TW202246272A - 吡唑並吡嗪三環類化合物及其應用 - Google Patents

Abstract

一種吡唑並吡嗪三環類化合物及其應用，其中吡唑並吡嗪三環類化合物為式（Ⅰ）所示的化合物或其藥學上可接受的鹽。

Description

吡唑並吡嗪三環類化合物及其應用

本發明涉及一種吡唑並吡嗪三環類化合物及其應用，特別是關於一種式（Ⅰ）所示的化合物或其藥學上可接受的鹽。

酪胺酸激酶的磷酸化作用與酪胺酸磷酸酶的去磷酸化作用是生物體內普遍存在的訊息傳遞機制，它們共同調節細胞內蛋白質的酪胺酸磷酸化水準。SHP2（SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2）就是使酪胺酸去磷酸化作用的一種非跨膜型蛋白酪胺酸磷酸酶，是蛋白酪胺酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）家族的重要成員之一，其分子由 PTPN11 基因編碼，既可以透過磷酸酶的催化活性來正向調控下游訊息傳遞通路，也可以作為磷酸酶非依賴性的接頭蛋白發揮正向調控作用，在特定的條件下亦可發揮負向調控作用，從而廣泛參與細胞的分化、遷移等生物學功能的調控及相關的訊息傳遞過程。

PTPN11突變被認為是幼年型粒單核細胞白血病（Juvenile myelomonocytic leukemia，JMML）的高危因子。同時，因其在不同類型白血病中均存在著SHP2的異常活化和突變而被認為是白血病的原癌基因；在前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和神經膠質瘤中，SHP2也被報導呈過度活化狀態；在肺癌中，SHP2 作為癌基因透過調控多種機制促進腫瘤的發生、發展。但在肝癌發生過程中，SHP2卻在特定環境的影響下發揮抑癌基因的作用。總之，作為重要的節點分子，SHP2在腫瘤發生、發展的過程中發揮著重要的調控作用，是潛在的治療靶點。

本發明提供了式（Ⅰ）的化合物或其藥學上可接受的鹽，

其中，T ₁為CR ₄或N； 當E ₁為O時，R ₃為H、F、Cl、Br、I或C _1-3烷基，所述C _1-3烷基任選被1、2或3個R _a取代； 當E ₁為CH ₂時，R ₃為H、Cl、Br、I或C _1-3烷基，所述C _1-3烷基任選被1、2或3個R _a取代； R ₁、R ₂和R ₄分別獨立地為H、F、Cl、Br、I或C _1-3烷基，所述C _1-3烷基任選被1、2或3個R _b取代； R ₅為被OH取代的C _1-3烷基； R ₆分別獨立地為H、F、Cl、Br、I、OH、NH ₂或C _1-3烷基，所述C _1-3烷基任選被1、2或3個R _c取代； R _a、R _b和R _c分別獨立地為F、Cl、Br、I、OH或NH ₂； m為1、2、3或4。

在一些實施例中，當上述E ₁為O時，上述R ₃為H或F，其他變數如本發明所定義。

在一些實施例中，當上述E ₁為CH ₂時，上述R ₃為H，其他變數如本發明所定義。

在一些實施例中，上述R ₁、R ₂和R ₄分別獨立地為H、F、Cl、Br或I，其他變數如本發明所定義。

在一些實施例中，上述R ₅為-CH ₂-OH，其他變數如本發明所定義。

在一些實施例中，上述R ₆分別獨立地為Cl或NH ₂，其他變數如本發明所定義。

在一些實施例中，上述結構單元

為

、

、

或

。

在一些實施例中，上述化合物為

， 其中，T ₁、E ₁、R ₁、R ₂、R ₃、R ₅、R ₆和m如本發明所定義。

在一些實施例中，上述化合物為

， 其中，T ₁、E ₁、R ₁、R ₂和R ₃如本發明所定義。

在一些實施例中，本發明還提供了下列化合物或其藥學上可接受的鹽，

、

、

或

。

在一些實施例中，上述化合物或其藥學上可接受的鹽，其中化合物選自，

、

、

或

。

在一些實施例中，本發明第二方面還提供一種藥物組合物，其包含上述任意實施例所限定的化合物或其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的載體。

在一些實施例中，本發明還提供一種在需要的受試者中治療與SHP2相關的疾病的方法，包括向受試者提供有效劑量的上述任意實施例所限定的化合物或其藥學上可接受的鹽或藥物組合物。

在一些實施例中，本發明還提供了上述化合物或其藥學上可接受的鹽在製備治療與SHP2相關疾病的藥物中的應用；其中所述與SHP2相關疾病是指肺癌，較佳為非小細胞肺癌。

在一些實施例中，本發明化合物對蛋白酪胺酸磷酸酶SHP2展現出較好的抑制活性，將會在SHP2異常腫瘤患者中具有優異的治療效果。

除非另有說明，本文所用的下列術語和縮寫旨在具有下列含義。一個特定的術語或縮寫在沒有特別定義的情況下，不應該被認為是不確定的或不清楚的，而應該按照普通的含義去理解。當本文中出現商品名時，意在指代其對應的商品或其活性成分。

這裡所採用的術語「藥學上可接受的」，是針對那些化合物、材料、組合物和/或劑型而言，它們在可靠的醫學判斷的範圍之內，適用於與人類和動物的組織接觸使用，而沒有過多的毒性、刺激性、過敏性反應或其它問題或併發症，與合理的利益/風險比相稱。

術語「藥學上可接受的鹽」是指本發明化合物的鹽，由本發明發現的具有特定取代基的化合物與相對無毒的酸或鹼製備。當本發明的化合物中含有相對酸性的官能基時，可以透過在純的溶液或合適的惰性溶劑中用足量的鹼與這類化合物接觸的方式獲得鹼加成鹽。藥學上可接受的鹼加成鹽包括鈉、鉀、鈣、銨、有機胺或鎂鹽或類似的鹽。當本發明的化合物中含有相對鹼性的官能基時，可以透過在純的溶液或合適的惰性溶劑中用足量的酸與這類化合物接觸的方式獲得酸加成鹽。藥學上可接受的酸加成鹽的實例包括無機酸鹽，所述無機酸包括例如鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸，碳酸氫根，磷酸、磷酸一氫根、磷酸二氫根、硫酸、硫酸氫根、氫碘酸、亞磷酸等；以及有機酸鹽，所述有機酸包括如乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸和甲磺酸等類似的酸；還包括胺基酸（如精胺酸等）的鹽，以及如葡萄糖醛酸等有機酸的鹽。本發明的某些特定的化合物含有鹼性和酸性的官能基，從而可以被轉換成任一鹼或酸加成鹽。

本發明的藥學上可接受的鹽可由含有酸根或鹼基的母體化合物透過常規化學方法合成。一般情況下，這樣的鹽的製備方法是：在水或有機溶劑或兩者的混合物中，經由游離酸或鹼形式的這些化合物與化學計量的適當的鹼或酸反應來製備。

本發明的化合物可以存在特定的幾何或立體異構物形式。本發明設想所有的這類化合物，包括順式和反式異構物、(-)- 和 (+)-鏡像異構物、(R)- 和 (S)-鏡像異構物、非鏡像異構物、(D)-異構物、(L)-異構物，及其外消旋混合物和其他混合物，例如鏡像異構物或非鏡像異構物富集的混合物，所有這些混合物都屬於本發明的範圍之內。烷基等取代基中可存在另外的不對稱碳原子。所有這些異構物以及它們的混合物，均包括在本發明的範圍之內。

