TW202320740A

TW202320740A - 神經細胞變性抑制用組成物

Info

Publication number: TW202320740A
Application number: TW111125345A
Authority: TW
Inventors: 福田壽之; 武田厚司; 池田大樹
Original assignee: 日商佐藤園股份有限公司; 日商萩原股份有限公司
Priority date: 2021-07-29
Filing date: 2022-07-06
Publication date: 2023-06-01
Also published as: JP2023019487A; CN115671083A

Abstract

本發明課題為開發一抑制神經細胞變性之手段。解決手段為一種神經細胞變性抑制用組成物，含有厄弗酚及/或去氫厄弗酚。

Description

神經細胞變性抑制用組成物

本揭示有關於神經細胞變性抑制用組成物等。另外，本說明書記載之所有文獻內容均藉由參照導入本說明書內。

已知神經細胞之變性會導致發生運動障礙。例如，帕金森氏症是一種進行性神經變性疾病，特徵在於中腦黑質-紋狀體多巴胺能(dopaminergic)神經的變性，會發生手腳顫抖、肌肉僵硬等運動功能障礙。然而，其變性・缺損(deflict)的原因尚未解明。由於多巴胺不穩定，會自動氧化而產生活性氧類，因此活性氧類被認為與多巴胺能神經之變性有關。

先行技術文獻非專利文獻非專利文獻1：Singhuber J, Baburin L, Khom S et al.: GABAA receptor modulators from the Chinese herbal drug junci medulla-the pith of juncus effuses. Planta med 78: 455-458 (2012) 非專利文獻2：Wang YG, Wang YL, Zhai HF et al.: Phenanthrens from juncus effusus with anxiolytic and sedative activities. Nat Prod Res. 26: 1234-1239 (2012) 非專利文獻3：Liao YJ, Zhai HF, Zhang B et al.: Anxiolytic and sedative effects of dehydroeffusol from juncus effusus in mice. Planta med. 77: 416-420 (2011) 非專利文獻4：Haruna Tamano, Ryusuke Nishio, Hiroki Morioka, Atsushi Takeda: Mol. Neurobiol., 56, 435-443 (2019). 非專利文獻5：Haruna Tamano, Hiroki Morioka, Ryusuke Nishio, Azusa Takeuchi, Atsushi Takeda: Mol. Neurobiol., 56, 4539-4548 (2019). 非專利文獻6：Haruna Tamano, Ryusuke Nishio, Hiroki, Morioka, Ryo Furuhata, Yuuma Komata, Atsushi Takeda: Mol. Neurobiol., 56, 7789-7799 (2019).

發明概要發明欲解決之課題本案發明人等建立下述假說：活性氧類(Reactive Oxygen Species；ROS)之過氧化氫產生而導致細胞內Zn ² ^＋恆定失調，是多巴胺神經變性的原因；並使用將多巴胺神經毒之6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine：6-OHDA)投予至大鼠單邊黑質緻密部之帕金森氏症模式進行驗證。本案發明人等已報導過6-OHDA會使黑質緻密部多巴胺能神經細胞內Zn ² ^＋水準過量增加、誘導細胞死亡、引起運動障礙(非專利文獻4~6)。

對此，本案發明人等認為，藉由開發抑制神經細胞變性之手段，有能夠治療該神經細胞變性所造成的病狀之可能性，並以開發如此手段為目的加以研討。

用以解決課題之手段本案發明人等獲得下述見解：厄弗酚及去氫厄弗酚能夠發揮神經細胞變性抑制效果；並進一步加以改良。

本揭示包含記載於例如以下項次之主題。項1. 一種神經細胞變性抑制用組成物，含有厄弗酚及/或去氫厄弗酚。項2. 如請求項1之組成物，其中神經細胞為多巴胺神經細胞。項3. 如請求項2之組成物，其用於發生多巴胺神經細胞變性之對象。項4. 如請求項1至3中任一項之組成物，其用於改善神經細胞變性所造成的運動障礙。項5. 如請求項1至4中任一項之組成物，其用於治療帕金森氏症。

發明效果藉由本揭示所包含之組成物、方法等，能夠抑制神經細胞變性。藉此，可期待神經細胞變性所造成之病狀(例如運動障礙)的恢復。

以下將針對本揭示所包含之各實施形態進一步詳細說明。本揭示宜包含神經細胞變性抑制用組成物等，但並不限定於此，本揭示包含本說明書所揭示且習於此藝者所知的全部。

本揭示所包含之神經細胞變性抑制用組成物含有選自於由厄弗酚及去氫厄弗酚所構成群組中至少一種化合物。有時將該組成物稱作本揭示組成物。

厄弗酚是以下結構式所表示的化合物。

[化學式1]

