TW202342741A - 多胜肽及使用其之胺基酸的製造方法 - Google Patents

多胜肽及使用其之胺基酸的製造方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202342741A
TW202342741A TW111149813A TW111149813A TW202342741A TW 202342741 A TW202342741 A TW 202342741A TW 111149813 A TW111149813 A TW 111149813A TW 111149813 A TW111149813 A TW 111149813A TW 202342741 A TW202342741 A TW 202342741A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
group
amino acid
residue
sequence
represented
Prior art date
Application number
TW111149813A
Other languages
English (en)
Inventor
篠田清道
太田淳
椎名淳一
松尾篤
石野聡
江島大貴
石山詩織
中野効彦
塚田啓介
Original Assignee
日商中外製藥股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日商中外製藥股份有限公司 filed Critical 日商中外製藥股份有限公司
Priority to PCT/JP2023/017861 priority Critical patent/WO2023219156A1/ja
Priority to PCT/JP2023/017844 priority patent/WO2023219152A1/ja
Publication of TW202342741A publication Critical patent/TW202342741A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y105/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5)
    • C12Y105/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.5.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)

Abstract

一種多胜肽，其包含與序列識別號1表示的胺基酸序列中經改變的1個胺基酸殘基的序列具有90%以上的序列相同性之序列，且對於以式(1)表示的化合物A的任1種以上或其鹽與以式(2)表示的化合物B的任1種以上或其鹽的還原胺化反應、或者化合物B的任1種以上或其鹽的分子内還原胺化反應的觸媒活性，在至少一種反應條件下，較具有序列識別號1表示的胺基酸序列的多胜肽的前述觸媒活性更高。

Description

多胜肽及使用其之胺基酸的製造方法
本發明關於一種多胜肽及使用其之胺基酸的製造方法。
N-烷基胺基酸等胺基酸已知作為各種天然的生理活性物質結構的一部分存在。亦已知對於一些作為N-烷基胺基酸一種的N-甲基胺基酸，其胺基酸本身是天然存在的(非專利文獻1)。
作為合成N-烷基胺基酸的方法，存在有各種有機化學的手法。自綠色化學的觀點而言，已探討・報導有藉由酵素合成N-烷基胺基酸之方法。
三原等人將自苯丙酮酸與甲胺合成N-甲基苯丙胺酸的活性作為基準，將各種微生物進行篩選(專利文獻1、非專利文獻2、3)。其結果，自該活性最高的P.Putida ATCC12633株發現N-甲基胺基酸脫氫酶(N-methyl amino acid dehydrogenase；NMAADH)，並且將該酵素的基因(亦稱為dpkA)進行選殖並在大腸菌中表現，而成功取得經純化的該酵素。
又，該純化酵素具有自各種α-酮酸(丙酮酸、苯丙酮酸、羥基丙酮酸等)與烷基胺(甲胺、乙胺、丙胺等)合成對應的N-烷基胺基酸之活性。
上述來自P.Putida ATCC12633株的NMAADH的胺基酸序列與在P.Putida KT2440株基因體中編碼的蛋白質PP3591顯示良好的一致性(專利文獻2、非專利文獻2、3、4)。
針對與來自P.Putida ATCC12633株的NMAADH顯示71%胺基酸序列一致的來自P.Syringae的NMAADH，進行X射線晶體結構分析(非專利文獻3、5)。來自P.Syringae的經純化的NMAADH對於α-酮酸、胺的基質特異性顯示與來自P.Putida ATCC12633株的經純化NMAADH的基質特異性類似，並且來自P.Syringae的NMAADH催化反應的機制是在結晶結構基礎上進行說明。
已有報導將變異導入至NMAADH的文獻。來自P.Syringae的NMAADH的結晶結構(非專利文獻5)中包含在基質結合位的殘基亦保留在來自P.Putida KT2440株的NMAADH中。藉由對該等胺基酸殘基導入變異，發現來自P.Putida KT2440株的NMAADH的變異體F117L，其可提升將乙醛酸與甲胺、乙醛酸與乙胺作為基質時的比活性(非專利文獻6)。
來自P.Putida KT2440株的NMAADH對丙酮酸顯示出比對苯丙酮酸更高的活性。對2個位置導入變異的變異體P262A、M141L對於苯丙酮酸與丙酮酸具有接近同等的活性(非專利文獻7)。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2003/072770號 [專利文獻2]國際公開第2002/077183號 [非專利文獻]
[非專利文獻1]J. F. Hyslop et al., J.Biotechnol. 2019, 293, 56-65. [非專利文獻2]H. Mihara et al., FEBS Journal2005, 272, 1117-1123. [非專利文獻3]三原久明，生化學2015, 87, 326-332. [非專利文獻4]K. E. Nelson et al., Environ.Microbiol. 2002, 4, 799-808. [非專利文獻5]M. Goto et al., J. Biol. Chem.2005, 280, 40875-40884. [非專利文獻6]M. Mindet et al., Front.Bioeng. Biotechnol. 2019, 7. [非專利文獻7]A. Kerbs et al.,Microorganisms 2021, 9, 824.
[發明欲解決的問題]
報導使用NMAADH改變以合成N-烷基胺基酸的文獻，據本發明者們所知，包括上述文獻在內僅為三篇。亦即，關於改變NMAADH的報告極少。
關於來自P.Putida ATCC12633株的NMAADH，在非專利文獻2、3中，顯示出針對氨完全不具活性、以及對於在β位具有支鏈的α-酮異己酸或α-酮-β-纈草酸甲酯亦完全不具活性。
針對非專利文獻4所載在P.Putida KT2440株的基因體中編碼的蛋白質PP3591，據本發明者們所知，其僅揭露序列資訊，但不存在對觸媒活性等進行探討的資訊。據本發明者們所知，目前亦不存在藉由改變PP3591的胺基酸序列等方式以提升特定胺基酸合成活性的報告。
本發明目的在於提供一種可利用作為催化還原胺化反應的酵素的新穎多胜肽。又，本發明目的在於提供使用該多胜肽的胺基酸之製造方法。 [解決問題的手段]
本發明關於，例如以下各發明。 [1] 一種多胜肽， 其包含與序列識別號1表示的胺基酸序列中經改變的1個胺基酸殘基的序列具有90%以上的序列相同性之序列，且 對於以下述式(1)表示的化合物A的任1種以上或其鹽與以下述式(2)表示的化合物B的任1種以上或其鹽的還原胺化反應、或者前述化合物B的任1種以上或其鹽的分子内還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較具有序列識別號1表示的胺基酸序列的多胜肽的前述觸媒活性更高。 [化1] [式(1)中， R 1及R 2各自獨立表示為氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜環基、或雜芳基，該等基可被取代，R 1或R 2中的任一個以上為氫原子。] [化2] [化3] [化4] [式(2)中， X表示碳原子， Y表示氫原子、以上述式(1’)表示的基或以上述式(3)表示的基， n表示0以上且2以下的整數， R 6表示氫原子、可經取代的碳數為1以上且6以下的脂肪族烴基、可經取代的碳數為5以上且12以下的芳基、可經取代的構成環的原子數為5以上且12以下的雜芳基、包含氮原子的基、或包含氧原子的基， 式(1’)中， [化5] 表示與X的鍵結點， R 1a為自式(1)中R 1表示的基移除氫原子的基，不為氫原子， 式(3)中， [化6] 表示與X的鍵結點， m表示0以上且6以下的整數， p為0或1， q為0或1， r為0或1， Z 1表示可經取代的伸烷基、或碳數為1以上且6以下的含醚鍵基，m為2以上時，存在複數個的Z 1可為相同亦可為不同， Z 2表示碳原子， R 3、R 4及R 5各自獨立表示為氫原子、可經取代的碳數為1以上且6以下的脂肪族烴基、可經取代的碳數為5以上且12以下的芳基、可經取代的構成環的原子數為5以上且12以下的雜芳基、包含氮原子的基、或包含氧原子的基， R 3、R 4及R 5中的任2個以上可彼此鍵結並與Z 2共同形成環結構，此等環結構可為環烷基、芳基、雜環基、或雜芳基，該等基可被取代， R 3、R 4及R 5可與Z 2形成雙鍵或三鍵，R 3、R 4及R 5中的任1個藉由雙鍵或三鍵與Z 2鍵結時，p、q或r中的任1個以上為0， 式(1)中，R 1及R 2中的一個為甲基，且另一個為氫原子時，式(2)中，Y為以上述式(3)表示的基，m為0，R 3至R 5中的2個以上不為氫原子。] [2] 一種多胜肽， 其包含與序列識別號1表示的胺基酸序列中經改變的2個胺基酸殘基的序列具有90%以上的序列相同性之序列，且， 對於以下述式(1)表示的化合物A的任1種以上或其鹽與以下述式(2)表示的化合物B的任1種以上或其鹽的還原胺化反應或前述化合物B的任1種以上或其鹽的分子内還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較具有序列識別號1表示的胺基酸序列的多胜肽的前述觸媒活性更高。 [化7] [式(1)中， R 1及R 2各自獨立表示為氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜環基、或雜芳基，該等基可被取代，R 1或R 2中的任一個以上為氫原子。] [化8] [化9] [化10] [式(2)中， X表示碳原子， Y表示氫原子、以上述式(1’)表示的基或以上述式(3)表示的基， n表示0以上且2以下的整數， R 6表示氫原子、可經取代的碳數為1以上且6以下的脂肪族烴基、可經取代的碳數為5以上且12以下的芳基、可經取代的構成環的原子數為5以上且12以下的雜芳基、包含氮原子的基、或包含氧原子的基， 式(1’)中， [化11] 表示與X的鍵結點， R 1a為自式(1)中R 1表示的基移除氫原子的基，不為氫原子， 式(3)中， [化12] 表示與X的鍵結點， m表示0以上且6以下的整數， p為0或1， q為0或1， r為0或1， Z 1表示可經取代的伸烷基、或碳數為1以上且6以下的含醚鍵基，m為2以上時，存在複數個的Z 1可為相同亦可為不同， Z 2表示碳原子， R 3、R 4及R 5各自獨立表示為氫原子、可經取代的碳數為1以上且6以下的脂肪族烴基、可經取代的碳數為5以上且12以下的芳基、可經取代的構成環的原子數為5以上且12以下的雜芳基、包含氮原子的基、或包含氧原子的基， R 3、R 4及R 5中的任2個以上可彼此鍵結並與Z 2共同形成環結構，此等環結構可為環烷基、芳基、雜環基、或雜芳基，該等基可被取代， R 3、R 4及R 5可與Z 2形成雙鍵或三鍵，R 3、R 4及R 5中的任1個藉由雙鍵或三鍵與Z 2鍵結時，p、q或r中的任1個以上為0， 式(1)中，R 1及R 2中的一個為甲基，且另一個為氫原子時，式(2)中，Y為以上述式(3)表示的基，m為0，R 3至R 5中的2個以上不為氫原子。] [3] 如[1]所載之多胜肽， 其包含與序列識別號1表示的胺基酸序列中經改變的2個胺基酸殘基的序列具有90%以上的序列相同性之序列，且 對於以下述式(1)表示的化合物A的任1種以上或其鹽與以下述式(2)表示的化合物B的任1種以上或其鹽的還原胺化反應或前述化合物B的任1種以上或其鹽的分子内還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較具有序列識別號1表示的胺基酸序列的多胜肽的前述觸媒活性更高。 [化13] [式(1)中， R 1及R 2各自獨立表示為氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜環基、或雜芳基，該等基可被取代，R 1或R 2中的任一個以上為氫原子。] [化14] [化15] [化16] [式(2)中， X表示碳原子， Y表示氫原子、以上述式(1’)表示的基或以上述式(3)表示的基， n表示0以上且2以下的整數， R 6表示氫原子、可經取代的碳數為1以上且6以下的脂肪族烴基、可經取代的碳數為5以上且12以下的芳基、可經取代的構成環的原子數為5以上且12以下的雜芳基、包含氮原子的基、或包含氧原子的基， 式(1’)中， [化17] 表示與X的鍵結點， R 1a為自式(1)中R 1表示的基移除氫原子的基，不為氫原子， 式(3)中， [化18] 表示與X的鍵結點， m表示0以上且6以下的整數， p為0或1， q為0或1， r為0或1， Z 1表示可經取代的伸烷基、或碳數為1以上且6以下的含醚鍵基，m為2以上時，存在複數個的Z 1可為相同亦可為不同， Z 2表示碳原子， R 3、R 4及R 5各自獨立表示為氫原子、可經取代的碳數為1以上且6以下的脂肪族烴基、可經取代的碳數為5以上且12以下的芳基、可經取代的構成環的原子數為5以上且12以下的雜芳基、包含氮原子的基、或包含氧原子的基， R 3、R 4及R 5中的任2個以上可彼此鍵結並與Z 2共同形成環結構，此等環結構可為環烷基、芳基、雜環基、或雜芳基，該等基可被取代， R 3、R 4及R 5可與Z 2形成雙鍵或三鍵，R 3、R 4及R 5中的任1個藉由雙鍵或三鍵與Z 2鍵結時，p、q或r中的任1個以上為0， 式(1)中，R 1及R 2中的一個為甲基，且另一個為氫原子時，式(2)中，Y為以上述式(3)表示的基，m為0，R 3至R 5中的2個以上不為氫原子。] [4] 一種多胜肽， 其包含與序列識別號1表示的胺基酸序列中經改變的3個胺基酸殘基的序列具有90%以上的序列相同性之序列，且， 對於以下述式(1)表示的化合物A的任1種以上或其鹽與以下述式(2)表示的化合物B的任1種以上或其鹽的還原胺化反應、或者前述化合物B的任1種以上或其鹽的分子内還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較具有序列識別號1表示的胺基酸序列的多胜肽的前述觸媒活性更高。 [化19] [式(1)中， R 1及R 2各自獨立表示為氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜環基、或雜芳基，該等基可被取代，R 1或R 2中的任一個以上為氫原子。] [化20] [化21] [化22] [式(2)中， X表示碳原子， Y表示氫原子、以上述式(1’)表示的基或以上述式(3)表示的基， n表示0以上且2以下的整數， R 6表示氫原子、可經取代的碳數為1以上且6以下的脂肪族烴基、可經取代的碳數為5以上且12以下的芳基、可經取代的構成環的原子數為5以上且12以下的雜芳基、包含氮原子的基、或包含氧原子的基， 式(1’)中， [化23] 表示與X的鍵結點， R 1a為自式(1)中R 1表示的基移除氫原子的基，不為氫原子， 式(3)中， [化24] 表示與X的鍵結點， m表示0以上且6以下的整數， p為0或1， q為0或1， r為0或1， Z 1表示可經取代的伸烷基、或碳數為1以上且6以下的含醚鍵基，m為2以上時，存在複數個的Z 1可為相同亦可為不同， Z 2表示碳原子， R 3、R 4及R 5各自獨立表示為氫原子、可經取代的碳數為1以上且6以下的脂肪族烴基、可經取代的碳數為5以上且12以下的芳基、可經取代的構成環的原子數為5以上且12以下的雜芳基、包含氮原子的基、或包含氧原子的基， R 3、R 4及R 5中的任2個以上可彼此鍵結並與Z 2共同形成環結構，此等環結構可為環烷基、芳基、雜環基、或雜芳基，該等基可被取代， R 3、R 4及R 5可與Z 2形成雙鍵或三鍵，R 3、R 4及R 5中的任1個藉由雙鍵或三鍵與Z 2鍵結時，p、q或r中的任1個以上為0， 式(1)中，R 1及R 2中的一個為甲基，且另一個為氫原子時，式(2)中，Y為以上述式(3)表示的基，m為0，R 3至R 5中的2個以上不為氫原子。] [5] 如[1]所載之多胜肽， 其包含與序列識別號1表示的胺基酸序列中經改變的3個胺基酸殘基的序列具有90%以上的序列相同性之序列，且， 對於以下述式(1)表示的化合物A的任1種以上或其鹽與以下述式(2)表示的化合物B的任1種以上或其鹽的還原胺化反應、或者前述化合物B的任1種以上或其鹽的分子内還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較具有序列識別號1表示的胺基酸序列的多胜肽的前述觸媒活性更高。 [化25] [式(1)中， R 1及R 2各自獨立表示為氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜環基、或雜芳基，該等基可被取代，R 1或R 2中的任一個以上為氫原子。] [化26] [化27] [化28] [式(2)中， X表示碳原子， Y表示氫原子、以上述式(1’)表示的基或以上述式(3)表示的基， n表示0以上且2以下的整數， R 6表示氫原子、可經取代的碳數為1以上且6以下的脂肪族烴基、可經取代的碳數為5以上且12以下的芳基、可經取代的構成環的原子數為5以上且12以下的雜芳基、包含氮原子的基、或包含氧原子的基， 式(1’)中， [化29] 表示與X的鍵結點， R 1a為自式(1)中R 1表示的基移除氫原子的基，不為氫原子， 式(3)中， [化30] 表示與X的鍵結點， m表示0以上且6以下的整數， p為0或1， q為0或1， r為0或1， Z 1表示可經取代的伸烷基、或碳數為1以上且6以下的含醚鍵基，m為2以上時，存在複數個的Z 1可為相同亦可為不同， Z 2表示碳原子， R 3、R 4及R 5各自獨立表示為氫原子、可經取代的碳數為1以上且6以下的脂肪族烴基、可經取代的碳數為5以上且12以下的芳基、可經取代的構成環的原子數為5以上且12以下的雜芳基、包含氮原子的基、或包含氧原子的基， R 3、R 4及R 5中的任2個以上可彼此鍵結並與Z 2共同形成環結構，此等環結構可為環烷基、芳基、雜環基、或雜芳基，該等基可被取代， R 3、R 4及R 5可與Z 2形成雙鍵或三鍵，R 3、R 4及R 5中的任1個藉由雙鍵或三鍵與Z 2鍵結時，p、q或r中的任1個以上為0， 式(1)中，R 1及R 2中的一個為甲基，且另一個為氫原子時，式(2)中，Y為以上述式(3)表示的基，m為0，R 3至R 5中的2個以上不為氫原子。] [6] 一種多胜肽， 其包含與序列識別號1表示的胺基酸序列中經改變的1個胺基酸殘基的序列具有90%以上的序列相同性之序列，且對於烷基胺或其鹽與以下述式(2’)表示的化合物的任1種以上或其鹽的還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較由序列識別號1表示的胺基酸序列所構成的多胜肽之前述觸媒活性更高。 [化31] [式中，Y’表示C 3~C 8環烷基、或C 6~C 9芳烷基，該芳烷基可被C 1~C 3烷基或鹵素原子所取代。] [7] 一種多胜肽， 其包含與序列識別號1表示的胺基酸序列中經改變的2個胺基酸殘基的序列具有90%以上的序列相同性之序列，且對於烷基胺或其鹽與以下述式(2’)表示的化合物的任1種以上或其鹽的還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較由序列識別號1表示的胺基酸序列所構成的多胜肽之前述觸媒活性更高。 [化32] [式中，Y’表示C 3~C 8環烷基、或C 6~C 9芳烷基，該芳烷基可被C 1~C 3烷基或鹵素原子所取代。] [8] 如[6]所載的多胜肽， 其包含與序列識別號1表示的胺基酸序列中經改變的2個胺基酸殘基的序列具有90%以上的序列相同性之序列，且對於烷基胺或其鹽與以下述式(2’)表示的化合物的任1種以上或其鹽的還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較由序列識別號1表示的胺基酸序列所構成的多胜肽之前述觸媒活性更高。 [化33] [式中，Y’表示C 3~C 8環烷基、或C 6~C 9芳烷基，該芳烷基可被C 1~C 3烷基或鹵素原子所取代。] [9] 一種多胜肽， 其包含與序列識別號1表示的胺基酸序列中經改變的3個胺基酸殘基的序列具有90%以上的序列相同性之序列，且對於烷基胺或其鹽與以下述式(2’)表示的化合物的任1種以上或其鹽的還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較由序列識別號1表示的胺基酸序列所構成的多胜肽之前述觸媒活性更高。 [化34] [式中，Y’表示C 3~C 8環烷基、或C 6~C 9芳烷基，該芳烷基可被C 1~C 3烷基或鹵素原子所取代。] [10] 如[6]所載的多胜肽， 其包含與序列識別號1表示的胺基酸序列中經改變的3個胺基酸殘基的序列具有90%以上的序列相同性之序列，且，對於烷基胺或其鹽與以下述式(2’)表示的化合物的任1種以上或其鹽的還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較由序列識別號1表示的胺基酸序列所構成的多胜肽之前述觸媒活性更高。 [化35] [式中，Y’表示C 3~C 8環烷基、或C 6~C 9芳烷基，該芳烷基可被C 1~C 3烷基或鹵素原子所取代。] [11] 如[1]至[10]中任一項所載之多胜肽，其包含與序列識別號17表示的胺基酸序列中經改變的1個胺基酸殘基的序列具有90%以上的序列相同性之序列。 [12] 如[1]至[11]中任一項所載之多胜肽，其包含與序列識別號17表示的胺基酸序列中經改變的2個胺基酸殘基的序列具有90%以上的序列相同性之序列。 [13] 如[1]至[12]中任一項所載之多胜肽，其包含與序列識別號17表示的胺基酸序列中經改變的3個胺基酸殘基的序列具有90%以上的序列相同性之序列。 [14] 一種多胜肽， 其包含位於以下部位的胺基酸殘基被改變的序列，該部位為相當在選自由以序列識別號1表示的胺基酸序列中的、第44位的組胺酸殘基、第117位的苯丙胺酸殘基、第141位的甲硫胺酸殘基、第156位的蘇胺酸殘基、第182位的組胺酸殘基、第186位的麩醯胺酸殘基、第253位的色胺酸殘基、以及第260位的離胺酸殘基所組成之群組中的1種以上的胺基酸殘基之部位。 [15] 如[1]至[13]中任一項所載之多胜肽， 其包含位於以下部位的胺基酸殘基被改變的序列，該部位為相當在選自由以序列識別號1表示的胺基酸序列中的第44位的組胺酸殘基、第117位的苯丙胺酸殘基、第141位的甲硫胺酸殘基、第156位的蘇胺酸殘基、第182位的組胺酸殘基、第186位的麩醯胺酸殘基、第253位的色胺酸殘基、以及第260位的離胺酸殘基所組成之群組中的1種以上的胺基酸殘基之部位。 [16] 如[1]至[15]中任一項所載之多胜肽， 其包含位於以下部位的胺基酸殘基被改變的序列，該部位為相當在選自由以序列識別號1表示的胺基酸序列中的第141位的甲硫胺酸殘基、第182位的組胺酸殘基、第253位的色胺酸殘基、以及第260位的離胺酸殘基所組成之群組中的1種以上的胺基酸殘基之部位。 [17] 一種多胜肽，其包含序列，該序列為： 序列識別號1表示的胺基酸序列中位於相當在選自由第141位的甲硫胺酸殘基、第182位的組胺酸殘基、以及第253位的色胺酸殘基所組成之群組中的1個胺基酸殘基的部位之胺基酸殘基作為第一改變位置而被改變， 序列識別號1表示的胺基酸序列中位於相當在選自由第182位的組胺酸殘基、第253位的色胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基所組成之群組，且與作為第一改變位置被改變的胺基酸殘基不同的1個胺基酸殘基的部位之胺基酸殘基作為第二改變位置而被改變。 [18] 如[1]至[16]中任一項所載之多胜肽，其包含序列，該序列為： 序列識別號1表示的胺基酸序列中位於相當在選自由第141位的甲硫胺酸殘基、第182位的組胺酸殘基、以及第253位的色胺酸殘基所組成之群組中的1個胺基酸殘基的部位之胺基酸殘基作為第一改變位置而被改變， 序列識別號1表示的胺基酸序列中位於相當在選自由第182位的組胺酸殘基、第253位的色胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基所組成之群組，且與作為第一改變位置被改變的胺基酸殘基不同的1個胺基酸殘基的部位之胺基酸殘基作為第二改變位置而被改變。 [19] 一種多胜肽，其包含序列，該序列為： 序列識別號1表示的胺基酸序列中位於相當在選自由第141位的甲硫胺酸殘基以及第182位的組胺酸殘基所組成之群組中的1個胺基酸殘基的部位之胺基酸殘基作為第一改變位置而被改變， 序列識別號1表示的胺基酸序列中位於相當在選自由第182位的組胺酸殘基以及第253位的色胺酸殘基所組成之群組，且與作為第一改變位置被改變的胺基酸殘基不同的1個胺基酸殘基的部位之胺基酸殘基作為第二改變位置而被改變， 序列識別號1表示的胺基酸序列中位於相當在選自由第253位的色胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基所組成之群組，且與作為第一改變位置以及第二改變位置被改變的胺基酸殘基不同的1個胺基酸殘基的部位之胺基酸殘基作為第三改變位置而被改變。 [20] 如[1]至[16]中任一項所載之多胜肽，其包含序列，該序列為： 序列識別號1表示的胺基酸序列中位於相當在選自由第141位的甲硫胺酸殘基以及第182位的組胺酸殘基所組成之群組中的1個胺基酸殘基的部位之胺基酸殘基作為第一改變位置而被改變， 序列識別號1表示的胺基酸序列中位於相當在選自由第182位的組胺酸殘基以及第253位的色胺酸殘基所組成之群組，且與作為第一改變位置被改變的胺基酸殘基不同的1個胺基酸殘基的部位之胺基酸殘基作為第二改變位置而被改變， 序列識別號1表示的胺基酸序列中位於相當在選自由第253位的色胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基所組成之群組，且與作為第一改變位置以及第二改變位置被改變的胺基酸殘基不同的1個胺基酸殘基的部位之胺基酸殘基作為第三改變位置而被改變。 [21] 如[1]、[6]、[11]、及[14]至[16]中任一項所載之多胜肽，其包含 位於相當在選自由以序列識別號1表示的胺基酸序列中的第141位的甲硫胺酸殘基、第253位的色胺酸殘基、以及第260位的離胺酸殘基所組成之群組中的1個胺基酸殘基的部位之胺基酸殘基被改變之序列。 [22] 如[1]、[6]、[11]、[14]至[16]及[21]中任一項所載之多胜肽，其中以序列識別號1表示的胺基酸序列中的改變位置為1個位置。 [23] 如[1]、[6]、[11]、[14]至[16]及[21]至[22]中任一項所載之多胜肽，其包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第44位的組胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由甲硫胺酸殘基取代之序列。 [24] 如[1]、[6]、[11]、[14]至[16]及[21]至[23]中任一項所載之多胜肽，其包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第117位的苯丙胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由白胺酸殘基取代之序列。 [25] 如[1]、[6]、[11]、[14]至[16]及[21]至[24]中任一項所載之多胜肽，其包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第141位的甲硫胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由酪胺酸殘基、色胺酸殘基、纈胺酸殘基、蘇胺酸殘基、絲胺酸殘基、精胺酸殘基、白胺酸殘基、離胺酸殘基、異白胺酸殘基、組胺酸殘基、苯丙胺酸殘基以及丙胺酸殘基所組成之群組中的一個以上胺基酸殘基取代之序列。 [26] 如[1]、[6]、[11]、[14]至[16]及[21]至[25]中任一項所載之多胜肽，其包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第141位的甲硫胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由酪胺酸殘基、色胺酸殘基、纈胺酸殘基、離胺酸殘基、異白胺酸殘基、苯丙胺酸殘基以及丙胺酸殘基所組成之群組中的一個以上胺基酸殘基取代之序列。 [27] 如[1]、[6]、[11]、[14]至[16]及[21]至[26]中任一項所載之多胜肽，其包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第156位的蘇胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由絲胺酸殘基取代之序列。 [28] 如[1]、[6]、[11]、[14]至[16]及[21]至[27]中任一項所載之多胜肽，其包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第182位的組胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由酪胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、白胺酸殘基、甘胺酸殘基、苯丙胺酸殘基以及丙胺酸殘基所組成之群組中的一個以上胺基酸殘基取代之序列。 [29] 如[1]、[6]、[11]、[14]至[16]及[21]至[28]中任一項所載之多胜肽，其包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第182位的組胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由甲硫胺酸殘基、白胺酸殘基以及苯丙胺酸殘基所組成之群組中的一個以上胺基酸殘基取代之序列。 [30] 如[1]、[6]、[11]、[14]至[16]及[21]至[29]中任一項所載之多胜肽，其包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第186位的麩醯胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由甲硫胺酸殘基以及麩胺酸殘基所組成之群組中的一個以上胺基酸殘基取代之序列。 [31] 如[1]、[6]、[11]、[14]至[16]及[21]至[30]中任一項所載之多胜肽，其包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第253位的色胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由酪胺酸殘基、纈胺酸殘基、蘇胺酸殘基、絲胺酸殘基、精胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、脯胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、白胺酸殘基、離胺酸殘基、異白胺酸殘基、組胺酸殘基、苯丙胺酸殘基以及丙胺酸殘基所組成之群組中的一個以上胺基酸殘基取代之序列。 [32] 如[1]、[6]、[11]、[14]至[16]及[21]至[31]中任一項所載之多胜肽，其包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第253位的色胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由白胺酸殘基、異白胺酸殘基以及組胺酸殘基所組成之群組中的一個以上胺基酸殘基取代之序列。 [33] 如[1]、[6]、[11]、[14]至[16]及[21]至[32]中任一項所載之多胜肽，其包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第253位的色胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由組胺酸殘基取代之序列。 [34] 如[1]、[6]、[11]、[14]至[16]及[21]至[33]中任一項所載之多胜肽，其包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第260位的離胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由酪胺酸殘基、色胺酸殘基、蘇胺酸殘基、絲胺酸殘基、精胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、白胺酸殘基、組胺酸殘基、甘胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、麩胺酸殘基以及丙胺酸殘基所組成之群組中的一個以上胺基酸殘基取代之序列。 [35] 如[1]、[6]、[11]、[14]至[16]及[21]至[34]中任一項所載之多胜肽，其包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第260位的離胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由麩醯胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、麩胺酸殘基以及天冬醯胺酸殘基所組成之群組中的一個以上胺基酸殘基取代之序列。 [36] 如[1]、[6]、[11]、[14]至[16]及[21]至[35]中任一項所載之多胜肽，其中前述序列識別號1表示的胺基酸序列中經改變的1個胺基酸殘基的序列為以序列識別號6表示，X為纈胺酸殘基的胺基酸序列(M141V)、以序列識別號6表示，X為酪胺酸殘基的胺基酸序列(M141Y)、以序列識別號8表示，X為白胺酸殘基的胺基酸序列(H182L)、以序列識別號11表示，X為組胺酸殘基的胺基酸序列(W253H)、或以序列識別號12表示，X為麩胺酸殘基的胺基酸序列(K260E)。 [37] 如[1]、[6]、[11]、[14]至[16]及[21]至[36]中任一項所載之多胜肽，其包含與以序列識別號6表示，X為纈胺酸殘基的胺基酸序列(M141V)、以序列識別號6表示，X為酪胺酸殘基的胺基酸序列(M141Y)、以序列識別號8表示，X為白胺酸殘基的胺基酸序列(H182Y)、以序列識別號11表示，X為組胺酸殘基的胺基酸序列(W253H)、或以序列識別號12表示，X為麩胺酸殘基的胺基酸序列(K260E)之序列具有90%以上序列相同性之序列。 [38] 如[1]、[6]、[11]、[14]至[16]及[21]至[37]中任一項所載之多胜肽，其包含以序列識別號6表示，X為纈胺酸殘基的胺基酸序列(M141V)、以序列識別號6表示，X為酪胺酸殘基的胺基酸序列(M141Y)、以序列識別號8表示，X為白胺酸殘基的胺基酸序列(H182Y)、以序列識別號11表示，X為組胺酸殘基的胺基酸序列(W253H)、或以序列識別號12表示，X為麩胺酸殘基的胺基酸序列(K260E)。 [39] 如[1]、[6]、[11]、[14]至[16]及[21]至[38]中任一項所載之多胜肽，其具有以序列識別號18、序列識別號19、序列識別號20、序列識別號21、或序列識別號22表示之胺基酸序列。 [40] 如[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]及[18]中任一項所載之多胜肽，其中以序列識別號1表示的胺基酸序列中的改變位置為2個位置以上。 [41] 如[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]及[40]中任一項所載之多胜肽，其中以序列識別號1表示的胺基酸序列中的改變位置為2個位置。 [42] 如[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、[40]及[41]中任一項所載之多胜肽，其包含： 以序列識別號1表示的胺基酸序列中的 位於相當在第141位的甲硫胺酸殘基以及第182位的組胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、 位於相當在第141位的甲硫胺酸殘基以及第253位的色胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、 位於相當在第141位的甲硫胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、 位於相當在第182位的組胺酸殘基以及第253位的色胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、 位於相當在第182位的組胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、或者 位於相當在第253位的色胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列。 [43] 如[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、及[40]至[42]中所載之多胜肽，其包含： 以序列識別號1表示的胺基酸序列中的 位於相當在第141位的甲硫胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、 位於相當在第182位的組胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、或者 位於相當在第253位的色胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列。 [44] 如[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、及[40]至[43]中任一項所載之多胜肽，其包含： 以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第141位的甲硫胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由酪胺酸殘基、色胺酸殘基、纈胺酸殘基、蘇胺酸殘基、精胺酸殘基、離胺酸殘基、異白胺酸殘基、以及丙胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列。 [45] 如[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、及[40]至[44]中任一項所載之多胜肽，其包含： 以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第141位的甲硫胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由酪胺酸殘基、纈胺酸殘基以及丙胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列。 [46] 如[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、及[40]至[45]中任一項所載之多胜肽，其包含： 以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第182位的組胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由酪胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、白胺酸殘基、以及苯丙胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列。 [47] 如[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、及[40]至[46]中任一項所載之多胜肽，其包含： 以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第182位的組胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由甲硫胺酸殘基以及白胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列。 [48] 如[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、及[40]至[47]中任一項所載之多胜肽，其包含： 以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第253位的色胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由酪胺酸殘基、蘇胺酸殘基、絲胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、組胺酸殘基以及丙胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列。 [49] 如[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、及[40]至[48]中任一項所載之多胜肽，其包含： 以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第253位的色胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由組胺酸殘基取代之序列。 [50] 如[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、及[40]至[49]中任一項所載之多胜肽，其包含： 序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基藉由選自由絲胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、白胺酸殘基、異白胺酸殘基、組胺酸殘基、甘胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、麩胺酸殘基以及丙胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列。 [51] 如[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、及[40]至[50]中任一項所載之多胜肽，其包含： 序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基藉由選自由麩醯胺酸殘基以及麩胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列。 [52] 如[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、及[40]至[51]中任一項所載之多胜肽，其中前述序列識別號1表示的胺基酸序列中的2個胺基酸殘基被改變之序列為： 以序列識別號25表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為丙胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141A_K260E)、 以序列識別號25表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為丙胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141A_K260Q)、 以序列識別號25表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為酪胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141Y_K260E)、 以序列識別號25表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_K260E)、 以序列識別號27表示，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(H182L_K260E)、 以序列識別號27表示，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(H182L_K260Q)、 以序列識別號27表示，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(H182M_K260E)、 以序列識別號27表示，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(H182M_K260Q)、或 以序列識別號28表示，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為組胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(W253H_K260E)。 [53] 如[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、及[40]至[52]中任一項所載之多胜肽，其包含與以下序列具有90%以上序列相同性之序列： 以序列識別號25表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為丙胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141A_K260E)、 以序列識別號25表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為丙胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141A_K260Q)、 以序列識別號25表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為酪胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141Y_K260E)、 以序列識別號25表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_K260E)、 以序列識別號27表示，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(H182L_K260E)、 以序列識別號27表示，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(H182L_K260Q)、 以序列識別號27表示，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(H182M_K260E)、 以序列識別號27表示，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(H182M_K260Q)、或 以序列識別號28表示，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為組胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(W253H_K260E)。 [54] 如[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、及[40]至[53]中任一項所載之多胜肽，其包含： 以序列識別號25表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為丙胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141A_K260E)、 以序列識別號25表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為丙胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141A_K260Q)、 以序列識別號25表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為酪胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141Y_K260E)、 以序列識別號25表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_K260E)、 以序列識別號27表示，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(H182L_K260E)、 以序列識別號27表示，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(H182L_K260Q)、 以序列識別號27表示，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(H182M_K260E)、 以序列識別號27表示，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(H182M_K260Q)、或 以序列識別號28表示，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為組胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(W253H_K260E)。 [55] 如[2]、[3]、[7]、[8]、[12]、[17]、[18]、及[40]至[54]中任一項所載之多胜肽，其具有以序列識別號36~44任一項所表示的胺基酸序列。 [56] 如[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]及[20]中任一項所載之多胜肽，其中以序列識別號1表示的胺基酸序列中的改變位置為3個位置以上。 [57] 如[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]及[56]中任一項所載之多胜肽，其中以序列識別號1表示的胺基酸序列中的改變位置為3個位置。 [58] 如[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、[56]及[57]中任一項所載之多胜肽，其包含： 以序列識別號1表示的胺基酸序列中的 位於相當在第141位的甲硫胺酸殘基、第182位的組胺酸殘基以及第253位的色胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、 位於相當在第141位的甲硫胺酸殘基、第182位的組胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、 位於相當在第141位的甲硫胺酸殘基、第253位的色胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、 位於相當在第182位的組胺酸殘基、第253位的色胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列。 [59] 如[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、及[56]至[58]中任一項所載之多胜肽，其包含： 以序列識別號1表示的胺基酸序列中的 位於相當在第141位的甲硫胺酸殘基、第182位的組胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、 位於相當在第141位的甲硫胺酸殘基、第253位的色胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、 位於相當在第182位的組胺酸殘基、第253位的色胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列。 [60] 如[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、及[56]至[59]中任一項所載之多胜肽，其包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的改變位置為3個，且 序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第141位的甲硫胺酸殘基之部位的胺基酸殘基藉由選自由酪胺酸殘基、纈胺酸殘基、蘇胺酸殘基、絲胺酸殘基、白胺酸殘基、離胺酸殘基、異白胺酸殘基、以及丙胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列。 [61] 如[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、及[56]至[60]中任一項所載之多胜肽，其包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的改變位置為3個，且 序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第141位的甲硫胺酸殘基之部位的胺基酸殘基藉由選自由酪胺酸殘基、纈胺酸殘基以及異白胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列。 [62] 如[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、及[56]至[61]中任一項所載之多胜肽，其包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的改變位置為3個，且 序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第182位的組胺酸殘基之部位的胺基酸殘基藉由選自由甲硫胺酸殘基、白胺酸殘基以及苯丙胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列。 [63] 如[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、及[56]至[62]中任一項所載之多胜肽，其包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的改變位置為3個，且 序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第182位的組胺酸殘基之部位的胺基酸殘基藉由選自由甲硫胺酸殘基以及白胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列。 [64] 如[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、及[56]至[63]中任一項所載之多胜肽，其包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的改變位置為3個，且 序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第253位的色胺酸殘基之部位的胺基酸殘基藉由選自由纈胺酸殘基、蘇胺酸殘基、絲胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、白胺酸殘基、組胺酸殘基、苯丙胺酸殘基以及麩胺酸所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列。 [65] 如[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、及[56]至[64]中任一項所載之多胜肽，其包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的改變位置為3個，且 序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第253位的色胺酸殘基之部位的胺基酸殘基藉由選自由麩醯胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、白胺酸殘基以及組胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列。 [66] 如[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、及[56]至[65]中任一項所載之多胜肽，其包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的改變位置為3個，且 序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基藉由選自由麩醯胺酸殘基以及麩胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列。 [67] 如[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、及[56]至[66]中任一項所載之多胜肽，其中前述序列識別號1表示的胺基酸序列中的3個胺基酸殘基被改變之序列為： 以序列識別號33表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為酪胺酸殘基，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141Y_H182M_K260E)、 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_W253M_K260E)、 以序列識別號32表示，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為組胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(H182L_W253H_K260E)、 以序列識別號33表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為酪胺酸殘基，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141Y_H182M_K260Q)、 以序列識別號33表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_H182M_K260E)、 以序列識別號33表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_H182L_K260Q)、 以序列識別號33表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為酪胺酸殘基，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141Y_H182L_K260Q)、 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141L_W253Q_K260E)、 以序列識別號32表示，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(H182L_W253Q_K260E)、 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為異白胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為組胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141I_W253H_K260E)、 以序列識別號33表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_H182L_K260E)、 以序列識別號33表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為酪胺酸殘基，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141Y_H182L_K260E) 以序列識別號32表示，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(H182L_W253M_K260E)、 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_W253Q_K260Q)、 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為組胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_W253H_K260Q)、 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_W253L_K260Q)、 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為異白胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為組胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141I_W253H_K260Q)、或 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_W253M_K260Q)。 [68] 如[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、及[56]至[67]中任一項所載之多胜肽，其包含： 以序列識別號33表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為酪胺酸殘基，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141Y_H182M_K260E)、 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_W253M_K260E)、 以序列識別號32表示，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為組胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(H182L_W253H_K260E)、 以序列識別號33表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為酪胺酸殘基，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141Y_H182M_K260Q)、 以序列識別號33表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_H182M_K260E)、 以序列識別號33表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_H182L_K260Q)、 以序列識別號33表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為酪胺酸殘基，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141Y_H182L_K260Q)、 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141L_W253Q_K260E)、 以序列識別號32表示，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(H182L_W253Q_K260E)、 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為異白胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為組胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141I_W253H_K260E)、 以序列識別號33表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_H182L_K260E)、 以序列識別號33表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為酪胺酸殘基，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141Y_H182L_K260E)、 以序列識別號32表示，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(H182L_W253M_K260E)、 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_W253Q_K260Q)、 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為組胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_W253H_K260Q)、 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_W253L_K260Q)、 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為異白胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為組胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141I_W253H_K260Q)、或 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_W253M_K260Q)。 [69] 如[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、及[56]至[68]中任一項所載之多胜肽，其包含： 以序列識別號33表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為酪胺酸殘基，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141Y_H182M_K260E)、 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_W253M_K260E)、 以序列識別號32表示，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為組胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(H182L_W253H_K260E)、 以序列識別號33表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為酪胺酸殘基，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141Y_H182M_K260Q)、 以序列識別號33表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_H182M_K260E)、 以序列識別號33表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_H182L_K260Q)、 以序列識別號33表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為酪胺酸殘基，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141Y_H182L_K260Q)、 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141L_W253Q_K260E)、 以序列識別號32表示，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(H182L_W253Q_K260E)、 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為異白胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為組胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141I_W253H_K260E)、 以序列識別號33表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_H182L_K260E)、 以序列識別號33表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為酪胺酸殘基，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(M141Y_H182L_K260E)、 以序列識別號32表示，位於相當在第182位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列(H182L_W253M_K260E)、 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_W253Q_K260Q)、 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為組胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_W253H_K260Q)、 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為白胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_W253L_K260Q)、 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為異白胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為組胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141I_W253H_K260Q)、或 以序列識別號31表示，位於相當在第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位於相當在第253位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位於相當在第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩醯胺酸殘基之胺基酸序列(M141V_W253M_K260Q)。 [70] 如[4]、[5]、[9]、[10]、[13]、[19]、[20]、及[56]至[69]中任一項所載之多胜肽，其具有以序列識別號45~62中任一項所表示的胺基酸序列。 [71] 如[6]至[70]中任一項所載之多胜肽，其中對於以前述式(1)表示的化合物A的任1種以上或其鹽與以前述式(2)表示的化合物B的任1種以上或其鹽的還原胺化反應、或者前述化合物B的任1種以上或其鹽的分子内還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較具有序列識別號1表示的胺基酸序列的多胜肽的前述觸媒活性更高。 [72] 如[1]至[71]中任一項所載之多胜肽，其中對於以前述式(1)表示的化合物A的任1種以上或其鹽與以前述式(2)表示的化合物B的任1種以上或其鹽的還原胺化反應、或者前述化合物B的任1種以上或其鹽的分子内還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較具有序列識別號17表示的胺基酸序列的多胜肽的前述觸媒活性更高。 [73] 如[6]至[10]中任一項所載之多胜肽，其中前述烷基胺或其鹽選自由甲胺、乙胺以及該等的鹽所組成之群組中的1個以上。 [74] 如[6]至[10]及[73]中任一項所載之多胜肽，其中前述式(2’)表示的化合物或其鹽選自由苯丙酮酸、2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸、2-環戊基-2-側氧基-乙酸以及該等的鹽所組成之群組中的1個以上。 [75] 如[1]至[74]中任一項所載之多胜肽，其中對於乙胺或其鹽與苯丙酮酸或其鹽的還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較由序列識別號17表示的胺基酸序列構成的多胜肽的前述觸媒活性更高。 [76] 如[1]至[75]中任一項所載之多胜肽，其中對於乙胺或其鹽與2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸或其鹽的還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較由序列識別號17表示的胺基酸序列構成的多胜肽的前述觸媒活性更高。 [77] 如[1]至[76]中任一項所載之多胜肽，其中對於甲胺或其鹽與2-環戊基-2-側氧基-乙酸或其鹽的還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較由序列識別號17表示的胺基酸序列構成的多胜肽的前述觸媒活性更高。 [78] 如[1]至[77]中任一項所載之多胜肽，其在至少一種反應條件下，具有對於氨或其鹽與苯丙酮酸或其鹽的還原胺化反應之觸媒活性。 [79] 如[1]至[78]中任一項所載之多胜肽，其中前述改變選自由取代、缺失以及插入所組成之群組中的1個以上。 [80] 如[1]至[79]中任一項所載之多胜肽，其中前述改變為保守性取代。 [81] 如[1]至[80]中任一項所載之多胜肽，其中前述改變為取代。 [82] 如[1]至[81]中任一項所載之多胜肽，其中前述改變為和改變前的胺基酸殘基不同的對天然胺基酸的取代。 [83] 如[82]所載之多胜肽，其中前述天然胺基酸選自由甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、組胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺酸、麩胺酸、天門冬胺酸、甲硫胺酸、離胺酸、精胺酸以及脯胺酸所組成之群組中的1個以上。 [84] 如[1]至[83]中任一項所載之多胜肽，其中在N端及C端中的任一者或兩者包含選自由卵白素結合胜肽(Streptavidin-binding peptide)標籤序列及His標籤序列所組成之群組中的1個以上。 [85] 如[1]至[84]中任一項所載之多胜肽，其中作為單體存在時的胺基酸殘基數為300以上且400以下。 [86] 如[1]至[85]中任一項所載之多胜肽，其中較具有前述以序列識別號1表示的胺基酸序列之多胜肽的前述觸媒活性高的溫度是在0℃以上且50℃以下的範圍。 [87] 如[1]至[86]中任一項所載之多胜肽，其中較具有前述以序列識別號1表示的胺基酸序列之多胜肽的前述觸媒活性高的pH是在7以上且11以下的範圍。 [88] 如[1]至[5]中任一項所載之多胜肽，其中進行還原胺化反應之際的反應液總量中的反應起始時點的前述化合物A及其鹽的濃度總計為100mM以上且3000mM以下的範圍的至少一點中，較具有前述以序列識別號1表示的胺基酸序列之多胜肽的前述觸媒活性高。 [89] 如[1]至[5]及[88]中任一項所載之多胜肽，其中進行還原胺化反應之際的反應液總量中的反應起始時點的前述化合物B及其鹽的濃度總計為0.001mM以上且1000mM以下的範圍的至少一點中，較具有前述以序列識別號1表示的胺基酸序列之多胜肽的前述觸媒活性高。 [90] 如[1]至[5]、[88]及[89]中任一項所載之多胜肽，其中進行還原胺化反應之際的反應液總量中的反應起始時點的前述化合物A及其鹽的莫耳數總計相對於前述化合物B及其鹽的莫耳數總計的比值為1以上時的至少一點中，前述觸媒活性較具有前述以序列識別號1表示的胺基酸序列之多胜肽的前述觸媒活性高。 [91] 如[1]至[90]中任一項所載之多胜肽，其中在37℃、pH8的反應條件下，其具有較具有前述以序列識別號1表示的胺基酸序列的多胜肽的觸媒活性高的觸媒活性。 [92] 如[1]至[91]中任一項所載之多胜肽，其中在25℃、pH9的反應條件下，其具有較具有前述以序列識別號1表示的胺基酸序列的多胜肽的觸媒活性高的前述觸媒活性。 [93] 如[1]至[92]中任一項所載之多胜肽，其中前述觸媒活性的評估是在以下的反應條件下進行： 在苯丙酮酸、2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸、或2-環戊基-2-側氧基-乙酸為50mM，D(+)-葡萄糖為100mM，甲胺或乙胺為500mM，磷酸緩衝液為100mM，β-NADPH為0.89mM，GDH溶液為0.002unit/μL，評估對象的多胜肽為2.5μM的濃度，且在37℃、pH8的條件下反應起始，經過19小時的時點中，求得由還原胺化反應所生成的胺基酸產率。 [94] 如[1]至[93]中任一項所載之多胜肽，其為催化還原胺化反應的酵素。 [95] 如[1]至[94]中任一項所載之多胜肽，其中前述觸媒活性為具有前述以序列識別號1表示的胺基酸序列的多胜肽的前述觸媒活性的1.2倍以上。 [96] 如[1]至[5]及[88]至[90]中任一項所載之多胜肽，其中前述式(1)中，R 1為氫原子，R 2為C 1~C 6烷基。 [97] 如[1]至[5]、[88]至[90]及[96]中任一項所載之多胜肽，其中前述式(1)中，R 1為氫原子，R 2為乙基。 [98] 如[1]至[5]、[88]至[90]及[96]中任一項所載之多胜肽，其中前述式(1)中，R 1為氫原子，R 2為甲基。 [99] 如[1]至[5]及[88]至[90]中任一項所載之多胜肽，其中前述式(1)中，R 1及R 2為氫原子。 [100] 如[1]至[5]、[88]至[90]及[96]至[99]中任一項所載之多胜肽，其中式(2)中，Y為C 3~C 8環烷基或C 6~C 9芳烷基，該芳烷基可被C 1~C 3烷基或鹵素原子所取代。 [101] 如[1]至[5]、[88]至[90]及[96]至[100]中任一項所載之多胜肽，其中式(2)中，Y為C 3~C 8環烷基。 [102] 如[1]至[5]、[88]至[90]及[96]至[100]中任一項所載之多胜肽，其中式(2)中，Y為C 6~C 9芳烷基，該芳烷基可被C 1~C 3烷基或鹵素原子所取代。 [103] 如[1]至[5]及[88]至[90]中任一項所載之多胜肽，其中 前述式(1)中，R 1為氫原子，R 2為乙基， 前述式(2)中，n及m皆為0，Y為以式(3)表示的基，R 3為苯基，R 4、R 5及R 6皆為氫原子，p、q、r皆為1。 [104] 如[1]至[5]及[88]至[90]中任一項所載之多胜肽，其中 前述式(1)中，R 1為氫原子，R 2為乙基， 前述式(2)中，n及m皆為0，Y為以式(3)表示的基，R 3為對甲苯基，R 4、R 5及R 6皆為氫原子，p、q、r皆為1。 [105] 如[1]至[5]及[88]至[90]中任一項所載之多胜肽，其中 前述式(1)中，R 1為氫原子，R 2為甲基， 前述式(2)中，n及m皆為0，Y為以式(3)表示的基，R 3及R 4為彼此連結形成環戊烷環，R 5及R 6皆為氫原子，p、q、r皆為1。 [106] 一種經分離的核酸，其編碼如[1]至[105]中任一項所載之多胜肽。 [107] 一種載體，其包含如[106]所載之核酸。 [108] 一種轉形體(transformant)，其包含如[106]所載之核酸或如[107]所載之載體。 [109] 一種方法，其為製造多胜肽之方法，其包含培養如[108]所載之轉形體，已產生該多胜肽之步驟。 [110] 如[109]所載之方法，其更包含回收前述多胜肽之步驟。 [111] 一種還原胺化劑，其包含如[1]至[105]中任一項所載之多胜肽。 [112] 一種胺基酸的製造方法，其包含在如[1]至[105]中任一項所載之多胜肽及還原劑的存在下，使選自由胺、胺類似物及其鹽所組成之群組中的1種以上與選自由酮酸、酮酸類似物及其鹽所組成之群組中的1種以上進行反應，或者使選自由酮酸、酮酸類似物及其鹽所組成之群組的化合物在分子內進行反應之步驟。 [113] 如[112]所載之製造方法，其中前述反應在適當的條件下進行。 [114] 如[112]或[113]所載之製造方法，其中前述反應伴隨胺、胺類似物或其鹽與酮酸、酮酸類似物或其鹽的還原胺化反應。 [115] 如[112]至[114]中任一項所載之製造方法，其中前述胺或胺類似物是以上述式(1)表示，且該式(1)中的R 1及R 2分別與[1]的式(1)所載之R 1及R 2為相同定義。 [116] 如[112]至[115]中任一項所載之製造方法，其中前述酮酸或酮酸類似物是以上述式(2)表示，且該式(2)中的式(1’)、式(3)、X、Y、Z 1、Z 2、R 1a、R 3、R 4、R 5、R 6、m、n、p、q及r分別與[1]的式(2)所載的式(1’)、式(3)、X、Y、Z 1、Z 2、R 1a、R 3、R 4、R 5、R 6、m、n、p、q及r為相同定義。 [117] 如[112]至[116]中任一項所載之製造方法，其中前述酮酸或酮酸類似物是以式(2’)表示，且該式(2’)中的Y’與[6]所載的Y’為相同定義。 [118] 如[112]至[117]中任一項所載之製造方法，其中前述還原劑選自由菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH))、NADP+、菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)及NAD+所組成之群組中的1種以上。 [119] 如[112]至[118]中任一項所載之製造方法，其中前述反應在以下述式(4)表示的化合物C的存在下進行。 [化36] [式(4)中，v及w各自獨立表示為0或1，v及w中的任1個以上表示1，T表示碳原子、磷原子或硫原子， 以下述式(4a)表示的官能基表示=O、-ORd或羥基， [化37] v及w共同為1時，存在複數個的式(4a)表示的2個官能基可為相同亦可為不同， Ra、Rb及Rc各自獨立表示為氫原子、C 1~C 3烷基、烷基胺基或-CH 2-ORd， Ra、Rb及Rc中的任2個以上可與T共同彼此連結而形成環結構， Rd表示C 1~C 3烷基， d、e及f各自獨立表示為0或1， d、e及f中的任1個以上表示1， v及w共同為1時，Ra、Rb及Rc中的任1個以上為甲基，Ra、Rb及Rc皆不彼此連結而與T共同形成環結構， Ra、Rb及Rc中的任1個以上為甲基胺基時，Ra、Rb及Rc皆不彼此連結而與T共同形成環結構， 以式(4a)表示的官能基為羥基，且T為碳原子時，v為1，w為0，d、e及f皆為1，Ra、Rb及Rc皆為氫原子。] [120] 如[119]所載之製造方法，其中前述式(4)中，T為磷原子或硫原子，前述式(4a)表示的官能基為=O，Ra、Rb及Rc皆為甲基。 [121] 如[119]或[120]所載之製造方法，其中前述化合物C選自由二甲基亞碸、二甲基碸、二甲氧乙烷、三甲基氧膦(trimethylphosphine oxide)、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、四亞甲基亞碸(tetramethylene sulfoxide)、二乙基亞碸、甲醇及甲基甲醯胺所組成之群組中的1種以上的化合物。 [122] 如[119]至[121]中任一項所載之製造方法，其中前述化合物C為二甲基亞碸。 [123] 如[112]至[122]中任一項所載之製造方法，其包含以下步驟(A)及(B)： 步驟(A)；將藉由如[112]至[122]中任一項所載之方法而得到的純化對象物與含鋰物質接觸之步驟，該純化對象物為作為純化目標物之以下(i)與作為雜質的以下(ii)的混合物， (i)N端具有保護基的前述胺基酸 (ii)前述純化目標物以外的化合物， 步驟(B)；使前述純化目標物的鋰鹽析出之步驟。 [124] 一種胜肽化合物的製造方法，其包含以下步驟： (1) 藉由如[112]至[122]中任一項所載之方法製造胺基酸之步驟；以及 (2) 將前述胺基酸與選自由其他胺基酸及胜肽所組成之群組中的1種以上連結，而製造胜肽化合物之步驟。 [發明效果]
根據本發明，可提供能夠作為催化還原胺化反應的酵素利用的新穎多胜肽。又，根據本發明，可提供使用該多胜肽的胺基酸之製造方法。
下文，針對用於實施本發明的形態進行詳細說明。然而，本發明不限於以下實施形態。
本說明書中，「一或複數個」是指1個或2個以上的數目。「一或複數個」在內文中用於關於某個基的取代基時，此用語是指從一個到該基所允許的取代基最大數目之數目。具體而言，作為「一或複數個」可舉出例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10及/或較其更大的數目。
本說明書中，表示範圍的「～」包含其兩端的值，例如，「A~B」是指A以上，且B以下的範圍。
本說明書中，「約」之用語在與數值組合使用時，表示其數值的+10%及-10%的數值範圍。
本說明書中，「及/或」的用語意義包含「以及」與「或」適當組合的所有組合。具體而言，例如「A、B及/或C」包含以下7種的變體：(i)A、(ii)B、(iii)C、(iv)A及B、(v)A及C、(vi)B及C、(vii)A、B及C。
本說明書中「烷基」，是指從脂肪族烴將任意1個的氫原子去除所衍生的一價的基，在骨架中不含有雜原子(是指碳及氫原子以外的原子)或不飽和的碳-碳鍵結，具有含有氫及碳原子的烴基，或烴基結構的部分集合。烷基不只包含直鏈狀者，亦包含支鏈狀者。作為烷基，具體而言，可舉出碳原子數1~20(C 1~C 20，以下「C p~C q」是指碳原子數為p~q個)的烷基，較佳為C 1~C 10烷基，更佳為C 1~C 6烷基。作為烷基，具體而言，可舉出甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、二級丁基、三級丁基、異丁基(2-甲基丙基)、正戊基、二級戊基(1-甲基丁基)、三級戊基(1,1-二甲基丙基)、新戊基(2,2-二甲基丙基)、異戊基(3-甲基丁基)、3-戊基(1-乙基丙基)、1,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、正己基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1,1,2,2-四甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基等。
本說明書中「烯基」，是指具有至少1個雙鍵(2個鄰接SP 2碳原子)的一價基。根據雙鍵及取代部分(如果存在)的配置，雙鍵的幾何學形態可採反側(entgegen)(E)或同側(zusammen)(Z)、順式或反式配置。烯基包含直鏈狀者，亦包含支鏈狀者。作為烯基，較佳可舉出C 2~C 10烯基，更佳為C 2~C 6烯基，具體而言，可舉出例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基(包含順式、反式)、3-丁烯基、戊烯基、3-甲基-2-丁烯基、己烯基等。
本說明書中的「炔基」為具有至少1個三鍵(2個鄰接SP碳原子)的一價基。炔基包含直鏈狀者，亦包含支鏈狀者。作為炔基，較佳可舉出C 2~C 10炔基，更佳為C 2~C 6炔基，具體而言，可舉出例如乙炔基、1-丙炔基、炔丙基、3-丁炔基、戊炔基、己炔基、3-苯基-2-丙炔基、3-(2'-氟苯基)-2-丙炔基、2-羥基-2-丙炔基、3-(3-氟苯基)-2-丙炔基、3-甲基-(5-苯基)-4-戊炔基等。
本說明書中「環烷基」表示飽和或部分飽和的環狀一價脂肪族烴基，包含單環、雙環、螺環。作為環烷基較佳可舉出C 3-C 8環烷基，具體而言，可舉出例如環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基、雙環〔2.2.1〕庚基、螺〔3.3〕庚基等。
本說明書中「芳基」是指一價的芳香族烴環，較佳可舉出C 6-C 10芳基。作為芳基，具體而言，可舉出例如苯基、萘基(例如，1-萘基、2-萘基)等。
