TW202241489A

TW202241489A - 細胞激素-17b受體（il-17rb）之拮抗劑及其用途

Info

Publication number: TW202241489A
Application number: TW110146784A
Authority: TW
Inventors: 李文華; 吳恒祥; 胡春美; 黃俊凱
Original assignee: 中央研究院
Priority date: 2020-12-14
Filing date: 2021-12-14
Publication date: 2022-11-01
Also published as: WO2022132705A1; US20240124528A1; EP4259181A1

Abstract

本發明涉及一種細胞激素-17B受體（IL-17RB）的拮抗劑，其特徵在於中斷IL-17RB與MLK4的相互作用。本發明還涉及一種該等拮抗劑用於治療與IL-17RB活化相關的疾病或病症之用途。並進一步公開磷酸化的IL-17RB作為用於預測預後及/或監測癌症進展的生物標記。

Description

細胞激素-17B受體（IL-17RB）之拮抗劑及其用途

相關申請。本申請主張根據美國專利法第119條（35 U.S.C. §119）規定於2020年12月14日申請之美國臨時申請號63/125,148的權益，其全部內容透過引用併入本文。

本發明涉及一種細胞激素-17B受體（IL-17RB）的拮抗劑，其特徵在於中斷IL-17RB與MLK4的相互作用。本發明還涉及一種該拮抗劑用於治療與IL-17RB活化相關的疾病或病症之用途。並進一步公開一種磷酸化的IL-17RB，可作為預測癌症預後及/或監測癌症進展的生物標記。

細胞激素17（IL-17）家族由至少六個具有20-50%序列同源性的配體（A至F）以及五個同源受體（RA至RE）所組成（ 1）。IL-17A、-C、-E，以及-F主要在自體免疫性、過敏性，以及慢性發炎性疾病中具有調節發炎的作用，而IL-17B與IL-17D在促進發炎功能中的作用尚不明確。IL-17受體（IL-17R）為具有保守結構特徵的單程跨膜蛋白（ 2）。特定而言，它們包含兩個細胞外類纖網蛋白II結構域以及一個細胞質內SEFIR結構域，後者在觸發下游訊息傳導中具有一定的作用（ 3）。IL-17RA透過與IL-17RC的異二聚化對IL-17A與IL-17F調節訊息傳導，與IL-17RB的異二聚化對IL-17E調節訊息傳導、與IL-17RE的異二聚化對IL-17C調節訊息傳導（ 4），以及與IL-17RD的異二聚化對IL-17A調節訊息傳導（ 5）。然而，IL-17B是否與IL-17RB同源二聚體或異源二聚體結合（ 6、 7）則仍不清楚。

儘管IL-17受體家族的相似度，但每種受體都有其獨特的結構特徵。透過詳細的遺傳分析，IL-17RA在SEFIR結構域之外包含大約100個額外的殘基，稱為SEFEX結構域，這也是訊息傳導所必需的（ 8、 9）。基於隨後的X射線晶體學研究，兩個結構域形成一個單一的複合結構模體（ 10）。此外，IL-17RA的細胞質尾部包含一個獨特的結構域，稱為C/EBP-b活化結構域（C/EBP-b activation domain，CBAD），其與TNF受體相關因子3（TNF receptor-associated factor 3，TRAF3）以及泛素編輯酶A20結合（ 11-13）。然而，有異於IL-17RA，IL-17RB的SEFIR區域表現出非常不同的3D拓撲（ 10 、 14），其C端缺乏CBAD結構域，表示IL-17RB可能以不同的方式運行。

已知癌細胞利用負責細胞增殖、分裂、分化以及遷移的各種訊息傳導通路來獲得生長優勢。促進發炎的細胞激素透過調節發炎性腫瘤微環境參與腫瘤進展（ 15）。然而，很少發現透過促進發炎細胞激素途徑驅動癌細胞進展。有趣的是，IL-17RB在胰臟癌（ 7）、乳腺癌（ 6 、 16 、 17）以及其他腫瘤中的過度表現與其惡性腫瘤相關。消耗IL-17RB或以針對IL-17RB的中和抗體治療可消除腫瘤的生長及轉移（ 7），顯示這種促進發炎的受體在這些癌症中的重要性。IL-17RB的這種潛在致癌功能類似於公認的受體酪胺酸激酶（receptor tyrosine kinases，RTKs），後者在許多癌症的致癌過程中具有關鍵作用。所有的RTKs都具有相似的蛋白質結構，包括一胞外配體結合結構域、一單個跨膜螺旋，以及包含一酪胺酸激酶結構域（tyrosine kinase domain，TKD）與一羧基（C）端尾部的細胞質區域（ 18）。RTKs通常透過與RTK的胞外區域結合而被受體特異性配體活化，且該受體透過配體誘導的受體二聚化及/或寡聚化來活化（ 18）。對於大多數的RTKs，這種構形變化使得TKD呈現出RTK自磷酸化的活性構形，並參與傳播關鍵細胞訊息傳遞途徑的下游調節子。然而，IL-17RB缺乏明確的激酶結構域且並非為一種RTK。IL-17RB如何對其配體作出反應並將訊息傳遞給下游調節子以發揮其致癌功能仍然是個謎。

於本發明中，意外地發現IL-17RB在與IL-17B結合時形成同源二聚體，並募集雙重激酶MLK4使其在第447個胺基酸位置上的酪胺酸處磷酸化。接著，酪胺酸磷酸化的IL-17RB會招募泛素連接酶TRIM56，在第470個胺基酸位置上的離胺酸上添加K63連接的泛素鏈。在IL-17RB中引入的Y447F或K470R突變無法傳遞致癌訊息。透過以一含有IL-17RB的第403-416個胺基酸序列的特定胜肽阻斷混合譜系激酶4（mixed-lineage kinase 4，MLK4，也稱為KIAA1804與MAP3K21）與IL-17RB的結合，導致Y447磷酸化以及K470泛素化的喪失，進而減少腫瘤發生及轉移並延長罹患胰臟腫瘤的小鼠的壽命，進一步證明了這種訊息傳導機制在癌症中的重要性。還發現MLK4調節的IL-17B/IL-17RB致癌訊息傳導與IL-17E/IL-17RB調節的免疫原性訊息傳導各自獨立且不同，因此抑制MLK4調節的IL-17B/IL-17RB致癌訊息傳導在臨床上有益於治療相關的增殖性疾病，而沒有由阻斷IL-17E誘導的IL-17RB免疫原性訊息傳導所引起的副作用。

因此，於一方面，本發明提供一種用於抑制IL-17B/IL-17RB活化及/或治療與IL-17B/IL-17RB活化相關的疾病或病症（例如，增殖性病症，如癌症或其轉移）之方法，透過對有需要的個體施用有效量之IL-17RB拮抗劑，該拮抗劑靶向IL-17RB與MLK4之間的相互作用，及/或Y447磷酸化，及/或IL-17RB的K470泛素化。於某些情況下，IL-17RB拮抗劑為抑制MLK4與IL-17RB結合的胜肽或小分子。特定而言，IL-17RB拮抗劑不涉及IL-17E/IL-17RB訊息傳導，因此不會抑制個體體內的IL-17E/IL-17RB調節的第2型免疫。

於某些具體實施例中，該IL-17RB拮抗劑為一種包含第一區段的IL-17RB抑制胜肽，該第一區段包含胺基酸序列X ₁CDX ₂X ₃CX ₄X ₅X ₆EGX ₇X ₈X ₉（SEQ ID NO: 10），其中X ₁為纈胺酸（V）、異白胺酸（I）、白胺酸（L）、丙胺酸（A）、甲硫胺酸（M），X ₂為甘胺酸（G）或絲胺酸（S），X ₃為蘇胺酸（T）或丙胺酸（A），X ₄為甘胺酸（G）、絲胺酸（S）或天門冬胺酸（D），X ₅為離胺酸（K）、組胺酸（H）或天門冬醯胺（N），X ₆為絲胺酸（S）、離胺酸（K）或天門冬醯胺（N），X ₇為絲胺酸（S）或甘胺酸（G），X ₈為脯胺酸（P）或丙胺酸（A），X ₉為絲胺酸（S）、半胱胺酸（C）、蘇胺酸（T）、精胺酸（R）或組胺酸（H）。

於某些具體實施例中，該第一區段包含X ₁CDX ₂X ₃CGX ₅X ₆EGSX ₈X ₉（SEQ ID NO: 11）的模體，其中X ₁為纈胺酸（V）、異白胺酸（I）或白胺酸（L），X ₂為甘胺酸（G）或絲胺酸（S），X ₃為蘇胺酸（T）或丙胺酸（A），X ₅為離胺酸（K）或組胺酸（H），X ₆為絲胺酸（S）、離胺酸（K）或天門冬醯胺（N），X ₈為脯胺酸（P）或丙胺酸（A），X ₉為絲胺酸（S）、半胱胺酸（C）、蘇胺酸（T）、精胺酸（R）或組胺酸（H）。

於某些具體實施例中，該第一區段包含X ₁CDGTCGKSEGSPX ₉（SEQ ID NO: 12）的模體，其中X _l為纈胺酸（V）或異白胺酸（I），且X ₉為絲胺酸（S）、半胱胺酸（C）或組胺酸（H）。

於某些具體實施例中，該第一區段包含VCDGTCGKSEGSPX ₉（SEQ ID NO: 13）的模體，其中X ₉為絲胺酸（S）或組胺酸（H）。

於某些具體實施例中，該第一區段包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：VCDGTCGKSEGSPS（SEQ ID NO: 14，人類）、VCDGTCGKSEGSPS（SEQ ID NO: 14，黑猩猩）、VCDGTCGKSEGSPS（SEQ ID NO: 14，大猩猩）、ICDGTCGKSEGSPC（SEQ ID NO: 15，狐）、LCDSACGHKEGSAT（SEQ ID NO: 16，大鼠）、LCDSACGHNEGSAR（SEQ ID NO: 17，小鼠）、VCDGTCGKSEGSPH（SEQ ID NO: 18，馬）、ACDGTCSNSEGGPH （SEQ ID NO : 19），以及MCDSTCDKSEGSPH（SEQ ID NO: 20，貓）。

於某些具體實施例中，該第一區段包含選自由SEQ ID NO: 14-18所組成之群組的胺基酸序列。

於某些具體實施例中，該第一區段包含選自由SEQ ID NO: 14、15及18所組成之群組的胺基酸序列。

於某些具體實施例中，該第一區段包含選自由SEQ ID NO: 14與18所組成之群組的胺基酸序列。

於某些具體實施例中，該第一區段融合至包含細胞穿透胜肽序列的第二區段。

於某些具體實施例中，該細胞穿透胜肽序列選自由下列所組成之群組： RKKRRQRRR（SEQ IDNO: 21）（HIV-TAT）、 RQIKIWFQNRRMKWKK（SEQ ID NO: 22）（滲透素）、 VRLPPPVRLPPPVRLPPP（SEQ ID NO: 23）（SAP）、 TRQARRNRRRWRERQR（SEQ ID NO: 24）（HIV-1 Rev）、 RRRNRTRRNRRRVR（SEQ ID NO: 25）（FHV）、 TRRQRTRRARRNR（SEQ ID NO: 26）（HTLV-II）、 KRPAAIKKAGQAKKKK（SEQ ID NO: 27）（NLS）、 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL（SEQ ID NO: 28）（細胞穿膜肽）、 LLIILRRRIRKQAHAHSK（SEQ ID NO: 29）（pVEC）。

於一特定實例中，該IL-17RB抑制胜肽包含或由如RKKRRQRRRVCDGTCGKSEGSPS（SEQ ID NO: 30）所示之胺基酸序列所組成。

於某些具體實施例中，該胜肽為一環（環狀）胜肽。

於某些具體實施例中，該IL-17RB抑制胜肽具有小於100個胺基酸的長度，例如80個胺基酸或更少、60個胺基酸或更少、40個胺基酸或更少，或30個胺基酸或更少。

於另一方面，本發明提供一種抑制MLK4與IL-17RB結合的IL-17RB抑制胜肽，如本文所述。

於另一方面，本發明提供一種重組核酸，包含編碼如本文所述之任何胜肽的核苷酸序列。這種核酸可為包含本文所述之編碼序列的載體。於某些實施例中，該載體為表現載體。

可將任何該胜肽或核酸配製成組合物，該組合物還包含生理學上可接受的載體。於某些情況下，本發明之組合物為用於醫療用途之醫藥組合物。

根據本發明，該IL-17RB抑制胜肽或編碼該胜肽的核酸或包含該胜肽或該編碼核酸的組合物的任何一者可用於在有此需要的個體中抑制IL-17B/IL-17RB活化及/或治療與該活化相關之疾病或病症。通常，該疾病或病症為IL-17B/IL-17RB調節的增殖病症，例如癌症及其轉移。

於某些具體實施例中，該癌症係選自由下列所組成之群組：肺癌、胰臟癌、乳癌、大腸直腸癌、肝癌、腎癌、頭頸癌、食道癌、胃癌、膽道癌、膽囊及膽管癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮體癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸腫瘤、成骨及軟組織肉瘤、血癌、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、皮膚癌、腦瘤，以及惡性胸膜間皮瘤。

於特定實施例中，該癌症為乳癌。

於另一特定實施例中，該癌症為胰臟癌。

於本發明中還發現磷酸化的IL-17RB（特別是P-Y447）與癌症的陰性（不良）預後相關。因此，本發明提供一種預測癌症預後之方法，包括收集從癌症患者獲得的生物樣品，測量該樣品中磷酸化IL-17RB的表現量，並根據該樣品中磷酸化IL-17RB的表現量確定該患者的癌症預後情況，其中該樣品中磷酸化IL-17RB含量升高表示預後不良。本發明還提供一種監測癌症患者中癌症進展（progression）之方法，包括（a）測量在第一時間點自該患者所獲得的第一生物樣品中的磷酸化IL-17RB蛋白的含量；（b）測量在第二時間點自該患者所獲得的第二生物樣品中的磷酸化IL-17RB蛋白的含量；（c）基於該第一及第二生物樣品中的含量確定該患者的癌症進展，其中相較於該第一生物樣品，該第二生物樣品中的磷酸化IL-17RB蛋白含量升高表示癌症進展。於一情況下，該癌症為胰臟癌。

本發明之一個或多個具體實施例的細節在以下的描述中闡述。從以下幾個具體實施例的詳細描述以及從所附申請專利範圍中，本發明的其他特徵或優點將是顯而易見的。

除非另有定義，本文使用的所有技術及科學術語與本發明所屬領域的技術人員通常理解的含義相同。

如本文所用，單數形式「一」、「一個」以及「該」包括複數指示物，除非上下文另有明確規定。因此，例如，提及「一組件」包括本領域技術人員已知的多個這樣的組件及其等同物。

「包含（comprise）」或「包含（comprising）」等詞通常以包括（include）/包括（including）的含義使用，其意指允許存在一種或多種特徵、成分或組成分。「包含（comprise）」或「包含（comprising）」等詞包含術語「組成（consists）」或「由...組成（consisting of）」。

如本文所用，「多胜肽」乙詞係指由透過胜肽鍵連接的胺基酸殘基所組成的聚合物。「胜肽」乙詞係指由連接的胺基酸所組成的相對較短的多胜肽，例如，200個或更少的胺基酸、175個或更少的胺基酸、150個或更少的胺基酸，例如140或更少、130或更少、120或更少、110或更少、100或更少、90或更少、80或更少、70或更少、60或更少、50或更少，或40或更少胺基酸長度。

如本文所用，「對應於」係指蛋白質或胜肽中所列舉位置處的殘基，或與蛋白質或胜肽中所列舉殘基類似、同源或等價的殘基。

如本文所用，「融合蛋白」乙詞係指透過遺傳技術產生的蛋白質，其包含源自不同蛋白質的兩個或更多個功能域。可以常規方式製備融合蛋白，例如透過在合適的細胞中表現編碼融合蛋白的核苷酸序列。

IL-17RB為IL-17的受體之一，為單一跨膜蛋白。如本文所述之IL-17RB可包括人類IL-17RB及其來自脊椎動物的同源物，特別是來自哺乳動物的那些同源物。特定而言，本文所述之IL-17RB包括來自人類的IL-17RB胺基酸序列（SEQ ID NO: 1）以及來自其他哺乳動物的IL-17RB胺基酸序列（SEQ ID NO: 2至9）。如本文所述之IL-17RB進一步包括由編碼IL-17RB的天然多核苷酸序列的cDNA拷貝編碼的任何重組（工程化）衍生的IL-17RB多胜肽。

在結構上，IL-17RB包括一個胞外結構域、一個跨膜結構域以及一個胞內胞質尾。特定而言，該胞外結構域位於SEQ ID NO: 1的第18-289位的對應的位置，該跨膜結構域位於SEQ ID NO: 1的第290-312位的對應的位置，該胞內胞質尾位於SEQ ID NO: 1的第313-502位的對應位置，其中用於MLK4結合的柔性環位於第403-416位。

以下所示為來自人類及其他哺乳動物的IL17RB的胺基酸序列（SEQ ID NOs: 1至 9）。

IL-17RB；細胞激素-17受體B [ Homo sapiens（人類）] NCBI-GeneID: 55540 來源：www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?hsa:55540

