TW202309277A - 病毒載體組合物及其使用方法 - Google Patents

病毒載體組合物及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202309277A
TW202309277A TW111116322A TW111116322A TW202309277A TW 202309277 A TW202309277 A TW 202309277A TW 111116322 A TW111116322 A TW 111116322A TW 111116322 A TW111116322 A TW 111116322A TW 202309277 A TW202309277 A TW 202309277A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
nucleic acid
acid sequence
length
sequence
gene
Prior art date
Application number
TW111116322A
Other languages
English (en)
Inventor
熊強
周彬
Original Assignee
美商邏輯生物療法公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商邏輯生物療法公司 filed Critical 美商邏輯生物療法公司
Publication of TW202309277A publication Critical patent/TW202309277A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本文中提出用AAV載體構築體改善基因編輯之組合物及方法。

Description

病毒載體組合物及其使用方法
由功能失調基因引起之遺傳疾病佔全球疾病之大部分。基因療法正成為一種有前景之治療形式，旨在減輕遺傳疾病之影響。
在本揭示案之前，某些利用同源重組之AAV基因療法(例如，GENERIDE™)採用包含相同長度之同源臂的病毒載體組合物。本揭示案認識到，一定長度(例如，各自至少750 nt或至少1000 nt)之同源臂尤其可展示改善之編輯活性。在一些實施例中，本揭示案認識到，當同源臂具有不同長度時，一定長度(例如，各自至少750 nt或至少1000 nt)之同源臂可展示編輯活性之額外改善。
替代地或另外，本揭示案進一步涵蓋認識到載體設計中先前未識別之問題。部分地，本揭示案涵蓋認識及觀測到最佳化之載體設計，包括特定同源臂長度及/或各同源臂之長度之間的比率，在物種之間可能不同。如本文所證明，一個物種或一個物種之模型系統(例如，野生型小鼠、人源化小鼠、嵌合小鼠)中之最佳設計可能不同於另一個物種或另一個物種之模型系統(例如，野生型小鼠、人源化小鼠、嵌合小鼠)中之彼等最佳設計。
本揭示案尤其提供用於改善病毒載體(包括AAV載體)之設計及/或生產的方法及技術。根據各種實施例，本揭示案提供病毒載體構築體之某些序列元件(例如，同源臂序列)可能顯著影響基因編輯效率之見解。在一些實施例中，本揭示案證明，在特定時間點(例如，出生後時間點)投與本文所述之一或多種病毒載體組合物(例如，包含平衡或不平衡同源臂)可提高編輯效率。在一些實施例中，基於靶細胞或組織生長階段(例如，對應於一或多個物種之特定年齡)來選擇投藥時間點。
在一些實施例中，本揭示案提供重組病毒載體，該等重組病毒載體包括編碼以下之聚核苷酸序列中之至少一者：1)第一核酸序列及第二核酸序列，其中該第一核酸序列包含至少一個外源基因序列且該第二核酸序列位於該第一核酸序列之5'或3'且在整合至靶整合位點中之後促進兩個獨立基因產物之產生；2)第三核酸序列，該第三核酸序列位於聚核苷酸之5'且包含與該靶整合位點之基因體序列5'同源之序列；及3)第四核酸序列，該第四核酸序列位於該聚核苷酸之3'且包含與該靶整合位點之基因體序列3'同源之序列，其中該第三核酸序列及該第四核酸序列中之每一者之長度為至少1000 nt且其中該第三核酸序列及該第四核酸序列之長度不同。在一些實施例中，所提供之病毒載體進一步包括長度在500 nt與2500 nt之間的外源基因序列。在一些實施例中，所提供之病毒載體包括長度在1000 nt與2000 nt之間的外源基因序列。在一些實施例中，所提供之病毒載體包括長度為至少750 nt之第三核酸序列。在一些實施例中，所提供之病毒載體包括長度為至少1000 nt之第三核酸序列。在一些實施例中，所提供之病毒載體包括長度為至少1600 nt之第三核酸序列。在一些實施例中，所提供之病毒載體包括長度為至少750 nt之第四核酸序列。在一些實施例中，所提供之病毒載體包括長度為至少1000 nt之第四核酸序列。在一些實施例中，所提供之病毒載體包括長度為至少1600 nt之第四核酸序列。在一些實施例中，所提供之病毒載體包括長度均為至少750 nt之第三核酸序列及第四核酸序列。在一些實施例中，所提供之病毒載體包括長度均為至少1000 nt之第三核酸序列及第四核酸序列。在一些實施例中，所提供之病毒載體包括長度為1000 nt之第三核酸序列及長度為1600 nt之第四核酸序列。在一些實施例中，所提供之病毒載體包括長度為1600 nt之第三核酸序列及長度為1000 nt之第四核酸序列。在一些實施例中，所提供之病毒載體為AAV載體。在一些實施例中，所提供之病毒載體為選自AAV2、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV-LK03或AAV-sL65之AAV載體。
在一些實施例中，所提供之組合物包括一或多種醫藥學上可接受之賦形劑及重組病毒載體，該等重組病毒載體包含編碼以下之聚核苷酸序列中之至少一者：1)第一核酸序列及第二核酸序列，其中該第一核酸序列包含至少一個外源基因序列且該第二核酸序列位於該第一核酸序列之5'或3'且在整合至靶整合位點中之後促進兩個獨立基因產物之產生；2)第三核酸序列，該第三核酸序列位於聚核苷酸之5'且包含與該靶整合位點之基因體序列5'同源之序列；及3)第四核酸序列，該第四核酸序列位於該聚核苷酸之3'且包含與該靶整合位點之基因體序列3'同源之序列，其中該第三核酸序列及該第四核酸序列中之每一者之長度為至少1000 nt且其中該第三核酸序列及該第四核酸序列之長度不同。
在一些實施例中，所提供之組合物用於將轉殖基因整合至個體組織中之一或多個細胞之基因體中的方法中，其中向組織中之細胞不能表現由基因產物編碼之功能性蛋白質之個體投與該等組合物且靶整合位點在一或多個細胞之基因體中。在一些實施例中，所提供之組合物可在方法中投與，其中一或多個細胞為非分裂細胞。在一些實施例中，所提供之組合物可在方法中投與，其中一或多個細胞為肝、肌肉、肺或CNS細胞。在一些實施例中，所提供之組合物可在方法中在出生後時段內投與。在一些實施例中，所提供之組合物可在方法中在出生後至少7天、出生後至少14天、出生後至少21天或出生後至少28天投與。在一些實施例中，所提供之組合物可在方法中在出生後28天或之前投與。在一些實施例中，所提供之組合物可在方法中投與，其中轉殖基因為或包含UGT1A1、FAH、因子IX、A1AT、ASL或LIPA。在一些實施例中，所提供之組合物可在方法中投與，其中整合效率相對於參考組合物提高。在一些實施例中，所提供之組合物可在方法中以至少5E13 vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，所提供之組合物可在方法中以至少1E14 vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，所提供之組合物可在方法中以至少2E14 vg/kg之劑量投與。在一些實施例中，所提供之組合物可在方法中投與，其中個體為動物。在一些實施例中，所提供之組合物可在方法中投與，其中個體為人類。在一些實施例中，所提供之組合物可在方法中投與，其中個體患有或疑似患有克里格勒-納賈爾症候群(Crigler-Najjar syndrome)、酪胺酸血症、血友病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、精胺醯丁二酸尿症或溶酶體酸性脂肪酶缺乏症。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2021年4月30日申請之美國臨時申請案第63/182,738號之優先權，各臨時申請案之全部內容以引用之方式併入本文中。 定義
為更容易理解本發明，下文首先定義某些術語。以下術語及其他術語之額外定義在本說明書通篇闡述。用以描述本發明背景及提供關於其實踐之額外細節的本文引用之出版物及其他參考材料藉此以引用之方式併入。
冠詞「一個」及「一種」在本文中用於指代冠詞之語法受詞中之一者或多於一者(亦即，至少一者)。舉例而言，「一個元件」意指一個元件或多於一個元件。
約： 術語「約」或「近似」當在本文中用於提及一個值時，係指在上下文中與所提及之值相似之值。一般而言，熟悉上下文之熟習此項技術者將了解在彼上下文中「約」所涵蓋之相關變化程度。舉例而言，在一些實施例中，術語「約」或「近似」可涵蓋在所提及值之25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小以內之值的範圍。
組合療法 ：如本文所用，術語「組合療法」係指將個體同時暴露於兩種或更多種治療方案(例如，兩種或更多種治療劑)之臨床干預。在一些實施例中，可同時投與兩種或更多種治療方案。在一些實施例中，可依序投與兩種或更多種治療方案(例如，在投與任何劑量之第二方案之前投與第一方案)。在一些實施例中，在重疊給藥方案中投與兩種或更多種治療方案。在一些實施例中，組合療法之投與可涉及向接受其他藥劑或模態之個體投與一或多種治療劑或模態。在一些實施例中，組合療法不一定要求個別藥劑在單一組合物中一起投與(或甚至必須同時投與)。在一些實施例中，單獨地，例如在單獨組合物中，經由單獨投藥途徑(例如，一種藥劑經口及另一種藥劑靜脈內)及/或在不同時間點，向個體投與組合療法之兩種或更多種治療劑或模態。在一些實施例中，可在組合組合物中，或甚至在組合化合物中(例如，作為單一化學複合物或共價實體之一部分)，經由相同投藥途徑及/或在相同時間，一起投與兩種或更多種治療劑。
可比較的 ：如本文所用，術語「可比較的」係指兩種或更多種藥劑、實體、情況、條件組等可彼此不同，但足夠相似以允許在其之間進行比較，使得熟習此項技術者將了解可基於所觀測之差異或相似性合理引出結論。在一些實施例中，可比較之條件、情形、個體或群體組之特徵在於多個實質上相同之特徵及一個或少量變化之特徵。一般熟習此項技術者將了解，在上下文中，在任何給定情形中需要何種程度之一致性以將兩種或更多種此類藥劑、實體、情況、條件組等視為可比較的。舉例而言，一般熟習此項技術者將了解，當由足夠數目及類型之實質上相同之特徵來表徵時，情形、個體或群體組為彼此可比較的，以確證依據或使用不同情形、個體或群體組獲得之結果或觀測之現象的差異係由彼等特徵之變化引起或指示彼等特徵之變化的合理結論。
包含 ：本文中描述為「包含」一或多個指定元件或步驟之組合物或方法為開放式的，意謂指定元件或步驟為必需的，但可在組合物或方法之範疇內添加其他元件或步驟。為避免冗長，亦應了解，描述為「包含」(或「包括」)一或多個指定元件或步驟之任何組合物或方法亦描述基本上由相同指定元件或步驟組成」 (或「基本上由相同指定元件或步驟構成」)之相應、更受限之組合物或方法，意謂組合物或方法包括指定基本元件或步驟且亦可包括不會實質性影響組合物或方法之基本及新穎特徵之額外元件或步驟。亦應了解，本文描述為「包含一或多個指定元件或步驟」或「基本上由一或多個指定元件或步驟組成」之任何組合物或方法亦描述「由指定元件或步驟組成」(或「由指定元件或步驟構成」)而不包括任何其他未指定元件或步驟之相應、更受限及封閉式組合物或方法。在本文所揭示之任何組合物或方法中，任何指定基本元件或步驟之已知或所揭示之等效物可替代彼元件或步驟。
對應於 ：如本文所用，術語「對應於」可用於經由與適當參考化合物或組合物比較來指定化合物或組合物中之結構元件之位置/一致性。舉例而言，在一些實施例中，聚合物中之單體殘基(例如，多肽中之胺基酸殘基或聚核苷酸中之核酸殘基)可鑑定為「對應於」適當參考聚合物中之殘基。舉例而言，一般熟習此項技術者將了解，為簡單起見，多肽中之殘基常常使用規範編號系統基於參考相關多肽來指定，以使得「 對應於」例如位置190處之殘基的胺基酸實際上不需要為特定胺基酸鏈中之第190位胺基酸，而對應於參考多肽中之190處所發現之殘基；一般熟習此項技術者容易了解如何鑑定「 相應」胺基酸。舉例而言，熟習此項技術者將知曉各種序列比對策略，包括軟體程式，諸如BLAST、CS-BLAST、CUSASW++、DIAMOND、FASTA、GGSEARCH/GLSEARCH、Genoogle、HMMER、HHpred/HHsearch、IDF、Infernal、KLAST、USEARCH、parasail、PSI-BLAST、PSI-Search、ScalaBLAST、Sequilab、SAM、SSEARCH、SWAPHI、SWAPHI-LS、SWIMM或SWIPE，例如，可用於鑑定根據本揭示案之多肽及/或核酸中之「相應」殘基。
工程化 ：一般而言，術語「工程化」係指已由人工操縱之態樣。舉例而言，當在自然界中未按一定次序連接在一起之兩個或更多個序列經人工操縱以在工程化聚核苷酸中彼此直接連接時，將該聚核苷酸視為「工程化的」。舉例而言，在本發明之一些實施例中，工程化聚核苷酸包含在自然界中發現與第一編碼序列操作性締合，但不與第二編碼序列操作性締合之調控序列，其由人工連接以使得其與第二編碼序列操作性締合。可比較地，若細胞或生物體經操縱以改變其遺傳資訊(例如，藉由例如轉型、交配、體細胞雜交、轉染、轉導或其他機制引入先前不存在之新遺傳物質，或藉由例如取代或缺失突變或藉由交配方案改變或移除先前存在之遺傳物質)，則將該細胞或生物體視為「工程化的」。如普遍實踐及熟習此項技術者所了解，工程化聚核苷酸或細胞之子代典型地仍稱作「工程化的」，即使實際操縱在先前實體上進行。
賦形劑： 如本文所用，係指醫藥組合物中可包括之非治療劑，例如，以提供或有助於所需稠度或穩定作用。在一些實施例中，適合之醫藥賦形劑可包括例如澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇及類似物。
表現 ：如本文所用，核酸序列之「表現」係指以下事件中之一或多者：(1)自DNA序列產生RNA模板(例如，藉由轉錄)；(2) RNA轉錄物之加工(例如，藉由剪接、編輯、5'帽形成及/或3'末端形成)；(3) RNA轉譯成多肽或蛋白質；及/或(4)多肽或蛋白質之轉譯後修飾。
基因 ：如本文所用，術語「基因」係指染色體中編碼基因產物(例如，RNA產物及/或多肽產物)之DNA序列。在一些實施例中，基因包括編碼序列(例如，編碼特定基因產物之序列)；在一些實施例中，基因包括非編碼序列。在一些特定實施例中，基因可包括編碼(例如，外顯子)及非編碼(例如，內含子)序列兩者。在一些實施例中，基因可包括例如可控制或影響基因表現之一或多個態樣(例如，細胞類型特異性表現、誘導性表現)之一或多個調控元件(例如，啟動子、增強子、緘默子、終止信號)。
基因產物或表現產物 ：如本文所用，術語「基因產物」或「表現產物」一般係指自基因轉錄之RNA (加工前及/或加工後)或由自基因轉錄之RNA編碼之多肽(修飾前及/或修飾後)。
同源性： 如本文所用，術語「同源性」係指聚合分子之間，例如多肽分子之間的總體相關性。在一些實施例中，若聚合分子(諸如抗體)之序列至少80%、85%、90%、95%或99%一致，則將其視為彼此「同源的」。在一些實施例中，若聚合分子之序列至少80%、85%、90%、95%或99%相似，則將其視為彼此「同源的」。
人源化小鼠 ：如本文所用，術語「人源化小鼠」 (亦與「嵌合小鼠」可互換使用)係指攜帶功能化人類基因、細胞、組織及/或器官之小鼠。在一些實施例中，人源化小鼠可用作人類之模型系統(例如，具有人源化肝細胞之小鼠可用作人類肝臟之模型系統)。在一些實施例中，人源化小鼠已移植有人類細胞及/或組織。在一些實施例中，人源化小鼠經工程化以表現人類基因或基因產物。
一致性 ：如本文所用，術語「一致性」係指聚合分子之間，例如核酸分子(例如，DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的總體相關性。在一些實施例中，若聚合分子之序列至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致，則將其視為「實質上一致的」。計算兩個核酸或多肽序列之百分比一致性例如可藉由比對兩個序列以達成最佳比較目的來進行(例如，可在第一序列及第二序列中之一或兩者中引入空位以達成最佳比對，且可忽略非一致序列以達成比較目的)。在某些實施例中，為達成比較目的而比對之序列長度為參考序列長度之至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或實質上100%。接著比較相應位置處之核苷酸。當第一序列中之位置由與第二序列中之相應位置相同之殘基(例如，核苷酸或胺基酸)佔據時，則分子在彼位置處為相同的。兩個序列之間的一致性百分比隨序列共享之一致位置之數目而變，將空位之數目及各空位之長度考慮在內，需要引入空位用於兩個序列之最佳比對。可使用數學演算法實現序列之比較及兩個序列之間的一致性百分比之確定。舉例而言，可使用Meyers及Miller (CABIOS, 1989, 4: 11-17)之演算法確定兩個核苷酸序列之間的一致性百分比，該演算法已併入ALIGN程式(2.0版)中。在一些示例性實施例中，用ALIGN程式進行之核酸序列比較使用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12及空位罰分4。或者，可使用GCG套裝軟體中之GAP程式，使用NWSgapdna.CMP矩陣來確定兩個核苷酸序列之間的百分比一致性。
「 改善」、「 增加」或「 減少 」： 如本文所用，此等術語或語法上可比較之比較術語指示相對於可比較之參考量測值之值。舉例而言，在一些實施例中，用所關注之藥劑(例如，治療劑)獲得之評估值可相對於用可比較之參考劑獲得之評估值「改善」。替代地或另外，在一些實施例中，相對於在不同條件下(例如，在諸如投與所關注之藥劑之事件之前或之後)之相同個體或系統中，或在不同可比較個體中(例如，在與所關注之個體或系統不同之可比較個體或系統中，在所關注之特定疾病、病症或疾患之一或多個指標存在下，或在先前暴露於某種條件或藥劑中，等等)所獲得之評估值，在所關注之個體或系統中獲得之評估值「改善」。在一些實施例中，可比較術語係指統計相關差異(例如，具有足以達成統計相關性之普遍性及/或量值)。熟習此項技術者將知曉或將容易地能夠確定在給定情形中達成此種統計顯著性所需或足夠之差異程度及/或普遍性。
活體外 ：如本文所用，術語「活體外」係指在人工環境中發生之事件，例如，在試管或反應容器中、在細胞培養物中等等，而不在多細胞生物體內。
活體內： 如本文所用，係指在多細胞生物體，諸如人類及非人類動物內發生之事件。在基於細胞之系統的情形中，該術語可用於指代在活細胞內發生之事件(與例如活體外系統相反)。
標誌物 ：如本文所用，標誌物係指其存在或水準為特定狀態或事件之特徵的實體或部分。在一些實施例中，特定標誌物之存在或水準可為疾病、病症或疾患之存在或階段的特徵。僅舉一例，在一些實施例中，該術語係指作為特定腫瘤、腫瘤亞類、腫瘤階段等之特徵的基因表現產物。替代地或另外，在一些實施例中，特定標誌物之存在或水準與特定信號傳導路徑之活性(或活性水準)相關聯，該特定信號傳導路徑例如可為特定類別之腫瘤的特徵。標誌物之存在或不存在之統計顯著性可取決於特定標誌物而變化。在一些實施例中，標誌物之偵測為高度特異性的，因為其反映腫瘤屬於特定亞類之高概率。此種特異性可能以敏感性為代價(亦即，即使腫瘤為預期表現標誌物之腫瘤，亦可能出現陰性結果)。反之，具有高度敏感性之標誌物之特異性可能不如敏感性較低之標誌物。根據本發明，適用之標記不需要以100%之準確度區分特定亞類之腫瘤。
核酸 ：如本文所用，在其最廣義上，係指併入或可併入寡核苷酸鏈中之任何化合物及/或物質。在一些實施例中，核酸為經由磷酸二酯鍵併入或可併入寡核苷酸鏈中之化合物及/或物質。如自上下文中將明確，在一些實施例中，「 核酸」係指個別核酸殘基(例如，核苷酸及/或核苷)；在一些實施例中，「 核酸」係指包含個別核酸殘基之寡核苷酸鏈。在一些實施例中，「 核酸」為或包含RNA；在一些實施例中，「 核酸」為或包含DNA。在一些實施例中，核酸為、包含或由一或多個天然核酸殘基組成。在一些實施例中，核酸為、包含或由一或多個核酸類似物組成。在一些實施例中，核酸類似物與核酸之不同之處在於其不利用磷酸二酯主鏈。舉例而言，在一些實施例中，核酸為、包含或由一或多個「 肽核酸」組成，其在此項技術中為已知的且在主鏈中具有肽鍵而非磷酸二酯鍵，且視為處於本發明之範疇內。替代地或另外，在一些實施例中，核酸具有一或多個硫代磷酸酯及/或5'-N-亞磷醯胺鍵而非磷酸二酯鍵。在一些實施例中，核酸為、包含或由一或多個天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、去氧腺苷、去氧胸苷、去氧鳥苷及去氧胞苷)組成。在一些實施例中，核酸為、包含或由一或多個核苷類似物組成(例如，2-胺基腺苷、2-硫胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-胺基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-胺基腺苷、7-去氮腺苷、7-去氮鳥苷、8-側氧基腺苷、8-側氧基鳥苷、0(6)-甲基鳥嘌呤、2-硫胞苷、甲基化鹼基、嵌入鹼基及其組合)。在一些實施例中，與天然核酸中之彼等相比，核酸包含一或多個經修飾之糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-去氧核糖、阿拉伯糖及己糖)。在一些實施例中，核酸具有編碼功能性基因產物，諸如RNA或蛋白質之核苷酸序列。在一些實施例中，核酸包括一或多個內含子。在一些實施例中，藉由以下方式中之一或多者來製備核酸：自天然來源分離、藉由基於互補模板聚合進行酶促合成(活體內或活體外)、在重組細胞或系統中再生，及化學合成。在一些實施例中，核酸之長度為至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000個或更多個殘基。在一些實施例中，核酸為部分或完全單股的；在一些實施例中，核酸為部分或完全雙股的。在一些實施例中，核酸具有包含至少一個元件之核苷酸序列，該至少一個元件編碼多肽或為編碼多肽之序列之補體。在一些實施例中，核酸具有酶促活性。
肽： 如本文所用，術語「肽」係指典型地相對較短之多肽，例如，長度小於約100個胺基酸、小於約50個胺基酸、小於約40個胺基酸、小於約30個胺基酸、小於約25個胺基酸、小於約20個胺基酸、小於約15個胺基酸或小於10個胺基酸。
醫藥學上可接受之載劑： 如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」意指參與攜帶或轉運主題化合物自身體之一個器官或部分至身體之另一個器官或部分的醫藥學上可接受之材料、組合物或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑或溶劑包封材料。在與調配物之其他成分相容且對個體無害之意義上，各載劑必須為「可接受的」。可用作醫藥學上可接受之載劑的材料之一些實例包括：糖，諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及醋酸纖維素；粉狀黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，諸如可可脂及栓劑蠟；油，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油；二醇，諸如丙二醇；多元醇，諸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇及聚乙二醇；酯，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；海藻酸；無熱原水；等張鹽水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇；pH緩衝溶液；聚酯、聚碳酸酯及/或聚酐；及醫藥調配物中採用之其他無毒相容物質。
醫藥組合物 ：如本文所用，術語「醫藥組合物」係指與一或多種醫藥學上可接受之載劑一起調配之活性劑。在一些實施例中，活性劑以適於在治療方案中投與之單位劑量存在，當向相關群體投與時，該治療方案顯示出達成預定治療作用之統計顯著概率。在一些實施例中，醫藥組合物可經特別調配用於以固體或液體形式投與，包括適於以下之彼等：經口投藥，例如，浸劑(水性或非水性溶液或懸浮液)；錠劑，例如，旨在用於經頰、舌下及全身吸收之彼等；大丸劑；粉末；顆粒；用於向舌頭施用之糊劑；非經腸投藥，例如，藉由皮下、肌肉內、靜脈內或硬膜外注射，例如無菌溶液或懸浮液，或持續釋放調配物；局部施用，例如，作為向皮膚、肺或口腔施用之乳膏、軟膏或控制釋放貼片或噴霧；陰道內或直腸內，例如，作為子宮托、乳膏或泡沫；舌下；經眼；經皮；或經鼻、經肺及其他黏膜表面。
多肽 ：如本文所用，術語「多肽」一般具有其技術公認之至少三個胺基酸之聚合物的含義。一般熟習此項技術者將了解，術語「多肽」意欲足夠籠統地不僅涵蓋具有本文所敘述之完整序列之多肽，而且涵蓋代表此類完整多肽之功能片段(亦即，保留至少一種活性之片段)的多肽。此外，一般熟習此項技術者了解，蛋白質序列一般耐受一些取代而不會破壞活性。因此，在如本文所用之相關術語「多肽」內涵蓋保留活性且與相同類別之另一多肽共享至少約30-40%總體序列一致性之任何多肽，常常大於約50%、60%、70%或80%，且進一步通常包括一致性高得多的至少一個區，在一或多個高度保守區中常常大於90%或甚至95%、96%、97%、98%或99%，通常涵蓋至少3-4個且常常多達20個或更多個胺基酸。多肽可含有L-胺基酸、D-胺基酸或兩者，且可含有此項技術中已知之多種胺基酸修飾或類似物中之任一者。適用之修飾包括例如末端乙醯化、醯胺化、甲基化，等等。在一些實施例中，蛋白質可包含天然胺基酸、非天然胺基酸、合成胺基酸及其組合。術語「肽」一般用於指代長度小於約100個胺基酸、小於約50個胺基酸、小於20個胺基酸或小於10個胺基酸之多肽。在一些實施例中，蛋白質為抗體、抗體片段、其生物活性部分及/或其特徵部分。
預防 或 防範 ：如本文所用，當與疾病、病症及/或疾患之發生相結合使用時，係指降低發展疾病、病症及/或疾患之風險及/或延遲疾病、病症或疾患之一或多種特徵、徵象或症狀之發作。當疾病、病症或疾患之發作已延遲預定時間段時，可將預防視為完成。
風險 ：如自上下文將了解，疾病、病症及/或疾患之「 風險」係指特定個體將發展疾病、病症及/或疾患之可能性。在一些實施例中，風險表示為百分比。在一些實施例中，風險為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90至100%。在一些實施例中，風險表示為相對於與參考樣品或參考樣品組相關之風險的風險。在一些實施例中，參考樣品或參考樣品組具有疾病、病症、疾患及/或事件之已知風險。在一些實施例中，參考樣品或參考樣品組來自與特定個體可比較之個體。在一些實施例中，相對風險為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。
個體： 如本文所用，術語「個體」係指生物體，典型地為哺乳動物(例如，人類，在一些實施例中包括出生前人類形式)。在一些實施例中，個體正罹患相關疾病、病症或疾患。在一些實施例中，個體易患疾病、病症或疾患。在一些實施例中，個體展現出疾病、病症或疾患之一或多種症狀或特徵。在一些實施例中，個體不展現出疾病、病症或疾患之任何症狀或特徵。在一些實施例中，個體為具有疾病、病症或疾患之易感性或風險所特有之一或多種特徵的人。在一些實施例中，個體為患者。在一些實施例中，個體為正投與及/或已投與診斷及/或療法之個人。
實質上： 如本文所用，術語「實質上」係指展現出所關注之特徵或特性之全部或接近全部範圍或程度的定性條件。一般熟習生物技術者將了解，生物及化學現象鮮少(若有)趨於完成及/或繼續完成或達成或避免絕對結果。因此，術語「實質上」在本文中用於捕獲許多生物及化學現象中固有之潛在完整性缺乏。
易患 ：「易患」疾病、病症及/或疾患之個人為比一般公眾成員發展該疾病、病症及/或疾患之風險更高的人。在一些實施例中，易患疾病、病症及/或疾患之個人可能未診斷為患有疾病、病症及/或疾患。在一些實施例中，易患疾病、病症及/或疾患之個人可能展現出疾病、病症及/或疾患之症狀。在一些實施例中，易患疾病、病症及/或疾患之個人可能不展現出疾病、病症及/或疾患之症狀。在一些實施例中，易患疾病、病症及/或疾患之個人將發展疾病、病症及/或疾患。在一些實施例中，易患疾病、病症及/或疾患之個人將不發展疾病、病症及/或疾患。
治療劑 ：如本文所用，片語「治療劑」係指當向個體投與時，具有治療作用及/或引發所需生物及/或藥理作用之藥劑。在一些實施例中，治療劑為可用於減輕、改善、緩解、抑制、預防疾病、病症及/或疾患之一或多種症狀或特徵、延遲其發作、減輕其嚴重性及/或降低其發生率之任何物質。
治療 ：如本文所用，術語「治療」 (亦為「處理」或「處置」)係指投與部分或完全減輕、改善、緩解、抑制特定疾病、病症及/或疾患之一或多種徵象、症狀、特徵及/或病因、延遲其發作、減輕其嚴重性及/或降低其發生率之療法。在一些實施例中，此種治療可針對不展現出相關疾病、病症及/或疾患之徵象的個體及/或僅展現出疾病、病症及/或疾患之早期徵象的個體。替代地或另外，此種治療可針對展現出相關疾病、病症及/或疾患之一或多種既定徵象的個體。在一些實施例中，治療可針對已診斷為罹患相關疾病、病症及/或疾患之個體。在一些實施例中，治療可針對已知具有在統計上與相關疾病、病症及/或疾患之發展風險增加相關聯之一或多種易感性因素的個體。因此，在一些實施例中，治療可為預防性的；在一些實施例中，治療可為治療性的。