本說明書中「雜環基」是指含有碳原子再加上1～5個雜原子，非芳香族的環狀的一價的基。雜環基可在環中具有雙鍵及/或三鍵，環中的碳原子亦可被氧化而形成羰基，可以是單環也可以是縮合環。構成環的原子數目，較佳為4～10(4～10員雜環基)，更佳為4～7(4～7員雜環基)。作為雜環基，具體而言，可舉出例如氮雜環丁烷基(azetidinyl)、環氧乙烷基(oxiranyl)、氧雜環丁烷基(oxetanyl)、二氫呋喃基(dihydrofuryl)、四氫呋喃基(tetrahydrofuryl)、二氫哌喃基(dihydropyranyl)、四氫哌喃基(tetrahydropyranyl)、四氫吡啶基(tetrahydropyridyl)、四氫嘧啶基(tetrahydropyrimidyl)、嗎啉基(morpholinyl)、噻嗎啉基(thiomorpholinyl)、吡咯啶基(pyrrolidinyl)、哌啶基(piperidinyl)、哌𠯤基(piperazinyl)、吡唑啶基(pyrazolidinyl)、咪唑啉基(imidazolinyl)、咪唑啶基(imidazolidinyl)、㗁唑啶基(oxazolidinyl)、異㗁唑啶基(isoxazolidinyl)、四氫噻唑基(thiazolidinyl)、異四氫噻唑基(isothiazolidinyl)、1,2-噻𠯤基(thiazinane)、噻二唑基(thiadiazolidinyl)、㗁唑烷酮基(oxazolidone)、苯并二㗁烷基(benzodioxanyl)、苯并㗁唑基(benzoxazolyl)、二氧戊環基(dioxolanyl)、二㗁烷基(dioxanyl)、四氫吡咯并[1,2-c]咪唑基、硫雜環丁基(thietanyl)、3,6-二氮雜二環[3.1.1]庚基(heptanyl)、2,5-二氮雜二環[2.2.1]庚基、3-氧雜-8-氮雜二環[3.2.1]辛基(octanyl)、磺內醯胺(sultam)、2-氧雜螺[3.3]庚基等。
本說明書中的「受保護的雜環基」表示前述定義的「雜環基」所含的1或複數個官能基，例如胺基被任意的保護基所保護的基，較佳可舉出受保護的4~7員雜環基。作為保護基，具體而言，可舉出例如Boc、Fmoc、Cbz、Troc、Alloc等，作為受保護的雜環基，具體而言，可舉出例如Boc保護的氮雜環丁烷等。
本說明書中的「雜環亞烷基(heterocycloalkylidene)」是指經由自前述定義的「雜環基」的1個碳原子去除2個氫原子所產生的游離原子價成為雙鍵的一部分的二價基。作為雜環亞烷基較佳為4~7員雜環亞烷基，具體而言，可舉出例如四氫哌喃-4-亞基(tetrahydropyran-4-ylidene)、氮雜環丁烷-3-亞基(azetidine-3-ylidene)等。
本說明書中的「受保護的雜環亞烷基」是指前述定義的「雜環亞烷基」所含的1或複數個的官能基，例如胺基被任意的保護基所保護的基，較佳為受保護的4~7員雜環亞烷基。作為保護基，具體而言，可舉出例如Boc、Fmoc、Cbz、Troc、Alloc等，作為受保護的雜環亞烷基，具體而言，可舉出例如Boc保護的氮雜環丁烷-3-亞基等。
本說明書中的「雜芳基」是指除碳原子外含有1~5個雜原子的芳香族性的環狀一價基。環可為單環，也可和其他環縮合，也可以部分被飽和。構成環的原子數可為5~12(5~12員雜芳基)，可為6~10(6~10員雜芳基)，可為6~7(6~7員雜芳基)。作為雜芳基，具體而言，可舉出例如呋喃基(furyl)、噻吩基(thienyl)、吡咯基(pyrrolyl)、咪唑基(imidazolyl)、吡唑基(pyrazolyl)、噻唑基(thiazolyl)、異噻唑基(isothiazolyl)、㗁唑基(oxazolyl)、異㗁唑基(isoxazolyl)、㗁二唑基(oxadizolyl)、噻二唑基(thiadizolyl)、三唑基(triazolyl)、四唑基(tetrazolyl)、吡啶基(pyridyl)、嘧啶基(pyrimidyl)、嗒𠯤基(pyridazinyl)、吡𠯤基(pyrazinyl)、三𠯤基(triazinyl)、苯并呋喃基(benzofuranyl)、苯并噻吩基(benzothienyl)、苯并噻二唑基(benzothiadiazolyl)、苯并噻唑基(benzothiazolyl)、苯并㗁唑基(benzoxazolyl)、苯并㗁二唑基(benzoxadiazolyl)、苯并咪唑基(benzoimidazolyl)、吲哚基(indolyl)、異吲哚基(isoindolyl)、吲唑基(indazolyl)、喹啉基(quinolyl)、異喹啉基(isoquinolyl)、噌啉基(cinnolinyl)、喹唑啉基(quinazolinyl)、喹㗁啉基(quinoxalinyl)、苯并間二氧雜環戊烯基(benzodioxolyl)、吲哚𠯤基(indolizinyl)、咪唑并吡啶基(imidazopyridyl)等。
本說明書中「烷氧基」是指與前述定義的「烷基」鍵結的氧基，較佳可舉出C 1-C 6烷氧基。作為烷氧基，具體而言，可舉出例如甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、二級丁氧基、三級丁氧基、戊氧基、3-甲基丁氧基等。
本說明書中「烷硫基」是指與前述定義的「烷基」鍵結的硫基，較佳可舉出C 1-C 6烷氧基。作為烷硫基，具體而言，可舉出例如甲硫基、乙硫基、1-丙硫基、2-丙硫基、正丁硫基、異丁硫基、二級丁硫基、三級丁硫基等。
本說明書中的「烯氧基」是指與前述定義的「烯基」鍵結的氧基，較佳為C 2~C 6烯氧基。作為烯氧基，具體而言，可舉出例如乙烯氧基、烯丙氧基、1-丙烯氧基、2-丙烯氧基、1-丁烯氧基，2-丁烯氧基(包含順式、反式)、3-丁烯氧基、戊烯氧基、己烯氧基等。
本說明書中「環烷氧基」是指與前述定義的「環烷基」鍵結的氧基，較佳可舉出C 3-C 8環烷氧基。作為環烷氧基，具體而言，可舉出例如環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基等。
本說明書中的「芳氧基」是指與前述定義的「芳基」鍵結的氧基，較佳為C 6~C 10芳氧基。作為芳氧基，具體而言，可舉出例如苯氧基、1-萘氧基、2-萘氧基等。
本說明書中的「胺基」，狹義是指-NH 2，廣義是指-NRR'，此處R及R'獨立選自由氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環基、芳基、或雜芳基，或者R及R'和該等鍵結的氮原子共同形成環。胺基較佳為NH 2、單C 1~C 6烷基胺基、二C 1~C 6烷基胺基、4~8員環狀胺基等。
本說明書中的「單烷基胺基」是指前述定義的「胺基」之中的R為氫原子，且R'為前述定義的「烷基」的基，較佳可舉出單C 1~C 6烷基胺基。作為單烷基胺基，具體而言，可舉出例如甲胺基、乙胺基、正丙胺基、異丙胺基、正丁胺基、二級丁胺基、三級丁胺基等。
本說明書中的「二烷基胺基」是指前述定義的「胺基」之中的R及R'獨立為前述定義的「烷基」的基，較佳可舉出二C 1~C 6烷基胺基。作為二烷基胺基，具體而言，可舉出例如二甲胺基、二乙胺基等。
本說明書中的「環狀胺基」是指前述定義的「胺基」之中R及R'和與該等鍵結的氮原子共同形成環的基，較佳可舉出4~8員環狀胺基。作為環狀胺基，具體而言，可舉出例如1-氮雜環丁烷基(1-azetidyl)、1-吡咯烷基(1-pyrrolidyl)、1-哌啶基(1-piperidyl)、1-哌𠯤基(1-piperazyl)、4-嗎啉基(4-morpholinyl)、3-㗁唑啶基(3-oxazolidyl)、1,1-二氧化硫代嗎啉-4-基(1,1-dioxidethiomorpholinyl-4-yl)、3-氧雜-8-氮雜雙環〔3.2.1〕辛烷-8-基(3-oxa-8-azabicyclo〔3.2.1〕octan-8-yl)等。
本說明書中的「受保護的胺基」是指以任意的保護基所保護的胺基。作為受保護的胺基，具體而言，可舉出例如以Boc、Fmoc、Cbz、Troc、Alloc等的保護基所保護的胺基。
本說明書中的「胺羰基」是指與前述定義的「胺基」鍵結的羰基，較佳可舉出-CONH 2、單C 1~C 6烷基胺羰基、二C 1~C 6烷基胺羰基、4~8員環狀胺羰基。作為胺羰基，具體而言，可舉出例如-CONH 2、二甲基胺羰基、1-氮雜環丁烷基羰基、1-吡咯啶基羰基、1-哌啶基羰基、1-哌𠯤基羰基、4-嗎啉基羰基、3-㗁唑啶基羰基、1,1-二氧化硫代嗎啉-4-基羰基、3-氧雜-8-氮雜二環〔3.2.1〕辛烷-8-基羰基等。
本說明書中的「烯氧羰基」是指與前述定義的「烯氧基」鍵結的羰基，較佳可舉出C 2~C 6烯氧羰基。作為烯氧羰基，具體而言，可舉出例如乙烯氧羰基、烯丙氧羰基、1-丙烯氧羰基、2-丙烯氧羰基、1-丁烯氧羰基，2-丁烯氧羰基(包含順式、反式)、3-丁烯氧羰基、戊烯氧羰基、己烯氧羰基等。
本說明書中的「烷磺醯基」是指與前述定義的「烷基」鍵結的磺醯基，較佳可舉出C 1~C 6烷磺醯基。作為烷磺醯基，具體而言，可舉出例如甲基磺醯基等。
本說明書中的「羥烷基」是指前述定義的「烷基」的1個或複數個的氫原子被羥基取代的基，較佳可舉出C 1~C 6羥烷基。作為羥烷基，具體而言，可舉出例如羥甲基、1-羥乙基、2-羥乙基、2-羥基-2-甲基丙基、5-羥戊基等。
本說明書中的「鹵烷基」是指前述定義的「烷基」的1個或複數個的氫原子被鹵素原子取代的基，較佳為C 1~C 6鹵烷基，更佳為C 1~C 6氟烷基。作為鹵烷基，具體而言，可舉出例如二氟甲基、三氟甲基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、3,3-二氟丙基、4,4-二氟丁基、5,5-二氟戊基等。
本說明書中的「氰烷基」是指前述定義的「烷基」的1個或複數個的氫原子被氰基取代的基，較佳為C 1~C 6氰烷基。作為氰烷基，具體而言，可舉出例如氰甲基、2-氰乙基等。
本說明書中的「胺烷基」是指前述定義的「烷基」的1個或複數個的氫原子被上述定義的「胺基」所取代的基，較佳為C 1~C 6胺烷基。作為胺烷基，具體而言，可舉出例如1-吡啶基甲基、2-(1-哌啶基)乙基、3-(1-哌啶基)丙基、4-胺丁基等。
本說明書中的「羧烷基」是指前述定義的「烷基」的1個或複數個的氫原子被羧基取代的基，較佳為C 2~C 6羧烷基。作為羧烷基，具體而言，可舉出例如羧甲基等。
本說明書中的「烯氧羰烷基」是指前述定義的「烷基」的1個或複數個的氫原子被前述定義的「烯氧羰基」所取代的基，較佳為C 2~C 6烯氧羰基C 1~C 6烷基，更佳為C 2~C 6烯氧羰基C 1~C 2烷基。作為烯氧羰烷基，具體而言，可舉出例如烯丙氧羰基甲基、2-(烯丙基氧羰基)乙基等。
本說明書中的「烷氧基烷基」是指前述定義的「烷基」的1個或複數個的氫原子被前述定義的「烷氧基」所取代的基，較佳為C 1~C 6烷氧基C 1~C 6烷基，更佳為C 1~C 6烷氧基C 1~C 2烷基。作為烷氧基烷基，具體而言，可舉出例如甲氧基甲基、乙氧基甲基、1-丙氧基甲基、2-丙氧基甲基、正丁氧基甲基、異丁氧基甲基、二級丁氧基甲基、三級丁氧基甲基、戊氧基甲基、3-甲基丁氧基甲基、1-甲氧基乙基、2-甲氧基乙基、2-乙氧基乙基等。
本說明書中的「烷硫基烷基」是指前述定義的「烷基」的1個或複數個的氫原子被前述定義的「烷硫基」所取代的基，較佳為C 1~C 6烷硫基C 1~C 6烷基，更佳為C 1~C 6烷硫基C 1~C 2烷基。作為烷硫基烷基，具體而言，可舉出例如甲硫基甲基、乙硫基甲基、1-丙硫基甲基、2-丙硫基甲基、正丁硫基甲基、異丁硫基甲基、二級丁硫基甲基、三級丁硫基甲基等。
本說明書中的「烯氧基烷基」是指前述定義的「烷基」的1個或複數個的氫原子被前述定義的「烯氧基」所取代的基，較佳為C 2~C 6烯氧基C 1~C 6烷基，更佳為C 1~C 6烯氧基C 1~C 2烷基。作為烯氧基烷基，具體而言，可舉出例如乙烯氧基甲基、烯丙氧基甲基等。
本說明書中的「環烷基烷基」是指前述定義的「烷基」的1個或複數個的氫原子被前述定義的「環烷基」所取代的基，較佳為C 3~C 8環烷基C 1~C 6烷基，更佳為C 3~C 6環烷基C 1~C 2烷基。作為環烷基烷基，具體而言，可舉出例如環丙基甲基、環丁基甲基、環戊基甲基、環己基甲基等。
本說明書中的「環烷氧基烷基」是指前述定義的「烷基」的1個或複數個的氫原子被前述定義的「環烷氧基」所取代的基，較佳為C 3~C 8環烷氧基C 1~C 6烷基，更佳為C 3~C 6環烷氧基C 1~C 2烷基。作為環烷氧基烷基，具體而言，可舉出例如環丙氧基甲基、環丁氧基甲基等。
本說明書中的「雜環基烷基」是指前述定義的「烷基」的1個或複數個的氫原子被前述定義的「雜環基」所取代的基，較佳為4~7員雜環基C 1~C 6烷基，更佳為4~7員雜環基C 1~C 2烷基。作為雜環基烷基，具體而言，可舉出例如2-(四氫-2H-哌喃-4-基)乙基、2-(氮雜環丁烷-3-基)乙基等。
本說明書中的「烷磺醯基烷基」是指前述定義的「烷基」的1個或複數個的氫原子被前述定義的「烷磺醯基」所取代的基，較佳為C 1~C 6烷磺醯基C 1~C 6烷基，更佳為C 1~C 6烷磺醯基C 1~C 2烷基。作為烷磺醯基烷基，具體而言，可舉出例如甲磺醯基甲基、2-(甲磺醯基)乙基等。
本說明書中的「胺羰基烷基」是指前述定義的「烷基」的1個或複數個的氫原子被前述定義的「胺羰基」所取代的基，較佳為胺羰基C 1~C 6烷基，更佳為胺羰基C 1~C 4烷基。作為胺羰基烷基，具體而言，可舉出例如甲基胺羰基甲基、二甲基胺羰基甲基、三級丁基胺羰基甲基、1-氮雜環丁烷基羰基甲基、1-吡咯啶基羰基甲基、1-哌啶基羰基甲基、4-嗎啉基羰基甲基、2-(甲基胺羰基)乙基、2-(二甲基胺羰基)乙基、2-(1-氮雜環丁烷基羰基)乙基、2-(1-吡咯啶基羰基)乙基、2-(4-嗎啉基羰基)乙基、3-(二甲基胺羰基)丙基、4-(二甲基胺羰基)丁基等。
本說明書中的「芳氧基烷基」是指前述定義的「烷基」的1個或複數個的氫原子被前述定義的「芳氧基」所取代的基，較佳為C 6~C 10芳氧基C 1~C 6烷基，更佳為C 6~C 10芳氧基C 1~C 2烷基。作為芳氧基烷基，具體而言，可舉出例如苯氧基甲基、2-苯氧基乙基等。
本說明書中的「芳烷基(芳基烷基)」是指前述定義的「烷基」的至少1個氫原子被前述定義的「芳基」所取代的基，較佳為C 7~C 14芳烷基，更佳為C 7~C 10芳烷基。作為芳烷基，具體而言，可舉出例如苄基、苯乙基、3-苯丙基等。
本說明書中的「芳烷氧基」是指與前述定義的「芳烷基」鍵結的氧基，較佳為C 7~C 14芳烷氧基，更佳為C 7~C 10芳烷氧基。作為芳烷氧基，具體而言，可舉出例如苄氧基、苯乙氧基、3-苯丙氧基等。
本說明書中的「芳烷氧基烷基」是指前述定義的「烷基」的1個或複數個的氫原子被前述定義的「芳烷氧基」所取代的基，較佳為C 7~C 14芳烷氧基C 1~C 6烷基，更佳為C 7~C 14芳烷氧基C 1~C 2烷基。作為芳烷氧基烷基，具體而言，可舉出例如苄氧基甲基、1-(苄氧基)乙基等。
本說明書中的「雜芳基烷基」是指前述定義的「烷基」的至少1個氫原子被前述定義的「雜芳基」所取代的基，較佳為5~10員雜芳基C 1~C 6烷基，更佳為5~10員雜芳基C 1~C 2烷基。作為雜芳基烷基，具體而言，可舉出例如3-噻吩基甲基、4-噻唑基甲基、2-吡啶基甲基、3-吡啶基甲基、4-吡啶基甲基、2-(2-吡啶基)乙基、2-(3-吡啶基)乙基、2-(4-吡啶基)乙基、2-(6-喹啉基)乙基、2-(7-喹啉基)乙基、2-(6-吲哚基)乙基、2-(5-吲哚基)乙基、2-(5-苯并呋喃基)乙基等。
本說明書中的「雜芳基烷氧基」是指與前述定義的「雜芳基烷基」鍵結的氧基，較佳為5~10員雜芳基C 1~C 6烷氧基，更佳為5~10員雜芳基C 1~C 2烷氧基。作為雜芳基烷氧基，具體而言，可舉出例如3-噻吩基甲氧基、3-吡啶基甲氧基。
本說明書中的「雜芳基烷氧基烷基」是指前述定義的「烷基」的1個或複數個的氫原子被前述定義的「雜芳基烷氧基」所取代的基，較佳為5~10員雜芳基C 1~C 6烷氧基C 1~C 6烷基，更佳為5~10員雜芳基C 1~C 2烷氧基C 1~C 2烷基。作為雜芳基烷氧基烷基，具體而言，可舉出例如3-吡啶基甲氧基甲基等。
本說明書中的「雜環亞烷基烷基」是指前述定義的「烷基」的1個或複數個的氫原子被前述定義的「雜環亞烷基」所取代的基，較佳為4~7員雜環亞烷基C 1~C 6烷基，更佳為4~7員雜環亞烷基C 1~C 2烷基。作為雜環亞烷基烷基，具體而言，可舉出例如四氫-4H-哌喃-4-亞基甲基、氮雜環丁烷-3-亞基甲基等。
本說明書中的「烷氧基烯基」是指前述定義的「烯基」的1個或複數個的氫原子被前述定義的「烷氧基」所取代的基，較佳為C 1~C 6烷氧基C 2~C 6烯基。作為烷氧基烯基，具體而言，可舉出例如(E)-4-甲氧基丁-2-烯-1-基等。
本說明書中的「胺羰基烯基」是指前述定義的「烯基」的1個或複數個的氫原子被前述定義的「胺羰基」所取代的基，較佳為胺羰基C 2~C 6烯基。作為胺羰基烯基，具體而言，可舉出例如(E)-3-(二甲基胺羰基羰基)-丙-2-烯-1-基等。
本說明書中的「鹵烷氧基」是指前述定義的「烷氧基」的1個或複數個的氫原子被鹵素原子所取代的基，較佳為C 1~C 6鹵烷氧基。作為鹵烷氧基，具體而言，可舉出例如二氟甲氧基、三氟甲氧基、2,2-二氟乙氧基、2,2,2-三氟乙氧基等。
本說明書中的「伸烷基(alkylene)」是指前述的「烷基」去除1個任意的氫原子所衍生的二價基，較佳為C 4~C 8伸烷基。作為伸烷基具體而言，可舉出-CH 2-、-(CH 2) 2-、-(CH 2) 3-、-CH(CH 3)CH 2-、-C(CH 3) 2-、-(CH 2) 4-、-CH(CH 3)CH 2CH 2-、-C(CH 3) 2CH 2-、-CH 2CH(CH 3)CH 2-、-CH 2C(CH 3) 2-、-CH 2CH 2CH(CH 3)-、-(CH 2) 5-、-(CH 2) 6-、-(CH 2) 7-、-(CH 2) 8-等。
本說明書中的「環伸烷基」是指前述「環烷基」去除1個任意的氫原子所衍生的二價基，較佳為C 3~C 8環伸烷基。作為環伸烷基具體而言，可舉出環丙烷-1,2-二基、環丁烷-1,2-二基、環戊烷-1,2-二基、環己烷-1,2-二基等。
本說明書中的「伸烯基(alkenylene)」是指前述「烯基」去除1個任意的氫原子所衍生的二價基。根據雙鍵及取代部分(如果存在)的配置，雙鍵的幾何學形態可採反側(entgegen)(E)或同側(zusammen)(Z)、順式或反式配置。伸烯基包含直鏈狀或支鏈狀者，較佳為C 2~C 10伸烯基，更佳為C 2~C 6伸烯基。
本說明書中的「伸炔基(alkynylene)」是指前述「炔基」去除1個任意的氫原子所衍生的二價基。伸炔基包含直鏈狀或支鏈狀者，較佳為C 2~C 10伸炔基，更佳為C 2~C 6伸炔基。
本說明書中的「伸芳基(arylene)」是指前述「芳基」去除1個任意的氫原子所衍生的二價基。伸芳基可以是單環也可以是縮合環。構成環的原子數目並未特別限定，較佳為6~10(C 6~C 10伸芳基)。作為伸芳基，具體而言，可舉出例如1,2-伸苯基(phenylene)、1,3-伸苯基、1,4-伸苯基、1,2-伸萘基、1,3-伸萘基、1,4-伸萘基等。
本說明書中的「螺環烷基」是指構成環烷烴環的1個碳原子為與鍵結對象的基中的碳原子共有而形成的基。作為螺環烷基，較佳可舉出C 3~C 8螺環烷基，具體而言，可舉出螺環丙基、螺環丁基、螺環戊基、螺環己基、螺環庚基、螺環辛基等。
本說明書中的「螺雜環基」是指前述「螺環烷基」的1個或複數個的碳原子被1個或複數個的雜原子所取代的基。作為螺雜環基，較佳可舉出4~10員螺雜環基。
本說明書中的「脂環式環」是指非芳香族烴環。脂環式環在環中可具有不飽和鍵，也可為具有2個以上的環的多環性的環。又，構成環的碳原子也可被氧化而形成羰基。作為脂環式環，較佳可舉出3~8員脂環式環，具體而言，可舉出例如環丙烷環、環丁烷環、環戊烷環、環己烷環、環庚烷環、環辛烷環、二環〔2.2.1〕庚烷環等。
本說明書中的「雜環」是指構成環的原子中含有較佳1~5個，更佳1~3個雜原子的非芳香族的雜環。雜環的環中可具有雙鍵及/或三鍵、環中的碳原子也可被氧化而形成羰基，可為單環、縮合環、螺環。構成環的原子數目較佳為3~12(3~12員雜環)，更佳為4~8(4~8員雜環)。作為雜環，具體而言，可舉出例如氮雜環丁烷環、氧環丁烷(oxetane)環、四氫呋喃環、四氫哌喃環、嗎啉環、硫代嗎啉環、吡咯啶環、4-側氧基吡咯啶(4-oxopyrrolidine)環、哌啶環、4-側氧基哌啶(4-oxopiperidine)環、哌𠯤環、吡唑啶(pyrazolidine)環、咪唑啶(imidazolidine)環、㗁唑啶(oxazolidine)環、異㗁唑啶環、四氫噻唑(thiazolidine)環、異四氫噻唑環、噻二唑(thiadiazolidine)環、㗁唑烷酮(oxazolidone)環、二氧戊環(dioxolane)環、二㗁烷(dioxane)環、噻呾(thietane)環、八氫吲哚環、或氮雜環辛烷(azocane)環、或者該等的飽和雜環中的1個或複數個的單鍵被雙鍵或三鍵所取代的環等。
本說明書中的「飽和雜環」是指除碳原子外含有1~5個雜原子、環中不含雙鍵及/或三鍵的非芳香族的雜環。飽和雜環可為單環，也可和其他環例如苯環等的芳香環形成縮合環。在飽和雜環形成縮合環的情形，作為飽和雜環較佳為4~7員飽和雜環，具體而言，可舉出例如氮雜環丁烷環、氧環丁烷環、四氫呋喃環、四氫哌喃環、嗎啉環、硫代嗎啉環、吡咯啶環、4-側氧基吡咯啶環、哌啶環、4-側氧基哌啶環、哌𠯤環、吡唑啶環、咪唑啶環、㗁唑啶環、異㗁唑啶環、四氫噻唑環、異四氫噻唑環、噻二唑環、㗁唑烷酮環、二氧戊環環、二㗁烷環、噻呾環、八氫吲哚環、吲哚啉(indoline)環、氮雜環庚烷(azepane)等。
本說明書中的「胺基酸」，包含天然胺基酸及非天然胺基酸。本說明書中的「天然胺基酸」，是指Gly、Ala、Ser、Thr、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、His、Glu、Asp、Gln、Asn、Cys、Met、Lys、Arg、Pro。非天然胺基酸並無特別限制，可例示β-胺基酸、γ-胺基酸、D型胺基酸、N-取代胺基酸、α,α-雙取代胺基酸、側鏈與天然胺基酸不同的胺基酸、羥基羧酸等。本說明書中的非天然的Ｎ取代胺基酸是指Pro以外的Ｎ取代胺基酸。作為本說明書中的胺基酸，容許任意的立體配置。胺基酸的側鏈的選擇並無特別限制，氫原子之外，例如，還可從烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、環烷基中自由地選擇，該等基中不鄰接的1或2個亞甲基可以氧原子、羰基(-CO-)、或磺醯基(-SO 2-)所取代。其各自上可賦予取代基，此等取代基也沒有限制，可以從包括例如，鹵素原子、O原子、S原子、N原子、B原子、Si原子或P原子的任意的取代基當中，獨立地自由選擇1個或2個以上。亦即，可例示，可經取代的烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、環烷基等。在非限定的一態樣中，本說明書中的胺基酸，可以是在同一分子內具有羧基及胺基的化合物(即使是此情況，如脯胺酸、羥基脯胺酸之類的亞胺基酸也可包含在胺基酸中)。
胺基酸的主鏈胺基可為非取代(NH 2基)，也可為被取代(亦即，-NHR基：R表示可有取代基的烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、環烷基，此等的基之中未鄰接的1或2個亞甲基可被氧原子、羰基(-CO-)、或磺醯基(-SO 2-)所取代，又也可如脯胺酸使鍵結於N原子的碳鏈和α位的碳原子形成環)。前述R的取代基選擇和上述胺基酸側鏈的取代基相同。在主鏈胺基被取代的情形的前述R包含於本說明書中的「胺基酸的側鏈」中。如此的主鏈胺基被取代的胺基酸，在本說明書稱為「N取代胺基酸」。作為本說明書中的「N取代胺基酸」，較佳例示為N-烷基胺基酸、N-C 1~C 6烷基胺基酸、N-C 1~C 4烷基胺基酸、N-甲基胺基酸，但不限於此等。
本說明書中的「胺基酸」包括各別所對應的全部同位素(isotope)。「胺基酸」的同位素為至少1個原子被原子數(質子數)相同，質量數(質子與中子的數的總和)相異的原子所取代者。作為本說明書中的「胺基酸」中所含的同位素的例子，有氫原子、碳原子、氮原子、氧原子、磷原子、硫原子、氟原子、氯原子等，分別包括 2H、 3H、 13C、 14C、 15N、 17O、 18O、 31P、 32P、 35S、 18F、 36Cl等。
作為本說明書中的包含鹵素原子的取代基，例示為在取代基具有鹵素的烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基等，更具體而言，例示為氟烷基、二氟烷基、三氟烷基等。
作為本說明書中的包含氧原子的取代基，可舉出羥基(-OH)、氧基(-OR)、羰基(-C(=O)-R)、羧基(-CO 2H)、氧羰基(-C(=O)-OR)、羰基氧基(-O-C(=O)-R)、硫羰基(-C(=O)-SR)、羰基硫基(-S-C(=O)-R)、胺羰基(-C(=O)-NHR)、羰基胺基(-NH-C(=O)-R)、氧羰基胺基(-NH-C(=O)-OR)、磺醯基胺基(-NH-SO 2-R)、胺基磺醯基(-SO 2-NHR)、胺磺醯基胺基(-NH-SO 2-NHR)、硫羧基(-C(=O)-SH)、羧基羰基(-C(=O)-CO 2H)等的基。
作為氧基(-OR)的例子，可舉出烷氧基、環烷氧基、烯氧基、炔基氧基、芳氧基、雜芳氧基、芳烷基氧基等。作為烷氧基，較佳為C 1~C 4烷氧基、C 1~C 2烷氧基，其中較佳為甲氧基、或乙氧基。
作為羰基(-C(=O)-R)的例子，可舉出甲醯基(-C(=O)-H)、烷基羰基、環烷基羰基、烯基羰基、炔基羰基、芳基羰基、雜芳基羰基、芳烷基羰基等。
作為氧羰基(-C(=O)-OR)的例子，可舉出烷基氧羰基、環烷基氧羰基、烯氧基羰基、炔基氧羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基、芳烷基氧羰基等。
作為羰基氧基(-O-C(=O)-R)的例子，可舉出烷基羰基氧基、環烷基羰基氧基、烯基羰基氧基、炔基羰基氧基、芳基羰基氧基、雜芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基等。
作為硫羰基(-C(=O)-SR)的例子，可舉出烷硫基羰基、環烷硫基羰基、烯基硫羰基、炔基硫羰基、芳基硫羰基、雜芳基硫羰基、芳烷基硫羰基等。
作為羰基硫基(-S-C(=O)-R)的例子，可舉出烷基羰基硫基、環烷基羰基硫基、烯基羰基硫基、炔基羰基硫基、芳基羰基硫基、雜芳基羰基硫基、芳烷基羰基硫基等。
作為胺羰基(-C(=O)-NHR)的例子，可舉出烷基胺羰基(例如，C 1~C 6或C 1~C 4烷基胺羰基，其中例示為乙基胺羰基、甲基胺羰基等)、環烷基胺羰基、烯基胺羰基、炔基胺羰基、芳基胺羰基、雜芳基胺羰基、芳烷基胺羰基等。除此之外，可舉出-C(=O)-NHR中與N原子鍵結的H原子可進一步被烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基取代的化合物。
作為羰基胺基(-NH-C(=O)-R)的例子，可舉出烷基羰基胺基、環烷基羰基胺基、烯基羰基胺基、炔基羰基胺基、芳基羰基胺基、雜芳基羰基胺基、芳烷基羰基胺基等。除此之外，可舉出-NH-C(=O)-R中與N原子鍵結的H原子可進一步被烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基取代的化合物。
作為氧羰基胺基(-NH-C(=O)-OR)的例子，可舉出烷氧基羰基胺基、環烷氧基羰基胺基、烯氧基羰基胺基、炔基氧羰基胺基、芳氧基羰基胺基、雜芳氧基羰基胺基、芳烷基氧羰基胺基等。除此之外，可舉出-NH-C(=O)-OR中與N原子鍵結的H原子可進一步被烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基取代的化合物。
作為磺醯基胺基(-NH-SO 2-R)的例子，可舉出烷磺醯基胺基、環烷基磺醯基胺基、烯基磺醯基胺基、炔基磺醯基胺基、芳基磺醯基胺基、雜芳基磺醯基胺基、芳烷基磺醯基胺基等。除此之外，可舉出-NH-SO 2-R中與N原子鍵結的H原子可進一步被烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基取代的化合物。
作為胺基磺醯基(-SO 2-NHR)的例子，可舉出烷基胺基磺醯基、環烷基胺基磺醯基、烯基胺基磺醯基、炔基胺基磺醯基、芳基胺基磺醯基、雜芳基胺基磺醯基、芳烷基胺基磺醯基等。除此之外，可舉出-SO 2-NHR中與N原子鍵結的H原子可進一步被烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基取代的化合物。
作為胺磺醯基胺基(-NH-SO 2-NHR)的例子，可舉出烷基胺磺醯基胺基、環烷基胺磺醯基胺基、烯基胺磺醯基胺基、炔基胺磺醯基胺基、芳基胺磺醯基胺基、雜芳基胺磺醯基胺基、芳烷基胺磺醯基胺基等。再者，-NH-SO 2-NHR中與N原子鍵結的2個H原子可獨立選自由烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、及芳烷基所組成之群組的取代基取代，或者亦該等的2個取代基形成環。
作為包含S原子的取代基，可舉出硫醇基(-SH)、硫基(-S-R)、亞磺醯基(-S(=O)-R)、磺醯基(-SO 2-R)、磺基(-SO 3H)等的基。
作為硫基(-S-R)的例子，可選自烷硫基、環烷硫基、烯基硫基、炔基硫基、芳基硫基、雜芳基硫基、芳烷基硫基等之中。
作為磺醯基(-SO 2-R)的例子，可舉出烷磺醯基、環烷基磺醯基、烯基磺醯基、炔基磺醯基、芳基磺醯基、雜芳基磺醯基、芳烷基磺醯基等。
作為本說明書中的包含氮原子的取代基，可舉出疊氮基(-N 3)、氰基(-CN)、1級胺基(-NH 2)、2級胺基(-NH-R；亦稱為單取代胺基)、3級胺基(-NR(R')；亦稱為二取代胺基)、脒基(-C(=NH)-NH 2)、取代脒基(-C(=NR)-NR'R")、胍基(-NH-C(=NH)-NH 2)、取代胍基(-NR-C(=NR''')-NR'R")、胺羰基胺基(-NR-CO-NR'R")、吡啶基、六氫吡啶基(piperidino)、嗎啉基、氮雜環丁烷基等的基。
作為2級胺基(-NH-R；單取代胺基)的例子，可舉出烷基胺基、環烷基胺基、烯基胺基、炔基胺基、芳基胺基、雜芳基胺基、芳烷基胺基等。
作為3級胺基(-NR(R')；雙取代胺基)的例子，可舉出例如烷基(芳烷基)胺基等，各自獨立選自烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基等當中的取代基的胺基，此等任意的2個取代基亦可形成環。具體而言，例示為二烷基胺基，其中C 1-C 6二烷基胺基、C 1-C 4二烷基胺基、二甲基胺基、二乙基胺基等。本說明書中的「C p-C q二烷基胺基」是指在胺基中被2個C p-C q烷基取代的基，兩個C p-C q烷基可相同亦可相異。
作為取代脒基(-C(=NR)-NR'R")的例子，可舉出N原子上的3個取代基R、R'、及R"為各自獨立選自烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基中的基，例如烷基(芳烷基)(芳基)脒基等。
作為取代胍基(-NR-C(=NR''')-NR'R")的例子，可舉出R,R'、R"、及R'''為各自獨立選自烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基中的基，或者其等形成環的基等。
作為胺羰基胺基(-NR-CO-NR'R")的例子，可舉出R、R'、及R"為各自獨立選自氫原子、烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基中的基，或者其等形成環的基等。
本說明書中的「胜肽殘基」、「胺基酸殘基」有時各自簡稱為「胜肽」、「胺基酸」。
本說明書中的「相當於的位置」可用於藉由以序列識別號1表示的胺基酸序列的參照而區別本實施形態的多胜肽的胺基酸序列中的胺基酸殘基。用於確定相當的位置的比對(alignment)可使用該技術領域中技術範圍的多種方法，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)軟體、或GENETYX(註冊商標)(Genetyx股份有限公司)等之公開可獲得的電腦軟體而達成。所屬技術領域中具有通常知識者可決定在被比較的序列全長中包含達到最大比對所必須的任意演算法之獲得序列比對用的適當參數。
一實施形態之多胜肽，其包含與序列識別號1表示的胺基酸序列中經改變的1個胺基酸殘基的序列具有90%以上的序列相同性之序列，且對於後述的式(1)表示的化合物A的任1種以上或其鹽與後述的式(2)表示的化合物B的任1種以上或其鹽的還原胺化反應、或者前述化合物B的任1種以上或其鹽的分子内還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較具有序列識別號1表示的胺基酸序列的多胜肽的前述觸媒活性更高。
一實施形態之多胜肽，其包含與序列識別號1表示的胺基酸序列中經改變的2個胺基酸殘基的序列具有90%以上的序列相同性之序列，且對於後述的式(1)表示的化合物A的任1種以上或其鹽與後述的式(2)表示的化合物B的任1種以上或其鹽的還原胺化反應、或者前述化合物B的任1種以上或其鹽的分子内還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較具有序列識別號1表示的胺基酸序列的多胜肽的前述觸媒活性更高。
一實施形態之多胜肽，其包含與序列識別號1表示的胺基酸序列中經改變的3個胺基酸殘基的序列具有90%以上的序列相同性之序列，且對於後述的式(1)表示的化合物A的任1種以上或其鹽與後述的式(2)表示的化合物B的任1種以上或其鹽的還原胺化反應、或者前述化合物B的任1種以上或其鹽的分子内還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較具有序列識別號1表示的胺基酸序列的多胜肽的前述觸媒活性更高。
一實施形態之多胜肽，其可為催化還原胺化反應的酵素。本實施形態之多胜肽，在至少一種反應條件下，可具有對於化合物A或其鹽與化合物B或其鹽的還原胺化反應或者化合物B或其鹽的分子内還原胺化反應之觸媒活性。 再者，本說明書中，化合物A或其鹽可統稱為化合物A，化合物B或其鹽可統稱為化合物B。
一實施形態之多胜肽，由於具有對於還原胺化反應的觸媒活性，適合用於胺基酸的製造。
一實施形態之多胜肽，即使在習知催化還原胺化反應的酵素的合成活性低的胺基酸的製造中，亦具有高的合成活性。具體而言，於編碼在非專利文獻4所載的P.Putida KT2440株基因體的蛋白質PP3591(以下，稱為野生型酵素)，較甲基的碳數更大的烷基(例如，乙基)鍵結於氮原子的胺基酸(以下亦稱為「N-Et以上的N取代胺基酸」)、以及相對於胺基在β位具有分支結構的胺基酸(以下，亦稱為「β-branch型胺基酸」)的合成活性低。一實施形態之多胜肽對於N-Et以上的N取代胺基酸及/或β-branch型胺基酸，與野生型酵素相比，具有較高的活性。再者，根據本實施形態之多胜肽，具有高的立體選擇性，能夠製造作為目標的胺基酸。
以序列識別號1表示的胺基酸序列為非專利文獻4所載的習知胺基酸序列。
與上述多胜肽的以序列識別號1表示的胺基酸序列中的1個胺基酸殘基被改變之序列的序列相同性，可為90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上或100%。
與上述多胜肽的以序列識別號1表示的胺基酸序列中的2個胺基酸殘基被改變之序列的序列相同性，可為90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上或100%。
與上述多胜肽的以序列識別號1表示的胺基酸序列中的3個胺基酸殘基被改變之序列的序列相同性，可為90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上或100%。
胺基酸序列的序列相同性定義為，以得到最大百分率的序列相同性而調整序列且視需要導入間隔(gap)之後，且不考慮任何保留性取代是序列相同性的一部分時，和參照多胜肽序列中的胺基酸殘基相同的候補序列中的胺基酸殘基的百分率。用於確定胺基酸序列的序列相同性目的的比對(alignment)可使用該技術領域中技術範圍的多種方法，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)軟體、或GENETYX(註冊商標)(Genetyx股份有限公司)等之公開可獲得的電腦軟體而達成。所屬技術領域中具有通常知識者可決定在被比較的序列全長中包含達到最大比對所必須的任意演算法之獲得序列比對用的適當參數。
胺基酸序列的序列相同性可依Karlin and Altschul之演算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:5873-7)決定。依此演算法，已開發出稱為BLASTN或BLASTX之程式(Altschul et al.,J.Mol.Biol.(1990)215:403-10)。當基於BLAST以BLASTN解析胺基酸序列時，參數設為例如score=50、Wordlength=3。使用BLAST與Gapped BLAST程式時，使用各程式的預設參數。該等解析方法之具體手法可參照習知的NCBI(National Center for Biotechnology Information)的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)的網站資訊。
ALIGN-2序列比較電腦程式為Genentech公司的著作，其原始碼在美國著作權局(U.S. Copyright Office, Wasington D.C., 20559)和使用說明書類一起提出，登錄為美國著作權登錄號TXU510087。ALIGN-2程式為可自Genentech社(Genentech, Inc., South San Francisco, California)公開獲得，也可從原始碼編輯。ALIGN-2程式為了在含Digital UNIX V4.0D的UNIX操作系統上使用而編輯。所有的序列比較參數根據ALIGN-2程式而設定、不變動。
在胺基酸序列比較上使用ALIGN-2的狀況，所給的胺基酸序列A對所給的胺基酸序列B、或者和該等、或對該等的%胺基酸序列相同性(或者也可說是，具有或包含對所給的胺基酸序列B、或者和該等、或對該等的某%胺基酸序列相同性之所給的胺基酸序列A)如以下計算：分率X╱Y的100倍。在此，X為根據序列比對程式ALIGN-2，在該程式的A和B的比對中為相同的一致而給分的胺基酸殘基數，Y為B中的胺基酸殘基的全數。在胺基酸序列A的長度和胺基酸序列B的長度不相等時，應理解A對B的%胺基酸序列相同性和B對A的胺基酸序列相同性不同。除非有另外說明，本說明書所使用的所有%胺基酸序列相同性的值，如前段所述，為使用ALIGN-2電腦程式所得者。
本說明書中的「觸媒活性較具有序列識別號1表示的胺基酸序列的多胜肽的前述觸媒活性更高」是指在至少一種反應條件下，觸媒活性較前述多胜肽的前述觸媒活性更高。「觸媒活性較由序列識別號17表示的胺基酸序列構成的多胜肽的前述觸媒活性更高」是指在至少一種反應條件下，觸媒活性較前述多胜肽的前述觸媒活性更高。在一態樣中，能夠使用實施例所載的反應條件並評估多胜肽的觸媒活性。例如，反應起始時的各化合物的濃度可如下，化合物B及其鹽的濃度總計為50mM，D(+)-葡萄糖的濃度為100mM，化合物A及其鹽的濃度總計為500mM，磷酸緩衝液的濃度為100mM，β-NADPH的濃度為0.89mM，GDH溶液的濃度為0.002 unit/μL，評估對象的多胜肽的濃度為2.5μM。相同反應，可進行將作為觸媒活性的評估對象之多胜肽添加至後述的預混物。預混物可溶解至化合物B及/或其鹽、將D(+)-葡萄糖以鹽酸調整至pH7.5~8.5的化合物A及/或其鹽的水溶液、以及磷酸緩衝液的混合溶媒，並使用氫氧化鈉水溶液調整至pH為8.0之後，藉由超純水稀釋，對此溶液添加β-NADPH水溶液(溶解於超純水成為89mM)、以及GDH溶液(溶解於1xTNG)而製備。
一實施形態中，前述觸媒活性的評估是苯丙酮酸、2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸、或2-環戊基-2-側氧基-乙酸為50mM，D(+)-葡萄糖為100mM，甲胺或乙胺為500mM，磷酸緩衝液為100mM，β-NADPH為0.89mM，GDH溶液為0.002 unit/μL，評估對象的多胜肽為2.5μM的濃度，且於37℃、pH8的條件下起始反應，在經過19小時的時點，可藉由求得以還原胺化反應生成的胺基酸的產率而進行評估。
觸媒活性是基於以還原胺化反應生成的胺基酸(以下，亦稱為「目標生成物」)的生成量算出。目標生成物的生成量可使用液相層析質譜分析計(LCMS)進行測定。具體而言，可以後述的實施例所載的條件進行測定。
本實施形態之多胜肽的觸媒活性可為具有以序列識別號1表示的胺基酸序列的多胜肽的前述觸媒活性的1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上或8倍以上。本實施形態之多胜肽的前述觸媒活性為具有以序列識別號1表示的胺基酸序列的多胜肽的前述觸媒活性的幾倍，可藉由在使用兩種胜肽的情況下，自反應起始時點經過19小時的時點，算出目標生成物的產率的比而求得。具體而言，可以使用本實施形態之多胜肽的情況的產率除以使用具有序列識別號1表示的胺基酸序列的多胜肽的情況的產率而求得。本說明書中，反應起始時點是指將式(1)表示的化合物A或其鹽及式(2)表示的化合物B或其鹽、本說明書揭示的酵素、以及還原劑添加至系統中的時點中，任意其一較晚添加者。
自反應起始時點經過19小時的時點的產率是指藉由以下所示的方法計算。首先，將反應溶液、以及另外製備的檢量線樣品(與目標生成物相同結構或具有顯示相同UV吸收波長的結構的化合物)供於LCMS解析，並針對各自，取得UV圖、或萃取離子層析圖。來自由反應溶液所得的UV圖、或萃取離子層析圖分別取得來自目標生成物的UV波峰面積、或MS波峰面積。檢量線樣品亦同樣地，取得標準品的UV波峰面積、或MS波峰面積。基於檢量線樣品所含的標準品濃度與UV波峰面積、或MS波峰面積的對應關係，自UV波峰面積、或MS波峰面積計算出反應溶液所含的目標生成物濃度。在反應溶液中的化合物B及其鹽皆轉換成目標生成物時，反應溶液中的目標生成物濃度被認為是與反應起始時點的反應溶液中的化合物B及其鹽的濃度總計相等。實際上，將反應溶液中所含的目標生成物濃度除以反應起始時點的反應溶液中的化合物B及其鹽的濃度總計，而計算出產率。
化合物A為以下述式(1)表示的化合物。 [化38]
式(1)中，R 1及R 2各自獨立表示為氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜環基、或雜芳基，該等基可被取代，R 1或R 2中的任一個以上為氫原子。又，式(1)中的R 1可為氫原子，R 2可為C 1~C 6烷基。化合物A可為胺或胺類似物。
化合物A可為在式(1)中，R 1及R 2的其一者為烷基，另一者為氫原子的烷基胺。烷基胺或其鹽可選自由甲胺、乙胺及該等的鹽所組成之群組中的1種以上。化合物A可為氨。化合物A可選自由氨、甲胺、乙胺及該等的鹽所組成之群組中的1種以上。
化合物B為以下述式(2)表示的化合物。 [化39] [化40] [化41]
式(2)中，X表示碳原子，Y表示氫原子、以上述式(1’)表示的基或以上述式(3)表示的基。式(2)中，Y表示C 3~C 8環烷基、或C 6~C 9芳烷基，該芳烷基可以C 1~C 3烷基或鹵素原子所取代。
N表示0以上且2以下的整數。N可為0或1，可為0。
R 6表示氫原子、可經取代的碳數為1以上且6以下的脂肪族烴基、可經取代的碳數為5以上且12以下的芳基、可經取代的構成環的原子數為5以上且12以下的雜芳基、包含氮原子的基、或包含氧原子的基。R 6表示的基的具體例如上述所示。 式(1’)中， [化42] 表示與X的鍵結點。 R 1a為自式(1)中R 1表示的基移除氫原子的基，不為氫原子。
式(3)中， [化43] 表示與X的鍵結點。
m表示0以上且6以下的整數。m的下限為0以上，可為1以上、2以上、3以上、4以上、或5以上。m的上限為6以下，可為5以下、4以下、3以下、2以下、或1以下。p為0或1，q為0或1，r為0或1。
Z 1表示可經取代的伸烷基、或碳數為1以上且6以下的含醚鍵基。m為2以上時，存在複數個的Z 1可為相同亦可為不同。作為「含醚鍵基」，例示為例如以烷氧基、烯丙基氧基等所取代的烷基。作為碳數為1以上且6以下的含醚鍵基的具體例，可舉出甲氧基甲基、乙氧基甲基及烯丙基氧基甲基、烯丙基氧基乙基、烯丙基氧基丙基。
Z 2表示碳原子。
R 3、R 4及R 5各自獨立表示為氫原子、可經取代的碳數為1以上且6以下的脂肪族烴基、可經取代的碳數為5以上且12以下的芳基、可經取代的構成環的原子數為5以上且12以下的雜芳基、包含氮原子的基、或包含氧原子的基。
R 3、R 4及R 5中的任2個以上可彼此鍵結而與Z 2共同形成環，此等環結構可為環烷基、芳基、雜環基、或雜芳基，該等的基可被取代。
R 3、R 4及R 5可與Z 2形成雙鍵或三鍵，R 3、R 4及R 5中的任1個藉由雙鍵或三鍵與Z 2鍵結時，p、q或r中任1個以上為0。
式(1)中，R 1及R 2中的一個為甲基，且另一個為氫原子時，式(2)中，Y為以上述式(3)表示的基，m為0，R 3至R 5中的2個以上不為氫原子。
R 3至R 5中的任2個為氫原子時，氫原子以外的基可為可經取代的碳數為1以上且6以下的脂肪族烴基、可經取代的碳數為5以上且12以下的芳基、或可經取代的構成環的原子數為5以上且12以下的雜芳基，可為可經取代的碳數為5以上且12以下的芳基，可為苯基或對甲苯基。 前述式(1)中，R 1可為氫原子，R 2可為乙基。 前述式(1)中，R 1可為氫原子，R 2可為甲基。 前述式(1)中，R 1及R 2可為氫原子。
化合物B可為酮酸或酮酸類似物。 化合物B可為以下述式(2’)表示的化合物。 [化44]
式(2’)中，Y’表示C 3~C 8環烷基、或C 6~C 9芳烷基，該芳烷基可被C 1~C 3烷基或鹵素原子所取代。
式(2’)表示的化合物或其鹽可選自由苯丙酮酸、2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸、2-環戊基-2-側氧基-乙酸及該等的鹽所組成之群組中的1種以上。
