TW202333793A - 作為創新填充劑之新玻尿酸衍生物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於與具有抗發炎及/或抗氧化性質之天然來源之分子共軛之新玻尿酸衍生物以及用於製造該等新玻尿酸衍生物之方法。此等生物活性分子與玻尿酸之共價鍵聯以及其網狀程度在該等生物活性分子之控制釋放及黏彈性方面提供獨特特性並且使該等所獲得玻尿酸衍生物對化學及酶降解穩定。此等新玻尿酸衍生物可用於製備有效作為軟組織填充劑(如真皮及皮下填充劑)之可注射真皮填充劑組成物。

Description

作為創新填充劑之新玻尿酸衍生物
本發明係關於多醣領域。更具體而言，本發明係關於使不同分子量之玻尿酸(HA)與具有抗發炎及/或抗氧化性質之天然來源之功能化分子交聯以及製造經交聯HA產物之新穎方法。含有藉由此等方法獲得之玻尿酸衍生物之可注射單相凝膠可在整容手術及醫學美容領域用作組織填充劑及用於組織增量。
玻尿酸(HA)係多醣，其係由藉助β-1,4糖苷鍵以線性方式鍵聯在一起之重複單體(葡醛酸鈉鹽及N-乙醯基葡萄糖胺雙醣單元)組成且屬於具有以下結構之醣胺聚醣之類別。
HA係在細胞外基質、玻璃狀液及軟骨中發現之天然聚合物。正常體重者(70 kg)中發現之HA之總數量係大約15g，且其平均周轉率係5g/天。人體中大約50%總數量之HA存在於皮膚中，且其具有24÷48小時之半衰期。HA係動物組織之基本組分中之一者：在皮膚層面，其以自由形式及與蛋白質組合之形式存在。HA因其保持水分之能力而賦予皮膚水合作用且因其使細胞外基質(使皮膚「緊致」之物質)聚集之性質而賦予張力。HA之缺乏導致皮膚之「支架」減弱，伴隨色調、水合及抵抗力之後續降低。根據純粹之審美標準，可供考量之基準係「皺紋之形成」。
就HA而言係不具有生物力學性質，此乃因在水存在之情況，其係液體而非凝膠。於皺紋下注射HA溶液以此將其提升並不具有效果，而且，由於係液體，其將在幾小時內由組織吸收。純HA在所謂的「生物刺激」中用作注射劑：由於係液體，其本身係刺激物且被注射其之組織迅速吸收。
為了獲得能夠支撐組織之重量且將其提升之凝膠(不僅在皮膚皺紋之情況下，而且在諸如膝蓋之退化關節之情形下)，HA必須化學轉化成凝膠。填充劑之玻尿酸凝膠(市售且用作醫療裝置者)係藉助工業方法製備以獲得生物力學性質(黏性及彈性)且整合至組織中。
在玻尿酸凝膠填充劑之製造製程期間，使用化學鍵聯劑，亦稱為交聯。最常用鍵聯劑中之一者係1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BBDE)，其能夠(多少穩定的)在玻尿酸絲之間形成鍵(Dermatol Surg 2013；39:1758–1766；DOI: 10.1111/dsu.12301)。結合在一起之股線變得如緊密網路一樣穩定，且整體變成固體凝膠。經交聯玻尿酸通常係黏性的，觸摸如凝膠狀且具有彈性性質以及取決於意欲之注射位點(亦即，臉頰、嘴唇、鼻唇溝等)而「訂製」之各種程度之硬度或軟度。注射後，此等填充劑顯示以月量化之可變持續時間，此等填充劑與組織整合，賦予其「形狀」及「持續時間」。交聯分子之數量以及其等形成之鍵之類型將使凝膠柔軟、緻密或堅硬：鍵越強且數值上越高，凝膠之剛性及硬度越大；相反，較弱且數值上較低之鍵將使凝膠較柔軟。此等經交聯HA填充劑之獨特流變特性可藉由其彈性模數(G')、其黏性(G’’)及溶脹因子(SwF)量測(Barnes HA；Handbook of Elementary Rheology，Institute of Non-Newtonian Fluid Mechanics，University of Wales，2000)；對於此最後一個流變參數而言，沒有與溶脹因子及治療後溶脹相關之臨床資料，此乃因可有助於判定組織溶脹之因子可係各種專屬交聯技術、注射技術、組織之品質等。
使用BBDE作為交聯劑製備之玻尿酸凝膠填充劑之實例揭示於國際專利申請案WO 2017/016917及WO 2005/097218；WO 2012/062775、WO 2013/028904、WO 2013/040242、WO 2016/051219及WO 2009/018076；WO 2017/001056、WO 2017/162676、WO 2016/074794、WO 2013/185934、WO 2017/001057、WO 2018/083195及WO 2017/076495中。
儘管未在文獻中闡述經水解BDDE之代謝，但應理解，此係藉助稱為細胞色素P450之酶家族之醚鍵斷裂進行。此等酶涉及有機分子之氧化降解且可催化醚鍵斷裂成醇。在降解後，可出現兩種主要產物：甘油及1,4-丁二醇。類似於所有二醇醚，亦已知，經水解BDDE係在尿中消除(Dermatol Surg 2013；39:1758–1766)。1,4-丁二醇已知為非誘變、非敏化且輕微刺激物(Ishikawa K. 1,4-butanediol. OECD SIDS CAS N° 110-63-4 2000:1–60；NICNAS 1,4-butanediol. Existing chemical hazard assessment report ISBN 978-0-9803124-7-8 2009，第1至25頁)。藉由對其代謝物執行之測試未識別到致癌可能性。在動物中觀察神經毒性不良效應，其中無可見不良效應水準(NOAEL)為100 mg/kg/天(根據小鼠中之口服投與判定)。1,4-丁二醇之半數致死劑量(LD50)係1.525 mg/kg (根據小鼠中之口服投與判定)。然而，用作工業溶劑之合成化合物之1,4丁二醇之長期效應未知。已知係在攝入時，其轉化成γ-羥基丁酸，一種主要作用於中樞神經系統之具有抑制效應的濫用藥物(N Engl J Med，第344卷，第2期，2001年1月11日，87-94)。
用於製備玻尿酸凝膠填充劑之其他交聯劑包含：硼酸衍生物，其屬於產生可逆鍵之烷基硼酸半酯之類別(WO2018/024795)；二胺及聚胺(己二胺、離胺酸單甲酯及3-[3-(3-胺基丙氧基)-2,2-雙(3-胺基-丙氧基甲基)-丙氧基]-丙胺)及碳化二亞胺(WO2013/040242)；檸檬酸(WO2018/087272)；內源性胺，如精胺及亞精胺及作為偶合劑之N-乙基,N-(二甲胺基丙基)-碳化二亞胺(WO2014/064632)；二乙烯基碸(WO2005/066215)；玻尿酸凝膠，其藉由自組裝獲得，其中羧基經活化以與同一多醣鏈或附近之其他多醣鏈上存在之醇基反應(EP0341745)；多組分縮合產物，其藉由涉及源自HA或衍生物之部分N-去乙醯基之羰基及胺基與醛及異腈一起之反應獲得(WO0218450)；甲醛、戊二醛、二乙烯基碸、聚酸酐、聚醛、多元醇、碳化二亞胺、醯氯、磺醯氯、環氧氯丙烷、乙二醇、丁二醇二縮水甘油醚、二縮水甘油醚、聚甘油聚縮水甘油醚、聚乙二醇二縮水甘油醚、聚丙二醇二縮水甘油醚及雙環氧化物或聚環氧化物，較佳地在丁二醇二縮水甘油醚或二乙烯基碸之存在下(EP1837347)。
KR 2018 0010361揭示藉由玻尿酸與1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)及兒茶酸反應獲得之經交聯玻尿酸。交聯鍵係醚型。
KR 2016 0031081揭示經多酚官能化之玻尿酸，其中多酚部分不充當交聯劑。
HA作為真皮填充劑之另一特性係其在生理條件下迅速降解。HA之降解可解釋為由糖苷鍵斷裂介導之解聚合過程。此解聚合可先於聚合物鏈在大分子層面上之解離(溶解及擴散)。HA之解聚合已在文獻中良好地表徵且主要涉及兩個機制：酶降解及自由基降解。統稱為玻尿酸酶之一大類酶介導HA之酶降解，此外，文獻中之數個報告指示，HA之自由基介導之降解藉助糖苷鍵之斷裂進行。HA分解代謝係在原位(例如，在細胞外基質中)、在細胞內或在轉移至淋巴結之後發生且將長HA鏈(多醣)轉變成較小HA單元(寡醣)。使用具有不同物理化學性質之多種經BDDE交聯之HA填充劑之兩個單獨研究顯示，BDDE改質不會干擾HA之天然酶降解機制(Jones D等人，Dermatol Surg 2010；36:804–9，Sall I等人，Polym Degrad Stab 2007；92:915–9)。
近年來，真皮填充劑之使用已顯著增加：自2000年之650,000增加至2015年每年大於2.4百萬且此因此已導致併發症之增加(美國美容整形協會(American Society of Plastic Surgeons)，2014年整形外科統計報告(2014 Plastic surgery statistics report)，https://www.plasticsurgery. org/ news/ plastic-surgery- statistics ? sub=2014+Plastic+Surgery+Statistics，2017年6月1日存取)。在大多數情形下，填充劑之使用對患者沒有臨床上顯著併發症，但取決於使用之增加以及臨床醫生培訓及經驗之較大可變性，併發症之總數量上升(Haneke E. Managing complications of fillers: rare and not-so-rare，J Cutan Aesthet Surg. 2015；8(4): 198-210)。根據美國食品藥品監督管理局(US Food and Drug Administration’s, FDA)、製造商及使用者裝置體驗(manufacturer and user device experience, MAUDE)資料庫，基於HA之填充劑Restylane ®、Belotero ®、Juvederm ®及Juvederm Voluma ®之併發症包括：腫脹、感染及結節形成。
