dup病毒,分別用Lentvirus+EGFRL858R/T790M/C797S、Lentvirus+EGFRDel19/T790M/C797S和Lentvirus+EGFRS768_D770du病毒感染NCI-H1975(ATCC,CRL-5908)、PC9+hB7H3(如上所述構建)和H322,藉由加壓篩選,獲得H1975-EGFRL858R/T790M/C797S、PC9+B7H3-EGFRDel19/T790M/C797S和H322-EGFRS768_D770dup穩轉細胞系。
實驗方法:
增殖抑制實驗
(1)、NSCLC:1500-2500 cells/100ul鋪96孔低吸附板(Corning,CLS7007-24EA),進行3D細胞培養,其中應用了如下細胞系和具體的量:
NSCLC:2000cells/100μl/well:
NCI-H292:中科院細胞庫,SCSP-582
NCI-H322:Cobioer,CBP60134
NCI-H1650:ATCC,CRL-5883
NCI-H1975:ATCC,CRL-5908
SK-MES-1:CoBioer,CBP60152
NCI-H1703:ATCC,HTB-43
PC9+hB7H3:如上文所構建
CRC和HNSCC:1500-2000 cells/100ul鋪96孔白底板(NUNC,136101),進行2D細胞培養,其中應用了如下細胞系和具體的量:
CRC:1500 cells/100ul/well
CCK-81:CoBioer,CBP60581
HT-55:CoBioer,CBP60012
H508:CoBioer,CBP60795
LS180:CoBioer,CBP60034
HNSCC:1500 cells/100ul/well
TE-1:CoBioer,CBP60655
Colo680:CoBioer,CBP60452。(2)、將提前稀釋準備好的抗體分子加到相應
細胞孔板中,混合均勻,37℃ 5% CO2培養箱培養5天。
(3)、增殖抑制實驗持續培養5天後,將提前準備好的Cell-Titer試劑(Promega,G7572)加入細胞孔中,室溫避光靜止15-25分鐘,CRC和HNSCC細胞直接進行多功能酶標儀(Molecular Devices,Spectra MAXi3)檢測。
(4)、NSCLC:將Cell-Titer和細胞混合液轉入96孔白底板(NUNC,136101),多功能酶標儀(Molecular Devices,Spectra MAXi3)檢測。
EGFR作為一個廣譜抗腫瘤靶點蛋白,從體外增殖抑制抗腫瘤藥效發現,Hz20G5.26/Zalu bsAb在食管癌腫瘤細胞系中有抗腫瘤效果(如圖6所示),其中在TE-1食管癌腫瘤細胞系,Hz20G5.26/Zalu bsAb比JNJ372具有更好的抗腫瘤效果。在結腸癌等腫瘤細胞系中(如圖5所示),Hz20G5.26/Zalu bsAb能達到EGFR單抗抗腫瘤效果,特別在LS180結腸癌腫瘤細胞系中,其體外抗腫瘤效果要優異於EGFR單抗;在NCI-H508結腸癌腫瘤細胞系中,抗腫瘤最大殺傷率達到84%。
在肺癌中,並非所有癌症腫瘤患者都是由於EGFR原發基因突變而發展演變的,在非小細胞肺癌患者EGFR平均突變率約為35%;作為治療標準的EGFR-TKI小分子(例如Erlotinib(Selleck Chemicals,cat:S7786)或Osimertinib(Selleck Chemicals,cat:S7297))主要針對敏感基因突變患者,但也常因
基因突變而造成耐藥失效,需要不斷針對新突變位點而開發新的靶向藥物。在肺癌中,Hz20G5.26/Zalu bsAb不僅對EGFR突變的NSCLC腫瘤細胞系有效,而且對野生型EGFR和異常擴增型EGFR非小細胞肺癌腫瘤細胞系都有抗腫瘤體外效果。在NSCLC腫瘤細胞系中,Hz20G5.26/Zalu bsAb相比JNJ-372體外抗腫瘤效果,其體外整體抗腫瘤藥效要遠優異於JNJ-372。
在NSCLC-EGFRWT腫瘤細胞系(圖7.1),NCI-H292體外最大抗腫瘤殺傷率為74.2±2.8%;在NSCLC-EGFR經典突變(L858R,T790M或Exon19 deletion)腫瘤細胞系(圖7.2),針對NCI-H1975(EGFRL858R/T790M)(圖7.2B)體外最大抗腫瘤抑制殺傷率為51.2±1.4%,IC50為0.99nM,體外藥效優異於JNJ-372和EGFR單抗;在NSCLC-EGFR異常擴增腫瘤細胞系(圖7.3),針對SK-MES-1體外最大抗腫瘤殺傷率為60.7±15.9%,IC50為0.40nM,整體體外藥效優異於JNJ-372和EGFR單抗,並且SK-MES-1和NCI-H1703這些異常擴增NSCLC-EGFR的腫瘤細胞系是對一代(厄洛替尼Erlotinib)和三代(奧希替尼Osimertinib)非敏感耐藥的。已上市和用於T790M突變治療的第三代EGFR-TKI小分子抑制劑奧希替尼是對EGFRexon20ins罕見突變藥效較差,為探究Hz20G5.26/Zalu bsAb對EGFRexon20ins腫瘤的藥效,我們在NCI-H322-EGFRWT細胞基礎上,構建H322-EGFRS768_D770dup穩轉細胞系,體外增殖抑制抗腫瘤藥效顯示(圖7.4),Hz20G5.26/Zalu bsAb是對EGFRexon20ins有體外藥效活性的。隨著EGFR-TKI小分子抑制劑的服用和治療,NSCLC患者不斷出現兩重(如Del19/T790M、L858R/T790M)或三重(如Del19/T790M/C797S、L858R/T790M/C797S)耐藥突變,這也是下一代EGFR-TKI重要研發方向。為驗證Hz20G5.26/Zalu bsAb對EGFR-TKI三重耐藥突變的藥效活性,我們構建了H1975-EGFRL858R/T790M/C797S和
PC9+B7H3-EGFRDel19/T790M/C797S穩轉細胞系,體外增殖抗腫瘤藥效顯示(圖7.4),Hz20G5.26/Zalu bsAb對EGFRL858R/T790M/C797S和EGFRDel19/T790M/C797S有一定的體外藥效活性。
為進一步驗證Hz20G5.26/Zalu bsAb體外藥效活性,將Hz20G5.26/Zalu bsAb與gp120/Zalu和gp120/Hz20G5.26聯合進行體外增殖抑制藥效比對分析(圖7.5),結果發現在Hz20G5.26/Zalu bsAb在NCI-H292(Lung adeno,EGFRWT)和SK-MES-1(sqNSCLC,EGFRAmp)NSCLC腫瘤細胞系以及LS180 CRC腫瘤細胞系中,Hz20G5.26/Zalu bsAb體外藥效遠優異於gp120/Zalu和gp120/Hz20G5.26聯合用藥。Hz20G5.26/Zalu bsAb增殖抑制腫瘤殺傷實驗結果如表3所示:
實施例5.3. Hz20G5.26/Zalu bsAb雙特異性抗體分子與KRAS小分子抑制劑聯合協同作用
在癌症腫瘤患者中,除了EGFR異常激活會導致癌症發生外,KRAS基因突變激活也是癌症腫瘤常見驅動誘因。在人類癌症中約有25%是KRAS突變,KRAS突變與癌症預後治療有很大關係。在CRC和NSCLC腫瘤中,KRAS-G12D和KRAS-G12C是常見異常突變,現在隨著KRAS小分子抑制劑的使用,預期後面會產生KRAS獲得性耐藥性。KRAS小分子抑制劑與其他藥物聯合使用(如免疫治療藥物療或靶向治療藥物)或是新藥研究和開發方向。
實驗方法:
增殖抑制實驗
(1)、NSCLC(H358)(Cobioer,CBP60136)和CRC(LS180)(Cobioer,CBP60034):1500-2500 cells/100ul鋪96孔低吸附板(Corning,CLS7007-24EA),進行3D細胞培養。
(2)、將提前稀釋準備好的抗體分子和小分子抑制劑加到相應細胞孔板中,混合均勻,37℃ 5% CO2培養5天。
(3)、增殖抑制實驗持續培養5天後,將提前準備好的Cell-Titer試劑(Promega,G7572)加入細胞孔中,室溫避光靜止15-25分鐘。
(4)、將Cell-Titer和上述細胞混合液轉入96孔白底板(NUNC,136101),多功能酶標儀(Molecular Devices,Spectra MAXi3)檢測。