變異體 ：如本文所用，術語「變異體」係指顯示出與參考實體之顯著結構一致性，但在結構上與參考實體之不同之處在於與參考實體相比一或多個化學實體之存在或不存在或水準的實體。在一些實施例中，變異體在功能上亦與其參考實體不同。一般而言，特定實體是否適當地視為參考實體之「變異體」係基於其與參考實體之結構一致性程度。如熟習此項技術者將了解，任何生物或化學參考實體具有某些特徵性結構元件。根據定義，變異體為共享一或多個此類特徵性結構元件之獨特化學實體。僅舉數例，小分子可具有特徵性核心結構元件(例如，大環核心)及/或一或多個特徵性側基部分，使得小分子之變異體為共享核心結構元件及特徵性側基部分，但其他側基部分及/或存在於核心內之鍵的類型(單對雙、E對Z等)不同之變異體；多肽可具有由在線性或三維空間中相對於彼此具有指定位置及/或有助於特定生物功能之多個胺基酸組成的特徵性序列元件；核酸可具有由在線性或三維空間中相對於彼此具有指定位置之多個核苷酸殘基組成的特徵性序列元件。在一些實施例中，變異體多肽或核酸由於胺基酸或核苷酸序列中之一或多個差異及/或作為多肽或核酸之共價組分(例如，連接至多肽或核酸主鏈)之化學部分(例如，碳水化合物、脂質、磷酸基團)中之一或多個差異而可能不同於參考多肽或核酸。在一些實施例中，變異體多肽或核酸顯示出與參考多肽或核酸至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%之總體序列一致性。替代地或另外，在一些實施例中，變異體多肽或核酸不與參考多肽或核酸共享至少一個特徵性序列元件。在一些實施例中，參考多肽或核酸具有一或多種生物活性。在一些實施例中，變異體多肽或核酸共享參考多肽或核酸之生物活性中之一或多者。在一些實施例中，變異體多肽或核酸缺乏參考多肽或核酸之生物活性中之一或多者。在一些實施例中，變異體多肽或核酸顯示出與參考多肽或核酸相比一或多種生物活性之水準降低。在一些實施例中，若所關注之多肽或核酸具有與參考之序列一致，但在特定位置處有少數序列變化之胺基酸或核苷酸序列，則將該多肽或核酸視為親本或參考多肽或核酸之「變異體」。典型地，與參考相比，變異體中少於約20%、約15%、約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%或約2%之殘基經取代、插入或缺失。在一些實施例中，與參考相比，變異體多肽或核酸包含約10個、約9個、約8個、約7個、約6個、約5個、約4個、約3個、約2個或約1個經取代之殘基。通常，變異體多肽或核酸相對於參考包含極少數(例如，少於約5個、約4個、約3個、約2個或約1個)經取代、插入或缺失之功能殘基(亦即，參與特定生物活性之殘基)。在一些實施例中，與參考相比，變異體多肽或核酸包含不超過約5個、約4個、約3個、約2個或約1個添加或缺失，且在一些實施例中，不包含添加或缺失。在一些實施例中，與參考相比，變異體多肽或核酸包含少於約25個、約20個、約19個、約18個、約17個、約16個、約15個、約14個、約13個、約10個、約9個、約8個、約7個、約6個且通常少於約5個、約4個、約3個或約2個添加或缺失。在一些實施例中，參考多肽或核酸為在自然界中發現之多肽或核酸。在一些實施例中，參考多肽或核酸為人類多肽或核酸。 某些實施例之詳細描述 基因療法
已報導，在截至2019年報告之約7,136種疾病中，由功能失調基因引起之遺傳疾病佔近80% (參見遺傳與罕見疾病資訊中心及全球基因(Genetic and rare Diseases Information Center and Global Genes))。全世界有超過3.3億人受遺傳疾病影響，且估計此等病例中近一半為兒童。然而，估計僅約500種人類疾病為可用藥物可治療的，指示新療法及治療選項對於解決此等遺傳病症中之實質性部分為必需的。基因療法為一種新興之治療形式，旨在經由將遺傳物質傳遞至個體中來介導遺傳病症之影響。在一些實施例中，基因療法可包括轉移之遺傳物質的轉錄及/或轉譯，及/或藉由投與核酸、病毒或基因工程化之微生物將轉移之遺傳物質整合至宿主基因體中(參見FDA指南(FDA Guidelines))。基因療法可允許將治療性遺傳物質遞送至個體之任何特定細胞、組織及/或器官以進行治療。在一些實施例中，基因療法涉及將治療基因或轉殖基因轉移至宿主細胞。 病毒基因療法
由於病毒能夠表現高水準之有效載荷(例如，轉殖基因)，且在一些實施例中能夠在宿主基因體內穩定地表現有效載荷(例如，轉殖基因)，因此病毒已成為基因療法之有吸引力之媒介。重組AAV為用於基因療法之流行病毒載體，因為其常常產生高病毒產量、溫和免疫反應，且能夠感染不同細胞類型。
在傳統AAV基因療法中，可對rAAV進行工程化，以將治療性有效載荷(例如，轉殖基因)遞送至靶細胞，而不整合至染色體DNA中。一或多個有效載荷(例如，轉殖基因)可自存在於細胞核內之非整合遺傳元件(稱為游離基因體)表現。儘管傳統基因療法在最初轉導之細胞中可能為有效的，但游離型表現為短暫的且隨時間推移，尤其隨細胞更新而逐漸降低。對於具有較長壽命之細胞(例如，在個體一生中之大部分時間存在之細胞)，游離型表現可能為有效的。然而，當向生命早期(例如，兒童期)之個體施用時，常規基因療法可能具有缺點，因為發育期間之快速組織生長可能導致有效載荷(例如，轉殖基因)之治療效益稀釋及最終喪失。
第二種類型之AAV基因療法GENERIDE™利用同源重組(HR)，一種維持細胞基因體保真度之天然存在之DNA修復過程。GENERIDE™使用HR將一或多個有效載荷(例如，轉殖基因)插入基因體序列內之特定靶基因座中。在一些實施例中，GENERIDE™利用一或多個靶基因座處之內源啟動子來驅動高水準之組織特異性表現。GENERIDE™不需要使用外源核酸酶或啟動子，從而減少常常與此等元件相關之有害影響。此外，GENERIDE™平台技術有潛力克服傳統基因療法及傳統基因編輯方法兩者之一些關鍵限制，從而充分用於治療遺傳疾病，特別在兒科個體中。GENERIDE™使用AAV載體將基因遞送至細胞核中。接著，其使用HR將校正基因穩定地整合至個體之基因體中受內源啟動子調控之位置處，即使身體隨時間推移而生長及變化，亦允許終生產生蛋白質，此對於傳統AAV基因療法為不可行的。
關於非破壞性基因靶向之先前工作描述於WO 2013/158309中，以引用之方式併入本文中。關於不存在核酸酶之情況下進行基因體編輯之先前工作描述於WO 2015/143177中，以引用之方式併入本文中。關於用於治療MMA之非破壞性基因療法之先前工作描述於WO 2020/032986中，以引用之方式併入本文中。關於基因療法監測之先前工作描述於WO/2020/214582中，以引用之方式併入本文中。 病毒結構及功能 病毒載體
病毒載體包含病毒或病毒染色體材料，其中可插入異源核酸序列用於轉移至所關注之靶序列中(例如，用於轉移至細胞內之基因體DNA中)。各種病毒可用作病毒載體，包括例如單股DNA (ssDNA)、雙股DNA (dsDNA)病毒及/或在其生命週期中具有DNA階段之RNA病毒。在一些實施例中，病毒載體為或包含腺相關病毒(AAV)或AAV變異體。
在一些實施例中，載體粒子為包含包裹基於病毒之聚核苷酸之衣殼的單個病毒單位(例如，野生型病毒基因體或重組病毒載體)。在一些實施例中，載體粒子為或包含AAV載體粒子。在一些實施例中，AAV載體粒子係指由至少一個AAV衣殼蛋白及經包裹之AAV載體組成之載體粒子。在一些實施例中，載體粒子(亦稱作病毒載體)包含至少一個AAV衣殼蛋白及經包裹之AAV載體，其中該載體進一步包含一或多個異源聚核苷酸序列。 衣殼蛋白
在一些實施例中，表現構築體包含編碼來自一或多種AAV亞型，包括天然存在及重組AAV之衣殼蛋白的聚核苷酸序列。在一些實施例中，表現構築體包含編碼來自以下之衣殼蛋白之聚核苷酸序列：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAVC11.01、AAVC11.02、AAVC11.03、AAVC11.04、AAVC11.05、AAVC11.06、AAVC11.07、AAVC11.08、AAVC11.09、AAVC11.10、AAVC11.11 (本文中可互換地稱作sL65)、AAVC11.12、AAVC11.13、AAVC11.14、AAVC11.15、AAVC11.16、AAVC11.17、AAVC11.18、AAVC11.19、AAV-DJ、AAV-LK03、AAV-LK19、AAVrh.74、AAVrh.10、AAVhu.37、AAVrh.K、AAVrh.39、AAV12、AAV 13、AAVrh.8、禽類AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、靈長類動物AAV、非靈長類動物AAV、綿羊AAV、雜合AAV (例如，包含一種AAV亞型之一或多個序列及第二種亞型之一或多個序列的AAV)，及/或包含突變AAV衣殼蛋白或嵌合AAV衣殼(例如，具有來源於兩種或更多種不同AAV血清型之聚核苷酸序列之衣殼)的AAV，或其變異體。
在一些實施例中，病毒載體包裝於衣殼蛋白(例如，來自一或多種AAV亞型之衣殼蛋白)內。在一些實施例中，衣殼蛋白提供相對於參考衣殼蛋白增加或增強之細胞(例如，人類或鼠類細胞)轉導。在一些實施例中，衣殼蛋白提供相對於參考衣殼蛋白增加或增強之某些細胞或組織類型(例如，肝向性、肌肉向性、CNS向性、肺向性)轉導。在一些實施例中，衣殼蛋白相對於參考衣殼蛋白使細胞或組織(例如，肝、肌肉及/或CNS)之轉導增加或增強至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或更高。在一些實施例中，衣殼蛋白相對於參考衣殼蛋白使細胞或組織(例如，肝、肌肉、肺及/或CNS)之轉導增加或增強至少約1.2x、1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、11x、12x、13x、14x、15x、16x、17x、18x、19x、20x、30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x或更高。 AAV 結構及功能
腺相關病毒(AAV)為由二十面體蛋白衣殼及單股DNA基因體組成之微小病毒。AAV病毒衣殼包含三個亞單位VP1、VP2及VP3及兩個反向末端重複(ITR)區域，其處於基因體序列之末端。ITR用作複制起點且在病毒包裝中發揮作用。病毒基因體亦包含 rep及 cap基因，其分別與復制及衣殼包裝相關。在大多數野生型AAV中， rep基因編碼病毒複製所需之四種蛋白質，Rep 78、Rep68、Rep52及Rep40。 cap基因編碼衣殼亞單位以及促進病毒粒子組裝之組裝活化蛋白(AAP)。AAV一般為複制缺陷型的，需要輔助病毒或輔助病毒功能(例如，單純皰疹病毒(HSV)及/或腺病毒(AdV))存在以在受感染之細胞內復制。舉例而言，在一些實施例中，AAV需要腺病毒E1A、E2A、E4及VA RNA基因以在宿主細胞內復制。 重組 AAV
一般而言，重組AAV (rAAV)載體可包含在野生型AAV中發現之許多相同元件，包括相似衣殼序列及結構，以及非AAV來源之聚核苷酸序列(例如，與AAV異源之聚核苷酸)。在一些實施例中，rAAV將用編碼有效載荷之聚核苷酸序列置換原生野生型AAV序列。舉例而言，在一些實施例中，rAAV將包含編碼一或多個意欲用於治療目的(例如，用於基因療法)之基因的聚核苷酸序列。rAAV可經修飾以移除一或多個野生型病毒編碼序列。舉例而言，與野生型AAV中所發現相比，rAAV可經工程化以僅包含一個ITR及/或包裝所必需之一或多個較少基因(例如， rep及 cap基因)。使用rAAV之基因表現一般限於一或多個總計5kb或更小之基因，因為較大序列不能有效地包裝於病毒衣殼內。在一些實施例中，可使用兩個或更多個rAAV以提供較大有效載荷之部分，例如，以提供完整編碼序列用於通常過大而無法容納於單個AAV中之基因。
本揭示案尤其提供包含本文所述之一或多個多肽之病毒載體。在一些實施例中，rAAV可包含一或多個衣殼蛋白(例如，一或多個來自以下之衣殼蛋白：AAVC11.01、AAVC11.02、AAVC11.03、AAVC11.04、AAVC11.05、AAVC11.06、AAVC11.07、AAVC11.08、AAVC11.09、AAVC11.10、AAVC11.11 (本文中可互換地稱作sL65)、AAVC11.12、AAVC11.13、AAVC11.14、AAVC11.15、AAVC11.16、AAVC11.17、AAVC11.18、AAVC11.19、AAV-DJ及/或AAV-LK03)、AAVrh.74、AAVrh.10、AAVhu.37、AAVrh.K、AAVrh.39、AAV12、AAV 13、AAVrh.8、禽類AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、靈長類動物AAV、非靈長類動物AAV、綿羊AAV、雜合AAV (例如，包含一種AAV亞型之一或多個序列及第二種亞型之一或多個序列的AAV)，及/或包含突變AAV衣殼蛋白或嵌合AAV衣殼(例如，具有來源於兩種或更多種不同AAV血清型之聚核苷酸序列之衣殼)的AAV。在一些實施例中，rAAV可包含一或多個編碼所關注之基因或核酸(例如，用於治療遺傳疾病/病症之基因及/或抑制性核酸序列)之聚核苷酸序列。
AAV載體可能能夠在受感染之宿主細胞中復制(有複製能力的)或不能在受感染之宿主細胞中復制(複製無能的)。有復制能力之AAV (rcAAV)需要存在一或多個功能性AAV包裝基因。重組AAV載體一般經設計以在哺乳動物細胞中複制無能，以便降低經由與編碼AAV包裝基因之序列重組而產生rcAAV之可能性。在一些實施例中，如本文所述之rAAV載體製劑經設計以包含少數(若有) rcAAV載體。在一些實施例中，rAAV載體製劑每10 2個rAAV載體包含少於約1個rcAAV。在一些實施例中，rAAV載體製劑每10 4個rAAV載體包含少於約1個rcAAV。在一些實施例中，rAAV載體製劑每10 8個rAAV載體包含少於約1個rcAAV。在一些實施例中，rAAV載體製劑每10 12個rAAV載體包含少於約1個rcAAV。在一些實施例中，rAAV載體製劑不包含rcAAV載體。 異源核酸
本揭示案尤其提供包含至少一個有效載荷及兩個同源臂之聚核苷酸卡匣，一個同源臂處於聚核苷酸卡匣之5'末端且另一個同源臂處於聚核苷酸卡匣之3'末端。 有效載荷
在一些實施例中，本文所述之一或多個載體或構築體可包含編碼一或多個有效載荷之聚核苷酸序列。根據各種態樣，可單獨或組合使用多種有效載荷中之任一者(例如，具有診斷及/或治療目的之彼等)。在一些實施例中，有效載荷可為或包含編碼肽或多肽之聚核苷酸序列。在一些實施例中，有效載荷為具有細胞內在或細胞外在活性之肽，該活性促進生物過程以治療醫學疾患。在一些實施例中，有效載荷可為或包含轉殖基因(本文中亦稱作所關注之基因(GOI))。在一些實施例中，有效載荷可為或包含一或多個反向末端重複(ITR)序列(例如，一或多個AAV ITR)。在一些實施例中，有效載荷可為或包含一或多個具有側翼ITR序列之轉殖基因。在一些實施例中，有效載荷可為或包含一或多個編碼報告基因(例如，螢光或發光報導體)之異源核酸序列。在一些實施例中，有效載荷可為或包含一或多個生物標誌物(例如，用於有效載荷表現之替代物)。在一些實施例中，有效載荷可包含用於多順反子表現之序列(包括例如2A肽或內含子序列、內部核糖體進入位點)。在一些實施例中，2A肽為能夠在單個編碼序列內共表現兩個或更多個離散蛋白質產物之小(例如，約18-22個胺基酸)肽序列。在一些實施例中，2A肽允許兩個或更多個離散蛋白質產物之共表現，而與蛋白質編碼序列之排列無關。在一些實施例中，2A肽為或包含共通基元(例如，DVEXNPGP)。在一些實施例中，2A肽促進蛋白質裂解。在一些實施例中，2A肽為或包含病毒序列(例如，口蹄疫病毒(F2A)、馬鼻炎A病毒、豬捷申病毒-1 (porcine teschovirus-1，P2A)或東亞細亞病毒(Thosea asigna virus，T2A))。
在一些實施例中，生物標誌物為或包含2A肽(例如，P2A、T2A、E2A及/或F2A)。在一些實施例中，生物標誌物為或包含弗林蛋白酶裂解基元(參見Tian等人, FurinDB: A Database of 20-Residue Furin Cleavage Site Motifs, Substrates and Their Associated Drugs, (2011), Int. J. Mol. Sci., 第12卷: 1060-1065)。在一些實施例中，生物標誌物為或包含標籤(例如，免疫標籤)。在一些實施例中，有效載荷可包含一或多個功能性核酸(例如，一或多個siRNA或miRNA)。在一些實施例中，有效載荷可包含一或多個抑制性核酸(尤其包括例如核酶、miRNA、siRNA或shRNA)。在一些實施例中，有效載荷可包含一或多個核酸酶(例如，Cas蛋白、核酸內切酶、TALEN、ZFN)。 轉殖基因
在一些實施例中，轉殖基因為經選擇以改善疾病、病症或疾患之一或多種徵象及/或症狀之校正基因。在一些實施例中，轉殖基因可經由使用本揭示案所涵蓋之載體永久整合至宿主細胞基因體中。在一些實施例中，轉殖基因為在宿主細胞中發現之疾病相關基因(亦即，與疾病、病症或疾患之表現或惡化相關之基因同種型)的功能型式。在一些實施例中，轉殖基因為在宿主細胞中發現之疾病相關基因之最佳化型式(例如，密碼子最佳化或表現最佳化之變異體)。在一些實施例中，轉殖基因為在宿主細胞中發現之疾病相關基因之變異體(例如，功能性基因片段或其變異體)。在一些實施例中，轉殖基因為引起通常在一或多個健康組織中表現之肽表現的基因。在一些實施例中，轉殖基因為引起通常在肝細胞中表現之肽表現的基因。在一些實施例中，轉殖基因為引起通常在肌細胞中表現之肽表現的基因。在一些實施例中，轉殖基因為引起通常在中樞神經系統細胞中表現之肽表現的基因。
在一些實施例中，轉殖基因可為或包含引起通常不在一或多個健康組織中表現之肽(例如，異位表現之肽)表現的基因。在一些實施例中，轉殖基因為引起在一或多個健康組織(例如，肝、肌肉、中樞神經系統(CNS)、肺)中異位表現之肽表現的基因。在一些實施例中，轉殖基因為引起在一或多個健康組織中異位表現且通常在一或多個健康組織(例如，肝、肌肉、中樞神經系統(CNS)、肺)中表現之肽表現的基因。
在一些實施例中，轉殖基因可為或包含編碼功能性核酸之基因。在一些實施例中，治療劑為或包含對宿主細胞或個體具有治療作用之藥劑(包括例如核酶、嚮導RNA (gRNA)、反義寡核苷酸(ASO)、miRNA、siRNA及/或shRNA)。舉例而言，在一些實施例中，治療劑促進生物過程以治療醫學疾患，例如，疾病、病症或疾患之至少一種症狀。
在一些實施例中，個體中之轉殖基因表現實質上由靶基因座處之整合引起。在一些實施例中，個體中總轉殖基因表現之75%或更高(例如，80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、99%或更高、99.5%或更高)係來自靶基因座處之轉殖基因整合。在一些實施例中，個體中總轉殖基因表現之25%或更低(例如，20%或更低、15%或更低、10%或更低、5%或更低、1%或更低、0.5%或更低、0.1%或更低)係來自除靶基因座處之轉殖基因整合以外之來源(例如，游離型表現、非靶基因座處之整合)。
在一些實施例中，轉殖基因在個體中短暫表現(例如，來自質體、微環DNA、病毒等之游離型表現)。在一些實施例中，個體中總轉殖基因表現之75%或更高(例如，80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、99%或更高、99.5%或更高)係來自短暫表現。在一些實施例中，個體中總轉殖基因表現之25%或更低(例如，20%或更低、15%或更低、10%或更低、5%或更低、1%或更低、0.5%或更低、0.1%或更低)係來自除短暫表現以外之來源(例如，非靶基因座處之整合)。在一些實施例中，轉殖基因在個體中短暫表現(例如，來自質體、微環DNA、病毒等之游離型表現)，在治療後持續一或多週。在一些實施例中，轉殖基因在個體中短暫表現(例如，來自質體、微環DNA、病毒等之游離型表現)，在治療後持續一或多個月。
在一些實施例中，轉殖基因在個體中短暫表現(例如，來自質體、微環DNA、病毒等之游離型表現)，在治療後一或多週處於與在治療後一或多天內所觀測之水準可比較之水準。在一些實施例中，轉殖基因在個體中短暫表現(例如，來自質體、微環DNA、病毒等之游離型表現)，在治療後一或多個月處於與在治療後一或多天內所觀測之水準可比較之水準。
在一些實施例中，轉殖基因在個體中短暫表現(例如，來自質體、微環DNA、病毒等之游離型表現)，在治療後一或多週處於相對於在治療後一或多天內所觀測之水準降低之水準。在一些實施例中，轉殖基因在個體中短暫表現(例如，來自質體、微環DNA、病毒等之游離型表現)，在治療後一或多個月處於相對於在治療後一或多天內所觀測之水準降低之水準。
在一些實施例中，轉殖基因在個體中短暫表現(例如，來自質體、微環DNA、病毒等之游離型表現)，在治療後持續不超過一個月。在一些實施例中，轉殖基因在個體中短暫表現(例如，來自質體、微環DNA、病毒等之游離型表現)，在治療後持續不超過兩個月。在一些實施例中，轉殖基因在個體中短暫表現(例如，來自質體、微環DNA、病毒等之游離型表現)，在治療後持續不超過三個月。在一些實施例中，轉殖基因在個體中短暫表現(例如，來自質體、微環DNA、病毒等之游離型表現)，在治療後持續不超過四個月。在一些實施例中，轉殖基因在個體中短暫表現(例如，來自質體、微環DNA、病毒等之游離型表現)，在治療後持續不超過五個月。在一些實施例中，轉殖基因在個體中短暫表現(例如，來自質體、微環DNA、病毒等之游離型表現)，在治療後持續不超過六個月。
在一些實施例中，轉殖基因及同源臂之組合尺寸可最佳化以增加此等轉殖基因具有適合之序列長度以有效包裝於遞送媒介中之可能性，此可增加轉殖基因最終將在患者中適當遞送之可能性。
在一些實施例中，編碼轉殖基因之核苷酸序列經密碼子最佳化。在一些實施例中，編碼轉殖基因之核苷酸序列針對某種細胞類型(例如，哺乳動物、昆蟲、細菌、真菌等)進行密碼子最佳化。在一些實施例中，編碼轉殖基因之核苷酸序列針對人類細胞進行密碼子最佳化。在一些實施例中，編碼轉殖基因之核苷酸序列針對特定組織類型(例如，肝、肌肉、CNS、肺)之人類細胞進行密碼子最佳化。
在某些實施例中，編碼轉殖基因之核苷酸序列可經密碼子最佳化以與參考核苷酸序列(例如，野生型基因序列)具有小於100%之核苷酸同源性。在某些實施例中，密碼子最佳化之編碼轉殖基因之核苷酸序列與參考核苷酸序列之間的核苷酸同源性小於100%、小於99%、小於98%、小於97%、小於96%、小於95%、小於94%、小於93%、小於92%、小於91%、小於90%、小於89%、小於88%、小於87%、小於86%、小於85%、小於84%、小於83%、小於82%、小於81%、小於80%、小於78%、小於76%、小於74%、小於72%、小於70%、小於68%、小於66%、小於64%、小於62%、小於60%、小於55%、小於50%及小於40%。
在一些實施例中，轉殖基因可為或包含與相應野生型參考核苷酸序列(例如，野生型基因序列)具有至少80%、85%、90%、95%、99%或100%一致性之序列。在一些實施例中，轉殖基因可為或包含與相應野生型參考核苷酸序列(例如，野生型基因序列)之一部分具有至少80%、85%、90%、95%、99%或100%一致性之序列。在一些實施例中，轉殖基因可為或包含與下表5中之示例性序列具有至少80%、85%、90%、95%、99%或100%一致性之序列。 表5：示例性轉殖基因序列
轉殖基因描述 序列 SEQ ID NO
人類FAH tccttcatcccggtggccgaggattccgacttccccatccacaacctgccctacggcgtcttctcgaccagaggcgacccaagaccgaggataggtgtggccattggcgaccagatcctggacctcagcatcatcaagcacctctttactggtcctgtcctctccaaacaccaggatgtcttcaatcagcctacactcaacagcttcatgggcctgggtcaggctgcctggaaggaggcgagagtgttcttgcagaacttgctgtctgtgagccaagccaggctcagagatgacaccgaacttcggaagtgtgcattcatctcccaggcttctgccacgatgcaccttccagccaccataggagactacacagacttctattcctctcggcagcatgctaccaacgtcggaatcatgttcagggacaaggagaatgcgttgatgccaaattggctgcacttaccagtgggctaccatggccgtgcctcctctgtcgtggtgtctggcaccccaatccgaaggcccatgggacagatgaaacctgatgactctaagcctcccgtatatggtgcctgcaagctcttggacatggagctggaaatggctttttttgtaggccctggaaacagattgggagagccgatccccatttccaaggcccatgagcacatttttggaatggtccttatgaacgactggagtgcacgagacattcagaagtgggagtatgtccctctcgggccattccttgggaagagttttgggaccactgtctctccgtgggtggtgcccatggatgctctcatgccctttgctgtgcccaacccgaagcaggaccccaggcccctgccgtatctgtgccatgacgagccctacacatttgacatcaacctctctgttaacctgaaaggagaaggaatgagccaggcggctaccatatgcaagtccaattttaagtacatgtactggacgatgctgcagcagctcactcaccactctgtcaacggctgcaacctgcggccgggggacctcctggcttctgggaccatcagcgggccggagccagaaaacttcggctccatgttggaactgtcgtggaagggaacgaagcccatagacctggggaatggtcagaccaggaagtttctgctggacggggatgaagtcatcataacagggtactgccagggggatggttaccgcatcggctttggccagtgtgctggaaaagtgctgcctgctctcctgccatca 4
人類FAH 密碼子最佳化之變異體3 tccttcattcctgtggccgaggattctgactttcccattcacaacctgccctatggcgtcttttcaaccaggggagatcccaggcccagaatcggggtggccattggagatcagatcctggacctgtcaatcatcaagcacctgtttacaggccctgtgctgagcaagcaccaggatgtgttcaaccagccaactctgaacagcttcatggggctggggcaggctgcctggaaggaggcaagggtgtttctgcagaatctgctgagcgtgtcacaggctaggctgagggatgataccgagctgaggaagtgtgcatttatctcacaggcatcagccacaatgcatctgccagctacaatcggcgactataccgacttttactcaagcaggcagcatgccaccaatgtgggcatcatgttcagggacaaagagaatgccctgatgccaaattggctgcacctgcctgtgggctatcatggcagagccagctcagtggtggtgtcagggacaccaattaggaggcctatgggccagatgaagcctgatgacagcaaaccacctgtctacggcgcctgcaagctcctggatatggaactggagatggctttttttgtgggcccaggcaatagactgggagagcccattccaatctcaaaggcccatgaacatatctttggcatggtcctgatgaatgactggtcagccagagacattcagaagtgggagtacgtgccactgggaccatttctgggaaagagctttggcaccacagtgtcaccatgggtggtgcccatggatgccctgatgccctttgctgtgccaaatccaaaacaagaccccaggcccctcccctatctctgtcatgatgaaccatatacttttgacattaacctgagcgtgaacctgaaaggagaaggcatgagccaagccgccactatctgtaagagcaacttcaaatatatgtactggacaatgctgcagcagctcacccaccatagcgtgaatgggtgtaacctgaggccaggcgacctgctggcatcaggcactatttcagggcctgagcctgaaaattttggatcaatgctggagctgtcatggaagggaactaaacccatcgacctggggaatggccagaccagaaagtttctcctggatggcgatgaggtgatcattacaggctactgtcagggggatggctatagaattggatttggccaatgcgccggcaaagtcctccctgccctgctgcccagc 5
