TW202317748A - 一種生產玻尿酸之乳酸菌株、其用途以及組合物 - Google Patents

Abstract

本發明係提供一種可有效生產玻尿酸之新穎乳酸菌菌株，該乳酸菌菌株係為副干酪乳桿菌CMU566（ Lactobacillus paracasei CMU566），寄存於台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC911070。本發明亦提供人體試驗可佐證本發明之實用性及有效性，並提供關於本乳酸菌株之組成物及其用途。

Description

一種生產玻尿酸之乳酸菌株、其用途以及組合物

本發明係關於一種益生菌株及其用途，特別係關於一種新穎複方乳酸菌株，以及其應用於生產玻尿酸之用途。

玻尿酸（Hyaluronan、Hyaluronic acid），又稱透明質酸、玻璃醣醛酸、琉璃醣碳基酸，是一種由雙糖（D-葡萄糖醛酸及N-乙醯葡糖胺）基本結構組成的糖胺聚糖。由於玻尿酸具有相當好的吸水保濕性，而且具有黏彈性，對人體也具有良好的生物相容性，且不引發抗原過敏反應，因此，玻尿酸可廣泛應用在食品、乳製品、飲料、藥品、美妝保養品和醫療用品等。

在人體內，玻尿酸廣泛存在於結締組織、上皮組織和神經組織中，以玻尿酸鹽形式在皮膚、臍帶及玻璃體液中，平均體重75公斤的正常人體內約含16克玻尿酸，其中約三分之一每天被分解並重新合成，但隨著年齡增加玻尿酸會逐漸減少，因此，越年輕的肌膚或關節含玻尿酸越多，所以皮膚越柔軟、有彈性且關節潤滑。玻尿酸減少時肌膚會逐漸失去保水能力，除了因年齡增加而需要補充外，若工作壓力大、熬夜生活、不均衡飲食習慣、紫外線傷害，或長期在冷氣房工作等因素，也很容易造成玻尿酸和肌膚水份的流失。

玻尿酸目前已廣泛地應用在醫學上，舉例來說，玻尿酸注射於膝關節可改善退化性骨關節炎，含有玻尿酸鈉活性成分的潤膚產品可被用於緩解皮膚乾燥（例如由異位性濕疹引起的乾皮症）。對於一些癌症，患者體內玻尿酸濃度可反映預後情況。因此，玻尿酸也被作為前列腺癌與乳腺癌的標誌物。玻尿酸也可用於監控癌症病程。同時，玻尿酸已被用於合成具有癒創功能的生物支架。這類支架中的玻尿酸及與其相連的纖連蛋白可以促進細胞向創口處遷移。這一作用對於傷口不易癒合的糖尿病人尤其重要。在白內障手術及其他手術中，玻尿酸亦被用於促進術後組織修復，也可幫助眼部組織中的流體液，而有助於保護眼睛。

目前市售可食用的玻尿酸主要係來自於雞冠以及流行鏈球菌的發酵。其中以雞冠萃取來源被廣泛應用於關節和皮膚之保健食品訴求，然而，從雞冠萃取玻尿酸在食用安全上依然有人畜共通疾病病毒感染之疑慮，且價格相當昂貴，並無法廣泛應用於保健食品供廣大民眾食用。另外，流行鏈球菌是一種流行性致病細菌，可引起多種動物感染發病，臨床症狀主要表現為敗血症、腦膜炎和關節炎等，因此，此來源的玻尿酸有食用上的風險疑慮存在。

為解決上述問題，本發明提供一種新穎乳酸菌株，係篩選自健康新生兒並且為一般公認安全的菌種（GRAS），該乳酸菌株可有效地生產玻尿酸。該乳酸菌株係為副乾酪乳桿菌（ Lactobacillus paracasei）CMU566（寄存編號為BCRC911070）。

本發明亦提供一種乳酸菌株用於製備生產玻尿酸組合物之用途，其中該乳酸菌株係為副乾酪乳桿菌（ Lactobacillus paracasei）CMU566（寄存編號為BCRC911070），且該乳酸菌株係為具有活性或去活性的菌株。