胺基酸序列（502個胺基酸）（SEQ ID NO: 1） MSLVLLSLAALCRSAVPREPTVQCGSETGPSPEWMLQHDLIPGDLRDLRVEPVTTSVATG DYSILMNVSWVLRADASIRLLKATKICVTGKSNFQSYSCVRCNYTEAFQTQTRPSGGKWT FSYIGFPVELNTVYFIGAHNIPNANMNEDGPSMSVNFTSPGCLDHIMKYKKKCVKAGSLW DPNITACKKNEETVEVNFTTTPLGNRYMALIQHSTIIGFSQVFEPHQKKQTRASVVIPVT GDSEGATVQLTPYFPTCGSDCIRHKGTVVLCPQTGVPFPLDNNKSKPGGWLPLLLLSLLV ATWVLVAGIYLMWRHERIKKTSFSTTTLLPPIKVLVVYPSEICFHHTICYFTEFLQNHCR SEVILEKWQKKKIAEMGPVQWLATQKKAADKVVFLLSNDVNSVCDGTCGKSEGSPSENSQ DLFPLAFNLFCSDLRSQIHLHKYVVVYFREIDTKDDYNALSVCPKYHLMKDATAFCAELL HVKQQVSAGKRSQACHDGCCSL 註：灰色背景區域表示MLK4結合的柔性環（第403-416個胺基酸）

IL-17rb；細胞激素-17受體B [ Pan troglodytes（黑猩猩）] NCBI-GeneID: 460451 來源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/460451

胺基酸序列（505個胺基酸）（SEQ ID NO: 2） MSLVLLSLAALCRSAVPREPTVQCGSETGPSPEWMLQHDLIPGDLRDLRVELVTTSVATG DYSILMNVSWVLRADASIRLLKATKICVTGKSNFQSYSCVRCNYTEAFQTQTRPSGGKWTFSYVGFPVELNTVYFIGAHNIPNANMNEDGPSMPVNFTSPGCLDHIMKYKKKCVKAGSLWDPNITACKKNEETVEVNFTTTPLGNRYMALIQHSTHSTVIGFSQVFEPHQKKQTRASVVIPVTGDSEGAMVQLTPYFPTCGSDCIRHKGIVVLCPQTGVPFPLDNNKSKLGGWLPLLLLSLLVATWVLVAGIYLMWRHERIKKTSFSTTTLLPPIKVLVVYPSEICFHHTICYFTEFLQNHCRSEVILEKWQKKKIAEMGPVQWLATQKKAADKVVFLLSNDVNSVCDGTCGKSEGSPSENSQDLFPLAFNLFCSDLRSQIHLHKYVVVYFRETDTKDDYNALSVCPKYHLMKDATAFCAELLHVKQQVSAGKRSQACHDGCCSL 註：灰色背景區域表示MLK4結合的柔性環（第403-419個胺基酸）

IL-17rb；細胞激素-17受體B [ Gorilla（西部低地大猩猩）] NCBI-GeneID: 101142225 來源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/101142225

胺基酸序列（502個胺基酸）（SEQ ID NO: 3） MSLVLLSLAALCRSAVPREPTIQCGSETGPSPEWMLQHDLIPGDLRDLRVEPVKTSVATGDYSILMNVSWVLRADASIRLLKATKICVTGKSNFQSYSCVRCNYTEAFQTQTRPSGGKWTFSYIGFPVELNTVYFIGAHNIPNANMNEDGPSMSVNFTSPGCLDHIMKYTKKCVKAGSLWDPNITACKKNEETVEVNFTTTPLGNRYMALIQHSTIIGFSQVFEPHQKKQTRASVVIPVTGDSEGAMVQLTPYFPTCGSDCIRHKGTVVLCPQTGVPFPLDNNKSKPGGWLPLLLLSLLVATWVLVAGIYLMWRHERIKKTSFSTTTLLPPIKVLVVYPSEICFHHTICYFTEFLQNHCRSEVILEKWQKKKIAEMGPVQWLATQKKAADKVVFLLSNDVNSVCDGTCGKSEGSPSENSQDLFPLAFNLFCSDLRSQIHLHKYVVVYFRETDTKDDYNALSVCPKYHLMKDATAFCAELLHVKQQVSAGKRSQACHDGCCSL 註：灰色背景區域表示MLK4結合的柔性環（第403-416個胺基酸）

IL-17rb；細胞激素-17受體B [ Pteropus alecto（黑狐蝠）] NCBI-GeneID: 102891713 來源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ 102891713

胺基酸序列（454個胺基酸）（SEQ ID NO: 4） MGGDDLAMSLMLLSLAALCWGAVSPEPTIQCGPETGPSPEWMVRHTLTPGDLRDLRVEPVKSSVASEDYSILMNISWILRADASIRLLKATKICVTGKSGFQSYGCVRCNYTEVFQTQSRPSGGKWMFFYIGFPVELNTLYFIGAHNIPNANMNEDSPSMSVNFTSPGSLWDPNITACKKNENMVEVNFTISPLGNRYMVLILKNTVIGTSVSEEKLTRTSVMVPVTGESEGAVVQLTPYFHTCGNDCIRRKGMVVLCPQTGVPFSPDNKKIKMSLSSTMLLPITVLVVYPSEICFHHTVCYFAEFLQNHCRSQVILDKWQKKKIAEMGPVQWLTTQKKAADKVIFLLSNDVNTICDGTCGKSEGSPCENSQDLFPLAFNLFCSDLRSQTHQHKYIVVYFREADTKDDYNALNVCPKYCL MKDATSFCMELLHVEQQVSTGKRLRACHNRCSSL 註：灰色背景區域表示MLK4結合的柔性環（第355-368個胺基酸）

IL-17rb；細胞激素-17受體B [ Rattus norvegicus（大鼠）] NCBI-GeneID: 306247 來源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/306247

胺基酸序列（354個胺基酸）（SEQ ID NO: 5） MNEDSPSLSVNFTSPGCLNHVMKYKKQCIEAGSLWDPNITACKKNEKTVEVNFTTNSLGNRYMVLIRRDTMLGVSIVLENKLTRTSVVIPVNDESEGALVELTPYLHTCDNDCIRRKGTVVLCSETSAPFPPDDNRSMLRGWLPLLLVLLVATWVLAVGIYLTWRQGRSTKTSFPITAMLLPLVKVLVVYPSEICFHHTVCRFTDFLQNYCRSEVILEKWQKKKIAEMGPVQWLTTQKQAADKVVFLLPSDAPSLCDSACGHKEGSATENSQDLFPLAFNLFCSDFSSQTHLHKYLVVYLGGADLKGDYNALRVCPQYHLMKDAPAFHTELLKATQSMPLKKRPQACHGSCSPL 註：灰色背景區域表示MLK4結合的柔性環（第255-268個胺基酸）

IL-17rb；細胞激素-17受體B [ Mus musculus（小鼠）] NCBI-GeneID: 50905 來源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/50905

胺基酸序列（499個胺基酸）（SEQ ID NO: 6） MLLVLLILAASCRSALPREPTIQCGSETGPSPEWMVQHTLTPGDLRDLQVELVKTSVAAEEFSILMNISWILRADASIRLLKATKICVSGKNNMNSYSCVRCNYTEAFQSQTRPSGGKWTFSYVGFPVELSTLYLISAHNIPNANMNEDSPSLSVNFTSPGCLNHVMKYKKQCTEAGSLWDPDITACKKNEKMVEVNFTTNPLGNRYTILIQRDTTLGFSRVLENKLMRTSVAIPVTEESEGAVVQLTPYLHTCGNDCIRREGTVVLCSETSAPIPPDDNRRMLGGWLPLFLVLLVAVWVLAAGIYLTWRQGRSTKTSFPISTMLLPLIKVLVVYPSEICFHHTVCRFTDFLQNYCRSEVILEKWQKKKIAEMGPVQWLTTQKQAADKVVFLLPSDVPTLCDSACGHNEGSARENSQDLFPLAFNLFCSDFSSQTHLHKYLVVYLGGADLKGDYNALSVCPQYHLMKDATAFHTELLKATQSMSVKKRSQACHDSCSPL 註：灰色背景區域表示MLK4結合的柔性環（第400-413個胺基酸）

IL-17RB；細胞激素-17受體B [ Equus caballus（馬）] NCBI-GeneID: 100059421 來源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/100059421

胺基酸序列（499個胺基酸）（SEQ ID NO: 7） MSLVLLSLAALCWGAVPREPTIQCGSEAGPSPEWMVQHALTPGDLRDLQVEPVKSRVATEDYSVLMNISWILRADASIRFLKATKICVTGKSNFQSYSCVRCNYTEAFQTQTRPSGGKWTFSYIGFPVELDTLYFIGAHNIPNANMNGDGPSLSVNFTSPGCLDHVMKYKKKCIEAGSLWDPNITACKKNEKMVEVNFTTSPLGNRYMALIQNNTVIGLSNVLENKLTRTSVVIPVTGESEGAVVQLTPYFHTCGSDCIRRRGIVVLCPHTGASSPPDNSRSVLGGWLPFLLPALLVATWVLAVGIYLTWRHERIKKTSFPTTALLSPIKVLVVYPSEICFHHTVCYFTKFLQNHCRTEVILEKWQKKKIAEMGPVQWLTTQKKAADKVIFLLSNNVNNVCDGTCGKSEGSPHENSQDLFPLAFNLFCSDLRSQNHLHKYMVVYFREADTKDDYDALHVCPKYCLMKDAAAFCTELLHVEQHVSVGKRWRACHNRCSAL 註：灰色背景區域表示MLK4結合的柔性環（第400-413個胺基酸）

IL-17rb；細胞激素-17受體B [ Sus scrofa（豬）] NCBI-GeneID: 100156014 來源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/100156014

胺基酸序列（477個胺基酸）（SEQ ID NO: 8） MLLVLLSLAALCWGAMPPEPTIQCGSEPGLSPEWMVRHALTPGDLRDLRVEPIKSSVAVEDYSILMNISWILRADASIRLLKATKICVTGKSQKQTYSCVRCNYTEAFQTQTRPSGGKWMFSYVGFPVELNTRYFIGAHNIPNANMNEDGPSLAVNFTSPGCLDRIMKYKKKCIEAGSLWDPNITACKKSENTVEVNFTTSPLGNRYMALIQNSTVIGTSYVSELTPYFRTCGNDCIRRRGTVVRCPHTGVPFPQDQSRSMLSGWLPLLLLALLVAIWVLAGGIYLTRRHERIKKTSFSATILLPPIKVLVVYPSEICFHHTVCYFTRFLQNHCRSEVILEKWQKKKIAEMGPVQWLTTQKAAADKVIFLLSNDGNTACDGTCSNSEGGPHENSQDLFPLAFNLFCSDLRSQTHLHKYVVVYFREVDIKDDYSALSVCPTYHLMKDAPAFCKELLHAEQHVSVGRRLQACHYSCSSL 註：灰色背景區域表示MLK4結合的柔性環（第378-391個胺基酸）

IL-17rb；細胞激素-17受體B [ Felis catus（貓）（銀貓）] NCBI-GeneID: 101080437, 來源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/101080437

胺基酸序列（494個胺基酸）（SEQ ID NO: 9） MSLALLSLAALCWGLVSTEPTIQCGSEPGPSPEWMVQHTLTPGDLRDLRVEPVRSRVAMDYSILMNVSWVLRADASIRLLKATKICVTGKSNLQSYSCVRCNYTEAFQTQTRPSGGRWTFSYVGFPVELNTVYFIGAHNIPNANINEDSPSMSVNFTSPGCLDHIMKYQKKCIKAGSLWDPNVTACKKNKTVVEVNFTTSPLGNKYMALIQNRIVIGFSNVLENKPPTRTSVVIPVTGESEGAMVQLTPYFHTCGNDCIRRKGTVVLCPQTGISFPLDGRRSMMGGWQPFLLPALLGATALLAAGIYVIWRHKRIKKASFPTATLLSPIKVLVVYPSEICFHHTVCHFTEFLQNHCRSEVILEEWQKKKIAEMGPVQWLTTQKKAVDKIIFLLSNDVNTMCDSTCDKSEGSPHENSQDLFPLAFNLFCSDLRNQTPLRKYMVVYFREADTKDEYSALSVCPKYRLMKDAPAFCTELLRVEQHMSAGKRLTACSM 註：灰色背景區域表示MLK4結合的柔性環（第400-413個胺基酸）

在功能上，IL-17RB可在細胞激素IL-17B的刺激下被活化。IL-17RB在與IL-17B結合後形成同源二聚體，並透過柔性環募集MLK4，使其在Y447位置上磷酸化，磷酸化的IL-17B反過來募集泛素連接酶TRIM56，在K470位置上添加K63連接的泛素鏈。IL-17B/IL-17RB訊息傳導的活化賦予致癌活性。IL-17RB亦可被IL-17E識別。然而，與IL-17B不同，IL-17E與IL-17RB的結合誘導IL-17RB與IL-17RA的異二聚化，進而活化不由MLK4磷酸化調節的Th2免疫反應。

本發明至少部分基於以下發現：包括透過Y447位置上的MLK4磷酸化以及K470位置上的TRIM56泛素化的IL-17B/IL-17RB訊息傳導在內的任何事件對於腫瘤發生至關重要。因此，本文提供用於抑制IL-17B/IL-17RB活化並因此治療與IL-17RB拮抗劑相關的疾病或病症之方法，該IL-17RB拮抗劑以IL-17RB與MLK4、Y447磷酸化及/或K470泛素化之間的相互作用為目標。特別是，本文所述之方法不會引起某些副作用，例如降低第2型免疫。

如本文所用，「IL-17RB拮抗劑」乙詞係指可顯著降低、抑制、阻斷，及/或減輕IL-17RB訊息傳導，特別是IL-17B/IL-17RB訊息傳導的活化的物質或藥劑。於某些具體實施例中，如本文所用之IL-17RB拮抗劑能夠抑制IL-17RB與MLK4之間的相互作用，例如透過競爭IL-17RB中MLK4的結合位點，進而顯著降低、抑制、阻斷及/或減輕IL-17RB的活化。用於本發明之IL-17RB拮抗劑可包括胜肽或小分子化合物。特定而言，用於本發明之IL-17RB拮抗劑不抑制透過IL-17E的IL-17RB免疫原性訊息傳導。

於某些具體實施例中，本發明公開一種作為IL-17RB拮抗劑用於抑制IL-17B/IL-17RB活化的IL-17RB抑制胜肽。該IL-17RB抑制胜肽為一種非天然存在的片段，包括用於與IL-17RB結合的MLK4環的胺基酸序列。此類胜肽競爭IL-17RB中MLK4的結合位點，可用於抑制IL-17B/IL-17RB藥物致癌訊息傳導途徑，進而有益於治療與異常IL-17RB活化相關的疾病及病症。

於某些具體實施例中，該IL-17RB抑制胜肽包含一第一區段，該第一區段包含X ₁CDX ₂X ₃CX ₄X ₅X ₆EGX ₇X ₈X ₉（SEQ ID NO: 10）的模體，其中X ₁為纈胺酸（V）、異白胺酸（I）、白胺酸（L）、丙胺酸（A）、甲硫胺酸（M），X ₂為甘胺酸（G）或絲胺酸（S），X ₃為蘇胺酸（T）或丙胺酸（A），X ₄為甘胺酸（G）、絲胺酸（S）或天門冬胺酸（D），X ₅為離胺酸（K）、組胺酸（H）或天門冬醯胺（N），X ₆為絲胺酸（S）、離胺酸（K）或天門冬醯胺（N），X ₇為絲胺酸（S）或甘胺酸（G），X ₈為脯胺酸（P）或丙胺酸（A），X ₉為絲胺酸（S）、半胱胺酸（C）、蘇胺酸（T）、精胺酸（R）或組胺酸（H）。

於特定實施例中，該第一區段包含選自由SEQ ID Nos: 14-20所組成之群組的胺基酸序列。

VCDGTCGKSEGSPS	SEQ ID NO: 14	人類	SEQ ID NO: 1的第403-416個胺基酸
VCDGTCGKSEGSPS	SEQ ID NO: 14	黑猩猩	SEQ ID NO: 2的第406-419個胺基酸
VCDGTCGKSEGSPS	SEQ ID NO: 14	大猩猩	SEQ ID NO: 3的第403-416個胺基酸
ICDGTCGKSEGSPC	SEQ ID NO: 15	狐蝠	SEQ ID NO: 4的第355-368個胺基酸
LCDSACGHKEGSAT	SEQ ID NO: 16	大鼠	SEQ ID NO: 5的第255-268個胺基酸
LCDSACGHNEGSAR	SEQ ID NO: 17	小鼠	SEQ ID NO: 6的第400-413個胺基酸
VCDGTCGKSEGSPH	SEQ ID NO: 18	馬	SEQ ID NO: 7的第400-413個胺基酸
ACDGTCSNSEGGPH	SEQ ID NO: 19	豬	SEQ ID NO: 8的第378-391個胺基酸
MCDSTCDKSEGSPH	SEQ ID NO: 20	貓	SEQ ID NO: 9的第400-413個胺基酸