人類FAH 密碼子最佳化之變異體2 tccttcatcccagtggctgaagattctgacttccccattcacaacctcccttatggagtctttagcacaagaggagacccaagacctagaattggcgtggctattggggatcagatcctggacctgagcattatcaaacatctctttacaggcccagtcctcagcaagcaccaagatgtgttcaatcaacccacactgaactcatttatggggctgggccaagctgcctggaaggaggcaagagtgtttctccagaacctcctgtcagtgagccaggccaggctgagagatgacacagagctgaggaagtgtgcctttatctcacaagccagcgccacaatgcacctgccagcaaccatcggggactacacagacttttacagcagcaggcagcacgccactaatgtgggcatcatgtttagagacaaagagaatgccctcatgcctaactggctgcatctgccagtgggctaccatggcagagccagcagcgtggtggtgtctggcacccctatcaggaggcccatgggccagatgaagcctgatgacagcaagccacctgtgtatggggcatgtaagctgctggacatggagctggaaatggctttctttgtggggcctgggaacaggctgggcgaaccaattcccatcagcaaagctcatgaacacatttttgggatggtgctcatgaatgactggtctgccagagacatccagaagtgggagtatgtccccctgggaccattcctgggcaagagctttgggaccactgtgtcaccatgggtggtgcccatggatgccctgatgccatttgctgtgcctaatcccaaacaagatccaaggccactgccctacctctgccacgatgagccctacacatttgatatcaacctctctgtgaatctgaagggagaaggaatgagccaagctgctaccatttgcaaaagcaactttaagtatatgtattggaccatgctgcagcaactcacccaccacagcgtgaatggctgtaacctgaggcctggcgacctgctggcctctggcaccatcagcggccctgaacctgagaactttggcagcatgctggagctgagctggaagggaaccaagcccattgacctgggcaatggacagaccaggaaattcctcctggacggggacgaggtgatcatcacaggctattgccagggggatgggtataggattggctttggccaatgtgccggcaaagtgctgcctgccctgctccctagc 6
人類FAH 密碼子最佳化之變異體1 tcctttattcctgtggccgaagatagcgacttccctatccataacctcccatatggcgtcttctcaaccaggggcgaccccaggcccaggattggggtggcaattggagaccagatcctggacctcagcatcattaagcacctctttacaggacctgtgctgagcaagcaccaggatgtgttcaaccagcctaccctgaatagctttatgggactgggccaggcagcatggaaagaagccagagtgttcctccagaatctgctgagcgtgagccaggccaggctcagggatgacacagaactgaggaaatgtgccttcatctcacaggcatcagccacaatgcacctccctgccacaattggggactacactgacttctacagcagcagacagcatgccactaatgtggggattatgtttagagacaaggaaaatgccctcatgccaaattggctgcacctgcctgtgggctaccacggcagagcctcatcagtggtggtgtcaggcacaccaattaggaggccaatgggacagatgaagcctgacgactcaaagccaccagtctatggcgcctgcaaactgctggacatggagctggagatggctttctttgtggggcctggcaacaggctgggagaaccaatccctatttcaaaggcccacgagcacatttttggcatggtgctcatgaatgactggtctgccagagatatccagaagtgggaatacgtgcccctgggcccttttctgggcaagagctttggcaccacagtgtcaccttgggtggtcccaatggatgccctgatgccctttgccgtgcccaaccccaagcaggatcccagaccactgccctacctgtgccacgatgagccctatacctttgacatcaacctgtcagtcaacctgaagggggagggcatgagccaggccgccactatttgcaagagcaactttaaatatatgtactggactatgctccaacagctcactcaccactcagtgaatggctgcaatctgaggcctggcgacctcctggctagcggcactatctctggccctgaacctgagaactttgggagcatgctggagctgtcatggaaagggacaaagcctattgacctggggaatggccagacaaggaagtttctcctggatggcgatgaggtcatcatcactgggtactgccagggcgatggctacaggattggatttggacagtgtgctggcaaagtgctcccagctctgctgccctca 7
人類截短ATP7B CCTGAGCAGGAGAGACAGATCACAGCCAGAGAAGGGGCCAGTCGGAAAATCTTATCTAAGCTTTCTTTGCCTACCCGTGCCTGGGAACCAGCAATGAAGAAGAGTTTTGCTTTTGACAATGTTGGCTATGAAGGTGGTCTGGATGGCCTGGGCCCTTCTTCTCAGCCGCAGAAGTGCTTCTTACAGATCAAAGGCATGACCTGTGCATCCTGTGTGTCTAACATAGAAAGGAATCTGCAGAAAGAAGCTGGTGTTCTCTCCGTGTTGGTTGCCTTGATGGCAGGAAAGGCAGAGATCAAGTATGACCCAGAGGTCATCCAGCCCCTCGAGATAGCTCAGTTCATCCAGGACCTGGGTTTTGAGGCAGCAGTCATGGAGGACTACGCAGGCTCCGATGGCAACATTGAGCTGACAATCACAGGGATGACCTGCGCGTCCTGTGTCCACAACATAGAGTCCAAACTCACGAGGACAAATGGCATCACTTATGCCTCCGTTGCCCTTGCCACCAGCAAAGCCCTTGTTAAGTTTGACCCGGAAATTATCGGTCCACGGGATATTATCAAAATTATTGAGGAAATTGGCTTTCATGCTTCCCTGGCCCAGAGAAACCCCAACGCTCATCACTTGGACCACAAGATGGAAATAAAGCAGTGGAAGAAGTCTTTCCTGTGCAGCCTGGTGTTTGGCATCCCTGTCATGGCCTTAATGATCTATATGCTGATACCCAGCAACGAGCCCCACCAGTCCATGGTCCTGGACCACAACATCATTCCAGGACTGTCCATTCTAAATCTCATCTTCTTTATCTTGTGTACCTTTGTCCAGCTCCTCGGTGGGTGGTACTTCTACGTTCAGGCCTACAAATCTCTGAGACACAGGTCAGCCAACATGGACGTGCTCATCGTCCTGGCCACAAGCATTGCTTATGTTTATTCTCTGGTCATCCTGGTGGTTGCTGTGGCTGAGAAGGCGGAGAGGAGCCCTGTGACATTCTTCGACACGCCCCCCATGCTCTTTGTGTTCATTGCCCTGGGCCGGTGGCTGGAACACTTGGCAAAGAGCAAAACCTCAGAAGCCCTGGCTAAACTCATGTCTCTCCAAGCCACAGAAGCCACCGTTGTGACCCTTGGTGAGGACAATTTAATCATCAGGGAGGAGCAAGTCCCCATGGAGCTGGTGCAGCGGGGCGATATCGTCAAGGTGGTCCCTGGGGGAAAGTTTCCAGTGGATGGGAAAGTCCTGGAAGGCAATACCATGGCTGATGAGTCCCTCATCACAGGAGAAGCCATGCCAGTCACTAAGAAACCCGGAAGCACTGTAATTGCGGGGTCTATAAATGCACATGGCTCTGTGCTCATTAAAGCTACCCACGTGGGCAATGACACCACTTTGGCTCAGATTGTGAAACTGGTGGAAGAGGCTCAGATGTCAAAGGCACCCATTCAGCAGCTGGCTGACCGGTTTAGTGGATATTTTGTCCCATTTATCATCATCATGTCAACTTTGACGTTGGTGGTATGGATTGTAATCGGTTTTATCGATTTTGGTGTTGTTCAGAGATACTTTCCTAACCCCAACAAGCACATCTCCCAGACAGAGGTGATCATCCGGTTTGCTTTCCAGACGTCCATCACGGTGCTGTGCATTGCCTGCCCCTGCTCCCTGGGGCTGGCCACGCCCACGGCTGTCATGGTGGGCACCGGGGTGGCCGCGCAGAACGGCATCCTCATCAAGGGAGGCAAGCCCCTGGAGATGGCGCACAAGATAAAGACTGTGATGTTTGACAAGACTGGCACCATTACCCATGGCGTCCCCAGGGTCATGCGGGTGCTCCTGCTGGGGGATGTGGCCACACTGCCCCTCAGGAAGGTTCTGGCTGTGGTGGGGACTGCGGAGGCCAGCAGTGAACACCCCTTGGGCGTGGCAGTCACCAAATACTGTAAAGAGGAACTTGGAACAGAGACCTTGGGATACTGCACGGACTTCCAGGCAGTGCCAGGCTGTGGAATTGGGTGCAAAGTCAGCAACGTGGAAGGCATCCTGGCCCACAGTGAGCGCCCTTTGAGTGCACCGGCCAGTCACCTGAATGAGGCTGGCAGCCTTCCCGCAGAAAAAGATGCAGTCCCCCAGACCTTCTCTGTGCTGATTGGAAACCGTGAGTGGCTGAGGCGCAACGGTTTAACCATTTCTAGCGATGTCAGTGACGCTATGACAGACCACGAGATGAAAGGACAGACAGCCATCCTGGTGGCTATTGACGGTGTGCTCTGTGGGATGATCGCAATCGCAGACGCTGTCAAGCAGGAGGCTGCCCTGGCTGTGCACACGCTGCAGAGCATGGGTGTGGACGTGGTTCTGATCACGGGGGACAACCGGAAGACAGCCAGAGCTATTGCCACCCAGGTTGGCATCAACAAAGTCTTTGCAGAGGTGCTGCCTTCGCACAAGGTGGCCAAGGTCCAGGAGCTCCAGAATAAAGGGAAGAAAGTCGCCATGGTGGGGGATGGGGTCAATGACTCCCCGGCCTTGGCCCAGGCAGACATGGGTGTGGCCATTGGCACCGGCACGGATGTGGCCATCGAGGCAGCCGACGTCGTCCTTATCAGAAATGATTTGCTGGATGTGGTGGCTAGCATTCACCTTTCCAAGAGGACTGTCCGAAGGATACGCATCAACCTGGTCCTGGCACTGATTTATAACCTGGTTGGGATACCCATTGCAGCAGGTGTCTTCATGCCCATCGGCATTGTGCTGCAGCCCTGGATGGGCTCAGCGGCCATGGCAGCCTCCTCTGTGTCTGTGGTGCTCTCATCCCTGCAGCTCAAGTGCTATAAGAAGCCTGACCTGGAGAGGTATGAGGCACAGGCGCATGGCCACATGAAGCCCCTGACGGCATCCCAGGTCAGTGTGCACATAGGCATGGATGACAGGTGGCGGGACTCCCCCAGGGCCACACCATGGGACCAGGTCAGCTATGTCAGCCAGGTGTCGCTGTCCTCCCTGACGTCCGACAAGCCATCTCGGCACAGCGCTGCAGCAGACGATGATGGGGACAAGTGGTCTCTGCTCCTGAATGGCAGGGATGAGGAGCAGTACATC 8
同源臂
在一些實施例中，本文所述之病毒載體包含一或多個與靶基因座具有顯著序列同源性之側翼聚核苷酸序列(例如，同源臂)。在一些實施例中，同源臂側接編碼有效載荷之聚核苷酸序列(例如，一個同源臂處於有效載荷之5' (本文中亦稱作5'同源臂)且一個同源臂處於有效載荷之3' (本文中亦稱作3'同源臂))。在一些實施例中，同源臂指導有效載荷之位點特異性整合。
在一些實施例中，同源臂具有相同長度(本文中亦稱作平衡同源臂或均勻同源臂)。在一些實施例中，包含相同長度之同源臂(其中同源臂至少為一定長度)之病毒載體提供改善之作用(例如，改善之靶整合率)。在一些實施例中，同源臂之長度在100 nt與1000 nt之間。在一些實施例中，同源臂之長度在200 nt與1000 nt之間。在一些實施例中，同源臂之長度在500 nt與1500 nt之間。在一些實施例中，同源臂之長度在1000 nt與2000 nt之間。在一些實施例中，同源臂之長度大於2000 nt。在一些實施例中，各同源臂之長度為至少750 nt。在一些實施例中，各同源臂之長度為至少1000 nt。在一些實施例中，各同源臂之長度為至少1250 nt。在一些實施例中，同源臂之長度小於1000 nt。在一些實施例中，同源臂含有與靶基因座至少70%之同源性。在一些實施例中，同源臂含有與靶基因座至少80%之同源性。在一些實施例中，同源臂含有與靶基因座至少90%之同源性。在一些實施例中，同源臂含有與靶基因座至少95%之同源性。在一些實施例中，同源臂含有與靶基因座至少99%之同源性。在一些實施例中，同源臂含有與靶基因座100%之同源性。
在一些實施例中，同源臂具有不同長度(本文中亦稱作不平衡同源臂或不均勻同源臂)。在一些實施例中，與參考序列相比，包含不同長度之不平衡同源臂之病毒載體提供改善之作用(例如，增加之靶位點整合率)。在一些實施例中，與參考序列(例如，包含相同長度之同源臂之病毒載體或包含一或多個長度小於1000 nt之同源臂之病毒載體)相比，包含不同長度之同源臂(其中各同源臂至少為一定長度)之病毒載體提供改善之作用(例如，增加之靶位點整合率)。
在一些實施例中，各同源臂之長度大於500 nt。在一些實施例中，各同源臂之長度為至少750 nt。在一些實施例中，各同源臂之長度為至少1000 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少750 nt，且另一個同源臂之長度為至少1000 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少750 nt，且另一個同源臂之長度為至少1100 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少750 nt，且另一個同源臂之長度為至少1200 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少750 nt，且另一個同源臂之長度為至少1300 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少750 nt，且另一個同源臂之長度為至少1400 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少750 nt，且另一個同源臂之長度為至少1500 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少750 nt，且另一個同源臂之長度為至少1600 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少750 nt，且另一個同源臂之長度為至少1700 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少750 nt，且另一個同源臂之長度為至少1800 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少750 nt，且另一個同源臂之長度為至少1900 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少750 nt，且另一個同源臂之長度為至少2000 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1000 nt，且另一個同源臂之長度為至少1100 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1000 nt，且另一個同源臂之長度為至少1200 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1000 nt，且另一個同源臂之長度為至少1300 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1000 nt，且另一個同源臂之長度為至少1400 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1000 nt，且另一個同源臂之長度為至少1500 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1000 nt，且另一個同源臂之長度為至少1600 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1000 nt，且另一個同源臂之長度為至少1700 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1000 nt，且另一個同源臂之長度為至少1800 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1000 nt，且另一個同源臂之長度為至少1900 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1000 nt，且另一個同源臂之長度為至少2000 nt。在一些實施例中，一個同源臂之長度為至少1300 nt，且另一個同源臂之長度為至少1400 nt。在一些實施例中，5'同源臂長於3'同源臂。在一些實施例中，3'同源臂長於5'同源臂。
在一些實施例中，與參考序列(例如，缺乏同源臂之病毒載體)相比，包含同源臂之病毒載體提供改善之作用(例如，增加之靶位點整合率)。在一些實施例中，包含同源臂之病毒載體提供0.01%或更高(例如，0.05%或更高、0.1%或更高、0.2%或更高、0.3%或更高、0.4%或更高、0.5%或更高、0.6%或更高、0.7%或更高、0.8%或更高、0.9%或更高、1%或更高、1.5%或更高、2%或更高、5%或更高、10%或更高、20%或更高、30%或更高)之靶位點整合率。在一些實施例中，包含同源臂之病毒載體提供隨時間推移而增加之靶位點整合率。在一些實施例中，相對於靶位點整合之初始量測值，靶位點整合率隨時間推移而增加。在一些實施例中，靶位點整合率隨時間推移比靶位點整合之初始量測值高至少1.5X (例如，1.5X、2X、3X、4X、5X、10X、20X、30X、40X、50X、60X、70X、80X、90X、100X、200X)。在一些實施例中，在一或多天后量測靶位點整合率。在一些實施例中，在一或多週後量測靶位點整合率。在一些實施例中，在一或多個月後量測靶位點整合率。在一些實施例中，在一或多年后量測靶位點整合率。
在一些實施例中，相對於參考序列(例如，具有相同長度之同源臂之病毒載體、具有至少一個低於500 nt之同源臂之病毒載體)，包含不同長度之同源臂之病毒載體提供改善之作用(例如，增加之靶位點整合率)。在一些實施例中，相對於參考組合物(例如，具有相同長度之同源臂之病毒載體、具有至少一個低於500 nt之同源臂之病毒載體)，包含不同長度之同源臂之病毒載體提供至少1.1X、至少1.2X、至少1.3X、至少1.4X、至少1.5X、至少1.6X、至少1.7X、至少1.8X、至少1.9X、至少2.0X、至少2.5X、至少3.0X、至少3.5X或至少4.0X改善之編輯活性。
在一些實施例中，包含不同長度之同源臂之病毒載體提供0.01%或更高(例如，0.05%或更高、0.1%或更高、0.2%或更高、0.3%或更高、0.4%或更高、0.5%或更高、0.6%或更高、0.7%或更高、0.8%或更高、0.9%或更高、1%或更高、1.5%或更高、2%或更高、5%或更高、10%或更高、20%或更高、30%或更高)之靶位點整合率。在一些實施例中，包含不同長度之同源臂之病毒載體提供隨時間推移而增加之靶位點整合率。在一些實施例中，相對於靶位點整合之初始量測值，靶位點整合率隨時間推移而增加。在一些實施例中，靶位點整合率隨時間推移比靶位點整合之初始量測值高至少1.5X (例如，1.5X、2X、3X、4X、5X、10X、20X、30X、40X、50X、60X、70X、80X、90X、100X、200X)。在一些實施例中，在一或多天后量測靶位點整合率。在一些實施例中，在一或多週後量測靶位點整合率。在一些實施例中，在一或多個月後量測靶位點整合率。在一些實施例中，在一或多年后量測靶位點整合率。在一些實施例中，經由評估一或多個生物標誌物(例如，包含2A肽之生物標誌物)量測靶位點整合率。在一些實施例中，經由評估一或多個分離之核酸(例如，mRNA、gDNA)量測靶位點整合率。在一些實施例中，經由評估基因表現(例如，經由免疫組織化學染色)量測靶位點整合率。 表1：用於評估靶位點整合之示例性方法
檢定類型 分析之樣品 示例性方法 示例性方案
基因體DNA整合率 (gDNA Int%) 肝(冷凍) qPCR 對肝活檢體進行基因體DNA提取。運行qPCR方法以偵測含有靶上插入之對偶基因(例如，白蛋白)之百分比。
融合之mRNA 肝(冷凍) ddPCR 對肝活檢體進行RNA提取。運行ddPCR方法以定量融合之mRNA (自編輯之對偶基因轉錄之獨特嵌合mRNA)的複本數。此檢定量測標靶插入後之轉錄活性。
ALB-2A 血漿 ELISA 收集血液且處理血漿。使用專有ELISA量測2A標記之白蛋白(用於靶向整合之通用循環生物標誌物)。此檢定量測標靶插入後之總蛋白質表現。
肝細胞編輯% 固定之肝切片 IHC 將固定之肝切片且針對轉殖基因進行染色。對轉殖基因陽性細胞進行計數且用於計算肝細胞編輯之百分比。為靶向整合至白蛋白基因座中，轉殖基因表現應為肝細胞特異性的。此檢定側重於每個細胞之靶整合且與gDNA Int%正交，後者側重於每個對偶基因之靶整合。
在一些實施例中，包含不同長度之同源臂之病毒載體可在物種或物種之模型系統(例如，小鼠、人類或其模型)中提供改善之基因編輯。在一些實施例中，當針對特定物種或特定物種之模型系統(例如，小鼠、人類或其模型)中之表現進行最佳化時，病毒載體可包含同源臂長度之不同組合。在一些實施例中，與第二個物種或第二個物種之模型系統(例如，小鼠、純小鼠模型)相比，包含同源臂長度之特定組合的病毒載體可在一個物種或一個物種之模型系統(例如，人類、人源化小鼠模型)中提供改善之基因編輯。在一些實施例中，與第二個物種或第二個物種之模型系統(例如，小鼠、純小鼠模型)相比，包含同源臂長度之特定組合的病毒載體可針對一個物種或一個物種之模型(例如，人類、人源化小鼠模型)中高水準之基因編輯進行最佳化。
在一些實施例中，同源臂指導緊接在高度表現之內源基因之後的轉殖基因之整合。在一些實施例中，同源臂指導轉殖基因之整合而不會破壞內源基因表現(非破壞性整合)。 同源臂設計與最佳化
在一些實施例中，當針對表現進行最佳化時，病毒載體可包含同源臂長度之不同組合。
本揭示案涵蓋認識到同源臂之不同設計在各種病毒載體(例如，包含不同表現卡匣之病毒載體，該等表現卡匣包括轉殖基因及2A序列)之情形中可能為有利的。舉例而言，在一些實施例中，若病毒載體包含表現卡匣，該表現卡匣包含轉殖基因、2A序列(例如，P2A)及總組合長度為至少2.7 kb (例如，留下約2 kb或更短用於給定典型AAV之包裝容量之同源臂)的ITR，則可能較佳使用相同長度之同源臂(亦即，平衡設計)，以維持各同源臂之長度盡可能接近1kb。此種設計可提供改善之整合效率。
在一些其他實施例中，如圖2中所展示，若病毒載體包含表現卡匣，該表現卡匣包含轉殖基因、2A序列(例如，P2P)及總計小於2.7 kb (例如，留下大於2 kb用於給定典型AAV之包裝容量之同源臂)的ITR，則較佳使用不同長度之同源臂(亦即，不平衡設計)，且可提供改善之整合效率。在一些實施例中，病毒載體可包含不同長度之同源臂，其中3'同源臂為1 kb且5'同源臂更長(例如，載體之包裝容量所允許之最大值)。預期此種設計可在物種(例如，人類)中提供改善之整合效率。
本揭示案涵蓋認識到同源臂之不同設計在物種或物種之模型系統(例如，小鼠、人類或其模型)中之基因編輯的情形下可能為有利的。舉例而言，在一些實施例中，如圖5中所展示，若病毒載體包含表現卡匣，該表現卡匣包含轉殖基因、2A序列(例如，P2A)及總計小於2.7 kb (例如，留下大於2 kb用於給定典型AAV之包裝容量之同源臂)的ITR，則較佳使用不同長度之同源臂(亦即，不平衡設計)，其中3'同源臂為1 kb且5'同源臂更長(例如，載體之包裝容量所允許之最大值(例如，1.6 kb))，且在物種(例如，人類)中可提供改善之整合效率。相比之下，在一些實施例中，如圖2中所展示，若如本文所述之病毒載體包含表現卡匣，該表現卡匣包含轉殖基因、2A序列(例如，P2A)及總計小於2.7 kb (例如，留下大於2 kb用於給定典型AAV之包裝容量之同源臂)的ITR，則較佳使用不同長度之同源臂(亦即，不平衡設計)，其中5'同源臂為1 kb且3'同源臂更長(例如，載體之包裝容量所允許之最大值(例如，1.6 kb))，且在物種(例如，小鼠)中可提供改善之整合效率。 治療方法
本文所揭示之組合物及構築體可用於任何活體外或活體內應用中，其中需要自細胞中之特定靶基因座表現有效載荷(例如，轉殖基因)，同時在靶基因座處及周圍維持內源基因之表現。舉例而言，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療個體之病症、疾病或醫學疾患(例如，經由基因療法)。
在一些實施例中，治療包括獲得或維持所需藥理及/或生理作用。在一些實施例中，所需藥理及/或生理作用可包括完全或部分地預防疾病(例如，預防疾病症狀)。在一些實施例中，所需藥理及/或生理作用可包括完全或部分地治愈疾病(例如，治愈與疾病相關之不良作用)。在一些實施例中，所需藥理及/或生理作用可包括預防疾病復發。在一些實施例中，所需藥理及/或生理作用可包括減緩疾病進展。在一些實施例中，所需藥理及/或生理作用可包括緩解疾病症狀。在一些實施例中，所需藥理及/或生理作用可包括預防疾病退化。在一些實施例中，所需藥理及/或生理作用可包括穩定及/或減輕與疾病相關之症狀。
在一些實施例中，治療包括在疾病發作之前、期間或之後(例如，在與疾病相關之症狀出現之前、期間或之後)投與組合物。在一些實施例中，治療包括組合療法(例如，與一或多種療法，包括不同類型之療法組合)。 所關注之疾病
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療包括遺傳缺陷或異常作為疾病之組成部分的所關注之任何疾病。