從NCI-H358(EGFR WT ,KRAS G12C )NSCLC腫瘤細胞系結果發現(圖8A),Hz20G5.26/Zalu bsAb在H358體外最大抗腫瘤殺傷率為66.9±1.9%,IC50=0.48nM,抗腫瘤藥效遠優異於EGFR單抗Zalu單抗和JNJ-372,優異於Gp120/Zalu和Gp120/Hz20G5.26聯合用藥;藉由與AMG510(KRAS-G12C小分子抑制劑)(MedChem Expresss,HY-114277)聯合用藥,結果發現Hz20G5.26/Zalu與AMG510有協同效果,0.98nM AMG510在10nM Hz20G5.26/Zalu bsAb作用下,H358細胞殺傷率由22.51%提高到67.12%,在H358細胞中抗腫瘤效果增強(圖8B)。為了證明協同效應,進一步基於圖8B,在SynergyFinder(https://synergyfinder.fimm.fi/synergy/20210817124619827928/)中計算藥效協同得分,結果參見圖8C和圖8D。圖8D中給出了不同維度得分總和,其中總分為11.895,大於10,代表兩種藥物之間具有協同作用。
從LS180(EGFRR521K,KRAS G12D)CRC腫瘤細胞系結果發現,Hz20G5.26/Zalu bsAb的體外抗腫瘤藥效不僅優異於EGFR單抗Zalu、JNJ372以及Gp120/Zalu和gp120/Hz20G5.26聯合用藥(圖7.5);而且與MRTX1133(KRAS-G12D小分子抑制劑)聯合用藥有明顯協同效果,在1.56nM Hz20G5.26/Zalu bsAb條件下,15.62nM MRTX1133抗LS180腫瘤藥效有原來36.45%提升到61.56%,
抗腫瘤效果明顯增強(圖9A)。圖9B和圖9C中進一步應用SynergyFinder計算了協同得分,其中總分為37.714,代表兩種藥物之間的協同作用。
實施例5.4. Hz20G5.26/Zalu bsAb雙特異性抗體分子增殖抑制體外藥效機制研究
在增殖抑制實驗中,Hz20G5.26/Zalu bsAb是在B7H3抗體幫助下,進一步提升EGFR信號阻斷而實現更強抗腫瘤殺傷作用。在NCI-H358細胞上,我們藉由Western blotting進行EGFR信號抑制阻斷和EGFR配體阻斷兩個方向進行研究,探究Hz20G5.26/Zalu bsAb體外抗腫瘤效果優異於EGFR單抗以及Gp120/Zalu和Gp120/Hz20G5.26聯合用藥的原因。
實驗方法:
1、EGFR信號阻斷實驗(Signal blocking)
(1)、細胞處理
<1>、取NCI-H358(Cobioer,CBP60136),7.0E5 cells/孔鋪6孔板(NEST,703011)過夜培養。
<2>、去除培養基(RPMI1640完全培養基(RPMI1640+10%FBS)),添加無血清培養基RPMI1640(assay medium)饑餓處理過夜。
<3>、去除<2>中的培養基,分別加入包含200nM Hz20G5.26/Zalu bsAb、200nM Gp120/Zalu、200nM Gp120/Hz20G5.26、200nM Zalu mAb、200nM Gp120/Zalu+200nM Gp120/Hz20G5.26的無血清培養基(assay medium)至相應細胞孔板,設置Blank組(培養基)、bsAb組(200nM Hz20G5.26/Zalu bsAb)、Gp120/Zalu組(200nM Gp120/Zalu)、Gp120/B7H3組(200nM Gp120/Hz20G5.26)、
Zalu組(200nM Zalu mAb)、Gp120/Zalu+Gp120/B7H3組(200nM Gp120/Zalu+200nM Gp120/Hz20G5.26),37℃ 5%CO2放置處理2小時。
(2)、蛋白提取和總蛋白定量
<1>、提前準備細胞裂解液,細胞裂解液組成:100-200ul/管RIPA(Thermo,89900)+1:100磷酸酶抑制劑(abcam,ab201112)+1:20蛋白酶抑制劑(Roche,11836170001)。
<2>、將提前準備好的細胞裂解液加入上述(1)中獲得的細胞以消化細胞,冰上裂解20min。
<3>、離心機預先4℃預冷,12000rpm/min,4℃離心15min,取上清。
<4>、採用BCA試劑(Beyotime,P0012),對提取的總蛋白進行濃度標定。
<5>、取相應總蛋白用LDS Sample buffer(Invitrogen,2201446)稀釋,70℃變性處理10分鐘,-40℃保存備用。
(3)、Western blotting
<1>、將(3)中獲得的蛋白樣品和蛋白marker(Prestained Protein Ladder(Thermo,26620))加入預製膠(Thermo,NP0321BOX);在200V電壓下,採用電泳儀(BIO-RAD,TRANS SD CELL)跑膠約50分鐘。
<2>、將膠片取出,採用轉膜儀(Invitrogen,IBCOT2)進行轉膜。
<3>、用準備好的封閉液(含5%脫脂奶粉TBST),緩速封閉1-2小時;加入EGF Receptor Rabbit mAb(CST,4267)、pEGF Receptor Rabbit mAb(CST,3777)和GAPDH Rabbit mAb(CST,2118)抗體,4度孵育過夜。
<4>、用TBST洗滌三次,每次8-10min,搖床轉速控制80-100rpm/min。
<5>、用標記的HRP-GoatAnti-RabbitIgG(abcam,Ab205718)室溫孵育1-2小時。
<6>、用TBST洗滌三次,每次8-10min,搖床轉速控制80-100rpm/min。
<7>、ECL發光液(Beyotime,P0018AM)顯影,顯影儀(BIO-RAD,chemi Doc MP)曝光。
結果如圖10。
2、EGFR配體阻斷實驗(Signal blocking)
(1)、細胞處理
<1>、取NCI-H358(H358),7.0E5 cells/孔鋪6孔板(NEST,703011)過夜培養。
<2>、去除培養基(RPMI1640完全培養基(RPMI1640+10%FBS)),添加無血清培養基RPMI1640饑餓處理過夜。
<3>、去除培養基,分別加入培養基(2個細胞孔)、包含200nM Hz20G5.26/Zalu bsAb、200nM Gp120/Zalu、200nM Gp120/Hz20G5.26、200nM Zalu mAb、200nM Gp120/Zalu+200nM Gp120/Hz20G5.26的培養基至相應細胞孔板,設置Blank組(培養基)、Control組(培養基)、bsAb組(200nM Hz20G5.26/Zalu bsAb)、Gp120/Zalu組(200nM Gp120/Zalu)、Gp120/B7H3組(200nM Gp120/Hz20G5.26)、Zalu組(200nM Zalu mAb)、Gp120/Zalu+Gp120/B7H3組(200nM Gp120/Zalu+200nM Gp120/Hz20G5.26),37℃ 5%CO2放置處理1小時。
<4>、待一小時後,在Blank組(培養基)、bsAb組(200nM Hz20G5.26/Zalu bsAb)、Gp120/Zalu組(200nM Gp120/Zalu)、Gp120/B7H3組(200nM Gp120/Hz20G5.26)、Zalu組(200nM Zalu mAb)、Gp120/Zalu+Gp120/B7H3組(200nM Gp120/Zalu+200nM Gp120/Hz20G5.26),分別添加30nM EGF(ACRO,EGF-
H52b)(圖11上圖)和30nM TGF-α(R&D,239-A-100)(圖11下圖),37℃ 5%CO2放置處理1小時。
(2)、蛋白提取和總蛋白定量
<1>、提前準備細胞裂解液,細胞裂解液組成:100-200ul/管RIPA(Thermo,89900)+1:100磷酸酶抑制劑(abcam,ab201112)+1:20蛋白酶抑制劑(Roche,11836170001)。
<2>、將提前準備好的細胞裂解液加入上述(1)中獲得的細胞以消化細胞,冰上裂解20min。
<3>、離心機預先4℃預冷,12000rpm/min,4℃離心15min,取上清。
<4>、採用BCA試劑(Beyotime,P0012),對提取的總蛋白進行濃度標定。
<5>、取相應總蛋白用LDS Sample buffer(Invitrogen,2201446)稀釋,70℃變性處理10分鐘,-40℃保存備用。
(3)、Western blotting
<1>、將蛋白樣品和蛋白marker(Prestained Protein Ladder(Thermo,26620))加入預製膠(Thermo,NP0321BOX);在200V電壓下,採用電泳儀(BIO-RAD,TRANS SD CELL)跑膠約50分鐘。
<2>、將膠片取出,採用轉膜儀(Invitrogen,IBCOT2)進行轉膜。
<3>、用準備好的封閉液(含5%脫脂奶粉TBST),緩速封閉1-2小時;加入EGF Receptor Rabbit mAb(CST,4267)、pEGF Receptor Rabbit mAb(CST,3777)和GAPDH Rabbit mAb(CST,2118)抗體,4度孵育過夜。