本發明另提供一種用於生產玻尿酸的組合物，包含：生產玻尿酸之副乾酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）CMU566（寄存編號為BCRC911070）乳酸菌株，其中該些菌株在腸道內可生產玻尿酸，在腸道產生的玻尿酸可經由腸道吸收，以提升血液中玻尿酸的含量；且該菌株可在腸道中存活和繁殖而增加該乳酸菌株總數量，該乳酸菌株可為活性或去活性的菌株。

在本發明之一實施例中，其中該組合物可作為食品、飲料、飲食補充物、乳製品、藥品、美妝保養品和醫療用品等。

在本發明另提供一種乳酸菌株之用途，其係將如本發明之乳酸菌株或其代謝產物，應用於製備提升玻尿酸之食品、飲料、飲食補充物、乳製品、藥品、美妝保養品和醫療用品等。

本發明所分離純化之乳酸菌株，係篩選自健康新生兒，且此菌株具有良好的耐膽鹽、耐胃酸特性，因此，可通過人體消化道，順利進入腸道生長。更特別的，本發明之乳酸菌株在腸道內可生產玻尿酸，使人體在服用後體內的玻尿酸含量提升。因此，本發明之乳酸菌株或其代謝產物可應用於食品、飲料、乳製品、藥品、美妝保養品和醫療用品等。

為使熟習本發明所屬技術領域之一般技藝者能更進一步了解本發明，下文特列舉本發明之數個較佳實施例，並配合所附圖式，詳細說明本發明的構成內容及所欲達成之功效。

本發明所分離純化之乳酸菌株CMU566，係篩選自健康新生兒，經純化培養及菌種鑑定後，該乳酸菌株CMU566係為副乾酪乳桿菌（ Lactobacillus paracasei），係寄存於新竹食品工業發展研究所編號為BCRC911070。

本發明之該乳酸菌株CMU566係源自於大量收集健康新生兒及母乳來源之乳酸菌，接著以玻尿酸分析方法測試篩選可大量發酵生產玻尿酸的菌株，而獲得該乳酸菌株CMU566其玻尿酸產量最高。再以模擬人體消化道實驗證實該乳酸菌株CMU566具有良好的耐胃酸及耐腸膽鹽特性，因此可順利通過人體消化道，最後分析該乳酸菌株CMU566之腸道吸附能力，證實可進入腸道中定殖生長。此外，經證實本發明之該乳酸菌株CMU566，具有改善腸道菌叢，及保持關節潤滑、增加皮膚彈性之潛力，因此，可製成能有效提升體內玻尿酸之食品、飲料、飲食補充物、乳製品、藥品、美妝保養品和醫療用品等。

（一)乳酸菌收集

本實驗中受測的多種乳酸菌株，其來源包括：購自生物資源保存及研究中心（BCRC，台灣，新竹）、自行篩選自中部區域的多家醫院及坐月子中心等之出生嬰兒糞便、成人糞便、水果、坊間傳統泡菜食品及動物來源等。該些乳酸菌株經分離後，依序以Catalase試驗、革蘭氏染色（Gram stain）、鏡檢及運動性之實驗分析，初步確認為乳酸菌。該些乳酸菌株以Lactobacilli MRS broth（含0.02% L-cysteine）在37℃下培養24小時後，以15%甘油之MRS broth保存於-70℃冰箱。

（二）篩選分析可生產玻尿酸之菌株及其耐受性試驗

本發明根據咔唑法（carbazole method）測定玻尿酸的含量（Bitter and Muir,1962, Anal. Biochem.4, 330-334）。將前述收集的該些乳酸菌株，進行MRS培養液發酵48小時後，培養液以無菌過濾膜過濾，濾液再以4倍體積的95%酒精沉澱3次以去除非糖類的成份，然後將沉澱物溶解溶解在等體積的緩衝溶液中。取1毫升（mL）的樣本與標準品溶液加入每個試管中並放置冰上，加入3 ml試劑A（0.381公克四硼酸鈉加400毫升硫酸溶解，避光冷藏），將試管移至沸水浴中10分鐘，再置於冰上冷卻至室溫後，再加入0.1毫升試劑B（試劑B：0.15公克咔唑（carbazole）加100毫升乙醇溶解，避光冷藏），將試管移至沸水浴中15分鐘，再置於冰上冷卻至室溫，最後利用分光光度計以波長525奈米（nm）測量吸光值。