即使此等併發症估計為所有注射HA填充劑之0.01%，亦需要更安全之基於HA之填充劑，以及開發具有增強之安全特性、對解聚合之穩定性及訂製化流變特性之新經交聯HA填充劑之可能性。實際上，一些完全合成之交聯劑之一些已知代謝物(舉例而言，如可能由BDDE產生之1,4丁二醇)之長期效應尚未完全闡明且促使研究更安全及天然衍生之交聯劑。
本發明揭示用於製造經交聯玻尿酸(HA)凝膠產物之新方法，該凝膠產物滿足以下要求：有效併入具有抗發炎及/或抗氧化性質之交聯劑、足夠凝膠強度以抵抗在植入時之變形及遷移以及相對於所採用天然HA增加對滅菌熱處理及酶水解之穩定性。因此，本發明允許利用驚人地低之化學改質之HA製造相對於非交聯HA具有增強之強度及有限溶脹程度之凝膠。
本發明之另一目的係提供具有交聯反應之模塊化效率之方法。本發明之另一目的係最小化獲得具有期望凝膠強度之HA凝膠產物所需之改質程度。本發明之另一目的係獲得相對於非交聯HA具有增強之活體內持續時間且同時具有有限程度之結構改質之HA凝膠產物。本發明之又一目的係獲得具有有用植入性質(包含黏彈性凝膠性質以及副產物及殘留物之純度)之HA凝膠產物。
根據本發明之所主張經交聯玻尿酸(HA)凝膠產物係自具有以下分子量之三種不同類型之玻尿酸製備： ●低分子量部分：8至15 kDa-優先用於新的非交聯衍生物之共軛及形成或作為賦予更多黏性性質之經交聯基質之一部分， ●中等分子量部分：500至750 kDa–此等部分可藉助錯流過濾經歷靶向純化以細化分子量範圍且使其盡可能接近該分子量範圍之上限，或原樣用於鍵聯， ●高分子量部分：1.5至3.0 MDa–此等部分用於完成調配物，其功能係支撐填充劑本身之結構，賦予更多彈性性質。
為了製備此新三模態(或三組分)填充劑，利用如虎杖苷(polydatin)、五倍子酸、綠原酸及根皮苷之天然及安全生物活性劑作為衍生物或交聯劑。
此等化合物具有如下共同特徵：係天然分子，通常存在於食物及飲料中，具有抗發炎及/或抗氧化性質，係水溶性的且具有可用於後續改質及與玻尿酸隨後結合之合適官能團(亦即，羥基及/或羧基官能團)。
特定而言，虎杖苷(化學名稱：3-羥基-5-[2-(4-羥基苯基)乙烯基]苯基β-D-葡萄哌喃糖苷；式2)係葡萄汁之主要組分，且係自然界中白藜蘆醇之最豐富形式。此分子已顯示寬範圍之生物活性，包含抗發炎、抗氧化、抗癌、神經保護、肝臟保護、腎臟保護及免疫刺激效應(Didem Sohretoglu等人，Recent advances in chemistry，therapeutic properties and sources of polydatin，Phytochemistry Reviews，第17卷，973–1005 (2018))。
此分子(即，茋類)係在位置3中經β-D-糖苷殘基取代之反式白藜蘆醇。虎杖苷具有6個羥基團，其中之兩者係酚型，反應性不同，其可用作後續衍化之錨定點。雙鍵之存在指示活性，此乃因不像順式，反式係有生物活性的。衍生化致力於改質兩個羥基(酚部分)或所有羥基，以此方式能夠將分子用作交聯劑及玻尿酸鏈之衍生物兩者。
五倍子酸(化學名稱：3,4,5-三羥基苯甲酸；式3)係在如五倍子、漆樹、金縷梅、茶葉及櫟樹皮之各種植物、蔬菜、堅果及水果中發現之天然次級代謝物。
五倍子酸係具有抗發炎及/或抗氧化活性之化合物，且基於可用文獻資料，在動物或臨床試驗中幾乎不展示毒性，從而使其可能用於發炎相關疾病之長期使用中(Nouri、F. Heibati、E. Heidarian，Gallic acid exerts anti-inflammatory, anti-oxidative stress, and nephroprotective effects against paraquat-induced renal injury in male rats，Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 2020)。文獻毒性資料證實，五倍子酸在較低濃度下對大多數細胞係安全的，僅在相對較高濃度下展示毒性效應：五倍子酸在白化小鼠中之急性毒性顯示，LD50大於2000 mg/kg (B.C. Variya等人，Acute and 28-days repeated dose sub-acute toxicity study of gallic acid in albino mice，Regul. Toxicol. Pharmacol 101 (2019) 71–78)。
綠原酸(化學名稱：(1S, 3R, 4R, 5R)-3-[[3-(3,4-二羥基苯基)-1-側氧基-2-丙烯-1-基]氧基]-1,4,5-三羥基-環己烷甲酸；式4)係藉由反式咖啡酸之羰基與奎尼酸之3-羥基之形式縮合獲得之肉桂酸酯，且首次係自綠咖啡豆分離(Freudenberg, Ber. 53, 237, 1920)。此化合物清除自由基，此抑制DNA損傷且可保護免於致癌作用之誘導。此外，此藥劑可上調免疫系統之活化中所涉及基因之表現並增強細胞毒性T淋巴細胞、巨噬細胞及天然殺手細胞之活化及增殖。
根皮苷(化學名稱：1-[2-(β-D-葡萄哌喃糖基氧基)-4,6-二羥基苯基]-3-(4-羥基苯基)-1-丙酮；式5)係屬於多酚類別之植物性化合物。根皮苷係在薔薇科家族(Rosaceae family)中之植物(包含蘋果、櫻桃及梨)之莖、根及樹皮中發現之糖苷。根皮苷之潛在及研究性用途包含2型糖尿病之輔助治療、作為用於肥胖症之減肥劑及高血糖症之急性管理(Diabetes Metab Res Rev 2005；21: 31–38)。
為了獲得與上文提及之生物活性劑共軛的呈溶液之低分子量HA衍生物，已用環氧氯丙烷或2-氯乙酸酐來衍生此等化合物。與低分子量HA之共價鍵聯不會產生三維網狀結構且於水中之最終衍生物不顯示凝膠之特性，而是顯示均勻溶液之外觀，其作為一種組分用於最終填充劑之 最終三模態(或三組分)結構化。
為了獲得中等分子量HA鏈之間之交聯，已藉由引入至少兩個反應性基團(環氧氯丙烷或2-氯乙酸酐)將生物活性劑改質，以幫助與玻尿酸鏈之後續交聯反應。在此情形下，共價鍵聯至中等分子量HA之虎杖苷、五倍子酸、綠原酸及根皮苷具有兩種作用：生物活性分子及成網劑。
縮水甘油基虎杖苷衍生物之製備係藉由使用環氧氯丙烷(EP)作為試劑及溶劑且有機銨鹽作為相轉移觸媒來實施。具體地，使用四丁基氯化銨(TBACl)或苄基三乙基氯化銨(BTEACl)。下文報告用於獲得虎杖苷之二縮水甘油化衍生物之以下合成方案(方案1)。
為了獲得虎杖苷之二縮水甘油基衍生物(化學名稱：(2R, 3S, 4S, 5R, 6S)-2-(羥甲基)-6-(3-(環氧乙烷-2-基甲氧基)-5-((E)-4-(環氧乙烷-2-基甲氧基)苯乙烯基)苯氧基)四氫-2H-哌喃-3,4,5-三醇)，利用以下實驗條件：使反應在100℃之溫度下、每莫耳虎杖苷使用20莫耳當量之EP及0.1當量之TBACl(或BTEACl)進行。此外，在此等條件下，3小時之反應時間足以達到最大轉化率。在此時間段之後，將反應混合物在室溫下冷卻，然後在劇烈攪拌下添加非質子有機溶劑、較佳地二異丙醚以獲得白色固體，將其回收。反應所獲得之粗製物可進一步藉由管柱層析在矽膠上純化以獲得虎杖苷二縮水甘油酸酯。
據吾人所知，(2R, 3S, 4S, 5R, 6S)-2-(羥甲基)-6-(3-(環氧乙烷-2-基甲氧基)-5-((E)-4-(環氧乙烷-2-基甲氧基)苯乙烯基)苯氧基)四氫-2H-哌喃-3,4,5-三醇；虎杖苷二縮水甘油酸酯)係新的。層析純化係獲得純產物所必需的，此乃因反應初級產物含有識別為以下之副產物：(2S,3R,4S,5S,6R)-2-(3-(3-氯-2-羥基丙氧基)-5-((E)-4-(環氧乙烷-2-基甲氧基)苯乙烯基)苯氧基)-6-(羥甲基)四氫-2H-哌喃-3,4,5-三醇。
利用2-氯乙酸酐製備虎杖苷衍生物係根據以下合成方案(方案2)來實施。
評估用以獲得2-氯乙醯化產物之不同溶劑。已發現，於乙酸乙酯(AcOEt)中之反應係最有利的，此乃因其允許分子或分子之混合物直接自反應混合物純化，而無需溶劑交換。反應係在無水條件下且在惰性氣氛(氮氣)下實施。將虎杖苷(1當量)懸浮於AcOEt中，且然後在室溫下在攪拌下添加6至12當量之單氯乙酸酐。使反應混合物在回流下持續5至10小時，然後冷卻且在室溫下攪拌24小時。然後，將反應混合物用水稀釋以得到白色固體沉澱，其藉由抽吸回收，用水洗滌並在室溫下在真空下乾燥，從而以91%產率獲得虎杖苷之六-氯乙醯基衍生物。據吾人所知，此化合物係新的。可獲得17 ± 3.4%/44.3 ± 8.8%/17.7 ± 3.6%/1.9 ± 0.4%之單、二、三及四-2-氯乙醯基虎杖苷酯之混合物。