除非另有說明，術語「鏡像異構物」或者「旋光異構物」是指互為鏡像關係的立體異構物。

除非另有說明，術語「順反異構物」或者「幾何異構物」係由因雙鍵或者成環碳原子單鍵不能自由旋轉而引起。

除非另有說明，術語「非鏡像異構物」是指分子具有兩個或多個掌性中心，並且分子間為非鏡像的關係的立體異構物。

除非另有說明，「(+)」表示右旋，「(-)」表示左旋，「(±) 」表示外消旋。

除非另有說明，用楔形實線鍵（

）和楔形虛線鍵（

）表示一個立體中心的絕對構型，用直形實線鍵（

）和直形虛線鍵（

）表示立體中心的相對構型，用波浪線（

）表示楔形實線鍵（

）或楔形虛線鍵（

），或用波浪線（

）表示直形實線鍵（

）和直形虛線鍵（

）。

除非另有說明，術語「互變異構物」或「互變異構物形式」是指在室溫下，不同官能基異構物處於動態平衡，並能很快的相互轉化。若互變異構物是可能的 (如在溶液中)，則可以達到互變異構物的化學平衡。例如，質子互變異構物 (proton tautomer) (也稱質子轉移互變異構物 (prototropic tautomer)) 包括透過質子遷移來進行的互相轉化，如酮-烯醇異構化和亞胺-烯胺異構化。價鍵異構物 (valence tautomer) 包括一些成鍵電子的重組來進行的相互轉化。其中酮-烯醇互變異構化的具體實例是戊烷-2,4-二酮與4-羥基戊-3-烯-2-酮兩個互變異構物之間的互變。

除非另有說明，術語「富含一種異構物」、「異構物富集」、「富含一種鏡像異構物」或者「鏡像異構物富集」指其中一種異構物或鏡像異構物的含量小於100%，並且，該異構物或鏡像異構物的含量大於等於60%，或者大於等於70%，或者大於等於80%，或者大於等於90%，或者大於等於95%，或者大於等於96%，或者大於等於97%，或者大於等於98%，或者大於等於99%，或者大於等於99.5%，或者大於等於99.6%，或者大於等於99.7%，或者大於等於99.8%，或者大於等於99.9%。

除非另有說明，術語「異構物過量」或「鏡像異構物過量」指兩種異構物或兩種鏡像異構物相對百分比之間的差值。例如，其中一種異構物或鏡像異構物的含量為90%，另一種異構物或鏡像異構物的含量為10%，則異構物或鏡像異構物過量（enantiomeric excess，ee值）為80%。

可以透過掌性合成或掌性試劑或者其他常規技術製備光學活性的(R)-和(S)-異構物以及D和L異構物。如果想得到本發明某化合物的一種鏡像異構物，可以透過不對稱合成或者具有掌性助劑的衍生作用來製備，其中將所得非鏡像異構物混合物分離，並且輔助基團裂開以提供純的所需鏡像異構物。或者，當分子中含有鹼性官能基（如胺基）或酸性官能基（如羧基）時，與適當的光學活性的酸或鹼形成非鏡像異構物的鹽，然後透過本領域所公知的常規方法進行非鏡像異構物拆分，然後回收得到純的鏡像異構物。此外，鏡像異構物和非鏡像異構物的分離通常是透過使用色譜法完成的，所述色譜法採用掌性固定相，並任選地與化學衍生法相結合（例如由胺生成胺基甲酸鹽）。

本發明的化合物可以在一個或多個構成該化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素標記化合物，比如氚（ ³H），碘-125（ ¹²⁵I）或C-14（ ¹⁴C）。又例如，可用重氫取代氫形成氘代藥物，氘與碳構成的鍵比普通氫與碳構成的鍵更堅固，相比於未氘化藥物，氘代藥物有降低毒副作用、增加藥物穩定性、增強療效、延長藥物生物半衰期等優勢。本發明的化合物的所有同位素組成的變換，無論放射性與否，都包括在本發明的範圍之內。術語「任選」或「任選地」指的是隨後描述的事件或狀況可能但不是必需出現的，並且該描述包括其中所述事件或狀況發生的情況以及所述事件或狀況不發生的情況。

術語「被取代的」是指特定原子上的任意一個或多個氫原子被取代基取代，取代基可以包括重氫和氫的變體，只要特定原子的價態是正常的並且取代後的化合物是穩定的。當取代基為氧（即=O）時，意味著兩個氫原子被取代。氧取代不會發生在芳香基上。術語「任選被取代的」是指可以被取代，也可以不被取代，除非另有規定，取代基的種類和數目在化學上可以實現的基礎上可以是任意的。

當任何變數（例如R）在化合物的組成或結構中出現一次以上時，其在每一種情況下的定義都是獨立的。因此，例如，如果一個基團被0-2個R所取代，則所述基團可以任選地至多被兩個R所取代，並且每種情況下的R都有獨立的選項。此外，取代基和/或其變體的組合只有在這樣的組合會產生穩定的化合物的情況下才是被允許的。

當一個連接基團的數量為0時，比如-(CRR) ₀-，表示該連接基團為單鍵。

當其中一個變數選自單鍵時，表示其連接的兩個基團直接相連，比如A-L-Z中L代表單鍵時表示該結構實際上是A-Z。

當一個取代基為空缺時，表示該取代基是不存在的，比如A-X中X為空缺時表示該結構實際上是A。當所列舉的取代基中沒有指明其透過哪一個原子連接到被取代的基團上時，這種取代基可以透過其任何原子相鍵結，例如，吡啶基作為取代基可以透過吡啶環上任意一個碳原子連接到被取代的基團上。

除非另有規定，當某一基團具有一個或多個可連接位點時，該基團的任意一個或多個位點可以透過化學鍵與其他基團相連。所述位點與其他基團連接的化學鍵可以用直形實線鍵（

）、直形虛線鍵（

）、或波浪線（

）表示。例如-OCH ₃中的直形實線鍵表示透過該基團中的氧原子與其他基團相連；

中的直形虛線鍵表示透過該基團中的氮原子的兩端與其他基團相連；

中的波浪線表示透過該苯基基團中的1和2位碳原子與其他基團相連。

除非另有規定，術語「C _1-3烷基」用於表示直鏈或支鏈的由1至3個碳原子組成的飽和碳氫基團。所述C _1-3烷基包括C _1-2和C _2-3烷基等；其可以是一價（如甲基）、二價（如亞甲基）或者多價（如次甲基）。C _1-3烷基的實例包括但不限於甲基 (Me)、乙基 (Et)、丙基 (包括 n-丙基和異丙基) 等。

除非另有規定，C _n-n+m或C _n-C _n+m包括n至n+m個碳的任何一種具體情況，例如C _1-12包括C ₁、C ₂、C ₃、C ₄、C ₅、C ₆、C ₇、C ₈、C ₉、C ₁₀、C ₁₁、和C ₁₂，也包括n至n+m中的任何一個範圍，例如C _1-12包括C _1-3、C _1-6、C _1-9、C _3-6、C _3-9、C _3-12、C _6-9、C _6-12、和C _9-12等；同理，n元至n+m元表示環上原子數為n至n+m個，例如3-12元環包括3元環、4元環、5元環、6元環、7元環、8元環、9元環、10元環、11元環、和12元環，也包括n至n+m中的任何一個範圍，例如3-12元環包括3-6元環、3-9元環、5-6元環、5-7元環、6-7元環、6-8元環、和6-10元環等。

術語「離去基團」是指可以被另一種官能基或原子透過取代反應（例如親核取代反應）所取代的官能基或原子。例如，代表性的離去基團包括三氟甲磺酸酯；氯、溴、碘；磺酸酯基，如甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、對溴苯磺酸酯、對甲苯磺酸酯等；醯氧基，如乙醯氧基、三氟乙醯氧基等等。

術語「保護基」包括但不限於「胺基保護基」、「羥基保護基」或「巰基保護基」。術語「胺基保護基」是指適合用於阻止胺基氮位上副反應的保護基團。代表性的胺基保護基包括但不限於：甲醯基；醯基，例如鏈烷醯基（如乙醯基、三氯乙醯基或三氟乙醯基）；烷氧基羰基，如叔丁氧基羰基（Boc）；芳基甲氧羰基，如苄氧羰基（Cbz）和9-芴甲氧羰基（Fmoc）；芳基甲基，如苄基（Bn）、三苯甲基（Tr）、1,1-二-（4'-甲氧基苯基）甲基；甲矽烷基，如三甲基甲矽烷基（TMS）, 2 -（三甲基矽）乙氧基甲基（SEM）和叔丁基二甲基甲矽烷基（TBS）等等。術語「羥基保護基」是指適合用於阻止羥基副反應的保護基。代表性羥基保護基包括但不限於：烷基，如甲基、乙基和叔丁基；醯基，例如鏈烷醯基（如乙醯基）；芳基甲基，如苄基（Bn），對甲氧基苄基（PMB）、9-芴基甲基（Fm）和二苯基甲基（二苯甲基，DPM）；甲矽烷基，如三甲基甲矽烷基（TMS）和叔丁基二甲基甲矽烷基（TBS）等等。