於特定實施例中，該第一區段包含選自由SEQ ID Nos: 14-18所組成之群組的胺基酸序列。

VCDGTCGKSEGSPS	SEQ ID NO: 14	人類	SEQ ID NO: 1的第403-416個胺基酸
VCDGTCGKSEGSPS	SEQ ID NO: 14	黑猩猩	SEQ ID NO: 2的第406-419個胺基酸
VCDGTCGKSEGSPS	SEQ ID NO: 14	大猩猩	SEQ ID NO: 3的第403-416個胺基酸
ICDGTCGKSEGSPC	SEQ ID NO: 15	狐蝠	SEQ ID NO: 4的第355-368個胺基酸
LCDSACGHKEGSAT	SEQ ID NO: 16	大鼠	SEQ ID NO: 5的第255-268個胺基酸
LCDSACGHNEGSAR	SEQ ID NO: 17	小鼠	SEQ ID NO: 6的第400-413個胺基酸
VCDGTCGKSEGSPH	SEQ ID NO: 18	馬	SEQ ID NO: 7的第400-413個胺基酸

於特定實施例中，該第一區段包含選自由SEQ ID Nos: 14、15，以及18所組成之群組的胺基酸序列。

VCDGTCGKSEGSPS	SEQ ID NO: 14	人類	SEQ ID NO: 1的第403-416個胺基酸
VCDGTCGKSEGSPS	SEQ ID NO: 14	黑猩猩	SEQ ID NO: 2的第406-419個胺基酸
VCDGTCGKSEGSPS	SEQ ID NO: 14	大猩猩	SEQ ID NO: 3的第403-416個胺基酸
ICDGTCGKSEGSPC	SEQ ID NO: 15	狐蝠	SEQ ID NO: 4的第355-368個胺基酸
VCDGTCGKSEGSPH	SEQ ID NO: 18	馬	SEQ ID NO: 7的第400-413個胺基酸

於特定實施例中，該第一區段包含選自由SEQ ID Nos: 14及18所組成之群組的胺基酸序列。

VCDGTCGKSEGSPS	SEQ ID NO: 14	人類	SEQ ID NO: 1的第403-416個胺基酸
VCDGTCGKSEGSPS	SEQ ID NO: 14	黑猩猩	SEQ ID NO: 2的第406-419個胺基酸
VCDGTCGKSEGSPS	SEQ ID NO: 14	大猩猩	SEQ ID NO: 3的第403-416個胺基酸
VCDGTCGKSEGSPH	SEQ ID NO: 18	馬	SEQ ID NO: 7的第400-413個胺基酸

在另外的具體實施例中，如本文所述之IL-17RB抑制胜肽可為其具有一個或多個突變的變體。可以理解的是，多胜肽可能具有有限數量的變化或修飾，這些變化或修飾可在與其活性或功能無關的多胜肽的某個部分內進行，但仍會產生具有可接受程度的等效或相似的生物學活性或功能的功能性等效變體。於某些實施例中，該胺基酸殘基突變為保守胺基酸取代，係指胺基酸殘基與另一個胺基酸殘基具有相似的化學結構而對多胜肽功能、活性或其他生物學特性的影響較小或基本沒有影響。可根據本領域普通技術人員已知的用於改變多胜肽序列的方法製備變體，例如在彙編此類方法的參考文獻中發現的那些，例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook等人編輯，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989年。例如，胺基酸的保守置換包括在以下群組內的胺基酸之間進行的置換：(i) A、G；(ii) T、S；(iii) Q、N；(iv) D、E ；(v) M、I、L、V；(vi) F、Y、W；以及(vii) K、R、H。

如本文所用，「基本相同」乙詞係指兩個序列具有70%或更多、較佳為75%或更多、更佳為80%或更多、甚至更佳為85%或更多、甚至更佳為90% 或更多，最佳為95%或更多或100%的同一性。

為確定兩個序列的同一性百分比，為了最佳比較目的比對序列（例如，可在第一核苷酸序列的序列中引入空位以與第二核苷酸序列進行最佳比對）。在計算同一性百分比時，通常會計算完全匹配。可使用本領域已知的數學演算法，例如BLAST與Gapped BLAST程式、NBLAST與XBLAST程式，或ALIGN程式來確定兩個序列之間的百分比同源性或同一性。

於某些具體實施例中，本文所述之IL-17RB抑制胜肽還可包括與本文所述之特定序列號基本相同的胺基酸序列，例如：與SEQ ID NO: 14、15、16、17、18、19或20具有70%或更多，較佳為75%或更多，更佳為80%或更多，甚至更佳為85%或更多，甚至更佳為90%或更多，最佳為95%或更多或100%的同一性的胺基酸序列。

於某些具體實施例中，本發明之IL-17RB抑制胜肽還包括第二片段，該第二片段包含與該第一片段融合的細胞穿透胜肽序列。

如本文所用，細胞穿透胜肽序列係描述關於導引多胜肽在細胞內轉運的胜肽鏈。進入細胞的遞送過程可透過內吞作用發生，而胜肽亦可透過直接膜易位被內化到細胞中。細胞穿透胜肽的胺基酸組成通常包含相對豐度較高的帶正電胺基酸（如離胺酸（L）或精胺酸（R）），或具有包含極性/帶電胺基酸以及非極性疏水胺基酸交替模式的序列。於一具體實施例中，該細胞穿透胜肽序列在該第一區段的N端融合，如本文所述。於另一具體實施例中，該細胞穿透胜肽在該第一區段的C端融合，如本文所述。

細胞穿透胜肽序列的實例包括SEQ ID NOs: 21-29。（HIV-TAT） RKKRRQRRR（SEQ IDNO: 21）、滲透素 RQIKIWFQNRRMKWKK（SEQ ID NO: 22）、 SAP VRLPPPVRLPPPVRLPPP（SEQ ID NO: 23）、 HIV-1 Rev TRQARRNRRRWRERQR（SEQ ID NO: 24）、 FHV RRRNRTRRNRRRVR（SEQ ID NO: 25）、 HTLV-II TRRQRTRRARRNR（SEQ ID NO: 26）、 NLS KRPAAIKKAGQAKKKK（SEQ ID NO: 27）、細胞穿膜肽 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL（SEQ ID NO: 28）、 pVEC LLIILRRRIRKQAHAHSK（SEQ ID NO: 29）。

於一特定實施例中，本發明之IL-17RB抑制胜肽包含如PKKRRQRRRVCDGTCGKSEGSPS（SEQ ID NO: 30）中所示之胺基酸序列或由如PKKRRQRRRVCDGTCGKSEGSPS（SEQ ID NO: 30）中所示之胺基酸序列組成。

於某些具體實施例中，該細胞穿透胜肽透過彈性胜肽、間隔胜肽或連接子胜肽與該第一片段融合，該彈性胜肽、間隔胜肽或連接子胜肽基本上不影響該第一片段的IL-17RB抑制活性以及該細胞穿透胜肽的細胞穿透活性。

於某些具體實施例中，本發明之IL-17RB抑制胜肽包含SEQ ID NO: 10的模體，或SEQ ID NO: 11、12或13的模體，或選自由SEQ ID Nos：14-20或其具有與其基本相同的胺基酸序列的變體所組成之群組的特定胺基酸序列，任選地融合至細胞穿透胜肽，具有至少14個胺基酸以及少於80個胺基酸，特別是少於70個胺基酸，更特別是少於60個胺基酸，甚至更特別是少於50個胺基酸。

本發明之IL-17RB抑制胜肽可使用蛋白質化學中習知的技術，例如固相合成或均相溶液中的合成，透過化學合成來生產。

作為替代，本發明之IL-17RB抑制胜肽可使用重組技術來製備。於此方面，提供包含編碼本發明之IL-17RB抑制胜肽的核苷酸序列的重組核酸。

「多核苷酸」或「核酸」等詞可指由核苷酸單元所組成之聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，例如去氧核糖核酸（「DNA」）以及核糖核酸（「RNA」）以及核酸類似物，包括那些具有非天然存在的核苷酸的核酸類似物。例如，可使用自動化DNA合成儀合成多核苷酸。「核酸」乙詞通常係指大的多核苷酸。應當理解的是，當核苷酸序列由DNA序列（亦即，A、T、G、C）表示時，這也包括其中由「U」取代「T」的RNA序列（亦即，A、U、G、C）。「cDNA」乙詞係指與單鏈或雙鏈形式的mRNA互補或相同的DNA。

「互補」乙詞係指兩個多核苷酸的相互作用表面的拓撲相容性或匹配在一起。因此，這兩種分子可說為互補的，且接觸面的特性是互補的。如果第一多核苷酸的核苷酸序列與第二多核苷酸的多核苷酸結合配偶體的核苷酸序列相同，則第一多核苷酸與第二多核苷酸互補。因此，序列5'-TATAC-3'的多核苷酸與序列為5'-GTATA-3'的多核苷酸互補。

「編碼」乙詞係指多核苷酸（例如基因、cDNA或mRNA）中特定核苷酸序列的固有特性，可作為在生物過程中合成具有確定序列的其他聚合物及大分子的模板核苷酸（亦即，rRNA、tRNA與mRNA）或確定的胺基酸序列以及由此產生的生物學特性。因此，如果由該基因產生的mRNA的轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則該基因編碼蛋白質。技術人員應當理解的是，由於遺傳密碼的簡併性，許多不同的多核苷酸及核酸可編碼相同的多胜肽。還應當理解的是，技術人員可使用常規技術進行不影響由此處描述的多核苷酸編碼的多胜肽序列的核苷酸取代，以反映要在任何特定宿主生物體中表現多胜肽的所使用的密碼子。因此，除非另有說明，「編碼胺基酸序列的核苷酸序列」包括彼此簡併形式且編碼相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質與RNA的核苷酸序列可能包括內含子。

「重組核酸」乙詞係指具有非天然連接在一起的序列的多核苷酸或核酸。重組核酸可以載體的形式存在。「載體」可包含給定的目標核苷酸序列以及調控序列。載體可用於表現給定的核苷酸序列（表現載體）或維持給定的核苷酸序列以複製它、操縱它或在不同位置之間（例如，在不同生物體之間）轉移它。針對上述目的，可將載體導入合適的宿主細胞中。「重組細胞」係指已將重組核酸引入其中的宿主細胞。「轉化」係指摻入新DNA（亦即，細胞外源DNA）後細胞中的遺傳變化。「轉染」係指將外源DNA轉移至細胞的過程。「轉導」可具體指透過病毒載體將外源DNA引入細胞中的過程。「轉化細胞」係指已透過重組DNA技術引入編碼目標蛋白質的DNA分子的細胞。

載體可為多種類型，包括質體、黏接質體、F型黏接質體、游離基因體、人工染色體、噬菌體、病毒載體等。通常，在載體中，給定的核苷酸序列可操作地連接到調節序列，使得當將載體引入宿主細胞時，給定的核苷酸序列可在調節序列的控制下在宿主細胞中表現。調節序列可包括，例如，但不限於，啟動子序列（例如，巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）啟動子、猿病毒40（simian virus 40，SV40）早期啟動子、T7啟動子，以及醇氧化酶基因（alcohol oxidase gene， AOX1）啟動子）、起始密碼子、複製起始點、增強子、操縱子序列、分泌訊息序列（例如，α-交配因子訊息）以及其他調控序列（例如，Shine-Dalgarno序列以及終止序列）。較佳地，載體可進一步包含標記序列（例如，抗生素抗性標記序列），以用於隨後的篩選程序。為了生產蛋白質的目的，在載體中，給定的目標核苷酸序列可連接到除上述調節序列之外的另一個核苷酸序列，進而產生融合的多胜肽並有利於隨後的純化程序。該融合多胜肽包括用於純化目的之標籤，其可結合到多胜肽的末端並較佳為尺寸小而不影響所需的多胜肽活性。特定而言，標籤的長度為約30個胺基酸殘基或更少，特別是約20個胺基酸殘基或更少，更特別是約10個胺基酸殘基或更少；或具有約10kDa或更小，特別是約5kDa或更小，更特別是約2.5kDa或更小的分子量。這種標籤的示例包括，但不限於，六（6）至十四（14）個His-標籤或一（1）至二（2）個Myc-標籤。標籤可連接至多胜肽的N端或C端。於某些具體實施例中，標籤可在體外或體內為可切割的。體外或體內切割可透過蛋白酶進行處理。

於某些具體實施例中，若本發明之胜肽基本上不含細胞材料或化學前體或可能參與胜肽製備過程的其他化學物質，則可說本發明之胜肽為「分離的」或「純化的」。應當理解的是，「分離的」或「純化的」等詞不一定反映胜肽已「絕對」分離或純化的程度，例如透過去除所有其他物質（例如，雜質或細胞成分）。於某些情況下，例如，分離或純化的胜肽包括含有胜肽的製劑，該胜肽具有小於50%、40%、30%、20%或10%（按重量計）的其他蛋白質（例如細胞蛋白質），具有小於50%、40%、30%、20%或10%（按體積計）的培養基，或具有少於50%、40%、30%、20%或10%（按重量計）的化學前體或其他合成過程中涉及的化學品。「分離的」或「純化的」等詞亦可應用於本發明之核酸。

根據本發明，可將有效量的IL-17RB拮抗劑與生理上可接受的載體配製成適當形式的組合物，以達到遞送及吸收之目的。本發明之組合物特別包含約0.1重量%至約100重量%的活性成分，其中重量百分比基於整個組合物的重量計算。於某些具體實施例中，本發明之組合物可為用於治療的醫藥組合物或藥物。

如本文所用，「生理上可接受的」係指載體與組合物中的活性成分相容，且較佳為可穩定該活性成分並對接受個體而言是安全的。該載體可為活性成分的稀釋劑、賦形劑、賦形劑或基質。合適的賦形劑的一些實例包括乳糖、蔗糖、右旋糖、山梨糖、甘露糖、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、無菌水、糖漿，以及甲基纖維素。該組合物可另外包含潤滑劑，例如滑石、硬脂酸鎂以及礦物油；潤濕劑；乳化劑與懸浮劑；防腐劑，例如羥基苯甲酸甲酯以及羥基苯甲酸丙酯；甜味劑；以及調味劑。本發明之組合物在給予患者後可提供活性成分快速、持續或延遲釋放的效果。

根據本發明，組合物的形式可為片劑、丸劑、散劑、口含錠、小包、錠劑、酏劑、混懸劑、洗劑、溶劑、糖漿劑、軟硬明膠膠囊、栓劑、無菌注射液，以及包裝粉末。

本發明之組合物可透過任何生理上可接受的途徑遞送，例如口服、腸胃外（例如，肌肉內、靜脈內、皮下，以及腹膜內）、透皮、栓劑，以及鼻內方法。關於腸胃外給藥，較佳為以無菌水溶液的形式使用，其可包含足以使溶液與血液等滲的其他物質，例如鹽類或葡萄糖。水溶液可根據需要適當緩衝（例如，pH值為3至9）。可使用本領域技術人員熟知的標準藥理學技術在無菌條件下製備合適的非腸道組合物。

為了實施本文公開之方法，可透過合適的途徑將一有效量的組合物，例如本文所述之醫藥組合物，包含IL-17RB拮抗劑施用於一需要治療的個體（例如，人類）。本文所用之「有效量」乙詞係指在治療對象或細胞中賦予所需生物效應的活性成分的量。該有效量可根據各種原因而改變，例如給藥途徑及頻率、接受該藥物的個體的體重與物種，以及給藥目的。本領域技術人員可根據本文之公開內容、確定的方法以及他們自己的經驗確定每種情況下的劑量。

待透過本文所述方法治療的個體可為哺乳動物，更佳為人類。哺乳動物包括，但不限於，農場動物、運動動物、寵物、靈長類動物、馬、狗、貓、小鼠，以及大鼠。需要治療的人類個體可為患有、處於危險中或懷疑患有例如癌症的目標疾病/病症的人類患者。懷疑患有任何此類目標疾病/病症的個體可能表現出該疾病/病症的一種或多種症狀。處於疾病/病症風險中的對象可為具有該疾病/病症的一種或多種風險因素的對象。

於某些具體實施例中，該異常的IL-17RB活化與增殖障礙有關，例如癌症及其轉移。

於某些具體實施例中，該癌症選自肺癌、胰臟癌、乳癌、大腸直腸癌、肝癌、腎癌、頭頸癌、食道癌、胃癌、膽道癌、膽囊及膽管癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮體癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸腫瘤、成骨及軟組織肉瘤、血癌、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、皮膚癌、腦瘤，以及惡性胸膜間皮瘤。

於一特定實施例中，該癌症為乳癌。於另一特定實施例中，癌症為胰臟癌。

本發明還基於將磷酸化IL-17RB的鑑定作為癌症預後不良的標記。如以下實施例所示，觀察到相較於磷酸化IL-17RB蛋白表現量較低的患者，具有較高磷酸化IL-17RB蛋白表現量的胰臟癌患者具有較低的存活率以及較高的腫瘤轉移。