實驗結果發現篩選自健康新生兒的該乳酸菌株CMU566之玻尿酸生產量最高，進一步分析CMU566乳酸菌株是否能安全抵達腸道，發揮玻尿酸分泌的功能，因此執行人體消化道模擬試驗，包括菌株的耐胃酸性試驗和耐膽鹽試驗，以及腸道吸附能力。實驗步驟如下說明:

（1）耐胃酸性試驗

分析方法參考Zavaglia et al.（1998）之研究報告修飾之。取經隔夜培養活化的乳酸菌菌液1毫升，以pH 7.2磷酸鹽緩衝溶液清洗一次，再以去離子水回溶菌體，取100微升（μl）上述菌液分別加入不同pH值（pH2.0、2.5及7.2）之9.9 毫升無菌磷酸鹽緩衝溶液中。菌液與緩衝溶液充分混合後，置於37℃、轉速80 rpm培養箱，3小時後立刻取出1毫升以pH7.2之磷酸鹽緩衝溶液進行序列稀釋，以MRS瓊脂培養基（MRS agar）在37℃培養48小時，計算存活之乳酸菌菌數。

（2）耐腸膽鹽試驗

膽鹽對乳酸菌生長之影響，乃依Lin et al. （2006）及Gilliland and Walker（1990）所述方法修飾之。將隔夜培養活化的乳酸菌菌液，各取100微升分別加入10毫升MRS broth或添加0.3 % （w/v）牛膽汁（ox gall, Sigma）之MRS肉湯培養基（MRS broth）中，進一步於37℃培養8小時後取1毫升菌液，加入9毫升pH 7.2的磷酸鹽緩衝溶液（PBS）中進行連續稀釋，利用傾注平板計數法（pour plate count method）與MRS瓊脂培養基混合培養分析菌數，以評估受試乳酸菌在膽鹽存在下的菌數生長。此外，於0、2及4小時取出1毫升菌液離心，以磷酸鹽緩衝溶液回溶懸浮後利用分光光度計分析其OD 600 nm之吸光值，並計算耐膽鹽能力（%），公式如下所示：Bile tolerance （%） = （Increment of OD 600 nm in MRS broth with bile salt / increment of OD 600 nm in MRS broth without bile salt）×100。

（3）腸道附著性試驗

此分析方法乃參考Lin et al.（2006）和Sarem et al.（1996）等學者之研究步驟。

a.人體腸道細胞株Caco-2以1毫升0.05%胰蛋白酶（Trypsin）處理5分鐘後，以手擊培養瓶輕輕將細胞拍下，分裝於96孔的培養盤中，每個孔洞中加入1×10 ⁴個細胞，每天換200微升新鮮的DMEM培養基。

b.接著加入20微升乳酸菌菌液於細胞中，接著培養1小時使乳酸菌附著。

c.乳酸菌附著1小時後，倒除培養基，以磷酸鹽緩衝溶液清洗5次以去除未附著之乳酸菌，加入100微升、10﹪甲醛溶液（formalin），30分鐘，固定細胞及細菌，再以磷酸鹽緩衝溶液洗3次，最後以100微升結晶紫（Crystal violet）進行染色，五分鐘後以少量75％酒精快速沖洗，去除細胞上的染色劑。

d.利用相位差顯微鏡觀察乳酸菌對腸道上皮細胞的吸附性，隨機在不同的顯微鏡視野（randomized microscopic areas）下，觀察並計算50個細胞的乳酸菌吸附情形，最後計算每個細胞平均吸附的乳酸菌數量。