本發明的化合物可以透過所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的多種合成方法來製備，包括下面列舉的具體實施方式、其與其他化學合成方法的結合所形成的實施方式以及本領域技術上人員所熟知的等同替換方式，優選的實施方式包括但不限於本發明的實施例。

本發明的化合物可以透過所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的常規方法來確認結構，如果本發明涉及化合物的絕對構型，則該絕對構型可以透過本領域常規技術手段予以確證。例如單晶X射線衍射法（SXRD），把培養出的單晶用Bruker D8 venture衍射儀收集衍射強度資料，光源為CuKα輻射，掃描方式：φ/ω 掃描，收集相關資料後，進一步採用直接法（Shelxs97）解析晶體結構，便可以確認絕對構型。

本發明所使用的溶劑可經市售獲得。本發明採用下述縮寫：aq代表水；DMF代表N，N-二甲基甲醯胺；EtOAc代表乙酸乙酯；EtOH代表乙醇；MeOH代表甲醇；BOC代表叔丁氧羰基是一種胺基保護基團；HOAc代表乙酸；r.t.代表室溫；THF代表四氫呋喃；Boc ₂O代表二-叔丁基二碳酸酯；TFA代表三氟乙酸；DIPEA代表二異丙基乙基胺；SOCl ₂代表氯化亞碸；CS ₂代表二硫化碳；TsOH代表對甲苯磺酸；mp代表熔點；LDA代表二異丙基胺基鋰；EDTA代表乙二胺四乙酸；SEM代表2-三甲基矽基乙氧基甲基；PMB代表對甲氧基苄基；TBDPS代表叔丁基二苯基矽基；TBS代表叔丁基二甲基矽基；OTf代表三氟甲磺醯基。

化合物依據本領域常規命名原則或者使用ChemDraw®軟體命名，市售化合物採用供應商目錄名稱。

下面經過實施例對本發明進行詳細描述，但並不意味著對本發明任何不利限制。本文已經詳細地描述了本發明，其中也公開了其具體實施例方式，對所屬技術領域中具有通常知識者而言，在不脫離本發明精神和範圍的情況下針對本發明具體實施方式進行各種變化和改進將是顯而易見的。

實施例 1:

。

步驟1：化合物001-3的合成：

在氮氣的保護下，將化合物001-1（5.0 g, 19.43 mmol, 1 eq）溶解於無水四氫呋喃中（60 mL）中，氮氣置換三次後降溫至-78 ℃。於反應混合物中緩慢滴加二異丙基氨基鋰（2.0 M, 10.69 mL, 1.1 eq）的四氫呋喃溶液後混合物在-78 ℃下攪拌1小時，之後往體系中緩慢滴加化合物001-2的四氫呋喃溶液並在-78 ℃下反應30分鐘，然後將反應體系緩慢升溫至-25 ℃反應15小時。反應結束後，用飽和氯化銨溶液（100 mL）淬滅，乙酸乙酯萃取三次（50 mL×3），合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋蒸除去溶劑，得到粗品。管柱層析：粗品經管柱層析（石油醚：乙酸乙酯= 0-10%）分離得到化合物001-3。MS（ESI）m/z: 388.2 [M+Na] ⁺。

步驟2：化合物001-4的合成：

在氮氣的保護下，將化合物001-3（6.91 g, 18.91 mmol, 1 eq）溶於二氧六環（80 mL）和甲醇（32 mL）中，再加入氫氧化鈉水溶液（6 M, 16 mL, 5.08 eq）後，升溫至100 ℃迴流反應15小時。反應結束後，冷卻至室溫，減壓除去有機溶劑後用稀鹽酸（1.0 M）調整pH值為3-4，過濾，濾餅用水洗滌，洗滌後的濾餅重新溶解於乙酸乙酯中，無水硫酸鈉乾燥後旋乾，以得到化合物001-4，MS （ESI） m/z: 360.1 [M+Na] ⁺。

步驟3：化合物001-5的合成：

在氮氣的保護下，將化合物001-4（6.10 g, 18.08 mmol, 1 eq）和多聚磷酸（40 mL，1.0 eq）加入單口瓶中，於120 ℃下反應1小時。反應結束後冷卻至室溫，將反應混合物倒入冰水中淬滅，冰浴下緩慢用氫氧化鈉水溶液（6 M）調整pH值至9。乙酸乙酯萃取三次（50 mL×3），合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋蒸除去溶劑後將粗品溶於二氯甲烷（100 mL）中。加入二碳酸二叔丁酯（6.12 g, 28.05 mmol, 6.44 mL, 3.0 eq）和三乙胺（5.68 g, 56.10 mmol, 7.81 mL, 6.0 eq）後，反應混合物在25 ℃下反應2小時。反應結束後加水，分液，水相用乙酸乙酯萃取（50 mL×3），合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋蒸除去溶劑，以得到化合物001-5。MS（ESI）m/z: 342.1 [M+Na] ⁺。

步驟4：化合物001-7的合成：

在氮氣的保護下，將化合物001-5（2 g, 6.26 mmol, 1.0 eq）和化合物001-6（2.28 g, 18.79 mol, 3.0 eq） 加入單口瓶中，隨後加入鈦酸四乙酯（5 mL），100 ℃迴流反應18小時。反應結束後冷卻至室溫，將混合物倒入冰水中淬滅，加入乙酸乙酯（50 mL）後攪拌1小時，分液，水相用乙酸乙酯萃取（50 mL×3）。合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋蒸除去溶劑，得到粗品。管柱層析：粗品經管柱層析（石油醚：乙酸乙酯= 0-20%）分離，得到化合物001-7。MS（ESI）m/z: 445.1 [M+Na] ⁺。

步驟5：化合物001-8的合成：

在氮氣的保護下，將化合物001-7（2.54g, 6.01 mmol, 1 eq）溶於四氫呋喃（25 mL）中，降溫至-20 ℃後加入硼氫化鈉（455 mg, 12.02 mmol, 2.0 eq）。反應體系逐漸恢復至25 ℃反應12小時。反應結束後，冰浴下加水淬滅反應，乙酸乙酯萃取（50 mL×3）後合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋蒸除去溶劑得到化合物001-8。MS（ESI）m/z: 447.1 [M+Na] ⁺。

步驟6：化合物001-9的合成：

將化合物001-8（34 mg, 80 μmol, 1 eq）溶於二氯甲烷（5 mL）中，加入三氟乙酸（91.2 mg, 800 μmol, 59.23 μL, 10 eq）。反應混合物在25 ℃下反應2小時後加入碳酸鉀中和反應體系至中性，旋乾溶劑，以得到化合物001-9。MS（ESI）m/z: 325.1 [M+H] ⁺。

步驟7：化合物001-11的合成：

化合物001-10（5 g, 44.22 mmol, 1 eq）溶於N,N-二甲基甲醯胺（40 mL），加入4-甲氧基苄氯（6.93 g, 44.22 mmol, 6.02 mL, 1 eq）和碳酸鉀（6.11 g, 44.22 mmol, 1 eq），80 ℃反應3小時。將反應液逐滴滴入水（200 mL）中，乙酸乙酯（300 mL）稀釋，分液，水相用乙酸乙酯洗（200 mL），合併有機相，飽和氯化鈉洗（200 mL ×4），有機相無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，以得到化合物001-11。 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ ppm 3.75 (s, 3 H) 5.12 - 5.20 (m, 2 H) 6.82 - 6.89 (m, 2 H) 7.16 - 7.19 (m, 2 H) 7.92 (s, 1 H) 7.99 - 8.08 (m, 1 H)。