五倍子酸與2-氯乙酸酐反應以獲得相應3,4,5-參(2-氯乙醯氧基)苯甲酸係報告於以下方案(方案3)中。
一般合成程序包括五倍子酸與4至8毫當量、較佳地6毫當量之2-氯乙酸酐之間於乙酸乙酯中的反應。反應溫度介於10℃與30℃之範圍內、較佳20℃至25℃。反應通常在約24小時內完成。有機相首先用酸性水溶液、較佳HCl 0.5M洗滌，然後用鹽水洗滌且隨後經由Na 2SO 4乾燥，過濾，且將濾液在真空下蒸發以獲得油性殘留物。然後將此油用水處理以獲得白色固體，然後將該白色固體在真空下乾燥。總體莫耳產率係79%。據吾人所知，此五倍子酸衍生物係新的。
五倍子酸及環氧氯丙烷之反應係根據以下合成方案(方案4)實施。
縮水甘油基衍生物之製備係藉由存在有機鹽(四丁基氯化銨，TBACl)作為相轉移觸媒之情況下將五倍子酸(GA)與EP混合來實施。在此反應中，EP充當試劑及溶劑兩者。GA與EP之間的相對莫耳比包括在1/14至1/18之範圍內、較佳地1/16。該程序涉及依序添加GA、TBACl及EP，隨後使混合物在介於60℃與100℃之間的溫度範圍內、較佳100℃下6個小時。然後，將反應混合物冷卻至室溫且用20% w/w NaOH溶液(2莫耳當量/OH)及0.1莫耳當量之TBACl處理。將所得白色懸浮液在室溫下劇烈搖晃，且然後將反應混合物用水稀釋四倍，用AcOEt萃取三次。將合併之有機相用飽和NaCl溶液洗滌，用無水Na 2SO 4脫水且在減壓下蒸發以獲得粗製物，該粗製物可進一步藉由層析純化以獲得期望產物。
類似地，獲得綠原酸及根皮苷之縮水甘油基及2-氯乙醯基衍生物。
然後，藉由使上文提及之虎杖苷衍生物與中等分子量之玻尿酸共軛來實施功能基質之製備。
在下文報告用於製備此等新玻尿酸衍生物之臨界參數。取決於所利用反應溶劑之類型、反應溫度及時間以及活化分子(亦即，用環氧氯丙烷及2-氯乙酸衍生之虎杖苷、五倍子酸、綠原酸及根皮苷)與玻尿酸之間的相對莫耳比，獲得黏性、彈性及穩定性(熱及酶)之不同特性。
溶劑之類型：由於輔助分子(虎杖苷、五倍子酸、綠原酸及根皮苷)之衍生決定其水溶性之顯著降低，因此有必要使用有機溶劑用於其溶解。在吾人實驗中，所使用溶劑係二甲亞碸(DMSO)，一種具有低毒性、極性及水溶性之溶劑。另一方面，呈其鈉鹽形式之玻尿酸完全溶於水且在DMSO中展現適度及有限之溶解性。基於此等考量，基於DMSO、H 2O及DMSO/H 2O混合物之使用評估不同反應條件。實驗證據指示，僅使用水不會促進共軛反應。使用DMSO作為唯一反應溶劑允許反應藉由產生共軛物來進行，該等共軛物一旦溶解於水中，即形成溶液。
吾人驚奇地發現，端視所使用H 2O之百分比而定，使用DMSO/H 2O混合物有助於製備水溶性共軛物及真正凝膠兩者。特定而言，使用1: 1比率之溶劑混合物有助於凝膠之形成。
反應溫度：反應溫度決定了多醣鏈上之取代度。所考量範圍包含30℃至80℃之範圍。此間隔之下限不會產生共軛，而在50℃下，反應開始發生。選擇50℃之溫度作為實施反應之最佳溫度，此乃因在此溫度下有證據表明共軛及凝膠形成。在引入結構之可能變化的同時，在80℃之上限下工作產生亦具有凝膠性質之經共軛結構。
反應時間：在反應條件設置之早期階段期間，實施製程中控制(IPC)以評估反應在先前所述條件下進展。動力學相當慢，且共軛之第一證據發生在3小時之後，顯著取代在大約15小時之後。如上文所提及，使用1:1比率之溶劑混合物允許在2小時內加速動力學過程。
經衍生輔助分子與玻尿酸之間的莫耳比：反應中使用之量以及特別地該等之間之莫耳比調節聚合物鏈上之取代度。所使用比率係1/1、1/5及1/10，該等比率表達為經衍生輔助分子(舉例而言，虎杖苷衍生物)之莫耳數與構成玻尿酸鏈之二聚單元之莫耳數之間之比率。吾人發現，1/5及1/1比率增加經共軛輔助分子之負載。
下文論述了使用三種不同分子量(HMW、MMW及LMW)之玻尿酸以及二縮水甘油酸酯虎杖苷(PO DG)製備凝膠所利用之反應條件及表徵。
此等反應條件進行微小修改應用於本發明之輔助分子 (亦即，五倍子酸、綠原酸及根皮苷)之所有縮水甘油基衍生物。
交聯度：交聯度較佳經選擇以給出小於1.0之黏性模數(G'')與彈性模數(G')之比率。當2-氯乙醯基虎杖苷用作交聯劑時，交聯度(表示為2-氯乙醯化虎杖苷相對於HA之重複單元之莫耳數之莫耳比)包括在1:5至1:10之間。
研究與交聯反應相關之以下臨界反應參數： ●PO DG與玻尿酸之間的相對莫耳比；調查以下莫耳比：5/1；1/1；1/5；1/10。 ●測試玻尿酸之三個部分：HMW、MMW、LMW ●考慮1小時及4小時、較佳地2小時之反應時間。
其他製程參數保持恆定：反應溫度始終係50℃且所使用溶劑係恆定1: 3或1:1 v/v比率之H 2O/DMSO混合物。
初步一般交聯程序涉及使用0.25M NaOH水溶液，其中使經定義分子量之玻尿酸在室溫下溶解(鹼性溶液之使用與溫度之間的平衡係相關的以使玻尿酸不降解)。因此，在製備階段期間，將玻尿酸在鹼性環境中在室溫下調節可變時間段(取決於分子量，自HMW之1小時至LMW之30分鐘)。
並行地，製備PO DG於DMSO中之溶液。虎杖苷利用環氧基團衍生化導致本身就相當低之水溶性的顯著降低。因此需要使用DMSO作為反應共溶劑。一旦兩種組分(玻尿酸及PO DG)溶解，即將DMSO溶液傾倒於0.25M NaOH中之玻尿酸溶液中並將溫度升高到50℃。將反應在攪拌下維持1小時或4小時。在反應結束時，需要使聚合物沉澱以消除過量試劑。為了與PO DG交聯，反應之後處理涉及添加低分子量醇、較佳地乙醇。在此等實驗條件下，聚合物顯現為沉積物且可藉由離心分離。最終步驟涉及使沉澱物在去離子水(MilliQ water)中水合，然後藉由滲析純化仍然存在之鹽。然後，藉由冷凍乾燥進行玻尿酸衍生物之最終分離。
在相同反應條件中使用具有MMW及LMW之HA證實，為了獲得具有PO DG之凝膠，最佳PO DG/HA比率係1/1，反應溫度係50℃且反應時間包括在1小時與4小時之間。
對所獲得凝膠樣本之熱滅菌實施之初步測試給出與穩定無菌凝膠調配物之開發相關之其他指示。實際上，利用聚2-氯乙醯化虎杖苷摻合物產生之凝膠不能承受熱應力。此處理在滅菌週期結束時產生溶液且不再為凝膠。該製程可能因酯鍵(其引起交聯且特別地熱不穩定)之水解而導致此等凝膠之解構。另一方面，利用二縮水甘油化虎杖苷(PO DG)產生之凝膠受到以如此廣泛之方式施加之熱應力影響，此乃因引起交聯之醚鍵較不易於熱降解。
基於此等滅菌結果，針對濕熱滅菌開發專門基於縮水甘油基化交聯劑之凝膠製劑，而2-氯乙醯化輔助交聯劑對於γ射線滅菌係較佳的。
本發明之經交聯玻尿酸可以1 mg/ml與50 mg/ml之間的量用於真皮填充劑組成物中，視情況存在包括在0.1與0.4%重量/體積之間之最終濃度的麻醉劑、較佳地利多卡因(lidocaine)。該等組成物將用於替換或填充生物組織或增加生物組織之體積用於整容目的之方法中。
本發明之可注射組成物係以無菌凝膠形式經皮內或關節內投與。可使用不同分子量之經交聯玻尿酸之混合物。
該等組成物可以套組之形式呈現，其包括使用說明及可能地其他有用藥劑。
本發明在以下實施例中詳述。 實施例1 虎杖苷二縮水甘油基化物(2R,3S,4S,5R,6S)-2-(羥甲基)-6-(3-(環氧乙烷-2-基甲氧基)-5-((E)-4-(環氧乙烷-2-基甲氧基)苯乙烯基)苯氧基)四氫-2H-哌喃-3,4,5-三醇)之製備
反應係在惰性氣氛(氬)下實施。將58 mg BTEACl (0.256 mmol，0.1莫耳當量)及4 mL環氧氯丙烷(51.2 mmol，20莫耳當量)添加至1.0 g虎杖苷(2.56 mmol)。將所得懸浮液在攪拌下加熱至100℃。在100℃下30分鐘之後，懸浮液變成透明稻草色溶液，繼續加熱3小時且使其冷卻至室溫。在反應混合物凝固之前，在劇烈攪拌下添加40 mL之二異丙醚。立即分離出白色固體並藉由用5 mL之相同溶劑洗滌來過濾。藉由TLC分析(CH 2Cl 2/MeOH 90/10)，所獲得之固體(1.18 g)由兩種化合物組成。