<4>、用TBST洗滌三次,每次8-10min,搖床轉速控制80-100rpm/min。
<5>、用標記的HRP-Goat Anti-Rabbit IgG(abcam,Ab205718)室溫孵育1-2小時。
<6>、用TBST洗滌三次,每次8-10min,搖床轉速控制80-100rpm/min。
<7>、ECL發光液(Beyotime,P0018AM)顯影,顯影儀(BIO-RAD,chemi Doc MP)曝光。
結果參見圖11。
從Signal blocking機制研究結果(圖10和圖11)發現,Hz20G5.26/Zalu bsAb在信號阻斷和配體阻斷作用均強於EGFR單抗Zalu以及Gp120/Zalu和Gp120/Hz20G5.26聯合作用;該結果也揭示了Hz20G5.26/Zalu bsAb在體外抗CRC、NSCLC和HNSCC腫瘤效果比EGFR單抗以及Gp120/Zalu和Gp120/Hz20G5.26更優的原因。
實施例6. Hz20G5.26/Zalu bsAb雙特異性抗體分子ADCC體外藥效活性
抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(ADCC)是抗腫瘤抗體發揮抗腫瘤作用的一種重要機制,其原理是利用抗體Fab段與腫瘤細胞表面的抗原表位結合,其Fc段與殺傷免疫(NK細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等)表面的FcR結合,藉由免疫細胞介導直接殺傷腫瘤細胞,ADCC作用主要是藉由抗體Fc與NK表面的FcR Ⅲ a受體來實現的。
Hz20G5.26/Zalu bsAb由於Hz20G5.26親本的引入,不僅提高了Hz20G5.26/Zalu bsAb中EGFR抗體阻斷活性,而且也整體提高了Hz20G5.26/Zalu bsAb ADCC作用(推測由於Hz20G5.26結合於B7H3的近膜端特定的表位,因而
引發了強ADCC功能);同時,採用GlymaxX低岩藻糖技術,進一步增強了Hz20G5.26/Zalu bsAb ADCC作用。
因此,Hz20G5.26/Zalu bsAb雙特性抗體分子可藉由EGFR信號阻斷和ADCC兩種作用機制,共同發揮多種抗腫瘤藥效。具體實驗步驟如下:
實施例6.1. ADCC報告實驗
在ADCC報告實驗中,ADCC效應細胞((Promega,G7102))是藉由工程化將FcR Ⅲ a(V158)受體過表達到Jurkat T細胞,藉由Jurkat T細胞內NFAT-RE驅動元件能快速反應ADCC強弱的工程化細胞。
實驗方法:
(1)、按照效靶比(10:1),將腫瘤細胞(表3所列細胞系)和ADCC效應細胞(Promega,G7102)混合均勻(1.5E4 cells:1.5E5 cells/well/100ul(1.5E5:1.5E6 cells/ml))至96孔白底板(NUNC,136101)。
(2)、將提前稀釋準備好的抗體分子加到相應細胞孔板中,混合均勻,37℃ 5% CO2培養20小時。
(3)、將提前準備好的Bio-glo試劑(Promega,G755B)加入細胞孔板中,室溫避光靜止10-15分鐘,多功能酶標儀(Molecular Devices,Spectra MAXi3)檢測。
我們在NSCLC腫瘤細胞系中,挑選不同EGFR類型腫瘤細胞系(EGFR野生型、EGFR異常擴增型、EGFR突變型、EGFR野生和KRAS突變型),藉由ADCC報告實驗驗證Hz20G5.26/Zalu bsAb ADCC活性,從ADCC報告實驗結果(圖12和表4)發現,在不同類型NSCLC-EGFR腫瘤細胞系中,Hz20G5.26/Zalu bsAb ADCC活性強於JNJ373和EGFR單抗;同時在H292(NSCLC-EGFR野生型)和H358(NSCLC-EGFR野生和KRAS突變型)實驗結果發
現,Hz20G5.26/Zalu bsAb ADCC活性不僅強於JNJ372和EGFR單抗,而且ADCC活性強於Gp120/Zalu和Gp120/Hz20G5.26聯合ADCC活性。
實施例6.2 huPBMC ADCC實驗
藉由上述ADCC報告實驗結果發現,Hz20G5.26/Zalu bsAb ADCC活性強於JNJ372、EGFR單抗Zalu、Gp120/Zalu和Gp120/Hz20G5.26聯合;為更能真實有效反應Hz20G5.26/Zalu bsAb ADCC活性,我們設計huPBMC ADCC實驗,採用正常人PBMC進行ADCC活性驗證。
實驗方法:
(1)、CTS培養基(Gibco,A3021002)37℃預熱,取huPBMC(秒通生物科技,PB100C-W)快速水浴融化,將細胞緩慢加入8ml CTS培養基(含有1%DNA酶)中。
(2)、300g,8min離心,去除上清,用30ml CTS(含有10uL DNA酶)重新懸浮,轉移T75培養瓶,37℃培養箱過夜。
(3)、取過夜培養的懸浮細胞,離心300g/8min,去除上清,CTS調整細胞密度;按照效應細胞(huPBMC)和靶細胞(表5的腫瘤細胞)效靶比50:1,將huPBMC和提前準備好的腫瘤細胞(Target:huPBMC=1.5E4/7.5E5 cells/well/100ul),鋪96孔低吸附板(Corning,CLS7007-24EA)。
(4)、將稀釋準備好的抗體藥物加入相應細胞孔板中,37℃ 5%CO2培養8h。
(5)、300g離心5min,取50ul上清轉移至96孔透明平底板((NUNC,136101);取50ul提前配置和準備好的LDH試劑(Promega,G1780)加入相應孔板中,室溫避光靜置15-30min。
(6)、取50ul LDH Stop Solution(Promega,G1780),490nm讀數,多功能酶標儀(Molecular Devices,Spectra MAXi3)檢測。
結果參見圖13和表5。Hz20G5.26/Zalu bsAb在huPBMC ADCC實驗結果更能真實有效反應實際藥效結果。從huPBMC ADCC結果(圖13和表5)發現,Hz20G5.26/Zalu bsAb在huPBMC ADCC活性結果與ADCC報告活性結果基本一致,在眾多不同類型NSCLC-EGFR腫瘤細胞系,Hz20G5.26/Zalu bsAb huPBMC ADCC活性強於JNJ373和EGFR單抗,強於Gp120/Zalu和Gpl20/Hz20G5.26聯合ADCC活性;藉由huPBMC ADCC作用,Hz20G5.26/Zalu bsAb
雖然在H1975抗腫瘤殺傷率最低,但殺傷率也有36.53%;Hz20G5.26/Zalu bsAb在H322抗腫瘤殺率最高,殺傷率高達100%。
因此,Hz20G5.26/Zalu bsAb在增強EGFR信號阻斷的基礎上,又藉由免疫細胞參與ADCC,可進一步發揮Hz20G5.26/Zalu bsAb在眾多癌症腫瘤中的抗腫瘤藥效活性。
實施例6. Hz20G5.26/Zalu bsAb雙特異性抗體分子藥物安全性體外研究
EGFR是一種上皮源表皮生長因子,除過度表達或異常激活導致癌症腫瘤發生外,在一些上皮細胞和角質細胞也會有EGFR的表達。相比EGFR-TKI小分子抑制劑的不良反應,如包括皮疹、腹瀉、甲溝炎、口腔黏膜炎、肝損傷、間質性肺疾病,EGFR單抗也會有一定的不良反應,主要體現皮膚毒性,如疹膿皰型
皮疹、甲溝炎及皮膚乾燥瘙癢等,這極大影響腫瘤患者的生活質量和治療依從性。
我們選擇人皮膚鱗癌細胞系(A431,ATCC,CRL-1555)和人皮膚角質細胞(HaCat,Cell lines service,300493)細胞作為Hz20G5.26/Zalu bs Ab不良反應研究模型,在體外實驗探究Hz20G5.26/Zalu bs Ab耐受性。
實驗方法
(1)、將A431和HaCat細胞1500-2000 cells/100ul鋪96孔低吸附板(Corning,CLS7007-24EA),進行3D細胞培養,其中應用的培養基均為DMEM+10% FBS+1% Pen/strep。
(2)、將提前稀釋準備好的抗體分子加到相應細胞孔板中,混合均勻,37℃ 5% CO2培養箱培養5天。
(3)、增殖抑制實驗持續培養5天後,將提前準備好的Cell-Titer試劑(Promega,G7572)加入細胞孔中,室溫避光靜止15-25分鐘。
(4)、將Cell-Titer和細胞混合液轉入96孔白底板(NUNC,136101),多功能酶標儀(Molecular Devices,Spectra MAXi3)檢測。
結果參見圖14。從實驗結果發現,Hz20G5.26/Zalu bs Ab在A431和HaCat細胞上,體外藥效遠低於EGFR單抗,說明細胞對於Hz20G5.26/Zalu bsAb耐受性很高,不良反應遠低於EGFR單抗;同時,細胞對於Hz20G5.26/Zalu bs Ab耐受性也優異於JNJ372。