本揭示組成物所使用之厄弗酚可為合成品，亦可為將存在於自然界之物進行萃取及純化者。可利用習知方法或可自習知方法容易想到之方法來合成而獲得。又，亦可購入市售品來使用。在從自然界獲得之情況下，例如，已知厄弗酚是存在於藺草(燈心草)中，而可從藺草進行萃取及視需要之純化而獲得。例如可透過水、甲醇、乙醇、或該等中至少2種之混合液等進行萃取，並視需要純化而獲得。該萃取液並不特別限定，但宜為甲醇或40~60%乙醇水溶液。又，視需要，亦可進一步將獲得之萃取液再進行分餾及/或純化。分餾可透過例如液液分配萃取來進行。該分配可透過例如使用水、正己烷、及乙酸乙酯等來進行。又，純化可透過例如矽膠管柱層析法及/或高速液體層析法(HPLC)來進行。更詳細而言，例如可舉下述方法：減壓濃縮藺草之甲醇萃取液，使用水與正己烷進行液液分配萃取，於獲得之水層進一步添加乙酸乙酯以進行液液分配萃取，並層析(矽膠管柱層析法及高速液體層析法)乙酸乙酯層來純化。另外，供應於萃取之藺草部分亦無特別限制，可例如將藺草全草供應於萃取，亦可將藺草芯供應於萃取。

又，去氫厄弗酚是以下結構式所表示的化合物。

[化學式2]

本揭示組成物所使用之去氫厄弗酚可為合成品，亦可為將存在於自然界之物進行萃取及純化者。可利用習知方法或可自習知方法容易想到之方法來合成而獲得。在從自然界獲得之情況下，例如，已知去氫厄弗酚是存在於藺草(燈心草)中，而可從藺草進行萃取(及視需要之純化)而獲得。更詳細而言，例如可透過水、乙醇、或該等之混合液從藺草進行萃取而獲得。該萃取液特別以40~60%乙醇水溶液為宜，且特別宜為50%乙醇水溶液。又，視需要，亦可進一步將獲得之萃取液再進行分餾及/或純化。分餾可透過例如液液分配萃取來進行。該分配可透過例如使用水與乙酸乙酯來進行。又，純化可透過例如高速液體層析法(HPLC)來進行。又，供應於萃取之藺草部分亦無特別限制，可例如將藺草全草供應於萃取，亦可將藺草芯供應於萃取。藺草芯存在許多去氫厄弗酚，因此特別宜使用藺草芯。

本揭示組成物係用於抑制神經細胞(特別是腦神經細胞)變性。其中又宜用於抑制多巴胺神經細胞變性。又，所謂的神經細胞變性，包含神經細胞受到傷害的所有情況，例如包含神經細胞缺損、神經細胞死亡等。

又，如上所述，由於神經細胞變性會造成運動功能障礙發生，可期待藉由本揭示組成物抑制神經細胞變性來改善運動功能障礙。因此，本揭示組成物亦可用於改善神經細胞變性造成的運動功能障礙。特別是能夠適宜用於帕金森氏症的治療。

另外，本揭示組成物之使用對象宜為發生神經細胞(特別是多巴胺神經細胞)變性之對象，進一步更宜為發生運動功能障礙之對象。又，使用對象並不限定於人類。例如，亦可用於非人類哺乳動物。特別宜為作為寵物及家畜而飼養的哺乳動物。具體可例示狗、貓、猴子、牛、馬、綿羊、山羊、豬、兔子、小鼠、大鼠、駱駝、駱馬等。

本揭示組成物亦包含生體萃取物(宜為藺草萃取物)本身。亦即，含有厄弗酚及/或去氫厄弗酚之生體萃取物(以及視需要經純化者，或是視需要而進一步摻合其他成分者)，若能產生效果，亦被本揭示組成物所包含。

又，雖並非特別有所限制，但本揭示組成物宜為經口組成物或注射組成物。若為注射組成物，作為其投予方法，可例示經血管投予(例如經靜脈投予或經動脈投予)，或者直接投予至腦或脊髓之方法。又，若為經口組成物，可用作例如下述經口醫藥組成物或食品組成物。

另外，厄弗酚及去氫厄弗酚係具有菲骨架之化合物，就這點而言，嗎啡係具有菲骨架之化合物，其會通過血腦屏障；又，有報告指出去氫厄弗酚也會通過血腦屏障的可能性(上述非專利文獻3)。進一步，厄弗酚係不溶於水的脂溶性成分，就這點而言，其脂溶性並不高如脂肪酸，而可說是用以通過血腦屏障之適宜的脂溶性。由上述可認為：厄弗酚及/或去氫厄弗酚即使是藉由例如經口投予或經血管投予，亦可到達腦並發揮效果。