將所獲得粗製固體溶解於20 mL之MeOH中(藉助輕微加熱)，將7g之SiO 2添加至溶液且在旋轉蒸發儀中蒸發溶劑。將藉由機械真空抽吸完全移除MeOH後所獲得粉末之加載於SiO 2快速層析柱中，將其用CH 2Cl 2/MeOH 90/10 v/v溶析。第一溶析產物係自25 mL之乙醇結晶的3,449 mg (35%莫耳產率)虎杖苷之期望二縮水甘油基化衍生物。該化合物具有m.p.167℃至170℃，[α] D25℃=-50°(c 0.5，於MeOH中)及[α] D25℃=-36°(c 1，於DMSO中)。該化合物經受NMR分析( 1H、 13C、H,H COSY、ETCORR)，此允許所有信號被指派，從而確認結構。編號涉及式1中報告之式。 1H NMR (500 MHz, DMSOd6): δ 7.51 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-10 e 14), 7.19 (1H, d, J = 16.4 Hz, H-8), 7.00 (1H, J = 16.4 Hz, H-7), 6.98 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-11 e 13), 6.88(1H, br s, H-6), 6.82 (1H, br s, H-4), 6:55 (1H, m, H-2), 5.31 (1H, d, J = 4.9 Hz, C-2’上之OH), 5.12 (1H, d, J = 4.4, C-3’上之OH), 5.05 (1H, d, J = 5.2 Hz, C-4’上之OH), 4.87 (1H, d, J= 7.0 Hz, H-1’), 4.67 (1H, dd, J = 5.1 e 5.1 Hz, C-6’上之OH), 4.36 (2H, dd, J = 11.4 e 2.6Hz, H-1a” x 2), 3.84 (2H, dd, J = 11.4 e 6.6 Hz, H-1b” x 2), 3.74 (1H, dd, J = 10.4 e 5.2 Hz,H6a’), 3.46 (1H, m, H-6b’), 3.40-3.32 (3H, 重疊, H-5’ e H-2” x 2), 3.31-3.22 (2H,重疊, H-2’ e H-3’) 3.15 (1H, dd, J = 8.8 e 5.1 Hz, H-4’), 2.85 (2H, m, H-3a”x 2), 2.71 (2H, m, H-3b” x 2); 13C NMR (125 MHz, DMSOd6): δ 159.3 (C-12), 158.7 (C-1), 157.9 (C-3), 139.3 (C-5), 129.8 (C-9), 128.6 (C-8), 127.8 (C-10 e C-14), 126.0 (C-7), 114.7 (C-11 e C-13), 106.9 (C-6), 106.1 (C-4), 102.0 (C-2), 100.5(C-1’), 77.1 (C-5’), 76.7 (C-3’), 73.2 (C-2’), 69.8 (C-4’), 68.9(C-1” x 2), 60.7 (C-6’), 49.6 (C-2” x 2), 43.7 (C-3” x 2)。Ms光譜(ESI)顯示在m/z = 525.8處之峰，其對應於Na +添加至分子離子中。
第二溶析產物係副產物(261 mg)，該副產物係自15 mL之異丙醇結晶以得到顯示以下之固體：m.p. 138℃至141℃(dec.)；[α] D25℃ = -43°(c 1，於MeOH中)。
該化合物經受NMR分析( 1H、 13C、H,H COSY、ETCORR)且發現係由比率為約3:1之兩種極類似(且非層析可分離)之化合物之混合物組成，該兩種化合物在縮水甘油基及氯醇取代基之位置中不同。下文報告主要組分4A之NMR資料。編號系統報告於式2 (化學名稱：(2S, 3R, 4S, 5S, 6R)-2-(3-(3-氯-2-羥基丙氧基)-5-((E)-4-(環氧乙烷-2-基甲氧基)苯乙烯基)苯氧基)-6-(羥甲基)四氫-2H-哌喃-3,4,5-三醇)中。 1H NMR (500 MHz, DMSOd6): δ 7.53 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-10 e 13), 7.19 (1H, d, J = 16.4 Hz, H-8), 7.02 (1H, d, J = 16.4 Hz, H-7), 6.98 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-11 e 13), 6.89 (1H, br s, H-6), 6.81 (1H, br s, H-4), 6.52 (1H, br s, H-2), 5.58 (1H, d, J = 4.0 Hz, 3”’中OH), 5.30 ( 1H, d, J = 4.7 Hz, 2’中之OH), 5.11 (1H, d, J = 4.0 Hz, 3’中之OH), 5.05 (1H, d, J = 4.9 Hz, 4’中OH), 4.88 (1H, d, J = 7.3 Hz, H-1’), 4.67 (1H, dd, J = 5.0 e 5.0 Hz), 4.35 (1H, dd, J = 11.4 e 2.1 Hz, H-1”a), 4.03 (1H,m, H-2”’), 4.01 (2H, m, H-1”’a e 1”’b), 3.85 (1H, dd, J = 11.4 e 6.5 Hz, H”b), 3.75 (1H, dd, J = 11.1 e 4.4 Hz, H-3”’a), 3.73 (1H, m, H-6’a), 3.68 (1H, dd, J = 11.1 e 5.1 Hz, H-3”’b), 3.47 (1H, dd, J = 11.7 e 5.9 Hz, H-6’b), 3.38-3.33 (2H, 重疊, H-2” e 5’), 3.28 (1H, m, H-3’), 3.26 (1H, m, H-2’), 3.15 (1H, m, H-4’), 2.85 (1H, m. H-3”a), 2.71 (1H, m, H-3”b); 13C NMR (125 MHz, DMSOd6): δ 159.5 (C-3), 158.7 (C-1), 157.9 (C-12), 139.3 (C-%), 129.8 (C-9), 128.6 (C-8), 127.8 (2C, C-10e 14), 126.0 (C-7), 114.7 (2C, C-11 e 13), 106.8 (C-6), 106.2 (C4), 102.1 (C-2), 100.6 (C-1’), 77.1 (C-5’), 76.6 (C-3’), 73.2 (C-2’), 69.8(C-4’), 69.1 (C-1”’), 68.9(C-1”), 68.6 (C-2”’), 60.7 (C-6’), 49.6 (C-2”), 46.7 (C-3”’), 43.7 (C-3”)。 實施例2 - 虎杖苷六-2-氯乙醯基衍生物之製備
反應係在無水條件下且在惰性氣氛(氮)下實施。將虎杖苷(2.0 g，5.13 mmol)懸浮於AcOEt (16 ml)中，且然後在室溫下在攪拌下添加單氯乙酸酐(8.7 g，51.2 mmol)。使反應回流且在45分鐘之後觀察到溶液化。使反應混合物再回流6小時15分鐘，然後冷卻且在室溫下攪拌24小時。然後，添加20 mL之H 2O，且將所獲得混合物攪拌30分鐘。觀察到白色固體沉澱之形成。固體藉由抽吸過濾且用水(20 mL x 3)洗滌。將白色固體在真空下在室溫下乾燥48小時，獲得4.3g產物(91%產率)。 表徵：[α] D25 ℃= -12.00 (c = 1.0; CHCl3); 1H NMR (500 MHz, CDCl 3): δ = 7.51 (重疊, 2H, H-10及H-14), 7.16 (重疊, 2H, H-11及H-13), 7.07(d, J7,8 = 16.2 Hz, 1H, H-7), 7.04 (s, 1H, H-6), 7.01 (s, 1H, H-8), 6.97 (d, J7,8 = 16.2 Hz, 1H, H-8), 6.78 (s, 1H, H-2), 5.43 (t, J = 9.3Hz, 1H, H-3’), 5.37 (t, J = 9.3 Hz, 1H, H-2’), 5.25 (t app, J = 9.3 Hz, 1H, H-4’), 5.20 (d, J = 7.6 Hz, 1H, H-1’), 4.39-4.35(重疊, 2H; H-6a’ 及H-6b’), 4.33-4,29 (重疊, 4H, 2 x CH2Cl), 4.10 (s, 2H, CH2Cl), 4.07 (s, 2H, CH2Cl),4.06-4.00 (重疊, 5H, 2 x CH2Cl及H-5); 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ = 166.9 (2C, C6’處之CO及C3’處之CO), 166.2 (在C4’處之CO), 160.0 (在C2’處之CO), 165.8及165.7 (2C, 在Ph處之2 x CO), 157.1(C1), 151.3 (C3), 150.1 (C12), 140.0(C5), 134.7 (C9), 129.9 (C7或C8) 127.8 (2C, C10及C14), 127.3 (C7或C8), 121.5 (2C, C11及C13), 114.3 (C6), 113.6 (C4), 109.2 (C2), 98.5 (C1’), 73.6 (C3’), 72.1 (C2’), 71.6 (C5’), 69.5 (C4’), 63.2 (C6’), 40.8 (2C, CH2Cl),40.5 (CH2Cl), 40.3(CH2Cl), 40.2 (CH2Cl), 40.1 (CH2Cl). MS (ESI正離子): m/z: 851.0[M+H] +。 實施例3 - 自五倍子酸製備3,4,5-參(2-氯乙醯氧基)苯甲酸