因此,Hz20G5.26/Zalu bs Ab在降低EGER親和力的基礎上,應用了B7H3高親和力Hz20G5.26親本,提高了Hz20G5.26/Zalu bs Ab藥效生物活性和藥效安全窗口。
實施例7. Hz20G5.26/Zalu bsAb雙特異性抗體分子體內藥效活性
為了證明Hz20G5.26/Zalu雙特異性抗體分子在體內的藥效,採用NSCLC-EGFRWT腫瘤細胞系NCI-H292細胞(ATCC)接種Balb/c Nude小鼠測定本發明的Hz20G5.26/Zalu雙特異性抗體的抗腫瘤藥效。實驗使用SPF等級的雌性Balb/c Nude小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司),合格證編號為NO.110011211108430747。
將NCI-H292細胞進行常規傳代培養用於後續體內實驗。離心收集細胞,以PBS(1×)和Matrigel Matix(Corning)等比例混合重新懸浮NCI-H292細胞,製備成細胞濃度為20×106個/ml細胞懸液。在第0天取0.2ml細胞懸液皮下接種至Balb/c Nude小鼠右側腹部區域中,建立NCI-H292荷瘤小鼠模型。
腫瘤細胞接種4天後檢測各隻小鼠瘤體積,進行分組(每組5隻小鼠),給藥劑量和方式如表6所示。
h-IgG、JNJ372、Gp120/Zalu、Hz20G5.26/Zalu和Zalu mAb的使用濃度均為0.5mg/ml,每3-4天給藥一次,共4次(Q3-4Dx4)。分別在NCI-H292細胞接種後第4、8、12、15天給藥,每週2次監測小鼠瘤體積與體重,如圖15A所示,監測至59天後結束。由於部分組別在較早就出現因腫瘤導致的小鼠死亡,因此按照接種後第22天腫瘤體積計算相對腫瘤抑制率(TGI%),計算公式如下:
TGI%=100% * (對照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積)/(對照組腫瘤體積-對照組給藥前腫瘤體積)。
腫瘤體積測定:採用游標卡尺測定腫瘤的最大長軸(L)和最大寬軸(W),腫瘤體積按如下公式計算:V=L*W2/2。
採用電子天平測定體重。對於腫瘤體積超過2000mm3或體重下降超過20%的小鼠,進行安樂死處理。
腫瘤抑制率結果如表7所示:在接種後第22天,與h-IgG,5mg/kg組對比,JNJ372、Gp120/Zalu、Hz20G5.26/Zalu和Zalu mAb的腫瘤抑制率分別為100%、72%、108%和107%。Hz20G5.26/Zalu和Zalu mAb組各有1隻腫瘤完全緩解的小鼠。小鼠生存曲線如圖15B所示,Hz20G5.26/Zalu能顯著延長小鼠的生存期。綜上所述,Hz20G5.26/Zalu對NCI-H292荷瘤小鼠的抗腫瘤藥效與親本的Zalu mAb相當,且優於JNJ372和無靶向的GP120/Zalu。
同時對小鼠體重進行監測的結果(圖15C)顯示,在接種後59天內,Hz20G5.26/Zalu組小鼠體重無明顯下降。
為了證明Hz20G5.26/Zalu雙特異性抗體分子對EGFR異常擴增的NSCLC的體內藥效,採用SK-MES-1細胞(南京科佰)接種Balb/c Nude小鼠測定本發明的Hz20G5.26/Zalu雙特異性抗體分子抗腫瘤藥效。實驗使用SPF等級的雌性Balb/c Nude小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司),合格證編號為NO.110011211108966881。
將SK-MES-1細胞進行常規傳代培養用於後續體內實驗。離心收集細胞,以PBS(1×)和Matrigel Matix(Corning)等比例混合SK-MES-1細胞,製備成細胞濃度為20×106個/ml細胞懸液。在第0天取0.2ml細胞懸液皮下接種至Balb/c Nude小鼠右側腹部區域中來建立SK-MES-1荷瘤小鼠模型。
腫瘤細胞接種6天後檢測各隻小鼠瘤體積,進行分組(每組7隻小鼠),給藥劑量和方式如表8所示。
h-IgG、Hz20G5.26/Zalu、JNJ372、Zalu mAb和Gp120/Zalu的使用濃度均為0.1mg/ml。在SK-MES-1細胞接種後第6天給藥1次,每週2次監測小鼠瘤體積與體重,如圖16A所示,監測至24天後結束。
接種後第24天計算相對腫瘤抑制率(TGI%),計算公式如下:
TGI%=100% * (對照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積)/(對照組腫瘤體積-對照組給藥前腫瘤體積)。
腫瘤體積測定:採用游標卡尺測定腫瘤的最大長軸(L)和最大寬軸(W),腫瘤體積按如下公式計算:V=L*W2/2。採用電子天平測定體重。
腫瘤抑制率結果如表9所示:在接種後第24天,與h-IgG,1mg/kg組對比,Hz20G5.26/Zalu、JNJ372、Zalu mAb和Gp120/Zalu的腫瘤抑制率分別為143%、122%、145%和113%。同時對小鼠體重進行監測的結果(圖16B)顯示,在接種後第24天,小鼠體重無顯著差異。
為了進一步證明Hz20G5.26/Zalu分子作為雙特異性抗體在體內藥效中的優勢,採用SK-MES-1細胞(南京科佰)接種Balb/c Nude小鼠測定本發明的Hz20G5.26/Zalu雙特異性抗體分子抗腫瘤藥效。實驗使用SPF等級的雌性Balb/c Nude小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司),合格證編號為NO.110011221103705231。
將SK-MES-1細胞進行常規傳代培養用於後續體內實驗。離心收集細胞,以PBS(1×)和Matrigel Matix(Corning)等比例混合SK-MES-1細胞,製備成細胞濃度為25×106個/ml細胞懸液。在第0天取0.2ml細胞懸液皮下接種至Balb/c Nude小鼠右側腹部區域中來建立SK-MES-1荷瘤小鼠模型。
腫瘤細胞接種14天後檢測各隻小鼠瘤體積,進行分組(每組6隻小鼠),給藥劑量和方式如表10所示。
h-IgG的使用濃度為0.06mg/ml,Hz20G5.26/Zalu、Gp120/Zalu和Gp120/Hz20G5.26的使用濃度均為0.03mg/ml。在SK-MES-1細胞接種後第14天給藥1次,每週2次監測小鼠瘤體積與體重,如圖17A所示,監測至35天後結束。
接種後第35天計算相對腫瘤抑制率(TGI%),計算公式如下:
TGI%=100% * (對照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積)/(對照組腫瘤體積-對照組給藥前腫瘤體積)。
腫瘤體積測定:採用游標卡尺測定腫瘤的最大長軸(L)和最大寬軸(W),腫瘤體積按如下公式計算:V=L*W2/2。採用電子天平測定體重。
腫瘤抑制率結果如表11所示:在接種後第35天,與h-IgG,0.6mg/kg組對比,Hz20G5.26/Zalu、Gp120/Zalu、Gp120/Hz20G5.26和Gp120/Zalu+Gp120/Hz20G5.26的腫瘤抑制率分別為121%、31%、1%和16%。Hz20G5.26/Zalu的抗腫瘤藥效優於對照無靶向單抗Gp120/Zalu,Gp120/Hz20G5.26或二者聯用,證明了Hz20G5.26/Zalu作為雙特異性抗體的獨特機制,即Hz20G5.26對於zalu
阻斷EGFR信號的拉動作用。同時對小鼠體重進行監測的結果(圖17B)顯示,在接種後第24天,小鼠體重無顯著差異。
實施例8. Hz20G5.26/Zalu bsAb雙特異性抗體分子聯合KRAS小分子抑制劑體內藥效活性
為了證明Hz20G5.26/Zalu雙特異性抗體分子聯合KRAS小分子抑制劑在體內的藥效,採用KRASG12C突變的NSCLC腫瘤細胞系NCI-H358(南京科佰)接種NOG小鼠測定本發明的Hz20G5.26/Zalu雙特異性抗體聯合KRAS小分子抑制劑AMG510的抗腫瘤藥效。實驗使用SPF等級的雌性NOG小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司),合格證編號為NO.1100112211001153625。
將NCI-H358細胞進行常規傳代培養用於後續體內實驗。離心收集細胞,以PBS(1×)和Matrigel Matix(Corning)等比例混合重新懸浮NCI-H358細胞,製備成細胞濃度為25×106個/ml細胞懸液。在第0天取0.2ml細胞懸液皮下接種至NOG小鼠右側腹部區域中,建立NCI-H358荷瘤小鼠模型。
腫瘤細胞接種6天後檢測各隻小鼠瘤體積,進行分組(每組7隻小鼠),給藥劑量和方式如表12所示。