作為具體實例，在一些實施例中，諸如本文所揭示之彼等的組合物及構築體可用於治療支鏈有機酸尿症(例如，楓糖尿症(MSUD)、甲基丙二酸血症(MMA)、丙酸血症(PA)、異戊酸血症(IVA)、精胺醯丁二酸尿症)。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因(例如，BCKDH複合物(E1a、E1b及E2亞單位)、甲基丙二醯-CoA變位酶、丙醯-CoA羧化酶(α及β亞單位)、異戊醯CoA去氫酶、精胺醯丁二酸裂解酶(ASL)及/或其變異體)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括減少與支鏈有機酸尿症相關之異常蛋白質(例如，非功能性蛋白質)。在一些實施例中，治療包括減少與支鏈有機酸尿症相關之徵象及/或症狀(例如，張力減退、發育遲緩、癲癇發作、視神經萎縮、急性腦病、換氣過度、呼吸窘迫、溫度不穩定、反復嘔吐、酮酸中毒、胰臟炎、便秘、嗜中性球減少症、全部血球減少症、繼發性紅血球吞噬症、心律不整、心肌病、慢性腎衰竭、皮炎、聽力喪失)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療脂肪酸氧化障礙(例如，三功能蛋白缺乏症、長鏈L-3羥醯基-CoA去氫酶(LCAD)缺乏症、中鏈醯基-CoA去氫酶(MCHAD)缺乏症、極長鏈醯基-CoA去氫酶(VLCHAD)缺乏症)。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因(例如，HADHA、HADHB、LCHAD、ACADM、ACADVL及/或其變異體)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括減少與脂肪酸氧化障礙相關之異常蛋白質(例如，非功能性蛋白質)。在一些實施例中，治療包括減少與脂肪酸氧化障礙相關之徵象及/或症狀(例如，肝增大、精神及身體發育遲緩、心肌無力、心律不整、神經損傷、肝功能異常、橫紋肌溶解症、肌紅蛋白尿、低血糖症、代謝性酸中毒、呼吸窘迫、肝腫大、張力減退、心肌病)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療糖原貯積病(例如，1型糖原貯積病(GSD1)、2型糖原貯積病(龐貝病(Pompe disease)，GSD2)。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因(例如，G6PC (GSD1a)、G6PT1 (GSD1b)、SLC17A3、SLC37A4 (GSD1c)、酸性α-葡萄糖苷酶及/或其變異體)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括減少與糖原貯積病相關之異常蛋白質(例如，非功能性蛋白質)。在一些實施例中，治療包括減少與糖原貯積病相關之徵象及/或症狀(例如，肝增大、低血糖症、肌無力、肌痙攣、疲勞、發育遲緩、肥胖症、出血障礙、肝功能異常、腎功能異常、呼吸功能異常、心功能異常、口瘡、痛風、硬化、纖維化、肝腫瘤)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療肉鹼循環障礙。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因(例如，OCTN2、CPT1、CACT、CPT2及/或其變異體)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括減少與肉鹼循環障礙相關之異常蛋白質(例如，非功能性蛋白質)。在一些實施例中，治療包括減少與肉鹼循環障礙相關之徵象及/或症狀(例如，低酮酸性低血糖症、心肌病、肌無力、疲勞、運動發育遲緩、水腫)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療尿素循環障礙。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因(例如，CPS1、ARG1、ASL、OTC及/或其變異體)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括減少與尿素循環障礙相關之異常蛋白質(例如，非功能性蛋白質)。在一些實施例中，治療包括減少與尿素循環障礙相關之徵象及/或症狀(例如，嘔吐、噁心、行為異常、疲勞、昏迷、精神病、嗜睡、週期性嘔吐、近視、高氨血症、鳥胺酸水準升高)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療克里格勒-納賈爾症候群。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因(例如，UGT1A1及/或其變異體)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括減少與克里格勒-納賈爾症候群相關之異常蛋白質(例如，非功能性蛋白質)。在一些實施例中，治療包括減少與克里格勒-納賈爾症候群相關之徵象及/或症狀(例如，黃疸、核黃疸、嗜睡、嘔吐、發熱、反射異常、肌痙攣、角弓反張、痙攣狀態、張力減退、手足徐動、膽紅素水準升高、腹瀉、口齒不清、意識模糊、吞嚥困難、癲癇發作)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療遺傳性酪胺酸血症。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因(例如，FAH及/或其變異體)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括減少與遺傳性酪胺酸血症相關之異常蛋白質(例如，非功能性蛋白質)。在一些實施例中，治療包括減少與遺傳性酪胺酸血症相關之徵象及/或症狀(例如，肝腫大、黃疸、肝病、硬化、肝癌、發熱、腹瀉、黑便、嘔吐、脾腫大、水腫、凝血病、腎功能異常、佝僂病、虛弱、張力亢進、腸阻塞、心動過速、高血壓、神經危象、呼吸衰竭、心肌病)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療水疱性表皮鬆解症。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因(例如，COL7A1、COL17A1、MMP1、KRT5、LAMA3、LAMB3、LAMC2、ITGB4及/或其變異體)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括減少與水疱性表皮鬆解症相關之異常蛋白質(例如，非功能性蛋白質)。在一些實施例中，治療包括減少與水疱性表皮鬆解症相關之徵象及/或症狀(例如，皮膚脆弱、指甲生長異常、水疱、皮膚增厚、瘢痕性脫髮、萎縮性瘢痕、粟丘疹、牙齒問題、嚥物困難、皮膚瘙癢及疼痛)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療α-1抗胰蛋白酶缺乏症(A1ATD)。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因(例如，α-1抗胰蛋白酶(A1AT)及/或其變異體)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括減少與α-1抗胰蛋白酶缺乏症相關之異常蛋白質(例如，非功能性蛋白質)。在一些實施例中，治療包括減少與A1ATD相關之徵象及/或症狀(例如，氣腫、慢性咳嗽、生痰、喘息、慢性呼吸道感染、黃疸、肝增大、出血、異常體液積聚、肝酶升高、肝功能障礙、門靜脈高壓症、疲勞、水腫、慢性活動性肝炎、硬化、肝癌、脂層炎)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療威爾遜氏病(Wilson's disease)。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因(例如，ATP7B及/或其變異體)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括減少與威爾遜氏病相關之異常蛋白質(例如，非功能性蛋白質)。在一些實施例中，治療包括減少與威爾遜氏病相關之徵象及/或症狀(例如，疲勞、食慾不振、腹痛、黃疸、凱塞-弗萊休環(Kayser-Fleischer ring)、水腫、言語問題、吞嚥問題、身體協調喪失、失控運動、肌肉僵硬、肝病、貧血、抑鬱症、精神分裂症、閉經、不孕症、腎結石、腎小管損傷、關節炎、骨質疏鬆症、骨贅)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療血液疾病(例如，A型血友病、B型血友病)。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因(例如，因子IX (FIX)、因子VIII (FVIII)及/或其變異體)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括減少與血液疾病相關之異常蛋白質(例如，非功能性蛋白質)。在一些實施例中，治療包括減少與血液疾病相關之徵象及/或症狀(例如，過度出血、異常淤血、關節疼痛及腫脹、血尿、血便、異常鼻出血、頭痛、嗜睡、嘔吐、複視、虛弱、抽搐、癲癇發作)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療遺傳性血管水腫。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因(例如，C1酯酶抑制物(C1-inh))之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括減少與遺傳性血管水腫相關之異常蛋白質(例如，非功能性蛋白質)。在一些實施例中，治療包括減少與遺傳性血管水腫相關之徵象及/或症狀(例如，水腫、瘙癢、蕁麻疹、噁心、嘔吐、急性腹痛、嚥物困難、發音困難、喘鳴)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療帕金森氏病(Parkinson's disease)。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因(例如，多巴胺去羧酶(DDC))之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括減少與帕金森氏病相關之異常蛋白質(例如，非功能性蛋白質)。在一些實施例中，治療包括減少與帕金森氏病相關之徵象及/或症狀(例如，震顫、運動徐緩、肌肉僵硬、姿勢及平衡受損、自發運動喪失、言語改變、書寫改變)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療肌肉疾病。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因(例如，肌營養不良症、杜氏肌營養不良症(Duchenne's muscular dystrophy，DMD)、肢帶肌營養不良症、X連鎖肌管性肌病)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括減少與肌肉疾病相關之異常蛋白質(例如，非功能性蛋白質)。在一些實施例中，治療包括減少與肌肉疾病相關之徵象及/或症狀(例如，運動困難、小腿後肌增大、肌肉疼痛及僵硬、發育遲緩、學習障礙、步態異常、脊柱側彎、呼吸問題、吞嚥困難、心律不整、心肌病、關節功能異常、張力減退、呼吸窘迫、反射消失)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療黏多醣貯積症(MPS) (例如，MPS IH、MPS IH/S、MPS IS、MPS II、MPS IIIA、MPS IIIB、MPS IIIC、MPS IIID、MPS IVA、MPS IVB、MPS V、MPS VI、MPS VII、MPS IX)。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因(例如，IDUA、IDS、SGSH、NAGLU、HGSNAT、GNS、GALNS、GLB1、ARSB、GUSB、HYAL1)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括減少與黏多醣貯積症相關之異常蛋白質(例如，非功能性蛋白質)。在一些實施例中，治療包括減少與MPS相關之徵象及/或症狀(例如，心臟異常、呼吸不規則、肝增大、脾增大、神經異常、發育遲緩、反復感染、持續流鼻涕、呼吸嘈雜、角膜混濁、胖大舌、脊柱畸形、關節僵硬、腕隧道、主動脈瓣閉鎖不全、進行性聽力喪失、癲癇發作、步態不穩、硫酸乙醯肝素積聚、酶缺乏、骨骼及肌肉組織異常、心臟病、囊腫、軟組織腫塊)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療溶酶體酸性脂肪酶缺乏症。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因(例如，LIPA及/或其變異體)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括減少與溶酶體酸性脂肪酶缺乏症相關之異常蛋白質(例如，非功能性蛋白質)。在一些實施例中，治療包括減少與溶酶體酸性脂肪酶缺乏症相關之徵象及/或症狀(例如，嘔吐、腹瀉、腹部腫脹及體重增加失敗、體重減輕、黃疸、發熱、鈣化、貧血、肝功能障礙或衰竭、惡病質、吸收不良、膽管問題、心臟病、中風)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療高胱胺酸尿症(HCU)。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因(例如，胱硫醚-β-合成酶或CBS基因、MTHFR及/或其變異體)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括增加個體代謝甲硫胺酸之能力。在一些實施例中，治療包括減少與HCU相關之徵象及/或症狀(例如，近視、智力障礙、體重增加無能、骨骼虛弱、癲癇發作、血栓)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療與膽酸代謝、轉運及/或膽汁淤積相關之病症。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因(例如，PFIC1、PFIC2、PFIC3、ABCB4及/或其變異體)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括減少與膽酸代謝、轉運及/或膽汁淤積相關之異常蛋白質(例如，非功能性蛋白質)。在一些實施例中，治療包括減少與膽酸代謝、轉運及/或膽汁淤積相關之徵象及/或症狀(例如，瘙癢、黃疸、成長遲緩、門靜脈高壓症、肝脾腫大、腹瀉、胰臟炎、肝細胞癌)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療苯酮尿症。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因(例如，苯丙胺酸羥化酶(PAH)及/或其變異體)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括減少與苯酮尿症相關之異常蛋白質(例如，非功能性蛋白質)。在一些實施例中，治療包括減少與苯丙酮尿症相關之徵象及/或症狀(例如，呼吸、皮膚及/或尿液中之黴味、癲癇發作、皮疹、小頭畸形、過動症、智力障礙、哮喘、濕疹、貧血、體重增加、腎功能不全、骨質疏鬆症、胃炎、食道及腎臟缺陷、腎結石、高血壓、精神問題、頭暈)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療原發性高草酸鹽尿症。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因(例如，AGT、AGXT、GRHPR、HOGA1及/或其變異體)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括減少與原發性高草酸鹽尿症相關之異常蛋白質(例如，非功能性蛋白質)。在一些實施例中，治療包括減少與苯丙酮尿症相關之徵象及/或症狀(例如，腰痛、草酸中毒、腎結石及/或泌尿道其他部位(諸如膀胱或尿道)結石、腎鈣沈積病、血尿、排尿困難、尿頻、腎絞痛、尿路阻塞、反復尿路感染、腎損傷、腎衰竭、成長遲緩)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療卟啉症。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因(例如，ALAD、HMBS、UROS、UROD、CPOX、PPOCX、FECH、ALAS2及/或其變異體)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括減少與卟啉症相關之異常蛋白質(例如，非功能性蛋白質)。在一些實施例中，治療包括減少與卟啉症相關之徵象及/或症狀(例如，腹痛、手臂及腿部疼痛、全身無力、嘔吐、意識模糊、便秘、心動過速、血壓波動、尿瀦留、精神病、幻覺、癲癇發作、擦傷、水疱、皮膚糜爛、皮膚病變、噁心、血壓升高、意識模糊)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療與抗體產生相關之病症(例如，自體免疫病症)。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因(例如，POLB、HLA-DRB1、IL7R、CYP27B1、TNFRSF1A、HLA-B、HLA-DPB1、HLA-DRB1、IRF5、PTPN22、RBPJ、RUNX1、STAT4及/或其變異體)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括減少與抗體產生相關之異常蛋白質(例如，非功能性蛋白質)。在一些實施例中，治療包括減少與抗體產生相關之徵象及/或症狀(例如，關節腫脹、關節僵硬、疲勞、發熱、食慾不振、視力問題、震顫、步態不穩、頭暈、皮疹、病變、痛覺過敏)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物及構築體可用於治療與分泌蛋白產生相關之病症。在一些實施例中，治療包括引入編碼一或多個所關注之轉殖基因之聚核苷酸序列。在一些實施例中，治療包括減少與分泌蛋白產生相關之異常蛋白質(例如，非功能性蛋白質)。在一些實施例中，治療包括減少與分泌蛋白產生相關之徵象及/或症狀。 靶向整合
在一些實施例中，本文所提供之組合物及構築體指導在靶基因座(例如，內源基因)處整合有效載荷(例如，轉殖基因及/或功能性核酸)。在一些實施例中，本文所提供之組合物及構築體指導在特定細胞類型中之靶基因座(例如，組織特異性基因座)處整合有效載荷。在一些實施例中，有效載荷之整合在特定組織(例如，肝、中樞神經系統(CNS)、肌肉、腎、血管、肺)中發生。在一些實施例中，有效載荷之整合在多個組織(例如，肝、中樞神經系統(CNS)、肌肉、腎、血管、肺)中發生。
在一些實施例中，本文所提供之組合物及構築體指導在視為安全港位點之靶基因座處整合有效載荷(例如，白蛋白、脂蛋白元A2 (ApoA2)、結合球蛋白)。在一些實施例中，靶基因座可選自適於與本文所提供之方法及組合物一起使用之任何基因體位點。在一些實施例中，靶基因座編碼多肽。在一些實施例中，靶基因座編碼在個體(例如，未罹患疾病、病症或疾患之個體，或罹患疾病、病症或疾患之個體)中高度表現之多肽。在一些實施例中，有效載荷之整合在一或多個內源基因(例如，編碼多肽之基因)之5'或3'末端處發生。在一些實施例中，有效載荷之整合在一或多個內源基因(例如，編碼多肽之基因)之5'或3'末端之間發生。
在一些實施例中，本文所提供之組合物及構築體指導在靶基因座處整合有效載荷，具有最小或無脫靶整合(例如，在非靶基因座處之整合)。在一些實施例中，本文所提供之組合物及構築體指導在靶基因座處整合有效載荷，與參考組合物或構築體相比(例如，相對於無側翼同源序列之組合物或構築體)脫靶整合減少。
在一些實施例中，在靶基因座處轉殖基因之整合允許有效載荷之表現，而不會破壞內源基因表現。在一些實施例中，在靶基因座處轉殖基因之整合允許自內源啟動子表現有效載荷。在一些實施例中，在靶基因座處轉殖基因之整合破壞內源基因表現。在一些實施例中，在靶基因座處轉殖基因之整合破壞內源基因表現，而不會對靶細胞及/或個體產生不利影響(例如，藉由靶向安全港位點)。在一些實施例中，在靶基因座處轉殖基因之整合不需要使用核酸酶(例如，Cas蛋白、核酸內切酶、TALEN、ZFN)。在一些實施例中，在靶基因座處轉殖基因之整合係藉由使用核酸酶(例如，Cas蛋白、核酸內切酶、TALEN、ZFN)來輔助。
在一些實施例中，在靶基因座處轉殖基因之整合賦予選擇性優勢(例如，相對於組織中之其他細胞，在多個細胞中之存活率增加)。在一些實施例中，選擇性優勢可在一或多個表現轉殖基因之組織中產生百分比增加之細胞。 組合物
在一些實施例中，可使用本文所提供之方法及構築體(例如，病毒載體)產生組合物。在一些實施例中，組合物包括液體、固體及氣體組合物。在一些實施例中，組合物包含額外成分(例如，稀釋劑、穩定劑、賦形劑、佐劑)。在一些實施例中，額外成分尤其可包括緩沖劑(例如，磷酸鹽、檸檬酸鹽、有機酸緩沖劑)、抗氧化劑(例如，抗壞血酸)、低分子量多肽(例如，少於10個殘基)、各種蛋白質(例如，血清白蛋白、明膠、免疫球蛋白)、親水聚合物(例如，聚乙烯吡咯啶酮)、胺基酸(例如，甘胺酸、麩醯胺、天冬醯胺、精胺酸、離胺酸)、碳水化合物(例如，單醣、雙醣、葡萄糖、甘露糖、糊精)、螯合劑(例如，EDTA )、糖醇(例如，甘露糖醇、山梨糖醇)、成鹽相對離子(例如，鈉、鉀)及/或非離子表面活性劑(例如，Tween™、Pluronics™、聚乙二醇(PEG))。在一些實施例中，水性載劑為水性pH緩衝溶液。
在一些實施例中，本文所提供之組合物可按一定劑量範圍提供。在一些實施例中，本文所提供之組合物可按單個劑量提供。在一些實施例中，本文所提供之組合物可按多個劑量提供。在一些實施例中，經一定時間段提供組合物。在一些實施例中，以特定時間間隔(例如，變化之時間間隔、設定之時間間隔)提供組合物。在一些實施例中，劑量可取決於劑型及投藥途徑而變化。在一些實施例中，本文所提供之組合物可按1e11與1e14 vg/kg之間的劑量提供。在一些實施例中，本文所提供之組合物可按1e11與1e12 vg/kg之間的劑量提供。在一些實施例中，本文所提供之組合物可按1e12與1e13 vg/kg之間的劑量提供。在一些實施例中，本文所提供之組合物可按1e12與1e14 vg/kg之間的劑量提供。在一些實施例中，本文所提供之組合物可按1e14與1e15 vg/kg之間的劑量提供。在一些實施例中，本文所提供之組合物可按不大於1e14 vg/kg之劑量提供。在一些實施例中，本文所提供之組合物可按不大於1e15 vg/kg之劑量提供。
在一些實施例中，可向特定時間點(例如，個體年齡)之個體投與本文所提供之組合物。在一些實施例中，可向初生個體投與本文所提供之組合物。在一些實施例中，可向新生個體投與本文所提供之組合物。在一些實施例中，新生小鼠個體在0日齡與7日齡之間。在一些實施例中，新生人類個體在0日齡與1月齡之間。在一些實施例中，可向7日齡與30日齡之間的個體投與本文所提供之組合物。在一些實施例中，可向3月齡與1歲齡之間的個體投與本文所提供之組合物。在一些實施例中，可向1歲齡與5歲齡之間的個體投與本文所提供之組合物。在一些實施例中，可向4歲齡與7歲齡之間的個體投與本文所提供之組合物。在一些實施例中，可向5歲齡或更大年齡之個體投與本文所提供之組合物。
在一些實施例中，可基於特定組織或器官之生長階段(例如，估計/平均成年體型或體重之百分比)向特定時間點之個體投與本文所提供之組合物。在一些實施例中，可向其中組織或器官(例如，肝、肌肉、CNS、肺等)為估計/平均成年體型或體重之至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少99%之個體投與本文所提供之組合物。在一些實施例中，可向其中組織或器官為估計/平均成年體型或體重之約20% (+/- 5%)之個體投與本文所提供之組合物。在一些實施例中，可向其中組織或器官為估計/平均成年體型或體重之約50% (+/- 5%)之個體投與本文所提供之組合物。在一些實施例中，可向其中組織或器官為估計/平均成年體型或體重之約60% (+/- 5%)之個體投與本文所提供之組合物。在一些實施例中，特定組織或器官之估計/平均成年體型或體重可如此項技術中所述來確定(參見Noda等人Pediatric radiology, 1997；Johnson等人Liver transplantation, 2005；及Szpinda等人Biomed research international, 2015，各自以全文引用之方式併入本文中)。 投藥途徑
在一些實施例中，可經由此項技術中已知之多種途徑中之任一者(或多者) (例如，非經腸、皮下、靜脈內、顱內、脊柱內、眼內、肌肉內、陰道內、腹膜內、表皮、皮內、經直腸、經肺、骨內、經口、經頰、門靜脈內、動脈內、氣管內或經鼻)向個體投與本文所提供之組合物。在一些實施例中，可將本文所提供之組合物引入細胞中，接著引入個體(例如，肝、肌肉、中樞神經系統(CNS)、肺、血液細胞)中。在一些實施例中，可經由此項技術中已知之遞送方法(例如，注射、導管)引入本文所提供之組合物。 產生病毒載體之方法 病毒載體之產生
在一些實施例中，病毒載體(例如，AAV病毒載體)之產生可包括產生病毒載體之上游步驟(例如，基於細胞之培養)及加工病毒載體之下游步驟(例如，純化、調配等)。在一些實施例中，上游步驟可包括細胞擴充、細胞培養、細胞轉染、細胞溶解、病毒載體產生及/或病毒載體收集中之一或多者。
在一些實施例中，下游步驟可包括分離、過濾、濃縮、澄清、純化、層析(例如，親和、離子交換、疏水、混合模式)、離心(例如，超速離心)及/或調配中之一或多者。
在一些實施例中，相對於參考構築體或方法，例如Xiao等人 1998及Grieger等人 2015 (各自以全文引用之方式併入本文中)中之彼等構築體或方法，本文所述之構築體及方法經設計以增加病毒載體產量(例如，AAV載體產量)，降低有複製能力之病毒載體(例如，有複製能力之AAV (rcAAV))之水準，提高病毒載體包裝效率(例如，AAV載體衣殼包裝)，及/或其任何組合。 細胞株及轉染試劑
在一些實施例中，病毒載體之產生包括使用細胞(例如，細胞培養物)。在一些實施例中，病毒載體之產生包括使用一或多種細胞株(例如，哺乳動物細胞株)之細胞培養物。在一些實施例中，病毒載體之產生包括使用HEK293細胞株或其變異體(例如，HEK293T、HEK293F細胞株)。在一些實施例中，細胞能夠在懸浮液中生長。在一些實施例中，細胞由黏附細胞組成。在一些實施例中，細胞能夠在不包含動物組分(例如，動物血清)之培養基中生長。在一些實施例中，細胞能夠在無血清培養基(例如，F17培養基、Expi293培養基)中生長。在一些實施例中，病毒載體之產生包括用表現構築體(例如，質體)轉染細胞。在一些實施例中，針對病毒載體(例如，AAV載體)之高表現來選擇細胞。在一些實施例中，針對病毒載體之高包裝效率(例如，AAV載體之衣殼包裝)來選擇細胞。在一些實施例中，針對提高之轉染效率(例如，使用化學轉染試劑，包括陽離子分子)來選擇細胞。在一些實施例中，針對病毒載體(例如，AAV載體)之高表現對細胞進行工程化。在一些實施例中，針對病毒載體之高包裝效率(例如，AAV載體之衣殼包裝)對細胞進行工程化。在一些實施例中，針對提高之轉染效率(例如，使用化學轉染試劑，包括陽離子分子)對細胞進行工程化。在一些實施例中，可針對上述屬性中之兩者或更多者對細胞進行工程化或選擇。在一些實施例中，使細胞與一或多種表現構築體(例如，質體)接觸。在一些實施例中，使細胞與一或多種轉染試劑(例如，化學轉染試劑，包括脂質、聚合物及陽離子分子)及一或多種表現構築體接觸。在一些實施例中，使細胞與一或多種陽離子分子(例如，陽離子脂質、PEI試劑)及一或多種表現構築體接觸。在一些實施例中，使細胞與PEIMAX試劑及一或多種表現構築體接觸。在一些實施例中，使細胞與FectoVir-AAV試劑及一或多種表現構築體接觸。在一些實施例中，使細胞與一或多種轉染試劑及一或多種表現構築體以特定比率接觸。在一些實施例中，轉染試劑與表現構築體之比率提高病毒載體之產生(例如，提高之載體產量、提高之包裝效率及/或提高之轉染效率)。 表現構築體
在一些實施例中，表現構築體為或包含一或多個聚核苷酸序列(例如，質體)。在一些實施例中，表現構築體包含特定聚核苷酸序列元件(例如，有效載荷、啟動子、病毒基因等)。在一些實施例中，表現構築體包含編碼病毒基因(例如， rep或 cap基因或基因變異體、一或多個輔助病毒基因或基因變異體)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，特定類型之表現構築體包含聚核苷酸序列元件之特定組合。在一些實施例中，特定類型之表現構築體不包含聚核苷酸序列元件之特定組合。在一些實施例中，特定表現構築體不包含編碼 rep及 cap基因及/或基因變異體之聚核苷酸序列元件。
在一些實施例中，表現構築體包含編碼野生型病毒基因(例如，野生型 rep基因、 cap基因、病毒輔助基因或其組合)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，表現構築體包含編碼病毒輔助基因或基因變異體(例如，疱疹病毒基因或基因變異體、腺病毒基因或基因變異體)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，表現構築體包含編碼表現一或多個野生型Rep蛋白之一或多個基因複本(例如，1個複本、2個複本、3個複本、4個複本、5個複本等)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，表現構築體包含編碼表現一或多個野生型Rep蛋白(例如，Rep68、Rep40、Rep52、Rep78或其組合)之單個基因複本之聚核苷酸序列。在一些實施例中，表現構築體包含編碼一或多個野生型Rep蛋白(例如，Rep68、Rep40、Rep52、Rep78或其組合)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，表現構築體包含編碼至少四個野生型Rep蛋白(例如，Rep68、Rep40、Rep52、Rep78)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，表現構築體包含編碼Rep68、Rep40、Rep52及Rep78中之每一者之聚核苷酸序列。在一些實施例中，表現構築體包含編碼一或多個野生型腺病毒輔助蛋白(例如，E2及E4)之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，表現構築體包含編碼野生型病毒基因(例如， rep基因、 cap基因、輔助基因)之野生型聚核苷酸序列。在一些實施例中，表現構築體包含編碼野生型病毒基因(例如， rep基因、 cap基因、輔助基因)之經修飾聚核苷酸序列(例如，密碼子最佳化)。在一些實施例中，表現構築體包含編碼經修飾病毒基因(例如， rep基因、 cap基因、輔助基因)之經修飾聚核苷酸序列。在一些實施例中，針對某些改善(例如，改善之轉導、組織特異性、減小之尺寸、降低之免疫反應、改善之包裝、降低之rcAAV水準等)對經修飾之病毒基因進行設計及/或工程化。