因此，本發明提供一種基於磷酸化IL-17RB蛋白含量的預測癌症例如胰臟癌預後之方法。

如本文所用，本文所用之術語「預後」通常係指預測臨床狀況或疾病的可能過程及結果。通常透過評估指示疾病的有利或不利進程或結果的疾病因子或症狀來做出患者的預後。可以理解的是，「預後」乙詞不一定是指以100%準確度預測疾病的進程或結果的能力。相反的，本領域技術人員將理解「預後」係指某個過程或結果將發生的概率增加；亦即，相較於沒有表現出一給定病症的個體，表現出該給定病症的患者更有可能發生病程或結果。可以理解的是，正向預後通常係指有益的臨床結果或前景，例如長期存活而不會有個體的癌症復發的狀況，而負面（不良）預後通常係指負面的臨床結果或前景，例如癌症的復發或進展。於某些具體實施例中，負面預後係選自降低的存活率、增加的腫瘤大小或數量、增加的轉移風險、增加的復發風險及其任何組合。

於某些具體實施例中，本發明之方法包括測量獲自一癌症患者的樣品中磷酸化IL-17RB蛋白的表現量（特別是位置Y447的磷酸化），並基於該樣品中磷酸化IL-17RB蛋白的表現量確定患者的癌症預後，其中該樣品中磷酸化IL-17RB蛋白表現量的升高表示預後不良。

如本文所用，升高的表現量係指與未罹癌的個體或參考的表現量或對照表現量相比增加的表現量。例如，升高的表現量可比一參考或對照表現量高10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%以上。參考或對照表現量可指在正常個體或樣品類型（例如未患病的組織或細胞）中測量的表現量。

如本文所用，本文所用之生物標記的「低表現」與「高表現」係指在樣品中發現的生物標記表現量的相對術語。於某些具體實施例中，可基於樣品中此類生物標記的表現高於（高）或低於（低）一癌症患者群體中的平均或中值表現量，而指定每個樣品的表現量為低或高。通常，所選擇的癌症患者群體與候選個體的例如年齡及/或種族背景相匹配。較佳為，這樣的癌症患者群體與候選個體屬於同一物種。於某些具體實施例中，低表現可定義為組織切片中細胞群陽性染色的百分比小於30%、20%、10%或5%，而高表現定義為組織切片中細胞群陽性染色的百分比多於30%、20%、10%或5%。

為了實施本文所述之方法，可從一有需要的個體獲得一生物樣品，並可透過本領域已知的任何方法例如免疫分析來檢測或測量該生物樣品中的標記。如在來自候選對象的生物樣品中檢測到的較高表現量的標記可指示該候選對象具有癌症的負面預後。於某些實施例中，對照樣品中的標記含量在對照樣品中是無法檢測到的（亦即，參考值為0），且在來自一個體的生物樣品中檢測到標記的存在可表示該個體具有癌症的負面預後。於某些實施例中，可在不同時間點測量標記的含量以監測癌症的進展。例如，在兩個不同時間點從候選對象獲得兩個生物樣品。若觀察到標記含量隨時間增加的趨勢，例如，較晚獲得的樣品中的標記含量高於較早獲得的樣品中的含量，則認為該個體具有癌症進展。

於某些具體實施例中，本發明之方法包括（a）測量在第一時間點自該患者所獲得的第一生物樣品中的磷酸化IL-17RB蛋白的含量；（b）測量在第二時間點自該患者所獲得的第二生物樣品中的磷酸化IL-17RB蛋白的含量；以及（c）基於該第一及第二生物樣品中的含量確定該患者的癌症進展，其中相較於該第一生物樣品，該第二生物樣品中的磷酸化IL-17RB蛋白含量升高表示癌症進展。

於某些具體實施例中，生物標記的存在及/或量可透過免疫分析來確定。免疫分析的實例包括，但不限於，西方墨點分析、酵素連結免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）、放射免疫沉澱分析（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）、免疫螢光分析（immunofluorescence assay，IFA）、酵素連結螢光免疫分析（enzyme-linked fluorescent immunoassay，ELFA）、電化學發光分析（electrochemiluminescence，ECL），以及毛細管凝膠電泳（Capillary gel electrophoresis，CGE）。於某些實施例中，一生物標記的存在及/或含量可使用特異性識別該生物標記的試劑來確定，例如特異性結合該生物標記的抗體。

於其他具體實施例中，可透過測量一種或多種基因的mRNA含量來確定生物標記的存在及/或量。基於使用特異性識別該基因的核苷酸序列的引子或探針的分析可用於測量，包括，但不限於，反轉錄酶-聚合酶連鎖反應（reverse transcriptase - polymerase chain reaction，RT-PCR）以及原位雜交（in situ hybridization，ISH），其程序在本領域中是習知的。本領域技術人員可基於目標核酸區域而易於設計並合成引子或探針。應當理解的是，考慮到本領域公開的目標基因的核苷酸序列，可使用任何合適的方法設計用於本發明之合適的引子或探針。

本文所用之抗體可為多株或單株。針對特定蛋白質的多株抗體的製備方法如下：對合適的實驗動物注射有效量的胜肽或抗原成分，從該動物身上收集血清，並透過任何已知的免疫吸附技術分離特定的血清。能容易地用於產生如本發明所用之多株抗體的動物包括雞、小鼠、兔、大鼠、山羊、馬等。於一實施例中，抗Y447位置上磷酸化IL-17RB的抗體被用於進行本發明之方法。

當例如人類患者的個體被診斷為具有負面預後時，該個體可進行進一步的測試（例如，常規身體檢測，包括外科活組織檢驗或成像方法，例如X射線成像、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）或超音波）以確認疾病的發生及/或確定癌症的階段及進展。

於某些具體實施例中，本文所述之方法可進一步包括治療癌症患者以至少緩解與疾病相關的症狀。治療可為任何常規的抗癌療法，包括放射療法、化學療法，以及手術。

本發明透過以下實施例進一步說明，提供這些實施例之目的係為說明而非限制。本領域的技術人員應該根據本發明內容理解在不脫離本發明的精神及範圍的情況下，可對所公開的具體實施例進行許多改變並仍然獲得相似或類似的結果。

實施例

細胞激素17（IL-17）細胞激素家族及其受體（IL-17R）的成員在幾十年前就已被確定。與IL-17RB、-C與-D異二聚化並調節促進發炎基因表現的IL-17受體A（IL-17RA）不同，IL-17B/IL-17RB在促進腫瘤生長及轉移方面具有獨特的作用。然而，IL-17RB的致癌訊息如何啟動並傳播的分子基礎尚不清楚。於此，本案發明人報導IL-17RB形成同型二聚體並募集MLK4（一種雙重激酶），在以IL-17B配體處理後在酪胺酸447位置上將其磷酸化。酪胺酸磷酸化的IL-17RB在預後不良的胰臟癌病例的細胞中含量較高，其募集泛素連接酶TRIM56。TRIM56將K63連接的泛素鏈添加至IL-17RB的離胺酸470位置上，進一步組裝Act1與其他因子以傳播下游致癌訊息。一致地，Y447F與K470RIL-17RB突變體都失去這種致癌活性。以由IL-17RB的第403-416個胺基酸組成的特定胜肽處理可阻斷MLK4結合、Y447磷酸化，以及K470泛素化，進而抑制腫瘤發生及轉移，並延長胰臟腫瘤小鼠的壽命。這些結果不僅建立IL-17RB近端訊息傳導如何發生的明確途徑，並且還提供了對該途徑在許多胰臟癌及乳癌中的臨床意義的深入了解。

1. 材料與方法

1.1細胞培養、轉染與試劑處理

人類胚胎腎細胞株HEK293T、人類胰臟癌細胞株AsPC-1、BxPC-3、CFPAC-1、人類乳癌細胞株MDA-MB-361與MDA-MB-468購自ATCC，並培養於補充有5% CO ₂的37℃培養箱。本文所使用的這些細胞株均未列入NCBI Biosample誤認細胞株資料庫中，購買後也未進行進一步鑑定。HEK293T、AsPC-1、MDA-MB-361以及MDA-MB-468細胞在Dulbecco氏改良Eagle氏培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）中培養，BxPC3細胞在RPMI-1640培養基中培養，CFPAC1細胞在Iscove氏改良Dulbecco氏培養基中培養（Iscove's Modified Dulbecco's Medium，IMDM）。所有培養基均添加10%胎牛血清、青黴素以及鏈黴素（分別為100 IU/ml與100 μg/ml），以及1x非必需胺基酸。所有培養基及補充試劑均購自Gibco公司（Thermo Fisher Scientific公司）。透過DAPI染色以及e-Myco黴漿菌PCR偵測套組（Bulldog Bio.公司）定期檢查這些細胞株是否受黴漿菌污染。根據製造商的說明，使用TransIT-LT1轉染試劑（MIR 2300，Mirus Bio公司）將質體短暫轉染到細胞中。

泛混合譜系激酶（Pan-mixed lineage kinase，Pan-MLK）抑制劑 CEP-1347購自Tocris Bioscience公司。TAT _48-57（對照）以及TAT-IL-17RB _403-416（環胜肽）的胜肽購自TOOLs公司，純度＞95%。為了評估IL-17B對IL-17RB訊息傳導的影響，將細胞在無血清培養基中培養2小時，然後加入50 ng/ml的rIL-17B以消除內源性IL-17B的干擾。

1.2 共免疫沉澱（Co-IP）分析以及免疫墨點分析

如前所述製備全細胞裂解物（ 6 、 7）。簡言之，將500 μg粗全細胞萃取物與5 μg抗IL-17RB抗體（FGRB，自家生產的小鼠多株抗體）或對照正常小鼠IgG抗體（mIgG，015-000-003，Jackson ImmunoResearch公司）於4℃下作用過夜。然後，將50 μl預洗過的蛋白A/G瓊脂糖珠（sc-2003，Santa Cruz Biotechnology公司）添加到該混合物中，並於4℃下輕輕攪拌作用2小時。針對相互共免疫沉澱，將全細胞萃取物與抗Flag M2瓊脂糖（A2220，Sigma-Aldrich公司）或抗HA（HA-7）瓊脂糖（A2095，Sigma-Aldrich）於4℃下輕輕攪動作用2小時。在以稀釋的裂解緩衝液（0.01% Triton X-100）充分洗滌後，透過免疫墨點分析法分析IL-17RB及其相關蛋白。Bradford分析法（Bio-Rad公司）用於確定蛋白質濃度。

在透過梯度SDS-PAGE（HR梯度凝膠溶液，TFUGG420，TOOLS公司）分離蛋白質並轉移到PVDF膜上後進行免疫墨點分析，以稀釋的一級抗體作用過夜，然後以稀釋的辣根過氧化物酶綴合的抗兔、抗小鼠或抗山羊抗體（Jackson ImmunoResearch公司）作用，如（ 48-50）所述。自家生產抗IL-17RB（A68）的小鼠單株抗體以及兔抗P-Y447多株抗體。使用的其他一級抗體包括來自Sigma-Aldrich公司的抗磷酸絲胺酸（P5747）抗體、抗Flag抗體（選殖株M2）以及抗HA抗體（選殖株HA-7），來自GeneTex公司的抗磷酸蘇胺酸抗體（選殖株RM102）、抗AAK1抗體（GTX59663）、抗HIPK1抗體（選殖株C3），以及抗GAPDH抗體（GTX627408），來自Merck公司的抗磷酸酪胺酸抗體（選殖株PY20），來自Cell Signaling公司的抗p-ERK1/2抗體（4370）以及抗ERK1/2抗體（4695），來自Abcam公司的抗MLK4抗體（ab93798），來自Bethyl Labs公司的抗6-His標籤抗體（A109-114）。使用Clarity ^TMWestern ECL墨點基質以及ChemiDoc ^TM成像系統（Bio-Rad公司）偵測免疫墨點訊息。使用美國國家衛生研究院ImageJ程式確定光密度。

1.3 質體、反轉錄病毒以及慢病毒之製備

如前所述（ 6 、 7），將Retro-neo對照以及IL-17RB選殖到反轉錄病毒載體中。根據製造商的說明，使用QuickChange XL定點誘變試劑盒（200516，Agilent公司）生成IL-17RB突變體，包括Y338F、Y350F、Y443F、Y447F、Y457F，以及Y466F。WT與突變體pQCXIP-IL-17RB質體分別與pMD.G（Env編碼載體）共轉染至Gp2-293細胞中，以產生攜帶IL-17RB的反轉錄病毒。

在pCMV6-Entry中選殖的Flag-MLK4與Flag-IL-17RB購自OriGene公司。將全長IL-17RB次選殖至pcDNA3.1質體的EcoRI/EcoRV位點以表現C端HA標記的IL-17RB。IL-17RA-His為透過在pCNA3.1+/myc-His A載體的HimDIII位點以及BamHI位點插入IL-17RA的cDNA所構築的。TRIM56-HA係透過在pCNA3.1+/C-HA載體的HimDIII位點以及BamHI位點插入TRIM56的cDNA所構築的。所有pcDNA3-His-泛素選殖株均由台灣中央研究院生物化學研究所的陳瑞華博士友情提供。

Flag標記的IL-17RB突變體（FNmut以及Y447F），HA標記的IL-17RB突變體（ΔH346~F354、ΔI373~T384、ΔV403~S416、ΔF423~F430、S423~F430、ΔN458~V462、ΔK470~Q484，以及ΔQ484 ~ S502）、MLK4突變體（Δ100-108、E314K與Y330H），以及TRIM56突變體（Δ31-50）亦使用QuickChange XL定點誘變套組（200516，Agilent公司）生成。

pLKO.1-shLacZ、shMLK4（TRCN3212與TRCN3213的混合物）、shAAK1（TRCN1945與TRCN1945的混合物）、shHIPK1（TRCN7163與TRCN7165的混合物）、TRIM56（TRCN73094、73096）、ACT1（TRCN162747、163987），以及TRAF6（TRCN7349、7350、7351、7352）的慢病毒shRNA表現載體，包裝質體pCMVΔR8.91與pMD.G獲自中央研究院國家RNAi核心設施（台北，台灣）。對於慢病毒生產，如（ 7）所述，以表現不同shRNA的5 μg pLKO.1-puro慢病毒載體以及0.5 μg包膜質體pMD.G與5 μg包裝質體pCMVΔR8.91轉染293T細胞。轉染後48小時收集病毒。為了建立以IL-17RB或MLK4耗盡的細胞，以含有相應shRNA的慢病毒，包括AsPC1、BxPC3、CFPAC1、MDA-MB-361，以及MDA-MB-468，感染不同的細胞株24小時，然後以適當的抗生素進行篩選。

1.4 胰臟癌細胞中IL-17RB、MLK4以及TRIM56基因的基因組編輯

為了在BxPC3細胞中的IL-17RB、MLK4與TRIM56中引入DNA雙鏈斷裂修復依賴性基因缺失或突變，本案發明人使用獲自中央研究院國家RNAi核心設施（台北，台灣）的RNA引導的核酸內切酶（RNA‐guided endonucleases，RGENs）系統以表現Cas9核酸內切酶，且設計並提供了以IL-17RB、MLK4與TRIM56為目標的引導RNA（gRNA）序列。按照製造商的說明，使用TransIT-LT1轉染試劑（MIR 2300，Mirus Bio公司）以10 μg的每種質體轉染BxPC3細胞。轉染2天後，本案發明人進行有限稀釋以獲得單細胞選殖株，並透過免疫墨點分析測量這些基因的表現。

1.5 RNA分離、反轉錄、即時RT-PCR檢測

使用Trizol試劑（Thermo Fisher Scientific）從培養的細胞與腫瘤組織中分離總RNA，並根據製造商的說明以轉錄子第一股cDNA合成套組（Roche Life Science公司）進行反轉錄以用於基因表現分析。根據製造商的說明，使用KAPA SYBR FAST qPCR套組（Kapa Biosystems公司）在StepOnePlus系統（Applied Biosystems公司）上運行定量即時RT-PCR分析，並透過StepOne軟體第2.2.2版分析數據。以β-肌動蛋白的mRNA作為內部對照。根據（ 7）所述之相對ΔCt方法計算表現量。

1.6 軟瓊脂集落形成分析及侵入試驗

如（ 7）所述進行軟瓊脂集落形成分析。簡言之，將2500~10000個細胞接種在12孔盤中的0.5%瓊脂/完全生長培養基層上的0.35%瓊脂/完全生長培養基層中。每三天補充一次含有指定濃度的rIL-17B（R&D公司）、DMSO（Sigma-Aldrich公司）或CEP-1347（Tocris Bioscience公司）的細胞培養基。在接種後第14天或第21天，將細胞固定並以含有0.05%結晶紫的純乙醇（Sigma-Aldrich公司）染色。透過光學顯微鏡對尺寸大於50 μm的結晶紫染色集落進行計數並客觀分析。

針對侵入分析，在含有rIL-17B、DMSO或CEP-1347的無血清培養基中，將大約10 ⁴個細胞接種在含有Matrigel塗層膜（24孔BD Falcon HTS Fluoro Block insert；孔徑，8 µm；BD Biosciences公司）的頂室中。以補充有10%血清的培養基作為下室中的化學引誘劑。作用24或48小時後，以甲醇固定侵入的細胞，以4,6-二脒基-2-苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色並透過螢光顯微鏡計數。