h-IgG的使用濃度為2mg/ml,Hz20G5.26/Zalu、JNJ372和Zalu mAb的使用濃度均為1mg/ml,每3-4天給藥1次,共4次(Q3-4D x4)。分別在NCI-H358細胞接種後第6、9、12、15天給藥,每週2次監測小鼠瘤體積與體重。AMG510的使用濃度為1mg/ml,在NCI-H358細胞接種後第6天開始給藥,每天給藥1次,共14次(QD x14),每週2次監測小鼠瘤體積,在給藥期間每天監測小鼠體重,結束給藥後每週2次監測小鼠體重。如圖18A所示,監測至33天後結束。在接種後第33天計算相對腫瘤抑制率(TGI%),計算公式如下:
TGI%=100% * (對照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積)/(對照組腫瘤體積-對照組給藥前腫瘤體積)。
腫瘤體積測定:採用游標卡尺測定腫瘤的最大長軸(L)和最大寬軸(W),腫瘤體積按如下公式計算:V=L*W2/2。採用電子天平測定體重。
腫瘤抑制率結果如表13所示:在接種後第33天,與h-IgG,20mg/kg組對比,AMG510、Hz20G5.26/Zalu、AMG510+Hz20G5.26/Zalu、JNJ372
和Zalu mAb的腫瘤抑制率分別為89%、110%、130%、82%和111%。在各組別中,Hz20G5.26/Zalu聯合AMG510對NCI-H358荷瘤小鼠的抗腫瘤藥效最優,具有協同作用。
同時對小鼠體重進行監測的結果(圖18B)顯示,AMG510給藥造成小鼠體重逐步下降,暫停給藥後體重回升,在第33天各組別小鼠體重正常。
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Claims (60)
- 一種結合EGFR和B7-H3的雙特異性抗體,其包含第一抗原結合區和第二抗原結合區,該第一抗原結合區特異性結合EGFR,且該第二抗原結合區特異性結合B7H3。
- 如請求項1所述的雙特異性抗體,其中該第二抗原結合區包含如SEQ ID NO:3、5或7所示的重鏈可變區的HCDR1、2和3序列,以及如SEQ ID NO:4、6或8所示的輕鏈可變區的LCDR1、2和3序列。
- 如請求項1所述的雙特異性抗體,其中該第二抗原結合區包含重鏈可變區VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3,以及輕鏈可變區VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中(i)該HCDR1、HCDR2和HCDR3為如SEQ ID NO:3所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3;且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO:4所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3;(ii)該HCDR1、HCDR2和HCDR3為如SEQ ID NO:5所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3;且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO:6所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3;或(iii)該HCDR1、HCDR2和HCDR3為如SEQ ID NO:7所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3;且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO:8所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3。
- 如請求項1所述的雙特異性抗體,其中該第二抗原結合區包含重鏈可變區VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3,以及輕鏈可變區VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中(i)HCDR1包含如SEQ ID NO:15所示的胺基酸序列或由該序列組成,HCDR2包含如SEQ ID NO:16所示的胺基酸序列或由該序列組成,HCDR3包含如SEQ ID NO:17所示的胺基酸序列或由該序列組成,LCDR1包含如SEQ ID NO:18所示的胺基酸序列或由該序列組成,LCDR2包含如SEQ ID NO:19所示的胺基酸序列或由該序列組成,LCDR3包含如SEQ ID NO:20所示的胺基酸序列或由該序列組成;或,(ii)HCDR1包含如SEQ ID NO:21所示的胺基酸序列或由該序列組成,HCDR2包含如SEQ ID NO:22所示的胺基酸序列或由該序列組成,HCDR3包含如SEQ ID NO:23所示的胺基酸序列或由該序列組成,LCDR1包含如SEQ ID NO:24所示的胺基酸序列或由該序列組成,LCDR2包含如SEQ ID NO:25所示的胺基酸序列或由該序列組成,LCDR3包含如SEQ ID NO:26所示的胺基酸序列或由該序列組成;或,(iii)HCDR1包含如SEQ ID NO:27所示的胺基酸序列或由該序列組成,HCDR2包含如SEQ ID NO:28所示的胺基酸序列或由該序列組成,HCDR3包含如SEQ ID NO:29所示的胺基酸序列或由該序列組成,LCDR1包含如SEQ ID NO:30所示的胺基酸序列或由該序列組成,LCDR2包含如SEQ ID NO:31所示的胺基酸序列或由該序列組成,LCDR3包含如SEQ ID NO:32所示的胺基酸序列或由該序列組成。
- 如請求項1至4中任一項所述的雙特異性抗體,其中該第二抗原結合區包含重鏈可變區VH,其中該VH包含SEQ ID NO:3、5或7所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:3、5或7所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項1至5中任一項所述的雙特異性抗體,其中該第二抗原結合區包含輕鏈可變區VL,其中該VL包含SEQ ID NO:4、6或8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:4、6或8所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項1至6中任一項所述的雙特異性抗體,其中該第二抗原結合區包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL,其中(i)該VH包含SEQ ID NO:3所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:3的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,且該VL包含SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:4的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;(ii)該VH包含SEQ ID NO:5所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:5的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,且該VL包含SEQ ID NO:6所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:6的胺基酸序列具有至少80%、85%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;或(iii)該VH包含SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:7的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,且該VL包含SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:8的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項1至7中任一項所述的雙特異性抗體,其中該第二抗原結合區包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL,其中VH和VL分別包含如下所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成:SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4;SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6;或SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