將2-氯乙酸酐(3 g；17.6毫莫耳)在室溫下在攪拌下添加至五倍子酸(0.5g；2.94毫莫耳)於乙酸乙酯(3 ml)中之懸浮液中。反應係在室溫下進行且在24小時之後完成。然後，將反應混合物用HCl水溶液0.5M (6 ml)處理且攪拌0.5小時以分解過量酸酐。將有機相分離且用鹽水洗滌(3次)。將有機相經Na 2SO 4乾燥，過濾，且將濾液在真空下蒸發以獲得油性殘留物。然後，用水處理此油以獲得白色固體，將該白色固體在真空下乾燥(25℃持續10小時且50℃持續3小時)，以獲得0.925 g呈白色固體之產物(2.3毫莫耳；79%莫耳產率)。物理化學性質：m.p. 158℃至159℃; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 7.92 (重疊, 2H, C3及C7), 4.83 (s, 2H, CH 2Cl), 4.77-4.73 (重疊, 4H, 2 x CH 2Cl); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 165.2 (2C, 在C4處之COCH 2Cl及C6), 164.9 (C1), 164.3 (在C5處之COCH 2Cl), 142.6 (2C, C4及C6), 137.2 (C5), 129.7 (C2), 122.3 (C3及C7), 40.9(2C, 在C4處之COCH 2Cl及C6), 40.3 (在C5處之COCH 2Cl)。質譜法確認分子量與C13H9Cl3O8相對應。MS (ESI負離子性)[M-H]- m/z: 396.6 (100%), 398.7 (100%), 400.3 (45%)。 實施例4 - 自五倍子酸製備3,4,5-參(環氧乙烷-2-基甲氧基)苯甲酸環氧乙烷-2-基甲酯
反應係在惰性氣氛(氬氣)下實施以避免五倍子酸之可能氧化。向2.0 g (11.76 mmol)五倍子酸與TBACl (266 mg，1.18 mmol，0.1莫耳當量)之混合物中添加14.68 mL環氧氯丙烷(187.6 mmol，五倍子酸/環氧氯丙烷之莫耳比1:16)且將所得白色懸浮液在100℃下攪拌。30 分鐘之後，獲得稻草色溶液且在100℃下繼續攪拌6小時。冷卻至室溫之後，添加15.4 mL之20% w/w NaOH溶液(2莫耳當量/OH)及266 mg TBACl。將所得白色懸浮液在室溫下劇烈搖晃90分鐘。然後，添加60 mL水且用AcOEt (3 x 60 mL)萃取。將經合併有機相用飽和NaCl溶液(2 x 80 mL)洗滌，用無水Na 2SO 4脫水，且在70℃下在減壓下蒸發以得到2.50 g呈稻草色油之粗製物。將此粗製物藉由層析(快速層析)純化：藉由用石油醚/AcOEt 20/80溶析，獲得期望產物(1.01 g；22%產率)。所獲得樣本之 13C-NMR光譜資料與所公開文獻資料(Aouf, Chahinez; Tetrahedron 2013, 69(4),1345-1353)一致。 實施例5 - 根皮苷之七-氯乙醯基衍生物之製備
將系統在氬下乾燥，將根皮苷(200 mg，0.51 mmol)及單氯乙酸酐(0.7 g，4.09 mmol)懸浮於AcOEt中，使反應回流(80℃)以在幾分鐘後得到溶液，將溶液攪拌回流3小時且在室溫下過夜。在此時間段之後，添加單氯乙酸酐(0.3 g，1.75 mmol)且使反應回流4小時。添加6 mL 0.5 M HCl且攪拌30分鐘。將有機相用AcOEt (10 mL x 3)萃取3次；合併之有機相用飽和NaCl溶液(鹽水，12 mL)洗滌。有機相經Na 2SO 4乾燥且在真空下濃縮。將6 mL H 2O添加至油性殘留物且留在冰上，且20分鐘後再添加6 mL水。在用NaHCO 3且然後鹽水進一步洗滌後，將有機相經由硫酸鈉乾燥且在真空下濃縮。獲得呈白色固體殘留物之期望產物(345 mg，79%). m.p. 145℃至148℃; [α] D25= -19.00 (c = 1.0; CHCl 3); 1H NMR (500 MHz, CDCl 3): δ = 7.27 (重疊, 2H, H-11及H-14), 7.05 (重疊, 2H, H-12及H-14), 6.96 (d, J2,4 = 1.9 Hz, 1H, H-2), 6.82 (d, J4,2 = 1.9 Hz, 1H, H-4), 5.39 (t app, J3’,2’ = 9.4 Hz, 1H, H-3’), 5.31 (dd, J2’,1’ = 7.8, J2’,3’ = 9.4 Hz, 1H, H-2’), 5.17 (t app, J = 9.6 Hz, 1H, H- 4’), 5.07 (d, J = 7.8 Hz, 1H, H- 1’), 4.35 (dd, J3’,2’ = 2.5, J6a’,6b’ = 12.4 Hz, 1H, H-6a’), 4.33-4,28 (重疊, 5H, 2 x CH 2Cl 及 H-6b’), 4.14 (s, 2H, CH2Cl), 4.05-4.00 (重疊, 5H, 2 x CH 2Cl及H-5), 4.04 (s, 2H, CH 2Cl), 3.98 (s, 2H, CH 2Cl), 3.13-3.04 (m, 2H, H8a 及 H8b), 3.04-2.87 (m, 2H, H9a及H9b);13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ = 199.9 (C7), 166.9, 166.7 (2C, C6’處之CO及C3’處之CO), 166.2, 160.0 (2C, C4’處之CO及C2’處之CO), 165.1及165.0 (2C, 在Ph下2 x CO), 154.0 (C1), 151.5 (C3), 148.6 (C13), 147.3 (C5), 139.0 (C10), 129.8 (2C, C11及C15), 123.7 (C6), 121.1 (2C, C12及C14), 111.5 (C4), 107.7 (C2), 99.3 (C1’), 73.1 (C3’), 71.9 (C5’), 71.3 (C2’), 69.3 (C4’), 63.2 (C6’), 46.0 (C8), 40.9 (CH2Cl), 40.7 (CH 2Cl), 40.5 (CH 2Cl), 40.3(CH 2Cl), 40.2 (2C,CH 2Cl), 40.1 (CH 2Cl), 28.4 (C9); MS (ESI陽性): m/z: 973.1 [M+H] +。 實施例6 - 綠原酸之五(氯乙醯基)衍生物之製備
將系統在氬下乾燥，將綠原酸(200 mg，0.56 mmol)及單氯乙酸酐(0.677 g，3.96 mmol)懸浮於AcOEt中，使反應回流(浴80℃)，在15分鐘後得到溶液。將混合物攪拌6小時，然後添加6 mL 0.5 M HCl且將混合物再攪拌30分鐘。將反應混合物用AcOEt (10 mL x 3)萃取3次；所彙集之有機相用飽和NaCl溶液(12 mL)洗滌。有機相經Na 2SO 4乾燥且在真空下濃縮。將6 mL H 2O添加至油性殘留物，冷卻至0℃，獲得期望產物作為粉末(224 mg, 40%產率). m.p. 118℃至122℃; [α] D25= -21.00 (c = 1.0; CHCl 3); 1H NMR (500 MHz, CDCl 3): δ = 7.81 (d, J5',9' = 1.8 Hz, 1H, H-5'), 7.74 (dd, J9',5' = 1.8, J9',8' = 8.8 Hz, 1H, H-9'), 7.63 (d, J3',2' = 16.0 Hz, 1H, H-3'), 7.43 (d, J8',9' = 8.8 Hz, 1H, H-8'), 6.62 (d, J2',3' = 16.0 Hz, 1H, H-2'), 5.55-5.52 (m, 1H, H-6), 5.42-5.36 (重疊, 2H, H-4及H-5), 7.78-7.71(重疊, 4H, 2 x CH2Cl), 4.60-4.23 (重疊, 6H, 3 x CH 2Cl), 2.62 (dd, J7a,6 = 3.4, J7a,7b = 16.0 Hz, 1H, H-7a), 2.56-2.51 (重疊, 2H, H-3a及H-7b), 2.19 (dd, J3b,4 = 9.9, J3b,3a = 12.9 Hz, 1H, H-3b); 13C NMR (125 MHz, CDCl 3): δ = 170.3 (C1),166.9, 166.4, 166.1, 165.4, 165.3, 164.8 (6C, C1', 在C2處之CO, 在C6處之CO, 在C5處之CO, 在C6’處之CO, 在C7’處之CO), 143.2 (C3'), 142.7 (C7'), 141.6 (C6'), 133.2 (4'), 127.7 (9'), 124.0 (8'), 123.0(5'), 118.9 (C2'), 80.0 (2), 72.1 (C4), 69.5 (C6), 66.5 (C5), 41.4 (CH2C), 40.9 (CH 2Cl), 40.8 (CH 2Cl), 40.7 (2C, 2 x CH 2Cl), 35.8 (C3), 31.3 (C7); MS (ESI負離子): m/z: 負離子[M-H]- m/z:734.9 (100%) [M-H]-, 737.0 (80%) [M-H]-, 733.1 (65%) [M-H]-。 使用縮水甘油化化合物進行交聯之一般程序：玻尿酸與二縮水甘油化虎杖苷交聯