步驟8：化合物001-12的合成：

化合物001-11（5.2 g, 22.30 mmol, 1 eq）溶於四氫呋喃（150 mL），-60 ℃下滴入雙（三甲矽基）氨基鋰（1 M, 26.76 mL, 1.2 eq），反應1小時，-60 ℃下滴入溶於30 mL四氫呋喃的六氯乙烷（6.33 g, 26.76 mmol, 3.03 mL, 1.2 eq），-60 ℃反應1小時。加入飽和氯化銨溶液（100 mL），逐漸升至20 ℃，乙酸乙酯稀釋（300 mL），分液，水相乙酸乙酯洗（200 mL），合併有機相，飽和氯化鈉溶液洗（100 mL），無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到的粗品經矽膠管柱層析（石油醚/乙酸乙酯 = 100:1- 10：1）純化得化合物001-12。 ¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ ppm 8.08 - 8.47 (m, 1 H) 7.12 - 7.42 (m, 2 H) 6.77 - 7.01 (m, 2 H) 5.33 (s, 2 H) 3.82 (s, 3 H)。

步驟9：化合物001-14的合成：

化合物001-12（5 g, 18.68 mmol, 1 eq）、化合物001-13（9.50 g, 56.04 mmol, 3 eq）溶於乙醇（75 mL）和水（75 mL），加入碳酸氫鈉（12.55 g, 149.44 mmol, 5.81 mL, 8 eq），90 ℃反應60小時。反應液減壓濃縮除去乙醇，水相二氯甲烷洗（200 mL×2），水相滴加濃鹽酸至pH ＜4，乙酸乙酯稀釋（200 mL），分液，水相乙酸乙酯洗（200 mL），合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，以得到化合物001-14。 ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ ppm 8.07 - 8.20 (m, 1 H) 7.31 (d, J=9.79 Hz, 1 H) 7.11 (d, J=8.53 Hz, 2 H) 6.91 - 6.94 (m, 1 H) 5.22 - 5.36 (m, 2 H) 4.45 (dt, J=9.79, 3.39 Hz, 1 H) 3.82 (br dd, J=11.04, 3.51 Hz, 2 H) 3.73 (s, 3 H) 3.65 (br d, J=3.26 Hz, 1 H) 3.18 (s, 1 H)。

步驟10：化合物001-15的合成：

化合物001-14（4 g, 11.89 mmol, 1 eq）溶於甲醇（100 mL），加入Pd/C（0.4 g, 10%），置換氫氣（400 mg, 11.89 mmol, 10%純度, 1 eq），50 Psi 30 ℃下反應88小時。抽濾（矽藻土助濾），濾液減壓除去溶劑，得化合物001-15的粗產物，此粗產物直接進行下一步反應。MS (ESI) m/z: 307.1 [M+H] ⁺。

步驟11：化合物001-16的合成：

化合物001-15（3.6 g, 11.75 mmol, 1 eq）溶於甲醇（100 mL），加入鹽酸甲醇溶液（4 M, 293.81μL, 0.1 eq），50 ℃反應16小時。減壓濃縮得化合物001-16。MS (ESI) m/z: 289.1 [M+H] ⁺。

步驟12：化合物001-17的合成：

化合物001-16（3 g, 10.41 mmol, 1 eq）溶於DMF（10 mL），加入咪唑（2.13 g, 31.22 mmol, 3 eq），0 ℃下加入叔丁基二苯基氯矽烷（8.58 g, 31.22 mmol, 8.02 mL, 3 eq），逐漸升至20 ℃反應1小時。將飽和氯化鈉溶液（50 mL）逐滴滴入反應體系，乙酸乙酯稀釋（100 mL），分液，水相乙酸乙酯洗（100 mL×3），合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到的粗品經矽膠管柱層析（PE/EA =10:1- 0:1）純化得化合物001-17。MS (ESI) m/z: 527.2 [M+H] ⁺。

步驟13：化合物001-18的合成：

化合物001-17（4.2 g, 7.97 mmol, 1 eq）溶於二氧六環（50 mL），加入二氧化錳（3.47 g, 39.87 mmol, 5 eq），20 ℃反應1小時。抽濾（矽藻土助濾），濾液減壓濃縮得化合物001-18。MS (ESI) m/z: 525.2 [M+H] ⁺。

步驟14：化合物001-19的合成：

化合物001-18（30 mg, 57.18 μmol, 1 eq）溶於N,N-二甲基甲醯胺（1 mL），加入三乙胺（23.14 mg, 228.72 μmol, 31.83 μL, 4 eq），0 ℃下加入N-苯基雙（三氟甲烷磺醯）亞胺（40.86 mg, 114.36 μmol, 2 eq），逐漸升至20 ℃反應20分鐘。飽和氯化鈉溶液（10 mL）和乙酸乙酯稀釋（20 mL），分液，有機相無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，粗品經薄層層析板分離（PE/EA = 10：1），得化合物001-19。MS (ESI) m/z: 657.3 [M+H] ⁺。

步驟15：化合物001-20的合成：

將001-19（5 g, 9.39 mmol, 1 eq）溶解於二氯乙烷（20 mL）中，25 ℃下一次加入三氯化鋁（10.0 g, 75.1 mmol, 8 eq），混合物在40℃攪拌1小時。將反應液溶解在水（10 mL）和二氯甲烷（10 mL）中，萃取分層，同時水相用二氯甲烷（100 mL，100 mL，100 mL）萃取三次。合併有機相，用飽和氯化鈉溶液（100 mL）洗滌一次，最後用無水硫酸鈉乾燥有機相，過濾並減壓濃縮，得到粗品。管柱層析：粗品經矽膠管柱層析（0 %-10 %甲醇在二氯甲烷中）（TLC檢測PE：EA = 2:1-1:1）分離，得到化合物001-20。MS (ESI) m/z: 299.0 [M+H] ⁺。

步驟16：化合物001-21的合成：

將001-20（2.2 g, 7.38 mmol, 1 eq）溶於DMF（10 mL），加入2,6-二甲基吡啶（3.95 g, 36.89 mmol, 5.0 eq），0 ℃下加入叔丁基二甲矽基三氟甲磺酸酯（4.29 g, 16.23 mmol, 3.73 mL, 2.2 eq），逐漸升至20 ℃反應1小時。將飽和氯化鈉溶液（50 mL）逐滴滴入反應體系，乙酸乙酯稀釋（100 mL），分液，水相乙酸乙酯洗（100 mL×3），合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓旋去溶劑，得到粗品。粗品經矽膠管柱層析（PE/EA =5:1- 2:1），得化合物001-21。MS (ESI) m/z: 413.0 [M+H] ⁺。

步驟17：化合物001-22的合成：

將001-21（1.4 g, 3.39 mmol, 1 eq）和 001-9（1.10 g, 3.39 mmol, 1.0 eq）溶解於乙腈（20 mL）中，一次加入二異丙基乙胺（1.32 g, 10.18 mmol, 1.77 mL, 3.0 eq），然後升溫至75 ℃攪拌16小時。將反應液冷卻到25 °C，並且在43 ℃減壓濃縮。將濃縮物溶解在水（30 mL）和乙酸乙酯（30 mL）中，萃取分層，同時水相用乙酸乙酯（20 mL，20 mL，20 mL）萃取三次。合併有機相，用飽和氯化鈉溶液（20 mL）洗滌一次，最後用無水硫酸鈉乾燥有機相，過濾並減壓濃縮，得到粗品。管柱層析：粗品經管柱層析（10%-70%乙酸乙酯在石油醚中）（TLC檢測石油醚：乙酸乙酯= 1:1）分離，得到化合物001-22。MS (ESI) m/z: 587.2 [M+H] ⁺。

步驟18：化合物001-24的合成：

將001-22（500 mg, 852.0 μmol, 1 eq），001-23（150 mg, 852.0 μmol, 1.0 eq）溶解於二甲基亞碸（5 mL），一次性加入碳酸鉀（141 mg, 846.42 μmol, 1.2 eq），混合物在25 ℃攪拌 3小時。將反應液溶解在20 mL水和 20 mL乙酸乙酯中，萃取分層，同時水相用乙酸乙酯（10 mL，10 mL，10 mL）萃取三次。合併有機相，用飽和氯化鈉溶液（15 mL）洗滌一次，最後用無水硫酸鈉乾燥有機相，過濾並減壓濃縮。得到化合物001-24的粗品，無需進一步純化，直接用於下一步反應。MS (ESI) m/z: 743.2， 744.2 [M+H] ⁺。