本揭示組成物可適宜使用作為醫藥組成物或食品組成物。使用作為醫藥組成物時，在該組成物(有時表示為「關於本揭示之醫藥品組成物」)中，可對厄弗酚及/或去氫厄弗酚(或者含有厄弗酚及/或去氫厄弗酚之生體萃取物)視需要摻合有藥學上容許之基劑、載劑、添加劑(例如賦形劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、溶劑、甘味劑、著色劑、口味調節劑、氣味改善劑、界面活性劑、保溼劑、防腐劑、pH調整劑、黏稠化劑等)等。如此基材、載劑、添加劑等已具體記載於例如醫藥品添加物辭典2016(股份有限公司藥事日報社)等，且可使用例如記載於其者。又，製劑形態亦無特別限制，可依常法混合有效成分及其他成分調製成例如錠劑、被覆錠劑、散劑、顆粒劑、細粒劑、膠囊劑、丸劑、液劑、懸浮劑、乳劑、凝膠劑、咀嚼劑、軟錠劑等製劑。例如，錠劑之製造可透過打錠法來進行。可使用以下任一方法：將混合好之原料直接打錠的直接打錠法、將混合好之原料做成顆粒後再打錠的顆粒打錠法。又，例如，在膠囊劑的情況，可為軟膠囊及硬膠囊之任一。

關於本揭示之醫藥組成物中厄弗酚及/或去氫厄弗酚的摻合量，若能發揮預防或改善記憶障礙之效果，則無特別限制，可依對象適宜設定。宜為0.0005~100質量%，較宜為0.005~90質量%，更宜為0.05~80質量%。再者，下限可為10質量%、20質量%、30質量%、40質量%、50質量%、60質量%、70質量%、或80質量%左右。

關於本揭示之醫藥組成物的投予時期並無特別限定，可考慮例如製劑形態、投予對象之年齡、投予對象之症狀的程度等來選擇適宜的投予時期。再者，投予形態雖無特別限制，然宜為經口投予及經血管投予(經靜脈投予、經動脈投予)。

關於本揭示之醫藥組成物的投予量可因應投予對象之年齡、投予對象之症狀的程度、其他條件等來適宜選擇。特別是，可以所含有之厄弗酚及/或去氫厄弗酚量為基準，在不損及效果之範圍內適宜設定。雖無特別限制，例如成人每一日所投予之厄弗酚及/或去氫厄弗酚的量宜為0.5~100mg左右，較宜為1~50mg左右，且更宜為5~30mg左右、6~24mg左右、10~24mg左右、或12~24mg左右。再者，可1日1次或分成複數次(宜為2~3次)投予。在非人類哺乳動物之情況下，亦可參考該人之情況來設定適宜的投予量。

將本揭示組成物使用作為食品組成物(例如飲食品或食品添加物)時，該組成物(以下有時記載為「關於本揭示之食品組成物」)可摻合厄弗酚及/或去氫厄弗酚(或者含有厄弗酚及/或去氫厄弗酚之生體萃取物)，以及食品衛生學上容許之基劑、載劑、添加劑、其他可利用作為飲食品之成分・材料等。例如，可例示含有厄弗酚及/或去氫厄弗酚之預防或改善記憶障礙用的加工食品、飲料、健康食品、機能性食品、營養補助食品、補充品、保健機能食品、特定保健用食品、營養機能性食品、機能性表示食品、或病患用食品(醫院食品、病人食品或照護食品等)等的食品組成物。雖無特別限制，然該食品組成物所摻合之厄弗酚及/或去氫厄弗酚為生體萃取物(宜為藺草萃取物)時，亦可為例如摻合有該萃取物之加工食品、健康食品、營養機能食品、特定保健用食品、補充品、病患用食品等。又，亦可將厄弗酚及/或去氫厄弗酚做成例如粉末狀等，並使之含在飲料類(果汁等)、點心類、麵包類、湯類(包含粉末湯等)、加工食品等各種飲食品中。再者，所謂醫院食品是住院時所提供的餐食，病人食品是病人用的餐食、所謂照護食品是被照護者用的餐食。關於本揭示之食品組成物可適宜使用作為特別是住院、在宅療養等之患者，或者受到照護之患者且感到記憶障礙之對象者用的醫院食品、病人食品或照護食品。