將100 mg玻尿酸鈉鹽(HANa)添加至2或4 mL 0.25 M NaOH (表1行A)且使混合物渦旋且在室溫下15分鐘。然後，添加溶解在1或2 mL DMSO (行D)中之虎杖苷二縮水甘油酸酯(PO DG)之0、25、50或78.2 mg溶液(表1行C)。PO PO DG:HANa (重複單元)莫耳比在行F中給出。將混合物在50℃下在攪拌下加熱2小時。然後，將其用1 M HCl (在4 mL 0.25 M NaOH之情形下大約0.95 mL且在2 mL 0.25 M NaOH之情形下0.4 mL)中和(pH ca 7)。添加5或10 mL EtOH (行G)以使聚合物沉澱，渦旋2分鐘且以4000 g離心10分鐘。在UV分光光度計中分析上清液(surn1)以判定存在之PO DG之mg (未與玻尿酸結合且與玻尿酸交聯之PO DG之比例不同；表1)。 表1.反應條件
行A 行B 行C 行D 行E 行F 行G 行H 行I 行L 行M
                  洗滌1 洗滌2 洗滌3及 下一步 凍乾後 之重量 自洗滌回收 之未結合 POdg
條目 測試編號 mL NaOH 0.25M 濃度 mg/mL mg PO DG mL DMSO %交聯劑 a 比率 b mL EtOH mL EtOH/H 2O 4:1 mL EtOH mg   
1 PR006* 4 25 25 1 20 1:5 10 5 4 90.7 100%
2 PR006A* 4 25 0 1 0    10 5 4 111.2 -
3 PR007* 2 50 25 1 20 1:5 5 5 4 106.5 71%
4 PR007A* 2 50 0 1 0    5 5 4 118.1 -
5 PR008* 2 50 25 1 20 1:5 5 5 4 91.4 66%
6 PR009* 2 50 25 1 20 1:5 2 H 2O +10 EtOH 5 4 111.6 63%
7 PR010* 4 25 25 1 20 1:5 10 5 4 109.8 95%
8 PR011* 2 50 25 1 20 1:5 5二-丙酮 5 acet/H 2O 4:1 4丙酮      
9 PR012* 2 50 50 2 40 1:2.5 5 5 4    63%
10 PR013* 2 50 78.2    62.5 1:1.6 5 5 4    67%
11 PRO15* 2 50 125 2 100 1:1 5 5 4 150 55%
12 PRO19** 2 50 125 2 100 1:1 5 5 4 100 80%
a% 交聯劑 = mol PO DG/mol HA(重複單元) x 100 b比率 = mol PO DG: mol HA(重複單元) *所利用中MW玻尿酸(500至750千道爾頓(KDalton)) **所利用低MW玻尿酸(8至15千道爾頓)
藉由與5 mL EtOH/H 2O 4:1渦旋來洗滌離心機中之沉降凝膠。將其如前所述離心，獲得上清液(surn2)。用4 mL EtOH重複洗滌數次，獲得相應上清液，將其藉由UV進行分析以判定存在之未結合PO DG之量(行M中之%)。在其中來自洗滌之上清液顯現輕微乳白色(指示不適於UV分析之可能膠狀分散液)之情形下，添加30 mg精細粉碎之NaCl且以4000 g再次離心10分鐘，然後進行UV分析。在最後一次洗滌之後，凝膠與5 mL H 2O水合過夜。然後，將其在-20℃下冷凍並冷凍乾燥。在表2中展示上清液之UV分析結果。 表2.UV分析結果，該等分析結果指示不同上清液中所含PO DG(亦即，未反應及交聯之PO DG)之mg且與經負載PO DG(經交聯PO DG之量)之差異
PR006    總mL 總PO DGmg              
   surn1 16.00 24.4              
   surn2 5.00 0.63              
   surn3 3.60 0.10              
      總PO DGmg 25.2 經回收(未反 應)PO DG% = 100 經交聯PO DG% = 0  
PR007    總mL 總mg              
   surn1 7.25 14.6              
   surn2 5.40 1.54              
   surn3 4.25 1.54              
      總PO DGmg 17.6 經回收(未反應) PO DG% = 71 PO DG% 經交聯= 29  
PR008    總mL 總mg              
   surn1 7.50 15.0              
   surn2 5.10 0.76              
   surn3 4.00 0.46              
   surn4 4.60 0.10              
   surn5 4.20 0.06              
   surn6 4.20 0.04              
   surn7 4.20 0.005              
      總PO DGmg 16.4 經回收(未反應) PO DG% = 66 經交聯PO DG% =44  
PR009    總mL 總mg                  
   surn1 14.50 15.3                  
   surn2 5.25 0.28                  
   surn3 4.25 0.05                  
   surn4 4.00 0.02                  
   surn5 4.25 0.01                  
      總PO DGmg 15.66 經回收(未反應) PO DG% = 63 PO DG% 經交聯= 47  
PR010    總mL 總mg                  
   surn1 15.00 23.1                  
   surn2 5.00 0.44                  
   surn3 4.50 0.08                  
   surn4 4.50 0.04                  
      總PO DGmg 23.70 經回收(未反應) PO DG% = 95 經交聯PO DG% = 5  
表2 (續)
PR012    總mL 總mg            
   surn1 6 11.30            
   surn2 5.5 5.16            
   surn3 4.2 2.66            
   surn4 4.3 3.96            
   surn5 4 1.44            
      總PO DGmg 24.53 經回收(未反 應)PO DG% = 49 經交聯 PO DG% = 51
PR013    總mL 總mg            
   surn1 6.2 27.45            
   surn2 5.3 6.71            
   surn3 4.3 3.70            
   surn4 4.25 3.91            
   surn5 4.25 1.82            
      總PO DGmg 43.59 經回收(未反應)PO DG% = 56 經交聯PO DG% =44
PR015    總mL 總mg      
   surn1 5.0 31.3      
   surn2 5.6 11.4      
   surn3 4.5 7.0      
   surn4 4.5 4.9      
   surn5 4.5 3.5      
   surn6 4.5 2.3      
   surn7 4.2 1.9      
   surn8 4.1 4.0      
   surn9 4,0 2.1      
   surn10 4.1 0.8      
      總PO DGmg 69,1 經回收(未反應)PO DG% = 55 經交聯 PO DG% =45
表2 (續)
PR019    總mL 總mg      
   surn1 7.25 92.0      
   surn2 5.25 5.8      
   surn3 4.30 0.7      
   surn4 4.00 0.5      
   surn5 4.20 0.2      
   surn6 4.20 0.1      
   surn7 4.00 0.1      
