TW202300655A - 具有特定gc含量之目標基因之放大方法 - Google Patents

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舘田一博
宮武佑弥
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日商電化股份有限公司
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Abstract

本發明提供一種於反應液中放大具有60%以上之GC含量之至少1個目標基因之方法，其包括使用用於將目標基因放大之包含第一引子及第二引子之引子組，將目標基因所特異性之鹼基序列放大的步驟；且 引子組之一引子係以高於另一引子之莫耳比添加於反應液中，各引子並非包含藉由活化酵素之作用而恢復之失活化學修飾之熱啟動引子。

Description

具有特定GC含量之目標基因之放大方法
本發明廣義上係關於一種利用非對稱PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應)於反應液中放大具有特定GC(Guanine-Cytosine，鳥嘌呤-胞嘧啶)含量之目標基因之方法等。
綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)係人類之上皮或腸道中存在之常駐菌，為機會性感染之代表菌種。獲得了抗藥性之多重抗藥性綠膿桿菌經常因院內感染而引起疾病爆發。因此，綠膿桿菌係在醫療機構中受到關注之菌種之一。 先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：日本專利特表2015-536653號公報
[發明所欲解決之問題]
一般已知生物所擁有之基因具有其物種固有之構成鹼基之組成及GC含量。綠膿桿菌係以具有高GC含量為特徵之細菌，例如根據PA01株之全基因組之解析結果，其GC含量為66.6%(Stover, C.K., Pham, X.Q., Erwin, A.L., Mizoguchi, S.D., Warrener, P., Hickey, M.J., Brinkman, F.S., Hufnagle, W.O., Kowalik, D.J., Lagrou, M. et al. 2000. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PA01, an opportunistic pathogen. Nature 406: 959-964.)。
但已知於將如綠膿桿菌般具有GC含量高之基因之菌種作為目標之情形時，目標基因之放大產物之合成量減少，檢測感度降低。檢測感度降低於在除了目標基因及包含其之對象菌種以外還包含多種應鑑別之菌種之檢體中將基因同時放大的方法中尤其會成為問題。此種多種基因之同時放大法常被稱作多重PCR，為能夠於1個反應系統中根據1個模板DNA(Deoxyribonucleic acid，去氧核糖核酸)將多個基因片段放大之方法。此種吞吐性優異之多重PCR亦能夠根據反應系統中存在之多種模板DNA將各基因片段放大，為基因診斷技術中不可或缺之技術。 [解決問題之技術手段]
為了解決該問題，本發明人等反覆進行銳意研究，結果藉由將GC含量高之目標基因(亦被稱作目的基因(GOI))之檢測技術與非對稱PCR加以組合，而創造出如下技術，即，GC含量不高(GC含量：40～60%)之目標基因自不必說，亦能夠網羅性地且以較高之感度、特異度同時檢測具有高達60%以上之GC含量之GOI，從而完成本發明。
即，本申請案包含以下發明。 [1]一種於反應液中放大具有60%以上之GC含量之至少1個目標基因之方法，其包括使用用於將目標基因放大之包含第一引子及第二引子之引子組，將目標基因所特異性之鹼基序列放大的步驟；且 引子組之一引子係以高於另一引子之莫耳比添加於反應液中，各引子並非包含藉由活化酵素之作用而恢復之失活化學修飾之熱啟動引子。 [2]如[1]記載之方法，其中上述反應液包含除目標基因以外之1個或複數個基因，且上述方法包括將除目標基因以外之1個或複數個基因與目標基因一併同時放大。 [3]如[1]或[2]記載之方法，其中引子組中之引子之莫耳比為1：1.5～20.0。 [4]如[1]至[3]中任一項記載之方法，其中目標基因係包含綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)之基因組序列中至少連續之13個鹼基的鹼基序列。 [5]如[1]至[4]中任一項記載之方法，其中第一引子係在嚴格之條件下與序列編號1～3之任一者所記載之鹼基序列、或於序列編號1～3之任一者所記載之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列進行雜交的引子，第二引子係在嚴格之條件下與序列編號1～3之任一者所記載之鹼基序列之互補鏈序列、或於序列編號1～3之任一者所記載之鹼基序列之互補鏈序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列進行雜交的引子。 [6]如[1]至[5]中任一項記載之方法，其中第一引子係包含序列編號4所記載之鹼基序列中、或於序列編號4所記載之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列中至少連續之13個鹼基的寡核苷酸。 [7]如[1]至[6]中任一項記載之方法，其中第二引子係包含序列編號5所記載之鹼基序列中、或於序列編號5所記載之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列中至少連續之13個鹼基的寡核苷酸。 [8]如[1]至[7]中任一項記載之方法，其中引子經生物素標記。 [9]如[1]至[8]中任一項記載之方法，其中莫耳比高之引子經生物素標記。 [10]一種於一反應液中檢測GC含量超過60%之至少1個目標基因之方法，其包括 使用與藉由如[1]至[9]中任一項記載之方法放大了之目標基因之單鏈互補之探針檢測目標基因的步驟。 [11]如[10]記載之方法，其中探針係與藉由莫耳比高之引子放大了之目標基因之單鏈互補。 [12]如[10]或[11]記載之方法，其中藉由目標基因之單鏈與探針之互補雙鏈基因形成之存在而檢測目標基因。 [13]如[1]至[12]中任一項記載之方法，其中目標基因係來自綠膿桿菌，對綠膿桿菌與除其以外之細菌性基因進行鑑別。 [14]如[10]至[13]中任一項記載之方法，其中探針固定於檢測基板材料。 [15]如[10]至[14]中任一項記載之方法，其中探針經標記。 [16]如[10]至[15]中任一項記載之方法，其中探針核酸包括包含序列編號6所記載之鹼基序列中、或於序列編號6所記載之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列中至少連續之13個鹼基的寡核苷酸。 [17]如[14]至[16]中任一項記載之方法，其中檢測基板材料係編碼化之微載體。 [18]如[17]記載之方法，其中微載體包含： (a)具有第一表面及第二表面之實質上透明之聚合物層，且 該第一及該第二表面相互平行； (b)實質上不透明之聚合物層，且該實質上不透明之聚合物層貼附於該實質上透明之聚合物層之該第一表面，包圍該實質上透明之聚合物層之中心部分，該實質上不透明之聚合物層包含表示類比編碼之二維形狀；以及 (c)用於捕捉分析物之捕捉劑，且該捕捉劑在該實質上透明之聚合物層之至少該中心部分，與該實質上透明之聚合物層之該第一表面及該第二表面中之至少一者連結。 [19]一種引子組，其包含第一引子及第二引子，用於檢測具有60%以上之GC含量之至少1個目標基因之存在，且 第一引子係包含序列編號4所記載之鹼基序列中、或於序列編號4所記載之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列中至少連續之13個鹼基的寡核苷酸， 第二引子係包含序列編號5所記載之鹼基序列中、或於序列編號5所記載之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列中至少連續之13個鹼基的寡核苷酸。 [20]如[19]記載之引子組，其中目標基因係包含綠膿桿菌之基因組序列中至少連續之13個鹼基的鹼基序列。 [21]如[19]或[20]記載之引子組，其中第一引子係在嚴格之條件下與序列編號1～3之任一者所記載之鹼基序列、或於序列編號1～3之任一者所記載之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列進行雜交的引子，第二引子係在嚴格之條件下與序列編號1～3之任一者所記載之鹼基序列之互補鏈序列、或於序列編號1～3之任一者所記載之鹼基序列之互補鏈序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列進行雜交的引子。 [22]如[19]至[21]中任一項記載之引子組，其中第一引子係包含序列編號4所記載之鹼基序列中、或於序列編號4所記載之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列中至少連續之13個鹼基的寡核苷酸。 [23]如[19]至[22]中任一項記載之引子組，其中第二引子係包含序列編號5所記載之鹼基序列中、或於序列編號5所記載之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列中至少連續之13個鹼基的寡核苷酸。 [發明之效果]
根據本發明，可藉由利用非對稱PCR而以高感度檢測GC含量高之基因。
以下對本發明之實施方式(以下稱作「本實施方式」)進行說明，但本發明之範圍不限定於以下實施方式進行解釋。
(基因放大/檢測方法) 於第一態樣中，提供一種於反應液中放大具有60%以上之GC含量之至少1個目標基因之方法。放大方法可包括：使用用於將目標基因放大之包含第一引子及第二引子之引子組將目標基因所特異性之鹼基序列放大之步驟、及其他任意步驟。放大步驟包括使引子組與目標基因接觸之步驟。反應液中亦可包含除目標基因以外之1個或複數個基因，於該情形時，使目標基因與除其以外之1個或複數個基因同時進行放大反應。
亦被稱作目的基因(GOI)之目標基因只要為具有60%以上之GC含量之基因即可，可為任意基因。於利用多重PCR進行放大反應之情形時，目標基因較佳為作為對象之複數個基因中具有相對較高之GC含量之基因。GC含量係構成目標基因之DNA鏈中之G鹼基及C鹼基之比率(%)，藉由進行目標基因之序列解析而確定。作為具有60%以上之目標基因之菌之例，除了上述綠膿桿菌以外，還可例舉：結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(65.86%)、痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)(60.3%)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)(60.84%)；動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)(61.36%)等，但不限定於該等菌。作為目標基因之例，例如有綠膿桿菌之oprL基因(GC含量：62.3%)。oprL基因係綠膿桿菌之編碼肽聚糖脂蛋白之前驅物的基因。
目標基因之放大步驟係於利用非對稱PCR之放大條件下進行。例如，為了放大目標基因而添加於反應液中之引子之莫耳比係以一引子之濃度高於另一引子之方式進行調節。日本專利特表2015-536653號公報(上文揭示)中，作為非對稱PCR所使用之引子，揭示有包含藉由活化酵素之作用而恢復之失活化學修飾之熱啟動引子，但本基因放大方法所使用之引子組並非如此種熱啟動引子(核糖引子)般包含藉由活化酵素之作用而恢復之失活化學修飾者。另一方面，用於放大除目標基因以外之基因之引子可為任意者，所添加之前置引子與反置引子之量亦可為相同之莫耳比。
關於用於放大目標基因之引子之莫耳比，只要與通常之PCR相比，可高效率地放大目標基因即可，並無特別限定，例如，在放大前之反應液中於1：1.5～20.0之範圍內適當地調節。基於進一步增大螢光強度之觀點考慮，莫耳比較佳為1：1.5～3.5，更佳為1.5～3.0，進而更佳為1.5～2.5。於非對稱PCR之條件下放大目標基因之情形時，作為過量添加之引子之放大產物之單鏈與藉由另一引子被放大之單鏈相比產生得更多，因此該單鏈與探針之互補鏈之形成效率亦提昇。目標基因亦可具有複數個，於該情形時，必須針對每個不同之目標基因製備不同之引子組。