1.7 質譜分析

血清飢餓2小時後，在無血清條件下，以50 ng/ml rIL-17B或牛血清白蛋白處理CFPAC1細胞30分鐘。然後，去除培養基並以PBS清洗細胞。以溶解在PBS中的交聯劑DSP（Thermo Fisher Scientific公司）處理細胞30分鐘，然後透過添加Tris緩衝液（50 mM，pH 8.0）停止反應。收集全細胞裂解物並與抗IL-17RB抗體一起作用以進行共免疫沉澱。透過SDS-PAGE分離與IL-17RB相互作用蛋白，按照標準程序對來自SDS-PAGE的蛋白條帶進行凝膠內胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶消化，然後進行質譜分析。如（ 48）所述進行分析程序及數據分析。簡言之，將酶消化的蛋白質樣品注射到自包裝的預備管柱（150 μm I.D. x 20 mm、5 μm、200 Å）上。使用0.1%甲酸水溶液（流動相 A）以及0.1%甲酸80%乙腈溶液對自填充反相C18奈米管柱（75 μm I.D. ×300 mm，5 μm，100 Å）進行色層分析分離（流動相B）。以300 nL/分鐘的流速自5-45%流動相B使用線性梯度40分鐘。電噴霧電壓為2 kV，毛細管溫度為200℃。掃描週期以在FT-ICR質譜儀上進行的全掃描調查MS光譜（m/z 300-2,000）開始，在400 Da時分辨率為100,000。在該掃描中檢測到的十個最豐富的離子在LTQ質譜儀中進行MS/MS實驗。全掃描以及MS/MS的離子累積（自動增益控制目標數）以及最大離子累積時間分別設置為1 x 10 ⁶個離子，1,000 ms與5 x 10 ⁴個離子，200 ms。離子透過使用碰撞誘導解離（collision-induced dissociation，CID）進行碎片化，標準化碰撞能量設置為35%，活化Q設置為0.3，活化時間為30毫秒。

1.8 透過免疫沉澱分析IL-17受體的寡聚化

根據製造商的說明，使用TransIT-LT1轉染試劑（MIR 2300，Mirus Bio公司）將BxPC3IL-17RB-KO細胞與IL-17RB-HA、IL-17RB-Flag與IL-17RA-His質體短暫共轉染。然後將細胞以不同濃度的rIL-17B或rIL-17E處理一段指定的時間，並使用如上所述之不同抗體裂解細胞進行共免疫沉澱分析。

1.9 Duolink原位相互作用分析

DuoLink鄰近連接分析（proximity ligation assay，PLA）套組（DuoLink，DUO92101，Sigma-Aldrich公司）用於使用螢光顯微鏡檢測蛋白質-蛋白質相互作用，如製造商的方案中所述。簡言之，在血清飢餓2小時後，以指定濃度的rIL-17B在八室顯微鏡載玻片中處理胰臟癌細胞30分鐘，在室溫下以4%多聚甲醛固定15分鐘，以0.2% Triton X-100透化並於37℃下以DuoLink阻隔緩衝液進行阻隔30分鐘。然後將細胞與在DuoLink抗體稀釋劑中稀釋的一級抗體一起作用1小時。這些不同的一級抗體組用於每個不同的實驗；在圖3F中使用抗IL-17RB（FGRB，自製）以及MLK4（Abcam公司，ab93798，兔）的抗體，以及在圖4C與圖13D中使用抗Flag標籤（Sigma-Aldrich公司，F7425，小鼠）以及HA標籤（Sigma-Aldrich公司，HA-7，兔）抗體，在圖4D中使用抗IL-17RB（D9）天然形式的抗體。之後，清洗細胞並於37℃下與攜帶PLA探針的物種特異性二級抗體進一步作用1小時以進行雜交，這在兩個互補寡核苷酸的存在下緊密接近（＜16 nm）促進雜交。在黏合與循環擴增後，加入由螢光標記的寡核苷酸組成的檢測溶液，並以Fluoroshield with DAPI（GeneTex公司）固定載玻片。該訊息在德克薩斯紅色通道中被檢測為不同的螢光點。透過共聚焦光譜顯微鏡（Leica SP2/SP8X）獲得顯微影像，並透過LAS AF軟體（Leica Biosystems公司）進行分析。陰性對照由如上所述處理但僅使用二級抗體的樣品所組成。

1.10 免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）

甲醛固定石蠟包埋的原發性腫瘤組織切片用於IHC。使用0.1M檸檬酸鹽緩衝液，pH 6.0進行熱誘導抗原修復，並高壓滅菌20分鐘。以3% H ₂O ₂消除內源性過氧化物酶。載玻片分別以自家生產的抗IL-17RB抗體（A81，1:2000）以及抗P-Y447抗體（1:500）在PBS/10% FBS中於4℃下染色過夜。清洗後，將載玻片與抗兔/小鼠HRP聚合物一起作用，然後以來自Dako REAL EnVision（卡本特利亞市，加州）的液體二胺基聯苯胺四鹽酸鹽加基質DAB色原進行觀察。所有載玻片都以蘇木精複染。

1.11 用於驗證預後標記的回顧性隊列研究

為了獨立驗證P-Y447 IL17RB作為預後標記，使用2007年至2015年於國立台灣大學醫院（National Taiwan University Hospital，NTUH）接受手術切除的87名胰臟癌患者的獨立隊列。胰臟癌標本取自接受胰臟十二指腸切除術並經病理證實為PDAC的患者。驗證隊列中患者的臨床特徵列於表4。本文根據 REMARK指南報告臨床相關性數據。

1.12 以流式細胞儀分析的腫瘤浸潤分析

切除腫瘤，稱重並測量。每個解剖腫瘤的大約一半固定在甲醛中用於組織病理學分析。將剩餘的腫瘤切片置於含1%（v/v）FBS的PBS中並以機械切碎。在含有溶解於Hanks平衡鹽溶液（Hanks' Balanced Salt Solution，HBSS）的0.4 mg/mL膠原酶P與0.1 ng/mL DNase I的溶液中，於37℃下進一步解離切碎的腫瘤30分鐘。將這些細胞沉澱重新懸浮於PBS中，並使用BD Bioscience（聖荷西市，加州，美國）提供的以下抗體對流式細胞儀分析進行染色，以根據其細胞表面標記鑑定免疫及腫瘤細胞亞群。使用以下單株抗體與試劑：BUV395抗CD45抗體（選殖株30-F11）、PerCP-Cy5.5抗CD4抗體（選殖株GK1.5）、APC-H7抗CD8a抗體（選殖株53-6.7）、Alexa Fluor647抗FoxP3抗體（選殖株MF23）、PerCP-Cy5.5抗CD11b抗體（選殖株M1/70）、APC-H7抗Ly6G抗體（Gr1、選殖株1A8）、APC-H7抗CD11c抗體（選殖株HL3）、PerCP-Cy5.5抗NK1.1抗體（選殖株PK136）、Alexa Fluor647抗F4/80抗體（TA45-2342）以及Alexa Fluor647抗CD206抗體（選殖株MR53D）。以BD Biosciences LSRII（富蘭克林湖，紐澤西州，美國）流式細胞儀進行流式細胞儀分析，數據由FlowJo軟體（阿什蘭，奧勒岡州，美國）分析。

1.13 人體研究

所有胰臟癌患者的資料及組織標本均來自台灣台北的國立台灣大學醫院（NTUH）（表3與表4），經NTUH機構審查委員會（201701015RINA）核准。

1.14 動物研究

本文描述之所有動物實驗均經台灣中央研究院（IACUC#16-03-945）以及中國醫藥大學（IACUC#2017-015）機構動物照護暨使用委員會核准。約8-12週齡的雄性小鼠以無偏見的方式隨機分組。在實驗與結果評估期間，研究人員對組別分配不知情。基於初步實驗，評估樣品量以在每組中提供足夠數量的小鼠用於統計分析。

針對自發性胰臟癌模型；攜帶Cre依賴性條件性敲入突變KrasG12D的Kras+/LSLG12D小鼠（B6;129-Kras2）獲自人類癌症聯盟的小鼠模型（ 48）。Kras+/LSLG12D小鼠與獲自Level Transgenic Center（台北，台灣）（ 33-35 、 49）的Elas-CreER小鼠進行繁殖，以產生Elas-CreER ^T;Kras+/LSLG12D小鼠。為了在腺泡細胞中誘導Kras+/LSLG12D的表現，將5週齡的Elas-CreER ^T; Kras+/LSLG12D雄性小鼠每週3次腹腔注射游離鹼他莫昔芬（20 mg/mL 溶於玉米油中；Sigma-Aldrich公司）（3次注射，每次2 mg），持續1週。然後將這些小鼠每週六次腹膜內注射藍皮素（50 μg/mL溶於PBS中；BACHEM公司）（六次注射，每次5 μg），持續三週，以誘導慢性發炎與腫瘤。以PBS、TAT胜肽（對照）或TAT-IL-17RB403-416胜肽對動物進行腹膜內注射，並監測其壽命及腫瘤大小。

針對原位胰臟癌模型，將表現GFP/Luc的人類胰臟腫瘤細胞注射至六週齡的NOD-SCID雌性小鼠中。首先使用連續異氟醚對這些小鼠進行麻醉，並對它們的腹部進行消毒。然後，在腹部左上腹進行剖腹手術（5-10毫米）以暴露腹膜腔。將胰臟置於無菌區域，透過30號針頭（Covidien公司）將懸浮在25 μl無菌PBS中的無菌PBS或5 x 10 ⁵個胰臟腫瘤細胞注射至胰臟尾部。透過在注射部位形成液體泡且液體洩漏量最少來確認是否注射成功。然後將胰臟輕輕放回腹膜腔。然後以5-0 PDS II紫色縫線（Ethicon公司）閉合腹膜，並使用AutoClip系統（Braintree Scientific公司）閉合皮膚。使用IVIS Spectrum活體內影像系統（PerkinElmer公司）評估並分析體內生物發光訊息。

1.15 研究設計

本發明研究之目的為闡明IL-17受體B與其配體IL-17B結合的致癌訊息傳導途徑的近端轉導機制。透過以針對修飾殘基的抗體進行免疫墨點分析來尋找受體磷酸化而獲得第一條線索。製備抗Y447磷酸化IL-17RB的特異性抗體，並用於透過蛋白質組學分析尋找負責的激酶。MLK4被鑑定為磷酸化IL-17RB的激酶，並透過標準致癌活性分析驗證其重要性。接下來，透過缺失分析繪製IL-17RB的MLK4結合位點，並透過環胜肽在小鼠模型中阻斷相互作用並抑制惡性腫瘤以進行驗證。以類似方法探索下游訊息的進一步關鍵步驟，並鑑定泛素連接酶TRIM56用於在P-Y447之後將K63連接的泛素鏈添加到IL-17RB的離胺酸470位置上。所有實驗至少重複兩次。

1.16 統計分析

本案發明人根據該領域常用的樣品量選擇樣品量，而無需透過統計方法預先確定。除了特定免疫墨點的臨床相關性及量化外，所有數據均以平均值±SD表示，並使用雙尾學生氏t檢定比較對照組及處理組。星號（*）以及（**）分別表示p值＜ 0.05 以及＜ 0.01的統計顯著性。使用GraphPad Prism 6與SPSS統計軟體進行以下分析。採用Kaplan-Meier估算法對荷瘤小鼠進行總體生存分析，並採用對數秩檢定比較差異。

2. 結果

2.1 Y447的磷酸化對IL-17B/IL-17RB致癌訊息轉導相當重要

為了探索IL-17B/IL-17RB訊息傳導如何啟動的分子基礎，本案發明人採用一種雙管齊下的方法，即識別IL-17RB的轉錄後修飾（post-transcriptional modification，PTM）殘基並透過蛋白質組學分析尋找其相互作用的酶。由於大多數細胞表面受體的最早反應為配體結合後的磷酸化，本案發明人首先測試了IL-17RB在IL-17B刺激後是否在酪胺酸、絲胺酸或蘇胺酸殘基處被磷酸化。如圖1A所示，在添加IL-17B的5分鐘內觀察到IL-17RB的酪胺酸磷酸化增加，但絲胺酸或蘇胺酸沒有增加（圖1A），這表示IL-17RB的酪胺酸磷酸化對訊息傳導很重要。為了確定哪個酪胺酸殘基被磷酸化，本案發明人將胞內結構域（intracellular domain，ICD）中的六個酪胺酸殘基中的每一個分別改變為苯丙胺酸（F）（圖1B）。本案發明人在IL-17RB敲除胰臟癌細胞中表現了野生型以及六個突變體，其中細胞激素基因表現與相關的侵入性表型均低於親本細胞（圖8A-8D），並發現Y447F突變體失去由IL-17B誘導的酪胺酸磷酸化（圖1C）。跨物種分析顯示Y447在哺乳動物中高度保守（圖9A）。因此，本案發明人產生一種兔抗IL-17RB（P-Y447）抗體，識別Y447磷酸化（圖1D），並證明IL-17RB的Y447磷酸化以劑量依賴性方式被IL-17B上調（圖1E）。因此，本案發明人評估這些細胞的下游訊息傳導，包括ERK1/2磷酸化、細胞激素基因表現以及致癌行為，發現只有表現Y447F的細胞表現出IL-17B誘導的ERK1/2磷酸化降低（圖1F與圖9B）、細胞激素基因表現（圖1G與圖9C），以及與WT對照相比的集落形成（圖1H與圖9D）。這些結果表示Y447的磷酸化對於IL-17B/IL-17RB致癌訊息轉導相當重要。

2.2 磷-IL-17RB（P-Y447）的豐度與胰臟癌的惡性腫瘤及更差的預後相關

為了確定IL-17RB Y447磷酸化的臨床意義，使用抗磷酸化-IL-17RB（P-Y447）抗體（圖2A）進行免疫組織化學（IHC）。在細胞膜上檢測到P-Y447（圖10A-10B），並與透過抗IL-17RB [A81]的單株抗體所評估的IL-17RB的表現相關（表1與圖10A）。

表1. 87例胰臟癌患者IL-17RB的表現與IL-17RB磷酸化（P-Y447）的相關性。

		磷-IL-17RB（P-Y447）
IHC染色	總數	低，n (%)	高，n (%)	P值
	87	59 (68)	28 (32)
IL-17RB (A81)
低	51	51 (100)	0 (0)	P ＜ 0.001
高	36	8 (22)	28 (78)

重要的是，大量P-Y447 IL-17RB與胰臟癌患者總體生存期較差的預後相關（圖2B），因此P-Y447可能是獨立的預後生物標記（表2與表3）。

表2. 87例胰臟癌患者的總生存期。使用卡方檢定。

變數	患者數(%)	危險機率 (95%信賴區間)	P值
單變量：
磷-IL-17RB：高（vs.低）	28 (32)	1.963 (1.209-3.190)	0.007
多變量 ^§：
磷-IL-17RB：高（vs.低）	28 (32)	2.314 (1.276-4.196)	0.006

§ 調整了年齡、性別、T值、N值、AJCC分期、邊緣參與、淋巴血管侵入，以及神經周圍侵入的癌症臨床與病理參數（表4）。

表3. IL-17RB磷酸化對總生存期影響的單變量及多變量Cox回歸分析。

變數	患者數(%)	危險機率 (95%信賴區間)	P值
單變量：
P-Y447：高（vs.低）	28 (32)	1.963 (1.209-3.190)	0.007
多變量 ^§：
P-Y447：高（vs.低）	28 (32)	2.314 (1.276-4.196)	0.006
年齡：＞= 60歲（vs.＜60歲）	55 (63)	1.145 (0.672-1.950)	0.618
性別：男（vs. 女）	52 (60)	1.178 (0.688-2.018)	0.551
T值：III （vs. II）	76 (87)	1.263 (0.473-3.372)	0.642
N值：陽性（vs. 陰性）	50 (57)	1.005 (0.548-1.841)	0.988
AJCC分期：IIA & IIB （vs. IA & IB）	82 (94)	1.392 (0.306-6.336)	0.668
分級			0.015
II （vs. I）	59 (67)	0.768 (0.370-1.597)
III （vs. I）	12 (14)	2.190 (0.905-5.299)
邊緣參與：參與（vs. 未參與）	17 (20)	1.990 (1.005-3.940)	0.048
淋巴血管侵入：陽性（vs. 陰性）	60 (69)	0.706 (0.388-1.287)	0.256
神經周圍侵入：陽性（vs. 陰性）	79 (91)	1.857 (0.702-4.913)	0.212