根據各種實施例，與先前技術相比，本文所揭示之表現構築體可提供增加之靈活性及模組化。在一些實施例中，本文所揭示之表現構築體可允許交換各種聚核苷酸序列(例如，不同 rep基因、 cap基因、有效載荷、輔助基因、啟動子等)，同時提供某些改善(例如，增加之病毒載體產量、增加之包裝、降低之rcAAV水準等)。在一些實施例中，本文所揭示之表現構築體與各種上游產生過程(例如，不同細胞培養條件、不同轉染試劑等)相容，同時提供某些改善(例如，增加之病毒載體產量、增加之包裝、降低之rcAAV水準等)。
在一些實施例中，不同類型之表現構築體包含聚核苷酸序列之不同組合。在一些實施例中，一種類型之表現構築體包含不存在於不同類型之表現構築體中之一或多個聚核苷酸序列元件(例如，有效載荷、啟動子、病毒基因等)。在一些實施例中，一種類型之表現構築體包含編碼病毒基因(例如， rep或 cap基因或基因變異體)之聚核苷酸序列元件及編碼有效載荷(例如，轉殖基因及/或功能性核酸)之聚核苷酸序列元件。在一些實施例中，一種類型之表現構築體包含編碼一或多個病毒基因(例如， rep或 cap基因或基因變異體及/或一或多個輔助病毒基因)之聚核苷酸序列元件。在一些實施例中，一種類型之表現構築體包含編碼一或多個病毒基因之聚核苷酸序列元件，其中該等病毒基因係來自一或多種病毒類型(例如，來自AAV及腺病毒之基因或基因變異體)。在一些實施例中，來自腺病毒之病毒基因為基因及/或基因變異體。在一些實施例中，來自腺病毒之病毒基因為E2A (例如，E2A DNA結合蛋白(DBP)、E4 (例如，E4開放閱讀框(ORF) 2、ORF3、ORF4、ORF6/7)、VA及/或其變異體中之一或多者。
在一些實施例中，表現構築體用於產生病毒載體(例如，經由細胞培養)。在一些實施例中，使表現構築體與一或多種轉染試劑(例如，化學轉染試劑)組合與細胞接觸。在一些實施例中，使表現構築體與一或多種轉染試劑組合以特定比率與細胞接觸。在一些實施例中，使不同類型之表現構築體與一或多種轉染試劑組合以特定比率(例如，重量比)與細胞接觸。在一些實施例中，使不同類型之表現構築體以約10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10比率(例如，重量比)與細胞接觸。在一些實施例中，使包含一或多個病毒輔助基因之第一表現構築體及包含一或多個有效載荷之第二表現構築體以第一表現構築體與第二表現構築體之約10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10比率(例如，重量比)與細胞接觸。在一些實施例中，使包含一或多個有效載荷之第一表現構築體及包含一或多個病毒輔助基因之第二表現構築體以第一表現構築體與第二表現構築體之約10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10比率(例如，重量比)與細胞接觸。在一些實施例中，表現構築體之特定比率提高AAV之產生(例如，增加之病毒載體產量、增加之包裝效率及/或增加之轉染效率)。在一些實施例中，使細胞與兩種或更多種表現構築體接觸(例如，依序或實質上同時)。在一些實施例中，使三種或更多種表現構築體與細胞接觸。在一些實施例中，表現構築體包含一或多個啟動子(例如，一或多個外源啟動子)。在一些實施例中，啟動子為或包含CMV、RSV、CAG、EF1α、PGK、A1AT、C5-12、MCK、結蛋白(desmin)、p5、p40或其組合。在一些實施例中，表現構築體包含特定聚核苷酸序列元件(例如， rep或 cap基因或基因變異體)上游之一或多個啟動子。在一些實施例中，表現構築體包含特定聚核苷酸序列元件(例如， rep或 cap基因或基因變異體)下游之一或多個啟動子。
在一些實施例中，表現構築體包含一或多個編碼細胞培養(例如，細菌細胞培養、哺乳動物細胞培養)所必需之元件(例如，選擇標誌物、複製起點)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，表現構築體包含一或多個編碼抗生素抗性基因(例如，康黴素抗性基因、胺苄青黴素抗性基因)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，表現構築體包含一或多個編碼細菌複製起點(例如，colE1複製起點)之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，表現構築體包含一或多個轉錄終止序列(例如，polyA序列)。在一些實施例中，表現構築體包含BGH polyA、FIX polyA、SV40 polyA、合成polyA或其組合中之一或多者。在一些實施例中，表現構築體包含特定序列元件(例如， rep或 cap基因或基因變異體)下游之一或多個轉錄終止序列。在一些實施例中，表現構築體包含特定序列元件(例如， rep或 cap基因或基因變異體)上游之一或多個轉錄終止序列。
在一些實施例中，表現構築體包含一或多個內含子序列。在一些實施例中，表現構築體包含不同來源(例如，已知基因)之內含子中之一或多者，包括但不限於FIX內含子、白蛋白內含子或其組合。在一些實施例中，表現構築體包含一或多個不同長度(例如，133 bp至4 kb)之內含子。在一些實施例中，表現構築體包含特定序列元件(例如， rep或 cap基因或基因變異體)上游之一或多個內含子序列。在一些實施例中，表現構築體包含特定序列元件(例如， rep或 cap基因或基因變異體)內之一或多個內含子序列。在一些實施例中，表現構築體包含特定序列元件(例如， rep或 cap基因或基因變異體)下游之一或多個內含子序列。在一些實施例中，表現構築體包含啟動子(例如，p5啟動子)之後的一或多個內含子序列。在一些實施例中，表現構築體包含 rep基因或基因變異體之前的一或多個內含子序列。在一些實施例中，表現構築體包含啟動子與 rep基因或基因變異體之間的一或多個內含子序列。 表徵 AAV 病毒載體之方法
根據各種實施例，可經由評估各種特性及/或特徵來表徵病毒載體。在一些實施例中，可在產生過程中之各個點進行病毒載體之評估。在一些實施例中，可在上游產生步驟完成後進行病毒載體之評估。在一些實施例中，可在下游產生步驟完成後進行病毒載體之評估。 病毒產量
在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估病毒產量(例如，病毒效價)。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括在純化及/或過濾之前評估病毒產量。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括在純化及/或過濾之後評估病毒產量。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估病毒產量是否大於或等於1e10 vg/mL。
在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估粗細胞溶解產物中之病毒產量是否大於或等於1e11 vg/mL。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估粗細胞溶解產物中之病毒產量是否大於或等於5e11 vg/mL。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估粗細胞溶解產物中之病毒產量是否大於或等於1e12 vg/mL。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估粗溶解產物中之病毒產量是否在5e9vg/mL與5e11 vg/mL之間。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估粗溶解產物中之病毒產量是否在5e9vg/mL與1e10 vg/mL之間。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估粗溶解產物中之病毒產量是否在1e10 vg/mL與1e11 vg/mL之間。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估粗溶解產物中之病毒產量是否在1e11 vg/mL與1e12 vg/mL之間。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估粗溶解產物中之病毒產量是否在1e12 vg/mL與1e13 vg/mL之間。
在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估經純化之藥物產品中之病毒產量是否大於或等於1e11 vg/mL。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估經純化之藥物產品中之病毒產量是否大於或等於1e12 vg/mL。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估經純化之藥物產品中之病毒產量是否在1e10 vg/mL與1e15 vg/mL之間。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估經純化之藥物產品中之病毒產量是否在1e11 vg/mL與1e15 vg/mL之間。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估經純化之藥物產品中之病毒產量是否在1e12vg/mL與1e14 vg/mL之間。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估經純化之藥物產品中之病毒產量是否在1e13與1e14 vg/mL之間。
在一些實施例中，與此項技術中已知之先前方法相比，本文所提供之方法及組合物可提供可比較或增加之病毒載體產量。舉例而言，在一些實施例中，與三質體系統相比，包括使用雙質體轉染系統的所提供之用於產生及/或製造病毒載體之方法提供可比較或增加之病毒載體產量。在一些實施例中，與具有序列元件之不同組合之雙質體系統相比，包括使用具有序列元件之特定組合之雙質體轉染系統的所提供之用於產生及/或製造病毒載體之方法提供可比較或增加之病毒載體產量。在一些實施例中，與具有不同質體比率之雙質體系統相比，包括使用具有特定質體比率之雙質體轉染系統的所提供之用於產生及/或製造病毒載體之方法提供可比較或增加之病毒載體產量。 病毒包裝
在一些實施例中，病毒載體之表徵包括病毒包裝效率之評估(例如，完整衣殼對比空衣殼之百分比)。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括在純化及/或完整衣殼富集之前評估病毒包裝效率(例如，基於氯化銫之密度梯度、基於碘克沙醇(iodixanol)之密度梯度或離子交換層析)。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括在純化及/或過濾之前評估病毒包裝效率是否大於或等於20% (例如，20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%)。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括在純化及/或完整衣殼富集之後評估病毒包裝效率。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括在純化及/或過濾之後評估病毒包裝效率是否大於或等於50% (例如，50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%)。
在一些實施例中，與此項技術中已知之先前方法相比，本文所提供之方法及組合物可提供可比較或增加之包裝效率。舉例而言，在一些實施例中，與三質體系統相比，包括使用雙質體轉染系統的所提供之用於產生及/或製造病毒載體之方法提供可比較或增加之包裝效率。在一些實施例中，與具有序列元件之不同組合之雙質體系統相比，包括使用具有序列元件之特定組合之雙質體轉染系統的所提供之用於產生及/或製造病毒載體之方法提供可比較或增加之包裝效率。在一些實施例中，與具有不同質體比率之雙質體系統相比，包括使用具有特定質體比率之雙質體轉染系統的所提供之用於產生及/或製造病毒載體之方法提供可比較或增加之包裝效率。 有複製能力之載體水準
在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估有複製能力之載體水準。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括在純化及/或過濾之前評估有複製能力之載體水準。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括在純化及/或過濾之後評估有複製能力之載體水準。在一些實施例中，病毒載體之表徵包括評估有複製能力之載體水準是否小於或等於1 rcAAV/1E10 vg。
在一些實施例中，與此項技術中已知之先前方法相比，本文所提供之方法及組合物可提供可比較或降低之有複製能力之載體水準。舉例而言，在一些實施例中，與三質體系統相比，包括使用雙質體轉染系統的所提供之用於產生病毒載體之方法提供可比較或降低之有複製能力之載體水準。在一些實施例中，與具有序列元件之不同組合之雙質體系統相比，包括使用具有序列元件之特定組合之雙質體轉染系統的所提供之用於產生病毒載體之方法提供可比較或降低之有複製能力之載體水準。在一些實施例中，與不含一或多個插入rep基因中之內含子序列之雙質體系統相比，包括使用具有該或該等內含子序列之雙質體轉染系統的所提供之用於產生病毒載體之方法提供可比較或降低之有複製能力之載體水準。 範例 實例 1 ：材料與方法 動物
動物處理及所有實驗程序係根據LogicBio Therapeutics之機構動物護理與使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)之指南進行。FvB或C57BL/6動物(稱作野生型小鼠)購自傑克森實驗室(Jackson lab) (Bar Harbor, ME)，且PXB動物購自Phoenix Bio (Hiroshima, Japan)。所有動物在研究前最少適應5天。先前描述研究中所用之B6.129-Ugt1tm1Rhtu/J小鼠模型(亦表示為Ugt1 -/-)小鼠。在與C57Bl/6 WT小鼠回交9次後，自傑克森實驗室(Bar Harbor, ME)獲得Ugt1 -/-小鼠之育種者。將所有動物圈養於具有受控溫度(23±3℃)及濕度(50% ± 20%)及12小時明/暗週期之設施中，且接受標準飲食及隨意飲水。對於載體投與，以3e13、1e14、2e14或3E14 vg/kg之劑量向動物給與具有平衡(相同長度)或不平衡(不同長度)同源臂設計之rAAV載體組合物。經由顳靜脈向新生動物給與載體；藉由眶後注射給與兒科動物(出生後14天，PND14)；經由側尾靜脈引入PND28 (出生後28天)至成年之兒科動物。在研究時段內在數個時間點經由面靜脈收集血液樣品。在研究結束時，對動物實施安樂死且經由心臟穿刺收集血液樣品。收集肝臟且急速冷凍。 光療法
將新生Ugt1 -/-小鼠暴露於藍色螢光燈(λ = 450 nm；平均25 μW/cm2/nm；Philips TL 20W/52燈)持續12小時/天(與明暗週期之光照時段同步)直至出生後21天，接著維持於正常光照條件下。每月將使用ILT74高膽紅素血症照度計(International Light Technologies)監測燈強度。 實例 2 ：不均勻同源臂可改善小鼠中之編輯活性
本實例證明，包含不平衡同源臂之病毒載體尤其可改善小鼠模型系統中之編輯活性。
構築包含AAV-DJ病毒衣殼、人類UGT1A1 (hUGT1A1)轉殖基因、P2A序列及側翼同源臂之病毒載體(圖1)。在出生後28天(PND28)以3E13 vg/kg劑量向C57Bl/6野生型小鼠投與病毒載體組合物。量測融合之mRNA及ALB-2A生物標誌物水準以確定GeneRide活性。將固定之肝樣品切片且針對hUGT1A1轉殖基因(抗體對人類UGT1A1蛋白具有特異性，且不與內源小鼠UGT1A1發生交叉反應)進行染色，以鑑定GeneRide編輯之肝細胞的存在(圖2)。圖2之A圖及B圖分別示出來自用1.0/1.0載體及1.0/1.6載體處理之動物之代表性IHC影像。棕色斑點代表表現hUGT1A1轉殖基因之GeneRide編輯之肝細胞。使用半定量演算法(ImageJ, NIH)以盲法方式分析影像，以計算肝細胞編輯之頻率。
測試之載體包含各種長度之同源臂。如圖2中所示，表示為1.0/1.6之構築體包含長度為1000 nt之5'同源臂及長度為1600 nt之3'同源臂。
本揭示案證明，不同長度之同源臂之某些配置尤其可改善動物(例如，小鼠)中之編輯活性。在一些實施例中，如圖2中所展示，相對於包含平衡同源臂之病毒載體，包含不平衡同源臂之病毒載體可提供改善之編輯活性。在一些實施例中，病毒載體可包含一或多個轉殖基因(例如，UGT1A1)。 實例 3 ：病毒載體組合物在特定時間點可提供增加之編輯活性
本實例證明，當在特定時間點投與時病毒載體組合物尤其可改善小鼠模型系統中之編輯活性。
構築包含AAV-DJ病毒衣殼、小鼠UGT1A1 (mUGT1A1)轉殖基因、P2A序列、長度為1000 nt之5'同源臂及長度為1600 nt之3'同源臂的病毒載體(圖3)。以各種劑量(vg/kg)向新生、出生後14天(PND14)及出生後28天(PND28) Ugt1 -/-小鼠投與病毒載體組合物。量測融合之mRNA及ALB-2A生物標誌物水準以確定編輯活性。亦用mUGT1A1對小鼠肝細胞進行染色(歸因於Ugt1 KO，未編輯之肝細胞在mUGT1A1染色中呈陰性)以鑑定GeneRide編輯之肝細胞的存在。使用半定量演算法(ImageJ, NIH)以盲法方式分析影像，以計算肝細胞編輯之頻率。在整個實驗過程中量測膽紅素水準(功效生物標誌物)。
構築包含AAV-DJ病毒衣殼、人類UGT1A1 (hUGT1A1)轉殖基因、P2A序列、長度為1300 nt之5'同源臂及長度為1400 nt之3'同源臂的病毒載體(圖9)。以3E13 vg/kg之劑量向新生(PND1)及出生後14天(PND14) C57B6小鼠投與病毒載體組合物。用hUGT1A1對小鼠肝細胞進行染色以鑑定GeneRide編輯之肝細胞的存在且計算編輯之細胞的百分比。
本揭示案證明，與新生投藥相比，當在特定出生後時間點(例如，PND14或PND28)投與時，病毒載體尤其可提供改善之編輯活性。此外，在特定時間點投與包含不均勻同源臂之病毒載體可提供基因編輯效率之協同改善。如圖3中所展示，在PND14及PND28投與具有長度為1000 nt之5'同源臂及長度為1600 nt之3'同源臂的病毒載體在12週過程中展現出增加之編輯活性及降低之膽紅素水準。如圖9中所示，與新生(PND1)時間點相比，當在PND14投與時，具有長度為1300 nt之5'同源臂及長度為1400 nt之3'同源臂之病毒載體的投藥展現出增加之編輯活性。此等給藥時間點可告知未來人類實驗中之給藥時機，因為基於各時間點之肝臟重量百分比，小鼠年齡可與人類年齡相關聯(圖4)。 實例 4 ：不均勻同源臂可改善人類中之編輯活性本實例證明，包含不平衡同源臂之病毒載體尤其可改善人類細胞中之編輯活性。
構築包含AAV-LK03病毒衣殼、人類UGT1A1 (hUGT1A1)轉殖基因、P2A序列及側翼同源臂之病毒載體(圖1)。向活體外人類細胞株(HepG2) (圖5，A圖)或肝臟人源化PXB小鼠模型(圖5，B圖)投與病毒載體組合物。對於活體外實驗量測融合mRNA之水準，且對於PXB小鼠實驗量測基因體DNA (gDNA)整合率。 測試之載體包含各種長度之同源臂。如圖5中所示，表示為1.0/1.6之構築體包含長度為1000 nt之5'同源臂及長度為1600 nt之3'同源臂。
本揭示案證明，不同長度之同源臂之某些配置尤其可改善人類中之編輯活性。在一些實施例中，如圖5中所展示，相對於包含平衡同源臂之病毒載體，包含不平衡同源臂之病毒載體可提供改善之編輯活性。 實例 5 ：不均勻同源臂可提高不同物種之編輯效率
本實例證明，包含不平衡同源臂之本揭示案之病毒載體尤其可在不同物種或不同物種(例如，小鼠及人類)之模型系統中提供編輯活性。
構築包含人類UGT1A1 (hUGT1A1)轉殖基因、P2A序列及側翼同源臂之病毒載體(圖1)。用於向Ugt1 -/-小鼠中投藥之載體包含AAV-DJ病毒衣殼、長度為1000 nt之5'同源臂及長度為1600 nt之3'同源臂。用於向人源化PXB小鼠中投藥之載體包含AAV-LK03衣殼、長度為1600 nt之5'同源臂及長度為1000 nt之3'同源臂。以指定濃度(vg/kg)向Ugt1 -/-或PXB小鼠投與病毒載體組合物。量測gDNA整合及UGT1A1染色之水準(圖6)。
本揭示案證明，如本文所揭示之病毒載體組合物尤其可在不同物種或不同物種(例如，小鼠及人類)之模型系統中提供可比較之編輯活性。在一些實施例中，如圖6中所展示，包含不平衡同源臂之特定配置之病毒載體可在不同物種或不同物種(例如，小鼠及人類)之模型系統中提供改善之編輯活性。在一些實施例中，針對在一種物種或一種物種之模型系統中之表現最佳化之病毒載體組合物可不同於針對在不同物種或不同物種之模型系統中之表現最佳化之病毒載體組合物(例如，載體可包含同源臂長度之不同組合)。 實例 6 ：同源臂長度可影響編輯活性
本實例證明，包含一定長度之同源臂之本揭示案之病毒載體尤其可提供編輯活性。
構築包含人類A1AT (hA1AT)轉殖基因、P2A序列及側翼同源臂之病毒載體(圖7、圖8)。如圖7及圖8中所指示，用於向FvB野生型小鼠中投藥之載體包含AAV-DJ病毒衣殼及各種長度之同源臂。以1E14 vg/kg劑量投與病毒載體組合物。量測ALB-2A生物標誌物(圖7及圖8)及hA1AT (圖7)之水準。
本揭示案證明，當至少一個同源臂低於一定長度(例如，小於或等於750 nt)時，包含同源臂之病毒載體尤其可展示降低之編輯活性。在一些實施例中，如圖7中所展示，與具有1000 nt長度之平衡同源臂設計相比，具有至少一個長度為500nt或更小之臂的不平衡同源臂設計展現出降低之編輯效率。另外，如圖8中所展示，在一些實施例中，與具有750 nt長度之平衡同源臂設計相比，具有1000 nt長度之平衡同源臂設計展現出提高之編輯效率。 實例 7 ：同源臂對 GENERIDE 活性之影響的比較
本實例確認，與不包含一定長度(或一定長度之比率)之同源臂的病毒載體相比，包含此類同源臂之本揭示案之病毒載體可提供增強之編輯活性。
構築包含人類UGT1A1 (hUGT1A1)或FIX (hFIX)轉殖基因、P2A序列及側翼同源臂之病毒載體(參見圖10)。如圖10中所指示，用於向小鼠中投藥之載體包含AAV-DJ病毒衣殼及各種長度之同源臂。以適當劑量投與病毒載體組合物。量測ALB-2A生物標誌物及轉殖基因(例如，hUGT1A1及/或hFIX)水準與肌動蛋白比率(圖10，A-B圖)。將轉殖基因表現水準與ALB-2A水準進行比較(圖10，C圖)。 本實例證明，不同長度之同源臂之某些配置尤其可改善動物(例如，小鼠)中之編輯活性。在一些實施例中，如圖10中所展示，相對於包含平衡同源臂之病毒載體，包含不平衡同源臂之病毒載體可提供改善之編輯活性。在一些實施例中，如圖10中所展示，相對於包含平衡同源臂之病毒載體，包含側接人類UGT1A1及/或FIX轉殖基因之5' 1000 nt及3' 1600 nt同源臂之GeneRide載體可在動物(例如，小鼠)中提供改善之編輯活性(如由ALB-2A水準及/或轉殖基因(UGT1A1及/或FIX)表現所量測)與肌動蛋白比率。 實例 8 ：不均勻同源臂可改善較高齡小鼠中之編輯活性
本實例確認，與不包含不平衡同源臂之病毒載體相比，當在特定時間點(例如，較高給藥年齡)投與時，包含此類同源臂之病毒載體尤其可改善小鼠模型系統中之編輯活性。
構築包含AAV-DJ病毒衣殼、人類FIX (hFIX)轉殖基因、P2A序列及側翼同源臂之病毒載體。如圖11中所指示，用於向小鼠中投藥之載體包含AAV-DJ病毒衣殼及各種長度之同源臂。以3e13 vg/kg向不同年齡之小鼠投與病毒載體組合物。藉由量測ALB-2A生物標誌物(例如，GENERIDE生物標誌物)及/或轉殖基因表現之水準來確定編輯活性(圖12)。
本實例證明，與新生投藥相比，當在特定出生後時間點(例如，幼年及/或成年)投與時，包含不平衡同源臂之病毒載體尤其可提供改善之編輯活性。此外，如圖11及圖12中所展示，與新生投與相比，在特定出生後時間點(例如，幼年及/或成年)投與包含側接人類(例如，FIX)轉殖基因之5' 1000 nt及3' 1600 nt同源臂之病毒載體可在動物(例如，小鼠)中提供基因編輯效率之協同改善。在一些實施例中，如圖12中所展示，與新生投藥相比，在特定出生後時間點(例如，PND84)投與包含側接人類(例如，FIX)轉殖基因之5' 1000 nt及3' 1600 nt同源臂之病毒載體可在動物(例如，小鼠)中在給藥後至少3週提供基因編輯效率之改善。在一些實施例中，如圖12中所展示，與新生投藥相比，在特定出生後時間點(例如，PND84)投與包含側接人類(例如，FIX)轉殖基因之5' 1000 nt及3' 1600 nt同源臂之病毒載體可在動物(例如，小鼠)中在給藥後至少6週提供基因編輯效率之持續改善。 在一些實施例中，如圖4中所示，此等給藥時間點可告知未來人類實驗中之給藥時機，因為基於各時間點之肝臟重量百分比，小鼠年齡可與人類年齡相關聯。 實例 9 ：不均勻同源臂可改善活體內肝功能
本實例證明，包含側接編碼反丁烯二醯乙醯乙酸水解酶(FAH)之序列之不平衡同源臂的病毒載體尤其可用於治療或預防活體內酪胺酸血症(例如，在一或多種小鼠模型中)。 材料與方法 動物研究
FAH敲除(Fah-/-，KO)及雜合Fah+/-同窩(HET)動物購自傑克森實驗室(Jackson Laboratories)。FRG小鼠購自Yecuris公司。 酪胺酸血症 FRG 小鼠中之 GeneRide 概念驗證 (PoC)
在麻醉下經由眶後竇用1e14 vg/kg之媒劑或rAAV.DJ-GR-hFAH處理四週齡之FRG雄性動物。在研究開始前及給藥後一週向所有小鼠保持施用8 mg/L尼替西農(Nitisinone，NTBC)，接著基於體重減輕將NTBC循環至給藥後5週，接著停止NTBC。在研究期間，藉由下頜下放血對動物進行定期取樣，且收集血漿並儲存於-80℃下直至進一步分析。在給藥後第9週及第16週進行最終收集。在處死時，經由心臟穿刺收集血液之血漿。將動物解剖整個肝臟或進行肝臟灌注以收集肝細胞。對於解剖整個肝臟之動物，將一個肝葉用10%福馬林(formalin)固定，且將剩餘肝葉速凍並儲存於-80℃下。第二天，將福馬林固定之肝臟轉移至70%乙醇中以進行石蠟包埋。肝臟灌注之後，在4℃下將分離之肝細胞以300xg離心5 分鐘且儲存於-80℃下。 GeneRide 在 FAH 小鼠中之劑量反應 PoC
在麻醉下經由眶後竇以1e13、3e13或1e14 vg/kg之劑量用rAAV.DJ-GR-mFAH處理14日齡之兒科Fah-/- (KO)及Fah+/- (HET)動物。在研究開始前及給藥後一週向所有小鼠保持施用8 mg/L NTBC，接著基於體重減輕將NTBC循環至給藥後2週。在研究期間，藉由下頜下放血對動物進行定期取樣，且收集血漿並儲存於-80℃下直至進一步分析。在給藥後16週進行最終收集。在處死時，經由心臟穿刺收集血液之血漿。對動物進行肝臟灌注以收集肝細胞。在灌注開始之前，縫合並解剖一個肝葉以進行福馬林固定。肝臟灌注之後，在4℃下將分離之肝細胞以300xg離心5 分鐘且儲存於-80℃下。第二天，將福馬林固定之肝臟轉移至70%乙醇中以進行石蠟包埋。 NTBC 對比 GeneRide 之間的肝細胞癌 (HCC) 風險評估
將Fah-/-動物自出生起維持施用8 mg/L NTBC。在四週齡時，隨機選擇一組Fah-/-動物且在麻醉下經由眶後竇以1e14 vg/kg之劑量用rAAV.DJ-GR-mFAH處理，接著自NTBC (GeneRide處理組)退出。將另一組Fah-/-動物維持施用8 mg/L NTBC (護理標準組)。將第三組Fah+/-同窩仔納入研究中，但未接受任何處理(未接受NTBC或GeneRide)。追蹤所有動物直至一歲齡，且定期評估HCC生物標誌物(AFP水準)。 NTBC ( 護理標準 ) 與 GeneRide 之間的相容性評估
在麻醉下經由眶後竇以1e14 vg/kg之劑量用rAAV.DJ-GR-mFAH處理四週齡之Fah-/-動物。在研究開始前向所有小鼠保持施用8 mg/L NTBC直至給藥後4週，接著將NTBC維持於8 mg/L (對照)或滴定降至3 mg/L、0.8 mg/L或0.3 mg/L，持續8週。在研究期間，藉由下頜下放血對動物進行定期取樣，且收集血漿並儲存於-80℃下直至進一步分析。在處死時，經由心臟穿刺收集血液之血漿。對於肝臟解剖，將一個肝葉用10%福馬林固定，且將剩餘肝葉速凍並儲存於-80℃下。第二天，將福馬林固定之肝臟轉移至70%乙醇中以進行石蠟包埋。 肝臟中之靶向基因體 DNA 整合