- 如請求項1至7中任一項所述的雙特異性抗體,其中該第一抗原結合區包含重鏈可變區VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3,以及輕鏈可變區VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中該HCDR1、HCDR2和HCDR3為如SEQ ID NO:1所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3;且該LCDR1、LCDR2和LCDR3為如SEQ ID NO:2所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3。
- 如請求項9所述的雙特異性抗體,其中該第一抗原結合區的HCDR1包含SEQ ID NO:9的胺基酸序列或由該序列組成;HCDR2包含SEQ ID NO:10的胺基酸序列或由該序列組成;HCDR3包含SEQ ID NO:11的胺基酸序列或由該序列組成;且第一抗原結合區的LCDR1包含SEQ ID NO:12的胺基酸序列或由該序列組成;LCDR2包含SEQ ID NO:13的胺基酸序列或由該序列組成;且LCDR3包含SEQ ID NO:14的胺基酸序列或由該序列組成。
- 如請求項9或10所述的雙特異性抗體,其中該第一抗原結合區包含重鏈可變區VH,其中該VH包含SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:1的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項9至11中任一項所述的雙特異性抗體,其中該第一抗原結合區包含輕鏈可變區VL,其中該VL包含SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:2的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項9至12中任一項所述的雙特異性抗體,其中該第一抗原結合區包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL,其中該VH包含SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:1的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,且該VL包含SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:2的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項9至13中任一項所述的雙特異性抗體,其中該第一抗原結合區包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL,其中VH和VL分別包含如下所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成:SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
- 如請求項1至14中任一項所述的雙特異性抗體,其中該第一抗原結合區特異性結合EGFR,其包含重鏈可變區VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3,以及輕鏈可變區VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中HCDR1包含SEQ ID NO:9的胺基酸序列或由該序列組成;HCDR2包含SEQ ID NO:10的胺基酸序列或由該序列組成;HCDR3包含SEQ ID NO:11的胺基酸序列或由該序列組成;LCDR1包含SEQ ID NO:12的胺基酸序列或由該序列組成;LCDR2包含SEQ ID NO:13的胺基酸序列或由該序列組成;且LCDR3包含SEQ ID NO:14的胺基酸序列或由該序列組成;且第二抗原結合區特異性結合B7H3,其包含重鏈可變區VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3,以及輕鏈可變區VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中(i)HCDR1包含SEQ ID NO:15的胺基酸序列或由該序列組成;HCDR2包含SEQ ID NO:16的胺基酸序列或由該序列組成;HCDR3包含SEQ ID NO:17的胺基酸序列或由該序列組成;LCDR1包含SEQ ID NO:18的胺基酸序列或由該序列組成;LCDR2包含SEQ ID NO:19的胺基酸序列或由該序列組成;且LCDR3包含SEQ ID NO:20的胺基酸序列或由該序列組成;(ii)HCDR1包含SEQ ID NO:21的胺基酸序列或由該序列組成;HCDR2包含SEQ ID NO:22的胺基酸序列或由該序列組成;HCDR3包含SEQ ID NO:23的胺基酸序列或由該序列組成;LCDR1包含SEQ ID NO:24的胺基酸序列或由該序列組成;LCDR2包含SEQ ID NO:25的胺基酸序列或由該序列組成;且LCDR3包含SEQ ID NO:26的胺基酸序列或由該序列組成;或者(iii)HCDR1包含SEQ ID NO:27的胺基酸序列或由該序列組成;HCDR2包含SEQ ID NO:28的胺基酸序列或由該序列組成;HCDR3包含SEQ ID NO:29的胺基酸序列或由該序列組成;LCDR1包含SEQ ID NO:30的胺基酸序列或由該序列組成;LCDR2包含SEQ ID NO:31的胺基酸序列或由該序列組成;且LCDR3包含SEQ ID NO:32的胺基酸序列或由該序列組成。
- 如請求項15所述的雙特異性抗體,其中該第一抗原結合區包含含有如SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH和含有如SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL,且第二抗原結合區包含分別含有如下所示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH和VL:SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4;SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6;或SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
- 如請求項1至16中任一項所述的雙特異性抗體,其包含Fc區,較佳地,該Fc區具有低岩藻糖基化,例如藉由GlymaxX技術處理後獲得的低岩藻糖基化。
- 如請求項17所述的雙特異性抗體,其包含第一Fc區和第二Fc區,其中第一Fc區和第二Fc區相同或不同。
- 如請求項17或18所述的雙特異性抗體,其中該第一Fc區和第二Fc區分別為人的IgG Fc,例如,人IgG1 Fc、人IgG2 Fc、人IgG3 Fc或人IgG4 Fc,例如包含胺基酸序列SEQ ID NO:46或47或與其具有至少90%同一性,例如95%、96%、97%、99%或更高的同一性的胺基酸序列或由其組成。
- 如請求項18或19所述的雙特異性抗體,其中在第一Fc區和第二Fc區中引入促進第一Fc區和第二Fc區的異二聚化的突變。
- 如請求項20所述的雙特異性抗體,其中該突變是基於Innobody技術引入的。
- 如請求項21所述的多特異性抗體,其中一個Fc區的CH3包含S364R和D399K突變,且另一個Fc區的CH3突變包含Y349T、K370S和K409D突變。