步驟19：化合物001-25的合成：

將001-24（240 mg, 381.49 μμmol, 1 eq）溶解於乙酸乙酯（8 mL），再加入飽和氯化銨水溶液（8 mL），一次性加入鐵粉（170.44 mg, 3.05 mmol, 8 eq），然後升溫至50 ℃攪拌3小時。將反應液冷卻到25 ℃，用矽藻土助濾，並減壓濃縮濾液。將反應液直接旋乾得到粗品。得到化合物 001-25的粗品，無需進一步純化，直接用於下一步反應。MS (ESI) m/z: 713.2，714.2 [M+H] ⁺。

步驟20：化合物001的合成：

將001-25（200 mg, 280.3 μmol, 1.0 eq）溶解於鹽酸/甲醇（4 M, 3.13 mL, 25 eq），混合物在25 ℃攪拌1 小時。將反應液直接旋乾得到粗品。將得到的粗品，用水（5 mL）溶解，濾出不溶物，用製備級高效液相色譜（HPLC）（色譜柱: Welch Xtimate C18 100*40mm*3μm;流動相:[水（0.075%三氟乙酸）-乙腈];乙腈%: 17%-47%,8min）分離純化。得到化合物001的三氟乙酸鹽。MS (ESI) m/z: 495.1 [M+H] ⁺。 ¹H NMR (400 MHz, CD ₃OD) δ ppm 8.41 (s, 1 H), 8.08 (d, J=6.02 Hz, 1 H), 7.48 - 7.36 (m, 2 H), 7.20 - 7.18 (m, 1 H), 7.08 (m, 1 H), 4.87 (s, 2 H), 4.55 (s, 1 H), 3.66 – 3.63 (m, 1 H), 3.57 – 3.54 (m, 1 H), 3.27 - 3.14 (m, 4 H), 2.10 - 2.08 (m, 1 H), 2.05 – 1.99 (m, 1 H), 1.99 – 1.84 (m, 1 H), 1.75 – 1.72 (m, 1 H)。

實施例2：

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步驟1：化合物002-2的合成：

將化合物002-1（1.5 g, 3.68 mmol, 1 eq）溶於二氯甲烷（10 mL）中，加入三氟乙酸（5 mL）。反應混合物在25 ℃下反應2小時後加入碳酸鉀中和反應體系至中性，旋乾溶劑得化合物002-2。MS（ESI）m/z: 308.1 [M+H] ⁺。

步驟2：化合物002-3的合成：

將002-2（1.1 g, 3.58 mmol, 1 eq）和001-21（1.48 g, 3.58 mmol, 1.0 eq）溶解於乙腈（20 mL）中，一次加入二異丙基乙胺（1.39 g, 10.73 mmol, 3.0 eq），然後升溫至75 ℃攪拌16小時。將反應液冷卻到25 ℃，並且在43 ℃減壓濃縮。將濃縮物溶解在水（30 mL）和乙酸乙酯（30 mL）中，萃取分層，同時水相用乙酸乙酯（20 mL，20 mL，20 mL）萃取三次。合併有機相，用飽和氯化鈉溶液（20 mL）洗滌一次，最後用無水硫酸鈉乾燥有機相，過濾並減壓濃縮，得到化合物002-3。MS (ESI) m/z: 570.2，571.2 [M+H] ⁺。

步驟3：化合物002-4的合成：

將002-3（700 mg, 1.23 mmol, 1 eq），001-23（217 mg, 1.23 mmol, 1.0 eq）溶解於二甲基亞碸（5 mL），一次性加入碳酸鉀（339 mg, 2.46 μmol, 2 eq），混合物在25 ℃攪拌 3小時。將反應液溶解在水（20 mL）和乙酸乙酯（20 mL）中，萃取分層，同時水相用乙酸乙酯（10 mL，10 mL，10 mL）萃取三次。合併有機相，用飽和氯化鈉溶液（15 mL）洗滌一次，最後用無水硫酸鈉乾燥有機相，過濾並減壓濃縮，得到粗品。得到的粗品，無需進一步純化，直接用於下一步反應。化合物002-4。MS (ESI) m/z: 726.2，727.2 [M+H]+。

步驟4：化合物002-5的合成：

將002-4（500 mg, 688 μmol, 1 eq）溶解於乙酸乙酯（8 mL），再加入飽和氯化銨水溶液（8 mL），一次性加入鐵粉（114.4 mg, 2.04 mmol, 3 eq），然後升溫至50 ℃攪拌3小時。將反應液冷卻到25 ℃，用矽藻土助濾，並減壓濃縮濾液。將反應液直接旋乾得到粗品。得到的粗品，無需進一步純化，直接用於下一步反應。化合物002-5。MS (ESI) m/z: 696.2，697.2 [M+H] ⁺。

步驟5：化合物002的合成：

將002-5（350 mg, 502.6 μmol, 1.0 eq）溶解於鹽酸/甲醇（4 M, 3.13 mL, 25 eq），混合物在25 ℃攪拌1 小時。將反應液直接旋乾得到粗品。粗品透過製備級高效液相色譜分離（色譜柱: Welch Xtimate C18 100*40mm*3μm;流動相:[水（0.075%三氟乙酸）-乙腈];乙腈%: 2%-32%,8min）分離純化。得到化合物002的三氟乙酸鹽。MS (ESI) m/z: 478.2，479.0 [M+H] ⁺。 ¹H NMR (400 MHz, CD ₃OD) δ ppm 8.62 (d, J=4.4 Hz, 1 H), 8.46 (s, 1 H), 8.11 – 8.06 (m, 2 H), 7.52 - 7.49 (m, 1 H), 7.28 (d, J=6.4 Hz, 1 H), 4.89 – 4.85 (s, 2 H), 4.65 (s, 1 H), 3.73 – 3.65 (m, 1 H), 3.63 – 3.55 (m, 1 H), 3.31 - 3.20 (m, 4 H), 2.20 - 2.00 (m, 2 H), 1.90 – 1.84 (m, 1 H), 1.75 – 1.72 (m, 1 H)。

實施例3：

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步驟1：化合物003-2的合成：

將化合物003-1（1.1 g, 2.45 mmol, 1 eq）溶於二氯甲烷（10 mL）中，加入三氟乙酸（5 mL）。反應混合物在25 ℃下反應2小時後加入碳酸鉀中和反應體系至中性，旋乾溶劑得化合物003-2。MS（ESI）m/z: 327.1 [M+H] ⁺。

步驟2：化合物003-3的合成：

將003-2（520 mg, 1.33 mmol, 1.2 eq）和001-21（548 mg, 1.33 mmol, 1.0 eq）溶解於到乙腈（20 mL）中，一次加入二異丙基乙胺（0.97 g, 7.2 mmol, 3.0 eq），然後升溫至75 ℃攪拌16小時。將反應液冷卻到25 ℃，並且在43 ℃減壓濃縮。將濃縮物溶解在水（30 mL）和乙酸乙酯（30 mL）中，萃取分層，同時水相用乙酸乙酯（20 mL，20 mL，20 mL）萃取三次。合併有機相，用飽和氯化鈉溶液（20 mL）洗滌一次，最後用無水硫酸鈉乾燥有機相，過濾並減壓濃縮，得到化合物003-3。MS (ESI) m/z: 589.2 [M+H] ⁺。

步驟3：化合物003-4的合成：

將003-3（300 mg, 645.3 μmol, 1 eq）和001-23（217 mg, 1.23 μmol, 1.0 eq）溶解於二甲基亞碸（5 mL），一次性加入碳酸鉀（133.8 mg, 968.1 μmol, 2 eq），混合物在25 ℃攪拌3小時。將反應液溶解在水（20 mL）和乙酸乙酯（20 mL）中，萃取分層，同時水相用乙酸乙酯（10 mL，10 mL，10 mL）萃取三次。合併有機相，用飽和氯化鈉溶液（15 mL）洗滌一次，最後用無水硫酸鈉乾燥有機相，過濾並減壓濃縮，得到的粗品，無需進一步純化，直接用於下一步反應。化合物003-4。MS (ESI) m/z: 745.2 [M+H] ⁺。

步驟4：化合物003-5的合成：

將003-4（470 mg, 630.6 μmol, 1 eq）溶解於乙酸乙酯（8 mL），再加入飽和氯化銨水溶液（8 mL），一次性加入鐵粉（281.7 mg, 5.04 mmol, 8 eq），然後升溫至50 ℃攪拌3 小時。將反應液冷卻到25 ℃，用矽藻土助濾，並減壓濃縮濾液。將反應液直接旋乾得到粗品。得到的粗品，無需進一步純化，直接用於下一步反應。化合物 003-5。MS (ESI) m/z: 715.2 [M+H] ⁺。