化合物A與化合物B的組合，可為式(1)中，R 1為氫原子，R 2為乙基的化合物A(乙胺)與式(2)中，n及m皆為0，Y為以式(3)表示的基，R 3為苯基，R 4、R 5及R 6皆為氫原子，p、q及r皆為1的化合物B(苯丙酮酸)之組合、可為式(1)中，R 1為氫原子，R 2為乙基的化合物A(乙胺)與式(2)中，n及m皆為0，Y為以式(3)表示的基，R 3為對甲苯基，R 4、R 5及R 6皆為氫原子，p、q及r皆為1的化合物B(2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸)之組合，可為式(1)中，R 1為氫原子，R 2為甲基之化合物A(甲胺)與式(2)中，n及m皆為0，Y為以式(3)表示的基，R 3及R 4為彼此連結形成環戊烷環，R 5及R 6皆為氫原子，p、q及r皆為1之化合物B(2-環戊基-2-側氧基-乙酸)之組合。
在測定觸媒活性時，可使用化合物A為乙胺，化合物B為苯丙酮酸鈉鹽之組合，在此情況下，可將H-EtPhe-OH合成活性作為指標評估多胜肽的觸媒活性。在另一態樣中的測定觸媒活性時，可使用化合物A為乙胺，化合物B為2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸鈉鹽之組合，在此情況下，可將H-EtPhe(4-Me)-OH合成活性作為指標評估多胜肽的觸媒活性。在另一態樣中的測定觸媒活性時，可使用化合物A為甲胺，化合物B為2-環戊基-2-側氧基-乙酸之組合，在此情況下，可將H-MeGly(cPent)-OH合成活性作為指標評估多胜肽的觸媒活性。
本發明之一實施形態之多胜肽可為以序列識別號1表示的胺基酸序列中的1個以上胺基酸殘基被改變之多胜肽，1~20個、1~15個、1~10個、1~7個或1~5個胺基酸殘基可被改變。被改變的胺基酸殘基可為3個以内，可為2個以内，可為1個。
本發明之一實施形態之多胜肽，例示為以序列識別號1表示的胺基酸序列中被改變的胺基酸殘基數目為1~5個，以1個為佳，以2個以上為更佳，以2個或3個為最佳。
改變可選自由取代、缺失及插入所組成之群組中的1種以上，可為取代。改變可為保守性取代。保守性取代是指與改變前的多胜肽相比，以不使作為目標的觸媒活性減少的方式的胺基酸殘基的改變。
又，前述改變可為與改變前的胺基酸殘基不同的天然胺基酸的取代。再者，用於前述取代的天然胺基酸可選自由甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、組胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺酸、麩胺酸、天門冬胺酸、甲硫胺酸、離胺酸、精胺酸、半胱胺酸及脯胺酸所組成之群組中的1種以上。
本發明之一實施形態之多胜肽可為包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於選自由第44位的組胺酸殘基、第117位的苯丙胺酸殘基、第141位的甲硫胺酸殘基、第156位的蘇胺酸殘基、第182位的組胺酸殘基、第186位的麩醯胺酸殘基、第253位的色胺酸殘基、及第260位的離胺酸殘基所組成之群組中的1個以上胺基酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列之多胜肽，為了更進一步提升對還原胺化反應之觸媒活性，可為包含位在相當於選自由第141位的甲硫胺酸殘基、第182位的組胺酸殘基、第253位的色胺酸殘基、及第260位的離胺酸殘基所組成之群組中的1個以上胺基酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列之多胜肽，再者，可為包含位在相當於選自由第141位的甲硫胺酸殘基、第253位的色胺酸殘基、及第260位的離胺酸殘基所組成之群組中的1個以上胺基酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列之多胜肽。
本發明之一實施形態之多胜肽可為包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第44位的組胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成組胺酸以外的胺基酸殘基之序列之多胜肽。該多胜肽可為包含以序列識別號2表示的胺基酸序列之多胜肽。序列識別號2中，以X表示的胺基酸殘基為丙胺酸殘基、天門冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、甘胺酸殘基、異白胺酸殘基、離胺酸殘基、白胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、脯胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、精胺酸殘基、絲胺酸殘基、蘇胺酸殘基、纈胺酸殘基、色胺酸殘基或酪胺酸殘基。
為了更進一步提升對還原胺化反應之觸媒活性，可包含位在相當於第44位的組胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成甲硫胺酸殘基的序列。亦即，本實施形態之多胜肽可包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第44位的組胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成甲硫胺酸殘基之胺基酸序列(H44M)。在此情況下，對於乙胺與2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸的還原胺化反應之觸媒活性更加提升。
本發明之一實施形態之多胜肽可為包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第117位的苯丙胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成苯丙胺酸殘基以外的胺基酸殘基之序列之多胜肽。該多胜肽可為包含序列識別號4表示的胺基酸序列之多胜肽。序列識別號4中，以X表示的胺基酸殘基為丙胺酸殘基、天門冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、甘胺酸殘基、組胺酸殘基、異白胺酸殘基、離胺酸殘基、白胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、脯胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、精胺酸殘基、絲胺酸殘基、蘇胺酸殘基、纈胺酸殘基、色胺酸殘基或酪胺酸殘基。
為了更進一步提升對還原胺化反應之觸媒活性，可包含位在相當於第117位的苯丙胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成白胺酸殘基之序列。亦即，本實施形態之多胜肽可包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第117位的苯丙胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成白胺酸殘基之胺基酸序列(F117L)。在此情況下，對於甲胺與2-環戊基-2-側氧基-乙酸的還原胺化反應之觸媒活性更加提升。
本發明之一實施形態之多胜肽可為包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第141位的甲硫胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成甲硫胺酸以外的胺基酸殘基之序列之多胜肽。該多胜肽可為包含序列識別號6表示的胺基酸序列之多胜肽。序列識別號6中，以X表示的胺基酸殘基為丙胺酸殘基、天門冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、甘胺酸殘基、組胺酸殘基、異白胺酸殘基、離胺酸殘基、白胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、脯胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、精胺酸殘基、絲胺酸殘基、蘇胺酸殘基、纈胺酸殘基、色胺酸殘基或酪胺酸殘基。
為了更進一步提升對還原胺化反應之觸媒活性，可包含位在相當於第141位的甲硫胺酸殘基之部位的胺基酸殘基藉由選自由酪胺酸殘基、色胺酸殘基、纈胺酸殘基、蘇胺酸殘基、絲胺酸殘基、精胺酸殘基、白胺酸殘基、離胺酸殘基、異白胺酸殘基、組胺酸殘基、苯丙胺酸殘基以及丙胺酸殘基所組成之群組中的1個以上胺基酸殘基取代之序列。亦即，本實施形態之多胜肽可包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第141位的甲硫胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成酪胺酸殘基、色胺酸殘基、纈胺酸殘基、蘇胺酸殘基、絲胺酸殘基、精胺酸殘基、白胺酸殘基、離胺酸殘基、異白胺酸殘基、組胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、或丙胺酸殘基之胺基酸序列(M141Y、M141W、M141V、M141T、M141S、M141R、M141L、M141K、M141I、M141H、M141F、M141A)。再者，可包含位在相當於第141位的甲硫胺酸殘基之部位的胺基酸殘基藉由選自由酪胺酸殘基、色胺酸殘基、纈胺酸殘基、離胺酸殘基、異白胺酸殘基、苯丙胺酸殘基以及丙胺酸殘基所組成之群組中的1個以上胺基酸殘基取代之序列。亦即，本實施形態之多胜肽は可包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第141位的甲硫胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成酪胺酸殘基、色胺酸殘基、纈胺酸殘基、離胺酸殘基、異白胺酸殘基、組胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、或丙胺酸殘基之胺基酸序列(M141Y、M141W、M141V、M141K、M141I、M141H、M141F、M141A)。
在包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第141位的甲硫胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成丙胺酸殘基、離胺酸殘基、纈胺酸殘基、色胺酸殘基或酪胺酸殘基之胺基酸序列之多胜肽，對於甲胺與2-環戊基-2-側氧基-乙酸的還原胺化反應、以及乙胺與苯丙酮酸的還原胺化反應、乙胺與2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸的還原胺化反應之觸媒活性更加提升。
在包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第141位的甲硫胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成精胺酸殘基、白胺酸殘基或絲胺酸殘基之胺基酸序列之多胜肽，對於甲胺與2-環戊基-2-側氧基-乙酸的還原胺化反應、以及乙胺與苯丙酮酸的還原胺化反應之觸媒活性更加提升。
在包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第141位的甲硫胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成異白胺酸殘基或蘇胺酸殘基之胺基酸序列之多胜肽，對於乙胺與苯丙酮酸的還原胺化反應、以及乙胺與2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸的還原胺化反應之觸媒活性更加提升。
在包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第141位的甲硫胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成苯丙胺酸殘基、或組胺酸殘基之胺基酸序列之多胜肽，對於乙胺與2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸的還原胺化反應之觸媒活性更加提升。
本發明之一實施形態之多胜肽可為包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第156位的蘇胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成蘇胺酸以外的胺基酸殘基之序列之多胜肽。該多胜肽可為包含序列識別號7表示的胺基酸序列之多胜肽。序列識別號7中，以X表示的胺基酸殘基為丙胺酸殘基、天門冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、甘胺酸殘基、組胺酸殘基、異白胺酸殘基、離胺酸殘基、白胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、脯胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、精胺酸殘基、絲胺酸殘基、蘇胺酸殘基、纈胺酸殘基、色胺酸殘基或酪胺酸殘基。
為了更進一步提升對還原胺化反應之觸媒活性，可包含位在相當於第156位的蘇胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成絲胺酸殘基之序列。亦即，本實施形態之多胜肽可包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第156位的蘇胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成絲胺酸殘基之胺基酸序列(T156S)。在此情況下，對於乙胺與2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸的還原胺化反應之觸媒活性更加提升。
本發明之一實施形態之多胜肽可為包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第182位的組胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成組胺酸以外的胺基酸殘基之序列之多胜肽。該多胜肽可為包含序列識別號8表示的胺基酸序列之多胜肽。序列識別號8中，以X表示的胺基酸殘基為丙胺酸殘基、天門冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、甘胺酸殘基、異白胺酸殘基、離胺酸殘基、白胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、脯胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、精胺酸殘基、絲胺酸殘基、蘇胺酸殘基、纈胺酸殘基、色胺酸殘基或酪胺酸殘基。
為了更進一步提升對還原胺化反應之觸媒活性，可包含位在相當於第182位的組胺酸殘基之部位的胺基酸殘基藉由選自由酪胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、白胺酸殘基、甘胺酸殘基、苯丙胺酸殘基以及丙胺酸殘基所組成之群組中的1個以上胺基酸殘基取代之序列。亦即，本實施形態之多胜肽可包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第182位的組胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成酪胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、白胺酸殘基、甘胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、或丙胺酸殘基之胺基酸序列(H182Y、H182Q、H182M、H182L、H182G、H182F、H182A)。再者，可包含位在相當於第182位的組胺酸殘基之部位的胺基酸殘基藉由選自由甲硫胺酸殘基、白胺酸殘基、以及苯丙胺酸殘基所組成之群組中的1個以上胺基酸殘基取代之序列。亦即，本實施形態之多胜肽可包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第182位的組胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成甲硫胺酸殘基、白胺酸殘基、或苯丙胺酸殘基之胺基酸序列(H182M、H182L、H182F)。
在包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第182位的組胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成丙胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、白胺酸殘基、甲硫胺酸殘基或酪胺酸殘基之胺基酸序列之多胜肽，對於乙胺與苯丙酮酸的還原胺化反應以及乙胺與2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸的還原胺化反應之觸媒活性更加提升。
在包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第182位的組胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成麩醯胺酸殘基之胺基酸序列之多胜肽，對於甲胺與2-環戊基-2-側氧基-乙酸的還原胺化反應之觸媒活性更加提升。
在包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第182位的組胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成甘胺酸殘基之胺基酸序列之多胜肽，對於乙胺與苯丙酮酸的還原胺化反應之觸媒活性更加提升。
本發明之一實施形態之多胜肽可為包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第186位的麩醯胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成麩醯胺酸殘基以外的胺基酸殘基之序列之多胜肽。該多胜肽可為包含序列識別號10表示的胺基酸序列之多胜肽。序列識別號10中，以X表示的胺基酸殘基為丙胺酸殘基、天門冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、甘胺酸殘基、組胺酸殘基、異白胺酸殘基、離胺酸殘基、白胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、脯胺酸殘基、精胺酸殘基、絲胺酸殘基、蘇胺酸殘基、纈胺酸殘基、色胺酸殘基或酪胺酸殘基。
為了更進一步提升對還原胺化反應之觸媒活性，可包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第186位的麩醯胺酸殘基之部位的胺基酸殘基藉由選自由甲硫胺酸殘基以及麩胺酸殘基所組成之群組中的1個以上胺基酸殘基取代之序列。亦即，本實施形態之多胜肽可包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第186位的麩醯胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成甲硫胺酸殘基或麩胺酸殘基之胺基酸序列(Q186M、Q186E)。
在包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第186位的麩醯胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成甲硫胺酸殘基之胺基酸序列之多胜肽，對於乙胺與苯丙酮酸的還原胺化反應之觸媒活性更加提升。
在包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第186位的麩醯胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成麩胺酸殘基之胺基酸序列之多胜肽，對於乙胺與2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸的還原胺化反應、以及乙胺與苯丙酮酸的還原胺化反應之觸媒活性更加提升。
本發明之一實施形態之多胜肽可為包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第253位的色胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成色胺酸殘基以外的胺基酸殘基之序列之多胜肽。該多胜肽可為包含序列識別號11表示的胺基酸序列之多胜肽。序列識別號11中，以X表示的胺基酸殘基為丙胺酸殘基、天門冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、甘胺酸殘基、組胺酸殘基、異白胺酸殘基、離胺酸殘基、白胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、脯胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、精胺酸殘基、絲胺酸殘基、蘇胺酸殘基、纈胺酸殘基、或酪胺酸殘基。
為了更進一步提升對還原胺化反應之觸媒活性，可包含位在相當於第253位的色胺酸殘基之部位的胺基酸殘基藉由選自由酪胺酸殘基、纈胺酸殘基、蘇胺酸殘基、絲胺酸殘基、精胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、脯胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、白胺酸殘基、離胺酸殘基、異白胺酸殘基、組胺酸殘基、苯丙胺酸殘基以及丙胺酸殘基所組成之群組中的1個以上胺基酸殘基取代之序列。亦即，本實施形態之多胜肽可包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第253位的色胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成酪胺酸殘基、纈胺酸殘基、蘇胺酸殘基、絲胺酸殘基、精胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、脯胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、白胺酸殘基、離胺酸殘基、異白胺酸殘基、組胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、或丙胺酸殘基之胺基酸序列(W253Y、W253V、W253T、W253S、W253R、W253Q、W253P、W253N、W253M、W253L、W253K、W253I、W253H、W253F、W253A)。再者，可包含位在相當於第253位的色胺酸殘基之部位的胺基酸殘基藉由選自由白胺酸殘基、異白胺酸殘基以及組胺酸殘基所組成之群組中的1個以上胺基酸殘基取代之序列，以包含藉由組胺酸殘基取代之序列為佳。亦即，本實施形態之多胜肽可包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第253位的色胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成白胺酸殘基、異白胺酸殘基或組胺酸殘基之胺基酸序列(W253L、W253I、W253H)，以包含取代成組胺酸殘基之胺基酸序列(W253H)為佳。
在包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第253位的色胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成組胺酸殘基之胺基酸序列之多胜肽，對於甲胺與2-環戊基-2-側氧基-乙酸的還原胺化反應、乙胺與苯丙酮酸的還原胺化反應、以及乙胺與2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸的還原胺化反應之觸媒活性更加提升。
在包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第253位的色胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成丙胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、異白胺酸殘基、白胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、脯胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、蘇胺酸殘基、纈胺酸殘基、或酪胺酸殘基之胺基酸序列之多胜肽，對於甲胺與2-環戊基-2-側氧基-乙酸的還原胺化反應、以及乙胺與苯丙酮酸的還原胺化反應之觸媒活性更加提升。
在包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第253位的色胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成離胺酸殘基、精胺酸殘基、或絲胺酸殘基之胺基酸序列之多胜肽，對於甲胺與2-環戊基-2-側氧基-乙酸的還原胺化反應之觸媒活性更加提升。
在包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第253位的色胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成天冬醯胺酸殘基之胺基酸序列之多胜肽，對於乙胺與苯丙酮酸的還原胺化反應之觸媒活性更加提升。
本發明之一實施形態之多胜肽可為包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成離胺酸殘基以外的胺基酸殘基之序列之多胜肽。該多胜肽可為包含序列識別號12表示的胺基酸序列之多胜肽。序列識別號12中，以X表示的胺基酸殘基為丙胺酸殘基、天門冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、甘胺酸殘基、組胺酸殘基、異白胺酸殘基、白胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、脯胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、精胺酸殘基、絲胺酸殘基、蘇胺酸殘基、纈胺酸殘基、色胺酸殘基或酪胺酸殘基。
為了更進一步提升對還原胺化反應之觸媒活性，可包含位在相當於第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基藉由選自由酪胺酸殘基、色胺酸殘基、蘇胺酸殘基、絲胺酸殘基、精胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、白胺酸殘基、組胺酸殘基、甘胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、麩胺酸殘基以及丙胺酸殘基所組成之群組中的1個以上胺基酸殘基取代之序列。亦即，本實施形態之多胜肽可具有以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成酪胺酸殘基、色胺酸殘基、蘇胺酸殘基、絲胺酸殘基、精胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、白胺酸殘基、組胺酸殘基、甘胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、麩胺酸殘基或丙胺酸殘基之胺基酸序列(K260Y、K260W、K260T、K260S、K260R、K260Q、K260N、K260M、K260L、K260H、K260G、K260F、K260E、K260A)。再者，可包含位在相當於第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基藉由選自由麩醯胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、麩胺酸殘基以及天冬醯胺酸殘基所組成之群組中的1個以上胺基酸殘基取代之序列。亦即，本實施形態之多胜肽可具有以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成麩醯胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、麩胺酸殘基或天冬醯胺酸殘基之胺基酸序列(K260Q、K260M、K260E、K260N)。
在包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成麩胺酸殘基或絲胺酸殘基之胺基酸序列之多胜肽，對於甲胺與2-環戊基-2-側氧基-乙酸的還原胺化反應、乙胺與苯丙酮酸的還原胺化反應、以及乙胺與2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸的還原胺化反應之觸媒活性更加提升。
在包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成苯丙胺酸殘基、白胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、蘇胺酸殘基、或酪胺酸殘基之胺基酸序列之多胜肽，對於乙胺與苯丙酮酸的還原胺化反應、以及乙胺與2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸的還原胺化反應之觸媒活性更加提升。
在包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基取代成丙胺酸殘基、甘胺酸殘基、組胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、精胺酸殘基、或色胺酸殘基之胺基酸序列之多胜肽，對於乙胺與苯丙酮酸的還原胺化反應之觸媒活性更加提升。
本實施形態之多胜肽可包含以序列識別號6表示，且以X表示的胺基酸殘基為纈胺酸殘基之胺基酸序列a1(變異：M141V)、以序列識別號6表示，且以X表示的胺基酸殘基為酪胺酸殘基之胺基酸序列a2(變異：M141Y)、以序列識別號8表示，且以X表示的胺基酸殘基為白胺酸殘基之胺基酸序列a3(變異：H182L)、以序列識別號11表示，且以X表示的胺基酸殘基為組胺酸殘基之胺基酸序列a4(變異：W253H)、或者以序列識別號12表示，且以X表示的胺基酸殘基為麩胺酸殘基之胺基酸序列a5(變異：K260E)。
本實施形態之多胜肽可包含與胺基酸序列a1、a2、a3、a4或a5具有90%以上序列相同性之序列。前述序列相同性可為91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上，可為100%。
本實施形態之多胜肽可為包含胺基酸序列a1、a2、a3、a4或a5中的1個以上胺基酸殘基被改變之序列之多胜肽，可為1~20個、1~15個、1~10個、1~7個或1~5個胺基酸殘基被改變。經改變的胺基酸殘基可為3個以内，可為2個以内，可為1個。
本實施形態之多胜肽，其中以序列識別號1表示的胺基酸序列中的改變位置可為2個位置以上，可為2個位置。以下，針對改變位置為2個位置以上的該多胜肽的適合態樣進行說明。
該多胜肽較佳為包含序列，該序列為以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於選自由第141位的甲硫胺酸殘基、第182位的組胺酸殘基、以及第253位的色胺酸殘基所組成之群組中的1個胺基酸殘基之部位的胺基酸殘基作為第一改變位置而被改變，並且以序列識別號1表示的胺基酸序列中位在相當於選自由第182位的組胺酸殘基、第253位的色胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基所組成之群組，且與作為第一改變位置被改變的胺基酸殘基不同之1個胺基酸殘基之部位的胺基酸殘基作為第二改變位置而被改變。
該多胜肽較佳為包含以下序列： 以序列識別號1表示的胺基酸序列中， 位在相當於第141位的甲硫胺酸殘基以及第182位的組胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、 位在相當於第141位的甲硫胺酸殘基以及第253位的色胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、 位在相當於第141位的甲硫胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、 位在相當於第182位的組胺酸殘基以及第253位的色胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、 位在相當於第182位的組胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、或者 位在相當於第253位的色胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列， 更佳為包含以下序列： 以序列識別號1表示的胺基酸序列中， 位在相當於第141位的甲硫胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、 位在相當於第182位的組胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、或者 位在相當於第253位的色胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列。
該多胜肽較佳為包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第141位的甲硫胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由酪胺酸殘基、色胺酸殘基、纈胺酸殘基、蘇胺酸殘基、精胺酸殘基、離胺酸殘基、異白胺酸殘基、以及丙胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列，更佳為包含藉由選自由酪胺酸殘基、纈胺酸殘基以及丙胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列。
該多胜肽較佳為包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第182位的組胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由酪胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、白胺酸殘基、以及苯丙胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列，更佳為包含藉由選自由甲硫胺酸殘基以及白胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列。
該多胜肽較佳為包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第253位的色胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由酪胺酸殘基、蘇胺酸殘基、絲胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、組胺酸殘基以及丙胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列，更佳為包含藉由組胺酸殘基取代之序列。
該多胜肽較佳為包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第260位的離胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由絲胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、白胺酸殘基、異白胺酸殘基、組胺酸殘基、甘胺酸殘基、苯丙胺酸殘基、麩胺酸殘基以及丙胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列，更佳為包含藉由選自由麩醯胺酸殘基以及麩胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列。
以下，序列識別號1表示的胺基酸序列中，位在相當於第m 1位的胺基酸殘基X 1之部位的胺基酸殘基藉由X 1以外的其他胺基酸殘基x 1取代，且位在相當於第m 2位的胺基酸殘基X 2之部位的胺基酸殘基藉由X 2以外的其他胺基酸殘基x 2取代之序列標記成X 1m 1x 1_X 2m 2x 2。例如，序列識別號23表示的胺基酸序列，由於位在相當於第141位及第182位的胺基酸殘基之部位的胺基酸殘基各自藉由其他胺基酸殘基X取代，因而標記成M141X_H182X。具體而言，以序列識別號23表示，位在相當於第141位的胺基酸殘基之部位的X為酪胺酸殘基，位在相當於第182位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基之胺基酸序列標記成M141Y_H182M。以序列識別號24~30表示的胺基酸序列中亦以同樣方式標記。
以序列識別號1表示的胺基酸序列中的2個胺基酸殘基被改變之序列，例如可為選自由以下所示的胺基酸序列所組成之群組a1~群組a4所組成之群組之胺基酸序列，較佳為選自由群組a1~群組a3所組成之群組之胺基酸序列，更佳為選自由群組a1及群組a2所組成之群組之胺基酸序列，最佳為選自群組a1之胺基酸序列。 群組a1： M141Y_K260E、H182L_K260Q、M141A_K260E、H182M_K260Q、M141A_K260Q、H182M_K260E、M141V_K260E、W253H_K260E、以及H182L_K260E。 群組a2： M141V_K260Q、W253H_K260Q、W253M_K260E、M141Y_H182M、M141Y_K260Q、H182F_K260Q、M141V_K260F、M141V_H182L、M141V_K260L、M141Y_K260G、H182L_W253H、H182F_K260E、以及M141T_K260Q 群組a3： M141Y_H182L、W253M_K260Q、M141V_W253M、M141V_K260S、M141V_K260A、M141A_K260F、M141A_K260H、W253A_K260E、M141V_W253A、M141V_W253H、M141K_K260L、M141V_K260G、以及M141A_K260L。 群組a4： M141W_K260A、M141V_W253Y、M141K_K260G、M141A_K260G、M141A_K260S、M141A_K260N、M141Y_W253H、M141A_K260A、M141K_K260S、W253A_K260Q、M141V_H182M、M141A_K260I、M141T_K260G、W253M_K260L、M141I_W253A、W253T_K260L、M141R_K260G、W253A_K260L、M141K_W253S、M141A_H182L、W253N_K260L、M141K_K260A、M141K_W253M、H182Y_W253A、H182M_W253H、M141R_K260A、H182M_W253A以及M141K_W253A。
該多胜肽可包含例如與選自由群組a1~群組a4所組成之群組的胺基酸序列具有90%以上序列相同性之序列，較佳為包含與選自由群組a1~群組a3所組成之群組的胺基酸序列具有90%以上序列相同性之序列，更佳為包含與選自由群組a1以及群組a2所組成之群組的胺基酸序列具有90%以上序列相同性之序列，最佳為包含與選自群組a1的胺基酸序列具有90%以上序列相同性之序列。
該多胜肽可包含選自由群組a1~群組a4所組成之群組的胺基酸序列，較佳為包含選自由群組a1~群組a3所組成之群組的胺基酸序列，更佳為包含選自由群組a1以及群組a2所組成之群組的胺基酸序列，最佳為包含選自群組a1之胺基酸序列。
本實施形態之多胜肽，其中例如以序列識別號1表示的胺基酸序列中的改變位置可為3個位置以上，可為3個位置。以下，針對改變位置為3個位置以上的該多胜肽的適合態樣進行說明。
該多胜肽較佳為包含以下序列： 序列識別號1表示的胺基酸序列中位於相當在選自由第141位的甲硫胺酸殘基以及第182位的組胺酸殘基所組成之群組中的1個胺基酸殘基的部位之胺基酸殘基作為第一改變位置而被改變， 序列識別號1表示的胺基酸序列中位於相當在選自由第182位的組胺酸殘基以及第253位的色胺酸殘基所組成之群組，且與作為第一改變位置被改變的胺基酸殘基不同的1個胺基酸殘基的部位之胺基酸殘基作為第二改變位置而被改變， 序列識別號1表示的胺基酸序列中位於相當在選自由第253位的色胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基所組成之群組，且與作為第一改變位置以及第二改變位置被改變的胺基酸殘基不同的1個胺基酸殘基的部位之胺基酸殘基作為第三改變位置而被改變。
該多胜肽較佳為包含以下序列： 序列識別號1表示的胺基酸序列中， 位在相當於第141位的甲硫胺酸殘基、第182位的組胺酸殘基以及第253位的色胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、 位在相當於第141位的甲硫胺酸殘基、第182位的組胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、 位在相當於第141位的甲硫胺酸殘基、第253位的色胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、 位在相當於第182位的組胺酸殘基、第253位的色胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列， 更佳為包含以下序列： 序列識別號1表示的胺基酸序列中， 位在相當於第141位的甲硫胺酸殘基、第182位的組胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、 位在相當於第141位的甲硫胺酸殘基、第253位的色胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列、 位在相當於第182位的組胺酸殘基、第253位的色胺酸殘基以及第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基被改變之序列。
該多胜肽較佳為包含序列識別號1表示的胺基酸序列中的改變位置為3個，且序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第141位的甲硫胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由酪胺酸殘基、纈胺酸殘基、蘇胺酸殘基、絲胺酸殘基、白胺酸殘基、離胺酸殘基、異白胺酸殘基、以及丙胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列，更佳為包含序列識別號1表示的胺基酸序列中的改變位置為3個，且序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第141位的甲硫胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由酪胺酸殘基、纈胺酸殘基以及異白胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列。
該多胜肽較佳為包含序列識別號1表示的胺基酸序列中的改變位置為3個，且以序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第182位的組胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由甲硫胺酸殘基、白胺酸殘基以及苯丙胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列，更佳為包含序列識別號1表示的胺基酸序列中的改變位置為3個，且序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第182位的組胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由甲硫胺酸殘基以及白胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列。
該多胜肽較佳為包含序列識別號1表示的胺基酸序列中的改變位置為3個，且序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第253位的色胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由纈胺酸殘基、蘇胺酸殘基、絲胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、白胺酸殘基、組胺酸殘基、苯丙胺酸殘基以及麩胺酸所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列，更佳為包含序列識別號1表示的胺基酸序列中的改變位置為3個，且序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第253位的色胺酸殘基的部位之胺基酸殘基藉由選自由麩醯胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、白胺酸殘基以及組胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列。