就健康食品(營養機能食品、特定保健用食品等)、補充品而言，在調製關於本揭示之食品組成物時，為了容易進行持續性的攝取，宜調製成例如顆粒、膠囊、錠劑(包含咀嚼劑等)、飲料(飲料劑)等形態，其中，膠囊、片劑、錠劑之形態因攝取簡便之特性而為佳。惟，並未特別受到該等所侷限。顆粒、膠囊、錠劑等形態的關於本揭示之食品組成物可使用藥學及/或食品衛生學上容許之載劑等，並依照常法來適宜調製。又，即便調製成其他形態時，亦可依照以往的方法。

關於本揭示之食品組成物中厄弗酚及/或去氫厄弗酚的摻合量，只要能發揮效果則無特別限制。宜為0.0005~100質量%，較宜為0.005~90質量%，更宜為0.05~80質量%。再者，下限可為10質量%、20質量%、30質量%、40質量%、50質量%、60質量%、70質量%、或80質量%左右。

關於本揭示之食品組成物的攝取量、攝取對象等，例如宜與上述關於本揭示之醫藥組成物相同。

本揭示亦包括下述：一種神經細胞變性抑制用組成物之製造方法，包含摻合厄弗酚及/或去氫厄弗酚之步驟；以及，一種藉由投予厄弗酚及/或去氫厄弗酚(宜為上述含有厄弗酚及/或去氫厄弗酚之神經細胞變性抑制用組成物)來抑制神經細胞(尤其是腦神經細胞，特別是多巴胺神經細胞)變性的方法，甚至是改善運動功能障礙的方法等。該等方法中的各種條件如上所述。

再者，本說明書中所謂的「包含/含有」，亦包括「實質上由…所組成」與「由…所組成」(The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of.")。又，本揭示包含本說明書中說明的所有構成要件之任意組合。

又，針對上述本揭示各實施形態說明之各種特性(性質、結構、功能等)，於特定本揭示包含之主題時，可為任意組合。換言之，本揭示包含所有本說明書所記載可組合之各種特性的任意組合所構成的主題。

實施例以下將舉例並更具體說明本揭示之實施形態，然本揭示之實施形態並未受限於下述例。另外，大鼠係使用從日本SLC股份有限公司購入之Wistar系大鼠。

調製(i)含有6-羥基多巴胺(6-OHDA；從SIGMA-ALDRICH購入)800μM之生理食鹽水、(ii)含有6-OHDA 800μM及厄弗酚200μM之生理食鹽水、或者(iii)含有6-OHDA 800μM及去氫厄弗酚200μM之生理食鹽水，用於以下的探討。

(實驗1)在50分鐘內將6-OHDA(800μM)與厄弗酚(200μM)或者去氫厄弗酚(200μM)一起投予1μL至大鼠腦之單邊黑質緻密部。關於投予，具體而言是在經麻醉的大鼠頭蓋上開洞，並將注射套管(內徑：0.15mm，外徑：0.35mm)插入黑質緻密部來進行。投予結束10分鐘後，使用APF(胺基苯基螢光素，Aminophenyl Fluorescein)的螢光測定黑質細胞內ROS水準，此時，相較於投予生理食鹽水(對照組)，單獨投予6-OHDA的細胞內ROS(活性氧類)水準有顯著上升，該上升能被厄弗酚或者去氫厄弗酚的同時投予抑制(圖1)。另外，AFP會與活性酵素反應而顯示強烈螢光。又，圖1中的圖表，是將顯微鏡照片中以白色虛線圍住的部分之螢光毛強度(相對值)數值化的圖表。又，該以白色虛線圍住的部分為「黑質緻密部」。以下圖亦同。

(實驗1-2)與實驗1同樣地，在50分鐘內將6-OHDA(800μM)與厄弗酚(200μM)或者去氫厄弗酚(200μM)一起投予1μL至大鼠腦之單邊黑質緻密部。投予結束10分鐘後，使用HYDROP的螢光測定黑質細胞內過氧化氫水準，此時，相較於投予生理食鹽水(對照組)，單獨投予6-OHDA的細胞內過氧化氫水準有顯著上升，該上升能被厄弗酚或者去氫厄弗酚的同時投予抑制(圖2)。另外，HYDROP為特異性檢測H ₂O ₂(過氧化氫)的螢光探針。