關於用於放大目標基因之引子序列之設計，業者可參照應該放大之目標基因之序列，適當地決定互補之寡核苷酸序列。非對稱PCR所使用之引子較佳為以前置引子與反置引子之Tm值成為相同程度之方式進行製備。例如，於目標基因為綠膿桿菌之基因之情形時，合成與包含其基因組序列中至少連續之13個鹼基之鹼基序列互補的引子。作為綠膿桿菌之目標基因之例，可例舉GC含量為約62%之oprL基因。oprL基因係編碼外膜蛋白之基因之一，每株之序列不同。例如，綠膿桿菌之E6130952株、NCTC10332株、PAO1株之oprL基因依序具有序列編號1、2及3之鹼基序列。
oprL基因具有序列編號1～3之任一者所示之鹼基序列，或具有於序列編號1～3之任一者所示之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列，且編碼OprL蛋白。
作為前置引子之第一引子只要為可在嚴格之條件下與序列編號1～3之任一者所記載之鹼基序列、或於序列編號1～3之任一者所記載之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列進行雜交的引子即可，可具有任意序列。
作為反置引子之第二引子只要為可在嚴格之條件下與序列編號1～3之任一者所記載之鹼基序列之互補鏈序列、或於序列編號1～3之任一者所記載之鹼基序列之互補鏈序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列進行雜交的引子即可，可具有任意序列。
於本說明書中使用之情形時，「嚴格之條件」意指形成所謂之特異之雜交，且不形成非特異之雜交之條件，例如可基於鹼基序列之長度等資訊適當地決定。例如，嚴格之條件可參照Molecular Cloning (Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)而設定。嚴格之條件亦可謂係如下條件，即，同源性(較佳為同一性)高之多核苷酸彼此、例如具有70%以上、較佳為80%以上、更佳為90%以上、進而更佳為95%以上、尤佳為99%以上之同源性之多核苷酸彼此進行雜交，且顯示出低於70%之同源性之多核苷酸彼此不進行雜交。
作為具體之嚴格條件，可為如下條件：在雜交液(50%甲醯胺、10×SSC (Saline Sodium Citrate，檸檬酸鈉鹽水)(0.15 M NaCl，15 mM檸檬酸鈉，pH值7.0)、5×Denhardt's溶液、1%SDS(Sodium Dodecyl Sulfate，十二烷基硫酸鈉)、10%硫酸葡聚糖、10 μg/ml之改性大馬哈魚精子DNA、及50 mM磷酸緩衝液(pH值7.5))中，將與所需之鹼基序列互補之鹼基序列、及疑存在目標基因或具有其之菌種之檢體於約42℃～約50℃下進行培養，然後使用0.1×SSC、0.1%SDS於約65℃～約70℃下進行洗淨。
作為將綠膿桿菌之oprL基因作為目標之第一引子之例，可例舉以下者，即，具有以下之序列編號4所記載之鹼基序列，或具有包含在序列編號4所記載之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列中連續之至少13個鹼基的鹼基序列，且具有與序列編號4所記載之鹼基序列相同之功能。 5'-GGTAAAGAGCGTCCGGTC-3'(序列編號4)
作為將綠膿桿菌之oprL基因作為目標之第二引子之例，可例舉以下者，即，具有以下之序列編號5所記載之鹼基序列，或具有包含在序列編號5所記載之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列中連續之至少13個鹼基的鹼基序列，且具有與序列編號5所記載之鹼基序列相同之功能。 5'-TTACTTCTTCAGCTCGACG-3'(序列編號5)
第一與第二引子可將目標基因之全部或一部分區域特異性地放大，藉此可與其他基因進行鑑別。或者，亦可藉由對第一與第二引子之放大產物進行熔解曲線解析，將其熔解溫度與利用其他引子組之放大產物之熔解溫度進行比較，來將目標基因(或具有其之菌種)與其他基因(或具有其之其他菌種)進行區分。
除設想進行鑑別之菌種所包含之基因以外之基因、更具體而言為除目標基因以外之基因且來自除鑑別對象之菌種以外之菌種之基因的GC含量並無特別限定，較佳為未達60%。
用於放大除目標基因以外之基因之引子之長度為任意，例如可於約10鹼基～約35鹼基之範圍內適當地設定，較佳為10鹼基以上。
用於放大除目標基因以外之基因之引子之比率並無特別限定，可相同，亦可互不相同。於將引子組用於非對稱PCR法之情形時，可以一引子之濃度高於另一引子之濃度之方式進行調整。
作為GC含量未達60%之菌，例如可例舉表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、奇異變形桿菌、鮑曼氏不動桿菌，但不限定於該等。此外，作為GC含量未達60%之菌之例，亦可例舉：克氏檸檬酸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、布氏檸檬酸桿菌、無丙二酸檸檬酸桿菌等檸檬酸桿菌屬；陰溝腸桿菌、阿氏腸桿菌等腸桿菌屬；大腸桿菌(Escherichia coli)、產氣腸桿菌；克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、產酸克雷伯氏菌、變棲克雷伯氏菌等克雷伯氏菌屬；黏質沙雷氏菌；鉛黃腸球菌、糞腸球菌、屎腸球菌等腸球菌屬；單核細胞增多性李斯特菌等李斯特菌屬等；金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)/人葡萄球菌等葡萄球菌屬；化膿性鏈球菌/肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)/口腔鏈球菌等鏈球菌屬；傑氏棒狀桿菌；腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)；白色念珠菌等念珠菌屬。