該多胜肽較佳為包含序列識別號1表示的胺基酸序列中的改變位置が為3個，且序列識別號1表示的胺基酸序列中的位於相當在第260位的離胺酸殘基之部位的胺基酸殘基藉由選自由麩醯胺酸殘基以及麩胺酸殘基所組成之群組中的一個胺基酸殘基取代之序列。
以下，序列識別號1表示的胺基酸序列中，位在相當於第m 1位的胺基酸殘基X 1之部位的胺基酸殘基藉由X 1以外的其他胺基酸殘基x 1取代，且位在相當於第m 2位的胺基酸殘基X 2之部位的胺基酸殘基藉由X 2以外的其他胺基酸殘基x 2取代，且位在相當於第m 3位的胺基酸殘基X 3之部位的胺基酸殘基藉由X 3以外的其他胺基酸殘基x 3取代之序列標記成X 1m 1x 1_X 2m 2x 2_X 3m 3x 3。例如，序列識別號31表示的胺基酸序列，由於位在相當於第141位、第253位以及第260位的胺基酸殘基之部位的胺基酸殘基各自藉由其他胺基酸殘基X取代，因而標記成M141X_W253X_K260X。具體而言，以序列識別號31表示，位在相當於第141位的胺基酸殘基之部位的X為纈胺酸殘基，位在相當於第253位的胺基酸殘基之部位的X為甲硫胺酸殘基，位在相當於第260位的胺基酸殘基之部位的X為麩胺酸殘基之胺基酸序列標記成M141V_W253M_K260E。以序列識別號32~35表示的胺基酸序列中亦以同樣方式標記。
以序列識別號1表示的胺基酸序列中的3個胺基酸殘基被改變之序列，例如可為選自由以下所示的胺基酸序列所組成之群組b1~群組b4所組成之群組之胺基酸序列，較佳為選自由群組b1~群組b3所組成之群組之胺基酸序列，更佳為選自由群組b1以及群組b2所組成之群組之胺基酸序列，最佳為選自群組b1之胺基酸序列。 群組b1： M141Y_H182M_K260E、M141V_W253M_K260E、H182L_W253H_K260E、M141Y_H182M_K260Q、M141V_H182M_K260E、M141V_H182L_K260Q、M141Y_H182L_K260Q、M141V_W253Q_K260E、H182L_W253Q_K260E、M141I_W253H_K260E、M141V_H182L_K260E、M141Y_H182L_K260E、H182L_W253M_K260E、M141V_W253Q_K260Q、M141V_W253H_K260Q、M141V_W253L_K260Q、M141I_W253H_K260Q、以及M141V_W253M_K260Q。 群組b2： H182M_W253H_K260E、M141V_W253V_K260Q、H182L_W253H_K260Q、M141V_W253H_K260E、H182L_W253Q_K260Q、M141L_W253H_K260E、H182M_W253Q_K260E、M141V_W253F_K260Q、M141V_W253L_K260E、M141V_W253T_K260Q、M141Y_H182F_K260E、H182M_W253M_K260E、H182L_W253M_K260Q、M141Y_W253H_K260E、M141Y_W253Q_K260E、M141V_H182M_K260Q、H182M_W253L_K260E、H182F_W253H_K260E、M141A_H182F_K260Q、M141Y_W253M_K260E、H182M_W253Q_K260Q、以及H182M_W253M_K260Q。 群組b3： H182L_W253T_K260Q、M141Y_W253S_K260E、M141V_H182F_K260E、M141A_H182M_K260E、M141T_H182L_K260Q、M141Y_W253T_K260E、H182M_W253L_K260Q、M141V_H182F_K260Q、M141S_W253H_K260E、M141T_W253H_K260E、H182M_W253H_K260Q、M141A_H182L_K260Q、H182M_W253F_K260Q、M141A_H182M_K260Q、M141A_W253Q_K260E、M141A_H182L_K260E、M141A_W253H_K260E、M141V_W253E_K260Q、M141A_W253M_K260E、M141A_W253H_K260Q、M141K_H182L_W253H、以及M141T_H182M_K260Q。 群組b4： M141A_W253M_K260Q、以及M141A_H182F_K260E
該多胜肽可包含例如與選自由群組b1~群組b4所組成之群組的胺基酸序列具有90%以上序列相同性之序列，較佳為包含與選自由群組b1~群組b3所組成之群組的胺基酸序列具有90%以上序列相同性之序列，更佳為包含與選自由群組b1以及群組b2所組成之群組的胺基酸序列具有90%以上序列相同性之序列，最佳為包含與選自群組b1之胺基酸序列具有90%以上序列相同性之序列。
該多胜肽可包含選自由群組b1~群組b4所組成之群組的胺基酸序列，較佳為包含選自由群組b1~群組b3所組成之群組的胺基酸序列，更佳為包含選自由群組b1以及群組b2所組成之群組的胺基酸序列，最佳為包含選自群組b1之胺基酸序列。
本實施形態之多胜肽，對於上述的式(1)表示的化合物A的任1種以上或其鹽與上述的式(2)表示的化合物B的任1種以上或其鹽的還原胺化反應、或者上述的化合物B的任1種以上或其鹽的分子内還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較具有序列識別號1表示的胺基酸序列的多胜肽的前述觸媒活性更高。在一態樣中，本實施形態之多胜肽的前述觸媒活性，在至少一種反應條件下，較由序列識別號17表示的胺基酸序列構成的多胜肽的前述觸媒活性更高。
在一態樣中，本實施形態之多胜肽，對於乙胺或其鹽與苯丙酮酸或其鹽的還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較由序列識別號17表示的胺基酸序列構成的多胜肽更高。
在一態樣中，本實施形態之多胜肽，對於乙胺或其鹽與2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸或其鹽的還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較由序列識別號17表示的胺基酸序列構成的多胜肽更高。
在一態樣中，本實施形態之多胜肽，對於甲胺或其鹽與2-環戊基-2-側氧基-乙酸或其鹽的還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較由序列識別號17表示的胺基酸序列構成的多胜肽更高。
在一態樣中，本實施形態之多胜肽，在至少一種反應條件下，具有對於氨或其鹽與苯丙酮酸或其鹽的還原胺化反應之觸媒活性。
本實施形態之多胜肽亦可與其他多胜肽或蛋白質融合。亦即，本實施形態之多胜肽在N端及C端中的任一者或兩者可以下序列以外的胺基酸序列(其他胺基酸序列)，該序列為具有與序列識別號1表示的胺基酸序列中的1個胺基酸殘基被改變之序列具有90%以上序列相同性之序列。該其他胺基酸序列可例如為標籤序列。
作為具有該其他胺基酸序列的多胜肽或蛋白質，可舉出例如由數個(例如6個、10個等)His(組胺酸)殘基所構成的標籤His標籤(6XHis、10XHis等)、包含對卵白素的生物素的結合部位具有結合能力的胺基酸序列之卵白素結合胜肽標籤(SBP標籤)、GST(Glutathione S-transferase)、流感病毒凝集素(HA)、免疫球蛋白恆定區域、B-半乳糖苷酶、MBP(麥芽糖結合蛋白質)、FLAG(Hopp,T.P.et al.,BioTechnology(1988)6,1204-1210)、人類c-myc之片段、VSV-GP之片段、p18HIV之片段、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原之片段、Ick tag、α-tubulin之片段、B-tag、ProteinC之片段、Stag、StrepTag、HaloTag等。His標籤可為例如序列識別號14表示的胺基酸序列。SBP標籤可為例如序列識別號15表示的胺基酸序列。
本實施形態之多胜肽在N端及C端中的任一者或兩者可包含選自由卵白素結合胜肽標籤序列及His標籤序列所組成之群組中的1個以上，在C端可包含卵白素結合胜肽標籤序列及His標籤序列。連接子(linker)序列可具有例如GGSS或GGS表示的胺基酸序列。作為包含卵白素結合胜肽標籤序列、連接子序列及His標籤序列之胺基酸序列的一例，可舉出例如序列識別號16表示的胺基酸序列。
本實施形態之多胜肽可具有上述胺基酸序列a1、a2、a3、a4或a5與標籤序列。本實施形態之多胜肽除了具有胺基酸序列a1、a2、a3、a4或a5與標籤序列之外，可具有將胺基酸序列a1、a2、a3、a4或a5與標籤序列連接的連接子序列。
一實施形態之多胜肽可具有以下的胺基酸序列： 以序列識別號18表示的胺基酸序列，其具有以序列識別號6表示，且X表示的胺基酸殘基為纈胺酸殘基之胺基酸序列a1(變異：M141V)、與連結在該胺基酸序列a1的C端的序列識別號16表示的胺基酸序列、 以序列識別號19表示的胺基酸序列，其具有以序列識別號6表示，且以X表示的胺基酸殘基為酪胺酸殘基之胺基酸序列a2(變異：M141Y)、與連結在該胺基酸序列a2的C端的序列識別號16表示的胺基酸序列、 以序列識別號20表示的胺基酸序列，其具有以序列識別號8表示，且以X表示的胺基酸殘基為白胺酸殘基之胺基酸序列a3(變異：H182L)、與連結在該胺基酸序列a3的C端的序列識別號16表示的胺基酸序列、 以序列識別號21表示的胺基酸序列，其具有以序列識別號11表示，且以X表示的胺基酸殘基為組胺酸殘基之胺基酸序列a4(變異：W253H)、與連結在該胺基酸序列a4的C端的序列識別號16表示的胺基酸序列、或者 以序列識別號22表示的胺基酸序列，其具有以序列識別號12表示，且以X表示的胺基酸殘基為麩胺酸殘基之胺基酸序列a5(變異：K260E)、與連結在該胺基酸序列a5的C端的序列識別號16表示的胺基酸序列。
以序列識別號18、序列識別號19、序列識別號20、序列識別號21、或序列識別號22表示的胺基酸序列中1個以上胺基酸殘基可被改變，可為1~20個、1~15個、1~10個、1~7個或1~5個胺基酸殘基被改變。以序列識別號18、序列識別號19、序列識別號20、序列識別號21、或序列識別號22表示的胺基酸序列中，經改變的胺基酸殘基可為3個以内，可為2個以内，可為1個。
一實施形態之多胜肽較佳為具有序列識別號36~44中任一表示的胺基酸序列。
一實施形態之多胜肽較佳為具有序列識別號45~62中任一表示的胺基酸序列。
本實施形態之多胜肽亦可作為與其他多胜肽的混合物使用，亦可以經分離・純化的狀態使用。作為與其他多胜肽的混合物使用時，可將目標生成物經由分離・純化的步驟而獲得作為目標的胺基酸。
本實施形態之多胜肽作為單體存在時的胺基酸殘基數目可為300以上、310以上、320以上、或325以上，可為330。又，本實施形態之多胜肽作為單體存在時的胺基酸殘基數目可為400以下、390以下、380以下、或375以下。
又，前述其他胺基酸序列未附加於N端及C端中任一者時，本實施形態之多胜肽的胺基酸殘基數目可為300以上、310以上、320以上、或325以上，可為330。又，前述其他胺基酸序列未附加於N端及C端中任一者時，本實施形態之多胜肽的胺基酸殘基數目可為360以下、350以下、340以下、或335以下。
再者，前述其他胺基酸序列附加於N端及C端中任一者或兩者時，本實施形態之多胜肽的胺基酸殘基數目可為340以上、350以上、360以上、或370以上，可為374。又，前述其他胺基酸序列附加於N端及C端中任一者或兩者時，本實施形態之多胜肽的胺基酸殘基數目可為400以下、390以下、380以下、或375以下。
再者，本實施形態之多胜肽亦可作為單體使用，亦可以2個以上單體彼此締合的形態使用。再者，本實施形態之多胜肽可為同質二聚體(homodimer)。
本實施形態之多胜肽為同質二聚體時，胺基酸殘基數目為作為單體存在時的2倍。 在一態樣中，本實施形態之多胜肽在至少一個反應條件下，前述觸媒活性較具有前述以序列識別號1表示的胺基酸序列之多胜肽的前述觸媒活性高。
在一態樣中，本實施形態之多胜肽，較具有前述以序列識別號1表示的胺基酸序列之多胜肽的前述觸媒活性高的溫度是在於0℃以上且50℃以下的範圍。
又，本實施形態之多胜肽，於0℃以上且50℃以下的反應條件下的至少一點，可具有對化合物A的任1種以上或其鹽與化合物B的任1種以上或其鹽的還原胺化反應或前述化合物B的任1種以上或其鹽的分子内還原胺化反應之觸媒活性。前述溫度的下限可為0℃以上、10℃以上、20℃以上、或30℃以上。反應溫度的上限可為50℃以下、40℃以下、或30℃以下。反應溫度可例如為0℃以上且50℃以下、10℃以上且40℃以下、或20℃以上且30℃以下。又，在一態樣中，前述溫度可為25℃，可為37℃。反應溫度亦可階段性或連續性的變化。
在一態樣中，本實施形態之多胜肽較具有前述以序列識別號1表示的胺基酸序列之多胜肽的前述觸媒活性高的pH是在7以上且11以下的範圍。又，本實施形態之多胜肽，於pH 7以上且11以下的反應條件下的至少一點具有觸媒活性。前述pH的下限可為7以上、7.5以上、8以上、或8.5以上。pH的上限可為11以下、10以下、9.5以下、或9以下。pH可例如為pH7以上且11以下、8以上且10以下、或8.5以上且9.5以下。又，在一態樣中，pH可為8，可為9。再者，在此所指的pH是指反應起始時點的pH，在反應中容許pH變動。反應中的pH變動可為2以内，可為1.5以内，可為1以内。
在一態樣中，本實施形態之多胜肽在進行還原胺化反應之際的反應液總量中，反應起始時點的前述化合物A及其鹽濃度總計為100mM以上且3000mM以下範圍的至少一點，較具有前述以序列識別號1表示的胺基酸序列之多胜肽的前述觸媒活性高的。在一態樣中，本實施形態之多胜肽，在37℃、pH8的反應條件下，具有較具有前述以序列識別號1表示的胺基酸序列之多胜肽的前述觸媒活性高的前述觸媒活性。
在一態樣中，本實施形態之多胜肽，在25℃、pH9的反應條件下，具有較具有前述以序列識別號1表示的胺基酸序列之多胜肽的前述觸媒活性高的前述觸媒活性。
又，本實施形態之多胜肽在化合物A及其鹽濃度總計為100mM以上且3000mM以下的反應條件下，可具有觸媒活性。 前述化合物A及其鹽濃度總計的下限可為100mM以上、300mM以上、500mM以上、700mM以上、900mM以上、1100mM以上、1300mM以上、1500mM以上、或1700mM以上。化合物A及其鹽濃度總計的上限可為3000mM以下、2500mM以下、或2000mM以下。化合物A及其鹽濃度總計可為100mM以上且3000mM以下、或500mM以上且2000mM以下。又，在一態樣中，化合物A及其鹽濃度總計可為500mM，可為1750mM。上述化合物A及其鹽濃度總計是在進行還原胺化反應之際的反應液總量中，反應起始時點的化合物A及其鹽濃度的總計。
在一態樣中，本實施形態之多胜肽在進行還原胺化反應之際的反應液總量中，反應起始時點的前述化合物B及其鹽濃度總計為0.001mM以上且1000mM以下的範圍的至少一點，較具有前述以序列識別號1表示的胺基酸序列之多胜肽的前述觸媒活性高。
又，本實施形態之多胜肽在化合物B及其鹽濃度總計為10mM以上且500mM以下的反應條件下，可具有觸媒活性。前述化合物B及其鹽濃度總計的下限可為10mM以上、30mM以上、50mM以上、100mM以上、150mM以上、200mM以上、250mM以上、300mM以上、或330mM以上。化合物B及其鹽濃度總計的上限可為500mM以下、450mM以下、400mM以下、或380mM以下。化合物B及其鹽濃度總計可為10mM以上且500mM以下、或300mM以上且400mM以下。在一態樣中，化合物B及其鹽濃度總計可為50mM，可為350mM。上述化合物B及其鹽濃度總計是在進行還原胺化反應之際的反應液總量中，反應起始時點的化合物B及其鹽濃度的總計。
在一態樣中，本實施形態之多胜肽在進行還原胺化反應之際的反應液總量中，反應起始時點的前述化合物A及其鹽的莫耳數總計相對於前述化合物B及其鹽的莫耳數總計的比值為1以上時的至少一點，前述觸媒活性較具有前述以序列識別號1表示的胺基酸序列之多胜肽的前述觸媒活性高。
又，本實施形態之多胜肽在化合物A及其鹽的莫耳數總計相對於化合物B及其鹽的莫耳數總計的比值(化合物A及其鹽的莫耳數總計/化合物B及其鹽的莫耳數總計)為1以上的反應條件下，可具有觸媒活性。
前述化合物A及其鹽的莫耳數總計相對於化合物B及其鹽的莫耳數總計的比值(化合物A及其鹽的莫耳數總計/化合物B及其鹽的莫耳數總計)可為1以上、3以上、5以上、8以上、或9以上，可為50以下、30以下、20以下、或15以下，可為5或10。上述化合物A及其鹽的莫耳數總計相對於化合物B及其鹽的莫耳數總計的比值是在進行還原胺化反應之際的反應液總量中，反應起始時點的化合物A及其鹽的莫耳數總計相對於化合物B及其鹽的莫耳數總計的比值。
本實施形態之多胜肽可利用於胺基酸的製造方法。該胺基酸的製造方法可包含在上述多胜肽及還原劑的存在下，將選自由胺、胺類似物及其鹽所組成之群組中的1種以上與選自由酮酸、酮酸類似物及其鹽所組成之群組中的1種以上進行反應，或者將選自由酮酸、酮酸類似物及其鹽所組成之群組的化合物在分子内進行反應之步驟。在分子進行反應時，酮酸及酮酸類似物可具有1級胺基或2級胺基。
又，在該胺基酸的製造方法中，可將前述反應在適當條件下進行。在此，適當條件是指適當地設定前述段落[0231]~[0241]所載的溫度、pH、反應起始時點的反應溶液中的化合物A及其鹽濃度的總計、化合物B及其鹽濃度的總計、以及化合物A及其鹽的莫耳數總計相對於化合物B及其鹽的莫耳數總計的比值等條件。
前述反應可在含有胺或胺類似物、酮酸或酮酸類似物、上述多胜肽、以及還原劑之反應液中進行。在一態樣中，可將化合物A作為胺或胺類似物使用。作為胺或胺類似物，可為烷基胺或氨，烷基胺可為C 1~C 6烷基胺或C 1~C 4烷基胺。更具體而言，例示為甲胺、乙胺、丙胺、及氨。在一態樣中，可將化合物B作為酮酸或酮酸類似物使用。作為酮酸或酮酸類似物，式(2)中的Y可為C 3~C 8環烷基或C 6~C 9芳烷基。更具體而言，例示為2-環戊基-2-側氧基-乙酸、苯丙酮酸、以及2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸。胺或胺類似物與酮酸或酮酸類似物可以鹽的狀態加入至反應液中。使用於反應的物質可以任意順序同時或各別進行混合。又，該鹽較佳可為化學上或藥學上可接受之鹽。該鹽包含，例如鹽酸鹽(hydrochloride)；溴酸鹽(hydrobromate)；碘酸鹽(hydroiodide)；磷酸鹽；膦酸鹽；硫酸鹽(sulfate)；甲磺酸鹽、對甲苯磺酸(p-toluenesulfonate)等磺酸鹽；乙酸鹽、檸檬酸鹽(citrate)、蘋果酸鹽(malate)、酒石酸鹽(tartrate)、琥珀酸鹽(succinate)、柳酸鹽(salicylate)等羧酸鹽；或鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽；鎂鹽、鈣鹽等鹼土金屬鹽；銨鹽、烷基銨鹽、二烷基銨鹽、三烷基銨鹽、四烷基銨鹽等銨鹽等。
作為還原劑，可舉出例如還原型菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、氧化型菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、還原型菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)以及氧化型菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。一實施形態中，還原劑可為β-NADPH。
再者，可共同添加例如葡萄糖脫氫酶(GDH)及葡萄糖等，將NADP+及NAD+各自還原成NADPH及NADH的添加劑。 例如，NADPH作為還原劑使用時，為了抑制NADPH的使用量，在反應的步驟中，可使用反應劑，其將反應液中產生得到的NADP +(氧化型菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)還原成NADPH。作為該反應劑，可舉出例如葡萄糖與GDH(葡萄糖脫氫酶)的組合。與NADPH一起使用葡萄糖及GDH時，可將NADPH的使用量抑制為觸媒量。
反應起始時點的反應溶液中的還原劑濃度可例如為0.001mM~100mM、或可為0.01~10mM。
在前述反應中，溫度、pH、以及各化合物的濃度等反應條件可為如上述的條件。
胺基酸的製造方法可將還原胺化反應在下述式(4)表示的化合物C存在下進行。 [化45]
式(4)中，v及w各自獨立表示為0或1，v及w中的任1個以上表示1，T表示碳原子、磷原子或硫原子。
式(4)中，下述式(4a)表示的官能基表示=O、-ORd或羥基。 [化46] 在此，式(4a)表示的官能基為=O是指T以雙鍵與氧原子鍵結者。亦即，式(4a)表示的官能基為=O的化合物C具有T=O表示的結構。式(4a)表示的官能基為-ORd是指T以單鍵與ORd鍵結者。亦即，式(4a)表示的官能基為-ORd的化合物C具有T-ORd表示的結構。式(4a)表示的官能基為羥基是表示T與羥基直接鍵結。亦即，式(4a)表示的官能基為-OH的化合物C具有T-OH表示的結構。
式(4)中，v及w共同為1時，存在複數個的式(4a)表示的2個官能基可為相同亦可為不同。Ra、Rb及Rc各自獨立表示為氫原子、C 1~C 3烷基、烷基胺基或-CH 2-ORd，Ra、Rb、及Rc中的任2個以上可與T共同彼此連結而形成環結構。Rd表示C 1~C 3烷基。d、e及f各自獨立表示為0或1，d、e及f中的任1個以上表示1。
式(4)中，v及w共同為1時，Ra、Rb及Rc中的任1個以上為甲基，Ra、Rb及Rc皆不彼此連結而與T共同形成環結構。例如，v及w共同為1時，T為硫原子，式(4a)表示的官能基皆為=O，f為0，Ra及Rb中的至少一個可為甲基。
Ra、Rb及Rc中的任1個以上為甲基胺基時，Ra、Rb及Rc皆不彼此連結而與T共同形成環結構。式(4a)表示的官能基為羥基，且T為碳原子時，v為1，w為0，d、e及f皆為1，Ra、Rb及Rc皆為氫原子。
化合物C可為式(1)中的T為碳原子的下述式(4-1)表示的化合物。 [化47]
式(4-1)表示的化合物可為v為1，w為0的下述式(4-1a)表示的化合物。 [化48]
式(4-1a)中，式(4a)表示的官能基為=O時，d、e及f中的2個為1，其他為0。式(4a)表示的官能基為=O時，式(4-1a)表示的化合物可為d及e為1，且f為0的下述式(4-1b)表示的化合物。 [化49]
式(4-1b)表示的化合物可為Ra及Rb的其一為氫原子或C 1~C 3烷基，且另一為烷基胺基的化合物。又，烷基胺基可為單甲基胺基或二甲基胺基。例如，式(4-1b)表示的化合物可為N,N二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、或N-甲基甲醯胺。
式(4-1a)中，式(4a)表示的官能基為羥基時，d、e及f皆為1。式(4a)表示的官能基為羥基時，式(4-1a)表示的化合物可為d、e及f皆為1的下述式(4-1c)表示的化合物。 [化50]
Ra、Rb及Rc可各自獨立為氫原子、或C 1~C 3烷基。式(4-1c)表示的化合物可為Ra、Rb及Rc皆為氫原子的甲醇。
式(4-1a)中，式(4a)表示的官能基為-ORd時，d、e及f可皆為1，且Rb及Rd可皆為氫原子。式(4a)表示的官能基為-ORd時，式(4-1a)表示的化合物可為d、e及f皆為1，且Rb及Rd皆為氫原子的下述式(4-1d)表示的化合物。下述式(4-1d)表示的化合物中，Ra可為-CH 2-ORd。下述式(4-1d)表示的化合物可為Ra為-CH 2-ORd，Rd皆為-CH 3的二甲氧乙烷。 [化51]
化合物C可為式(4)中的T為磷原子的下述式(4-2)表示的化合物。 [化52]
式(4-2)表示的化合物可為v為1，w為0，式(4a)表示的官能基為=O的下述式(4-2a)表示的化合物。 [化53]
式(4-2a)中，Ra、Rb及Rc可皆為C 1~C 3烷基。式(4-2a)表示的化合物可為Ra、Rb及Rc皆為甲基的三甲基氧膦。
化合物C可為式(4)中的T為硫原子之下述式(4-3)表示的化合物。 [化54]
式(4-3)表示的化合物可為v為1，w為0，式(4a)表示的官能基為=O，d及e皆為1，f為0之下述式(4-3a)表示的化合物。 [化55]
式(4-3a)中，Ra及Rb可皆為C 1~C 3烷基，Ra及Rb亦可彼此連結而與硫原子(S)共同形成環結構。
式(4-3a)表示的化合物的Ra及Rb可各自獨立為甲基、或乙基。式(4-3a)表示的化合物可為Ra及Rb皆為甲基之二甲基亞碸、或者Ra及Rb皆為乙基之二乙基亞碸。式(4-3a)表示的化合物可為Ra及Rb皆為C 1~C 3烷基，該烷基彼此互相連結而與S共同形成環結構之四亞甲基亞碸。
式(4-3)表示的化合物可為v及w皆為1，式(4a)表示的官能基為=O，d及e皆為1，f為0之下述式(4-3b)表示的化合物。 [化56]
式(4-3b)表示的化合物的Ra及Rb中任1個以上可為甲基。式(4-3b)表示的化合物可為Ra及Rb皆為甲基之二甲基碸。
為了能夠產率更佳地製造胺基酸，化合物C可為選自由二甲基亞碸、二甲基碸、三甲基氧膦、二甲氧乙烷、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、四亞甲基亞碸、二乙基亞碸、甲醇及甲基甲醯胺所組成之群組中的1種以上的化合物。為了能夠產率更佳地製造胺基酸，化合物C可選自由二甲基亞碸、二甲基碸及三甲基氧膦所組成之群組中的1種以上，可為二甲基亞碸。
化合物C在25℃且1大氣壓的條件下可為液體或固體，為了更提升胺基酸的製造効率，可在25℃且1大氣壓的條件下可為液體。作為在25℃且1大氣壓的條件下為液體之化合物C，可舉出二甲基亞碸、二甲氧乙烷、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、甲醇及N-甲基甲醯胺。
胺基酸的製造方法可包含以下步驟(A)及(B)。 步驟(A)；將藉由上述方法所得到的純化對象物與含鋰物質接觸之步驟，該純化對象物為作為純化目標物之以下(i)與作為雜質的以下(ii)的混合物， (i)N端具有保護基的前述胺基酸 (ii)前述純化目標物以外的化合物， 步驟(B)；使前述純化目標物的鋰鹽析出之步驟。
本發明之另一實施形態為自純化對象物除去雜質之方法，其包含上述步驟(A)及(B)。
本發明之更另一實施形態，可為胺基酸的鋰鹽或其溶媒合物，上述胺基酸的鋰鹽為含有純度99莫耳%以上或表觀純度99%以上的下述通式(5)表示的胺基酸的鋰鹽之胺基酸的鋰或其溶媒合物。 [化57]
前述通式(5)中，n5表示1以上且3以下的數目，R 5a存在複數個時，R 5a可彼此相同亦可彼此不同，R 5a及R 5b各自獨立表示氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜環基或雜芳基或者選自由該等的取代基所組成之群組中的2個以上鍵結的取代基，該等基可具有取代基，該等基可為飽和烴基或不飽和烴基，A表示碳原子，B表示氫原子或胺基酸或者與胜肽化合物的鍵結點，Z 5表示芴基甲氧基羰基、三級丁氧基羰基、苄氧基羰基、烯丙基氧羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基或2-(三甲基矽基)乙氧基羰基，R 5a及R 5b亦可與N及A共同鍵結而形成環，在此情況下，R 5a及R 5b為自與成環無關時的取代基結構中除去一個氫原子的結構的取代基，n5為2時，R 5b及存在2個的R 5a中的任1個以上不為氫原子。
過去，在純化上述的純化目標物時，會有其難以以高純度純化的情況。一般而言，純化目標物可使用作為胜肽化合物及蛋白質合成等原料。在其作為醫藥品的情況下，重要的是獲得高純度的胜肽化合物及蛋白質，以抑制因雜質所致的副作用。亦即，重要的是以高純度純化構成其的原料。本發明者們深入探討的結果，驚人地新發現藉由將純化目標物轉換為鋰鹽，可以純化至高純度，更加提升純化目標物的的實用性、使用其的胜肽化合物及蛋白質合成的實用性。
本發明中的胺基酸的鹽或其溶媒合物，較佳為胺基酸的鹽，更佳為胺基酸的鋰鹽可將純化對象物藉由步驟(A)及步驟(B)處理而獲得。本說明書的純化對象物可為前述純化目標物與前述雜質的混合物。本說明書的純化目標物是指N端具有保護基的前述胺基酸。作為前述純化目標物，例示為上述通式(5)表示的胺基酸。又，本說明書的前述雜質是指包含於前述純化對象物中的前述純化目標物以外的化合物。作為前述雜質，可舉出準特定雜質(純化目標物以外的N端具有保護基的胺基酸)。更具體而言，例示為β-丙胺酸或其衍生物。本說明書的衍生物是指某些有機化合物被認為是基體時，在不大幅改變基體的結構或性質的程度下，進行官能基的導入、氧化、還原、原子的取代等改變之化合物，作為β-丙胺酸的衍生物，例示為特定雜質(N端具有保護基的β-丙胺酸)。
步驟(A)為純化對象物與含鋰物質接觸之步驟。又，藉由步驟(A)可形成前述純化目標物的鋰鹽，可形成前述雜質的鋰鹽。步驟(B)是使純化目標物的鋰鹽析出之步驟。又，步驟(A)的一部分和步驟(B)的一部分亦可在時間上重複進行。再者，在步驟(A)支籤，亦可將前述純化對象物以本發明以外的方法進行純化。例如，亦可不形成純化目標物的鋰鹽，而使純化目標物以游離體的狀態析出以進行純化。步驟(A)及步驟(B)的至少一者可在溶媒存在下進行，在本說明書中，「析出」是指自溶媒中產生固體。
純化目標物的保護基可為胺基碳酸鹽(carbamate)基。胺基碳酸鹽基是指芴基甲氧基羰基、三級丁氧基羰基、苄氧基羰基、烯丙基氧羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基或2-(三甲基矽基)乙氧基羰基，可為芴基甲氧基羰基、三級丁氧基羰基或苄氧基羰基，可為芴基甲氧基羰基或苄氧基羰基，可為芴基甲氧基羰基，可為苄氧基羰基。
雜質的保護基可為胺基碳酸鹽基。胺基碳酸鹽基是指芴基甲氧基羰基、三級丁氧基羰基、苄氧基羰基、烯丙基氧羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基或2-(三甲基矽基)乙氧基羰基，可為芴基甲氧基羰基、三級丁氧基羰基或苄氧基羰基，可為芴基甲氧基羰基或苄氧基羰基，可為芴基甲氧基羰基，可為苄氧基羰基。該等的保護基可為保護雜質N端的保護基。
純化目標物的保護基與雜質的保護基可為不同，亦可為相同。純化目標物的保護基與前述雜質的保護基以相同為佳。
步驟(A)亦可在第一有機溶媒存在下進行。自有效地進行純化目標物與含鋰物質的接觸之觀點而言，第一有機溶媒為可溶解純化目標物之溶媒。第一有機溶媒對於前述純化目標物的溶解度較佳為20g/L以上。第一有機溶媒對於前述純化目標物的鋰鹽的溶解度較佳為20g/L以下。第一有機溶媒對於前述雜質的溶解度較佳為20g/L以上。
作為第一有機溶媒，例示為選自由乙腈等腈類、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、2-甲基-2-丙醇、乙二醇等醇類、四氫呋喃、1,4-二㗁烷、2-甲基四氫呋喃、甲基三級丁基醚、二異丙醚、二乙醚、1,2-二甲氧乙烷等醚類、丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮等酮類、二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺、N-甲基-2-吡咯啶酮等醯胺類、1,3-二甲基-2-咪唑啶酮等脲類、二甲基亞碸等亞碸類、環丁碸(sulfolane)等碸類、庚烷、甲基環己烷、己烷、環己烷、戊烷等烷烴類、苯、甲苯、1,2-二甲基苯、1,3-二甲基苯、1,4-二甲基苯等芳香族化合物類、乙酸乙酯、乙酸異丙酯等酯類、二氯乙烷、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳等鹵化烷類所組成之群組中的至少1種。第一溶媒的種類可為複數種，以簡化步驟(A)的觀點而言，以1種為佳。
步驟(A)亦可在水的存在下進行。
步驟(B)亦可在第二有機溶媒存在下進行。第二有機溶媒為純化目標物的鋰鹽的溶解度小的溶媒，亦即，發揮對於純化目標物的鋰鹽的不良溶媒的功能之溶媒。第二有機溶媒對於前述純化目標物的鋰鹽的溶解度較佳為10g/L以下。
作為第二有機溶媒，例示為選自由乙腈等腈類、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、2-甲基-2-丙醇、乙二醇等醇類、四氫呋喃、1,4-二㗁烷、2-甲基四氫呋喃、甲基三級丁基醚、二異丙醚、二乙醚、1,2-二甲氧乙烷等醚類、丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮等酮類、二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺、N-甲基-2-吡咯啶酮等醯胺類、1,3-二甲基-2-咪唑啶酮等脲類、二甲基亞碸等亞碸類、環丁碸等碸類、庚烷、甲基環己烷、己烷、環己烷、戊烷等烷烴類、苯、甲苯、1,2-二甲基苯、1,3-二甲基苯、1,4-二甲基苯等芳香族化合物類、乙酸乙酯、乙酸異丙酯等酯類、二氯乙烷、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳等鹵化烷類所組成之群組中的至少1種。第二溶媒的種類可為複數種，以簡化步驟(B)的觀點而言，以1種為佳。
步驟(B)亦可在水的存在下進行，自溶解雜質的鋰鹽之觀點而言，以在水的存在下進行為佳。水對於雜質的鋰鹽的溶解度較佳為10g/L以上。
第二有機溶媒亦可在步驟(A)中與第一有機溶媒共同使用。 步驟(B)中，使前述純化目標物的鋰鹽析出。析出之際，添加前述第二有機溶媒，藉由增加該比例，能夠促進前述純化目標物的鋰鹽的析出。在增加前述第二有機溶媒比例的情況下，將前述第二有機溶媒添加至於步驟(A)使用的前述第一有機溶媒即可。
又，前述第一有機溶媒的比例或第二有機溶媒的比例是指藉由前述第一有機溶媒或第二有機溶媒的體積除以純化目標物的質量而算出的體積/質量比(ml/g，以下亦表示v/w)。
又，步驟(A)中使用的前述第一有機溶媒對於前述純化目標物的鋰鹽的溶解度十分小的情況下，前述第一有機溶媒及前述第二有機溶媒亦可為相同的溶媒。在此情況下，步驟(B)中不需添加前述第二有機溶媒。在此情況下，步驟(A)中，使前述純化目標物與前述含鋰物質接觸時，加速步驟(B)起始，使純化目標物的鋰鹽析出。
純化目標物的鋰鹽以作為固體析出為佳。在此所謂的固體，包含結晶或非晶形。又，以作為結晶析出(使其晶析)更佳。在此情況下，步驟(B)亦可為使純化目標物的鋰鹽晶析之步驟。
前述第一有機溶媒相對於前述純化對象物1g的容量，經由步驟(A)及步驟(B)，可為1ml以上、2ml以上或3ml以上，可為100ml以下、80ml以下、60ml以下或40ml以下。前述第一有機溶媒相對於前述純化對象物1g的容量，經由步驟(A)及步驟(B)，可為1ml以上且100ml以下、1ml以上且80ml以下、2ml以上且60ml以下或3ml以上且40ml以下。
在步驟(B)中增加第二有機溶媒的比例的情況下，步驟(A)結束時的前述第一有機溶媒相對於前述純化對象物1g的容量(第一有機溶媒的初期濃度)，可為1ml以上、2ml以上或3ml以上，可為50ml以下、40ml以下、30ml以下或20ml以下。第一有機溶媒的初期濃度可為1ml以上且50ml以下、1ml以上且40ml以下、2ml以上且30ml以下或3ml以上且20ml以下。
在步驟(B)中不增加第二有機溶媒的比例的情況下，步驟(A)結束時的前述第一有機溶媒相對於前述純化對象物1g的容量(第一有機溶媒的初期濃度)，可為1ml以上、10ml以上、20ml以上或30ml以上、35ml以上，可為100ml以下、75ml以下或50ml以下或37ml以下。第一有機溶媒的初期濃度可為1ml以上且100ml以下、10ml以上且75ml以下、20ml以上且50ml以下、30ml以上且37ml以下或35ml以上且37ml以下。
第二有機溶媒相對於純化對象物1g的容量，經由步驟(A)及步驟(B)，可為0ml以上，可為40ml以下、60ml以下、80ml以下或100ml以下。第二有機溶媒相對於純化對象物1g的容量，經由步驟(A)及步驟(B)，可為0ml以上且100ml以下、0ml以上且80ml以下、1ml以上且60ml以下或1ml以上且40ml以下。
步驟(B)結束時的第二有機溶媒相對於純化對象物1g的容量，可為0ml以上，可為40ml以下、60ml以下、80ml以下、或100ml以下。步驟(B)結束時的第二有機溶媒相對於純化對象物1g的容量，可為0ml以上且100ml以下、0ml以上且80ml以下、0ml以上且60ml以下或0ml以上且40ml以下。
前述水相對於前述純化對象物1g的容量，經由步驟(A)及步驟(B)，可為0.1ml以上、0.3ml以上或0.5ml以上，可為50ml以下、30ml以下、10ml以下或5ml以下。溶媒中水的容量，經由步驟(A)及步驟(B)，可為0.1ml以上且50ml以下、0.1ml以上且30ml以下、0.3ml以上且10ml以下或0.5ml以上且5ml以下。
步驟(A)結束時的前述水相對於前述純化對象物1g的容量(水的初期濃度)，可為0.1ml以上、0.3ml以上或0.5ml以上，可為50ml以下、30ml以下、10ml以下或4ml以下。水的初期濃度可為0.1ml以上且50ml以下、0.1ml以上且30ml以下、0.3ml以上且10ml以下或0.5ml以上且4ml以下。
步驟(B)結束時的前述水相對於前述純化對象物1g的容量(水的初期濃度) ，可為0.1ml以上、0.3ml以上或0.5ml以上，可為50ml以下、30ml以下、10ml以下或4ml以下。水的初期濃度可為0.1ml以上且50ml以下、0.1ml以上且30ml以下、0.3ml以上且10ml以下或0.5ml以上且4ml以下。
步驟(A)及步驟(B)亦可在第一有機溶媒及第二有機溶媒以外的其他溶媒存在下進行。作為其他溶媒，例示為磷酸緩衝液、CHES(N-環己基-2-胺基乙磺酸)、Tris(三羥基甲基胺基甲烷)、二羥乙甘胺酸(bicine)(N,N-二(2-羥基乙基)甘胺酸)等緩衝液。
進行步驟(A)的溫度，可為-20℃以上，可為0℃以上，可為10℃以上，可為20℃以上。進行步驟(A)的溫度，可為100℃以下，可為80℃以下，可為60℃以下，可為40℃以下，可為30℃以下。進行步驟(A)的溫度，可為-20~100℃，可為0~80℃，可為10~60℃，可為10~40℃，亦可為20~30℃。
進行步驟(B)的溫度，可為-20℃以上，可為0℃以上，可為10℃以上，可為20℃以上，亦可為30℃以上，亦可為35℃以上。進行步驟(B)的溫度，可為100℃以下，可為80℃以下，可為60℃以下，可為40℃以下，亦可為30℃以下。進行步驟(A)的溫度，可為-20~100℃，可為0~80℃，可為10~60℃，可為10~40℃，亦可為20~30℃。
步驟(A)及步驟(B)中的溫度、各種溶液所含的物質的濃度等各條件可為相同亦可為不同。在兩者中該各條件不同的情況下，亦可選自上述步驟(A)的各種條件中的的條件進行組合。又，前述步驟(A)結束時點的前述含鋰物質的質量，以純化目標物的質量為基準，可為0.5當量以上、0.8當量以上或1.0當量以上，可為2.0當量以下、1.5當量以下或1.1當量以下。以前述純化目標物的質量為基準的含鋰物質的質量，可為0.5當量以上且2.0當量以下、0.8當量以上且1.5當量以下或1.0當量以上且1.1當量以下。
再者，本說明書中的前述含鋰物質是指含有鋰的物質，其用於與步驟(A)中前述純化目標物接觸。作為步驟(A)中使用的含鋰物質，可舉出例如選自由氫氧化鋰、三級丁醇鋰、氫氧化鋰、碳酸鋰、氫化鋰、磷酸三鋰、甲醇鋰、乙醇鋰、異丙醇鋰、三級丁醇鋰、甲基鋰、正丁基鋰、二級丁基鋰、三級丁基鋰、胺化鋰(lithium amide)、二異丙基胺化鋰、六甲基二矽胺化鋰(lithium hexamethyldisilazide)、四甲基哌啶鋰所組成之群組中的至少1種。
將純化對象物與含鋰物質接觸之方法並未限定，能夠使純化對象物及含鋰物質在第一有機溶媒存在下進行接觸。在此情況下，純化對象物、含鋰物質及第一有機溶媒亦可預先在同一容器中混合，亦可將純化對象物與第一有機溶媒混合後，將含鋰物質添加至所得的混合液，亦可將含鋰物質與第一有機溶媒混合後，將純化對象物添加至所得的混合液。
再者，作為決定第一有機溶媒、第二有機溶媒及含鋰物質的量之際的基準之純化對象物中純化目標物的含量可為實測值、推估值或計算值，以實測值或計算值為佳，以實測值為最佳。
作為純化目標物所含的N端具有保護基的胺基酸或構成N端具有保護基的胜肽化合物的胺基酸，可舉出上述通式(5)表示的胺基酸(亦稱為胺基酸(1))、疏水性胺基酸、脂肪族胺基酸、芳香族胺基酸等。
n5表示1以上且3以下的數目，可為1以上且3以下的整數。n5可為1、2或3。n5為2的情況下，R 5b及存在2個的R 5a中的任1個以上不為氫原子，R 5b及存在2個的R 5a中的任2個以上可不為氫原子，R 5b及存在2個的R 5a的3個亦可皆不為氫原子。
R 5a及R 5b表示氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜環基或雜芳基或者選自由該等的取代基所組成之群組中的2個以上鍵結的取代基(例如苄基等)，該等的基可具有取代基，該等的基可為飽和或不飽和。
A表示碳原子，B表示氫原子或與胺基酸或胜肽化合物的鍵結點。
Z 5表示芴基甲氧基羰基、三級丁氧基羰基、苄氧基羰基、烯丙基氧羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基或2-(三甲基矽基)乙氧基羰基。
R 5a及R 5b可與N及A共同鍵結而形成環。在此情況下，R 5a及R 5b為自與成環無關時的取代基結構中除去一個氫原子的結構的取代基。
步驟(B)中，可以步驟(B)所得的析出物(純化產物)中所含的準特定雜質的含量減少的方式使純化產物析出。步驟(B)中，可以純化產物的純度成為95莫耳%以上的方式使純化產物析出。前述純度較佳為96莫耳%以上，更佳為97莫耳%以上，再更佳為98莫耳%以上，特佳為99莫耳%以上，最佳為100莫耳%。本說明書中的「純度」，廣義而言，是指作為測定純度的對象的物質中所含的目標物質的存在比例，狹義而言，是指以純化目標物的鋰鹽及特定雜質的鋰鹽之質量總計為基準，純化產物中所含的純化目標物的鋰鹽的質量比例。
步驟(B)中，可以純化產物中的雜質含有率成為5莫耳%以下的方式使純化產物析出。前述雜質含有率較佳為4莫耳%以下，更佳為3莫耳%以内，再更佳為2莫耳%以内，特佳為1莫耳%以内，最佳為0莫耳%。本說明書中的「雜質含有率」是指以純化目標物的鋰鹽及特定雜質的鋰鹽之質量總計為基準，純化產物中所含的特定雜質的鋰鹽質量。
純度或雜質含有率可藉由例如核磁共振裝置、氣相層析法、或高效液相層析法進行測定。在使用高效液相層析法的情況下，可藉由UV吸收波峰的面積比進行計算。下述式1a示出求得純度的公式，下述式2a示出求得雜質含有率的公式。 [公式1] [公式2]
在此，每單位UV吸收波峰面積的質量是指純化目標物或特定雜質的UV吸收波峰面積除以質量的數值。
步驟(B)中，可以純化產物的表觀純度成為95%以上的方式使純化產物析出。表觀純度較佳為96%以上，更佳為97%以上，再更佳為98%以上，特佳為99%以上，最佳為100%。本說明書中的「表觀純度」是指純化產物以高效液相層析法於純化目標物與特定雜質分離後測定兩者的特定波長的UV吸收波峰面積總計為基準，純化目標物的前述特定波長的UV吸收波峰面積的比例。
步驟(B)中，可以純化產物的表觀雜質含有率成為5%以下的方式使純化產物析出。表觀雜質含有率較佳為4%以下，更佳為3%以内，再更佳為2%以内，特佳為1%以内，最佳為0%。本說明書中的「表觀雜質含有率」是指純化產物以高效液相層析法於純化目標物與特定雜質分離後測定兩者的特定波長的UV吸收波峰面積總計為基準，特定雜質的特定波長的UV吸收波峰面積的比例。
下述式1b示出求得表觀純度的公式，下述式2b示出求得表觀雜質含有率的公式。 [公式3] [公式4]
本說明書中的特定波長是指自純化目標物具有的保護基顯示的極大吸收波長的前後10%以内的波長。又，存在複數個極大吸收波長的情況下，以其中最大吸收波長的吸收強度為基準，若為顯示30%以上的吸收強度的極大吸收波長，亦可任意選擇作為極大吸收波長。又，藉由選擇存在複數個極大吸收波長中的長波長側可減輕雜訊的影響。又，可根據所選的極大吸收波長的吸收強度可調整樣品濃度。在測定之際，可選擇自調整樣品濃度的容易度或減輕雜訊的觀點而言被認為最佳的極大吸收波長。
例如，若為Fmoc基，可將254nm的UV光作為特定波長的UV光，若為Boc基，可將197nm的UV光作為特定波長的UV光，若為Cbz基，可將210nm的UV光作為特定波長的UV光。
一實施形態之製造方法中，藉由獲得鋰鹽，可降低純化對象物中的β-丙胺酸或其衍生物的含有率。換言之，本實施形態之製造方法亦可具備降低β-丙胺酸或其衍生物的含有率之步驟。
本實施形態之製造方法更可具備成為鋰鹽以外的鹽之步驟。具體而言，例如可將藉由一實施形態之製造方法所得的鋰鹽進行脫鹽，而得到游離體的胺基酸或游離體的胜肽化合物。脫鹽可藉由習知的方法進行。再者，可自所得到的游離體的胺基酸或胜肽化合物製造鋰鹽以外的鹽。作為鋰鹽以外鹽，可例示為與鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機酸形成的鹽；與乙酸、琥珀酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸酸、酒石酸、檸檬酸、乳酸、硬脂酸、苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸等有機酸形成的鹽；與鹼金屬(鈉或鉀)形成的鹽；與鈣和鎂等鹼土類金屬形成的鹽；銨鹽等。