- 如請求項22所述的雙特異性抗體,其中a)一個Fc區多肽包含SEQ ID NO:49或50所示的胺基酸序列或由其組成,而另一個Fc區多肽包含SEQ ID NO:52或53所示的胺基酸序列或由其組成;b)一個Fc區多肽包含與SEQ ID NO:49或50所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性的胺基酸序列,而另一個Fc區多肽包含與SEQ ID NO:52或53所示的胺基酸序列所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性的胺基酸序列;或c)一個Fc區多肽包含與SEQ ID NO:49或50所示的胺基酸序列所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性的胺基酸 序列且包含突變Y349T、K370S和K409D,而另一個Fc區包含與SEQ ID NO:52或53所示的胺基酸序列所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性的胺基酸序列且包含突變S364R和D399K。
- 如請求項20所述的雙特異性抗體,其中該突變是基於Knob-into-Hole技術引入的,其中在第一Fc區和第二Fc區中引入相應的Knob突變和Hole突變。
- 如請求項24所述的雙特異性抗體,其中a)一個Fc區多肽包含突變T366W,而另一個Fc區多肽包含T366S、L368A和Y407V(編號方式依照EU索引),或b)一個Fc區包含胺基酸替代S354C和T366W,且另一個Fc區包含胺基酸替代Y349C、T366S、L368A和Y407V(編號方式依照EU索引)。
- 如請求項1至25中任一項所述的雙特異性抗體,其中該第一和/或第二抗原結合區(例如其中的重鏈可變區)還可以與1個或2個重鏈恆定區(例如人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4的重鏈恆定區)連接,該重鏈恆定區包含CH1和Fc區,經由或不經由鉸鏈區連接,例如重鏈可變區的C末端與重鏈恆定區的CH1的N末端連接。
- 如請求項26所述的雙特異性抗體,其中該CH1包含SEQ ID NO:42所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:42的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項1至27中任一項所述的雙特異性抗體,其中該第一和/或第二抗原結合區(例如其中的輕鏈可變區)還可以與輕鏈恆定區連接,例如輕鏈可變區的C末端與輕鏈恆定區的N末端連接。
- 如請求項28所述的雙特異性抗體,其中該輕鏈恆定區為kappa輕鏈恆定區或lambda輕鏈恆定區。
- 如請求項20所述的雙特異性抗體,其中該輕鏈恆定區包含SEQ ID NO:54所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:54的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項1至30中任一項所述的雙特異性抗體,其中該雙特異性抗體為IgG樣抗體,其具有如圖1所示的構型。
- 如請求項31所述的雙特異性抗體,其中包含重鏈1和輕鏈1,以及重鏈2和輕鏈2,其中重鏈1和輕鏈1構成第一半抗體,且重鏈2和輕鏈2構成第二半抗體;其中重鏈1包含第一抗原結合區的重鏈可變區和第一重鏈恆定區;輕鏈1包含第一抗原結合區的輕鏈可變區和第一輕鏈恆定區;且重鏈2包含第二抗原結合區的重鏈可變區和第二重鏈恆定區;輕鏈2包含第二抗原結合區的輕鏈可變區和第二輕鏈恆定區。
- 如請求項32所述的雙特異性抗體,其中該重鏈1包含SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:33的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項32或33所述的雙特異性抗體,其中該輕鏈1包含SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:34的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項32至34中任一項所述的雙特異性抗體,其中該重鏈1包含SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:33的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,且該輕鏈1包含SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:34的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項32至35中任一項所述的雙特異性抗體,其中該重鏈2包含SEQ ID NO:35、37或39所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:35、37或39所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項32至36中任一項所述的雙特異性抗體,其中該輕鏈2包含SEQ ID NO:36、38或40所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:36、38或40所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項32至37中任一項所述的雙特異性抗體,其中(1)重鏈2包含SEQ ID NO:35所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:35所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;且輕鏈2包含SEQ ID NO:36所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:36所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;(2)重鏈2包含SEQ ID NO:37所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:37所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;且輕鏈2包含SEQ ID NO:38所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:38所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;(3)重鏈2包含SEQ ID NO:39所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:39所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;且輕鏈2包含SEQ ID NO:40所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:40所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項32至38中任一項所述的雙特異性抗體,其中重鏈1包含SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:33的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,且輕鏈1包含SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO:34的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的 胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;且重鏈2和輕鏈2分別包含如下的SEQ ID NO:所示的胺基酸序列,或包含與所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性的胺基酸序列,或由如下SEQ ID NO所示的序列組成:i)SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36;ii)SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38;iii)SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。