用於放大目標基因之引子組並不限定於第一及第二引子之組合，亦可包含該等第一及第二引子、以及除該等以外之引子、例如第三、第四、第五、第六等追加引子。藉由使用適當之追加引子，可提昇檢測感度。作為此種引子，例如設想用於放大目標基因中與第一及第二引子所放大之區域不同之區域的引子等。
藉由使用上述引子之核酸放大反應，可檢測檢體中所含之目標基因或具有其之菌種之存在。基於效率之觀點考慮，目標基因之放大與檢測較佳為於一反應液中進行。核酸放大反應後之放大產物之檢測亦可利用能夠特異性地識別出放大產物之標記物。作為此種標記物，可例舉：螢光色素、生物素、地高辛等。被標記之引子可為任一引子，於非對稱PCR所使用之引子組之情形時，較佳為對莫耳比高之引子進行標記。進行標記之部位亦無限定，較佳為直接或經由連接子配置於引子之5'末端。
於使用探針之情形時，可藉由利用非對稱PCR放大了之目標基因之單鏈與探針之互補雙鏈基因形成之存在，而檢測目標基因。探針較佳為以與藉由莫耳比高之引子放大了之目標基因之單鏈互補之方式進行設計。於使用螢光作為標記物之情形時，可使用螢光顯微鏡、螢光讀板儀等檢測該螢光。
作為探針之例，可例舉捕捉綠膿桿菌JCM14847株之PCR產物之序列編號6所記載之探針。於編碼探針之核酸具有序列編號6所記載之鹼基序列之情形時，該核酸亦可包括包含序列編號6所記載之鹼基序列中、或於序列編號6所記載之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列中至少連續之13個鹼基的寡核苷酸。
構成引子或探針等之多核苷酸亦可固定於檢測基板等上。基板只要為可將多核苷酸固定並保持者即可，可使用玻璃、塑膠、纖維類等各種材料。作為基板材料之形態，可例舉微陣列等微載體，關於其形狀，可想到圓盤狀或珠粒狀。
於多重分析(multiplex assay)之情形時，微載體之表面較佳為利用條碼等固有之識別碼進行編碼化。例如，微載體可包含： (a)具有第一表面及第二表面之實質上透明之聚合物層，且 該第一及該第二表面相互平行； (b)實質上不透明之聚合物層，且該實質上不透明之聚合物層貼附於該實質上透明之聚合物層之該第一表面，包圍該實質上透明之聚合物層之中心部分，該實質上不透明之聚合物層包含表示類比編碼之二維形狀；以及 (c)用於捕捉分析物之捕捉劑，且該捕捉劑在該實質上透明之聚合物層之至少該中心部分，與該實質上透明之聚合物層之該第一表面及該第二表面中之至少一者連結。
提供目標基因之檢體只要為疑存在目標基因或具有該基因之菌種者即可，並無特別限定，可例舉來自人類或並非來自人類之血液、血清、血漿、尿、便、唾液、痰、組織液、腦脊髓液、拭子等體液等或其稀釋物等，較佳為血液、血清、血漿、尿、便、腦脊髓液或該等之稀釋物。檢體亦可為食品、土壤、植物等。
反應液中除了引子、檢體以外，亦添加有包含DNA聚合酶酵素、受質、鎂離子之PCR緩衝液。
PCR可為僅將目標基因放大之單重分析，亦可為將目標基因與除其以外之1個或複數個基因同時放大之多重分析。
業者已知多重PCR等多重分析。作為多重分析之技術，有π編碼技術，其係如下技術：藉由將抗體或基因測定用探針固定於表面刻印有條碼之磁性微碟上，而特定出檢查對象之種類，從而可進行同時多項目測定。關於π編碼技術，例如揭示於WO2016/198954(日本專利特表2018-518146號公報)或WO2018/052464(日本專利特表2019-535003號公報)中，本說明書中藉由引用而援用該等公報之內容整體。
以下示出實施例而具體地說明本發明，但本發明不限定於實施例。 [實施例]
實施例 1 ：利用通常之 PCR 與非對稱 PCR 之使用將綠膿桿菌之基因組作為對象之 DNA 探針之基板上之檢測結果的比較(1)引子、探針之設計 基於圖1所示之綠膿桿菌之E6130952株、NCTC10332株、PAO1株之oprL基因(序列編號1、2、3)之多重序列比對結果，設計出序列編號4及5之引子、以及序列編號6之探針。oprL基因之GC含量為62.3%。上述引子不包含藉由活化酵素之作用而恢復之失活化學修飾。
(2)核酸放大及檢測 將自綠膿桿菌JCM14847株提取之基因組DNA作為模板，分別進行以莫耳比1：1使用序列編號4與序列編號5之引子之通常之PCR、以莫耳比1：2.5使用序列編號4與序列編號5之引子之非對稱PCR，並進行基板上之雜交反應及標記化、螢光測定。使用表面刻印有條碼之磁性微載體(PlexBio公司製造)作為基板。此時，使用在序列編號5之5'末端經由連接子進行生物素修飾而得之引子。
放大係使用TaKaRa Multiplex Assay Kit Ver.2(TAKARA BIO公司)。於通常之PCR中，以最終濃度成為0.2 μM之方式添加各引子。於非對稱PCR中，以最終濃度分別成為0.2 μM、0.5 μM之方式添加各引子。模板之基因組DNA係每1次反應添加200 pg。TaKaRa Multiplex Assay Kit Ver.2內之2×反應緩衝液係以最終濃度成為1倍之方式添加，Multiplex Enzyme Mix係以最終濃度成為1 U之方式添加。核酸放大裝置係使用T100 Thermal Cycler(Bio-Rad公司)。放大反應結束後，在供於基板上之雜交反應之前，利用該機器進行熱改性反應。
基板上之雜交反應所使用之試劑係藉由如下方式製備：將包含固定有捕捉綠膿桿菌JCM14847株之PCR產物之序列編號6之探針之基板的溶液、磷酸鈉-乙二胺四乙酸鹽水緩衝液(SSPE-buffer)、及實施了熱改性之PCR反應液加以混合。
標記化係使用鏈黴親和素藻紅蛋白(Streptavidin-Phycoerythrin)(PlexBio公司)作為試劑。基板上之雜交反應及標記化係使用IntelliPlex 1000 πCode Processor(PlexBio公司)作為機器。螢光測定裝置係使用PlexBio(註冊商標) 100 Fluorescent Analayzer(PlexBio公司)。
使用之條件如下。 放大反應條件： 94℃ 30秒 60℃ 60秒-＞94℃ 30秒(循環數30次) 72℃ 600秒
熱改性條件： 95℃ 5分鐘-＞急冷至4℃
雜交條件： 於37℃下培育20分鐘