步驟5：化合物003的合成：

將003-5（448 mg, 626.26 μmol, 1.0 eq）溶解於鹽酸/甲醇（4 M, 1.0 mL, 25 eq），混合物在25 ℃攪拌1 小時。將反應液直接旋乾得到粗品。粗品透過製備級高效液相色譜分離（色譜柱: Welch Xtimate C18 100*40mm*3um;流動相:[水（0.075%三氟乙酸）-乙腈];乙腈%: 16%-46%,8min）分離純化。得到化合物003的三氟乙酸鹽。MS (ESI) m/z: 497.0 [M+H] ⁺。 ¹H NMR (400 MHz, CD ₃OD) δ ppm 8.43 (s, 1 H), 8.08 (d, J=6.02 Hz, 1 H), 7.56 (dd, J=8.16, 5.65 Hz, 1 H), 7.12 (d, J= 5.77 Hz, 1 H), 6.83 (m, 2 H), 4.87 (s, 2 H), 3.80 – 3.75 (m, 1 H), 3.64 - 3.36 (m, 3 H), 2.42 - 2.32 (m, 1 H), 2.18 – 1.97 (m, 4 H)。

實施例4：

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步驟1：化合物004-3的合成：

將化合物004-1（7.13 g, 33.93 mmol,1 eq）溶於四氫呋喃（160 mL）中，待溫度降低至-78 ℃下加入雙異丙基氨基鋰的四氫呋喃溶液（2 M, 22.06 mL, 1.3 eq），反應體系在-78 ℃下反應1小時，加入004-2（10 g, 37.32 mmol, 1.1 eq），體系在-78 ℃下再反應1小時，而後在攪拌下緩慢升溫至25 ℃。反應結束後用飽和氯化銨溶液（25 mL）淬滅，乙酸乙酯萃取三次（150 mL×3），合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋蒸去除溶劑，得到粗品。管柱層析：粗品經管柱層析（石油醚：乙酸乙酯= 0-10%）分離得到化合物004-3。MS（ESI）m/z: 296.8&298.8 [M-100+H] ⁺。

步驟2：化合物004-4的合成：

在氮氣的保護下，將化合物004-3（12.00 g, 30.21 mmol, 1 eq）溶於N-N二甲基乙醯銨（100 mL）和水（10 mL）的混合溶液中，加入二氯雙［二叔丁基-（4-二甲基氨基苯基）膦］鈀（2.14 g, 3.02 mmol, 2.14 mL, 0.1 eq）和三乙胺（12.23 g, 120.82 mmol, 16.82 mL, 4 eq），體系抽換氮氣三次，升溫至130 ℃反應5小時。將反應液冷卻至室溫，加入水150 ml，用乙酸乙酯萃取（200 mL×3），合併有機相，減壓濃縮至濃縮液體積為150 ml左右，水洗4次，飽和食鹽水洗滌2次，無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮得粗品。粗品經管柱層析（30%~35%乙酸乙酯在石油醚中）分離得到化合物004-4，MS（ESI）m/z: 263.9[M-56+H] ⁺。

步驟3：化合物004-5的合成：

將化合物004-4（8.83 g, 27.65 mmol, 1 eq）溶於鈦酸四乙酯（85 ml）中，加入化合物001-6（10.05 g, 82.94 mmol, 3 eq），體系抽換氮氣三次，而後升溫至130 ℃反應3小時。反應結束後，將反應液冷卻至室溫，將反應液加入至冰水中，攪拌40分鐘，將上清液加入分液漏斗中，再加入乙酸乙酯萃取（200 mL×3），合併有機相，用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮得粗品。粗品經管柱層析（25%~35%乙酸乙酯在石油醚中）分離得到化合物004-5。MS（ESI）m/z: 322.9 [M-100+H] ⁺。

步驟4：化合物004-6的合成：

將化合物004-5（7.34 g, 17.37 mmol, 1 eq）溶於四氫呋喃中（70 mL），降溫至0 ℃攪拌下加入硼氫化鈉（1.31 g, 34.74 mmol, 2 eq），反應體系逐漸恢復至25 ℃下反應16小時。向反應液中加入水淬滅（150 ml）未反應完的硼氫化鈉，乙酸乙酯萃取（200 mL×3），合併有機相用無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮得粗產物。粗產物經SFC純化得到化合物004-6。MS (ESI) m/z: 325.0 [M-100+H] ⁺。

步驟5：化合物004-7的合成：

將004-6（1.10 g, 2.59 mmol, 1 eq）溶於二氯甲烷（10 mL）中，加入三氟乙酸（3.84 g, 33.68 mmol, 2.49 mL, 13 eq），混合液在25 ℃下反應50分鐘。反應結束後，減壓濃縮除掉部分三氟乙酸，再向濃縮液中加入水（30 ml），加入碳酸鉀（3 g）除掉多餘三氟乙酸，乙酸乙酯萃取（50 mL×3），有機相合併後用無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋蒸除去溶劑得到化合物004-7。MS(ESI) m/z: 325.1 [M+H] ⁺。

步驟6：化合物004-8的合成：

將004-7（783.67 mg, 1.90 mmol, 1 eq）和001-21（740.00 mg, 2.28 mmol, 1.2 eq）溶解於乙腈（12 mL）中，一次加入二異丙基乙胺（736.69 mg, 5.70 mmol, 992.84 uL, 3 eq），體系抽換氮氣三次，然後升溫至75 ℃攪拌16小時。將反應液冷卻到室溫，減壓濃縮。將濃縮物溶解在水（50 mL）和乙酸乙酯（50 mL）中，乙酸乙酯（50 mL×3）萃取三次。合併有機相，用飽和氯化鈉溶液（50 mL）洗滌一次，最後用無水硫酸鈉乾燥有機相，過濾並減壓濃縮，得到化合物004-8的粗品。MS (ESI) m/z: 587.3 [M+H] ⁺。

步驟7：化合物004-9的合成：

將004-8（970 mg, 1.65 mmol, 1 eq）和001-23（291.80 mg, 1.65 mmol, 1 eq）溶於二甲亞碸（2 ml），加入碳酸鉀（456.89 mg, 3.31 mmol, 2 eq），混合物在25 ℃下反應1.5小時。反應結束後，向反應液中加入50 ml的水，乙酸乙酯（50 mL×3）萃取三次，合併有機相，有機相用飽和食鹽水洗滌3次，無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮得粗產物004-9。MS (ESI) m/z: 743.2 [M+H] ⁺。

步驟8：化合物004-10的合成：

將004-9（1.20 g, 1.62 mmol, 1 eq）溶解於乙酸乙酯（8 mL），再加入飽和氯化銨水溶液（8 mL），一次性加入鐵粉（723.12 mg, 12.95 mmol, 8 eq），然後升溫至50 ℃攪拌3小時。將反應液冷卻到25 ℃，用矽藻土助濾，並減壓濃縮濾液。將反應液直接旋乾得到粗品。得到的粗品，無需進一步純化，直接用於下一步反應。化合物 004-10。MS (ESI) m/z: 713.2 [M+H] ⁺。

步驟9：化合物004的合成：

將004-10（1.06 g, 1.48 mmol, 1 eq）溶解於鹽酸/甲醇（4 M, 1.0 mL, 25 eq），混合物在25℃攪拌1小時。將反應液直接旋乾得到粗品。

粗品透過製備級高效液相色譜分離（色譜柱: Phenomenex Genimi NX C18 150*40mm*5μm;流動相:[水（0.225%三氟乙酸）-乙腈];乙腈%: 1%-30%,10 min）分離純化。得到化合物004的三氟乙酸鹽。MS (ESI) m/z: 495.1 [M+H] ⁺。 ¹H NMR (400 MHz, CD ₃OD) δ ppm 8.41 (s, 1 H), 8.08 (d, J=6.02 Hz, 1 H), 7.48 - 7.36 (m, 2 H), 7.20 - 7.18 (m, 1 H), 7.08 (m, 1 H), 4.87 (s, 2 H), 4.55 (s, 1 H), 3.66 – 3.63 (m, 1 H), 3.57 – 3.54 (m, 1 H), 3.27 - 3.14 (m, 4 H), 2.10 - 2.08 (m, 1 H), 2.05 – 1.99 (m, 1 H), 1.99 – 1.84 (m, 1 H), 1.75 – 1.72 (m, 1 H)。