本實施形態之多胜肽可用於胜肽化合物的製造方法。 在一態樣中，該胜肽化合物的製造方法可包含以下步驟。 (1)根據上述方法，製造胺基酸或胺基酸衍生物之步驟；以及 (2)將前述胺基酸與選自由其他胺基酸及胜肽所組成之群組中的1種以上連結之步驟。 前述步驟(2)亦可在如“SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS” (https://www.bachem.com/wpfd_file/solid-phase-peptide-synthesis/,2002363 published by Global Marketing, Bachem AG, December 2019)所載的條件下實施。
前述反應可在水性介質中或水性介質與有機溶媒的混合液中進行。水性介質可為水或緩衝液。作為緩衝液，可舉出磷酸緩衝液、CHES(N-環己基-2-胺基乙磺酸)、Tris(三羥基甲基胺基甲烷)、二羥乙甘胺酸(N,N-二(2-羥基乙基)甘胺酸)。作為有機溶媒，可舉出例如二甲基亞碸。
藉由本實施形態之胜肽化合物之製造方法所得的胜肽化合物可為例如具有環狀部的胜肽化合物(環狀胜肽化合物)。
本實施形態之環狀胜肽化合物的胺基酸殘基數，可為30以下、25以下、20以下、15以下、14以下、13以下、12以下、11以下、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下或2以下。又，本實施形態之環狀胜肽化合物可為由2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、或15以上的胺基酸所形成的胜肽化合物。又，本實施形態之環狀胜肽化合物的胺基酸殘基數，可為2以上且10以下、2以上且8以下、2以上且6以下、或2以上且4以下。又，本實施形態之環狀胜肽化合物的胺基酸殘基數，可為5以上且30以下、7以上且25以下、8以上且15以下、9以上且14以下、10以上且13以下、或11。
環狀胜肽化合物的「環狀部」是指2個以上胺基酸殘基連結，所形成的環狀的部分。環狀胜肽化合物的構成環狀部的胺基酸殘基數，可為5以上且14以下、6以上且14以下、7以上且14以下、8以上且14以下、9以上且14以下、10以上且14以下、5以上且13以下、6以上且13以下、7以上且13以下、8以上且13以下、9以上且13以下、10以上且13以下、5以上且12以下、6以上且12以下、7以上且12以下、8以上且12以下、9以上且12以下、10以上且12以下、5以上且11以下、6以上且11以下、7以上且11以下、8以上且11以下、9以上且11以下、10以上且11以下、或11。環狀部較佳為透過醯胺鍵、碳-碳鍵、S-S鍵、硫醚鍵、三唑鍵等共價鍵形成，可將連結胺基酸殘基的直鏈狀胜肽化合物的N端側的基與C端側的基鍵結而形成。具體而言，例如可將連結胺基酸殘基的直鏈狀胜肽化合物的N端側的胺基與C端側的羧基鍵結而形成。環化亦可為如醯胺鍵的碳-氮鍵所致的環化、如酯鍵及醚鍵的碳-氧鍵所致的環化、如硫醚鍵的碳-硫鍵所致的環化、碳-碳鍵所致的環化、硫-硫鍵所致的環化、或構築雜環所致的環化等如此的形態。在該等之中，較佳為透過醯胺鍵及碳-碳鍵等共價鍵的環化，更佳為透過側鏈的羧基與主鏈的胺基所致的醯胺鍵的環化。用於環化的羧基及胺基等位置，可為主鏈上者，亦可為側鏈上者，只要為可環化的位置則無特別限定。
本實施形態之環狀胜肽化合物的環原子數可為15以上且46以下。本說明書的「環原子數」是指包含環的最內側部分的環式化合物的原子(環原子)的數目，化合物具有複數個環的情況下，以該原子數目最多的環的該原子數目進行定義。再者，存在2個環的一部分的原子共有的情況下，使用共有的原子數目小的一者，並計算出各自環的環原子數。針對「環原子數」在具體例中進一步說明，例如使用此方法時，四氫呋喃(THF)的環原子數為5，他克莫司(tacrolimus)(FK506)的環原子數為21。
本實施形態之環狀胜肽化合物的環原子數，可例如為34以上且46以下、34以上且43以下、34以上且40以下、34以上且37以下、34以上且36以下、或34。用於計算環原子數的環原子亦可選自由碳原子、氫原子、氮原子、氧原子、硫原子、磷原子、及矽原子所組成之群組，亦可選自由碳原子、氫原子、氮原子、及氧原子所組成之群組。
本實施形態之環狀胜肽化合物，除了環狀部之外，亦可具有直鏈部。環狀胜肽化合物的胺基酸殘基數的具體態樣可與上述的胜肽化合物的胺基酸殘基數的具體態樣相同。環狀胜肽化合物具有直鏈部的情況下，環狀部與直鏈部合併的胺基酸殘基數以納入同樣範圍為佳。又，環狀胜肽化合物具有直鏈部的情況下，構成環狀部的胺基酸殘基數，較佳為5以上且15以下、6以上且15以下、6以上且14以下、7以上且14以下、8以上且14以下、7以上且13以下，更佳為7以上且12以下、8以上且11以下，再更佳為9以上且11以下，特佳為10或11，構成直鏈部的胺基酸殘基數，較佳為1以上且8以下、1以上且7以下、1以上且6以下、1以上且5以下、1以上且4以下，更佳為1以上且3以下。
本實施形態之環狀胜肽化合物的分子量並未特別限定，例如可為500以上、550以上、600以上、650以上、700以上、750以上、800以上、850以上、900以上、950以上，較佳為1000以上、1100以上、1200以上、1300以上、或1400以上。作為本實施形態之胜肽化合物的分子量上限並未特別限定，較佳為5000以下、4000以下、3000以下、2500以下、2000以下。本說明書的分子量是指構成化合物分子的原子的原子量總和(單位：「g/mol」)，藉由算出分子結構式所包含的原子的原子量總和而得到(單位：「g/mol」)。本說明書中，會有省略分子量單位的情況。再者，胜肽化合物的分子量可藉由實施例所載的液體層析質量分析(LC/MS)進行測定。
本實施形態之環狀胜肽化合物可含有1或複数個N取代胺基酸殘基，較佳為含有至少3個N取代胺基酸殘基，更佳為含有至少4個N取代胺基酸殘基，再更佳為含有至少5個N取代胺基酸殘基。N取代胺基酸殘基在N取代環狀胜肽化合物中可連續地存在，亦可不連續地存在。
本發明之一實施形態為編碼上述多胜肽的DNA。該DNA亦可任意包含例如基因體DNA、cDNA及以其為基礎人工作出的DNA。基因體DNA包含外顯子及內含子。亦即，基因體DNA可包含亦可不包含內含子，又，可包含亦可不包含非轉譯區域(5’UTR及/或3’UTR)或轉錄調控區域等。又，cDNA亦可包含來自內含子序列的一部分的核酸序列且編碼胺基酸序列的核酸序列。又，該DNA亦包含簡併多核苷酸(degenerate polynucleotide)，其只要為編碼相同胺基酸的密碼子則可由任何密碼子所構成。本實施形態之DNA可為來自期望的生物的DNA。
本實施形態之DNA可為以任何方法所得的DNA。例如，自mRNA製備的互補DNA(cDNA)、由基因體DNA製備之DNA、利用化學合成獲得之DNA、以RNA或DNA作為模板以PCR法放大而獲得之DNA及將該等方法適當組合而建構之DNA，全部都包括在內。可依據常法，藉由從編碼上述多胜肽的基因體DNA或RNA選殖(cloning)該DNA，導入變異等而製作本實施形態之DNA。
例如，作為從編碼於本實施形態之DNA的編碼上述多胜肽的mRNA將cDNA選殖之方法，首先，從表現、表現及產生上述多胜肽的任意組織或細胞依常法製備編碼該多胜肽之mRNA。例如可將利用硫氰酸胍(guanidine thiocyanate)法、熱苯酚法或AGPC(Acid Guanidium-Phenol-Chloroform)法等方法製備之全RNA施用寡(dT)纖維素或多U-Sepharose等進行的親和性層析法以進行。
其次，將獲得之mRNA作為模板，例如以使用反轉錄酵素等公知方法(Mil.Cell.Biol.,Vol.2,p.161,1982;Mol.Cell. Biol.,Vol.3,p.280,1983;Gene,Vol.25,p.263,1983)等合成cDNA鏈，並且轉換為cDNA之雙股cDNA，將此cDNA納入質體載體、噬菌體載體或黏粒載體等，將大腸菌轉形(transformation)或於體外包裝後，對於大腸菌進行轉染(transfection)，以製成cDNA分子庫。
使用所製作的cDNA分子庫，並將本實施形態之DNA或其一部分作為探針進行篩選，可取得目標的基因。或者，亦可將本實施形態之DNA或其一部分作為引子使用，並藉由PCR進行擴增。探針及引子的部位及長度可適當決定。
本發明之一實施形態為具有上述DNA之重組載體。作為該重組載體可為原核細胞及/或真核細胞之各種寄主內能保持複製或自體增殖即不特別限並，包含質體載體、噬菌體載體、及病毒載體等。
作為轉殖用載體，例示為例如pUC19、λgt10、λgt11等。再者，分離能於寄主細胞內表現本實施形態之多胜肽之細胞時，較佳為具有能表現本實施形態之DNA之啟動子的載體。
作為重組載體，可藉由將編碼本實施形態之多胜肽之DNA利用常法簡便地連結到該技術領域可取得之重組用載體(質體DNA及細菌噬菌體DNA)而製備。
作為可用之重組用載體，例示為例如大腸菌來源之質體(pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC19等)、酵母來源質體(pSH19、pSH15等)、枯草菌來源質體(pUBl10、pTP5、pC194等)。
又，作為噬菌體，可列舉λ噬菌體等細菌噬菌體，也可例示反轉錄病毒、牛痘(vaccinia)病毒、核多角體病毒、慢病毒等動物或昆蟲的病毒(pVL1393，Invitrogen製)。
在使編碼本實施形態之多胜肽之DNA表現並生產上述多胜肽的目的中，表現載體為有用的。作為表現載體，只要是在原核細胞及/或真核細胞之各種寄主細胞中表現編碼上述多胜肽之DNA，且具有生產此等多胜肽之功能者則不特別限定。
例如，可舉出pMAL C2、pEF-BOS(NucleicAcid Research,Vol.18,1990,p.5322等)或pME18S(實驗醫學別冊「基因工程手冊」，1992年等)等。
當寄主細胞使用細菌，特別是大腸菌時，重組載體較佳為至少包含啟動子-操縱組區域、起始密碼子、編碼上述多胜肽DNA、終止密碼子、終止子區域(terminator region)及可複製單元。
當寄主使用酵母、動物細胞或昆蟲細胞時，重組載體較佳為至少包含啟動子、起始密碼子、編碼上述多胜肽DNA、及終止密碼子。
重組載體亦可包含編碼為訊號胜肽之DNA、增強子序列、編碼上述多胜肽之基因之5'側及3'側之非轉譯區、剪接接合部、多聚腺苷酸化(polyadenylation)部位、選擇標記區域或可複製單元等。
重組載體亦可根據需要，包含能挑選經基因放大及轉形之寄主的標記基因(基因放大基因、藥劑耐性基因等)。
作為標記基因，可例示為例如，二氫葉酸還原酵素(DHFR)基因、胸苷激酶基因、耐新黴素(neomycin)基因、麩胺酸合成酵素基因、腺苷去胺酶基因、鳥胺酸去羧酶基因、潮黴素-B-磷酸轉移酶(hygromycin-B-phosphotransferase)基因、天冬胺酸轉氨甲醯酶(aspartate transcarbamylase)基因等。
在細菌中用於表現上述多胜肽的啟動子-操縱組區域可包含は、啟動子、操縱組及Shine-Dal garno(SD)序列(例如，AAGG等)。
例如寄主為大腸菌屬菌時，作為啟動子，可舉出例如Trp啟動子、lac啟動子、recA啟動子、λPL啟動子、lPP啟動子、tac啟動子等。
作為用於在酵母中表現上述多胜肽之啟動子，可舉出PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子。寄主為桿菌屬菌時，可舉出SLO1啟動子、SP02啟動子、penP啟動子等。
寄主為哺乳動物細胞等真核細胞時，作為啟動子，可舉出SV40來源之啟動子、慢病毒之啟動子、熱休克啟動子等。較佳為SV40、慢病毒。然而，啟動子並未特別限定。又，表現時利用增強子亦為有效方法。
作為適合的起始密碼子，例示為甲硫胺酸密碼子(ATG)。作為終止密碼子，例示為常用之終止密碼子(例如，TAG-TGA、TM)。作為終止子區域，可使用通常採用之天然或合成之終止子。
可複製單元是指有在寄主細胞中能夠將其全部DNA序列複製之能力的DNA，可包含天然質體、經人工修飾之質體(從天然質體製備之DNA片段)及合成質體等。作為適合的質體，可舉出於E.coli之質體pBR322、或其人工的修飾物(將pBR322以適當的限制酶處理而得之DNA片段)，於酵母可舉出酵母2μ質體、或酵母染色體DNA，或者於哺乳動物細胞可舉出質體pRSVneo(ATCC 37198)、質體pSV2dhfr(ATCC 37145)、質體pdBPV-MMTneo(ATCC 37224)、質體pSV2neo(ATCC 37149)等。
針對增強子序列、多聚腺苷酸化部位及剪接接合部位，例如可分別來自SV40等、使用該技術領域中具有通常知識者所通常使用者。
表現載體，可藉由至少將上述啟動子、起始密碼子、編碼上述多胜肽之DNA、終止密碼子及終止子區域以連結成連續且環狀的適當的可複製單元的方式製備。又，此時可依所需，以限制酶消化或使用T4 DNA接合酶進行接合等常法，使用適當的DNA片段(例如，連接子、其他限制酶切斷部位等)。
本發明之一實施形態為具有編碼上述多胜肽之DNA的轉形體。該轉形體例如可藉由將上述的表現載體導入寄主細胞，而獲得經轉形的重組細胞。
作為寄主細胞，只要適於上述表現載體且能被轉形者即不特別限定，可例示在本發明之發明所屬之技術領域中通常使用之天然細胞或人工建立的重組細胞等各種細胞(例如，細菌(大腸菌(Escherichia)屬菌、桿菌(Bacillus)屬菌)、酵母(糖化酵母(Saccharomyces)屬、畢氏菌(Pichia)屬等)、動物細胞或昆蟲細胞等。
寄主細胞較佳為大腸菌或動物細胞，作為大腸菌或動物細胞，例示為例如大腸菌(DH5a、TB1、HB101等)、小鼠來源細胞(COP、L、C127、Sp2/0、NS-1或NIH3T3等)、大鼠來源細胞(PC12、PC12h)、倉鼠來源細胞(BHK及CHO等)、猴來源細胞(COS1、COS3、COS7、CV1及Velo等)及人類來源細胞(Hela、來自2倍體纖維母細胞之細胞、骨髓瘤細胞及HepG2等)等。
表現載體對於寄主細胞之導入(轉形(轉染))可依常法進行([E.coli、Bacillus subtilis等情形]：Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,Vol.69,p.2110,1972; Mil.Gen.Genet., Vol.168,p.111,1979; J.Mol.Biol.,Vol.56,p.209,1971；[Saccharomyces cerevisiae的情形]：Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,Vol.75,p.1927,1978; J.Bacteriol.,Vol.153,p.163,1983)；[動物細胞情形]：Virology,Vol.52,p.456,1973；[昆蟲細胞的情形]：Mol.Cell.Biol.,Vol.3,p.2156-2165,1983)。
本實施形態之多胜肽例如可藉由包含以下步驟之方法進行製造：將轉形體之重組細胞依常法進行培養、以及自經由培養所得的培養物獲得作為目標的多胜肽。
作為自培養物獲得作為目標的多胜肽之方法，可使用通常使用的分離、純化方法。作為分離、精製方法，，可列舉例如鹽析、溶媒沈澱法等利用溶解度之方法、透析、超過濾、凝膠過濾、十二基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳等利用分子量之差異之方法、離子交換層析或羥基磷灰石層析等利用電荷之方法、親和性層析等利用專一性親和性之方法、逆相高效液相層析法等利用疏水性之差異的方法、等電點電泳等利用等電點之差之方法等。
作為目標的多胜肽存在於培養的重組細胞(大腸菌等)的細胞間質或細胞質內時，將培養物施以過濾或離心分離等常法以收集菌體或細胞，懸浮於適當緩衝液，並例如超音波或溶菌酶及冷凍融解等方法破壞細胞等細胞壁及/或細胞膜後，以離心分離或過濾等方法獲得含有作為目標的多胜肽之組分(fraction)。將該組使用Triton TM- X100等界面活性劑予以可溶化而獲得粗溶液。接著，可將該粗溶液以先前例示之常法，將作為目標的多胜肽分離、純化。
本實施形態之多胜肽可使用如上述之習知基因重組技術進行製作，但通常可使用如下述方式進行製備。首先，將包含野生型多胜肽基因之質體作為模板，藉由使用該引子的PCR將部位特異性變異導入至特定位置及特定的胺基酸，以限制霉將模板質體轉形至經消化後的大腸菌等，選殖導入目標變異的質體。
在導入第二個胺基酸的胺基酸變異的情況下，接著，將在特定位置導入變異的質體作為模板，重複與上述同樣的方式的使用引子的部位特異性變異導入，構築編碼二個胺基酸取代體的質體DNA。再進一步導入胺基酸變異的情況下亦可以同樣方式進行。
將製作的DNA與編碼有lac抑制子(lac repressor)(Laci)的質體pREP4等同時轉形至大腸菌BL21株等，將所得的轉形進行分離培養之後，以IPTG進行表現誘導。然後將所得菌株進行破碎，藉由上清液通過使用His標籤的親和管柱以純化目標多胜肽。
或者，亦可以以下的方法進行製備。亦即，基因合成編碼有作為目標的多胜肽的鹼基序列，並將其轉移至表現載體後，藉由蛋白質表現、使用各種的純化標籤的親和管柱純化作為目標的多胜肽。
作為本實施形態之多胜肽的製造方法，並不限於上述方法，亦可使用習知的點突變技術或基因合成技術、藉由限制酶導入改變斷片的方法等各種基因操作技術，表現亦不限於大腸菌，亦可可使用動物細胞或無細胞轉譯系統。又，純化方法亦不限於利用聚組胺酸的親和管柱，亦可使用各種的胜肽標籤或純化管柱。 [實施例]
以下對本發明以實施例進一步說明，但本發明不限於該等實施例。
實施例中使用以下的縮寫。 [表1]
縮寫 正式名稱
FA 蟻酸
β-NADPH 還原型菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸
HEPES 4-(2-羥乙基)-1-哌𠯤乙磺酸
1xTNG 50mM Tris(參羥甲基胺基甲烷)、150mM 氯化鈉、10%(v/v)甘油、pH8.0
GDH 葡萄糖脫氫酶
PVDF 聚偏二氟乙烯
PTFE 四氟乙烯
[表2]
縮寫 結構式
Fmoc-MeGly(cPent)-OH
H-MeGly(cPent)-OH
H-EtPhe-OH
H-EtPhe(4-Me)-OH
H-MePhe-OH
Phe
LCMS的分析條件如下所述。 [表3]
分析 條件 裝置 管柱 (I.D. x 長度 (mm)) 移動相 梯度 (A/B) 流速 (ml/分) 管柱溫度 (℃) 波長
FA 05-1 Acquity UPLC/ SQD Aldrich Ascentis Express C18 (2.1 x 50) A) 0.1% FA, H 2O B) 0.1% FA CH 3CN 95/5～0/100 (1.0分鐘間) =＞ 0/100 (0.4分鐘間) 0.9 35 210-400 nm PDA total
FA 05-2 Acquity UPLC/ SQD Aldrich Ascentis Express C18 (2.1 x 50) A) 0.1% FA, H 2O B) 0.1% FA CH 3CN 95/5～80/20 (0.8分鐘間) =＞ 80/20～0/100 (0.2分鐘間) =＞ 0/100 (0.4分鐘間) 0.9 35 210-400 nm PDA total
HILIC Acquity UPLC/ SQD Intrada amino acid, 3 um (3.0 x 50) A) 50 mM ammonium formate, H 2O B) 0.1% FA CH 3CN/50 mM ammonium formate, H 2O (86:14) 0/100 (3分鐘間) =＞ 0/100～100/0 (0.5分鐘間) =＞ 100/0 (0.9分鐘間) 0.6 35 210-400 nm PDA total
關於購入處未特別記載的試劑可購入自Sigma-Aldrich Japan有限責任公司、富士軟片和光純藥股份有限公司、東京化成工業股份有限公司、NACALAI TESQUE股份有限公司、以及渡邊化學工業股份有限公司中的任一者。
比較例1：野生型酵素的表現･純化 針對野生型酵素序列(序列識別號1)，合成於C端附加有卵白素結合胜肽標籤序列(GTDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQ)、以及His標籤序列(HHHHHH)之基因，選殖至大腸菌表現用載體。將此表現載體導入至BL21(DE3)大腸菌株(Novagen)，並使用Overnight Express Instant TB Medium (Novagen)於18℃培養2天以使目標蛋白質表現。
所得的菌體藉由離心回收，將菌體進行超音波破碎。藉由離心分離分解物，並以使用Ni Sepharose 6 Fast Flow (Cytiva)的親和層析法純化上清液組分。回收含有目標蛋白質的組分，作為最終製備品(#02-001(序列識別號17))。
實施例1：改變酵素的表現･純化 針對各種改變酵素序列(序列識別號2~13以及23~35)，合成於C端附加有卵白素結合胜肽標籤序列(GTDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQ)、連接子序列(GGS)、以及His標籤序列(HHHHHH)的基因，選殖至大腸菌表現用載體。將此表現載體導入至BL21(DE3)大腸菌株(Novagen)，並使用Overnight Express Instant TB Medium (Novagen)於18℃培養2天以使目標蛋白質表現。
所得的菌體藉由離心回收，將菌體進行超音波破碎。藉由離心分離分解物，並以使用Ni Sepharose 6 Fast Flow (Cytiva)的親和層析法純化上清液組分。回收含有目標蛋白質的組分，作為最終製備品(#02-002~217以及#03-001~130以及#04-001~0072)。
實施例2：改變酵素的表現･純化 除了上清液組分不使用Ni Sepharose 6 Fast Flow(Cytiva)，而以使用cOmplete TMHis-Tag Purification Resin (Roche)的親和層析法進行純化的點、以及回收含有目標蛋白質的組分之後，將樣品於50mM Tris-鹽酸(pH 8.0)/150mM 氯化鈉/10% 甘油進行透析而成為最終製備品的點之外，以與實施例1同樣的方法實施(#02-169)。
合成例1：H-MeGly(cPent)-OH的合成 [化58] 將4-(3-苯丙基)哌啶(TCI、cat.NoP0760)(0.419ml、1.977mmol)加入至Fmoc-MeGly(cPent)-OH(CASNo 187475-29-2)(250mg、0.659mmol)的二氯甲烷(KANTO、cat.No11338-25)(1.0ml)懸浮液於室溫攪拌1分鐘，之後加入水(1.0ml)後，於室溫攪拌隔夜。取反應溶液中的水層，藉由逆相矽膠管柱層析法(0.1%蟻酸水溶液/0.1%蟻酸乙腈溶液=100/0→95/5)純化，獲得H-MeGly(cPent)-OH (88.2mg、85%)。 LCMS(ESI) m/z=158.1(M+H) +滯留時間：0.25分(分析條件FA05-1) 1H-NMR(JNM-ECZ400S,400MHz,D 2O)δppm3.28(1H,d,7.6Hz),2.53(3H,s),2.07(1H,m),1.69(1H,m),1.60-1.38(5H,m),1.22(2H,m)
評估例1：H-MeGly(cPent)-OH合成活性作為指標的改變酵素篩選的實施 製備含有基質的溶液(以下亦稱為預混物1)，以將H-MeGly(cPent)-OH合成活性作為指標的方式實施而篩選於實施例1製備的改變酵素(#02-002~217)。具體而言，將2-環戊基-2-側氧基-乙酸(購自Enamine Ltd)、D(+)-葡萄糖(富士軟片和光純藥股份有限公司)的2種化合物溶解於甲胺水溶液(將購自富士軟片和光純藥股份有限公司的水溶液以鹽酸調整至pH8.5)、磷酸緩衝液(400mM、pH7.4)的混合溶媒。使用氫氧化鈉水溶液並將pH調整至8.0之後，以超純水稀釋。對此溶液，添加β-NADPH水溶液(購自ORIENTAL酵母工業股份有限公司的粉末以89mM溶解於超純水)、以及GDH溶液(購自富士軟片和光純藥股份有限公司的粉末溶解於1xTNG)，獲得預混物1。再者，在預混物1的時點的各化合物濃度，2-環戊基-2-側氧基-乙酸為55.6mM，D(+)-葡萄糖為111mM，甲胺為556mM，磷酸緩衝液為111mM，β-NADPH為0.99mM，GDH溶液為0.0022 unit/μL。
對製備的預混物1，添加#02-001~217中的任一者，並實施H-MeGly(cPent)-OH合成反應。具體而言，對預混物1，各自添加#02-001~217中的任一溶液。在陰性對照組的酵素(-)中，添加含咪唑緩衝液(250mM 咪唑、50mM HEPES(pH7.5)、150mM氯化鈉)。將其充分混合之後，於37℃進行培養19小時。再者，反應起始時的各化合物的濃度，2-環戊基-2-側氧基-乙酸為50mM，D(+)-葡萄糖為100mM，甲胺為500mM，磷酸緩衝液為100mM，β-NADPH為0.89mM，GDH溶液為0.002unit/μL，#02-001~217中的任一者為2.5μM。
針對培養後的反應溶液，實施後處理以進行LCMS分析用樣品製備。具體而言，添加反應溶液的9倍量的鹽酸以使氯化氫的添加後最終濃度成為30mM(以下，將此溶液稱為經後處理的反應溶液1)。
以溶解於經後處理的反應溶液1的H-MeGly(cPent)-OH的濃度藉由LCMS進行定量為目的，製作於合成例1合成的H-MeGly(cPent)-OH稀釋數列。具體而言，將H-MeGly(cPent)-OH以成為1000mM的方式溶解於1M氫氧化鈉水溶液之後，以超純水重複進行2倍的稀釋操作。
由於溶解在經後處理的反應溶液1中的各種化合物的離子抑制導致使用該稀釋數列的濃度定量困難，因此將該稀釋數列添加到模擬經後處理的反應溶液1的組成的溶液中。首先，將2-環戊基-2-側氧基-乙酸、D(+)-葡萄糖的2種化合物溶解於甲胺水溶液、磷酸緩衝液的混合溶媒，使用氫氧化鈉水溶液以及鹽酸將pH調整至8.0之後，以超純水稀釋(以下，將本溶液稱為預混物2)。接著，對預混物2，添加β-NADPH水溶液、1xTNG、含咪唑緩衝液、稀釋數列並充分混合。再者，在此時點的各化合物濃度，2-環戊基-2-側氧基-乙酸為25mM，D(+)-葡萄糖為75mM，甲胺為475mM，磷酸緩衝液為100mM，β-NADPH為0.89mM，1xTNG與含咪唑緩衝液各自體積比為10%。最後，添加反應溶液的9倍量的鹽酸以使氯化氫的添加後最終濃度成為30mM，獲得LCMS分析用檢量線樣品(以下，將此溶液稱為經後處理的檢量線樣品1)。
考慮到經後處理的反應溶液1中溶解了超過經後處理的檢量線樣品1的檢量線範圍程度的H-MeGly(cPent)-OH的可能性，而進行稀釋操作。首先，作為對前述的離子抑制的處理，製備模擬溶解在經後處理的反應溶液1的各種化合物的組成的稀釋用溶液。具體而言，將預混物2、1xTNG、含咪唑緩衝液、β-NADPH水溶液、鹽酸進行混合，以超純水稀釋。再者，稀釋後的β-NADPH、氯化氫的濃度分別為0.089mM、30mM，預混物2、1xTNG、含咪唑緩衝液的最終體積比分別為6%、1%、1%。使用此稀釋用溶液，並將經後處理的反應溶液1稀釋32倍，以獲得經後處理的反應溶液2。 經後處理的反應溶液1、經後處理的反應溶液2、經後處理的檢量線樣品1皆通過0.2μm的PVDF膜過濾器(購自Corning,Inc)之後，供於LCMS測定。測定所使用的液量為1μL。使用搭載於MassLynx且檢測萃取離子層析圖的波峰面積之功能(TargetLynx)，評估#02-001~217各自的H-MeGly(cPent)-OH合成活性。結果如下表所示，可發現複數種相較野生型酵素(#02-001)更高的H-MeGly(cPent)-OH合成活性之改變酵素。 LCMS(ESI) m/z=158.10(M+H) +滯留時間：0.23分(分析條件FA05-1) 針對合成活性，是將使用#02-001~217時的目標生成物的產率除以使用野生型酵素(#02-001)時的目標生成物的產率而求得。計算出的合成活性的比示於表4及表5。再者，使用野生型酵素時的產率為21%。 [表4]
編號 名稱 活性比 (倍） 編號 名稱 活性比 (倍） 編號 名稱 活性比 (倍）
酵素(-) 酵素(-) 0.00 #02-036 R48W 0.00 #02-074 M141A 2.47
#02-001 WT 1.00 #02-037 R48Y 0.03 #02-075 M141D 0.13
#02-002 H44A 0.00 #02-038 F117A 0.08 #02-076 M141E 0.13
#02-003 H44D 0.00 #02-039 F117D 0.00 #02-077 M141F 0.10
#02-004 H44E 0.01 #02-040 F117E 0.00 #02-078 M141G 0.64
#02-005 H44F 0.00 #02-041 F117G 0.03 #02-079 M141H 0.26
#02-006 H44G 0.00 #02-042 F117H 0.07 #02-080 M141I 0.98
#02-007 H44I 0.00 #02-043 F117I 0.28 #02-081 M141K 2.01
#02-008 H44K 0.00 #02-044 F117K 0.04 #02-082 M141L 1.55
#02-009 H44L 0.00 #02-045 F117L 1.33 #02-083 M141N 0.22
#02-010 H44M 0.00 #02-046 F117M 0.20 #02-084 M141P 0.13
#02-011 H44N 0.01 #02-047 F117N 0.24 #02-085 M141Q 0.59
#02-013 H44Q 0.00 #02-048 F117P 0.00 #02-086 M141R 1.61
#02-014 H44R 0.00 #02-049 F117Q 0.09 #02-087 M141S 1.84
#02-015 H44S 0.04 #02-051 F117S 0.06 #02-088 M141T 0.86
#02-016 H44T 0.00 #02-052 F117T 0.10 #02-089 M141V 1.59
#02-017 H44V 0.00 #02-053 F117V 0.10 #02-090 M141W 1.88
#02-018 H44W 0.00 #02-054 F117W 0.14 #02-091 M141Y 1.20
#02-019 H44Y 0.00 #02-055 F117Y 0.51 #02-092 T156A 0.03
#02-020 R48A 0.02 #02-057 S140D 0.00 #02-093 T156D 0.00
#02-021 R48D 0.00 #02-058 S140E 0.00 #02-094 T156E 0.00
#02-022 R48E 0.00 #02-059 S140F 0.00 #02-095 T156F 0.00
#02-023 R48F 0.00 #02-060 S140G 0.04 #02-096 T156G 0.00
#02-024 R48G 0.03 #02-061 S140H 0.00 #02-097 T156H 0.00
#02-025 R48H 0.04 #02-062 S140I 0.00 #02-098 T156I 0.00
#02-026 R48I 0.00 #02-063 S140K 0.00 #02-099 T156K 0.00
#02-027 R48K 0.01 #02-064 S140L 0.00 #02-100 T156L 0.00
#02-028 R48L 0.01 #02-065 S140M 0.00 #02-101 T156M 0.00
#02-029 R48M 0.02 #02-066 S140N 0.24 #02-102 T156N 0.03
#02-030 R48N 0.03 #02-067 S140P 0.00 #02-103 T156P 0.05
#02-031 R48P 0.00 #02-068 S140Q 0.00 #02-104 T156Q 0.00
#02-032 R48Q 0.08 #02-069 S140R 0.00 #02-105 T156R 0.00
#02-033 R48S 0.02 #02-070 S140T 0.03 #02-106 T156S 0.27
#02-034 R48T 0.03 #02-071 S140V 0.00 #02-107 T156V 0.00
#02-035 R48V 0.01 #02-072 S140W 0.00 #02-108 T156W 0.00
            #02-073 S140Y 0.00 #02-109 T156Y 0.00
[表5]
編號 名稱 活性比 (倍） 編號 名稱 活性比 (倍） 編號 名稱 活性比 (倍）
#02-110 H182A 0.26 #02-146 Q186A 0.26 #02-182 K260A 0.95
#02-111 H182D 0.04 #02-147 Q186D 0.14 #02-183 K260D 0.23
#02-112 H182E 0.55 #02-148 Q186E 0.63 #02-184 K260E 1.20
#02-113 H182F 0.26 #02-149 Q186F 0.08 #02-185 K260F 0.97
#02-114 H182G 0.07 #02-150 Q186G 0.06 #02-186 K260G 0.85
#02-115 H182I 0.13 #02-151 Q186H 0.08 #02-187 K260H 0.91
#02-116 H182K 0.48 #02-152 Q186I 0.15 #02-188 K260I 0.20
#02-117 H182L 0.93 #02-153 Q186K 0.22 #02-189 K260L 0.47
#02-118 H182M 0.32 #02-154 Q186L 0.20 #02-190 K260M 0.50
#02-119 H182N 0.09 #02-155 Q186M 0.23 #02-191 K260N 0.77
#02-120 H182P 0.00 #02-156 Q186N 0.06 #02-192 K260P 0.11
#02-121 H182Q 1.76 #02-157 Q186P 0.00 #02-193 K260Q 0.93
#02-122 H182R 0.78 #02-158 Q186R 0.14 #02-194 K260R 0.76
#02-123 H182S 0.09 #02-159 Q186S 0.12 #02-195 K260S 1.02
#02-124 H182T 0.05 #02-160 Q186T 0.19 #02-196 K260T 0.93
#02-125 H182V 0.19 #02-161 Q186V 0.28 #02-197 K260V 0.63
#02-126 H182W 0.20 #02-162 Q186W 0.07 #02-198 K260W 0.43
#02-127 H182Y 0.25 #02-163 Q186Y 0.07 #02-199 K260Y 0.66
#02-128 G183A 0.01 #02-164 W253A 1.18 #02-200 P262A 0.31
#02-129 G183D 0.00 #02-165 W253D 0.25 #02-201 P262D 0.01
#02-130 G183E 0.00 #02-166 W253E 0.19 #02-202 P262E 0.03
#02-131 G183F 0.00 #02-167 W253F 1.95 #02-203 P262F 0.00
#02-132 G183H 0.00 #02-168 W253G 0.69 #02-204 P262G 0.05
#02-133 G183I 0.00 #02-169 W253H 3.07 #02-205 P262H 0.00
#02-134 G183K 0.00 #02-170 W253I 2.00 #02-206 P262I 0.07
#02-135 G183L 0.00 #02-171 W253K 1.14 #02-207 P262K 0.09
#02-136 G183M 0.00 #02-172 W253L 2.17 #02-208 P262L 0.05
#02-137 G183N 0.00 #02-173 W253M 1.62 #02-209 P262M 0.03
#02-138 G183P 0.00 #02-174 W253N 1.00 #02-210 P262N 0.00
#02-139 G183Q 0.00 #02-175 W253P 1.93 #02-211 P262Q 0.04
#02-140 G183R 0.00 #02-176 W253Q 1.77 #02-212 P262R 0.04
#02-141 G183S 0.00 #02-177 W253R 1.44 #02-213 P262S 0.02
#02-142 G183T 0.00 #02-178 W253S 1.30 #02-214 P262T 0.04
#02-143 G183V 0.00 #02-179 W253T 1.67 #02-215 P262V 0.05
#02-144 G183W 0.00 #02-180 W253V 1.96 #02-216 P262W 0.01
#02-145 G183Y 0.00 #02-181 W253Y 1.11 #02-217 P262Y 0.00
評估例2：將H-EtPhe-OH合成活性作為指標的改變酵素篩選的實施(單一變異體篩選) 製備含有基質的溶液(以下亦稱為預混物3)，以將H-MeGly(cPent)-OH合成活性作為指標的方式實施而篩選於實施例1製備的改變酵素(#02-002~217)。具體而言，將苯丙酮酸鈉鹽(購自Sigma-Aldrich Japan有限責任公司)、D(+)-葡萄糖的2種化合物溶解於乙胺水溶液(將購自東京化成工業股份有限公司的水溶液以鹽酸調整成pH7.7)、磷酸緩衝液的混合溶媒。使用氫氧化鈉水溶液及鹽酸將pH調整成8.0之後，以超純水稀釋。對此溶液，添加β-NADPH水溶液、以及GDH溶液，獲得預混物3。再者，在預混物3的時點的各化合物濃度，苯丙酮酸鈉鹽為55.6mM，D(+)-葡萄糖為111mM，乙胺為556mM，磷酸緩衝液為111mM，β-NADPH為0.99mM，GDH溶液為0.0022 unit/μL。
對製備的預混物3，添加#02-001~217中的任一者，並實施H-EtPhe-OH合成反應。具體而言，對預混物3，各自添加#02-001~217中的任一溶液。在陰性對照組的酵素(-)中，添加含咪唑緩衝液。將其充分混合之後，於37℃進行培養19小時。再者，反應起始時的各化合物的濃度，苯丙酮酸鈉鹽為50mM，D(+)-葡萄糖為100mM，乙胺為500mM，磷酸緩衝液為100mM，β-NADPH為0.89mM，GDH溶液為0.002unit/μL，#02-001~217中的任一者為2.5μM。
針對培養後的反應溶液，實施後處理以進行LCMS分析用樣品製備。具體而言，添加反應溶液的9倍量的鹽酸以使氯化氫的添加後最終濃度成為30mM(以下，將此溶液稱為經後處理的反應溶液3)。 以溶解於經後處理的反應溶液3的H-EtPhe-OH的濃度藉由LCMS進行定量為目的，製作推定莫耳吸光係數係数與H-EtPhe-OH同等的H-MePhe-OH的稀釋數列。具體而言，將H-MePhe-OH(購自渡邊化學工業股份有限公司)以成為500mM的方式溶解於1M氫氧化鉀水溶液之後，以超純水重複進行2倍的稀釋操作。將此稀釋數列添加至含有磷酸緩衝液、1xTNG、含咪唑緩衝液的混合溶媒以作成檢量線樣品。再者，此時點的磷酸緩衝液的濃度為100mM(pH7.4)，1xTNG、含咪唑緩衝液、H-MePhe-OH稀釋數列的體積比各自為10%、10%、20%，剩餘的體積比為超純水。最後，添加反應溶液9倍量的鹽酸，以使氯化氫的添加後最終濃度成為30mM，獲得LCMS分析用檢量線樣品(以下，將此溶液稱為經後處理的檢量線樣品2)。
經後處理的反應溶液3、經後處理的檢量線樣品2皆通過0.2μm的PVDF膜過濾器(購自Corning,Inc)之後，供於LCMS測定。測定所使用的液量為1μL。使用TargetLynx，檢測來自UV圖(254nm)上的H-EtPhe-OH之波峰面積，以評估#02-001~217各自的H-EtPhe-OH合成活性。結果如下表所示，可發現複數種相較野生型酵素(#02-001)更高的H-EtPhe-OH合成活性之改變酵素。 LCMS(ESI) m/z=194.18(M+H) +滯留時間：0.37分(分析條件FA05-2，UV圖(254nm)中的滯留時間)
針對合成活性，是將使用#02-001~217時的目標生成物的產率除以使用野生型酵素(#02-001)時的目標生成物的產率而求得。計算出的合成活性的比示於表6及表7。再者，野生型酵素的產率，對應於#02-193~200者為22%，其他為28%。 [表6]
編號 名稱 活性比 （倍） 編號 名稱 活性比 （倍） 編號 名稱 活性比 （倍）
酵素(-) 酵素(-) 0.00 #02-039 F117D 0.00 #02-080 M141I 1.32
#02-001 WT 1.00 #02-040 F117E 0.00 #02-081 M141K 1.44
#02-002 H44A 0.00 #02-041 F117G 0.53 #02-082 M141L 1.43
#02-003 H44D 0.00 #02-042 F117H 0.34 #02-083 M141N 0.22
#02-004 H44E 0.00 #02-045 F117L 0.79 #02-084 M141P 0.12
#02-005 H44F 0.00 #02-046 F117M 0.96 #02-085 M141Q 0.26
#02-006 H44G 0.00 #02-047 F117N 0.64 #02-086 M141R 1.16
#02-007 H44I 0.24 #02-048 F117P 0.00 #02-087 M141S 1.08
#02-008 H44K 0.00 #02-049 F117Q 0.30 #02-088 M141T 1.25
#02-009 H44L 0.14 #02-052 F117T 0.15 #02-089 M141V 1.76
#02-010 H44M 0.47 #02-053 F117V 0.27 #02-090 M141W 1.47
#02-011 H44N 0.15 #02-054 F117W 0.08 #02-091 M141Y 1.90
#02-013 H44Q 0.00 #02-055 F117Y 0.36 #02-092 T156A 0.00
#02-014 H44R 0.00 #02-057 S140D 0.00 #02-093 T156D 0.00
#02-015 H44S 0.18 #02-058 S140E 0.00 #02-094 T156E 0.00
#02-016 H44T 0.21 #02-059 S140F 0.00 #02-095 T156F 0.00
#02-017 H44V 0.22 #02-060 S140G 0.00 #02-096 T156G 0.00
#02-018 H44W 0.00 #02-061 S140H 0.00 #02-097 T156H 0.00
#02-019 H44Y 0.00 #02-062 S140I 0.00 #02-098 T156I 0.00
#02-020 R48A 0.10 #02-063 S140K 0.00 #02-099 T156K 0.00
#02-021 R48D 0.00 #02-064 S140L 0.00 #02-100 T156L 0.00
#02-022 R48E 0.00 #02-065 S140M 0.00 #02-101 T156M 0.00
#02-023 R48F 0.00 #02-066 S140N 0.14 #02-102 T156N 0.00
#02-024 R48G 0.14 #02-067 S140P 0.00 #02-103 T156P 0.00
#02-025 R48H 0.06 #02-068 S140Q 0.00 #02-104 T156Q 0.00
#02-026 R48I 0.05 #02-069 S140R 0.00 #02-105 T156R 0.00
#02-027 R48K 0.00 #02-070 S140T 0.00 #02-106 T156S 0.74
#02-028 R48L 0.18 #02-071 S140V 0.00 #02-107 T156V 0.00
#02-029 R48M 0.16 #02-072 S140W 0.00 #02-108 T156W 0.00
#02-030 R48N 0.13 #02-073 S140Y 0.00 #02-109 T156Y 0.00
#02-032 R48Q 0.19 #02-074 M141A 1.57 #02-110 H182A 1.45
#02-033 R48S 0.11 #02-075 M141D 0.00 #02-111 H182D 0.13