自冷凍之肝組織中提取基因體DNA，且藉由長程聚合酶鏈反應(PCR)擴增來分析靶向基因體DNA整合，繼而使用合格方法進行定量聚合酶鏈反應(qPCR)定量(參見下圖)。使用正向引子(F1)及反向引子(R1)進行長程PCR。藉由固相可逆固定珠粒(ABM，G950)清潔PCR產物，且用作使用正向引子(F1)、反向引子(R2)及探針(P1)之qPCR的模板。引子及探針為(F1) 5'-ATGTTCCACGAAGAAGCCA-3'、(R1) 5'-TCAGCAGGCTGAAATTGGT-3、(R2) 5'-AGCTGTTTCTTACTCCATTCTCA-3'、(P1) 5’-AGGCAACGTCATGGGTGTGACTTT-3'。小鼠轉鐵蛋白受體(Tfrc)用作qPCR中之內部對照。
Figure 02_image001
血漿白蛋白 -2A 融合蛋白定量
藉由化學發光ELISA量測血漿中之小鼠白蛋白-2A，使用專有兔多株抗2A抗體進行捕獲且使用HRP標記之多株山羊抗小鼠白蛋白抗體(abcam ab19195)進行偵測。在哺乳動物細胞中表現及親和純化之重組小鼠白蛋白-2A用於在1%對照小鼠血漿中建立標準曲線，以解釋基質效應。含1%牛乳(Cell Signaling 9999S)之PBS用於封閉，且1% BSA用於PBST中之樣品稀釋。 血漿肝損傷生物標誌物定量
將小鼠血漿中之丙胺酸胺基轉移酶(ALT)活性及總膽紅素水準定量為肝損傷之生物標誌物。遵循供應商之說明書，使用丙胺酸胺基轉移酶活性比色檢定套組(BioVision)定量血漿ALT活性。根據製造商之方案，使用經認證之臨床分析儀Advanced ®BR2 Bilirubin Stat-Analyzer™ (Advanced Instruments, LLC)量測血漿中之總膽紅素。 血漿 α- 胎蛋白定量
根據製造商之方案，使用化學發光ELISA套組(R&D Systems)定量血漿α-胎蛋白。 免疫組織化學
在機器人平台(Ventana discover Ultra Staining Module, Ventana Co., Tucson, AZ)上進行免疫組織化學。將組織切片(4 µm)脫蠟且進行熱誘導之抗原修復持續64分鐘。用過氧化酶抑制劑(CM1)阻斷內源過氧化酶持續8分鐘，隨後在室溫下將切片與抗FAH抗體(Yecuris, Portland, OR)以1:400稀釋度培育60分鐘。接著使用DISC偵測抗原-抗體複合物。OmniMap抗兔多聚體RUO偵測系統及DISCOVERY ChromoMap DAB套組(Ventana Co., Tucson, AZ)。隨後將所有載玻片用蘇木精(hematoxylin) (Fisher Sci, Waltham, MA)進行複染、脫水、清理並安裝，以便使用數位載玻片掃描儀(Hamamatsu, Bridgewater, NJ)進行影像掃描。使用ImageJ軟體以盲法方式評價掃描之影像以定量陽性染色區域。
下文提供本實例及實例 10 中所用之示例性序列： SEQ ID NO. 1 ： AAV-DJ-mha-mFAH (PM-0550)cagatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgct ggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatg agcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgcc atctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactg ggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgaatggtgcactctcagtac aatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgc gccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgg gagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcct cgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcagg tggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattc aaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaag gaagagtatgagccatattcaacgggaaacgtcgaggccgcgattaaattccaacatgga tgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaat ctatcgcttgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtag cgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcc tcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgc gatccccggaaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatat tgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtcc ttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggttt ggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaa agaaatgcataaacttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctc acttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagt cggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttc tccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataa attgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaactgtcagaccaagtttactcata tatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcct ttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcaga ccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctg cttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctacc aactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttct agtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgc tctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggtt ggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg cacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagct atgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcag ggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatag tcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggg gcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctg gccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattac cgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagt gagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgat tcattaatgcagctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctcccca gcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtcc ccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccata gtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccg ccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgag ctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagttggcc actccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgg gcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaac tccatcactaggggttcctTACGTAATGCATGGATCCCCTAGGgcggccgcCTGAAACTA GACAAAACCCGTGTGACTGGCATCGATTATTCTATTTGATCTAGCTAGTCCTAGCAAAGT GACAACTGCTACTCCCCTCCTACACAGCCAAGATTCCTAAGTTGGCAGTGGCATGCTTAA TCCTCAAAGCCAAAGTTACTTGGCTCCAAGATTTATAGCCTTAAACTGTGGCCTCACATT CCTTCCTATCTTACTTTCCTGCACTGGGGTAAATGTCTCCTTGCTCTTCTTGCTTTCTGT CCTACTGCAGGGCTCTTGCTGAGCTGGTGAAGCACAAGCCCAAGGCTACAGCGGAGCAAC TGAAGACTGTCATGGATGACTTTGCACAGTTCCTGGATACATGTTGCAAGGCTGCTGACA AGGACACCTGCTTCTCGACTGAGGTCAGAAACGTTTTTGCATTTTGACGATGTTCAGTTT CCATTTTCTGTGCACGTGGTCAGGTGTAGCTCTCTGGAACTCACACACTGAATAACTCCA CCAATCTAGATGTTGTTCTCTACGTAACTGTAATAGAAACTGACTTACGTAGCTTTTAAT TTTTATTTTCTGCCACACTGCTGCCTATTAAATACCTATTATCACTATTTGGTTTCAAAT TTGTGACACAGAAGAGCATAGTTAGAAATACTTGCAAAGCCTAGAATCATGAACTCATTT AAACCTTGCCCTGAAATGTTTCTTTTTGAATTGAGTTATTTTACACATGAATGGACAGTT ACCATTATATATCTGAATCATTTCACATTCCCTCCCATGGCCTAACAACAGTTTATCTTC TTATTTTGGGCACAACAGATGTCAGAGAGCCTGCTTTAGGAATTCTAAGTAGAACTGTAA TTAAGCAATGCAAGGCACGTACGTTTACTATGTCATTGCCTATGGCTATGAAGTGCAAAT CCTAACAGTCCTGCTAATACTTTTCTAACATCCATCATTTCTTTGTTTTCAGGGTCCAAA CCTTGTCACTAGATGCAAAGACGCCTTAGCCggaagcggcgccaccaatttcagcctgct gaaacaggccggcgacgtggaagagaaccctggccctTCCTTTATTCCAGTGGCCGAGGA CTCCGACTTTCCCATCCAAAACCTGCCCTATGGTGTTTTCTCCACTCAAAGCAACCCAAA GCCACGGATTGGTGTAGCCATCGGTGACCAGATCTTGGACCTGAGTGTCATTAAACACCT CTTTACCGGACCTGCCCTTTCCAAACATCAACATGTCTTCGATGAGACAACTCTCAATAA CTTCATGGGTCTGGGTCAAGCTGCATGGAAGGAGGCAAGAGCATCCTTACAGAACTTACT GTCTGCCAGCCAAGCCCGGCTCAGAGATGACAAGGAGCTTCGGCAGCGTGCATTCACCTC CCAGGCTTCTGCGACAATGCACCTTCCTGCTACCATAGGAGACTACACGGACTTCTACTC TTCTCGGCAGCATGCCACCAATGTTGGCATTATGTTCAGAGGCAAGGAGAATGCGCTGTT GCCAAATTGGCTCCACTTACCTGTGGGATACCATGGCCGAGCTTCCTCCATTGTGGTATC TGGAACCCCGATTCGAAGACCCATGGGGCAGATGAGACCTGATAACTCAAAGCCTCCTGT GTATGGTGCCTGCAGACTCTTAGACATGGAGTTGGAAATGGCTTTCTTCGTAGGCCCTGG GAACAGATTCGGAGAGCCAATCCCCATTTCCAAAGCCCATGAACACATTTTCGGGATGGT CCTCATGAACGACTGGAGCGCACGAGACATCCAGCAATGGGAGTACGTCCCACTTGGGCC ATTCCTGGGGAAAAGCTTTGGAACCACAATCTCCCCGTGGGTGGTGCCTATGGATGCCCT CATGCCCTTTGTGGTGCCAAACCCAAAGCAGGACCCCAAGCCCTTGCCATATCTCTGCCA CAGCCAGCCCTACACATTTGATATCAACCTGTCTGTCTCTTTGAAAGGAGAAGGAATGAG CCAGGCGGCTACCATCTGCAGGTCTAACTTTAAGCACATGTACTGGACCATGCTGCAGCA ACTCACACACCACTCTGTTAATGGATGCAACCTGAGACCTGGGGACCTCTTGGCTTCTGG AACCATCAGTGGATCAGACCCTGAAAGCTTTGGCTCCATGCTGGAACTGTCCTGGAAGGG AACAAAGGCCATCGATGTGGGGCAGGGGCAGACCAGGACCTTCCTGCTGGACGGCGATGA AGTCATCATAACAGGTCACTGCCAGGGGGACGGCTACCGTGTTGGCTTTGGCCAGTGTGC TGGGAAAGTGCTGCCTGCCCTTTCACCAGCCTAAACACATCACAACCACAACCTTCTCAG GTAACTATACTTGGGACTTAAAAAACATAATCATAATCATTTTTCCTAAAACGATCAAGA CTGATAACCATTTGACAAGAGCCATACAGACAAGCACCAGCTGGCACTCTTAGGTCTTCA CGTATGGTCATCAGTTTGGGTTCCATTTGTAGATAAGAAACTGAACATATAAAGGTCTAG GTTAATGCAATTTACACAAAAGGAGACCAAACCAGGGAGAGAAGGAACCAAAATTAAAAA TTCAAACCAGAGCAAAGGAGTTAGCCCTGGTTTTGCTCTGACTTACATGAACCACTATGT GGAGTCCTCCATGTTAGCCTAGTCAAGCTTATCCTCTGGATGAAGTTGAAACCATATGAA GGAATATTTGGGGGGTGGGTCAAAACAGTTGTGTATCAATGATTCCATGTGGTTTGACCC AATCATTCTGTGAATCCATTTCAACAGAAGATACAACGGGTTCTGTTTCATAATAAGTGA TCCACTTCCAAATTTCTGATGTGCCCCATGCTAAGCTTTAACAGAATTTATCTTCTTATG ACAAAGCAGCCTCCTTTGAAAATATAGCCAACTGCACACAGCTATGTTGATCAATTTTGT TTATAATCTTGCAGAAGAGAATTTTTTAAAATAGGGCAATAATGGAAGGCTTTGGCAAAA AAATTGTTTCTCCATATGAAAACAAAAAACTTATTTTTTTATTCAAGCAAAGAACCTATA GACATAAGGCTATTTCAAAATTATTTCAGTTTTAGAAAGAATTGAAAGTTTTGTAGCATT CTGAGAAGACAGCTTTCATTTGTAATCATAGGTAATATGTAGGTCCTCAGAAATGGTGAG ACCCCTGACTTTGACACTTGGGGACTCTGAGGGACCAGTGATGAAGAGGGCACAACTTAT ATCACACATGCACGAGTTGGGGTGAGAGGGTGTCACAACATCTATCAGTGTGTCATCTGC CCACCAAGTAACAGATGTCAGCTAAGACTAGGTCATGTGTAGGCTGTCTACACCAGTGAA AATCGCAAAAAGAATCTAAGAAATTCCACATTTCTAGAAAATAGGTTTGGAAACCGTATT CCATTTTACAAAGGACACTTACATTTCTCTTTTTGTTTTCCAGGCTACCCTGAGAAAAAA AGACATGAAGACTCAGGACTCATCTTTTCTGTTGGTGTAAAATCAACACCCTAAGGAACA CAAATTTCTTTAAACATTTGACTTCTTGTCTCTGTGCTGCAATTAATAAAAAATGGAAAG AATCTACTCTGTGGTTCAGAACTCTATCTTCCAAAGGCGCGCTTCACCCTAGCAGCCTCT TTGGCTCAGAGGAATCCCTGCCTTTCCTCCCTTCATCTCAGCAGAGAATGTAGTTCCACA TGGGCAACACAATGAAAATAAACGTTAATACTCTCCCATCTTATGGGTGGTGACCCTAGA AACCAATACTTCAACATTACGAGAATTCTGAATGAGAGACTAAAAGCTTATGAACTGTGG CTTTCCTTTGTCAGTGGGACTCTAAGAATGAGTTGGGGACAAAAGAGATAGGAATGGCTT TAAAGGTGACTAGTTGAACTGATAAAGTAAATGAACTGAGGAAAAAAAATATCACTCAAc ctgcaggGGACGTCCTACGTAATGCATaggaacccctagtgatggagttggccactccct ctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggct ttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaagaattaat tccgtgtattctatagtgtcacctaaatcgtatgtgtatgatacataaggttatgtatta attgtagccgcgttctaacgacaatatgtacaagcctaattgtgtagcatctggcttact gaagcagaccctatcatctctctcgtaaactgccgtcagagtcggtttggttggacgaac cttctgagtttctggtaacgccgtcccgcacccggaaatggtcagcgaaccaatcagcag ggtcatcgctagc SEQ ID NO. 2 ： AAV-DJ-mha-hFAH (PM-0549)cagatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgct  ggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatg  agcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgcc  atctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactg  ggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgaatggtgcactctcagtac  aatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgc  gccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgg  gagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcct  cgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcagg  tggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattc  aaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaag  gaagagtatgagccatattcaacgggaaacgtcgaggccgcgattaaattccaacatgga  tgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaat  ctatcgcttgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtag  cgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcc  tcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgc  gatccccggaaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatat  tgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtcc  ttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggttt  ggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaa  agaaatgcataaacttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctc  acttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagt  cggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttc  tccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataa  attgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaactgtcagaccaagtttactcata  tatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcct  ttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcaga  ccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctg  cttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctacc  aactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttct  agtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgc  tctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggtt  ggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg  cacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagct  atgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcag  ggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatag  tcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggg  gcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctg  gccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattac  cgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagt  gagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgat  tcattaatgcagctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctcccca  gcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtcc  ccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccata  gtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccg  ccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgag  ctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagttggcc  actccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgg  gcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaac  tccatcactaggggttcctTACGTAATGCATGGATCCCCTAGGgcggccgcCTGAAACTA  GACAAAACCCGTGTGACTGGCATCGATTATTCTATTTGATCTAGCTAGTCCTAGCAAAGT  GACAACTGCTACTCCCCTCCTACACAGCCAAGATTCCTAAGTTGGCAGTGGCATGCTTAA  TCCTCAAAGCCAAAGTTACTTGGCTCCAAGATTTATAGCCTTAAACTGTGGCCTCACATT  CCTTCCTATCTTACTTTCCTGCACTGGGGTAAATGTCTCCTTGCTCTTCTTGCTTTCTGT  CCTACTGCAGGGCTCTTGCTGAGCTGGTGAAGCACAAGCCCAAGGCTACAGCGGAGCAAC  TGAAGACTGTCATGGATGACTTTGCACAGTTCCTGGATACATGTTGCAAGGCTGCTGACA  AGGACACCTGCTTCTCGACTGAGGTCAGAAACGTTTTTGCATTTTGACGATGTTCAGTTT  CCATTTTCTGTGCACGTGGTCAGGTGTAGCTCTCTGGAACTCACACACTGAATAACTCCA  CCAATCTAGATGTTGTTCTCTACGTAACTGTAATAGAAACTGACTTACGTAGCTTTTAAT  TTTTATTTTCTGCCACACTGCTGCCTATTAAATACCTATTATCACTATTTGGTTTCAAAT  TTGTGACACAGAAGAGCATAGTTAGAAATACTTGCAAAGCCTAGAATCATGAACTCATTT  AAACCTTGCCCTGAAATGTTTCTTTTTGAATTGAGTTATTTTACACATGAATGGACAGTT  ACCATTATATATCTGAATCATTTCACATTCCCTCCCATGGCCTAACAACAGTTTATCTTC  TTATTTTGGGCACAACAGATGTCAGAGAGCCTGCTTTAGGAATTCTAAGTAGAACTGTAA  TTAAGCAATGCAAGGCACGTACGTTTACTATGTCATTGCCTATGGCTATGAAGTGCAAAT  CCTAACAGTCCTGCTAATACTTTTCTAACATCCATCATTTCTTTGTTTTCAGGGTCCAAA  