標記化條件： 於37℃下培育10分鐘
(3)測定結果 將測定結果示於圖2。於將自綠膿桿菌JCM14847株提取之基因組DNA作為模板之情形時，藉由通常之PCR所獲得之螢光值為27195，相對於此，藉由非對稱PCR所獲得之螢光值為87818。由此可知，藉由將非對稱PCR應用於綠膿桿菌之檢測，而大約增感至3倍。
實施例 2 ：使用 GC 含量不同之模板之情形時之非對稱 PCR 之增感效果的差異(1)核酸放大及檢測 將自綠膿桿菌JCM14847株提取之基因組DNA作為模板，分別進行以莫耳比1：1使用序列編號4與序列編號5之引子之通常之PCR、以莫耳比1：2.5使用序列編號4與序列編號5之引子之非對稱PCR，並進行基板上之雜交反應及標記化、螢光測定。此時，使用在序列編號5之5'末端經由連接子進行生物素修飾而得之引子。
又，作為第一個比較對象，將自表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)JCM2414株提取之基因組DNA作為模板，分別進行以莫耳比1：1使用序列編號7、8之引子之通常之PCR、以莫耳比1：2.5使用序列編號7與序列編號8之引子之非對稱PCR，並進行基板上之雜交反應及標記化、螢光測定。此時，使用在序列編號8之5'末端經由連接子進行生物素修飾而得之引子。
又，作為第2個比較對象，將自奇異變形桿菌JCM1669株提取之基因組DNA作為模板，分別進行以莫耳比1：1使用序列編號10、11之引子之通常之PCR、以莫耳比1：2.5使用序列編號10與序列編號11之引子之非對稱PCR，並進行基板上之雜交反應及標記化、螢光測定。此時，使用在序列編號11之5'末端經由連接子進行生物素修飾而得之引子。
最後，作為第3個比較對象，將自鮑曼氏不動桿菌JCM6841株提取之基因組DNA作為模板，分別進行以莫耳比1：1使用序列編號13、14之引子之通常之PCR、以莫耳比1：2.5使用序列編號13與序列編號14之引子之非對稱PCR，並進行基板上之雜交反應及標記化、螢光測定。此時，使用在序列編號14之5'末端經由連接子進行生物素修飾而得之引子。
放大係使用TaKaRa Multiplex Assay Kit Ver.2(TAKARA BIO公司)。於通常之PCR中，以最終濃度成為0.2 μM之方式添加各引子。於非對稱PCR中，以最終濃度成為0.2 μM及0.5 μM之方式添加各引子。模板之基因組DNA係每1次反應添加200 pg。TaKaRa Multiplex Assay Kit Ver.2內之2×反應緩衝液係以最終濃度成為1倍之方式添加，Multiplex Enzyme Mix係以最終濃度成為1 U之方式添加。核酸放大裝置係使用T100 Thermal Cycler(Bio-Rad公司)。放大反應結束後，在供於基板上之雜交反應之前，利用該機器進行熱改性反應。
基板上之雜交反應所使用之試劑係將包含固定有序列編號6、9、12、15之探針之基板之溶液、SSPE(磷酸鈉-乙二胺四乙酸鹽水)緩衝液、及實施了熱改性之PCR反應液加以混合而得。此處，序列編號9之探針係捕捉表皮葡萄球菌之PCR產物之探針，序列編號12之探針係捕捉奇異變形桿菌之PCR產物之探針，序列編號15係捕捉鮑曼氏不動桿菌之PCR產物之探針。
標記化所使用之試劑、基板上之雜交反應及標記化所使用之機器、以及螢光測定裝置及各條件係與實施例1相同。
(2)測定結果 將利用非對稱PCR時之螢光值除以利用通常之PCR時之螢光值而得之值作為增感倍率示於橫軸，將序列編號16、17、18、19所示之各項目之PCR產物之GC含量示於縱軸，將此時之繪圖結果示於圖3。此處，增感倍率意指使用應用非對稱PCR實施放大反應而獲得之放大產物進行檢測時之螢光值除以使用應用通常之PCR實施放大反應而獲得之放大產物進行檢測時之螢光值而得的數值，增感倍率越高，則意味著檢測感度相較於通常之PCR越高。由圖3之結果可知，於GC含量低之情形時，增感倍率依賴於GC含量而增大，於目標基因之GC含量為60%以上之情形時，增感倍率即檢測感度之增大變得顯著。
如圖3所示，確認到增感倍率與GC含量呈正相關性。作為確認到該相關性之原因，認為核酸之雜交反應之速度較大地取決於核酸之組成。關於雜交反應，提倡如下模型，即，於具有互補序列之兩分子間，一部分互補鹼基反覆接近及背離，若最終與一完整之互補序列締合，則以自該處閉合拉鏈之方式形成鹼基對。使用8鹼基之模型序列進行計算，結果計算出高GC之鹼基序列之鹼基對形成速度為高AT(Adenine-Thymine，腺嘌呤-胸腺嘧啶)之鹼基序列之鹼基對形成速度的3.2倍，報告有高GC之鹼基序列會更快地與其互補序列締合而形成互補鏈(DNA hybridization kinetics: zippering, internal displacement and sequence dependence. Nucleic Acids Res. 2013 Oct; 41 (19): 8886-8895.)。
本實施例中之基板上之捕捉對象係以雙鏈DNA之形式被放大，並進行熱改性之PCR產物。因此，認為PCR產物係以共存有與基板上之探針之局部互補鏈形成、及與PCR產物之互補鏈形成之形式進行雜交反應。根據上述測定結果認為，GC含量越高之產物除了利用探針之捕捉反應以外，PCR產物間之互補鏈形成亦一併越加速，雖然於通常之PCR中未充分進行利用探針之捕捉反應，但藉由應用非對稱PCR，過剩地產生於基板上捕捉之分子，從而有效地進行利用探針之捕捉反應，增感效果變得顯著。
另一方面，可知於GC含量低之鮑曼氏不動桿菌中，增感倍率為0.92倍，若實施非對稱PCR，則螢光值降低。設想於基板上之檢測中，以上文之共存有與基板上之探針之局部互補鏈形成、及與PCR產物之互補鏈形成之形式，發生2種雜交反應，除此以外，亦與捕捉對象之分子數、GC含量、鹼基對之形成速度等多種參數有關，從而輸出為最終之螢光值。已知非對稱PCR相較於通常之PCR，PCR產物之產量降低，該結果顯示，對於低GC含量之目標基因，非對稱PCR可能發揮不利作用。
由上文可知：於檢測60%以上之GC含量之模板時，藉由應用非對稱PCR，而檢測感度提昇。