手術治療後胰腺癌患者共87例。

此外，具有高P-Y447表現的腫瘤標本分化差（表4），且在小鼠異種移植模型中具有更高的形成腫瘤的潛力（表5）。

表4. 胰臟腫瘤樣品中IL-17RB的高P-Y447表現與患者更差的臨床進展相關。

		磷-IL-17RB（P-Y447）
臨床參數	總數	低表現(%)	高表現(%)	P值
年齡	87	59 (68)	28 (32)
＜ 60	32	20 (63)	12 (37)	0.418
＞= 60	55	39 (71)	16 (29)
性別
男	35	235 (77)	10 (23)	0.554
女	52	34 (65)	18 (35)
T值
II	11	6 (55)	5 (45)	0.313
III	76	53 (70)	23 (30)
N值
陽性	37	25 (68)	123 (32)	0.966
陰性	50	34 (68)	16 (32)
分期 (AJCC)
IA & IB	5	2 (40)	3 (60)	0.170
IIA & IIB	82	57 (70)	25 (30)
分級（分化）
I（好）	16	16 (100)	0 (0)	0.007
II（中等）	59	37 (63)	22 (37)
III（差）	12	6 (50)	6 (50)
邊緣參與
未參與	70	49 (70)	21 (30)	0.397
參與	17	10 (59)	7 (41)
淋巴血管侵入
陰性	27	20 (74)	7 (26)	0.402
陽性	60	39 (65)	21 (35)
神經周圍侵入
陰性	8	6 (75)	2 (25)	0.648
陽性	79	53 (67)	26 (33)

皮爾森氏卡方 (χ2) 檢驗用於分析相關性。

表5. 44例胰臟癌病例中P-Y447在癌細胞中的表現與來自患者的異種移植物中的腫瘤形成之間的相關性。

		自患者的異種移植物
IHC染色	總數	無腫瘤 n (%)	腫瘤形成 n (%)	P值
	44	26 (59)	18 (41)
磷-IL-17RB（P-Y447）
低	26	21 (81)	5 (19)	0.001
高	18	5 (28)	13 (72)

在這44名因PDX切除胰臟腫瘤的患者中（表5），復發及/或轉移（圖2C）表示與較差的術後進展相關的高IL-17RB P-Y447表現。此外，相較於原發性腫瘤，從肝轉移灶獲得的具有高P-Y447的腫瘤標本比例更大（12/17對28/87， P=0.005，圖10B）。綜合這些結果顯示，IL-17RB的P-Y447與更具臨床侵入性的胰臟腫瘤有關。

2.3 MLK4被鑑定用於IL-17RB Y447磷酸化且對於下游致癌訊息轉導相當重要

為了鑑定IL-17RB的激酶磷酸化Y-447，本案發明人進行共免疫沉澱，然後進行MS/MS分析，以鑑定在IL-17B刺激下與IL-17RB相關的蛋白質（圖3A）。在IL-17B刺激後，有126種蛋白質與IL-17RB共免疫沉澱。具有激酶活性的前三種蛋白質包括AP2相關蛋白激酶1（AAK1，登錄號（Uniprot ID）: AAK1_HUMAN）、同源結構域相互作用蛋白激酶1（HIPK1，登錄號（Uniprot ID）: HPK3_HUMAN），以及混合譜系激酶4（MLK4，亦稱為KIAA1804以及MAP3K21，登錄號（Uniprot ID）：M3LK4_HUMAN）。在IL-17B處理後，這三種蛋白質確實以劑量依賴性方式與IL-17RB相互作用（圖3B）。有趣的是，只有MLK4（圖3C）的消耗減弱了IL-17B誘導的ERK1/2磷酸化，而不是AAK1（圖11A）或HIPK1（圖11B）的消耗造成減弱。此外，基於相互共免疫沉澱分析（圖3D）以及鄰近連接分析（PLA）（圖3E），IL-17RB與MLK4在體內添加IL-17B後直接相互作用。由於MLK4為一種特徵相對較差的激酶（ 19），本案發明人透過消耗胰臟癌細胞與乳癌細胞中的MLK4表現來測試MLK4是否參與致癌訊息傳導。注意到IL-17B誘導的ERK1/2磷酸化（圖12A）、細胞激素基因表現（圖3F與圖12B）、集落形成（圖3G與圖12C），以及細胞侵入活性（圖12D）在這些MLK4敲低的癌細胞中均被消除，這表示MLK4對於IL-17RB調節的致癌途徑是必不可少的。

2.4 招募MLK4用於IL-17B誘導的致癌訊息傳導需要IL-17RB同源二聚化

據報導，IL-17RA異二聚體在特異性配體結合後啟動細胞內訊息傳導（ 20 、 21）。儘管IL-17RB與IL-17RA形成異二聚體以結合IL-17E，但尚不清楚IL-17RB是否與另一條受體鏈結合以結合IL-17B。從由IL-17B誘導的IL-17RB相互作用蛋白列表（未顯示）中，沒有發現IL-17受體家族的其他成員，這表示IL-17RB可能在IL-17B結合後同源二聚化。為了測試這種可能性，本案發明人在添加IL-17B後將帶有HA與Flag標記的IL-17RB（分別為IL-17RB-HA與IL-17RB-Flag）共轉染到IL-17RB-KO細胞中進行共免疫沉澱實驗。與增加的MLK4結合以及ERK1/2磷酸化一致，IL-17B以時間依賴性方式誘導IL-17RB同源二聚化（圖4A）。為了證實這一發現，本案發明人表現IL-17RB野生型與突變體（IL-17RB ^FNmut-Flag），其中假定的二聚化結構域（類纖網蛋白結構域2）（ 22）被截斷（圖13A），在添加IL-17B後的共免疫沉澱實驗中，以相容的量分佈在細胞表面（圖13B與圖13C）。與野生型IL-17RB不同，IL-17RB ^FNmut在刺激後未能形成同源二聚體（圖4B）。使用Duolink原位相互作用分析獲得類似的結果，該分析顯示在異位表現受體（圖4C與圖13D）或內源性條件（圖4D）下細胞膜上IL-17RB的同源二聚體的特異性相互作用。此外，消除IL-17RB二聚化不僅抑制了MLK4結合（圖4E），並且消除了IL-17B誘導的IL-17RB Y-447與ERK1/2磷酸化（圖4F）。這些結果表示，IL-17B觸發了IL-17RB的同源二聚化，用於MLK4結合以及下游訊息傳輸。

IL-17RB有兩種不同的配體：IL-17E與IL-17B（ 23 、 24）。與IL-17B不同，IL-17E與IL-17RA/IL-17RB異二聚體結合以活化Th2免疫反應（ 24-26）。為了驗證IL-17RB二聚化對IL-17B反應的特異性，本案發明人使用異位表現HA標記以及Flag標記的IL-17RB與His標記的IL-17RA的IL-17RB-KO細胞進行共免疫沉澱實驗（圖4G）。本案發明人發現IL-17B特異性誘導IL-17RB同源二聚化，而非由IL-17E結合引起的IL-17RA/IL-17RB異源二聚化（圖4G）。此外，IL-17B而非IL-17E誘導MLK4與IL-17RB結合，而非與IL-17RB ^FNmut結合（圖4E與4G）。一致地，表現IL-17RB ^FNmut的細胞消除了IL-17B誘導的細胞激素表現（圖4H與圖13E）以及集落形成能力（圖4I與圖13F）。此外，IL-17B誘導的IL-17RB同源二聚化不受MLK4消耗或Y447F突變的影響（圖14A與圖14B），表示IL-17RB的二聚化為下游訊息傳導事件的先決條件。總之，這些結果表示IL-17RB/B訊息級聯與其他IL-17受體家族成員不同。

2.5 MLK4透過與IL-17RB的柔性環結合，在Y447處特異性磷酸化IL-17RB。

MLK4屬於混合譜系激酶家族，其成員同時具有絲胺酸/蘇胺酸以及酪胺酸激酶結構域（ 19 、 27）。儘管已知MLK具有功能性絲胺酸/蘇胺酸激酶活性（ 28 、 29），但它們的酪胺酸激酶活性很少顯示。由於在IL-17B刺激下觀察到IL-17RB的磷酸化（圖1與圖13G）以及MLK4與IL-17RB的結合（圖4E與圖4G），但在IL-17E、IL-17RB中沒有被認為是MLK4的基質。如圖5A所示，MLK4的敲低（左）或敲除（右）幾乎完全消除了胰臟癌細胞與乳癌細胞中Y447處的IL-17RB磷酸化（圖5A與圖15A-15D），表示其他細胞酶可能無法替代MLK4來完成此一作用。

接下來，為了探索對MLK4結合相當重要的IL-17RB的關鍵相互作用區域，本案發明人基於小鼠IL-17rb（3vbc）的結構對人類IL-17RB的胞內結構域（ICD）進行了建模（圖16A與圖16B）。這表示ICD由五個α-螺旋、五個β-折疊以及一個柔性環組成（圖16A），且小鼠Y444（與人類Y447同源）位於ICD的表面（圖16B）。然後，本案發明人透過刪除分佈在IL-17RB ICD表面上的α-螺旋與柔性環的核心殘基構建了八個單獨的突變體（圖5B）。刪除的IL-17RB突變體以及Flag-MLK4在293T細胞中異位共表現，用於互惠共免疫沉澱實驗。ΔV403~S416突變體（Del-3）單獨消除了IL-17B誘導的IL-17RB與MLK4結合（圖5C）。為了評估Del-3的生物學活性，IL-17RB-KO胰臟癌細胞異位表現Del-3或野生型IL-17RB，並分析細胞裂解物的MLK4結合以及Y447磷酸化。Del-3未能與MLK4結合並磷酸化Y447（圖5D）。相較於對照細胞，表現Del-3的細胞不僅降低了ERK1/2磷酸化（圖5D）以及 CCL20與 TFF1的表現（圖5E），而且還降低了它們的侵入（圖5F）以及集落形成（圖5G）能力。這些結果清楚地表示，含有IL-17RB的V403~S416的柔性環對於MLK4結合以及下游致癌訊息傳導相當重要。

為了進一步評估MLK4在體外培養系統中IL-17B/IL-17RB訊息轉導中的生物學意義，本案發明人透過在MLK4-KO細胞中異位表現野生型或已知MLK4突變體（SH3突變體：del 100-108；激酶死亡突變體：E314K，Y330H）（ 30）來進行拯救實驗。野生型MLK4而非突變體的異位表現恢復了IL-17B誘導的IL-17RB Y447與ERK1/2磷酸化（圖5H）以及下游基因表現（圖5I）。此外，當本案發明人使用CEP-1347治療IL-17RB高表現的乳癌與胰臟癌細胞時，本案發明人注意到ERK1/2與IL-17RB的磷酸化（圖15A）、細胞激素基因表現（圖15B）、集落形成（圖15C）以及癌細胞的侵入特性被消除（圖15D）。這些數據進一步表示MLK4磷酸化IL-17RB的Y447的激酶活性對於IL-17B/IL-17RB致癌訊息傳導相當重要。

2.6 P-Y447IL-17RB招募TRIM56泛素連接酶將K63連接的泛素添加至IL-17RB的離胺酸470上以用於致癌訊息傳導

為了揭示P-Y447IL-17RB如何進行下游致癌訊息傳導的下一步，本案發明人進行共免疫沉澱與MS/MS分析，使用異位表達IL-17RB的WT或Y447F的IL-17RB-KO BxPC3細胞鑑定與IL-17RB的P-Y447特異性結合的蛋白質（圖6A）。在IL-17B刺激後，發現61種蛋白質與P-Y447IL-17RB相關。其中，泛素E3連接酶TRIM56（三部分模體56）受到關注，因為已知它與STING相互作用並在STING上進行K63連接的泛素化以募集TBK1以轉導下游訊號( 31)，因此可能以類似的方式調節IL-17RB。為了測試這種可能性，本案發明人進行體內（圖6B）以及體外（圖17A）結合分析，並觀察到在IL-17B刺激後，TRIM56特異性結合WT，但不結合Y447F突變體或非酪胺酸磷酸化的IL-17RB。此外，TRIM56的敲低和敲除都消除了IL-17B誘導的乳癌及胰腺癌細胞的ERK1/2磷酸化（圖6C與圖17B）、細胞激素基因表現（圖17C）、集落形成（圖17D）以及侵入（圖17E）的能力。這些結果表示TRIM56在IL-17B/IL-17RB致癌訊息傳導中具有重要的作用。

為了鑑定與TRIM56結合的IL-17RB區域，本案發明人在293T細胞中異位共表現如圖5B所示產生的8個IL-17RB突變體以及HA-TRIM56，用於互惠共免疫沉澱實驗。ΔV403~S416（Del-3）、ΔN458~V462（Del-6），以及ΔK470~Q484（Del-7）突變體在IL-17B刺激下未能結合TRIM56（圖6D）。Del-3未能按預期與TRIM56結合，因為該區域對MLK4的結合相當重要，並對Y447位置上的IL-17RB磷酸化相當重要（圖5C）。由於TRIM56結合需要Y447的磷酸化，因此Y447附近的區域（N458~V462）對於IL-17RB與TRIM56的相互作用可能很重要。為了測試這種可能性，本案發明人在293T細胞中異位表現WT與Del-6以用於共免疫沉澱實驗，並注意到Del-6不僅不能結合內源性TRIM56，而且也不能誘導ERK1/2磷酸化（圖17F）。

注意到由IL-17B誘導的IL-17RB泛素化由K63連接而非K48連接的多聚泛素組成（圖18A），且TRIM56的消耗消除了IL-17B誘導的K63連接的泛素化IL-17RB（圖6E）。為了確定IL-17RB的泛素化位點，本案發明人以精胺酸取代IL-17RB胞內結構域（圖18B）表面上的三個離胺酸殘基，以分別產生K333R、K454R以及K470R突變體。這些突變體在IL-17RB-KO細胞中異位表現。相較於在IL-17B結合後被多泛素化的WT，K470R而非K333R或K454R突變體未能被泛素化（圖6F與圖18C），表示K470為泛素化位點。這一發現可部分解釋IL-17RB的K470~Q484缺失損害TRIM56結合的觀察結果（圖6D與圖18F）。此外，純化的TRIM56可在體外對IL-17RB的K470位置進行泛素化（圖18D）。總之，這些結果表示IL-17RB在IL-17B誘導後透過TRIM56在K470位置上發生K63連接的多泛素化以進行致癌訊息傳導。

IL-17RA訊息傳導包括配體誘導的IL-17RA寡聚化、透過細胞質SEFIR結構域募集ACT1，以及活化ACT1/TRAF6/TAK1/TBK1錯合物的訊息軸（ 20 、 32）。值得注意的是，觀察到WT，而非K470R突變體，IL-17RB在IL-17B誘導時與ACT1、TRAF6與TAK1相互作用（圖6G），但具有E3連接酶活性的ACT1或TRAF6的敲低確實不影響IL-17B誘導的IL-17RB泛素化（圖18E）。一致地，IL-17RB-KO細胞中K470R突變體而非WT的異位表現未能恢復致癌訊息傳導的轉導（圖6H至圖6J），進一步表示由TRIM56造成的在IL-17RB的K470位置上的多泛素化對IL-17B/IL-17RB致癌訊息傳導相當重要。

總之，這些結果揭示了MLK4對IL-17RB的Y447磷酸化的關鍵作用，這導致在這個致癌訊息級聯中，TRIM56在K470位置上募集到多泛素化IL-17RB。

2.7 特定胜肽干擾IL-17RB與MLK4之間的相互作用而阻礙致癌訊息傳導

這種機制理解突出了以致癌訊息為目標及潛在阻斷致癌訊息的充足機會。為了進一步探索這一點，本案發明人專注於MLK4對IL-17RB的酪胺酸磷酸化的第一步。本案發明人認為含有V403~V416柔性環的胜肽可能會競爭性地抑制MLK4結合以及Y447磷酸化。因此，本案發明人合成了兩種胜肽，一種對照胜肽（TAT _48-57）以及一種環胜肽（TAT-IL-17RB _403-416）（圖7A），並證明兩種胜肽都可以進入細胞（圖19A）。然後本案發明人以這些胜肽處理異位表現Flag-MLK4以及HA-IL-17RB的細胞並進行共免疫沉澱分析。以環胜肽而非對照胜肽處理後破壞了IL-17RB與MLK4之間的相互作用（圖7B），消除了IL-17RB的酪胺酸磷酸化及泛素化，以及由IL-17B誘導的ERK1/2磷酸化（圖7C）。此外，當以環胜肽處理時，表現IL-17RB的胰臟癌細胞降低了細胞因子基因表達（圖7D與圖19B）、侵襲（圖7E與圖19C）以及集落形成（圖7F與圖19D）的能力，表示環胜肽具有阻斷致癌訊號傳導的潛力。

為了測試環胜肽（TAT-IL-17RB _403-416）的治療潛力，使用兩種胰臟癌小鼠模型。第一個模型涉及胰臟特異性KrasG12D敲除小鼠（ LSL-Kras ^G12D/+; p53 ^+/-; Ela-Cre ^ERT ；EKP小鼠）在以藍皮素處理後產生的自發性胰臟腫瘤（ 33-35）。採用兩種平行的治療方案（圖7G）。首先，本案發明人在治療方案後的第56天對小鼠實施安樂死後測量肺轉移（圖7G，上）。以環胜肽而非對照處理，減少了胰臟組織中P-Y447IL-17RB的表現（圖7H），抑制了肺轉移結節的形成（圖7I）並減少了MDSC與M2巨噬細胞的募集（比較圖20A與圖20B）。類似地，按照用於測量治療小鼠存活時間的第二種方案（圖7G，下），注意到以環胜肽治療顯著延長了壽命（圖7J）。