   surn8 4.00 0.0      
   surn9 4.50 0.1      
   surn10 4.20 0.0      
   總PO DGmg 99.6 經回收(未反應)PO DG% = 80 經交聯 PO DG% =20
利用UV分析來量化在HA與PO DG之成網反應中之PO DG
使用下文(圖A至C)報告之工作曲線，在λ = 322 nm下獲取讀數，針對於surn1及2，針對EtOH/H2O之4:1混合物獲取讀數，對於surn3及之後，針對EtOH獲取讀數。 使用氯乙醯基化合物進行交聯反應之一般程序:使玻尿酸與虎杖苷六-氯乙醯基衍生物(全氯乙醯化虎杖苷)交聯
使用中等分子量(MMW，500至750 kDa)或低分子量(LMW，8至15 kDa)之玻尿酸鈉鹽(HA)。針對該兩種分子量使用25及50 mg/mL之玻尿酸濃度實施交聯反應。在下文報告所執行測試，如在「一般程序」及在表1中所詳述。在洗滌及離心之後對上清液(surns)進行分析以評估總共存在之全氯乙醯化虎杖苷(POca)之總mg，其指示未結合之交聯劑之量及與HA上之經交聯POca之差異。結果顯示於表2中。 一般程序
將100 mg玻尿酸鈉鹽(HA)添加至2或4 mL H 2O且使混合物渦旋且在70℃下15分鐘。然後，添加溶解於2或4 mL DMSO中之0、21、42 mg全氯乙醯化虎杖苷(POca)之溶液。在行F中給出了POca:HANa(重複單元)之莫耳比(其等係1:5或1:10)。將混合物在70℃在攪拌下加熱15小時。然後冷卻至室溫，且添加5或10 mL EtOH或10 mL EtOH + 2 CH 3CN (行I)以使聚合物沉澱，渦旋2分鐘且以4000 g離心10 分鐘。在UV分光光度計中分析上清液(surn1)以判定存在之POca之mg。凝膠藉由與5 mL EtOH/H 2O 4:1渦旋或直接用4 mL CN 3CN來洗滌。使其如前所述離心，獲得上清液(surn2)。用4 mL EtOH重複洗滌數次以獲得相應上清液，藉由UV分析該等上清液以判定存在之未結合POca之量(表1’ P行中之%)。在一些情形中，用4 mL之CH 3CN洗滌， POca更易溶解於其中。在其中洗滌之上清液顯現出輕微乳白色(指示不適於UV分析之可能膠狀分散液)之情形下，添加30 mg之精細粉碎之NaCl且以4000 g再次離心10分鐘，並且然後進行UV分析。在最後一次洗滌之後，凝膠與5或10或20 mL H 2O水合過夜。然後，將其在冷凍器中在-20℃下冷凍並冷凍乾燥。
上清液之POca之UV量化分析結果顯示於表2’中。 表1’：反應條件
         A B C D E F G H I L M O P
                                    洗滌1 洗滌2 洗滌3 及下 一步 經冷凍 乾燥樣 本之重量 所結合 POca %
條目 樣本 HA mg HA mL H 2O mg/mL Mg POca mL DMSO 交聯劑 a% 比率 bPOca/HA t ℃ 時間 (小時) mL EtOH mL EtOH/H2O 4:1 mL EtOH mg   
0 PR030A MMW 100 2 50 0 2 - - 70 15 5 5 4 71.4 -
0 PR030B - - 2 - 42 2 - - 70 15 10 - - - -
1 PR028A MMW 100 2 50 42 2 20 1:5 70 15 5 5 4 159 80
2 PR028B MMW 100 4 25 42 4 20 1:5 70 15 10 5 4 141 77
3 PR028C LMW 100 2 50 42 2 20 1:5 70 15 15 5 4      
4 PR028D LMW 100 4 25 42 4 20 1:5 70 15 15 5 4      
5 PR032A MMW 100 2 50 21 2 10 1:10 70 15 10 5 4** 95 84
6 PR032B MMW 100 2 50 42 2 20 1:5 70 15 10 5 4** 135 77
7 PR032C LMW 100 2 50 21 2 10 1:10 70 15 12* - 4*    80
8 PR032D LMW 100 2 50 42 2 20 1:5 70 15 12* - 4*    81
a% 交聯劑 = mol POca/mol HA(重複單元) x 100 b比率 = mol POca/mol HA(重複單元) *用12 mL EtOH:CH 3CN (10:2, v/v)進行沉澱，所有上清液均使用4 mL CH 3CN而非EtOH獲得。 **上清液7、8、9係使用4 mL CH 3CN而非EtOH獲得。 表2’.洗滌之上清液中存在之POca之UV量化分析及交聯至HA之POca量
PR028A    總mL 總mg      
   surn1 6,3 4,7      
   surn2 5,5 1,3      
   surn3 4,5 0,7      
   surn4 4,4 0,8      
   surn5 4,2 0,4      
   surn6 4,2 0,2      
   surn7 4,0 0,2      
   surn8 4,2 0,1      
   surn9 4,5 0,1      
   surn10 4,5 0,1 在反應中加載之POca mg 42.0
      總POca mg 8,5 交聯至HA之POca mg 33,5
表2’(續)
PR028B    總mL 總mg      
   surn1 6,8 2,6      
   surn2 4,0 1,0      
   surn3 6,5 1,2      
   surn4 6,0 1,2      
   surn5 5,5 1,0      
   surn6 4,7 0,7      
   surn7 4,9 0,7      
   surn8 4,2 0,5      
   surn9 4,5 0,5      
   surn10 4,5 0,4 在反應中加載之POca mg 42
      總POca mg 9,8 交聯至HA之POca 32,2
PR032A    總mL 總mg      
   surn1 11,0 1,57      
   surn2 5,0 0,4      
   surn3 5,0 0,53      
   surn4 4,2 0,2      
   surn5 4,2 0,23      
   surn6 4,5 0,1      
   surn7 4,5 0,19      
   surn8 4,2 0,06      
   surn9 4,3 0,02      
   surn10 0 0 在反應中加載之POca mg 21
      總POca mg 3,3 交聯至HA之POca 17,7
PR032B    總mL 總mg      
   surn1 11,2 4,15      
   surn2 5 1,43      
   surn3 4,6 1,42      
   surn4 4,2 1,06      
   surn5 4,2 0,40      
   surn6 4,2 0,20      
   surn7 4,1 0,81      
   surn8 4,1 0,18      
   surn9 4,3 0,06      
   surn10 0,00 0,0 在反應中加載之POca mg 42
      總POca mg 9,8 交聯至HA之POca 32,2
PR032C    總mL 總mg      
   surn1 14,0 3,30      
   surn2 4,8 0,33      
   surn3 4,0 0,30      
   surn4 4,3 0,12      
   surn5 4,0 0,03      
   surn6 4,2 0,06      
   surn7 4,3 0,00      
   surn8 4,0 0,01      
   surn9 4,3 0,01      
   surn10 4,5 0,01 在反應中加載之POca mg 21
      總POca mg 4,2 交聯至HA之POca 16,8
PR032D    總mL 總mg      
   surn1 15,0 5,60      
   surn2 4,3 0,48      
   surn3 4,5 0,49      
   surn4 4,5 0,45      
   surn5 4,3 0,27      
   surn6 4,5 0,20      
   surn7 4,1 0,28      
   surn8 4,5 0,05      
   surn9 4,3 0,04      
   surn10 4,1 0,03 反應之POca mg 42
      總POca mg 7,9 未結合之POca mg 34,1