CCTTGTCACTAGATGCAAAGACGCCTTAGCCggaagcggcgccaccaatttcagcctgct  gaaacaggccggcgacgtggaagagaaccctggcccttccttcatcccggtggccgagga  ttccgacttccccatccacaacctgccctacggcgtcttctcgaccagaggcgacccaag  accgaggataggtgtggccattggcgaccagatcctggacctcagcatcatcaagcacct  ctttactggtcctgtcctctccaaacaccaggatgtcttcaatcagcctacactcaacag  cttcatgggcctgggtcaggctgcctggaaggaggcgagagtgttcttgcagaacttgct  gtctgtgagccaagccaggctcagagatgacaccgaacttcggaagtgtgcattcatctc  ccaggcttctgccacgatgcaccttccagccaccataggagactacacagacttctattc  ctctcggcagcatgctaccaacgtcggaatcatgttcagggacaaggagaatgcgttgat  gccaaattggctgcacttaccagtgggctaccatggccgtgcctcctctgtcgtggtgtc  tggcaccccaatccgaaggcccatgggacagatgaaacctgatgactctaagcctcccgt  atatggtgcctgcaagctcttggacatggagctggaaatggctttttttgtaggccctgg  aaacagattgggagagccgatccccatttccaaggcccatgagcacatttttggaatggt  ccttatgaacgactggagtgcacgagacattcagaagtgggagtatgtccctctcgggcc  attccttgggaagagttttgggaccactgtctctccgtgggtggtgcccatggatgctct  catgccctttgctgtgcccaacccgaagcaggaccccaggcccctgccgtatctgtgcca  tgacgagccctacacatttgacatcaacctctctgttaacctgaaaggagaaggaatgag  ccaggcggctaccatatgcaagtccaattttaagtacatgtactggacgatgctgcagca  gctcactcaccactctgtcaacggctgcaacctgcggccgggggacctcctggcttctgg  gaccatcagcgggccggagccagaaaacttcggctccatgttggaactgtcgtggaaggg  aacgaagcccatagacctggggaatggtcagaccaggaagtttctgctggacggggatga  agtcatcataacagggtactgccagggggatggttaccgcatcggctttggccagtgtgc  tggaaaagtgctgcctgctctcctgccatcaTAAACACATCACAACCACAACCTTCTCAG  GTAACTATACTTGGGACTTAAAAAACATAATCATAATCATTTTTCCTAAAACGATCAAGA  CTGATAACCATTTGACAAGAGCCATACAGACAAGCACCAGCTGGCACTCTTAGGTCTTCA  CGTATGGTCATCAGTTTGGGTTCCATTTGTAGATAAGAAACTGAACATATAAAGGTCTAG  GTTAATGCAATTTACACAAAAGGAGACCAAACCAGGGAGAGAAGGAACCAAAATTAAAAA  TTCAAACCAGAGCAAAGGAGTTAGCCCTGGTTTTGCTCTGACTTACATGAACCACTATGT  GGAGTCCTCCATGTTAGCCTAGTCAAGCTTATCCTCTGGATGAAGTTGAAACCATATGAA  GGAATATTTGGGGGGTGGGTCAAAACAGTTGTGTATCAATGATTCCATGTGGTTTGACCC  AATCATTCTGTGAATCCATTTCAACAGAAGATACAACGGGTTCTGTTTCATAATAAGTGA  TCCACTTCCAAATTTCTGATGTGCCCCATGCTAAGCTTTAACAGAATTTATCTTCTTATG  ACAAAGCAGCCTCCTTTGAAAATATAGCCAACTGCACACAGCTATGTTGATCAATTTTGT  TTATAATCTTGCAGAAGAGAATTTTTTAAAATAGGGCAATAATGGAAGGCTTTGGCAAAA  AAATTGTTTCTCCATATGAAAACAAAAAACTTATTTTTTTATTCAAGCAAAGAACCTATA  GACATAAGGCTATTTCAAAATTATTTCAGTTTTAGAAAGAATTGAAAGTTTTGTAGCATT  CTGAGAAGACAGCTTTCATTTGTAATCATAGGTAATATGTAGGTCCTCAGAAATGGTGAG  ACCCCTGACTTTGACACTTGGGGACTCTGAGGGACCAGTGATGAAGAGGGCACAACTTAT  ATCACACATGCACGAGTTGGGGTGAGAGGGTGTCACAACATCTATCAGTGTGTCATCTGC  CCACCAAGTAACAGATGTCAGCTAAGACTAGGTCATGTGTAGGCTGTCTACACCAGTGAA  AATCGCAAAAAGAATCTAAGAAATTCCACATTTCTAGAAAATAGGTTTGGAAACCGTATT  CCATTTTACAAAGGACACTTACATTTCTCTTTTTGTTTTCCAGGCTACCCTGAGAAAAAA  AGACATGAAGACTCAGGACTCATCTTTTCTGTTGGTGTAAAATCAACACCCTAAGGAACA  CAAATTTCTTTAAACATTTGACTTCTTGTCTCTGTGCTGCAATTAATAAAAAATGGAAAG  AATCTACTCTGTGGTTCAGAACTCTATCTTCCAAAGGCGCGCTTCACCCTAGCAGCCTCT  TTGGCTCAGAGGAATCCCTGCCTTTCCTCCCTTCATCTCAGCAGAGAATGTAGTTCCACA  TGGGCAACACAATGAAAATAAACGTTAATACTCTCCCATCTTATGGGTGGTGACCCTAGA  AACCAATACTTCAACATTACGAGAATTCTGAATGAGAGACTAAAAGCTTATGAACTGTGG  CTTTCCTTTGTCAGTGGGACTCTAAGAATGAGTTGGGGACAAAAGAGATAGGAATGGCTT  TAAAGGTGACTAGTTGAACTGATAAAGTAAATGAACTGAGGAAAAAAAATATCACTCAAc  ctgcaggGGACGTCCTACGTAATGCATaggaacccctagtgatggagttggccactccct  ctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggct  ttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaagaattaat  tccgtgtattctatagtgtcacctaaatcgtatgtgtatgatacataaggttatgtatta  attgtagccgcgttctaacgacaatatgtacaagcctaattgtgtagcatctggcttact  gaagcagaccctatcatctctctcgtaaactgccgtcagagtcggtttggttggacgaac  cttctgagtttctggtaacgccgtcccgcacccggaaatggtcagcgaaccaatcagcag  ggtcatcgctagc SEQ ID NO. 3 ： AAV-DJ-mha-mFAH (PM-0549)gtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatct  cagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataacta  cgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgct  caccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtg  gtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaa  gtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgt  cacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagtta  catgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca  gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctctta  ctgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattct  gagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccg  cgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaac  tctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact  gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaa  atgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttccttt  ttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaat  gtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctg  acgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggc  cctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccgg  agacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgt  cagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtac  tgagagtgcaccattcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagt  agtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcg  cccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatg  agcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagca  accgcacctgtggcgccggtgggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggc  aaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaa  aagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgc  gcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaa  atgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaat  gaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcc  cgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacat  tcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtgga  tttggatgactgcatctttgaacaataaatgATTTAAATCAGGTatggctgccgatggtt  atcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctca  aacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttg  tgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtca  acgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcg  gagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgccgagttccaggagcggctcaaag  aagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgagcagtcttccaggccaaaaagaggcttc  ttgaacctcttggtctggttgaggaagcggctaagacggctcctggaaagaagaggcctg  tagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccggaaaggcgggccagcagc  ctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagactcagtcccagaccctc  aaccaatcggagaacctcccgcagccccctcaggtgtgggatctcttacaatggctgcag  gcggtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgg  gaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaa  cctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaagcaaatctccaacagcacatctg  gaggatcttcaaatgacaacgcctacttcggctacagcaccccctgggggtattttgact  ttaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcagcgactcatcaacaacaact  ggggattccggcccaagagactcagcttcaagctcttcaacatccaggtcaaggaggtca  cgcagaatgaaggcaccaagaccatcgccaataacctcaccagcaccatccaggtgttta  cggactcggagtaccagctgccgtacgttctcggctctgcccaccagggctgcctgcctc  cgttcccggcggacgtgttcatgattccccagtacggctacctaacactcaacaacggta  gtcaggccgtgggacgctcctccttctactgcctggaatactttccttcgcagatgctga  gaaccggcaacaacttccagtttacttacaccttcgaggacgtgcctttccacagcagct  acgcccacagccagagcttggaccggctgatgaatcctctgattgaccagtacctgtact  acttgtctcggactcaaacaacaggaggcacgacaaatacgcagactctgggcttcagcc  aaggtgggcctaatacaatggccaatcaggcaaagaactggctgccaggaccctgttacc  gccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaatactcgtggactg  gagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggcccggccatgg  caagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctcatctttggga  agcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgattacagacgaagagg  aaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatctaccaacctcc  agagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgttcttccaggca  tggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaagattccacaca  cggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaacaccctccgc  ctcagatcctgatcaagaacacgcctgtacctgcggatcctccgaccaccttcaaccagt  caaagctgaactctttcatcacccagtattctactggccaagtcagcgtggagatcgagt  gggagctgcagaaggaaaacagcaagcgctggaaccccgagatccagtacacctccaact  actacaaatctacaagtgtggactttgctgttaatacagaaggcgtgtactctgaacccc  gccccattggcacccgttacctcacccgtaatctgtaaTTGCTTGTTAATCAATAAACCG  TTTAATTCGTTTCAGTTGAACTTTGGTCTCTGCGTATTTCTTTCTTATCTAGTTTCCATA  TGCATGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTAAccggtacctctagaactat  agctagcgatgaccctgctgattggttcgctgaccatttccgggtgcgggacggcgttac  cagaaactcagaaggttcgtccaaccaaaccgactctgacggcagtttacgagagagatg  atagggtctgcttcagtaagccagatgctacacaattaggcttgtacatattgtcgttag  aacgcggctacaattaatacataaccttatgtatcatacacatacgatttaggtgacact  atagaatacacggaattaattcttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactga  ggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcga  gcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttaccgaCTGAAAC  TAGACAAAACCCGTGTGACTGGCATCGATTATTCTATTTGATCTAGCTAGTCCTAGCAAA  GTGACAACTGCTACTCCCCTCCTACACAGCCAAGATTCCTAAGTTGGCAGTGGCATGCTT  AATCCTCAAAGCCAAAGTTACTTGGCTCCAAGATTTATAGCCTTAAACTGTGGCCTCACA  TTCCTTCCTATCTTACTTTCCTGCACTGGGGTAAATGTCTCCTTGCTCTTCTTGCTTTCT  GTCCTACTGCAGGGCTCTTGCTGAGCTGGTGAAGCACAAGCCCAAGGCTACAGCGGAGCA  ACTGAAGACTGTCATGGATGACTTTGCACAGTTCCTGGATACATGTTGCAAGGCTGCTGA  CAAGGACACCTGCTTCTCGACTGAGGTCAGAAACGTTTTTGCATTTTGACGATGTTCAGT  TTCCATTTTCTGTGCACGTGGTCAGGTGTAGCTCTCTGGAACTCACACACTGAATAACTC  CACCAATCTAGATGTTGTTCTCTACGTAACTGTAATAGAAACTGACTTACGTAGCTTTTA  ATTTTTATTTTCTGCCACACTGCTGCCTATTAAATACCTATTATCACTATTTGGTTTCAA  ATTTGTGACACAGAAGAGCATAGTTAGAAATACTTGCAAAGCCTAGAATCATGAACTCAT  TTAAACCTTGCCCTGAAATGTTTCTTTTTGAATTGAGTTATTTTACACATGAATGGACAG  TTACCATTATATATCTGAATCATTTCACATTCCCTCCCATGGCCTAACAACAGTTTATCT  TCTTATTTTGGGCACAACAGATGTCAGAGAGCCTGCTTTAGGAATTCTAAGTAGAACTGT  AATTAAGCAATGCAAGGCACGTACGTTTACTATGTCATTGCCTATGGCTATGAAGTGCAA  ATCCTAACAGTCCTGCTAATACTTTTCTAACATCCATCATTTCTTTGTTTTCAGGGTCCA  AACCTTGTCACTAGATGCAAAGACGCCTTAGCCggaagcggcgccaccaatttcagcctg  ctgaaacaggccggcgacgtggaagagaaccctggccctTCCTTTATTCCAGTGGCCGAG  GACTCCGACTTTCCCATCCAAAACCTGCCCTATGGTGTTTTCTCCACTCAAAGCAACCCA  AAGCCACGGATTGGTGTAGCCATCGGTGACCAGATCTTGGACCTGAGTGTCATTAAACAC  CTCTTTACCGGACCTGCCCTTTCCAAACATCAACATGTCTTCGATGAGACAACTCTCAAT  AACTTCATGGGTCTGGGTCAAGCTGCATGGAAGGAGGCAAGAGCATCCTTACAGAACTTA  CTGTCTGCCAGCCAAGCCCGGCTCAGAGATGACAAGGAGCTTCGGCAGCGTGCATTCACC  TCCCAGGCTTCTGCGACAATGCACCTTCCTGCTACCATAGGAGACTACACGGACTTCTAC  TCTTCTCGGCAGCATGCCACCAATGTTGGCATTATGTTCAGAGGCAAGGAGAATGCGCTG  TTGCCAAATTGGCTCCACTTACCTGTGGGATACCATGGCCGAGCTTCCTCCATTGTGGTA  TCTGGAACCCCGATTCGAAGACCCATGGGGCAGATGAGACCTGATAACTCAAAGCCTCCT  GTGTATGGTGCCTGCAGACTCTTAGACATGGAGTTGGAAATGGCTTTCTTCGTAGGCCCT  GGGAACAGATTCGGAGAGCCAATCCCCATTTCCAAAGCCCATGAACACATTTTCGGGATG  GTCCTCATGAACGACTGGAGCGCACGAGACATCCAGCAATGGGAGTACGTCCCACTTGGG  CCATTCCTGGGGAAAAGCTTTGGAACCACAATCTCCCCGTGGGTGGTGCCTATGGATGCC  CTCATGCCCTTTGTGGTGCCAAACCCAAAGCAGGACCCCAAGCCCTTGCCATATCTCTGC  CACAGCCAGCCCTACACATTTGATATCAACCTGTCTGTCTCTTTGAAAGGAGAAGGAATG  AGCCAGGCGGCTACCATCTGCAGGTCTAACTTTAAGCACATGTACTGGACCATGCTGCAG  CAACTCACACACCACTCTGTTAATGGATGCAACCTGAGACCTGGGGACCTCTTGGCTTCT  GGAACCATCAGTGGATCAGACCCTGAAAGCTTTGGCTCCATGCTGGAACTGTCCTGGAAG  GGAACAAAGGCCATCGATGTGGGGCAGGGGCAGACCAGGACCTTCCTGCTGGACGGCGAT  GAAGTCATCATAACAGGTCACTGCCAGGGGGACGGCTACCGTGTTGGCTTTGGCCAGTGT  GCTGGGAAAGTGCTGCCTGCCCTTTCACCAGCCTAAACACATCACAACCACAACCTTCTC  AGGTAACTATACTTGGGACTTAAAAAACATAATCATAATCATTTTTCCTAAAACGATCAA  GACTGATAACCATTTGACAAGAGCCATACAGACAAGCACCAGCTGGCACTCTTAGGTCTT  CACGTATGGTCATCAGTTTGGGTTCCATTTGTAGATAAGAAACTGAACATATAAAGGTCT  AGGTTAATGCAATTTACACAAAAGGAGACCAAACCAGGGAGAGAAGGAACCAAAATTAAA  AATTCAAACCAGAGCAAAGGAGTTAGCCCTGGTTTTGCTCTGACTTACATGAACCACTAT  GTGGAGTCCTCCATGTTAGCCTAGTCAAGCTTATCCTCTGGATGAAGTTGAAACCATATG  AAGGAATATTTGGGGGGTGGGTCAAAACAGTTGTGTATCAATGATTCCATGTGGTTTGAC  CCAATCATTCTGTGAATCCATTTCAACAGAAGATACAACGGGTTCTGTTTCATAATAAGT  GATCCACTTCCAAATTTCTGATGTGCCCCATGCTAAGCTTTAACAGAATTTATCTTCTTA  TGACAAAGCAGCCTCCTTTGAAAATATAGCCAACTGCACACAGCTATGTTGATCAATTTT  GTTTATAATCTTGCAGAAGAGAATTTTTTAAAATAGGGCAATAATGGAAGGCTTTGGCAA  AAAAATTGTTTCTCCATATGAAAACAAAAAACTTATTTTTTTATTCAAGCAAAGAACCTA  TAGACATAAGGCTATTTCAAAATTATTTCAGTTTTAGAAAGAATTGAAAGTTTTGTAGCA  TTCTGAGAAGACAGCTTTCATTTGTAATCATAGGTAATATGTAGGTCCTCAGAAATGGTG  AGACCCCTGACTTTGACACTTGGGGACTCTGAGGGACCAGTGATGAAGAGGGCACAACTT  ATATCACACATGCACGAGTTGGGGTGAGAGGGTGTCACAACATCTATCAGTGTGTCATCT  GCCCACCAAGTAACAGATGTCAGCTAAGACTAGGTCATGTGTAGGCTGTCTACACCAGTG  AAAATCGCAAAAAGAATCTAAGAAATTCCACATTTCTAGAAAATAGGTTTGGAAACCGTA  TTCCATTTTACAAAGGACACTTACATTTCTCTTTTTGTTTTCCAGGCTACCCTGAGAAAA  AAAGACATGAAGACTCAGGACTCATCTTTTCTGTTGGTGTAAAATCAACACCCTAAGGAA  CACAAATTTCTTTAAACATTTGACTTCTTGTCTCTGTGCTGCAATTAATAAAAAATGGAA  AGAATCTACTCTGTGGTTCAGAACTCTATCTTCCAAAGGCGCGCTTCACCCTAGCAGCCT  CTTTGGCTCAGAGGAATCCCTGCCTTTCCTCCCTTCATCTCAGCAGAGAATGTAGTTCCA  CATGGGCAACACAATGAAAATAAACGTTAATACTCTCCCATCTTATGGGTGGTGACCCTA  GAAACCAATACTTCAACATTACGAGAATTCTGAATGAGAGACTAAAAGCTTATGAACTGT  GGCTTTCCTTTGTCAGTGGGACTCTAAGAATGAGTTGGGGACAAAAGAGATAGGAATGGC  TTTAAAGGTGACTAGTTGAACTGATAAAGTAAATGAACTGAGGAAAAAAAATATCACTCA  Atcggtaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctc  actgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtg  agcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactttttgcaaaagcctaggcctccaaaa  aagcctcctcactacttctggaatagctcagaggccgaggcggcctcggcctctgcataa  ataaaaaaaattagtcagccatggggcggagaatgggcggaactgggcggagttaggggc  gggatgggcggagttaggggcgggactatggttgctgactaattgagatgcatgctttgc  atacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacctggttgctgactaattgaga  tgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacaccctaactga  cacacattccacagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgta  ttgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggc  gagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacg  caggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgt  tgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaa  gtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagct  ccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcc  cttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtagg  tcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgcct  tatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcag  cagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttga  agtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctga  agccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctg  gtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaag  aagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaag  ggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaat  gaagttttaaatcaatctaaa