為了探索環胜肽在人類胰臟癌細胞中的治療潛力，本案發明人將GFP/Luc標記的CFPAC1細胞原位移植到NOD-SCID小鼠中，並透過IVIS進行體內成像以監測胰臟腫瘤的生長以及肝臟與肺臟的遠處轉移。如圖所示之方法（圖21A）。在原位植入7天後，將對照胜肽以及環胜肽注射到患有胰臟腫瘤的小鼠的腹腔中。在胰臟腫瘤中磷酸-IL-17RB的表現受到抑制（圖21B）。處理程序結束後，本案發明人透過IVIS監測腫瘤大小（圖21C）並注意到以環胜肽治療顯著阻礙了腫瘤生長（圖21D）並延長了壽命，如Kaplan-Meier生存分析所示（圖21E）。於另一組實驗中，本案發明人在第34天對小鼠實施安樂死以透過IVIS系統進行轉移分析，並注意到以環胜肽治療顯著抑制了胰臟腫瘤向肝臟及肺臟的遠處轉移（圖21F與圖21G）。

3.討論

IL-17受體家族成員以其促進發炎功能及促進腫瘤進展的發炎微環境而聞名（ 36）。然而，與其他IL-17受體不同，IL-17RB的過度表現賦予胰臟癌以及乳癌的致瘤活性。從機制上來說，IL-17RB在與IL-17B結合後形成同源二聚體，並募集MLK4磷酸化IL-17RB的Y447位置。接著，酪胺酸磷酸化的IL-17RB募集TRIM56將K63連接的泛素鏈添加至IL-17RB的K470位置上。IL-17RB的Y447或K470的突變消除了致癌訊息。這種訊息傳導機制的生物學意義透過以含有IL-17RB的胺基酸序列403-416的特定胜肽阻斷MLK4與IL-17RB的結合來進一步證明，這會導致Y477磷酸化以及K470泛素化的喪失，進而減少腫瘤發生與轉移，並延長胰臟腫瘤小鼠的壽命。

已知IL-17RA作為與其他IL-17受體形成異二聚體的共同受體。IL-17A與IL-17F作為同源二聚體或異源二聚體存在，所有形式的細胞激素透過專一性二聚體IL-17RA與IL-17RC受體錯合物誘導訊息傳導（ 37）。類似地，IL-17E（IL-25）透過IL-17RA與IL-17RB異二聚體誘導訊息以放大Th2免疫反應。與這些與IL-17RA異二聚體結合的IL-17配體不同，IL-17B明顯與IL-17 RB同源二聚體結合（圖4）。如果IL-17RA含量高，則IL-17E可能會抑制IL-17RB二聚化及磷酸化。如所證明的，在過度表現IL-17RA的細胞中確實是這種情況（圖22A至22D）。有趣的是，IL-17RB在胰臟癌細胞中過度表現（7），但幾乎無法檢測到IL-17RA的表現，這使得這些細胞對IL-17B的敏感性高於對IL-17E的反應（圖22A至22D）。此外，胰臟癌細胞以自分泌方式分泌IL-17B，以促進IL-17B/IL-17RB訊息傳導的活化，進而促進癌症進展（7）。IL-17細胞激素及受體家族成員的這些功能變異以及差異分佈可能有助於不同的生物學功能與疾病模式。

重要的是，IL-17B/IL-17RB致癌訊息傳導的近端機制過程在IL-17受體家族中似乎是不同的。IL-17B與IL-17RB結合並引起同源二聚化，這是致癌訊息傳導所必需的。與RTK受體不同，IL-17RB本身不是激酶，並且在同源二聚化後募集混合譜系激酶MLK-4以磷酸化IL-17RB的Y447位置。這一發現突顯了IL-17RB與RTK的相似性，因為兩者都是酪胺酸磷酸化受體。據報導，酪胺酸激酶Syk可能參與IL-17RA訊息傳導（ 40）。然而，Syk對IL-17B誘導的IL-17RB與ERK1/2磷酸化沒有影響（圖11C），表示Syk在IL-17RB致癌訊息傳導中可能幾乎沒有作用。因此，MLK4對IL-17RB的酪胺酸磷酸化以啟動IL-17B/IL-17RB致癌訊息傳導顯然不同於其他IL-17家族受體。其他IL-17異二聚體受體是否被其他酪胺酸激酶磷酸化以反應其同源配體仍有待解決。

顯然，IL-17RB的Y447位置磷酸化是募集TRIM56 E3連接酶以泛素化IL-17RB的K470位置所必需的（圖7）。儘管在IL-17RA訊息傳導途徑的其他調節物上觀察到TRAF6或ACT1 E3連接酶的泛素化（ 20 、 41），但ACT1或TRAF6的去除不影響IL-17RB K63連接的泛素化（圖18E）。IL-17RB的K63連接的多泛素化的功能是募集其他因子，包括ACT1與可能的其他調節物，這些調節物負責傳輸遠端致癌訊息。有趣的是，ACT1還依賴其E3連接酶活性進行下游IL-17訊息轉導，進而活化核因子κB（NF-κB）以及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑，以及CCAAT增強子-結合蛋白（C/EBPs）途徑（ 42 、 43）。這些轉錄因子共同驅動IL-17目標基因的轉錄活化。有趣的是，IL-17B/IL-17RB致癌途徑似乎參與NF-κB與MAPK途徑以活化下游目標細胞激素基因，進而促進腫瘤發生與轉移（ 6 、 7）。因此，IL-17B/IL-17RB近端訊息傳導機制似乎與先前從3D結構中預見的不同（ 14）。

基於對這種近端訊息傳導機制的理解，有幾個節點顯然對致癌訊息轉導相當重要。因此，阻斷這些節點可能是特異性抑制惡性腫瘤的有效策略（圖23）。有報導以中和抗體抑制IL-17RB（ 7）。同樣地，可以想像抗體調節去除IL-17B，因為以抗體阻斷IL-17A在臨床上對銀屑病有益（ 44 、 45）。已知IL-17RB亦可作為IL-17E的受體，促進傾向Th2的發炎反應（ 25 、 26）。由於Th2對免疫穩態及防禦細菌感染相當重要，且Th2細胞激素透過抑制抗腫瘤免疫與腫瘤生長及轉移有關（ 46 、 47），因此可延長IL-17RB的治療性阻斷，例如使用抗IL-17RB抗體可能導致有害的臨床副作用。然而，TAT-IL-17RB _403-416特異性抑制MLK4與IL-17RB相互作用會阻斷IL-17RB調節的致癌訊息傳導，但不會阻斷IL-17E/IL-17RB誘導的Th2免疫反應（圖24），暗示對Th2免疫的副作用最小。

注意到TRIM56為調節IL-17RB K63連接的泛素化的E3連接酶（圖6A至6J）。顯然，這種TRIM56調節的IL-17RB K63連接的泛素化過程對於IL-17RB/B致癌訊息也是必不可少的。基於上述原理，TRIM56以及IL-17RB之間的相互作用表面也可能為阻斷該途徑提供有用的標的。因此，本案發明人在此描述的結果不僅闡明了近端IL-17B/IL-17RB致癌訊息的分子基礎，而且還提供了一種使用環胜肽或其衍生物治療由該途徑驅動的治療某些胰臟癌、乳癌以及其他惡性腫瘤的新策略。參考資料及附註 1. Y. Iwakura, H. Ishigame, S. Saijo, S. Nakae, Functional specialization of interleukin-17 family members. Immunity34, 149-162 (2011). 2. S. Aggarwal, A. L. Gurney, IL-17: prototype member of an emerging cytokine family. J Leukoc Biol71, 1-8 (2002). 3. M. Novatchkova, A. Leibbrandt, J. Werzowa, A. Neubuser, F. Eisenhaber, The STIR-domain superfamily in signal transduction, development and immunity. Trends Biochem Sci28, 226-229 (2003). 4. V. Ramirez-Carrozzi, A. Sambandam, E. Luis, Z. Lin, S. Jeet, J. Lesch, J. Hackney, J. Kim, M. Zhou, J. Lai, Z. Modrusan, T. Sai, W. Lee, M. Xu, P. Caplazi, L. Diehl, J. de Voss, M. Balazs, L. Gonzalez, Jr., H. Singh, W. Ouyang, R. Pappu, IL-17C regulates the innate immune function of epithelial cells in an autocrine manner. Nat Immunol12, 1159-1166 (2011). 5. Y. Su, J. Huang, X. Zhao, H. Lu, W. Wang, X. O. Yang, Y. Shi, X. Wang, Y. Lai, C. Dong, Interleukin-17 receptor D constitutes an alternative receptor for interleukin-17A important in psoriasis-like skin inflammation. Sci Immunol4, (2019). 6. C. K. Huang, C. Y. Yang, Y. M. Jeng, C. L. Chen, H. H. Wu, Y. C. Chang, C. Ma, W. H. Kuo, K. J. Chang, J. Y. Shew, W. H. Lee, Autocrine/paracrine mechanism of interleukin-17B receptor promotes breast tumorigenesis through NF-kappaB-mediated antiapoptotic pathway. Oncogene33, 2968-2977 (2014). 7. H. H. Wu, W. W. Hwang-Verslues, W. H. Lee, C. K. Huang, P. C. Wei, C. L. Chen, J. Y. Shew, E. Y. Lee, Y. M. Jeng, Y. W. Tien, C. Ma, W. H. Lee, Targeting IL-17B-IL-17RB signaling with an anti-IL-17RB antibody blocks pancreatic cancer metastasis by silencing multiple chemokines. J Exp Med212, 333-349 (2015). 8. A. Maitra, F. Shen, W. Hanel, K. Mossman, J. Tocker, D. Swart, S. L. Gaffen, Distinct functional motifs within the IL-17 receptor regulate signal transduction and target gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A104, 7506-7511 (2007). 9. R. M. Onishi, S. J. Park, W. Hanel, A. W. Ho, A. Maitra, S. L. Gaffen, SEF/IL-17R (SEFIR) is not enough: an extended SEFIR domain is required for il-17RA-mediated signal transduction. J Biol Chem285, 32751-32759 (2010). 10. B. Zhang, C. Liu, W. Qian, Y. Han, X. Li, J. Deng, Structure of the unique SEFIR domain from human interleukin 17 receptor A reveals a composite ligand-binding site containing a conserved alpha-helix for Act1 binding and IL-17 signaling. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr70, 1476-1483 (2014). 11. A. V. Garg, M. Ahmed, A. N. Vallejo, A. Ma, S. L. Gaffen, The deubiquitinase A20 mediates feedback inhibition of interleukin-17 receptor signaling. Sci Signal6, ra44 (2013). 12. A. V. Garg, S. L. Gaffen, IL-17 signaling and A20: a balancing act. Cell Cycle12, 3459-3460 (2013). 13. S. Zhu, W. Pan, P. Shi, H. Gao, F. Zhao, X. Song, Y. Liu, L. Zhao, X. Li, Y. Shi, Y. Qian, Modulation of experimental autoimmune encephalomyelitis through TRAF3-mediated suppression of interleukin 17 receptor signaling. J Exp Med207, 2647-2662 (2010). 14. B. Zhang, C. Liu, W. Qian, Y. Han, X. Li, J. Deng, Crystal structure of IL-17 receptor B SEFIR domain. J Immunol190, 2320-2326 (2013). 15. F. McAllister, J. M. Bailey, J. Alsina, C. J. Nirschl, R. Sharma, H. Fan, Y. Rattigan, J. C. Roeser, R. H. Lankapalli, H. Zhang, E. M. Jaffee, C. G. Drake, F. Housseau, A. Maitra, J. K. Kolls, C. L. Sears, D. M. Pardoll, S. D. Leach, Oncogenic Kras activates a hematopoietic-to-epithelial IL-17 signaling axis in preinvasive pancreatic neoplasia. Cancer Cell25, 621-637 (2014). 16. S. Furuta, Y. M. Jeng, L. Zhou, L. Huang, I. Kuhn, M. J. Bissell, W. H. Lee, IL-25 causes apoptosis of IL-25R-expressing breast cancer cells without toxicity to nonmalignant cells. Sci Transl Med3, 78ra31 (2011). 17. S. C. Huang, P. C. Wei, W. W. Hwang-Verslues, W. H. Kuo, Y. M. Jeng, C. M. Hu, J. Y. Shew, C. S. Huang, K. J. Chang, E. Y. Lee, W. H. Lee, TGF-beta1 secreted by Tregs in lymph nodes promotes breast cancer malignancy via up-regulation of IL-17RB. EMBO Mol Med9, 1660-1680 (2017). 18. S. R. Hubbard, W. T. Miller, Receptor tyrosine kinases: mechanisms of activation and signaling. Curr Opin Cell Biol19, 117-123 (2007). 19. S. M. Craige, M. M. Reif, S. Kant, Mixed - Lineage Protein kinases (MLKs) in inflammation, metabolism, and other disease states. Biochim Biophys Acta1862, 1581-1586 (2016). 20. S. L. Gaffen, Structure and signalling in the IL-17 receptor family. Nat Rev Immunol9, 556-567 (2009). 21. J. M. Kramer, L. Yi, F. Shen, A. Maitra, X. Jiao, T. Jin, S. L. Gaffen, Evidence for ligand-independent multimerization of the IL-17 receptor. J Immunol176, 711-715 (2006). 22. J. M. Kramer, W. Hanel, F. Shen, N. Isik, J. P. Malone, A. Maitra, W. Sigurdson, D. Swart, J. Tocker, T. Jin, S. L. Gaffen, Cutting edge: identification of a pre-ligand assembly domain (PLAD) and ligand binding site in the IL-17 receptor. J Immunol179, 6379-6383 (2007). 23. Y. Shi, S. J. Ullrich, J. Zhang, K. Connolly, K. J. Grzegorzewski, M. C. Barber, W. Wang, K. Wathen, V. Hodge, C. L. Fisher, H. Olsen, S. M. Ruben, I. Knyazev, Y. H. Cho, V. Kao, K. A. Wilkinson, J. A. Carrell, R. Ebner, A novel cytokine receptor-ligand pair. Identification, molecular characterization, and in vivo immunomodulatory activity. J Biol Chem275, 19167-19176 (2000). 24. E. Tian, J. R. Sawyer, D. A. Largaespada, N. A. Jenkins, N. G. Copeland, J. D. Shaughnessy, Jr., Evi27 encodes a novel membrane protein with homology to the IL17 receptor. Oncogene19, 2098-2109 (2000). 25. V. Dolgachev, B. C. Petersen, A. L. Budelsky, A. A. Berlin, N. W. Lukacs, Pulmonary IL-17E (IL-25) production and IL-17RB+ myeloid cell-derived Th2 cytokine production are dependent upon stem cell factor-induced responses during chronic allergic pulmonary disease. J Immunol183, 5705-5715 (2009). 26. E. A. Rickel, L. A. Siegel, B. R. Yoon, J. B. Rottman, D. G. Kugler, D. A. Swart, P. M. Anders, J. E. Tocker, M. R. Comeau, A. L. Budelsky, Identification of functional roles for both IL-17RB and IL-17RA in mediating IL-25-induced activities. J Immunol181, 4299-4310 (2008). 27. A. Rana, B. Rana, R. Mishra, G. Sondarva, V. Rangasamy, S. Das, N. Viswakarma, A. Kanthasamy, Mixed Lineage Kinase-c-Jun N-Terminal Kinase Axis: A Potential Therapeutic Target in Cancer. Genes Cancer4, 334-341 (2013). 28. M. Martini, M. Russo, S. Lamba, E. Vitiello, E. H. Crowley, F. Sassi, D. Romanelli, M. Frattini, A. Marchetti, A. Bardelli, Mixed lineage kinase MLK4 is activated in colorectal cancers where it synergistically cooperates with activated RAS signaling in driving tumorigenesis. Cancer Res73, 1912-1921 (2013). 29. A. Rana, K. Gallo, P. Godowski, S. Hirai, S. Ohno, L. Zon, J. M. Kyriakis, J. Avruch, The mixed lineage kinase SPRK phosphorylates and activates the stress-activated protein kinase activator, SEK-1. J Biol Chem271, 19025-19028 (1996). 30. A. A. Marusiak, N. L. Stephenson, H. Baik, E. W. Trotter, Y. Li, K. Blyth, S. Mason, P. Chapman, L. A. Puto, J. A. Read, C. Brassington, H. K. Pollard, C. Phillips, I. Green, R. Overman, M. Collier, E. Testoni, C. J. Miller, T. Hunter, O. J. Sansom, J. Brognard, Recurrent MLK4 Loss-of-Function Mutations Suppress JNK Signaling to Promote Colon Tumorigenesis. Cancer Res76, 724-735 (2016). 31. T. Tsuchida, J. Zou, T. Saitoh, H. Kumar, T. Abe, Y. Matsuura, T. Kawai, S. Akira, The ubiquitin ligase TRIM56 regulates innate immune responses to intracellular double-stranded DNA. Immunity33, 765-776 (2010). 32. Y. Qian, C. Liu, J. Hartupee, C. Z. Altuntas, M. F. Gulen, D. Jane-Wit, J. Xiao, Y. Lu, N. Giltiay, J. Liu, T. Kordula, Q. W. Zhang, B. Vallance, S. Swaidani, M. Aronica, V. K. Tuohy, T. Hamilton, X. Li, The adaptor Act1 is required for interleukin 17-dependent signaling associated with autoimmune and inflammatory disease. Nat Immunol8, 247-256 (2007). 33. C. C. Hsieh, Y. M. Shyr, W. Y. Liao, T. H. Chen, S. E. Wang, P. C. Lu, P. Y. Lin, Y. B. Chen, W. Y. Mao, H. Y. Han, M. Hsiao, W. B. Yang, W. S. Li, Y. P. Sher, C. N. Shen, Elevation of beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase 1 in a fructoseresponsive manner promotes pancreatic cancer metastasis. Oncotarget8, 7691-7709 (2017). 34. S. C. Tang, L. Baeyens, C. N. Shen, S. J. Peng, H. J. Chien, D. W. Scheel, C. E. Chamberlain, M. S. German, Human pancreatic neuro-insular network in health and fatty infiltration. Diabetologia61, 168-181 (2018). 35. S. C. Tang, C. N. Shen, P. Y. Lin, S. J. Peng, H. J. Chien, Y. H. Chou, C. E. Chamberlain, P. J. Pasricha, Pancreatic neuro-insular network in young mice revealed by 3D panoramic histology. Diabetologia61, 158-167 (2018). 36. G. Murugaiyan, B. Saha, Protumor vs antitumor functions of IL-17. J Immunol183, 4169-4175 (2009). 37. N. Amatya, A. V. Garg, S. L. Gaffen, IL-17 Signaling: The Yin and the Yang. Trends Immunol38, 310-322 (2017). 38. P. G. Fallon, S. J. Ballantyne, N. E. Mangan, J. L. Barlow, A. Dasvarma, D. R. Hewett, A. McIlgorm, H. E. Jolin, A. N. McKenzie, Identification of an interleukin (IL)-25-dependent cell population that provides IL-4, IL-5, and IL-13 at the onset of helminth expulsion. J Exp Med203, 1105-1116 (2006). 39. A. M. Owyang, C. Zaph, E. H. Wilson, K. J. Guild, T. McClanahan, H. R. Miller, D. J. Cua, M. Goldschmidt, C. A. Hunter, R. A. Kastelein, D. Artis, Interleukin 25 regulates type 2 cytokine-dependent immunity and limits chronic inflammation in the gastrointestinal tract. J Exp Med203, 843-849 (2006). 40. N. L. Wu, D. Y. Huang, H. N. Tsou, Y. C. Lin, W. W. Lin, Syk mediates IL-17-induced CCL20 expression by targeting Act1-dependent K63-linked ubiquitination of TRAF6. J Invest Dermatol135, 490-498 (2015). 41. Z. Rong, L. Cheng, Y. Ren, Z. Li, Y. Li, X. Li, H. Li, X. Y. Fu, Z. Chang, Interleukin-17F signaling requires ubiquitination of interleukin-17 receptor via TRAF6. Cell Signal19, 1514-1520 (2007). 42. M. J. Ruddy, G. C. Wong, X. K. Liu, H. Yamamoto, S. Kasayama, K. L. Kirkwood, S. L. Gaffen, Functional cooperation between interleukin-17 and tumor necrosis factor-alpha is mediated by CCAAT/enhancer-binding protein family members. J Biol Chem279, 2559-2567 (2004). 43. Z. Yao, S. L. Painter, W. C. Fanslow, D. Ulrich, B. M. Macduff, M. K. Spriggs, R. J. Armitage, Human IL-17: a novel cytokine derived from T cells. J Immunol155, 5483-5486 (1995). 44. C. E. Griffiths, K. Reich, M. Lebwohl, P. van de Kerkhof, C. Paul, A. Menter, G. S. Cameron, J. Erickson, L. Zhang, R. J. Secrest, S. Ball, D. K. Braun, O. O. Osuntokun, M. P. Heffernan, B. J. Nickoloff, K. Papp, Uncover, U.-. investigators, Comparison of ixekizumab with etanercept or placebo in moderate-to-severe psoriasis (UNCOVER-2 and UNCOVER-3): results from two phase 3 randomised trials. Lancet386, 541-551 (2015). 45. P. J. Mease, I. B. McInnes, B. Kirkham, A. Kavanaugh, P. Rahman, D. van der Heijde, R. Landewe, P. Nash, L. Pricop, J. Yuan, H. B. Richards, S. Mpofu, F. S. Group, Secukinumab Inhibition of Interleukin-17A in Patients with Psoriatic Arthritis. N Engl J Med373, 1329-1339 (2015). 46. A. Budhu, M. Forgues, Q. H. Ye, H. L. Jia, P. He, K. A. Zanetti, U. S. Kammula, Y. Chen, L. X. Qin, Z. Y. Tang, X. W. Wang, Prediction of venous metastases, recurrence, and prognosis in hepatocellular carcinoma based on a unique immune response signature of the liver microenvironment. Cancer Cell10, 99-111 (2006). 47. R. F. Gabitass, N. E. Annels, D. D. Stocken, H. A. Pandha, G. W. Middleton, Elevated myeloid-derived suppressor cells in pancreatic, esophageal and gastric cancer are an independent prognostic factor and are associated with significant elevation of the Th2 cytokine interleukin-13. Cancer Immunol Immunother60, 1419-1430 (2011). 48. E. L. Jackson, N. Willis, K. Mercer, R. T. Bronson, D. Crowley, R. Montoya, T. Jacks, D. A. Tuveson, Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev15, 3243-3248 (2001). 49. S. Y. Wu, C. C. Hsieh, R. R. Wu, J. Susanto, T. T. Liu, C. R. Shen, Y. Chen, C. C. Su, F. P. Chang, H. M. Chang, D. Tosh, C. N. Shen, Differentiation of pancreatic acinar cells to hepatocytes requires an intermediate cell type. Gastroenterology138, 2519-2530 (2010). 50. C. M. Hu, S. C. Tien, P. K. Hsieh, Y. M. Jeng, M. C. Chang, Y. T. Chang, Y. J. Chen, Y. J. Chen, E. Y. P. Lee, W. H. Lee, High Glucose Triggers Nucleotide Imbalance through O-GlcNAcylation of Key Enzymes and Induces KRAS Mutation in Pancreatic Cells. Cell Metab29, 1334-1349 e1310 (2019). 51. C. K. Huang, P. H. Chang, W. H. Kuo, C. L. Chen, Y. M. Jeng, K. J. Chang, J. Y. Shew, C. M. Hu, W. H. Lee, Adipocytes promote malignant growth of breast tumours with monocarboxylate transporter 2 expression via beta-hydroxybutyrate. Nat Commun8, 14706 (2017). 52. P. C. Wei, Y. H. Hsieh, M. I. Su, X. Jiang, P. H. Hsu, W. T. Lo, J. Y. Weng, Y. M. Jeng, J. M. Wang, P. L. Chen, Y. C. Chang, K. F. Lee, M. D. Tsai, J. Y. Shew, W. H. Lee, Loss of the oxidative stress sensor NPGPx compromises GRP78 chaperone activity and induces systemic disease. Mol Cell48, 747-759 (2012).