實施例 3 ：具有 60% 以上之 GC 含量之基因與除其以外之基因之同時檢測例(1)核酸放大及檢測 準備藉由培養鑑定法判定為包含綠膿桿菌(PA01株之GC含量：66.6%)、鉛黃腸球菌2種菌種之檢體1。已知PA01株之GC含量為66.6%，鉛黃腸球菌之GC含量為42.9%(Sanderson, H., Ortega-Polo, R., Zaheer, R. et al. Comparative genomics of multidrug-resistant Enterococcus spp. isolated from wastewater treatment plants. BMC Microbiol 20, 20 (2020). https://doi.org/10.1186/s12866-019-1683-4)。
對於上述檢體，使用QIAamp BiOstic Bacteremia DNA Kit(QIAGEN公司)，將依照試劑附帶之標準操作說明而提取之基因組DNA作為模板，進行利用Multiplex PCR之放大、及基板上之雜交反應及標記化、螢光測定。基板係與實施例1及2同樣地，使用表面刻印有條碼之磁性微載體(PlexBio公司製造)。此外，關於標記化所使用之試劑、基板上之雜交反應、標記化所使用之機器、螢光測定裝置、其他各條件，亦只要無特別記載，則與實施例1及2相同。
放大係使用TaKaRa Multiplex Assay Kit Ver.2(TAKARA BIO公司)。引子係使用綠膿桿菌用之序列編號4、5所表示之引子、及鉛黃腸球菌用之序列編號20、21、22、23所表示之引子。關於各引子，於通常之PCR中，以最終濃度成為0.2 μM之方式添加全部引子。於非對稱PCR中，以最終濃度成為0.2 μM之方式添加除序列編號5以外之引子，並以最終濃度成為0.5 μM之方式添加序列編號5之引子。使用在序列編號5、23之5'末端經由連接子進行生物素修飾而得之引子。模板溶液係每1次反應添加5 μL。TaKaRa Multiplex Assay Kit Ver.2內之2×反應緩衝液係以最終濃度成為1倍之方式添加，Multiplex Enzyme Mix係以最終濃度成為1 U之方式添加。核酸放大裝置係使用T100 Thermal Cycler(Bio-Rad公司)。放大反應結束後，在供於基板上之雜交反應之前，利用該機器進行熱改性反應。
基板上之雜交反應所使用之試劑係向包含固定有捕捉綠膿桿菌之探針(序列編號6)之基板1、及固定有捕捉鉛黃腸球菌之探針(序列編號24)之基板2之溶液中混合磷酸鈉-乙二胺四乙酸鹽水緩衝液(SSPE-buffer)、實施了熱改性之PCR反應液而得。
關於固定有捕捉綠膿桿菌之探針之基板1減去空白值後之螢光值，於通常之PCR時為1622，於應用了非對稱PCR之情形時為13731，檢測感度大幅提昇。又，固定有捕捉鉛黃腸球菌之探針之基板2於通常之PCR時，檢測感度亦充分較高，但於利用非對稱PCR將綠膿桿菌放大之情形時，亦未對基板1之結果產生不良影響，於基板2之結果中，檢測感度亦上升。
因此，於具有60%以上之GC含量之基因與除其以外之基因之同時檢測中，非對稱PCR亦有效地發揮作用，可確認到本發明之有效性。
圖1表示綠膿桿菌之E6130952株、NCTC10332株、PAO1株之oprL基因(序列編號1、2、3)之多重序列比對結果。 圖2表示將自綠膿桿菌JCM14847株提取之基因組DNA作為模板所進行之通常之PCR與非對稱PCR之螢光值的比較結果。 圖3表示利用非對稱PCR將GC含量與自綠膿桿菌JCM14847株提取之基因組DNA不同之模板放大之情形時之增感倍率結果。 圖4表示將自包含綠膿桿菌、鉛黃腸球菌之培養液提取之基因組DNA作為模板所進行之通常之PCR與非對稱PCR之螢光值的比較結果。 

          <![CDATA[<110>  日商電化股份有限公司(DENKA COMPANY LIMITED)、學校法人東邦大學(TOHO UNIVERSITY)]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  用於奇異變形桿菌之探針]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          tttttttttt agaaacgcct taccg                                             25
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  用於]]>鮑曼氏不動桿菌之前置引子
          <![CDATA[<400>  13]]>
          tgatctgacg aagacacatt aac                                               23
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  用於鮑曼氏不動桿菌之反置引子]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          atttcagttt agagcactgt gc                                                22
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  用於鮑曼氏不動桿菌之探針]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          ttttttgaat ttagattgaa gctgt                                             25
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  78]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  綠膿桿菌]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          ttacttcttc agctcgacgc gacggttctg agcccaggac tgctcgtcgt ggccggtagc       60