（三）對大腸桿菌的殺菌力試驗

所用之方法乃根據Koga et al. （2002） and Lorca et al. （2001）之步驟修飾之。將篩選出的乳酸菌接種到10毫升MRS培養液，經過48小時發酵後，分別加入100微升的大腸桿菌菌液並混合均勻後，於0、2、4小時分別取100微升的共培養菌液於無菌磷酸鹽緩衝溶液中進行10倍連續稀釋，以Coliform培養基進行塗抹後培養於37℃，2天後計算大腸桿菌之存活菌數。

（四）菌株鑑定

不同屬種的微生物必有其獨特的核酸序列，以乳酸菌而言，通常以16S rDNA基因序列進行菌種鑑定。因此，本發明之該乳酸菌株CMU566乃委託財團法人食品工業發展研究所分析16S rDNA序列（如序列辨識編碼：1所示），經鑑定為副乾酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），現已寄存於新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC911070。分析結果如本發明一併附上之菌種鑑定報告所示。

（五）乳酸菌株CMU566於不同發酵時間之玻尿酸生產濃度分析

為了觀察該乳酸菌株CMU566在腸液中之玻尿酸生產分泌曲線，乃將該乳酸菌株CMU566培養於以MRS培養基調製的模擬人工腸液中，經過72小時發酵培養，並於培養6、12、24、48及72小時的時間點收集發酵菌液，用以進行玻尿酸濃度分析。

（六）乳酸菌株CMU566在人體之有效性試驗為了證實該乳酸菌株CMU566對人體之有效性，乃進行12人之人體臨床試驗，年紀為30歲至50歲之間女性，以自體比較方式進行，受試者每日服用一次含有1*10 ¹⁰CFU以上劑量之包埋保護的CMU566乳酸菌粉末。在服用第0、1、3、5及7天，收集受試者的血清樣本以人類玻尿酸免疫分析套組進行分析。實驗步驟為將100微升的不同濃度的玻尿酸標準液及受試者的血清樣品加入已經披覆玻尿酸抗體的培養盤（coating plate）的每個孔洞中，於37℃之條件下培養2小時，然後去除孔洞內的液體，再加入100微升的生物素-抗體（Biotin-antibody），再37℃之條件下培養1小時進行反應，再加入HRP（horseradish peroxidase）-avidin，1小時37℃培養後清洗5次以去除未連結的試劑，最後加入100微升的TMB受質進行反應30分鐘後，加入50微升終止呈色反應，在5分鐘內利用免疫酵素分析儀以450nm波長測量吸光值。

實驗結果

請參照第1圖所示，其繪示將有玻尿酸生產潛力的菌株進行比較的結果，數據顯示該乳酸菌株CMU566之玻尿酸產量最高。

請參照第2圖所示，其顯示具有玻尿酸較高產量的乳酸菌培養在人工模擬胃液中各菌株的耐酸性試驗。數據顯示該乳酸菌株CMU566具有非常良好的胃酸耐受性。

請參照第3圖所示，其顯示具有玻尿酸較高產量的乳酸菌培養在人工模擬腸液中測試各菌株的耐膽鹽性試驗。數據顯示該乳酸菌株CMU566具有非常良好的膽鹽耐受性，因此可在腸液中穩定生長。

請參照第4圖所示，其顯示具有玻尿酸較高產量的乳酸菌對腸道細胞吸附性試驗。實驗證實該乳酸菌株CMU566具有腸道細胞之吸附能力。

請參照第5圖所示，其繪示具有玻尿酸較高產量的乳酸菌對大腸桿菌的殺菌能力試驗。實驗證實該乳酸菌株CMU566對致病菌具有相當優異的殺菌能力。

請參照第6圖所示，其繪示該乳酸菌株CMU566在模擬人工腸液中，不同發酵時間偵測其玻尿酸生產濃度曲線圖。實驗顯示該乳酸菌株CMU566在發酵培養24小時即可達到玻尿酸最高生產濃度為每毫升1460微克（µg/mL）。

請參照第7圖所示，其繪示12位受試者在服用本發明之該乳酸菌株CMU566第0、1、3及5天後，受試者血液中的平均玻尿酸濃度表現。實驗證實，受試者血液中的平均玻尿酸濃度隨著時間而逐漸增加，顯示該乳酸菌株CMU566確實能在人體腸道中持續生產玻尿酸，同時可被腸道吸收，使血液中的玻尿酸濃度上升。