構築包含AAV-DJ病毒衣殼、人類FAH (hFAH)轉殖基因、P2A序列、長度為1000個核苷酸(nt)之側翼5'同源臂及長度為1600 nt之3'同源臂的病毒載體(圖13A)。同源臂經設計用於與小鼠基因體白蛋白靶整合位點互補。經由靜脈內注射向4週齡之FRG小鼠(一種酪胺酸血症小鼠模型)投與病毒載體，且自出生起維持施用 NTBC飲用水(8mg/L)直至給藥後1週(圖13B)。在給藥後1週與4週之間，根據需要調整NTBC劑量(例如，若動物體重比前一週量測值下降10%，則將動物循環返回至8 mg/L NTBC飲用水持續一週)。自給藥後4週直至處死(給藥後9或16週)，停止NTBC投藥。
評估小鼠之循環GeneRide生物標誌物(例如，ALB-2A水準)直至處理後9週(圖13C)，且評估身體生長(經由體重變化百分比)直至處理後16週(圖13D)。亦評估肝功能之標誌物(例如，丙胺酸胺基轉移酶(ALT)、膽紅素) (圖13E及圖13F)。在處理後9週(9WK；收集4隻動物)及16週(16WK；收穫4隻動物)處死小鼠，且分離小鼠肝臟。處死一小組經處理之小鼠，且收集肝臟樣品，且經由用抗FAH抗體進行免疫組織化學染色來分析(圖13G)。自一小組單獨經處理之小鼠中分離肝細胞，該等小鼠之肝臟已進行灌注(n=2)。評估分離之肝細胞的gDNA整合(圖13H)。與健康Fah+/-雜合(HET)小鼠及僅媒劑處理之小鼠相比，亦評估來自小鼠之血漿樣品中α-胎蛋白(AFP) (一種肝細胞癌(HCC)標誌物)的存在(圖13I)。 結果
本實例證明，與參考(例如，未經處理或媒劑)相比，用包含側接編碼人類FAH (hFAH)之序列之不平衡同源臂的病毒載體處理尤其可在罹患遺傳性酪胺酸血症1 (HT1)之個體中(例如，在FRG小鼠模型系統中)提供改善之肝功能。在一些實施例中，如圖13之E圖及/或F圖中所展示，與參考(例如，未經處理或媒劑)相比，用本揭示案之病毒載體處理個體可提供與肝功能降低相關之生物標誌物(例如，ALT、膽紅素)之水準降低。在一些實施例中，如圖13之D圖中所展示，相對於參考(例如，未經處理或媒劑)，用本揭示案之病毒載體處理個體(例如，罹患遺傳性酪胺酸血症之個體)可允許或恢復正常生長(例如，經由隨時間推移之體重變化百分比量測)。在一些實施例中，如圖13之I圖中所展示，用本揭示案之病毒載體處理個體(例如，罹患遺傳性酪胺酸血症之個體)可提供與疾病(例如癌症，包括HCC)相關之生物標誌物(例如，AFP)之水準降低。在一些實施例中，如圖13中所展示，相對於參考(例如，未經處理或媒劑)，用本揭示案之病毒載體處理個體(例如，罹患遺傳性酪胺酸血症之個體)可提供以下一或多者：改善之肝功能(例如，經由評估肝功能之標誌物量測)、正常生長(例如，經由隨時間推移之體重變化百分比量測)，及與疾病(例如癌症，包括HCC)相關之生物標誌物(例如，AFP)之水準降低。
如圖13之H圖中所示，此證明本揭示案之病毒載體尤其能夠將轉殖基因序列(例如，FAH)整合至個體之基因體靶位點中。在一些實施例中，轉殖基因序列(例如，FAH)之整合可為個體(例如，罹患遺傳性酪胺酸血症之個體)中之細胞(例如，肝細胞)提供選擇性優勢。在一些實施例中，用本揭示案之病毒載體處理個體(例如，罹患遺傳性酪胺酸血症之個體)可實現在特定組織類型(例如，肝臟)內之細胞(例如，肝細胞)中遞送之轉殖基因(例如，FAH)的基因體DNA整合大於10% (例如，20%、30%、40%、50%)。在一些實施例中，用本揭示案之病毒載體處理個體(例如，罹患遺傳性酪胺酸血症之個體)可實現特定組織類型(例如，肝臟)內多於50% (例如，60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%等)之細胞(例如，肝細胞)由已成功整合遞送之轉殖基因(例如，FAH)的細胞組成。 實例 10 ：不均勻同源臂可允許編輯之細胞在活體內快速選擇性擴充
本實例證明，尤其可按某些劑量向個體(例如，罹患1型遺傳性酪胺酸血症之個體)投與包含側接編碼反丁烯二醯乙醯乙酸水解酶(FAH)之序列之不平衡同源臂的病毒載體，且為已成功整合FAH編碼序列之細胞提供選擇性優勢。除非另有規定，否則所用材料及方法同上述實例9。
構築包含AAV-DJ病毒衣殼、小鼠FAH (mFAH)轉殖基因、P2A序列、長度為1000個核苷酸(nt)之側翼5'同源臂及長度為1600 nt之3'同源臂的病毒載體(參見圖14，A圖)。同源臂經設計用於與小鼠基因體白蛋白靶整合位點互補。在兩週齡時經由靜脈內注射向Fah-/-小鼠投與本文所述之載體(圖14，A圖)。自出生起向小鼠提供8 mg/L NTBC直至投與GeneRide載體後1週(3週齡)。在3週齡與4週齡之間，僅向觀測到體重比前一週下降10%之動物提供8 mg/L NTBC飲用水。自4週齡直至處死(至少18週齡)，停止NTBC投藥。另一組Fah-/-小鼠始終用8 mg/L NTBC飲用水維持且用作護理標準對照組。評估小鼠之循環生物標誌物(例如，ALB-2A水準)直至處理後8週(圖14，B圖)，且評估NTBC移除後之存活率(圖14，C圖)、肝功能標誌物(例如，ALT)及毒性代謝物(例如，丁二醯丙酮(SUAC))之存在(圖14，D圖及圖14，E圖)。
構築包含AAV-DJ病毒衣殼、小鼠FAH (mFAH)轉殖基因、P2A序列、長度為1000個核苷酸(nt)之側翼5'同源臂及長度為1600 nt之3'同源臂的病毒載體(圖14，A圖)。同源臂經設計用於與小鼠基因體白蛋白靶整合位點互補。在1月齡時經由靜脈內注射向Fah-/-小鼠投與本文所述之載體(參見圖15，A圖)。自出生起用8 mg/L NTBC處理小鼠直至投與GeneRide載體。自1月齡直至處死(至少12月齡)，停止NTBC投藥。評估小鼠之循環生物標誌物(例如，ALB-2A水準)持續至少5月齡(圖15，B圖)，且在處理後監測體重持續至少6個月(圖15，C圖)。在此等小鼠(至少6月齡)中亦評估HCC風險(AFP水準) (圖15，D圖)。
本實例證明，用本揭示案之病毒載體處理個體(例如，罹患1型遺傳性酪胺酸血症之個體)尤其可為細胞(例如，肝細胞)提供快速選擇性優勢，從而導致處理後4週內患病肝臟之完全再增生。在一些實施例中，用本揭示案之病毒載體處理個體(例如，罹患遺傳性酪胺酸血症之個體)可實現特定組織類型(例如，肝臟)內多於50% (例如，60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%等)之細胞(例如，肝細胞)在處理後4週內由已成功整合遞送之轉殖基因(例如，FAH)的細胞組成。在一些實施例中，用本揭示案之病毒載體以某些劑量(例如，3E13 vg/kg、1E13 vg/kg、1E14 vg/kg)處理個體(例如，罹患遺傳性酪胺酸血症之個體)可在處理後4週內為細胞(例如，肝細胞)提供選擇性優勢。
本實例證明，與參考(例如，未經處理)相比，用包含編碼小鼠FAH (mFAH)之序列的病毒載體處理尤其可在罹患遺傳性酪胺酸血症1 (HT1)之個體中(例如，在FAH-/-小鼠模型系統中)提供改善之肝功能(圖14，B圖)。在一些實施例中，如圖14之D圖中所展示，與參考(例如，未經處理)相比，用本揭示案之病毒載體處理個體可提供與肝功能降低相關之生物標誌物(例如，ALT)之水準降低。在一些實施例中，如圖14之E圖中所展示，相對於參考(例如，未經處理或NTBC處理)，用本揭示案之病毒載體處理個體(例如，罹患遺傳性酪胺酸血症之個體)可提供有害代謝物(例如，SUAC)之水準降低。
本實例證明，用本揭示案之病毒載體處理個體(例如，罹患遺傳性酪胺酸血症之個體)尤其可顯示出成年時持續轉殖基因表現。在一些實施例中，如圖15之B圖中所展示，向至少一月齡之個體投與本揭示案之病毒載體展示出在給藥後至少5個月循環生物標誌物(例如，ALB-2A)之持續表現。在一些實施例中，如圖15之C圖中所展示，用本揭示案之病毒載體處理之個體與參考(例如，NTBC處理之個體)相比顯示出類似之體重。
本實例證明，與參考(例如，未經處理或NTBC處理之個體)相比，用本揭示案之病毒載體處理個體(例如，罹患遺傳性酪胺酸血症之個體)尤其可降低HCC風險。在一些實施例中，如圖15之D圖中所展示，與至少6月齡之參考(例如，未經處理或NTBC處理之個體)相比，用本揭示案之病毒載體處理個體(例如，罹患遺傳性酪胺酸血症之個體)可提供與疾病(例如癌症，包括HCC)相關之生物標誌物(例如，AFP)之水準降低。 等效物
熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗來確定本文所述之本發明之特定實施例的許多等效物。本發明之範疇不欲受上述描述所限制，而實際上如以下申請專利範圍中所闡述：
圖 1提供實驗方案之流程圖以及說明在各種實驗中測試之小鼠及人類載體之某些組分的示意圖。 圖 2展示在C57BL/6小鼠中包含UGT1A1轉殖基因及各種長度之同源臂之各種小鼠GeneRide載體的編輯效率。 (A)量測融合之mRNA水準(左上圖)、ALB-2A GeneRide生物標誌物水平(右上圖)及由染色肝細胞百分比確定之編輯效率(左下圖)。右下圖為編輯之肝細胞百分比與ALB-2A水準之間相關性的圖形表示。 (B)收集小鼠肝臟並染色以鑑定編輯之肝細胞(棕色斑點，左圖：來自肝臟之代表性IHC，用具有1.0/1.0 KB同源臂之GeneRide載體處理(基準)；右圖：來自肝臟之代表性IHC，用具有1.0/1.6 KB同源臂之GeneRide載體處理)。使用半自動演算法對影像進行定量以計算肝細胞編輯頻率。 圖 3展示包含側接UGT1A1轉殖基因之5' 1000 nt及3' 1600 nt同源臂之單個小鼠GeneRide載體的功效數據。向新生(PND2)、出生後14天(PND14)及出生後28天(PND28) UGT1-/-小鼠以各種劑量(3E14 vg/kg、1E14 vg/kg、3E14 vg/kg)投與載體。經由 (A)UGT1A1染色評估、 (B)融合之mRNA水準及 (C)ALB-2A生物標誌物水準來量測編輯效率。在12週過程中亦量測 (D)膽紅素水準(功效生物標誌物)及 (E)膽紅素降低百分比。 圖 4描繪小鼠肝臟重量相對於年齡之圖表。對於肝臟靶向基因療法，經由評估各別肝臟重量百分比，小鼠年齡可與人類年齡相對應。 圖 5描述包含側接UGT1A1轉殖基因之不同長度同源臂之各種人類GeneRide載體的編輯效率。 (A)在活體外人類細胞檢定中及 (B)在活體內肝臟人源化小鼠模型(PXB)中測試載體。 (C)PXB小鼠特徵為來自移植之人類肝細胞之高度均勻肝臟人源化，如由PXB小鼠肝臟中人類肝細胞標誌物之IHC染色所示。 圖 6描繪包含UGT1A1轉殖基因之人類及小鼠GeneRide載體之編輯活性。測試之載體先前針對在人類(圖5)或小鼠(圖2)系統中之活性進行最佳化。 圖 7描繪在FvB野生型小鼠中測試之包含側接人類A1AT轉殖基因之不同長度同源臂之各種小鼠GeneRide載體的編輯活性。 (A)用於各種載體設計之同源臂長度之示意圖。 (B)用於各種載體設計之ALB-2A生物標誌物及人類A1AT (hA1AT)水準。 圖 8描繪在FvB野生型小鼠中測試之包含側接cyno-A1AT轉殖基因之相同長度同源臂之各種小鼠GeneRide載體的編輯活性。對於兩種設計量測ALB-2A生物標誌物水準。 圖 9描繪包含側接人類UGT1A1轉殖基因之5' 1300 nt及3' 1400 nt同源臂之單個小鼠GeneRide載體的編輯活性。向新生(PND1)及出生後14天(PND14) C57B6小鼠以3E13 vg/kg之劑量投與載體。經由評估小鼠肝細胞中之hUGT1A1染色及ALB-2A生物標誌物之水準來量測編輯效率。 圖 10展示包含人類UGT1A1或人類因子9 (FIX)轉殖基因之各種小鼠GeneRide載體之功效數據。向出生後28天(PND28)小鼠投與載體。經由評估 (A)ALB-2A生物標誌物(例如，GeneRide生物標誌物)之水準、 (B)針對肌動蛋白參考正規化之轉殖基因表現及 (C)與ALB-2A水準相比之轉殖基因表現水準之比較來量測編輯效率。 圖 11示出包含人類FIX轉殖基因之各種小鼠GeneRide載體之功效數據。向各種年齡之小鼠(新生、幼年及成年小鼠)投與載體。在各種年齡(新生、幼年及成年小鼠)量測ALB-2A生物標誌物之水準。 圖 12展示包含側接人類FIX轉殖基因之5' 1000 nt及3' 1600 nt同源臂之單個小鼠GeneRide載體的功效數據。向新生(PND2)、出生後28天(PND28)及出生後84天(PND84)小鼠投與載體。量測ALB-2A生物標誌物及轉殖基因表現之水準。 圖 13示出用如本文所述之療法治療患有遺傳性酪胺酸血症之小鼠的結果。 (A)示出具有不均勻同源臂之示例性聚核苷酸卡匣。 (B)示出示例性療法時程。 (C)示出循環生物標誌物之評估。 (D)示出治療之小鼠的體重變化。 (E)及 (F)示出治療之小鼠中肝功能之標誌物(例如，丙胺酸轉胺酶(ALT)、膽紅素)之水準。 (G)示出用反丁烯二醯乙醯乙酸水解酶(FAH)抗體對肝臟樣品進行之免疫組織化學染色。 (H)示出整合至宿主基因體DNA (gDNA INT)中之評估。圖 (I)示出α-胎蛋白(AFP)存在之評估，AFP為臨床上驗證之肝細胞癌(HCC)之生命中生物標誌物。 圖 14示出用如本文所述之療法治療患有遺傳性酪胺酸血症之小鼠的結果及選擇性優勢。 (A)示出示例性載體及治療排程。 (B)示出ALB-2A生物標誌物(例如，GeneRide生物標誌物)之評估。 (C)示出治療之小鼠的存活率。 (D)及 (E)示出治療之小鼠中的肝功能標誌物(例如，ALT、丁二醯丙酮(SUAC))。 圖 15示出用如本文所述之療法治療兒科HT1小鼠之結果。 (A)示出治療時程。 (B)示出GENERIDE™生物標誌物之評估。 (C)示出治療之小鼠的體重變化。 (D)示出治療之小鼠中之α-胎蛋白(AFP)水準。

Claims (32)

  1. 一種用於將轉殖基因整合至細胞基因體中之靶整合位點中的重組病毒載體，該重組病毒載體包含： (i) 包含第一核酸序列及第二核酸序列之聚核苷酸，其中該第一核酸序列包含至少一個外源基因序列且該第二核酸序列位於該第一核酸序列之5'或3'且在整合至靶整合位點中之後促進兩個獨立基因產物之產生； (ii) 第三核酸序列，該第三核酸序列位於該聚核苷酸之5'且包含與該靶整合位點之基因體序列5'同源之序列；及 (iii) 第四核酸序列，該第四核酸序列位於該聚核苷酸之3'且包含與該靶整合位點之基因體序列3'同源之序列； 其中該第三核酸序列及該第四核酸序列中之每一者之長度為至少1000 nt且其中該第三核酸序列及該第四核酸序列之長度不同。
  2. 如請求項1之重組病毒載體，其中該外源基因序列之長度在500 nt與2500 nt之間。
  3. 如請求項1或2之重組病毒載體，其中該基因序列之長度在1000 nt與2000 nt之間。
  4. 如請求項1至3中任一項之重組病毒載體，其中該第三核酸序列之長度為至少750 nt。
  5. 如請求項4之重組病毒載體，其中該第三核酸序列之長度為至少1000 nt。
  6. 如請求項5之重組病毒載體，其中該第三核酸序列之長度為至少1600 nt。
  7. 如請求項1至3中任一項之重組病毒載體，其中該第四核酸序列之長度為至少750 nt。
  8. 如請求項7之重組病毒載體，其中該第四核酸序列之長度為至少1000 nt。
  9. 如請求項8之重組病毒載體，其中該第四核酸序列之長度為至少1600 nt。
  10. 如請求項1至4或7中任一項之重組病毒載體，其中該第三核酸序列及該第四核酸序列兩者之長度均為至少750 nt。
  11. 如請求項1至5或7至8中任一項之重組病毒載體，其中該第三核酸序列及該第四核酸序列兩者之長度均為至少1000 nt。
  12. 如前述請求項中任一項之重組病毒載體，其中該第三核酸序列之長度為1000 nt且該第四核酸序列之長度為1600 nt。
  13. 如前述請求項中任一項之重組病毒載體，其中該第三核酸序列之長度為1600 nt且該第四核酸序列之長度為1000 nt。
  14. 如請求項1至13中任一項之重組病毒載體，其中該病毒載體為AAV載體。
  15. 如請求項14之重組病毒載體，其中該病毒載體係選自AAV2、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV-LK03或AAV-sL65。
  16. 一種組合物，該組合物包含： 如前述請求項中任一項之重組病毒載體；及 一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。
  17. 一種將轉殖基因整合至個體組織中之一或多個細胞之基因體中的方法，該方法包括向該組織中之細胞不能表現由基因產物編碼之功能性蛋白質之個體投與如請求項16之組合物，其中該靶整合位點在該一或多個細胞之該基因體中。
  18. 如請求項17之方法，其中該一或多個細胞為非分裂細胞。
  19. 如請求項17或18之方法，其中該一或多個細胞為肝細胞、肌肉細胞、肺細胞或CNS細胞。
  20. 如請求項17至19中任一項之方法，其中在出生後時段內投與該組合物。
  21. 如請求項17至20中任一項之方法，其中在出生後至少7天、出生後至少14天、出生後至少21天或出生後至少28天投與該組合物。
  22. 如請求項17至20中任一項之方法，其中在出生後28天或之前投與該組合物。
  23. 如請求項17至22中任一項之方法，其中該轉殖基因為或包含UGT1A1、FAH、因子IX、A1AT、ASL或LIPA。
  24. 如請求項17至23中任一項之方法，其中相對於參考組合物，整合效率得到改善。
  25. 如請求項17至24中任一項之方法，其中以至少5E13 vg/kg之劑量投與該組合物。
  26. 如請求項17至25中任一項之方法，其中以1E14 vg/kg之劑量投與該組合物。
  27. 如請求項17至26中任一項之方法，其中以2E14 vg/kg之劑量投與該組合物。
  28. 如請求項17至27中任一項之方法，其中該個體為動物。
  29. 如請求項17至28中任一項之方法，其中該個體為人類。
  30. 如請求項28或29之方法，其中該個體患有或疑似患有克里格勒-納賈爾症候群(Crigler-Najjar syndrome)、酪胺酸血症、血友病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、精胺醯丁二酸尿症或溶酶體酸性脂肪酶缺乏症。
  31. 一種確定包含至少一個有效載荷、5'同源臂及3'同源臂之聚核苷酸卡匣之同源臂長度的方法，該方法包括 (a) 確定包含至少一個有效載荷但不包括任何同源臂之聚核苷酸卡匣之長度， (b) 若步驟(a)之長度小於2.7kb，則該3'同源臂序列之長度為1 kb或更小，且該5'同源臂序列之長度為2.7kb - 該3'同源臂之長度，及 (c) 若步驟(a)之長度大於2.7kb，則該5'同源臂及該3'同源臂之長度各自為[4.7kb - 步驟(a)之長度]/2個核苷酸。
  32. 一種用於將轉殖基因整合至細胞基因體中之靶整合位點中的重組病毒載體，該重組病毒載體包含： (i) 包含第一核酸序列及第二核酸序列之聚核苷酸，其中該第一核酸序列包含至少一個外源基因序列且該第二核酸序列位於該第一核酸序列之5'或3'且在整合至靶整合位點中之後促進兩個獨立基因產物之產生； (ii) 第三核酸序列，該第三核酸序列位於該聚核苷酸之5'且包含與該靶整合位點之基因體序列5'同源之序列；及 (iii) 第四核酸序列，該第四核酸序列位於該聚核苷酸之3'且包含與該靶整合位點之基因體序列3'同源之序列； 其中該第三核酸序列及該第四核酸序列中之每一者之長度係如請求項31來確定。
TW111116322A 2021-04-30 2022-04-29 病毒載體組合物及其使用方法 TW202309277A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163182738P 2021-04-30 2021-04-30
US63/182,738 2021-04-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202309277A true TW202309277A (zh) 2023-03-01

Family

ID=83847345

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111116322A TW202309277A (zh) 2021-04-30 2022-04-29 病毒載體組合物及其使用方法

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP4330417A1 (zh)
JP (1) JP2024517743A (zh)
KR (1) KR20240004566A (zh)
CN (1) CN117321215A (zh)
AU (1) AU2022264585A1 (zh)
BR (1) BR112023022657A2 (zh)
CA (1) CA3216909A1 (zh)
CO (1) CO2023015532A2 (zh)
TW (1) TW202309277A (zh)
WO (1) WO2022232545A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3209111A1 (en) * 2021-02-26 2022-09-01 Matthias Charles Jerome HEBBEN Manufacturing and use of recombinant aav vectors

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ527435A (en) * 1998-05-15 2005-01-28 Stanford Res Inst Int Transgenic animals produced by homologous sequence targeting
MX2016011690A (es) * 2014-03-21 2016-11-07 Univ Leland Stanford Junior Edicion del genoma sin nucleasas.
JP2021520211A (ja) * 2018-04-05 2021-08-19 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 組換え受容体を発現するｔ細胞、関連ポリヌクレオチド、および方法
JP7473548B2 (ja) * 2018-08-10 2024-04-23 ロジックバイオ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｍｍａの処置のための非破壊的遺伝子治療

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022264585A1 (en) 2023-11-30
BR112023022657A2 (pt) 2024-01-16
WO2022232545A1 (en) 2022-11-03
EP4330417A1 (en) 2024-03-06
CN117321215A (zh) 2023-12-29
JP2024517743A (ja) 2024-04-23
KR20240004566A (ko) 2024-01-11
CO2023015532A2 (es) 2023-11-30
CA3216909A1 (en) 2022-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3288594B1 (en) Dual aav vector system for crispr/cas9 mediated correction of human disease
JP2023159235A (ja) 新規アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）ベクター、低減されたカプシド脱アミド化を有するａａｖベクター、およびその使用
BR112020001940A2 (pt) modelos celulares de e terapias para doenças oculares
WO2019169004A9 (en) Novel adeno-associated virus (aav) vectors, aav vectors having reduced capsid deamidation and uses therefor
KR20230051208A (ko) 신규 aav 캡시드 및 이를 함유하는 조성물
JP2019505183A (ja) クリグラー・ナジャー症候群の処置のための組成物
TW202309277A (zh) 病毒載體組合物及其使用方法
WO2019036484A1 (en) COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF ARGININOSUCCINIC ACIDURIA
US11814642B2 (en) Manufacturing and use of recombinant AAV vectors
JP2021097617A (ja) オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症の治療用アデノ随伴ウイルスビリオン
EP4328313A1 (en) Adeno-associated virus virion for treating ornithine transcarbamylase deficiency
TW202330928A (zh) 用於治療ｈｔ１之基因療法
CN117043347A (zh) 重组aav载体的制造和使用
TW202323528A (zh) 用於治療威爾森氏病之基因療法
WO2023230098A1 (en) Gene therapy compositions and methods of use thereof
Baruteau A gene therapy approach for Argininosuccinic aciduria