          gaccggacgc tctttacc                                                     78
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  122]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  表皮葡萄球菌]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          tacattccaa ctccagaacg tgattctgac aaaccattca tgatgccagt tgaggacgta       60
          ttctcaatca ctggtcgtgg tactgttgct acaggccgtg ttgaacgtgg tcaaatcaaa      120
          gt                                                                     122
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  150]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  奇異變形桿菌]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          caactcacta tggtcgtgtg tgtccaatcg aaacacctga aggtccaaat atcggtctga       60
          ttaactcatt atctgtttat gcacagacta acgagtacgg attcttagaa acgccttacc      120
          gtgttgtaga aaacaacgct gtaacagatg                                       150
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  198]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  鮑曼氏不動桿菌]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          tgatctgacg aagacacatt aactcattaa cagattggca aaattgagtc tgaaataaat       60
          tgttcactca agagtttagg ttaagcaatt aatctagatg aattgagaac tagcaaatta      120
          actgaatcaa gcgttttggt atgtgaattt agattgaagc tgtacggtgc ttaagtgcac      180
          agtgctctaa actgaaat                                                    198
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  用於鉛黃腸球菌之引子]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          ttcaattaaa tttggtaatt ccaat                                             25
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  用於鉛黃腸球]]>菌之引子
          <![CDATA[<400>  21]]>
          tcaatcaaat tcggtaattc yaat                                              24
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  用於鉛黃腸球菌之引子]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          cgatcaaatt yggtaattcc aac                                               23
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  用於鉛黃腸球菌之引子]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          arcttggctg gacacgta                                                     18
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  用於鉛黃腸球菌之探針]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          gcttctacgt tctcg                                                        15
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007

Claims (23)

  1. 一種於反應液中放大具有60%以上之GC含量之至少1個目標基因之方法，其包括使用用於將目標基因放大之包含第一引子及第二引子之引子組，將目標基因所特異性之鹼基序列放大的步驟；且 引子組之一引子係以高於另一引子之莫耳比添加於反應液中，各引子並非包含藉由活化酵素之作用而恢復之失活化學修飾之熱啟動引子。