綜上所述，本發明之該乳酸菌株CMU566除了可生產高濃度的玻尿酸之外，且該菌株具有耐胃酸、耐腸膽鹽及具有腸道細胞吸附能力，因此能順利到達腸道中於腸道內且進行有效繁殖同時生產出高量的玻尿酸，因此，可製成有效提升體內玻尿酸之食品、飲料、飲食補充物、乳製品、藥品、美妝保養品和醫療用品等形式。 以上所述僅為本發明之較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做之均等變化與修飾，皆應屬本發明之涵蓋範圍。

無

第1圖繪示多種具玻尿酸生產潛力的菌株的比較示意圖。 第2圖繪示多種乳酸菌株於人工模擬胃液的耐酸性試驗的結果示意圖。 第3圖繪示多種乳酸菌株於人工模擬腸液中各菌株的耐膽鹽性試驗的結果示意圖。 第4圖繪示多種乳酸菌株於腸道細胞吸附性試驗結果的示意圖。 第5圖繪示多種乳酸菌株對大腸桿菌的殺菌力試驗結果的曲線示意圖。 第6圖繪示本發明之乳酸菌株在模擬人工腸液於不同發酵時間所偵測的玻尿酸生產濃度的曲線示意圖。 第7圖繪示本發明之CMU566乳酸菌在人體試驗中血液的平均玻尿酸濃度的長條示意圖。

副乾酪乳桿菌（ Lactobacillus paracasei）CMU566菌株，於2021年8月12日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號：BCRC911070。

                         序列表 (SEQUENCE LISTING)
          <![CDATA[<110>  領航生技股份有限公司]]>
          <![CDATA[<120>  一種生產玻尿酸之乳酸菌株、其用途以及組合物]]>
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          ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcttttgat cacctgagag     1020
          atcaggtttc cccttcgggg gcaaaatgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt     1080
          cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tatgactagt tgccagcatt     1140
          tagttgggca ctctagtaag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca     1200
          aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggatgg tacaacgagt     1260
          tgcgagaccg cgaggtcaag ctaatctctt aaagccattc tcagttcgga ctgtaggctg     1320
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          acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatga gagtttgtaa cacccgaagc     1440
          cggtggcgta acccttttag gagcgagccg tctaa                                1475
          

Claims (10)

1. 一種生產玻尿酸之乳酸菌株，其中該乳酸菌株係為副乾酪乳桿菌（ Lactobacillus paracasei）CMU566，寄存於台灣新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC911070。
2. 如申請專利範圍第1項所述之乳酸菌株，其中該乳酸菌株的來源為健康新生兒。
3. 一種乳酸菌株在製備用於生產玻尿酸的組合物之用途，其中該乳酸菌株係為副乾酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），寄存於台灣新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，CMU566寄存編號為BCRC911070。
4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該乳酸菌株係為具有活性或去活性的菌株。
5. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該乳酸菌株係經發酵培養後產生代謝產物，將該代謝產物用於生產玻尿酸的組合物。
6. 一種用於生產玻尿酸的組合物，包含： 生產玻尿酸之乳酸菌株或其代謝產物，該乳酸菌株係為副乾酪乳桿菌（ Lactobacillus paracasei），寄存於台灣新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心， CMU566寄存編號為BCRC911070。
7. 如申請專利範圍第6項所述之組合物，其中該乳酸菌株可於腸道內可生產玻尿酸，在腸道產生的玻尿酸可經由腸道吸收，以提升血液中玻尿酸的含量。
8. 如申請專利範圍第6項所述之組合物，其中該乳酸菌株能在腸道內有效繁殖而增加該乳酸菌株數量。
9. 如申請專利範圍第6項所述之組合物，其中該乳酸菌株係為具有活性或去活性的菌株。
10. 如申請專利範圍第6項所述之組合物，其中該組合物可為食品、飲料、飲食補充物、乳製品、藥品、美妝保養品和醫療用品等。

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