(實驗2)測定了過氧化氫誘發性之黑質細胞內Zn ² ^＋水準上升。與實驗1同樣地，在50分鐘內將6-OHDA(800μM)與厄弗酚(200μM)或者去氫厄弗酚(200μM)一起投予1μL至大鼠腦之單邊黑質緻密部。投予結束10分鐘後，6-OHDA的單獨投予導致黑質細胞內Zn ² ^＋之水準顯著上升，然該上升能完全被厄弗酚或者去氫厄弗酚的同時投予抑制(圖3)。另外，係使用鋅離子檢測用螢光探針之ZnAF-2DA(五稜化藥股份有限公司)來測定Zn ² ^＋量。

(實驗2-2)進一步，使用酪胺酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)免疫染色來探討厄弗酚或者去氫厄弗酚針對神經細胞死亡的效果。與實驗1同樣地，在50分鐘內將6-OHDA(800μM)與厄弗酚(200μM)或者去氫厄弗酚(200μM)一起投予1μL至大鼠腦之單邊黑質緻密部。投予結束二週後，將大鼠麻醉，使用冰冷4%多聚甲醛(ice-cold 4% paraformaldehyde)灌流並將腦摘出。自固定後的腦在-20°下作成切片，使用抗酪胺酸羥化酶抗體(anti-tyrosine hydroxylase antibody)(Abcam)、Alexa Fluor 633山羊抗兔二次抗體(Alexa Fluor 633 goat anti-rabbit secondary antibody)(ThermoFisher)處理切片，並進行多巴胺神經標記物之酪胺酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)的免疫染色。6-OHDA的單獨投予導致位於黑質緻密部的TH陽性細胞達約50%，觀察到約半數的多巴胺神經變性。該神經變性能完全被厄弗酚或者去氫厄弗酚的同時投予抑制(圖4)。

由以上結果可推測：即使是對於顯現運動障礙的實驗模式動物，厄弗酚及去氫厄弗酚也有充分的效果(可改善運動障礙)。

再者，厄弗酚及去氫厄弗酚皆是使用將藺草(全草或芯)之50%乙醇水溶液萃取液進一步純化而獲得者。圖5顯示將藺草全草50%乙醇水溶液萃取液或藺草芯50%乙醇水溶液萃取液進行HPLC分析而獲得之層析圖。針對藺草芯的萃取、分餾及純化，詳述如下。將市售之燈心草(燈心草科燈心草之莖髓乾燥者)5kg在20倍量之50%含水乙醇中且80℃加熱下，進行2次2小時回流萃取，並過濾。將濾液在減壓下濃縮，於濃縮液添加1.3公升之蒸餾水使之懸浮，添加1.3公升的乙酸乙酯並以分液漏斗進行液液分配萃取。將其反覆3次，分成水層與乙酸乙酯層。乙酸乙酯是在減壓下蒸餾去除溶劑並乾燥而獲得乙酸乙酯抽取物26.2g。將該乙酸乙酯抽取物以矽膠管柱層析法(510毫升)分餾成從A至M之13個餾分(溶出液：含有2%甲醇之氯仿~含有40%甲醇之氯仿)。將餾分F及G以分取HPLC進行純化，獲得化合物1(0.218公克)、化合物2(1.725公克)。將化合物1及2測定NMR譜，而分別鑑定為厄弗酚及去氫厄弗酚。

(無)

圖1顯示將用於作成帕金森氏症模式的6-OHDA同時與厄弗酚或去氫厄弗酚投予至大鼠單邊黑質緻密部時，使用螢光試劑測定細胞內活性氧類(ROS)量的結果。圖2顯示將用於作成帕金森氏症模式的6-OHDA同時與厄弗酚或去氫厄弗酚投予至大鼠單邊黑質緻密部時，使用螢光試劑測定細胞內過氧化氫量的結果。圖3顯示將用於作成帕金森氏症模式的6-OHDA同時與厄弗酚或去氫厄弗酚投予至大鼠單邊黑質緻密部時，使用螢光試劑測定細胞內Zn ² ^＋量的結果。圖4顯示將用於作成帕金森氏症模式的6-OHDA同時與厄弗酚或去氫厄弗酚投予至大鼠單邊黑質緻密部時，使用酪胺酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)免疫染色測定變性神經細胞量的結果。圖5顯示將藺草全草50%乙醇水溶液萃取液或藺草芯50%乙醇水溶液萃取液進行HPLC分析而獲得之層析圖。

Claims

一種神經細胞變性抑制用組成物，含有厄弗酚及/或去氫厄弗酚。
如請求項1之組成物，其中神經細胞為多巴胺神經細胞。
如請求項2之組成物，其用於發生多巴胺神經細胞變性之對象。
如請求項1至3中任一項之組成物，其用於改善神經細胞變性所造成的運動障礙。
如請求項1至4中任一項之組成物，其用於治療帕金森氏症。