  2. 如請求項1之方法，其中上述反應液包含除目標基因以外之1個或複數個基因，上述方法包括將除目標基因以外之1個或複數個基因與目標基因一併同時放大。
  3. 如請求項1或2之方法，其中引子組中之引子之莫耳比為1：1.5～20.0。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中目標基因係包含綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)之基因組序列中至少連續之13個鹼基的鹼基序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中第一引子係在嚴格之條件下與序列編號1～3之任一者所記載之鹼基序列、或於序列編號1～3之任一者所記載之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列進行雜交的引子，第二引子係在嚴格之條件下與序列編號1～3之任一者所記載之鹼基序列之互補鏈序列、或於序列編號1～3之任一者所記載之鹼基序列之互補鏈序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列進行雜交的引子。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中第一引子係包含序列編號4所記載之鹼基序列中、或於序列編號4所記載之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列中至少連續之13個鹼基的寡核苷酸。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中第二引子係包含序列編號5所記載之鹼基序列中、或於序列編號5所記載之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列中至少連續之13個鹼基的寡核苷酸。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中引子經生物素標記。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中莫耳比高之引子經生物素標記。
  10. 一種於一反應液中檢測GC含量超過60%之至少1個目標基因之方法，其包括 使用與藉由如請求項1至9中任一項之方法放大之目標基因之單鏈互補之探針檢測目標基因的步驟。
  11. 如請求項10之方法，其中探針係與藉由莫耳比高之引子放大之目標基因之單鏈互補。
  12. 如請求項10或11之方法，其中藉由目標基因之單鏈與探針之互補雙鏈基因形成之存在而檢測目標基因。
  13. 如請求項1至12中任一項之方法，其中目標基因係來自綠膿桿菌，對綠膿桿菌與除其以外之細菌性基因進行鑑別。
  14. 如請求項10至13中任一項之方法，其中探針固定於檢測基板材料。
  15. 如請求項10至14中任一項之方法，其中探針經標記。
  16. 如請求項10至15中任一項之方法，其中探針核酸包括包含序列編號6所記載之鹼基序列中、或於序列編號6所記載之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列中至少連續之13個鹼基的寡核苷酸。
  17. 如請求項14至16中任一項之方法，其中檢測基板材料係編碼化之微載體。
  18. 如請求項17之方法，其中微載體包含： (a)具有第一表面及第二表面之實質上透明之聚合物層，且 該第一及該第二表面相互平行； (b)實質上不透明之聚合物層，且該實質上不透明之聚合物層貼附於該實質上透明之聚合物層之該第一表面，包圍該實質上透明之聚合物層之中心部分，該實質上不透明之聚合物層包含表示類比編碼之二維形狀；以及 (c)用於捕捉分析物之捕捉劑，且該捕捉劑在該實質上透明之聚合物層之至少該中心部分，與該實質上透明之聚合物層之該第一表面及該第二表面中之至少一者連結。
  19. 一種引子組，其包含第一引子及第二引子，用於檢測具有60%以上之GC含量之至少1個目標基因之存在，且 第一引子係包含序列編號4所記載之鹼基序列中、或於序列編號4所記載之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列中至少連續之13個鹼基的寡核苷酸， 第二引子係包含序列編號5所記載之鹼基序列中、或於序列編號5所記載之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列中至少連續之13個鹼基的寡核苷酸。
  20. 如請求項19之引子組，其中目標基因係包含綠膿桿菌之基因組序列中至少連續之13個鹼基的鹼基序列。
  21. 如請求項19或20之引子組，其中第一引子係在嚴格之條件下與序列編號1～3之任一者所記載之鹼基序列、或於序列編號1～3之任一者所記載之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列進行雜交的引子，第二引子係在嚴格之條件下與序列編號1～3之任一者所記載之鹼基序列之互補鏈序列、或於序列編號1～3之任一者所記載之鹼基序列之互補鏈序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列進行雜交的引子。
  22. 如請求項19至21中任一項之引子組，其中第一引子係包含序列編號4所記載之鹼基序列中、或於序列編號4所記載之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列中至少連續之13個鹼基的寡核苷酸。
  23. 如請求項19至22中任一項之引子組，其中第二引子係包含序列編號5所記載之鹼基序列中、或於序列編號5所記載之鹼基序列中缺失、置換、插入或附加1個或數個鹼基而成之鹼基序列中至少連續之13個鹼基的寡核苷酸。
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