- 如請求項32至39中任一項所述的雙特異性抗體,其中(i)重鏈1包含SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列的重鏈或由其組成,且輕鏈1包含SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列或由其組成,重鏈2包含SEQ ID NO:35所示的胺基酸序列或由其組成,且輕鏈2包含SEQ ID NO:36所示的胺基酸序列或由其組成;或,(ii)重鏈1包含SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列或由其組成,且輕鏈1包含SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列或由其組成,重鏈2包含SEQ ID NO:37所示的胺基酸序列或由其組成,且輕鏈2包含SEQ ID NO:38所示的胺基酸序列或由其組成;或,(iii)重鏈1包含SEQ ID NO:33所示的胺基酸序列或由其組成,且輕鏈1包含SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列或由其組成,重鏈2包含SEQ ID NO:39所示的胺基酸序列或由其組成,且輕鏈2包含SEQ ID NO:40所示的胺基酸序列或由其組成。
- 如請求項1至40中任一項所述的雙特異性抗體,其中該抗體或其抗原結合片段具有以下一個或多個特性:(i)該抗體一方面可以阻斷EGFR配體與EGFR的結合,抑制生物信號傳遞,阻斷腫瘤相應生物活性;另一方面會刺激EGFR內吞而最終被細胞內溶酶體等降解;(ii)該抗體採用對EGFR低親和力的EGFR抗體親本序列,極大降低了系列EGFR單株抗體對皮膚等正常上皮組織帶來的毒副作用;(iii)該抗體在EGER低親和力的基礎上引用B7-H3高親和力的抗體親本序列,極大提高了EGFR信號阻斷活性,提高了本發明雙特異性抗體的藥效生物活性和藥效安全窗口;(iv)該抗體為低岩藻糖基化的抗體;(ii)該抗體具有較高的藥效生物活性和安全性;(v)該抗體具有優良的腫瘤殺傷和抑制效果;(vi)該抗體具有優良的ADCC體內外藥效活性;(vii)該抗體與KRAS小分子抑制劑聯用具有優良的抗腫瘤協同效果。
- 一種分離的核酸,其編碼如請求項1至41中任一項的所述的結合EGFR和B7-H3的雙特異性抗體中的任一條鏈。
- 一種載體,其包含如請求項42所述的核酸,較佳地該載體是表達載體,較佳地,該表達載體為pcDNA,例如pcDNA3.1。
- 一種宿主細胞,其包含如請求項42所述的核酸或如請求項43所述的載體,較佳地,該宿主細胞是原核的或真核的,更佳的酵母細胞或哺乳動物細胞(例如293細胞或CHO細胞,例如293F細胞或293T細胞或CHO-S細胞)。
- 如請求項44所述的宿主細胞,其被糖工程化而表達RMD酶,較佳地,該宿主細胞是CHO細胞。
- 如請求項45所述的宿主細胞,其包含編碼RMD酶的核酸。
- 如請求項46所述的宿主細胞,其中該RMD酶包含SEQ ID NO:41所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,較佳地,該RMD酶來自銅綠假單胞菌。
- 一種製備結合EGFR和B7-H3的雙特異性抗體的方法,該方法包括在適於表達編碼前述如請求項1至41任一項所述的雙特異性抗體的核酸的條件下培養如請求項44至47中任一項所述的宿主細胞,視需要地分離該抗體或其抗原結合片段,視需要地該方法還包括從該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體或其抗原結合片段。
- 一種免疫綴合物,其包含與治療劑或診斷劑綴合的前述如請求項1至41中任一項所述的雙特異性抗體。
- 一種醫藥組成物,其包含前述如請求項1至41中任一項所述的雙特異性抗體或如請求項49所述的免疫綴合物,以及視需要地藥用輔料。
- 如請求項50所述的醫藥組成物,其還包含第二治療劑;較佳地,該第二治療劑選自抗血管發生劑、化療劑、其它抗體、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑(例如共刺激分子的激活劑或免疫檢查點分子的抑制劑);較佳地,該第二治療劑選自KRAS小分子抑制劑,例如KRAS G12C抑制劑(例如AMG510(Sotorasib)或GFH925)、KRAS G12D(例如MRTX1133)或KRAS G12S抑制劑。
- 一種藥物組合產品,其包含如請求項1至41中任一項所述的雙特異性抗體或如請求項49所述的免疫綴合物或如請求項50所述的醫藥組成物,以及一種或多種第二治療劑,較佳地,該第二治療劑選自抗血管發生劑、化療劑、其它抗體、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑(例如共刺激分子的激活劑或免疫檢查點分子的抑制劑);較佳地,該第二治療劑選自KRAS小分子抑制劑,例如KRAS G12C抑制劑(例如AMG510(Sotorasib)或GFH925)、KRAS G12D(例如MRTX1133)或KRAS G12S抑制劑。
- 一種在受試者中預防或治療腫瘤或感染性疾病的方法,該方法包括向該受試者施用有效量的如請求項1至41中任一項所述的雙特異性抗體、或如請求項49所述的免疫綴合物、或如請求項50所述的醫藥組成物。
- 如請求項53所述的方法,其還包括向該受試者聯合施用一種或多種其它療法,該療法例如包括治療方式和/或其它治療劑,較佳地,該治療方式包括手術治療和/或放射療法,或者該治療劑選自抗血管發生劑、化療劑、其它抗體、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑(例如共刺激分子的激活劑或免疫檢查點分子的抑制劑);較佳地,該第二治療劑選自KRAS小分子抑制劑,例如KRAS G12C抑制劑(例如AMG510(Sotorasib)或GFH925)、KRAS G12D(例如MRTX1133)或KRAS G12S抑制劑。
- 一種在受試者中預防或治療腫瘤或感染性疾病的方法,該方法包括向該受試者施用有效量的如請求項51所述的醫藥組成物或如請求項52所述的藥物組合產品。
- 如請求項53至55中任一項所述的方法,其中該腫瘤為癌症,例如實體腫瘤或血液腫瘤,包括上皮來源的癌症,例如胃腸道腫瘤或肺部腫瘤或 皮膚腫瘤,例如皮膚癌(例如皮膚鱗癌、頭頸癌如頭頸部鱗狀細胞癌)、食管癌(例如:食管鱗狀癌)、腸癌(例如:結腸癌、直腸癌、結直腸癌)或肺癌(例如非小細胞肺癌、肺鱗癌、肺腺癌)。
- 如請求項53至56中任一項所述的方法,其中該腫瘤的腫瘤細胞中(i)相比相鄰組織正常細胞或相比健康受試者中的相同組織的正常細胞,過度表達野生型EGFR(例如具有升高的核酸或蛋白質水平的野生型EGFR),和/或表達突變的EGFR,較佳地,該突變的EGFR包含選自R521K、L858R、T790M、G719X、C797S、Y1069C、Exon19缺失(Del19)、Exon20ins(例如S768_D770dup)中的一個或多個突變,較佳地,該突變的EGFR包含R521K/Y1069C、R521K、L858R/T790M/C797S、Del19/T790M/C797S或S768_D770dup;(ii)相比相鄰組織正常細胞或相比健康受試者中的相同組織的正常細胞,過度表達野生型KRAS(例如具有升高的核酸或蛋白質水平的野生型KRAS),或表達突變的KRAS,較佳地,該突變的KRAS包含G12位或G13位突變,例如G12D或G12C;(iii)相比相鄰組織正常細胞或相比健康受試者中的相同組織的正常細胞,具有升高的核酸水平或蛋白水平的B7-H3;和/或(iv)該腫瘤細胞對於酪胺酸激酶抑制劑,例如對一代(厄洛替尼Erlotinib)和三代(奧希替尼Osimertinib)耐藥,例如對於奧希替尼耐藥。
- 如請求項57所述的方法,其中該腫瘤的腫瘤細胞中表達突變的EGFR和突變的KRAS,例如包含具有R521K的突變的EGFR和具有G120D的突變的KRAS。
- 一種檢測樣品中抗原EGFR和/或B7-H3的方法,該方法包括(a)將樣品與如請求項1至41中任一項所述的雙特異性抗體接觸;和(b)檢測抗體或其抗原結合片段和EGFR和/或B7-H3間的複合物的形成,視需要地,該抗體被可檢測的標記。
- 一種如請求項1至41中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、和/或如請求項42所述的分離的核酸、和/或如請求項43所述的載體、和/或如請求項44至47中任一項所述的宿主細胞、和/或如請求項49所述的免疫綴合物、和/或如請求項50或51所述的醫藥組成物或如請求項52所述的藥物組合產品,在製備用於預防和/或治療受試者疾病的藥物中的用途。
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