#02-034 R48T 0.25 #02-076 M141E 0.05 #02-112 H182E 0.30
#02-035 R48V 0.22 #02-077 M141F 0.83 #02-113 H182F 1.53
#02-036 R48W 0.00 #02-078 M141G 0.07 #02-114 H182G 1.20
#02-038 F117A 0.66 #02-079 M141H 0.63 #02-115 H182I 0.45
[表7]
編號 名稱 活性比 （倍） 編號 名稱 活性比 （倍） 編號 名稱 活性比 （倍）
#02-116 H182K 0.83 #02-152 Q186I 0.56 #02-188 K260I 0.99
#02-117 H182L 2.03 #02-153 Q186K 0.46 #02-189 K260L 1.22
#02-118 H182M 1.85 #02-154 Q186L 0.89 #02-190 K260M 1.40
#02-119 H182N 0.32 #02-155 Q186M 1.35 #02-191 K260N 1.62
#02-120 H182P 0.00 #02-156 Q186N 0.28 #02-192 K260P 0.18
#02-121 H182Q 0.56 #02-157 Q186P 0.00 #02-193 K260Q 1.88
#02-122 H182R 0.98 #02-158 Q186R 0.20 #02-194 K260R 1.25
#02-123 H182S 0.15 #02-159 Q186S 0.67 #02-195 K260S 1.21
#02-124 H182T 0.09 #02-160 Q186T 0.66 #02-196 K260T 1.44
#02-125 H182V 0.70 #02-161 Q186V 0.58 #02-197 K260V 0.56
#02-126 H182W 0.80 #02-162 Q186W 0.24 #02-198 K260W 1.17
#02-127 H182Y 1.39 #02-163 Q186Y 0.23 #02-199 K260Y 1.34
#02-128 G183A 0.17 #02-164 W253A 1.07 #02-200 P262A 0.68
#02-129 G183D 0.08 #02-165 W253D 0.49 #02-201 P262D 0.00
#02-130 G183E 0.00 #02-166 W253E 0.59 #02-202 P262E 0.05
#02-131 G183F 0.00 #02-167 W253F 1.25 #02-203 P262F 0.00
#02-132 G183H 0.00 #02-168 W253G 0.69 #02-204 P262G 0.00
#02-133 G183I 0.00 #02-169 W253H 1.70 #02-205 P262H 0.08
#02-134 G183K 0.00 #02-170 W253I 1.32 #02-206 P262I 0.00
#02-135 G183L 0.06 #02-171 W253K 0.94 #02-207 P262K 0.07
#02-136 G183M 0.05 #02-172 W253L 1.35 #02-208 P262L 0.00
#02-137 G183N 0.00 #02-173 W253M 1.30 #02-209 P262M 0.00
#02-138 G183P 0.00 #02-174 W253N 1.16 #02-210 P262N 0.00
#02-139 G183Q 0.00 #02-175 W253P 1.25 #02-211 P262Q 0.00
#02-140 G183R 0.00 #02-176 W253Q 1.40 #02-212 P262R 0.00
#02-141 G183S 0.15 #02-177 W253R 0.89 #02-213 P262S 0.00
#02-142 G183T 0.08 #02-178 W253S 0.91 #02-214 P262T 0.00
#02-143 G183V 0.00 #02-179 W253T 1.15 #02-215 P262V 0.00
#02-144 G183W 0.00 #02-180 W253V 1.13 #02-216 P262W 0.00
#02-145 G183Y 0.00 #02-181 W253Y 1.01 #02-217 P262Y 0.00
#02-146 Q186A 0.76 #02-182 K260A 1.03
#02-147 Q186D 0.76 #02-183 K260D 0.49
#02-148 Q186E 1.15 #02-184 K260E 1.90
#02-149 Q186F 0.29 #02-185 K260F 1.30
#02-150 Q186G 0.30 #02-186 K260G 1.25
#02-151 Q186H 0.23 #02-187 K260H 1.17
合成例2：2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸的鈉鹽化 實施作為H-EtPhe(4-Me)-OH的原料酮酸之2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸的鈉鹽化。具體而言，將2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸(購自ChemSpace社)懸浮於乙腈-超純水(1:1)的混合溶媒之後，相對於上述酮酸添加1M氫氧化鈉水溶液1當量，進行充分攪拌。確認完全溶解之後，通過0.5μm的PTFE膜過濾器(購自東曹股份有限公司)，進行冷凍乾燥。
評估例3：將H-EtPhe(4-Me)-OH合成活性作為指標的改變酵素篩選的實施 製備含有基質的溶液(以下亦稱為預混物4)，以將H-EtPhe(4-Me)-OH合成活性作為指標的方式實施而篩選於實施例1製備的改變酵素(#02-002~217)。具體而言，將合成例2製備的酮酸的鈉鹽、D(+)-葡萄糖的2種化合物溶解於乙胺水溶液、磷酸緩衝液的混合溶媒。使用氫氧化鈉水溶液將pH調整成8.0之後，以超純水稀釋。對此溶液，添加β-NADPH水溶液、以及GDH溶液，獲得預混物4。再者，在預混物4的時點的各化合物濃度，合成例2製備的酮酸的鈉鹽為55.6mM，D(+)-葡萄糖為111mM，乙胺為556mM，磷酸緩衝液為111mM，β-NADPH為0.99mM，GDH溶液為0.0022 unit/μL。
對製備的預混物4，添加#02-001~217中的任一者，並實施H-EtPhe(4-Me)-OH合成反應。具體而言，對預混物4，各自添加#02-001~217中的任一溶液。在陰性對照組的酵素(-)中，添加含咪唑緩衝液。將其充分混合之後，於37℃進行培養19小時。再者，反應起始時的各化合物的濃度，合成例2製備的酮酸的鈉鹽為50mM，D(+)-葡萄糖為100mM，乙胺為500mM，磷酸緩衝液為100mM，β-NADPH為0.89mM，GDH溶液為0.002 unit/μL，#02-001~217中的任一者為2.5μM。
針對培養後的反應溶液，實施後處理以進行LCMS分析用樣品製備。具體而言，添加含反應溶液9倍量的鹽酸的DMSO溶液(鹽酸與DMSO的體積比為3:87)以使氯化氫的添加後最終濃度成為30mM(以下，將此溶液稱為經後處理的反應溶液4)。
以溶解於經後處理的反應溶液4的H-EtPhe(4-Me)-OH的濃度藉由LCMS進行定量為目的，以與H-EtPhe-OH時同樣的方式製作H-MePhe-OH的稀釋數列(經後處理的檢量線樣品2)。再者，最後稀釋過程中，使用鹽酸或含鹽酸的DMSO溶液(含鹽酸的DMSO溶液的組成與經後處理的反應溶液4使用的相同)。
經後處理的反應溶液4、經後處理的檢量線樣品2皆通過0.2μm的PVDF膜過濾器(購自Corning,Inc)之後，供於LCMS測定。測定所使用的液量為1μL。使用TargetLynx，檢測來自UV圖(254nm)上的H-EtPhe(4-Me)-OH之波峰面積，以評估#02-001~217各自的H-EtPhe(4-Me)-OH合成活性。結果如下表所示，可發現複數種相較野生型酵素(#02-001)更高的H-EtPhe(4-Me)-OH合成活性之改變酵素。 LCMS(ESI)m/z=208.21(M+H) +滯留時間：0.59分(分析條件FA05-2，UV圖(254nm)中的滯留時間)
針對合成活性，是將使用#02-001~217時的目標生成物的產率除以使用野生型酵素(#02-001)時的目標生成物的產率而求得。計算出的合成活性的比示於表8及表9。再者，野生型酵素的產率，針對#02-002~073、#02-092~109、#02-128~145、#02-200~217為10%，其他為6%。 [表8]
編號 名稱 活性比（倍） 編號 名稱 活性比（倍） 編號 名稱 活性比（倍）
酵素(-) 酵素(-) 0.00 #02-041 F117G 0.74 #02-086 M141R 0.73
#02-001 WT 1.00 #02-042 F117H 0.47 #02-087 M141S 0.86
#02-003 H44D 0.00 #02-045 F117L 0.34 #02-088 M141T 1.91
#02-004 H44E 0.00 #02-046 F117M 0.71 #02-089 M141V 7.93
#02-005 H44F 0.00 #02-047 F117N 0.79 #02-090 M141W 3.89
#02-006 H44G 0.00 #02-049 F117Q 0.00 #02-091 M141Y 5.96
#02-007 H44I 0.00 #02-054 F117W 0.00 #02-092 T156A 0.00
#02-008 H44K 0.00 #02-055 F117Y 0.55 #02-093 T156D 0.00
#02-009 H44L 0.69 #02-057 S140D 0.00 #02-094 T156E 0.00
#02-010 H44M 2.08 #02-058 S140E 0.00 #02-095 T156F 0.00
#02-011 H44N 0.39 #02-059 S140F 0.00 #02-096 T156G 0.00
#02-013 H44Q 0.00 #02-060 S140G 0.00 #02-097 T156H 0.00
#02-014 H44R 0.00 #02-061 S140H 0.00 #02-098 T156I 0.00
#02-015 H44S 0.45 #02-062 S140I 0.00 #02-099 T156K 0.00
#02-016 H44T 0.76 #02-065 S140M 0.00 #02-100 T156L 0.00
#02-018 H44W 0.23 #02-066 S140N 0.27 #02-101 T156M 0.00
#02-019 H44Y 0.00 #02-067 S140P 0.00 #02-102 T156N 0.00
#02-020 R48A 0.00 #02-068 S140Q 0.00 #02-103 T156P 0.25
#02-021 R48D 0.00 #02-069 S140R 0.00 #02-104 T156Q 0.00
#02-022 R48E 0.00 #02-071 S140V 0.00 #02-105 T156R 0.00
#02-024 R48G 0.00 #02-072 S140W 0.00 #02-106 T156S 1.21
#02-025 R48H 0.00 #02-073 S140Y 0.00 #02-107 T156V 0.00
#02-026 R48I 0.00 #02-074 M141A 1.55 #02-108 T156W 0.00
#02-027 R48K 0.00 #02-075 M141D 0.00 #02-109 T156Y 0.00
#02-028 R48L 0.40 #02-076 M141E 0.00 #02-110 H182A 1.17
#02-029 R48M 0.00 #02-077 M141F 3.01 #02-111 H182D 0.00
#02-030 R48N 0.21 #02-078 M141G 0.00 #02-112 H182E 0.00
#02-032 R48Q 0.34 #02-079 M141H 1.98 #02-113 H182F 2.31
#02-033 R48S 0.29 #02-080 M141I 2.18 #02-114 H182G 0.00
#02-034 R48T 0.35 #02-081 M141K 2.05 #02-115 H182I 0.59
#02-035 R48V 0.25 #02-082 M141L 0.97 #02-116 H182K 0.00
#02-036 R48W 0.00 #02-083 M141N 0.00 #02-117 H182L 4.48
#02-038 F117A 0.64 #02-084 M141P 0.00 #02-118 H182M 2.62
#02-039 F117D 0.00 #02-085 M141Q 0.00 #02-119 H182N 0.00
#02-040 F117E 0.00 #02-120 H182P 0.00
                        #02-121 H182Q 0.00
[表9]
編號 名稱 活性比 （倍） 編號 名稱 活性比 （倍） 編號 名稱 活性比 （倍）
#02-122 H182R 0.16 #02-159 Q186S 0.00 #02-195 K260S 1.16
#02-123 H182S 0.00 #02-160 Q186T 0.37 #02-196 K260T 1.97
#02-124 H182T 0.00 #02-161 Q186V 0.43 #02-197 K260V 0.80
#02-125 H182V 0.35 #02-162 Q186W 0.00 #02-198 K260W 0.85
#02-126 H182W 0.37 #02-163 Q186Y 0.00 #02-199 K260Y 1.35
#02-127 H182Y 1.89 #02-164 W253A 0.08 #02-200 P262A 0.37
#02-128 G183A 0.32 #02-165 W253D 0.00 #02-201 P262D 0.00
#02-129 G183D 0.00 #02-166 W253E 0.00 #02-202 P262E 0.00
#02-130 G183E 0.00 #02-167 W253F 0.31 #02-203 P262F 0.00
#02-132 G183H 0.00 #02-168 W253G 0.00 #02-204 P262G 0.00
#02-133 G183I 0.00 #02-169 W253H 1.33 #02-205 P262H 0.00
#02-134 G183K 0.00 #02-170 W253I 0.86 #02-206 P262I 0.00
#02-135 G183L 0.00 #02-171 W253K 0.00 #02-207 P262K 0.00
#02-136 G183M 0.23 #02-172 W253L 0.63 #02-208 P262L 0.00
#02-137 G183N 0.00 #02-173 W253M 0.43 #02-209 P262M 0.00
#02-138 G183P 0.00 #02-174 W253N 0.05 #02-210 P262N 0.00
#02-139 G183Q 0.00 #02-175 W253P 0.58 #02-211 P262Q 0.00
#02-140 G183R 0.00 #02-176 W253Q 0.69 #02-212 P262R 0.00
#02-141 G183S 0.40 #02-177 W253R 0.27 #02-213 P262S 0.00
#02-142 G183T 0.29 #02-178 W253S 0.24 #02-214 P262T 0.00
#02-143 G183V 0.22 #02-179 W253T 0.41 #02-215 P262V 0.00
#02-144 G183W 0.00 #02-180 W253V 0.34 #02-216 P262W 0.00
#02-145 G183Y 0.00 #02-181 W253Y 0.08 #02-217 P262Y 0.00
#02-146 Q186A 0.21 #02-182 K260A 0.54
#02-147 Q186D 0.00 #02-183 K260D 0.00
#02-148 Q186E 1.22 #02-184 K260E 3.52
#02-149 Q186F 0.00 #02-185 K260F 1.15
#02-150 Q186G 0.00 #02-186 K260G 0.15
#02-151 Q186H 0.00 #02-187 K260H 0.93
#02-152 Q186I 0.22 #02-188 K260I 0.53
#02-153 Q186K 0.06 #02-189 K260L 1.98
#02-154 Q186L 0.39 #02-190 K260M 2.41
#02-155 Q186M 0.56 #02-191 K260N 0.54
#02-156 Q186N 0.00 #02-192 K260P 0.00
#02-157 Q186P 0.00 #02-193 K260Q 3.20
#02-158 Q186R 0.00 #02-194 K260R 0.99
評估例4：將H-EtPhe-OH合成活性作為指標的改變酵素篩選的實施(雙變異體篩選) 以將H-EtPhe-OH合成活性作為指標的方式實施而篩選於實施例1製備的改變酵素(#03-001~130)。流程除了使用#03-001~130以替代#02-002~217作為改變酵素的點之外，以與評估例2同樣的方式實施。再者，儘管已經對#02-021、117於評估例2進行活性評估，但其皆作為不同於WT的實驗系統的對照組使用。 結果如下表所示。可發現複數種相較野生型酵素(#02-001)更高的H-EtPhe-OH合成活性之改變酵素。 LCMS(ESI) m/z=194.11(M+H) +滯留時間：0.38分(分析條件FA05-2，UV圖(254nm)中的滯留時間) 針對合成活性，是將分別使用#02-001及#03-001~130時的目標生成物的產率除以使用野生型酵素(#02-001)時的目標生成物的產率而求得。計算出的合成活性的比示於表10及表11。再者，野生型酵素的產率為32%。 [表10]
編號 名稱 活性比 （倍） 編號 名稱 活性比 （倍）
酵素(－) 酵素(－) 0.00    #03-031 W253H_K260E 2.62   
#02-001 WT 1.00    #03-032 W253H_K260Q 2.29   
#02-021 R48D 0.00    #03-033 W253M_K260E 2.29   
#02-117 H182L 1.80    #03-034 W253M_K260Q 1.85   
#03-001 M141A_H182F 0.45    #03-035 W253A_K260E 1.65   
#03-002 M141A_H182L 1.08    #03-036 W253M_K260G 0.72   
#03-003 M141A_H182M 0.75    #03-037 M141V_K260G 1.54   
#03-004 M141A_W253H 0.84    #03-038 W253A_K260G 0.44   
#03-005 M141A_W253M 0.68    #03-039 W253A_K260W 0.61   
#03-006 M141A_K260E 2.68    #03-040 M141A_W253A 0.55   
#03-007 M141A_K260Q 2.65    #03-041 W253A_K260L 1.11   
#03-008 M141K_W253M 1.05    #03-042 W253M_K260L 1.20   
#03-009 M141V_H182F 0.80    #03-043 W253A_K260T 0.45   
#03-010 M141V_H182L 2.21    #03-044 W253A_K260Q 1.32   
#03-011 M141V_H182M 1.30    #03-045 M141A_H182W 0.25   
#03-012 M141V_W253H 1.60    #03-046 M141K_W253A 1.02   
#03-013 M141V_W253M 1.80    #03-048 W253A_K260A 0.71   
#03-014 M141V_K260E 2.65    #03-049 M141V_K260F 2.21   
#03-015 M141V_K260Q 2.49    #03-050 M141A_K260G 1.48   
#03-016 M141Y_H182F 0.92    #03-051 W253A_K260I 0.79   
#03-017 M141Y_H182L 1.89    #03-052 W253A_K260F 0.83   
#03-018 M141Y_H182M 2.28    #03-053 M141A_W253S 0.58   
#03-019 M141Y_W253H 1.40    #03-054 M141R_K260G 1.11   
#03-020 M141Y_K260E ＞ 3.00    #03-055 M141V_W253A 1.64   
#03-022 H182F_W253H 0.96    #03-056 W253K_K260G 0.32   
#03-023 H182F_K260E 2.10    #03-057 W253A_K260S 0.66   
#03-024 H182F_K260Q 2.23    #03-058 W253M_K260A 0.99   
#03-025 H182L_W253H 2.12    #03-059 W253Y_K260L 0.83   
#03-026 H182L_K260E 2.51    #03-060 H182W_K260G 0.58   
#03-027 H182L_K260Q 2.76    #03-061 M141K_K260L 1.56   
#03-028 H182M_W253H 1.03    #03-062 M141Q_W253A 0.55   
#03-029 H182M_K260E 2.65    #03-063 M141V_K260S 1.80   
#03-030 H182M_K260Q 2.65               
[表11]
編號 名稱 活性比 （倍） 編號 名稱 活性比 （倍）
#03-064 M141K_K260G 1.48    #03-098 H182M_W253A 1.02   
#03-065 M141A_K260A 1.38    #03-099 W253R_K260L 0.84   
#03-066 W253K_K260L 0.82    #03-100 M141K_K260A 1.07   
#03-067 M141Q_K260G 0.30    #03-101 H182S_W253A 0.11   
#03-068 M141A_K260S 1.46    #03-102 M141R_W253M 0.61   
#03-069 M141A_W253T 0.48    #03-103 M141R_W253A 0.60   
#03-070 H182W_K260L 0.46    #03-104 M141T_K260Q 2.07   
#03-071 M141Y_K260G 2.13    #03-105 M141S_K260L 0.94   
#03-072 W253R_K260F 0.63    #03-106 M141W_K260A 1.49   
#03-073 H182G_W253A 0.79    #03-107 M141A_K260L 1.51   
#03-074 W253A_K260H 0.78    #03-108 H182S_K260L 0.15   
#03-075 W253Y_K260G 0.41    #03-109 W253N_K260L 1.07   
#03-076 M141A_K260V 0.75    #03-110 W253Y_K260I 0.51   
#03-077 W253R_K260A 0.48    #03-111 M141Q_K260A 0.25   
#03-078 W253A_K260V 0.48    #03-112 W253L_K260G 0.76   
#03-079 F117N_M141A 0.68    #03-113 M141T_H182S 0.10   
#03-080 W253S_K260G 0.40    #03-114 W253Y_K260V 0.41   
#03-081 W253A_K260R 0.73    #03-115 M141V_K260A 1.74   
#03-082 W253T_K260L 1.17    #03-116 M141A_K260N 1.43   
#03-083 M141A_K260I 1.22    #03-117 W253M_K260H 0.97   
#03-084 W253M_K260S 0.79    #03-118 W253R_K260T 0.33   
#03-085 H182W_W253A 0.54    #03-119 M141A_K260F 1.72   
#03-086 M141V_W253Y 1.49    #03-120 W253R_K260V 0.48   
#03-087 M141A_W253Y 0.38    #03-121 H182Y_W253A 1.04   
#03-088 W253T_K260G 0.47    #03-122 M141K_W253S 1.09   
#03-089 W253A_K260M 0.94    #03-123 W253Q_K260G 0.40   
#03-090 W253Y_K260F 0.68    #03-124 M141K_H182S 0.11   
#03-091 M141V_K260L 2.14    #03-125 H182G_K260G 0.49   
#03-092 W253A_K260N 0.56    #03-126 W253M_K260V 0.53   
#03-093 W253R_K260G 0.30    #03-127 M141A_H182S 0.12   
#03-094 H182S_K260G 0.10    #03-128 W253N_K260G 0.41   
#03-095 M141K_K260S 1.34    #03-129 M141A_K260H 1.66   
#03-096 M141R_K260A 1.03    #03-130 M141I_W253A 1.19   
#03-097 M141T_K260G 1.21               
評估例5：將H-EtPhe-OH合成活性作為指標的改變酵素篩選的實施(三變異體篩選) 以將H-EtPhe-OH合成活性作為指標的方式實施而篩選於實施例1製備的改變酵素(#04-001~072)。流程除了使用#04-001~072以替代#02-002~217作為改變酵素的點之外，以與評估例2同樣的方式實施。再者，儘管已經對#02-021、117、#03-006、020於評估例2、3進行活性評估，但其皆作為不同於WT的實驗系統的對照組使用。 結果如下表所示。可發現複數種相較野生型酵素(#02-001)更高的H-EtPhe-OH合成活性之改變酵素。 LCMS(ESI) m/z=194.07(M+H) +滯留時間：0.37分(分析條件FA05-2，UV圖(254nm)中的滯留時間) 針對合成活性，是將使用#02-001、#04-001~072時的目標生成物的產率除以使用野生型酵素(#02-001)時的目標生成物的產率而求得。計算出的合成活性的比示於表12。再者，野生型酵素的產率為16%。 [表12]
編號 名稱 活性比 （倍） 編號 名稱 活性比 （倍）
酵素(－) 酵素(－) 0.00    #04-039 T156V_Q186R 0.00   
#04-001 M141V_W253H_K260E 3.41    #04-040 T156I_Q186H 0.00   
#04-002 H182L_W253H_K260Q 3.45    #04-041 T156I_Q186R 0.00   
#04-003 M141V_W253H_K260Q 3.61    #04-042 M141Y_W253M_K260E 2.70   
#04-004 H182L_W253H_K260E 4.28    #04-043 M141V_W253M_K260Q 3.55   
#04-005 M141Y_W253H_K260E 3.14    #04-044 M141V_H182L_K260Q 3.98   
#04-006 H182M_W253H_K260Q 2.17    #04-045 M141V_H182M_K260Q 3.06   
#04-007 H182M_W253H_K260E 3.49    #04-046 M141V_W253M_K260E 4.34   
#04-008 M141A_W253H_K260E 1.74    #04-047 H182F_W253H_K260E 2.89   
#04-009 M141V_W253Q_K260E 3.90    #04-048 M141Y_H182M_K260Q 4.03   
#04-010 M141I_W253H_K260E 3.82    #04-049 M141Y_H182M_K260E 4.67   
#04-011 M141V_W253L_K260Q 3.60    #04-050 M141A_H182M_K260Q 1.89   
#04-012 M141V_W253L_K260E 3.35    #04-051 M141A_W253M_K260E 1.71   
#04-013 H182M_W253M_K260E 3.16    #04-052 M141A_H182L_K260Q 2.17   
#04-014 H182M_W253Q_K260E 3.36    #04-053 M141V_H182L_K260E 3.79   
#04-015 M141A_W253Q_K260E 1.89    #04-054 M141V_H182M_K260E 4.01   
#04-016 M141I_W253H_K260Q 3.57    #04-055 M141T_H182L_K260Q 2.43   
#04-017 H182L_W253Q_K260E 3.86    #04-056 M141A_H182M_K260E 2.44   
#04-018 H182L_W253M_K260Q 3.15    #04-057 M141A_W253M_K260Q 1.39   
#04-019 M141V_W253E_K260Q 1.73    #04-058 M141A_H182L_K260E 1.85   
#04-020 H182M_W253M_K260Q 2.51    #04-059 M141T_H182M_K260Q 1.62   
#04-021 M141A_W253H_K260Q 1.66    #04-060 M141Y_H182L_K260E 3.75   
#04-022 M141Y_W253T_K260E 2.30    #04-061 M141Y_H182L_K260Q 3.97   
#04-023 H182L_W253M_K260E 3.71    #04-062 M141V_H182F_K260Q 2.25   
#04-024 M141L_W253H_K260E 3.37    #04-063 M141A_H182F_K260Q 2.78   
#04-025 M141V_W253Q_K260Q 3.65    #04-064 M141A_H182F_K260E 1.37   
#04-026 H182L_W253T_K260Q 2.48    #04-065 M141V_H182F_K260E 2.46   
#04-027 H182L_W253Q_K260Q 3.40    #04-066 M141Y_H182F_K260E 3.26   
#04-028 H182M_W253L_K260Q 2.28    #04-067 M141I_H182M 1.67   
#04-029 H182M_W253Q_K260Q 2.67    #04-068 M141K_H182L_W253H 1.63   
#04-030 M141V_W253F_K260Q 3.36    #04-069 F117I_M141A_K260Q 0.34   
#04-031 M141V_W253T_K260Q 3.31    #04-070 W253L_K260D 0.77   
#04-032 M141Y_W253Q_K260E 3.09    #04-071 M141Y_H182G_W253H 0.41   
#04-033 H182M_W253F_K260Q 1.95    #04-072 M141Y_H182A 1.62   
#04-034 M141T_W253H_K260E 2.19    #02-001 WT 1.00   
#04-035 M141Y_W253S_K260E 2.46    #02-021 R48D 0.00   
#04-036 M141V_W253V_K260Q 3.48    #02-117 H182L 2.15   
#04-037 H182M_W253L_K260E 2.91    #03-006 M141A_K260E 4.23   
#04-038 M141S_W253H_K260E 2.20    #03-020 M141Y_K260E 5.00   
合成例3：H-MeVal-OH的合成 為了測試於實施例1製備的改變酵素(#02-169)所致的H-MeVal-OH合成，製備含有基質的溶液(以下，稱為預混物5)。具體而言，將3-甲基-2-側氧基丁酸鈉(購自Sigma-Aldrich Japan有限責任公司)、D(+)-葡萄糖的2種化合物溶解於甲胺水溶液、磷酸緩衝液(400mM、pH7.4)的混合溶媒。使用氫氧化鈉水溶液將pH調整成8.0之後，以超純水稀釋。對此溶液，添加β-NADPH水溶液、及GDH溶液，獲得預混物5。再者，於預混物5的時點的各化合物濃度，3-甲基-2-側氧基丁酸鈉為55.6mM，D(+)-葡萄糖為111mM，甲胺為556mM，磷酸緩衝液為111mM，β-NADPH為0.99mM，GDH溶液為0.0022 unit/μL。
對製備的預混物5，添加#02-169，並實施H-MeVal-OH合成反應。具體而言，對預混物5，添加#02-169的溶液。將其充分混合之後，於37℃進行培養19小時。再者，反應起始時的各化合物的濃度，3-甲基-2-側氧基丁酸鈉為50mM，D(+)-葡萄糖為100mM，甲胺為500mM，磷酸緩衝液為100mM，β-NADPH為0.89mM，GDH溶液為0.002unit/μL，#02-169為2.5μM。
針對培養後的反應溶液，實施後處理以進行LCMS分析用樣品製備。具體而言，添加反應溶液9倍量的鹽酸以使氯化氫的添加後最終濃度成為30mM(以下，將此溶液稱為經後處理的反應溶液5)。
以溶解於經後處理的反應溶液5的H-MeVal-OH的濃度藉由LCMS進行定量為目的，製作H-MeVal-OH的稀釋數列。具體而言，將H-MeVal-OH以成為1000mM的方式溶解於超純水之後，以超純水重複進行2倍的稀釋操作。
由於溶解在經後處理的反應溶液5中的各種化合物的離子抑制導致使用該稀釋數列的濃度定量困難，因此將該稀釋數列添加到模擬經後處理的反應溶液5的組成的溶液中。首先，將3-甲基-2-側氧基丁酸鈉、D(+)-葡萄糖的2種化合物溶解於甲胺水溶液、磷酸緩衝液的混合溶媒，使用氫氧化鈉水溶液將pH調整成8.0之後，以超純水稀釋(以下，將本溶液稱為預混物6)。接著，對預混物6，添加β-NADPH水溶液、1xTNG、含咪唑緩衝液、稀釋數列並充分混合。再者，在此時點的各化合物濃度，3-甲基-2-側氧基丁酸鈉為25mM，D(+)-葡萄糖為75mM，甲胺為475mM，磷酸緩衝液為100mM，β-NADPH為0.89mM，1xTNG與含咪唑緩衝液各自的體積比為10%。最後，添加反應溶液的9倍量的鹽酸以使氯化氫的添加後最終濃度成為30mM，獲得LCMS分析用檢量線樣品(以下，將此溶液稱為經後處理的檢量線樣品3)。
考慮到經後處理的反應溶液5中溶解了超過經後處理的檢量線樣品3的檢量線範圍程度的H-MeGly(cPent)-OH的可能性，而進行稀釋操作。首先，作為對前述的離子抑制的處理，製備模擬溶解在經後處理的反應溶液5的各種化合物的組成的稀釋用溶液。具體而言，將預混物6、1×TNG、含咪唑緩衝液、β-NADPH水溶液、鹽酸進行混合，以超純水稀釋。再者，稀釋後的β-NADPH、氯化氫的濃度分別為0.089mM、30mM，預混物6、1×TNG、含咪唑緩衝液的最終體積比分別為6%、1%、1%。使用此稀釋用溶液，並將經後處理的反應溶液5稀釋32倍，以獲得經後處理的反應溶液6。 經後處理的反應溶液5、經後處理的反應溶液6、經後處理的檢量線樣品3皆通過0.2μm的PVDF膜過濾器之後，供於LCMS測定。測定所使用的液量為1μL。使用搭載於MassLynx且檢測萃取離子層析圖的波峰面積之功能(TargetLynx)，評估#02-169的H-MeVal-OH合成活性，顯示#02-169具有H-MeVal-OH的合成活性。 LCMS(ESI) m/z=132.02(M+H) +滯留時間：2.85分(分析條件HILIC) 產率：26%
合成例4：H-MeGly(cPent)-OH的合成 LC/MS以以下分析條件實施。 HPLC method 裝置：Waters AQUITY UPLC H-Class/QDa 管柱：ACQUITY UPLC HSS T3 2.1×50mm、 1.8μm 溶媒：A)0.05%TFA-H 2O、B)0.05%TFA-CH 3CN 梯度：0%B (0min) →98%B (5.0min) → 98%B (6.0min) → 0%B (6.01min) → 0%B (8.0min) 流量：0.5mL/min 注入量：1.0μl 溫度：30℃ 波長：197nm
於本實施例中使用以下的試劑。 [表13]
試劑名稱 CAS登錄編號 供應商
2-環戊基-2-側氧基-乙酸鈉鹽 223422-04-6 Hebei Yaocheng Pharmaceutical Technology
甲胺鹽酸鹽 593-51-1 東京化成工業
D-葡萄糖 50-99-7 富士軟片和光純藥
N,N-二(2-羥基乙基)甘胺酸 150-25-4 東京化成工業
50w/v%氫氧化鈉水溶液 1310-73-2 富士軟片和光純藥
氧化型菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 1184-16-3 ORIENTAL酵母工業
D-葡萄糖脫氫酶(CDX-901) 9028-53-9 Codexis   
改變酵素溶液 N/A 於實施例2製備
濃鹽酸 7647-01-0 富士軟片和光純藥
[化59] 將2-環戊基-2-側氧基-乙酸鈉鹽(5.3g、32.5mmol)、甲胺鹽酸鹽(11.0g、162.7mmol)、D-葡萄糖(11.7g、65.1mmol)、N,N-二(2-羥基乙基)甘胺酸(10.6g、65.1mmol)溶解於蒸餾水(69.4mL)，將外溫設定成25℃。加入50w/v%氫氧化鈉水溶液(4.8mL)，並調整成pH 9.2。加入氧化型菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(249.0mg、0.3mmol)、D-葡萄糖脫氫酶(26.0mg、0.5wt%、1300U)、改變酵素溶液(2.0mL、作為酵素53mg，相當於1.0wt%)，於內溫25℃攪拌21小時(反應轉化率99%以上)。加入濃鹽酸(7.5mL)並調整成pH 1.9，攪拌1小時。將不溶物以矽藻土過濾濾除，以蒸餾水(10.7mL)洗淨矽藻土，獲得作為濾液的H-MeGly(cPent)-OH溶液。滯留時間：1.41 min、MS(ESI):m/z = 158.10 (M+H) +
合成例4-2：(S)-3,3-二甲基-2-(甲基胺基)酪酸的合成 LC/MS以以下的分析條件實施。 HPLC method 裝置：Waters AQUITY UPLC H-Class/QDa 管柱：ACQUITY UPLC HSS T3 2.1x50mm、 1.8μm 溶媒：A)0.05%TFA-H 2O、B)0.05%TFA-CH 3CN 梯度：0%B (0min) → 98%B (5.0min) → 98%B (6.0min) → 0%B (6.01min) → 0%B (8.0min) 流量：0.5mL/min 注入量：0.5μl 溫度：30℃ 波長：197 nm 本實施例中使用下表所載的試劑。未記載的試劑使用表13的試劑。 [表14]
試劑名稱 CAS登錄編號 供應商
3,3-二甲基-2‐側氧基酪酸 815-17-8 東京化成工業
(S)-2-胺基-3,3-二甲基酪酸 20859-02-3 東京化成工業
[化60]
將氧化型菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(50mg)溶解於0.4 mol/L N,N-二(2-羥基乙基)甘胺酸溶液(1.0mL、pH9.0)，製備氧化型菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸溶液(A液)。 將D-葡萄糖脫氫酶(50mg)溶解於0.4mol/LN,N-二(2-羥基乙基)甘胺酸溶液(1.0mL、pH9.0)，製備D-葡萄糖脫氫酶溶液(B液)。 將3,3-二甲基-2‐側氧基酪酸(50mg、0.38mmol)、N,N-二(2-羥基乙基)甘胺酸(130mg、0.77mmol)、甲胺鹽酸鹽(130mg、1.9mmol)、D-葡萄糖(140mg、0.77mmol)溶解於蒸餾水(0.80mL)、二甲基亞碸(0.20mL)。加入50w/v% 氫氧化鈉水溶液(88μL)，調整成pH 9.0以作為基質溶液(C液)。 將A液(59μL、3.8μmol)、B液(10μL、1.0wt%)加入至C液，加入於實施例2製備的改變酵素溶液(1.0~100wt%，作成73.3mg/ml的溶液而各自添加)，於外溫25℃攪拌17小時之後，於外溫37℃搖動24小時。 以(S)-2-胺基-3,3-二甲基酪酸作為標準品而自LC/MS中的197nm的UV吸收波峰面積計算出反應液中的(S)-3,3-二甲基-2-(甲基胺基)酪酸的產率。結果示於表15。 [表15]
改變酵素量(wt%) 產率(%)
25℃、15小時 37℃、24小時
1.0 0 0
10 0 1
100 1 4
評估例6：使用改變酵素W253H-SBP-His以及添加劑(二甲基亞碸)之MeHph(2-Cl)的合成 縮寫MeHph(2-Cl)示出具有以下結構式的化合物。 [表16]
縮寫 結構式
MeHph(2-Cl)  
LCMS的分析條件如下所示。 LCMS method 條件名稱：FA05 裝置：Waters Acquity UPLC/SQD 管柱(I.D.×長度(mm)、粒徑(μm))：Aldrich Ascentis Express C18(2.1×50、2.7) 移動相：A) 0.1% FA H 2O、B) 0.1% FA MeCN 梯度(A/B)：95/5~0/100(1.0分鐘間) 0/100(0.4分鐘間) 流速(ml/分)：1 管柱溫度：35℃ 波長：210-400nm PDA total
條件名稱：TFA00 裝置：Waters H class 管柱：(I.D.×長度(mm)、粒徑(μm)):ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×50、1.8) 移動相：A) 0.05% TFA H 2O、B) 0.05% TFA MeCN 梯度(A/B)：100/0~2/98(5.0分鐘間) 2/98(1.0分鐘間) 100/0(0.01分鐘間) 100/0(2.0分鐘間) 流速(ml/分)：0.5 管柱溫度：30℃ 波長：197nm
條件名稱：TFA00-QDa 裝置：Waters H class/QDa 管柱：(I.D.×長度(mm)、粒徑(μm)):ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×50、1.8) 移動相：A) 0.05% TFA H 2O、B) 0.05% TFA MeCN 梯度(A/B)：100/0~2/98(5.0分鐘間) 2/98(1.0分鐘間) 100/0(0.01分鐘間) 100/0(2.0分鐘間) 流速(ml/分)：0.5 管柱溫度：30℃ 波長：197nm
本實施例中使用以下的試劑。 [表17]
試劑名稱 CAS登錄編號 供應商
丙酮酸鈉 113-24-6 東京化成工業
2-氯苯甲醛 89-98-5 東京化成工業
鈀/碳 PE型 7440-05-3 NE Chemcat
二苯硫醚 139-66-2 富士軟片和光純藥
D(+)-葡萄糖 50-99-7 富士軟片和光純藥
甲胺40%水溶液 74-89-5 富士軟片和光純藥
磷酸緩衝劑粉末 (1/15 mol/L, pH 7.4) ― 富士軟片和光純藥