利用UV分析來量化在HA與POca之成網反應中之POca
使用下文顯示之工作曲線，在λ = 313 nm下獲取讀數，對於surn1及2，針對4:1 EtOH/H 2O混合物獲取讀數，對於surn3及以後，針對EtOH獲取讀數。在表中所展示之情形中，針對EtOH:CH 3CN 10:2或針對CH 3CN實施(參見圖A’至E’)。 所獲得填充劑之HPLC_SEC分析：與玻尿酸交聯之PO DG
藉由粒徑排阻層析法(SEC)、使用HPLC Column BioSep (5um SEC-s3000 290A)並且H 2O作為流動相，流速1mL/min，分析玻尿酸、二縮水甘油基化虎杖苷及填充劑批號PR019、PR015及PR008。以0.5 mg/mL之濃度(1 uL、5 uL、10 uL、25 uL)注射中等分子量HA且在322 nm (在此波長下PO DG吸收最大且HA較少)下及在220 nm及215 nm (其中HA吸收最大)下獲取光譜。注射25 uL之此等溶液；然後藉由注射以0.5 mg/mL之濃度適當溶液化之一些製備樣本進行。 表1”
   所注 射體 積 HA面積 (tr = 4 min), λ= 322 HA面積 (tr = 4 min), λ= 220 HA面積 (tr= 4 min), λ= 215 面積比率 220/322
HAm 0,5 mg/mL 1 uL 129 557 653 4,3
   5 uL 258 1083 1268 4,1
   10 uL 366 1448 1780 3,95
   25 uL 637 2517 3155 3,74
PR0006A mg/mL 0,5 25 uL 609 2330 2873 3,83
PR0007A mg/mL 0,5 25 uL 678 2811 3504 4,15
PR015 mg/mL 0,5 25 uL 3417 7261 8354 2,12
PR008 mg/mL 0,5 25 uL 1577 4477 5142 2,83
                 
HAl mg/mL 0,5 25 uL 637 2517 3155 3,74
PR019 mg/mL 0,5 25 uL 5098 9261 10236 2,12
PR019 mg/mL (新) 0,5 25 uL 4245    4477 5142 2,83
表1”中所報告之此等分析結果確認，HA與PO DG批號PR015、PR008及PR019之交聯衍生物含有可感測量之虎杖苷且進一步支持在表2中報告之填充劑中存在之虎杖苷之百分比。 藉由玻尿酸(不同分子量)與虎杖苷六氯乙醯基衍生物(POca)之反應獲得之填充劑之網狀度之NMR評估
亦在氘代氫氧化鈉(NaOD)中實施水解之後使用填充劑之NMR光譜研究藉由玻尿酸(不同分子量)與虎杖苷六氯乙醯基衍生物(POca)之反應獲得之填充劑之網狀度：結果表示為玻尿酸(HA)之N-乙醯基葡萄糖胺(d 1.80 0.5 ppm)與虎杖苷(PO)之雙鍵上反式質子(J H,H= 16.0)在6.93 0.5 ppm e 6.67 0.5 ppm之CH 3相關信號之間的比率(如在填充劑PR032D之 1H-NMR光譜1中所展示)。表2’中報告之資料進一步支持表1’中報告之玻尿酸上經結合虎杖苷之百分比之結果。
NMR資料確認以下假設： ●所獲得填充劑與高程度之乙醯化虎杖苷交聯，此乃因虎杖苷(PO)及玻尿酸(HA)自填充劑以與表1’中報告之彼等比率(經結合POca之%)一致之相對比率強鹼性水解釋放。 ●對於MMW及LMW玻尿酸兩者，相對於1:10，使用1:5之POca與HA之間的相對莫耳比(對於HA，考量之莫耳數係葡醛酸鈉鹽及N-乙醯基葡萄糖胺之重複二糖單元)獲得此等填充劑之更高網狀度。 材料及方法
將3 mg填充劑溶解於0.7 mL 0.5 M NaOD中(在一些實驗中，亦將樣本溶解於0.25 M NaOD中而無實質差別；在較稀之條件下工作，溶解時間增加幾分鐘)。NaOD係藉由在適宜無水容器中在氬氣氛下且在冰上(以避免非氘化水之可能干擾)將Na金屬溶解於D 2O中來以1M之濃度製備。然後，將1M NaOD溶液用D 2O以1:1 v/v稀釋以得到0.5M最終溶液，或1:4 v/v稀釋以得到0.25M最終溶液。以大於16之掃描數獲取 1H-NMR (500 MHz)光譜。將聚合物之光譜與以下各項比較：於NaOD 0.25M或NaOD 0.5M中之單獨的中等重量之玻尿酸；於NaOD 0.5M中之PR030A (在不添加全氯乙醯化虎杖苷之情況下實施反應；參見表1’)之光譜；於NaOD 0.5M中之單獨虎杖苷或單獨全氯乙醯化虎杖苷(後兩者明顯一致，此乃因於NaOD 0.5M中之全氯乙醯化虎杖苷水解成游離虎杖苷)。
評估玻尿酸之N-乙醯基葡萄糖胺之CH 3相關信號與虎杖苷之芳香族質子之間的關係。
在圖F中之1H-NMR光譜1自頂部至底部報告了於NaOD溶液中之HA、於NaOD溶液中之虎杖苷及填充劑 PR032D。 結果 表2”.
樣本 HA % 交聯劑 a 比率 bPOca/HA 經結合POca % NMR分析 HA/PO c
PR028A MMW 20 1:5 80 1:1
PR028B MMW 20 1:5 77 1:0.8
PR032A MMW 10 1:10 84 1:0.17
PR032C LMW 10 1:10 80 1:0.33
PR032D LMW 20 1:5 81 1:0.8
a% 交聯劑 = mol POca/mol HA(重複單元) x 100 b比率 = mol POca/mol HA(重複單元) c玻尿酸(HA)之N-乙醯基葡萄糖胺之CH 3相關信號與虎杖苷(PO)之芳香族質子之間的關係係在填充劑樣本在NaOD溶液中水解之後藉助於1H-NMR光譜評估。
圖A至圖C為利用UV分析來量化在HA與PO DG之成網反應中之PO DG； 圖A’至圖E’為利用UV分析來量化在HA與PO ca之成網反應中之PO ca；及 圖F報告於NaOD溶液中之HA、於NaOH溶液中之虎杖苷及填充劑PR032D之1H-NMR光譜1。

Claims (19)

  1. 一種與選自虎杖苷、五倍子酸、綠原酸、土耳其鞣酸及根皮苷之植物多酚的活化衍生物交聯之玻尿酸。
  2. 如請求項1之經交聯玻尿酸，其中，該等植物多酚的該等活化衍生物係縮水甘油醚(環氧乙烷-2-基-甲基醚)或2-氯乙醯基酯。
  3. 如請求項2之經交聯玻尿酸，其中，該活化衍生物選自：二縮水甘油化虎杖苷；六氯乙醯基虎杖苷；單、二、三及四2-氯乙醯基虎杖苷酯之混合物；五倍子酸之3,4,5-參(2-氯乙醯基)酯；3,4,5-參(環氧乙烷-2-基甲氧基)苯甲酸環氧乙烷-2-基甲酯；根皮苷之七-2-氯乙醯基衍生物；綠原酸之五氯乙醯基衍生物；3,4,5-參(環氧乙烷-2-基甲氧基)苯甲酸環氧乙烷-2-基甲酯；3,4,5-參(2-氯乙醯氧基)苯甲酸。
  4. 如請求項3之經交聯玻尿酸，其中，該等活化衍生物係虎杖苷或五倍子酸之縮水甘油醚或2-氯乙醯基酯。
  5. 如請求項3之經交聯玻尿酸，其中，單、二、三及四-2-氯乙醯基虎杖苷酯之相對莫耳比係17 ± 3.4%/44.3 ± 8.8%/17.7 ± 3.6%/1.9 ± 0.4%。
  6. 如請求項1至5中任一項之經交聯玻尿酸，其係自具有80至110 kDa之平均分子量Mn之玻尿酸獲得。
  7. 如請求項1至5中任一項之經交聯玻尿酸，其係自具有250至450 kDa之平均分子量Mn之玻尿酸獲得。
  8. 如請求項1至5中任一項之經交聯玻尿酸，其係自具有1.5至3.0 MDa之平均分子量Mn之玻尿酸獲得。
  9. 如請求項1至8中一或多項之經交聯玻尿酸，其具有交聯度以給出小於1.0之黏性模數(G'')與彈性模數(G')之比率。
  10. 一種製備請求項1至9中任一項之經交聯玻尿酸之方法，其包括在介於30℃至80℃、較佳地50℃至80℃範圍內之溫度下使呈水溶液之經交聯玻尿酸與呈二甲亞碸溶液之植物多酚之活化衍生物反應。
  11. 如請求項10之方法，其中，活化多酚衍生物與玻尿酸之莫耳比介於1:1至1:10之範圍內。
  12. 一種呈無菌凝膠形式之皮內或關節內可注射組成物，其包括請求項1至9中任一項之經交聯玻尿酸。
  13. 如請求項12之可注射組成物，其包括不同分子量之經交聯玻尿酸的混合物。
  14. 如請求項13之可注射組成物，其包括請求項6、7及8中任一項之經交聯玻尿酸。
  15. 如請求項12至14中任一項之可注射組成物，其包括1 mg/ml至50 mg/ml之經交聯玻尿酸，視情況存在濃度為0.1%至0.4%重量/體積之麻醉劑，較佳地利多卡因(lidocaine)。
  16. 一種化合物(2R,3S,4S,5R,6S)-2-(羥甲基)-6-(3-(環氧乙烷-2-基甲氧基)-5-((E)-4-(環氧乙烷-2-基甲氧基)苯乙烯基)苯氧基)四氫-2H-哌喃-3,4,5-三醇，其為下式 。
  17. 一種六-2氯乙醯基虎杖苷，其為下式 。
  18. 一種七-2-氯乙醯基根皮苷，其為下式 。
  19. 一種五-2-氯乙醯基綠原酸，其為下式 。
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