粗品透過製備級高效液相色譜分離（色譜柱: Welch Xtimate C18 150*25mm*5μm;流動相:[水（0.225%甲酸）-乙腈];乙腈%: 1%-30%,10 min）分離純化。得到化合物004的甲酸鹽。MS (ESI) m/z: 495.1 [M+H] ⁺。 ¹H NMR (400 MHz, CD ₃OD) δ ppm 8.41 (s, 1 H), 8.08 (d, J=6.02 Hz, 1 H), 7.40 - 7.30 (m, 1 H), 7.27 - 7.18 (m, 1 H), 7.08 (m, 1 H), 6.94 (d, J=6.02 Hz, 1 H), 4.87 (s, 2 H), 4.31 (s, 1 H), 3.62 - 3.45 (m, 2 H), 3.27 - 3.14 (m, 3 H), 3.05 - 2.92 (m, 1 H), 2.15 - 1.99 (m, 2 H), 1.81 - 1.65 (m, 2 H)。

生物測試

實驗例 1 ：體外測試

實驗材料：

反應緩衝液：60 mM 羥乙基呱嗪乙硫磺酸（HEPES）（pH 7.4），1 mM乙二胺四乙酸（EDTA），75 mM KCl，75 mM NaCl，0.01%Brij-35,5 mM 二硫蘇糖醇（DTT）和10%DMSO（最終）。

酶：PTPN11 / SHP2-FL（FL表示全長的酶）（RBC生產，沒有CAS號）。

重組人類全長PTPN11（Genbank登錄號＃NM_002834; aa 2-597）。

同種型1（規範）在大腸桿菌中表達，具有N-端StrepII-TEV，C-端組胺酸的標籤。 Mw = 71.93 kDa。

活化肽： H ₂N-LN(pY)IDLDLV(dPEG8)LST(pY)ASINFQK-amide（基於出版物）。

基質：DiFMUP [6,8-二氟-7-羥基-4-甲基香豆素]。

測定中的最終濃度：0.35 μM活化肽；100 μM DiFMUP。

步驟：

1.在新製備的反應緩衝液中製備指定的酶/肽和基質。

2.將酶/肽溶液加入到反應孔中。

3.透過聲學技術將化合物在100％DMSO中提供到酶溶液中（Echo550；納升範圍），在室溫下培養30分鐘。

4.將基質溶液加入到反應孔中以引發反應。

5.監測酶活性（Ex/Em 355/460），作為室溫下螢光基質螢光信號增加60分鐘的時程測量。

資料分析：取時間過程測量的線性部分的斜率×（信號/分鐘），並計算相對於DMSO對照組的％酶活性。減去酶基礎活性（無肽）的背景斜率。本發明化合物體外篩選試驗結果如表1。

表1.本發明化合物體外篩選試驗結果

化合物	PTPN11/SHP2-FL (IC 50nM)
化合物001的三氟乙酸鹽	1.61
化合物002的三氟乙酸鹽	23.4
化合物003的三氟乙酸鹽	4.22
化合物004的三氟乙酸鹽	2.60

結論：本發明化合物對PTPN11/SHP2-FL的抑制活性良好。

實驗例2：化合物H358細胞活性測試

實驗目的：

本實驗旨在驗證本發明化合物對KRAS G12C突變的NCI-H358人類非小細胞肺癌細胞增殖抑制效果。

實驗材料：

細胞株NCI-H358（購自普諾賽），RPMI1640培養基、盤尼西林/鏈黴素抗生素購自維森特，胎牛血清購自Biosera，CellTiter-Glo（細胞活率化學發光檢測試劑）試劑購自Promega。

實驗方法：

將NCI-H358細胞種於白色96孔板中，每孔添加80 μL細胞懸液，其中包含4000個NCI-H358細胞。細胞板置於二氧化碳培養箱中過夜培養。將待測化合物用排槍5倍稀釋，連續稀釋至第9個濃度，即從2000 μM稀釋至5.12 nM，設置雙複孔實驗。向中間板中加入78 μL培養基，再按照對應位置，轉移2 μL每孔的梯度稀釋化合物至中間板，混勻後轉移20 μL每孔到細胞板中。轉移到細胞板中的化合物濃度範圍是10 μM至0.026 nM。細胞板置於二氧化碳培養箱中培養5天。另準備一塊細胞板，在加藥當天讀取信號值作為最大值（下面方程式中Max值）參與資料分析。向此細胞板每孔加入25 μL與數細胞活率化學發光檢測試劑，室溫培養10分鐘使發光信號穩定，採用多標記分析儀讀數。

資料分析：

利用方程式(Sample-Min)/(Max-Min)*100%將原始資料換算成抑制率，IC ₅₀的值即可透過四參數進行曲線擬合得出（GraphPad Prism中"log(inhibitor) vs. response -- Variable slope" 模式得出）。

本發明化合物H358細胞活性篩選試驗結果如表2所示。

表2. 本發明化合物體外篩選試驗結果

化合物編號	H358 (IC 50nM)
化合物001的三氟乙酸鹽	46.5
化合物003的三氟乙酸鹽	136.0
化合物004的甲酸鹽	16.0

結論：本發明化合物對H358細胞的抑制活性良好。

實驗例3：化合物藥代動力學測試

實驗目的：測試化合物在CD-1小鼠體內藥代動力學。

實驗材料：CD-1小鼠（雄性, 32-33g）。

實驗操作：

以標準方案測試化合物靜脈注射及口服給藥後的齧齒類動物藥代特徵，實驗中候選化合物配成澄清溶液，單次靜脈注射及口服給予小鼠。靜注及口服溶媒為一定比例的羥丙基β環糊精水溶液或生理鹽水溶液。收集24小時內的全血樣品，3000 g離心15分鐘，分離上清液得血漿樣品，加入4倍體積含內標的乙腈溶液沉澱蛋白，離心取上清液加入等倍體積的水混勻後再離心取上清液進樣，以LC-MS/MS 分析方法定量分析血藥濃度，並計算藥代參數，如達峰濃度，達峰時間，清除率，半衰期，藥時曲線下面積，生物利用度等。

本發明化合物藥代動力學測試結果如表3所示。

表3. 化合物藥代動力學測試結果

供試品	清除率 (mL/min/kg) （IV @ 2 mpk）	半衰期 T 1/2(h) （PO @ 10 mpk）	C max(nM)	T max(h)	藥時曲線下面積 AUC (nM.hr) （PO @ 10 mpk）	生物利用度 F (%)
化合物001的三氟乙酸鹽	5.99	6.4	2610	3.5	31757	61.9
化合物004的三氟乙酸鹽	13.40	5.7	1421	3.5	16963	68.3

結論：本發明化合物可以顯著提高小鼠藥代動力學單項或部分指標。

實驗例4：hERG 鉀離子通道的抑制試驗

1. 實驗目的：

用全自動膜片鉗的方法檢測待測實施例1對hERG鉀離子通道的影響。

2. 實驗方法

2.1. 細胞培養

實驗所用的穩定表達hERG 鉀離子通道的細胞來自於Aviva Biosciences 的CHO-hERE，CHO-hERG 培養於5% CO ₂，37℃的環境下。CHO hERG 培養液見表4。

表4 . CHO hERG 培養液

試劑	供應商	貨號	體積 (mL)
F12 Hams	Invitrogen	31765-092	500
FBS	Invitrogen	10099-141	50
G418/Geneticin	Invitrogen	10131-027	1
Hygromycin B	Invitrogen	10687-010	1

2.2. 細胞的前期準備

準備用於實驗的CHO-hERG細胞至少培養兩天以上，且細胞密度達到75%以上。實驗開始之前，用TrypLE懸浮細胞，然後用細胞外液重懸收集細胞。

2.3. 細胞內外液的配製

細胞外液需每個月配製一次。細胞內液須分裝凍存在-20℃。細胞內外液成分見表5。

表5. 細胞內外液成分

組成成分	細胞外液 (mM)	細胞內液 (mM)
NaCl	145	-
KCl	4	120
KOH	-	31.25
CaCl2	2	5.374
MgCl2	1	1.75
Glucose	10	-
Na2ATP	-	4
HEPES	10	10
EGTA	-	10
pH	7.4 with NaOH	7.2 with KOH
滲透壓	295 mOsm	285 mOsm