NADPH 2646-71-1 ORIENTAL酵母工業
GDH 9028-53-9 富士軟片和光純藥
2-環戊基-2-側氧基乙酸鈉 223422-04-6 Hebei Yaocheng Pharmaceutical Technology
N,N-二(2-羥基乙基)甘胺酸 150-25-4 東京化成工業
氫氧化銨溶液(28~30%NH 3) 1336-21-6 Sigma-Aldrich
以下試劑使用以下所述方式實施預先製備。
[表18]
試劑名稱 預先製備
甲胺溶液 使用鹽酸、超純水將甲胺40%水溶液作成pH8.5的2.5M溶液
磷酸緩衝液 使用氫氧化鈉水溶液、超純水將磷酸緩衝劑粉末作成pH8.5的1M溶液
NADPH溶液 使用超純水作成100mM溶液
GDH溶液 使用1xTNG作成0.02unit/μL溶液
氨溶液 使氫氧化銨溶液(28~30%NH3)中的氨濃度成為28%，並使用鹽酸、超純水作成pH8.5的2.5M溶液
N,N-二(2-羥基乙基)甘胺酸緩衝液 使用氫氧化鈉水溶液、超純水將N,N-二(2-羥基乙基)甘胺酸作成pH9的1M溶液
原料中間體(E)-4-(2-氯苯基)-2-側氧基丁-3-烯酸的合成 [化61] 於0度下將丙酮酸鈉(2.42g、0.022mol)加入至1N 氫氧化鈉水溶液(60ml)與乙醇(3ml)的混合溶液之後，滴加2-氯苯甲醛(2.25ml、0.02mol)20分鐘以上，於0度攪拌反應液2小時。之後，將水(160ml)加入至反應液，以甲苯(100ml)清洗。於0度下滴加5N鹽酸至所得的水層直到pH成為1，將該溶液攪拌30分鐘。以過濾回收溶液中產生的析出物，以冷水進行該析出物的清洗。加熱減壓乾燥所得的溼式固體，獲得(E)-4-(2-氯苯基)-2-側氧基丁-3-烯酸(2.7g、0.013mol、64%產率)。 LCMS(ESI)m/z=209.0(M-H) -滯留時間：0.52分(分析條件FA05)
原料4-(2-氯苯基)-2-側氧基丁酸鈉的合成 [化62] 將(E)-4-(2-氯苯基)-2-側氧基丁-3-烯酸(1.00g、4.75mol)與鈀/碳(0.20g、1.88mol)的甲醇(20ml)及二苯硫醚(7.97μl、0.047mmol)的懸浮液於氫氣氣氛下室溫攪拌1小時。過濾反應液之後，減壓條件下將所得的濾液進行濃縮。將1N氫氧化鈉水溶液(15ml)加入至所得的殘渣，以甲苯(15ml)清洗(2次)。於0度下攪拌水層30分鐘後，以過濾回收溶液中產生的析出物，以冷水進行該析出物的清洗。加熱減壓乾燥所得的溼式固體，獲得4-(2-氯苯基)-2-側氧基丁酸鈉(847mg、3.61mmol、75%產率)。 LCMS(ESI)m/z=211.0(M-H) -滯留時間：0.59分(分析條件FA05)
使用改變酵素W253H-SBP-His以及添加劑的MeHph(2-Cl)的合成 製備4-(2-氯苯基)-2-側氧基丁酸鈉(最終濃度50mM)、D(+)-葡萄糖(最終濃度100mM)、甲胺溶液(最終濃度500mM)、磷酸緩衝液(最終濃度0.1M)、NADPH溶液(最終濃度1mM)、GDH溶液(最終濃度0.002 unit/μL)、二甲基亞碸(DMSO)(相對於反應溶液20v/v%)、於實施例2製備的改變酵素W253H-SBP-His(最終濃度2.5μM)、超純水的混合溶液(pH8-9)，於25℃或37℃進行培養3小時。
將反應溶液19倍量的含鹽酸DMSO溶液以氯化氫的添加最終濃度成為300mM的方式添加至培養後的反應溶液。所得的溶液通過0.45μm的PTFE膜過濾器(Cosmospin過濾器H，NACALAI TESQUE)，作為LCMS分析用樣品，實施LCMS測定(分析條件：FA05)。算出目標物MeHph(2-Cl)的254nm的UV波峰面積，求得反應產率。結果示於表19。 LCMS(ESI)m/z=228.1(M+H) +滯留時間：0.38分(分析條件FA05) [表19]
添加劑 反應溫度25℃ 產率(%) 反應溫度37℃ 產率(%)
DMSO 98 99
本實施例中使用以下的試劑。 [表20]
試劑名稱 CAS登錄編號 供應商
2-側氧基-3-苯基丁酸鈉 125116-72-5 Chemieliva Pharmaceutical
D(+)-葡萄糖 50-99-7 富士軟片和光純藥
氫氧化銨溶液(28~30%NH 3) 1336-21-6 Sigma-Aldrich
β-NADPH 2646-71-1 ORIENTAL酵母工業
GDH 9028-53-9 富士軟片和光純藥
N,N-二(2-羥乙基)甘胺酸 150-25-4 富士軟片和光純藥
5mol/L鹽酸 7647-01-0 富士軟片和光純藥
(2S,3R)-2-胺基-3-苯基-丁酸鹽酸鹽 143251-58-5 J&W Pharmlab
(2S,3S)-2-胺基-3-苯基-丁酸鹽酸鹽 53331-55-8 J&W Pharmlab
(2R,3R)-2-胺基-3-苯基-丁酸鹽酸鹽 143251-57-4 J&W Pharmlab
以下試劑使用以下所述方式實施預先製備。 [表21]
試劑名稱 預先調整
氨溶液 使氫氧化銨溶液(28~30%NH 3)中的氨濃度成為28%，並使用鹽酸、超純水作成pH8.5的2.5M溶液
NADPH溶液 使用超純水作成100mM
GDH溶液 使用1xTNG作成0.02unit/μL溶液
N,N-二(2-羥基乙基)甘胺酸緩衝液 使用氫氧化鈉水溶液、超純水將N,N-二(2-羥基乙基)甘胺酸作成pH9的1M溶液
LCMS的分析條件如下所示。 LCMS method 條件名稱：FA05 裝置：Waters Acquity UPLC/SQD 管柱(I.D.×長度(mm)、粒徑(μm))：Aldrich Ascent is Express C18 (2.1×50、2.7) 移動相：A) 0.1% FA H 2O、B) 0.1% FA MeCN 梯度(A/B)：95/5~0/100(1.0分鐘間) 0/100(0.4分鐘間) 流速(ml/分)：1 管柱溫度：35℃ 波長：210-400nm PDA total
1H-NMR分析使用以下的機器、氘代溶媒進行測定。 機器：AVANCE III HD 400 SMART-BBFO probe(400 MHz, Bruker) 氘代溶媒：三氟乙酸(Trifluoroacetic acid)- d 1
本實施例中使用以下的縮寫。 [表22]
縮寫 化合物
(I) 反應所得的化合物：(2S,3S)-2-胺基-3-苯基-丁酸
(II) 標準品化合物：(2S,3R)-2-胺基-3-苯基-丁酸鹽酸鹽
(III) 標準品化合物：(2S,3S)-2-胺基-3-苯基-丁酸鹽酸鹽
(IV) 標準品化合物：(2R,3R)-2-胺基-3-苯基-丁酸鹽酸鹽
評估例7：使用改變酵素W253H-SBP-His以及添加劑(二甲基亞碸)的(2S,3S)-2-胺基-3-苯基-丁酸的合成 [化63] 製備2-側氧基-3-苯基丁酸鈉(最終濃度50mM)、D(+)-葡萄糖(最終濃度100mM)、氨溶液(最終濃度500mM)、N,N-二(2-羥基乙基)甘胺酸緩衝液(最終濃度0.1M)、NADPH溶液(最終濃度1mM)、GDH溶液(最終濃度0.002unit/μL)、添加劑DMSO(20vol%)、於實施例2製備的改變酵素W253H-SBP-His(最終濃度20μM)、超純水的混合溶液，於37℃進行培養47小時。 添加600μL的5mol/L鹽酸至培養後的反應溶液，將所得的溶液以逆相矽膠管柱層析法(0.1%蟻酸水溶液/0.1%蟻酸乙腈溶液=100/0→95/5)進行純化，獲得(2S,3S)-2-胺基-3-苯基-丁酸(I)(16.5mg、18%)。 LCMS(ESI) m/z=180.1(M+H) +滯留時間：0.31分(分析條件FA05) 1H-NMR(400 MHz, Trifluoroacid- d 1, 298K)δ7.32-7.21 (3H, m),7.18-7.16 (2H, m),4.94 (1H, d, J= 5.6 Hz),3.55-3.48 (1H, m),1.45 (1H, d, J= 6.8 Hz )
本反應所得的化合物(2S,3S)-2-胺基-3-苯基-丁酸(I)與購入的標準品化合物(2S,3R)-2-胺基-3-苯基-丁酸鹽酸鹽(II)、(2S,3S)-2-胺基-3-苯基-丁酸鹽酸鹽(III)、以及(2R,3R)-2-胺基-3-苯基-丁酸鹽酸鹽(IV)的 1H-NMR、掌性HPLC分析數據比較以確定所得化合物的立體結構。
根據 1H-NMR分析中的第2位與第3位的特徵質子峰比較結果(第1圖)以及掌性HPLC分析的比較結果(第2圖、以及表23)，本反應所得的化合物(I)的結構確定為(2S,3S)-2-胺基-3-苯基-丁酸。
掌性HPLC分析條件如下所示。 裝置：SHIMADZU Nexera X3 管柱(I.D.×長度(mm)、粒徑(μm))：DAICEL社 CHIRALPAK ZWIX(+)(3.0×150、3.0) 移動相：含50mM蟻酸以及25mM二乙胺，MeOH:MeCN:H 2O(49:49:2,v/v)溶液 溶析法：等度(isocratic) 分析時間：10分 流速(ml/分)：0.5 管柱溫度：25℃ 波長：254nm
第2圖、以及表23中的(V)是將購入的標準品化合物(III)、(IV)以(III):(IV)=7:3的比率混合而製備。 [表23]
(I) PDA Ch 1 254 nm
波峰# 滯留時間 面積 面積%
1 4.103 96765 100.000
總計    96765 100.000
              
(V) PDA Ch 1 254 nm
波峰# 滯留時間 面積 面積%
1 4.082 133994 71.853
2 5.344 52490 28.147
總計    186484 100.000
評估例8：使用改變酵素W253H-SBP-His以及添加劑(DMSO)的MeGly(cPent)合成中添加劑的評估 將2-環戊基-2-側氧基乙酸鈉(最終濃度100mM)、D(+)-葡萄糖(最終濃度200mM)、甲胺鹽酸鹽(最終濃度500mM)、NADPH(最終濃度2.0mM)、N,N-二(2-羥基乙基)甘胺酸(最終濃度100mM)溶解於蒸餾水，添加添加劑DMSO(0~40v/v%)之後，以5M氫氧化鈉水溶液調整成pH8.8~8.9。加入GDH溶液(0.10units/μL、1xTNG溶液、最終濃度0.0040 units/μL)、於實施例2製備的改變酵素W253H-SBP-His(0.67mM、最終濃度5.0μM)，於25℃進行培養24小時。
取樣培養中的反應溶液50μL，添加甲醇750μL、1M鹽酸200μL。所得的溶液以0.5μm的PTFE膜過濾器(DISMIC，ADVANTEC)過濾作為LC分析用樣品，並實施LC測定(分析條件：TFA00)。測定LC的197nm中的UV波峰面積，基於下述式X修正各化合物的吸光係數的比以算出反應產率。反應產率的變化示於表24。 滯留時間：1.1分(分析條件：TFA00) 又，將所得的溶液進行LCMS測定(分析條件TFA00-QDa)，確認MeGly(cPent)的MS波峰。 滯留時間：1.5分(分析條件：TFA00-QDa) LCMS(ESI) m/z=158.1(M+H) +式X：反應產率(%)=S 1a/((S 2a/8.0)+S 1a)x100 式X中，S 1a表示MeGly(cPent)的UV波峰面積。S 2a表示2-環戊基-2-側氧基乙酸鈉的UV波峰面積。 [表24]
DMSO(v/v%) 反應產率(%)
3h 9h 24h
0 26 64 97
10 37 79 99
20 47 86 99
30 47 85 95
40 47 84 97
評估例9：使用改變酵素W253H-SBP-His的Phe合成中添加劑的評估 製備苯丙酮酸(最終濃度50mM)、D(+)-葡萄糖(最終濃度100mM)、氨溶液(最終濃度500mM)、N,N-二(2-羥基乙基)甘胺酸緩衝液(最終濃度0.1M)、NADPH溶液(最終濃度1mM)、GDH溶液(最終濃度0.002unit/μL)、添加劑DMSO(相對於反應溶液20v/v%)、於實施例2製備的改變酵素W253H-SBP-His(最終濃度2.5μM)、超純水的混合溶液(pH8-9)，於25℃進行培養，實施反應的評估。作為比較條件，在無添加劑(0v/v%)條件中，添加超純水以取代添加劑。將反應溶液19倍量的含鹽酸DMSO溶液以氯化氫的添加最終濃度成為300mM的方式添加至培養後的反應溶液。將所得的溶液通過0.45μm的PTFE膜過濾器(Cosmospin過濾器H、NACALAI TESQUE)，作為LCMS分析用樣品，實施LCMS測定(分析條件：FA05-1)。計算出目標物Phe的254nm的UV波峰面積，求得反應產率。此時，求得在反應溫度25℃中3小時後以及5小時後的反應產率。結果示於表25。 LCMS(ESI) m/z=166.1(M+H) +滯留時間：0.27分(分析條件FA05-1) [表25]
添加劑 反應溫度 25℃ 產率 (%)  
3 小時 5 小時
無 32 68
DMSO 50 86
高效液相層析法的條件如下述所示。 高效液相層析法的條件1 裝置：Waters AQUITY H-class/QDa 管柱：(I.D.×長度(mm)、粒徑(μm))：ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×50、1.8) 移動相：A) 0.05% TFA H 2O、B) 0.05% TFA MeCN 梯度(A/B)：100/0~2/98(5.0分鐘間) 2/98(1.0分鐘間) 100/0(0.01分鐘間) 100/0(2.0分鐘間) 流速(ml/分)：0.5 管柱溫度：30℃
高效液相層析法的條件2 裝置：Waters AQUITY H-class 管柱：(I.D.×長度(mm)、粒徑(μm)):Ascentis Express RP-Amide(2.1×50、2.7) 移動相：A) 0.05% TFA H 2O、B) 0.05% TFA MeCN 梯度(A/B)：95/5~0/100(4.0分鐘間) 0/100(0.5分鐘間) 95/5(0.1分鐘間) 95/5(1.4分鐘間) 流速(ml/分)：0.5 管柱溫度：35℃
高效液相層析法的條件3 裝置：Waters AQUITY H-class/QDa 管柱：(I.D.×長度(mm)、粒徑(μm)):Ascentis Express C18(3.0×50、2.7) 移動相：A) 0.05% TFA H 2O、B) 0.05% TFA MeCN 梯度(A/B)：95/5~0/100(5.0分鐘間) 0/100(1.0分鐘間) 95/5(0.01分鐘間) 95/5(2.0分鐘間) 流速(ml/分)：0.5 管柱溫度：30℃
高效液相層析法的條件4 裝置：Waters AQUITY H-class/QDa 管柱(I.D.×長度(mm)、粒徑(μm))：DAICEL CHIRALPAK IC-3(4.6×150、3) 移動相：A) 0.05% TFA H 2O、B) 0.05% TFA MeCN 梯度(A/B)：95/5~40/60(20.0分鐘間) 95/5(0.1分鐘間) 95/5(4.9分鐘間) 流速(ml/分)：1.0 管柱溫度：30℃
合成例5：(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸粗純化物的合成 [化64]
將2-環戊基-2-側氧基-乙酸鈉鹽(3.9g、24mmol)、甲胺鹽酸鹽(8.1g、120mmol)、D-葡萄糖(8.7g、48mmol)以及N,N-二(2-羥基乙基)甘胺酸(7.8g、48mmol)溶解於蒸餾水(50mL)，將反應容器的外溫設定成25℃。加入5M氫氧化鈉水溶液(6.0mL)，調整成pH8.8。加入NADP+(0.18g、0.24mmol)、D-葡萄糖脫氫酶(3.8mg、960U、250U/mg)以及於實施例2製備的改變酵素W253H-SBP-His(1.6mL、相當於43mg作為酵素，1.1質量%)，在反應容器的外溫25℃下攪拌24小時。加入濃鹽酸(3.0mL)並調整成pH 1.9，攪拌1小時。以矽藻土墊過濾不溶物，以蒸餾水(20mL)清洗矽藻土墊，獲得(S)-2-環戊基-2-(甲基胺基)乙酸溶液(120g)。
使用高效液相層析法的條件1，進行質量分析(MS(ESI))。於滯留時間1.5分，確認到m/z=158.1(M+H) +的波峰，確認獲得作為目標的(S)-2-環戊基-2-(甲基胺基)乙酸溶液。
將10M氫氧化鈉水溶液(10mL)加入至(S)-2-環戊基-2-(甲基胺基)乙酸溶液(60g、相當12mmol)，將pH調整成12.0。於反應容器的外溫40℃減壓下濃縮乾燥所得的溶液。加入蒸餾水(30mL)，加入濃鹽酸(0.75mL)以調整成pH 9.7。加入乙腈(10mL)、N-苄氧甲醯基琥珀醯亞胺(carbobenzoxy succinimide)(4.2g、17mmol)、甲基三級丁基醚(10mL)，攪拌1小時。加入50w/v%氫氧化鈉水溶液(1.5mL)並攪拌3小時。加入N-苄氧甲醯基琥珀醯亞胺(1.2g、4.8mmol)並攪拌90分鐘。加入50w/v%氫氧化鈉水溶液(0.5mL)並攪拌18小時。加入濃鹽酸(8.0mL)，將目標物萃取至有機層，於反應容器的外溫40℃減壓下濃縮乾燥所得的有機層。加入甲基三級丁基醚(15mL)，將有機層以5%磷酸氫二鈉水溶液清洗2次(10mL×2)，以2M氫氧化鈉水溶液清洗1次(10mL)，將目標物萃取至水層。合併所得的水層加入甲基三級丁基醚(20mL)、濃鹽酸(1.5mL)以對有機層再萃取目標物。於反應容器的外溫40℃減壓下濃縮乾燥所得的有機層。加入甲基三級丁基醚(30mL)、1M氫氧化鈉水溶液(30mL)將目標物萃取至水層。所得的水層以甲基三級丁基醚(30mL)清洗。加入甲苯(30mL)、濃鹽酸(3.0mL)並對有機層再萃取目標物。於反應容器的外溫40℃減壓下濃縮乾燥所得的有機層，獲得(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸粗純化物(2.8g)。
合成例6：(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸粗純化物的合成 [化65]
將2-環戊基-2-側氧基-乙酸鈉鹽(5.3g、33mmol)、甲胺鹽酸鹽(11g、160mmol)、D-葡萄糖(12g、65mmol)、N,N-二(2-羥基乙基)甘胺酸(11g、65mmol)溶解於蒸餾水(69mL)，將反應容器的外溫設定成25℃。加入50w/v%氫氧化鈉水溶液(4.8mL)，調整成pH 9.2。加入NADP+(0.25g、0.33mmol)、D-葡萄糖脫氫酶(26mg、1300U、50U/mg)、於實施例2製備的改變酵素W253H-SBP-His(2.0mL、相當於53mg作為酵素、1.0質量%)，於反應容器的外溫25℃下攪拌21小時(反應轉化率99%以上)。加入濃鹽酸(7.5mL)並調整成pH 1.9，攪拌1小時。以矽藻土墊過濾不溶物，將矽藻土墊以蒸餾水(11mL)清洗，獲得(S)-2-環戊基-2-(甲基胺基)乙酸溶液(130g)。
使用高效液相層析法的條件1，進行質量分析(MS(ESI))。於滯留時間1.4分，確認到m/z=158.1(M+H) +的波峰，確認獲得作為目標的(S)-2-環戊基-2-(甲基胺基)乙酸溶液。
將50w/v%氫氧化鈉水溶液(3.2mL)加入至(S)-2-環戊基-2-(甲基胺基)乙酸溶液(27g、相當6.5mmol)，將pH調整成12.3。於反應容器的外溫40℃濃縮乾燥所得的溶液。於反應容器的外溫25℃下加入蒸餾水(24mL)、濃鹽酸(0.53mL)並將pH製備成9.2。加入甲基三級丁基醚(5.3mL)、乙腈(2.7mL)、N-苄氧甲醯基琥珀醯亞胺(1.8g、7.2mmol)，攪拌105分鐘。加入乙腈(1.6mL)進一步攪拌30分鐘。加入50w/v%氫氧化鈉水溶液(0.8mL)並調整成pH9.3，攪拌105分鐘。加入N-苄氧甲醯基琥珀醯亞胺(1.0g、3.9mmol)並攪拌105分鐘。加入50w/v%氫氧化鈉水溶液(0.5mL)並調整成pH 9.2之後，加入N-苄氧甲醯基琥珀醯亞胺(1.1g、4.6mmol)攪拌13小時。加入濃鹽酸(4.3mL)並調整成pH 0.4之後，加入甲基三級丁基醚(3.0mL)，將目標物萃取至有機層。將甲基三級丁基醚(5.3mL)加入至所得的水層，並將目標物萃取至有機層。合併所得的有機層並加入2M氫氧化鈉水溶液(11mL)以成為鹼性，加入甲基三級丁基醚(5.3mL)並將目標物萃取至水層。將甲基三級丁基醚(11mL)加入至水層以清洗。將甲基三級丁基醚(11mL)、濃鹽酸(2.1mL)加入至水層，調整成pH 0.0，將目標物萃取至有機層，獲得(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸粗純化物溶液(14g)。
使用高效液相層析法的條件1，進行質量分析(MS(ESI))。於滯留時間3.9分確認到m/z=292.1(M+H) +的波峰，確認獲得作為目標的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸粗純化物。
合成例7：(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸鋰鹽種晶的合成法 將(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸(1.0g、3.4mmol、市售品)溶解於四氫呋喃(5.0ml、5.0v/w)，於反應容器的外溫25℃攪拌。加入三級丁醇鋰(0.30g、3.8mmol)，確認到結晶的析出。加入四氫呋喃(20ml、20v/w)攪拌1小時。過濾結晶，以四氫呋喃(5.0ml、5.0v/w)清洗所得的結晶。於反應容器的外溫40℃減壓下乾燥3小時，以獲得(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸鋰鹽(0.90g、產率88%)。
比較例2以及實施例1-1：胺基酸衍生物以游離體的純化以及以鋰鹽的純化 比較胺基酸衍生物以游離體(羧酸)的純化與以鋰鹽的純化。將包含雜質的胺基酸衍生物各自分離以成為游離體或鋰鹽，並比較表觀純度。藉由高效液相層析法的UV吸收波峰面積比計算出表觀純度或表觀雜質含有率。藉由式1b計算出表觀純度，藉由式2b計算出表觀雜質含有率。
比較例2：(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸(游離體)的純化 將於合成例5獲得的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸粗純化物(1.4g、理論產量1.8g作為(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸、相當6.0mmol)溶解於甲苯(3.0mL、1.7v/w)，於反應容器的外溫25℃使用攪拌葉進行攪拌。加入庚烷(1.0mL、0.6v/w)、種晶((S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸(游離體)的結晶、市售品、5.0mg)並攪拌15分鐘，確認結晶的析出。滴加庚烷(5.5mL、3.1v/w)1小時，進一步攪拌30分鐘。於反應容器的外溫0℃進一步攪拌1小時。過濾結晶，以庚烷/甲苯(v/v)=4/1(4.0mL、2.3v/w)清洗所得的結晶。於反應容器的外溫40℃減壓下乾燥1小時以獲得(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸(1.3g、產率73%(以合成例5的2-環戊基-2-側氧基-乙酸鈉鹽為基準計算))。
使用高效液相層析法的條件3，進行質量分析(MS(ESI))的結構確認。於滯留時間2.6分確認到作為雜質之一的Cbz-β-Ala-OH所具有的m/z=224.1(M+H) +的波峰。於滯留時間3.9分確認到Cbz-MeGly(cPent)-OH所具有的m/z=292.1(M+H) +的波峰。於210nm的測定波長，測定Cbz-MeGly(cPent)-OH以及Cbz-β-Ala-OH的UV吸收波峰面積，使用前述式1b以及2b計算表觀純度以及表觀雜質含有率。表觀純度以及表觀雜質含有率的計算是針對合成例5所獲得的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸粗純化物(純化前)、以及於比較例2獲得的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸(純化後)兩者進行。結果示於表26。 [表26]
   Cbz-β-Ala-OH (表觀雜質含有率) Cbz-MeGly(cPent)-OH (表觀純度)
純化前 1.5% 98.5%
純化後 1.3% 98.7%
實施例1-1：(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸以鋰鹽的純化 [化66]
將乙腈(2.5ml、5.0v/w)溶解於比較例2獲得的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸(500mg、1.7mmol)，於反應容器的外溫25℃使用攪拌葉進行攪拌。加入4M氫氧化鋰水溶液(0.47ml、1.9mmol)、蒸餾水(0.50ml、1.0v/w)並於反應容器的外溫40℃攪拌20分鐘。加入乙腈(5.0ml、10v/w)10分鐘，加入種晶(於合成例7合成、5.0mg)並攪拌40分鐘，確認到結晶的析出。將反應容器的外溫設定成25℃，攪拌3小時。將反應容器的外溫設定成0℃攪拌30分鐘，加入乙腈(2.5ml、5.0v/w)5分鐘，進一步攪拌30分鐘。加入乙腈(5.0ml、10v/w)5分鐘，攪拌30分鐘。過濾結晶，以蒸餾水/乙腈(v/v)=5/95(2.0mL、4.0v/w)清洗所得的結晶。於反應容器的外溫40℃減壓下乾燥3小時，以獲得(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸鋰鹽(360mg、產率71%、於比較例2獲得的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸為基準計算)。
使用高效液相層析法的條件3，進行質量分析(MS(ESI))以及基於其的表觀純度分析。於滯留時間2.6分確認到作為雜質之一的Cbz-β-Ala-OH的波峰。於滯留時間3.9分確認到Cbz-MeGly(cPent)-OH所具有的m/z=292.1(M+H) +的波峰。於210nm測定波長測定Cbz-MeGly(cPent)-OH以及Cbz-β-Ala-OH的UV吸收波峰面積，使用前述式1b以及式2b計算表觀純度以及表觀雜質含有率。表觀純度以及表觀雜質含有率的計算是針對於比較例2獲得的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸(純化前)、以及於實施例1-1獲得的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸鋰鹽(純化後)兩者進行。結果示於表27。 [表27]
   Cbz-β-Ala-OH (表觀雜質含有率) Cbz-MeGly(cPent)-OH (表觀純度)
純化前 1.3% 98.7%
純化後 N.D. 100%
實施例1-2：(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸鋰鹽的純化 [化67]
於反應容器的外溫40℃下濃縮乾燥於合成例6獲得的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸粗純化物溶液(7.0g、理論產量0.95g作為(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸、相當3.3mmol)。加入乙腈(3.2mL、3.4v/w)，在反應容器的外溫25℃使用攪拌葉進行攪拌。添加蒸餾水(0.53mL、0.6v/w)、4M氫氧化鋰水溶液(0.90mL、3.6mmol)並攪拌20分鐘。加入乙腈(2.7mL、2.8v/w)10分鐘，加入種晶(由合成例7合成、5.0mg)並攪拌15分鐘。加入乙腈(5.3mL、5.6v/w)20分鐘，攪拌17小時。加入乙腈(5.3mL、5.6v/w)30分鐘，攪拌1小時。加入乙腈(5.3mL、5.6v/w)30分鐘，攪拌1小時。過濾結晶，並以蒸餾水/乙腈(v/v)=5/95(3.2mL、3.4v/w)清洗所得的結晶，於反應容器的外溫40℃減壓下乾燥2.5小時，以獲得(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸鋰鹽(產量：620mg、產率：64%、以合成例6的2-環戊基-2-側氧基-乙酸鈉鹽為基準計算)。
使用高效液相層析法的條件1，進行質量分析(MS(ESI))以及基於其的表觀純度分析。於滯留時間2.8分確認到作為雜質之一的Cbz-β-Ala-OH的波峰。於滯留時間3.9分確認到Cbz-MeGly(cPent)-OH所具有的m/z=292.1(M+H) +的波峰。於210nm測定波長測定Cbz-MeGly(cPent)-OH以及Cbz-β-Ala-OH的UV吸收波峰面積，使用前述式1b以及式2b計算表觀純度以及表觀雜質含有率。表觀純度以及表觀雜質含有率的計算是針對於合成例6獲得的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸粗純化物溶液(純化前)、以及於實施例1-2獲得的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸鋰鹽(純化後)兩者進行。結果示於表28。 [表28]
   Cbz-β-Ala-OH (表觀雜質含有率) Cbz-MeGly(cPent)-OH (表觀純度)
純化前 3.6% 96.4%
純化後 N.D. 100%
使用高效液相層析法4的條件，實施掌性分析。測定波長使用210nm。(S)體以及(R)體的滯留時間是根據標準品(購自Amatek社)的分析，確認(S)體為16.7分，(R)體為17.3分。掌性分析的結果，於實施例1-2獲得的(S)-2-(苄氧基羰基(甲基)胺基)-2-環戊基-乙酸鋰鹽(純化後)中並未檢測出(R)體，確認為99.9%ee以上的光學純度。
無
[第1圖]示出實施例的反應中所得的化合物(2S,3S)-2-胺基-3-苯基-丁酸(I)、購入的標準品化合物(2S,3R)-2-胺基-3-苯基-丁酸鹽酸鹽(II)、以及(2S,3S)-2-胺基-3-苯基-丁酸鹽酸鹽(III)的 1H-NMR測定光譜之圖式。 [第2圖]示出實施例的反應中所得的化合物(2S,3S)-2-胺基-3-苯基-丁酸(I)、以及將購入的標準品化合物(III)及(IV)以(III)：(IV)=7：3的比例混合而製備的混合物(V)的掌性HPLC分析數據之圖式。
TW202342741A_111149813_SEQL.xml

Claims (17)

  1. 一種多胜肽，其包含與序列識別號1表示的胺基酸序列中經改變的1個胺基酸殘基的序列具有90%以上的序列相同性之序列，且 對於以下述式(1)表示的化合物A的任1種以上或其鹽與以下述式(2)表示的化合物B的任1種以上或其鹽的還原胺化反應、或者前述化合物B的任1種以上或其鹽的分子内還原胺化反應之觸媒活性，在至少一種反應條件下，較具有序列識別號1表示的胺基酸序列的多胜肽的前述觸媒活性更高， [式(1)中， R 1及R 2各自獨立表示為氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜環基、或雜芳基，該等基可被取代，R 1或R 2中的任一個以上為氫原子]， [式(2)中， X表示碳原子， Y表示氫原子、以上述式(1’)表示的基或以上述式(3)表示的基， n表示0以上且2以下的整數， R 6表示氫原子、可經取代的碳數為1以上且6以下的脂肪族烴基、可經取代的碳數為5以上且12以下的芳基、可經取代的構成環的原子數為5以上且12以下的雜芳基、包含氮原子的基、或包含氧原子的基， 式(1’)中， 表示與X的鍵結點， R 1a為自式(1)中R 1表示的基移除氫原子的基，不為氫原子， 式(3)中， 表示與X的鍵結點， m表示0以上且6以下的整數， p為0或1， q為0或1， r為0或1， Z 1表示可經取代的伸烷基、或碳數為1以上且6以下的含醚鍵基，m為2以上時，存在複數個的Z 1可為相同亦可為不同， Z 2表示碳原子， R 3、R 4及R 5各自獨立表示為氫原子、可經取代的碳數為1以上且6以下的脂肪族烴基、可經取代的碳數為5以上且12以下的芳基、可經取代的構成環的原子數為5以上且12以下的雜芳基、包含氮原子的基、或包含氧原子的基， R 3、R 4及R 5中的任2個以上可彼此鍵結並與Z 2共同形成環結構，此等環結構可為環烷基、芳基、雜環基、或雜芳基，該等基可被取代， R 3、R 4及R 5可與Z 2形成雙鍵或三鍵，R 3、R 4及R 5中的任1個藉由雙鍵或三鍵與Z 2鍵結時，p、q或r中的任1個以上為0， 式(1)中，R 1及R 2中的一個為甲基，且另一個為氫原子時， R 1及R 2中的一個為甲基，且另一個為氫原子時，式(2)中，Y為以上述式(3)表示的基，m為0，R 3至R 5中的2個以上不為氫原子]。
  2. 如請求項1所述之多胜肽，其中前述式(1)中，R 1為氫原子，R 2為C 1~C 6烷基。
  3. 如請求項1或2所述之多胜肽，其中式(2)中，Y為C 3~C 8環烷基或C 6~C 9芳烷基，該芳烷基可被C 1~C 3烷基或鹵素原子所取代。
  4. 一種多胜肽，其包含與序列識別號1表示的胺基酸序列中經改變的1個胺基酸殘基的序列具有90%以上的序列相同性之序列，且 對於烷基胺或其鹽與以下述式(2’)表示的化合物的任1種以上或其鹽的還原胺化反應的觸媒活性，在至少一種反應條件下，較由序列識別號17表示的胺基酸序列構成的多胜肽的前述觸媒活性更高， [式中，Y’表示C 3~C 8環烷基、或C 6~C 9芳烷基，該芳烷基可被C 1~C 3烷基或鹵素原子所取代]。
  5. 如請求項4所述之多胜肽，其中前述烷基胺或其鹽為選自由甲胺、乙胺及其鹽所組成之群組中的1種以上。
  6. 如請求項4或5所述之多胜肽，其中前述式(2’)表示的化合物或其鹽選自由苯丙酮酸、2-側氧基-3-(對甲苯基)丙酸(2-oxo-3-(p-tolyl)propanoic acid)、2-環戊基-2-側氧基-乙酸及其鹽所組成之群組中的1種以上。
  7. 如請求項1至6中任一項所述之多胜肽，其中前述序列識別號1表示的胺基酸序列中經改變的1個胺基酸殘基的序列為以序列識別號6表示，X為纈胺酸殘基的胺基酸序列、以序列識別號6表示，X為酪胺酸殘基的胺基酸序列、以序列識別號8表示，X為白胺酸殘基的胺基酸序列、以序列識別號11表示，X為組胺酸殘基的胺基酸序列、或以序列識別號12表示，X為麩胺酸殘基的胺基酸序列。
  8. 一種多胜肽，其包含位於以下部位的胺基酸殘基被改變的序列，該部位為序列識別號1表示的胺基酸序列中，相當在選自由第44位的組胺酸殘基、第117位的苯丙胺酸殘基、第141位的甲硫胺酸殘基、第156位的蘇胺酸殘基、第182位的組胺酸殘基、第186位的麩醯胺酸殘基、第253位的色胺酸殘基、以及第260位的離胺酸殘基所組成之群組中的1種以上的胺基酸殘基之部位。
  9. 如請求項8所述之多胜肽，其中 對於以前述式(1)表示的化合物A的任1種以上或其鹽與以前述式(2)表示的化合物B的任1種以上或其鹽的還原胺化反應、或者前述化合物B的任1種以上或其鹽的分子内還原胺化反應的觸媒活性，在至少一種反應條件下，較具有序列識別號1表示的胺基酸序列的多胜肽的前述觸媒活性更高。
  10. 如請求項1至9中任一項所述之多胜肽，其包含以序列識別號1表示的胺基酸序列中，位在相當於第253位的色胺酸殘基的部位之胺基酸殘基經由選自由酪胺酸殘基、纈胺酸殘基、蘇胺酸殘基、絲胺酸殘基、精胺酸殘基、麩醯胺酸殘基、脯胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基、甲硫胺酸殘基、白胺酸殘基、離胺酸殘基、異白胺酸殘基、組胺酸殘基、苯丙胺酸殘基以及丙胺酸殘基所組成之群組中的1種以上的胺基酸殘基所取代之序列。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之多胜肽，其包含以序列識別號6表示，X為纈胺酸殘基的胺基酸序列、以序列識別號6表示，X為酪胺酸殘基的胺基酸序列、以序列識別號8表示，X為白胺酸殘基的胺基酸序列、以序列識別號11表示，X為組胺酸殘基的胺基酸序列、或以序列識別號12表示，X為麩胺酸殘基的胺基酸序列。
  12. 一種胺基酸的製造方法，其包含以下步驟： 在如請求項1至11中任一項所述之多胜肽及還原劑的存在下，使選自由胺、胺類似物及其鹽所組成之群組中的1種以上與選自由酮酸、酮酸類似物及其鹽所組成之群組中的1種以上進行反應，或者 使選自由酮酸、酮酸類似物及其鹽所組成之群組的化合物於分子内進行反應之步驟。
  13. 如請求項12所述之製造方法，其中前述胺或胺類似物是以式(1)表示，且該式(1)中的R 1及R 2分別與請求項1的式(1)所述之R 1及R 2為相同定義。
  14. 如請求項12或13所述之製造方法，其中前述酮酸或酮酸類似物是以式(2)表示，且該式(2)中的式(1’)、式(3)、X、Y、Z 1、Z 2、R 1a、R 3、R 4、R 5、R 6、m、n、p、q及r分別與請求項1的式(2)所述之式(1’)、式(3)、X、Y、Z 1、Z 2、R 1a、R 3、R 4、R 5、R 6、m、n、p、q及r為相同定義。
  15. 如請求項12至14中任一項所述之製造方法，其中前述反應是在下述式(4)所表示的化合物C的存在下進行， [式(4)中， v及w各自獨立表示為0或1， v及w中的任1個以上表示1， T表示碳原子、磷原子或硫原子， 以下述式(4a)表示的官能基表示=O、-ORd或羥基， v及w共同為1時，存在複數個的式(4a)表示的2個官能基可為相同亦可為不同， Ra、Rb及Rc各自獨立表示為氫原子、C 1~C 3烷基、烷基胺基或-CH 2-ORd， Ra、Rb及Rc中的任2個以上可與T共同彼此連結而形成環結構， Rd表示C 1~C 3烷基， d、e及f各自獨立表示為0或1， d、e及f中的任一個以上表示1， v及w共同為1時，Ra、Rb及Rc中的任1個以上為甲基，Ra、Rb及Rc皆不彼此連結而與T共同形成環結構， Ra、Rb及Rc中的任1個以上為甲基胺基時，Ra、Rb及Rc皆不彼此連結而與T共同形成環結構， 式(4a)表示的官能基為羥基，且T為碳原子時，v為1，w為0，d、e及f皆為1，Ra、Rb及Rc皆為氫原子]。
  16. 如請求項12至15中任一項所述之製造方法，其包含以下步驟(A)及(B)： 步驟(A)：使含鋰物質與純化對象物接觸之步驟，該純化對象物為藉由如請求項12至15中任一項所述之方法所得之作為純化目標物的以下(i)與作為雜質的以下(ii)的混合物， (i)    N端具有保護基的前述胺基酸 (ii)  前述純化目標物以外的化合物， 步驟(B)：使前述純化目標物的鋰鹽析出之步驟。
  17. 一種胜肽化合物的製造方法，其包含以下步驟： (1) 根據如請求項12至16中任一項所述之方法，製造胺基酸之步驟；以及 (2) 將前述胺基酸與選自由其他胺基酸及胜肽所組成之群組的1種以上連結，以製造胜肽化合物之步驟。
TW111149813A 2021-12-28 2022-12-23 多胜肽及使用其之胺基酸的製造方法 TW202342741A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2023/017861 WO2023219156A1 (ja) 2022-05-13 2023-05-12 酵素及び添加剤を用いたアミノ酸及びペプチド化合物の製造方法
PCT/JP2023/017844 WO2023219152A1 (ja) 2022-05-13 2023-05-12 リチウム塩の析出工程を含む、アミノ酸の塩若しくはペプチド化合物の塩又はこれらの溶媒和物の製造方法

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021-215094 2021-12-28
JP2021215094 2021-12-28
JP2022-079712 2022-05-13
JP2022079708 2022-05-13
JP2022079712 2022-05-13
JP2022079711 2022-05-13
JP2022-079708 2022-05-13
JP2022-079711 2022-05-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202342741A true TW202342741A (zh) 2023-11-01

Family

ID=86558905

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111149813A TW202342741A (zh) 2021-12-28 2022-12-23 多胜肽及使用其之胺基酸的製造方法

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP4206322A3 (zh)
TW (1) TW202342741A (zh)
WO (1) WO2023127752A1 (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002306849A1 (en) 2001-03-21 2002-10-08 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Identification of essential genes in microorganisms
WO2003072770A1 (fr) * 2002-02-28 2003-09-04 Mitsubishi Chemical Corporation Nouvelle deshydrogenase et gene codant cette derniere
JP4590981B2 (ja) * 2003-08-26 2010-12-01 三菱化学株式会社 光学活性環状アミノ酸の製造方法
WO2013170050A1 (en) * 2012-05-11 2013-11-14 Codexis, Inc. Engineered imine reductases and methods for the reductive amination of ketone and amine compounds

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023127752A1 (ja) 2023-07-06
EP4206322A3 (en) 2023-09-06
EP4206322A2 (en) 2023-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5424531B2 (ja) ジペプチドまたはジペプチド誘導体の製造法
JP3447066B2 (ja) 水性溶液の形で保護された及び保護されていないジ− 及びオリゴペプチドの酵素による製造方法
US11459549B2 (en) Method for biocatalytic synthesis of Sitagliptin and intermediate thereof
US20230128192A1 (en) Methods for enzymatic peptide ligation
TWI226372B (en) Stereoselective reductive amination of ketones
TW202342741A (zh) 多胜肽及使用其之胺基酸的製造方法
WO2018004014A1 (ja) トランスグルタミナーゼ活性を有する組換えタンパク質
JP6675519B2 (ja) Ｄ型アミノ酸脱水素酵素
CN111254134B (zh) 腈基水解酶突变体及其在(s)-单腈单酸合成中的应用
US20070100561A1 (en) Crystals of DPP-IV
WO2023219156A1 (ja) 酵素及び添加剤を用いたアミノ酸及びペプチド化合物の製造方法
JP2008029239A (ja) Ｎ３６結合ペプチドの製造方法
TW202409292A (zh) 使用酵素及添加劑的胺基酸及胜肽化合物的製造方法
JPWO2014025023A1 (ja) γ−グルタミルバリルグリシン結晶の製造方法
US9453044B2 (en) Method of synthesizing peptides, proteins and bioconjugates
JP7333913B2 (ja) アンブレインの効率的製造方法
TW202411238A (zh) 包含鋰鹽的析出步驟之胺基酸的鹽或胜肽化合物的鹽或該些之溶劑合物的製造方法
JP5614477B2 (ja) Ｓａｒｓ３ｃｌプロテアーゼの組換えタンパク質
WO2023219152A1 (ja) リチウム塩の析出工程を含む、アミノ酸の塩若しくはペプチド化合物の塩又はこれらの溶媒和物の製造方法
EP1422293A1 (en) Crystal structure of dipeptidyl peptidase IV
CN113880947B (zh) 小分子抗体及其编码基因和制备方法及应用和药物组合物
JP2011239707A (ja) ペプチドの製造法
AU2017214761A1 (en) Proteinaceous compounds and uses therefor
KR101223665B1 (ko) 나이트릴레이즈 ｒｍｎ２을 이용한 카르복실산의 제조방법
KR101223664B1 (ko) 나이트릴레이즈 ｒｍｎ１을 이용한 카르복실산의 제조방법