2.4. 化合物的配製

將待測化合物和陽性對照Amitriptyline用 DMSO 溶解成一定濃度的儲備液，然後按照不同的梯度稀釋，最後按一定的比例加入細胞外液中，稀釋成待測濃度。在實驗開始前用肉眼檢查看有無沉澱。最後，待測溶液和陽性對照Amitriptyline中，DMSO的濃度最高不能超過0.3%。

2.5. 電壓刺激方案

保持鉗制電位在-80 mv，首先是給予-50 mv的電壓刺激，持續80 ms以記錄細胞漏電流值，隨後去極化至+20 mv，維持4800 ms，打開hERG的通道，然後複極化至-50 mv 維持5000 ms，引出hERG 尾電流並記錄，最後，電壓恢復至鉗制電位-80 mv，維持3100 ms。以上電壓刺激，每15000 ms重複一次。

2.6. QPatchHTX全細胞膜片鉗記錄

hERG QPatchHTX 實驗是在室溫下進行的。在QPatch Assay Software 5.2（Sophion Bioscience）的軟體上建立全細胞方案，電壓刺激方案和化合物檢測方案。

首先進行30次重複設定電壓刺激，該區段為後續分析的基線區域，隨後加入5 µL細胞外液，重複三次。依次加入各個化合物的作用濃度，仍舊以5 µL加入體積重複三次。每一測試濃度培養細胞至少不低於5 mins。整個記錄過程中，各項指標需達到資料分析接收標準，若未達到該標準，則該細胞不計入分析範圍，化合物將重新進行測試，以上記錄過程均由Qpatch分析軟體自動化操作。每一化合物測試濃度依次為0.24 µM、1.20 µM、6.00 µM、30.00 µM，每一濃度至少重複兩組細胞。

2.7. 資料分析

在每一個完整電流記錄中，基於峰值電流在陰性對照中所占的百分比，可以計算出每一化合物作用濃度的抑制百分比。利用標準希式方程式擬合得到量效關係曲線，具體方程式如下：

I _(C)= I _b+(I _fr-I _b)*c ⁿ/(IC ₅₀ ⁿ+c ⁿ)

其中，C為化合物測試濃度，n為斜率。

曲線擬合和抑制率計算均由Qpatch分析軟體分析完成，若最低濃度下抑制率超過半數抑制或最高濃度下抑制率未達到半數抑制，則該化合物相應的IC ₅₀低於最低濃度或IC ₅₀值大於最高濃度。

2.8. 測試結果

實施例化合物 hERG IC ₅₀值結果見表6。

表6. 實施例化合物 hERG IC ₅₀值結果

供試樣品	hERG IC 50（nM）
化合物001的三氟乙酸鹽	18.3
化合物003的三氟乙酸鹽	6.4
化合物004的甲酸鹽	9.8

結論：本發明化合物對hERG抑制不明顯。

實驗例5：體外微粒體穩定性實驗

1. 實驗材料

人和動物微粒體購買於Corning 或 Xenotech，儲存於-80℃ 冰箱。

還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），供應商：Chem-impex international，貨號：00616。

對照化合物：睾酮，雙氯芬酸，普羅帕酮。

2．實驗步驟

2.1 工作液的配製

儲備液：10 mM的DMSO溶液。

工作濃度配製：100%乙腈稀釋到100 μM（有機相含量：99%ACN，1%DMSO）。

2.2  實驗步驟

準備2塊96孔培養板，分別命名為T60培養板和NCF60培養板。

在T60培養板和NCF60培養板上分別加入445 μL微粒體工作液（肝微粒體蛋白濃度為0.56 mg/mL），然後將上述培養板放置於37 ℃水浴鍋中預培養大約10分鐘。

預培養結束後，在T60培養板和NCF60培養板上分別加入5 μL供試品或對照化合物工作液，混勻。在NCF60培養板上每孔添加50 μL磷酸鉀鹽緩衝液啟動反應；在T0終止板中加入180 μL的終止液（含200 ng/mL tolbutamide和200 ng/mL labetalol的乙腈溶液）和6 μL的NADPH再生體系工作液，從T60培養板中取出54 μL樣品至T0終止板（T0樣品產生）。在T60培養板上每孔添加44 μL NADPH再生體系工作液啟動反應。在Blank板中只添加54 μL微粒體工作液、6 μL的NADPH再生體系工作液和180 μL的終止液。因此，在供試品或對照化合物的樣品中，化合物、睾酮、雙氯芬酸和普羅帕酮的反應終濃度為1 μM，肝微粒體的終濃度為0.5 mg/mL，DMSO和乙腈在反應體系中的終濃度分別為0.01%（v/v）和0.99%（v/v）。

培養適當時間（如5、15、30、45和60分鐘）後，分別在每個終止板的樣品孔中加入180 μL的終止液（含200 ng/mL tolbutamide和200 ng/mL labetalol的乙腈溶液），之後從T60培養板中取出60 μL樣品以終止反應。

所有樣品板搖勻並在3220×g離心20分鐘，然後每孔取80 μL上清液稀釋到240 μL純水中用於液相色譜串聯質譜分析。

本發明化合物 MMS 結果如表7所示。

表7. 本發明化合物 MMS 結果

供試樣品	MMS（mL/min/kg）, H（人）, M（小鼠）
化合物001的三氟乙酸鹽	11.9,57.5
化合物004的甲酸鹽	11.9, 64.1

結論：本發明化合物具有較好的肝微粒體穩定性。

Claims (13)

1. 一種式（Ⅰ）所示的化合物或其藥學上可接受的鹽，

   

   其中，T ₁為CR ₄或N； 當E ₁為O時，R ₃為H、F、Cl、Br、I或C _1-3烷基，所述C _1-3烷基任選被1、2或3個R _a取代； 當E ₁為CH ₂時，R ₃為H、Cl、Br、I或C _1-3烷基，所述C _1-3烷基任選被1、2或3個R _a取代； R ₁、R ₂和R ₄分別獨立地為H、F、Cl、Br、I或C _1-3烷基，所述C _1-3烷基任選被1、2或3個R _b取代； R ₅為被OH取代的C _1-3烷基； R ₆分別獨立地為H、F、Cl、Br、I、OH、NH ₂或C _1-3烷基，所述C _1-3烷基任選被1、2或3個R _c取代；以及 R _a、R _b和R _c分別獨立地為F、Cl、Br、I、OH或NH ₂； m為1、2、3或4。
2. 如請求項1所述的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，當E ₁為O時，R ₃為H或F。
3. 如請求項1所述的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，當E ₁為CH ₂時，R ₃為H。
4. 如請求項1所述的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，R ₁、R ₂和R ₄分別獨立地為H、F、Cl、Br或I。
5. 如請求項1所述的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，R ₅为-CH ₂-OH。
6. 如請求項1所述的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，R ₆分別獨立地為Cl或NH ₂。
7. 如請求項1所述的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，結構單元

   

   為

   

   、

   

   、

   

   或

   

   。
8. 如請求項1所述的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，該化合物為

   

   ， 其中，T ₁、E ₁、R ₁、R ₂、R ₃、R ₅、R ₆和m如請求項1-7所定義。
9. 如請求項8所述的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，該化合物為

   

   ， 其中，T ₁、E ₁、R ₁、R ₂和R ₃如請求項8所定義。
10. 一種選自下列所示的化合物或其藥學上可接受的鹽，

    

    、

    

    、

    

    或

    

    。
11. 如請求項10所述的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，該化合物選自：

    

    、

    

    、

    

    或

    

    。
12. 一種藥物組合物，其包含如請求項1至11中任一項所述的化合物或其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的載體。
13. 一種如請求項1至11中任一項所述的化合物或其藥學上可接受的鹽或如請求項12所述的藥物組合物在製備治療與SHP2相關疾病的藥物中的用途，其中所述與SHP2相關疾病是指肺癌，較佳為非小細胞肺癌。