無

當結合附圖閱讀時，將更好地理解以上之概述以及本發明以下之詳細描述。為了說明本發明，於圖式中顯示目前較佳的具體實施例。然而，應當理解的是，本發明不限於所示之精確佈置及手段。

於圖式中：

圖1A至1H顯示IL-17RB的胞內結構域中的酪胺酸447（Y447）對IL-17RB致癌訊息傳導至關重要。（圖1A）來自以rIL-17B處理的CFPAC1細胞的抗IL-17RB抗體（D9）免疫沉澱的IL-17RB的酪胺酸、絲胺酸以及蘇胺酸殘基的磷酸化免疫墨點。（圖1B）具有六個酪胺酸殘基的IL-17RB胞內結構域的序列。全長人類IL-17RB的胺基酸序列為SEQ ID NO: 1。（圖1C）表現IL-17RB的野生型（WT）以及六個酪胺酸（Y）-苯丙胺酸（F）突變體的IL-17RB-KO BxPC3細胞的免疫墨點分析。以rIL-17B處理IL-17RB-KO BxPC3細胞，並以抗IL-17RB或對照mIgG（小鼠IgG）免疫沉澱細胞裂解物，然後以指定抗體進行免疫墨點分析或以指定抗體作為輸入量對照直接進行免疫墨點分析。（圖1D）在IL-17B處理後，P-Y447抗體可識別野生型（WT），但不能識別Y447F、IL-17RB。以 rIL-17B處理表現Flag標記的WT以及Y447F IL-17RB的IL-17RB-KO BxPC3細胞，並透過抗Flag綴合的珠子免疫沉澱細胞裂解物。以P-Y447特異性抗體偵測墨點或以指定抗體作為輸入量對照直接進行免疫墨點分析。（圖1E）IL-17RB的P-Y447表現的免疫墨點分析取決於IL17B的含量。以指定量的rIL-17B處理BxPC3細胞，並以指定抗體對細胞裂解物進行免疫墨點分析。（圖1F至圖1H）Y447對於IL-17RB致癌訊息傳導相當重要。（圖1F）以指定的抗體對如（圖1C）中的表現IL-17RB以及六種突變體的CFPAC1細胞進行免疫墨點分析。（圖1G）透過RT-qPCR（n = 3）測量相同細胞中 CCL20、 CXCL1以及 TFF1的相對mRNA表現。（圖1H）相同細胞的SACF分析（n = 6）。

圖2A至2C包括顯示IL-17RB P-Y447的高度表現與高IL-17RB含量平行的圖表，且與胰臟癌患者的惡化進展相關。（圖2A）以抗P-Y477抗體或胜肽預吸收抗血清染色的BxPC3異種移植腫瘤的三個連續切片的代表性IHC影像，以驗證抗體特異性。比例尺：50 μm。（圖2B）以Kaplan-Meier法繪製87名具有不同P-Y447表現量的胰臟癌患者的總生存期。使用對數秩檢定。（圖2C）該圖所示為44名具有高或低P-Y447表現量的胰臟癌患者一年內術後進展的比例。虛線表示癌症進展的中位時間。#進展#由術後復發及/或轉移所定義。使用對數秩檢定。

圖3A至3G包括顯示鑑定MLK4對胰臟癌細胞中的IL-17B/IL-17RB致癌訊息傳導至關重要的圖表。（圖3A）流程圖描述鑑定IL-17RB相互作用蛋白的程序（左）。該圖顯示在以rIL-17B處理後特異性鑑定了126種候選蛋白質（右）。（圖3B）IL-17RB與三種激酶結合的免疫墨點分析。以指定濃度的rIL-17B處理CFPAC1細胞，且細胞裂解物與抗IL-17RB抗體共免疫沉澱，並以指定的抗體進行墨點分析或以指定抗體作為輸入量對照直接進行免疫墨點分析。（圖3C）MLK4消耗及ERK1/2磷酸化的免疫墨點分析。CFPAC1細胞被shMLK4或做為對照的shLacZ的相應lenti-shRNA耗盡，細胞裂解物直接以指定的抗體進行免疫墨點分析。RE：相對數量。（圖3D）MLK4與IL-17RB的共免疫沉澱。以rIL-17B處理以IL-17RB-HA與Flag-MLK4共轉染的293T細胞，並以抗Flag-及抗-HA-綴合的珠子相互共免疫沉澱細胞裂解物，然後以指定的抗體進行免疫墨點分析。（圖3E）Duolink原位相互作用分析的影像顯微照片。在rIL-17B處理後，使用抗IL-17RB及抗MLK4抗體在BxPC3細胞中分析IL-17RB與MLK4之間的相互作用。比例尺：5 μm（上）。對細胞中的綠點進行評分（n = 20）（下）。（圖3F及圖3G）具有MLK4敲低的CFPAC1細胞用於以RT-qPCR（n = 3）（圖3F）或SACF分析（n = 4）（圖3G）測量細胞激素基因的mRNA表現。

圖4A至4I包括顯示IL-17RB的同二聚化為下游致癌訊息傳導募集MLK4的圖表。（圖4A）IL-17B誘導的IL-17RB同二聚化的免疫墨點分析。以IL-17RB-HA與IL-17RB-Flag共轉染的IL-17RB-KO BxPC3細胞以rIL-17B處理一指定的時間。以抗Flag綴合的珠子免疫沉澱細胞裂解物並以指定的抗體進行免疫墨點分析或以指定抗體作為輸入量對照直接進行免疫墨點分析。（圖4B）IL-17RB ^FNmut突變體同二聚化的免疫墨點分析。以IL-17RB-Flag或IL-17RB ^FNmut-Flag共轉染表現IL-17RB-HA的293T細胞並以rIL-17B處理，以抗HA-綴合的珠子免疫沉澱細胞裂解物並以指定的抗體進行免疫墨點分析或以指定抗體作為輸入量對照直接進行免疫墨點分析。（圖4C）Duolink原位相互作用分析。以IL-17B或IL-17E處理表現IL-17RB-Flag或IL-17RB ^FNmut-Flag的表現IL-17RB-HA的IL-17RB-KO BxPC3，並使用抗HA與抗Flag抗體作為探針進行Duolink原位相互作用分析。該圖所示為陽性綠點的數量。（圖4D）對IL-17B反應的內源性IL-17RB的Duolink原位相互作用分析。以50 ng/ml rIL-17B處理30分鐘的CFPAC1細胞以FITC預標記的抗IL-17RB抗體(D9)染色，接著以兩種攜帶PLA探針的小鼠二級抗體（抗小鼠PLUS以及抗小鼠MINUS抗體）進行Duolink原位相互作用分析。在以rIL-17B處理後IL-17RB的二聚化由膜上的紅點顯示（左）。比例尺：5 μm。紅點（n = 25）的量化顯示於右圖中。（圖4E）在以IL-17B刺激下與MLK4結合的IL-17RB ^FNmut的免疫墨點分析。與（C）中相同的細胞以50 ng/ml rIL-17B或rIL-17E處理30分鐘，並以抗Flag綴合的珠子免疫沉澱細胞裂解物並以指定的抗體進行免疫墨點分析或以指定抗體作為輸入量對照直接進行免疫墨點分析。（圖4F）在IL-17B誘導的IL-17RB Y447與ERK1/2磷酸化中IL-17RB ^FNmut的免疫墨點分析。裂解與（圖4C）相同的細胞，並以指定的抗體直接對全體細胞裂解物進行免疫墨點分析。（圖4G）在IL-17B刺激下IL-17RB的不同二聚化模式的免疫墨點分析。以IL-17RB-HA、IL-17RB-Flag以及IL-17RA-His共轉染IL-17RB-KO BxPC3細胞，並以rIL-17B或rIL-17E處理，以抗HA-綴合的珠子免疫沉澱細胞裂解物，接著以指定的抗體進行免疫墨點或以指定抗體作為輸入量對照直接進行免疫墨點分析。（圖4H）IL-17RB-KO CFPAC1細胞中 CCL20、 CXCL1以及 TFF1mRNA的相對表現。以rIL-17B處理表現IL-17RB-Flag或IL-17RB ^FNmut-Flag的IL-17RB-KO CFPAC1細胞，透過RT-qPCR（n=3）或SACF分析（n=6）測量相應的mRNA（圖4I）。

圖5A至5I包括顯示MLK4結合以及IL-17RB的Y447-磷酸化必需要有IL-17RB的柔性環（V403～S416）的圖表。（圖5A）IL-17RB的Y447磷酸化的MLK4活性的免疫墨點分析。以rIL-17B誘導以shMLK4或shLacZ處理或透過敲除耗盡MLK4的BxPC3細胞，並以指定的抗體對細胞裂解物進行免疫墨點分析。（圖5B）人類IL-17RB胞內結構域與八個潛在亞結構域的圖以及具有相應缺失胺基酸序列的突變體列表。（圖5C）MLK4結合所必需的IL-17RB亞結構域的免疫墨點分析。293T細胞與Flag-MLK4以及HA標記的野生型（WT）或以上列出的每個突變體共轉染，然後以rIL-17B處理。將細胞裂解物與抗-HA與抗-Flag抗體相互共免疫沉澱，並以抗-Flag或抗-HA抗體進行墨點分析或以指定抗體直接墨點分析作為輸入量對照。（圖5D）與MIL4結合並磷酸化Y447以及ERK1/2的Del-3突變體之免疫墨點分析。將IL-17RB的HA標記的WT或Del-3突變體分別轉導至低IL-17RB表現的SU.86.86細胞中。在rIL-17B處理30分鐘後，將細胞裂解物與抗HA綴合的珠子進行共免疫沉澱（co-IP），然後以抗P-Y447以及抗MLK4抗體進行免疫墨點分析，以指定抗體作為輸入量對照直接進行免疫墨點分析。（圖5E至圖5G）Del-3突變體的生物活性分析。透過RT-qPCR（n = 3）（圖5E）測量表現HA標記的WT或IL-17RB的Del-3突變體的IL-17RB-KO BxPC3細胞的 CCL20與 TFF1mRNA，用於侵入分析（n = 4 ）（圖5F），以及以50 ng/ml rIL-17B處理後的SACF分析（n = 4）（圖5G）。（圖5H與圖5I），MLK4激酶突變體在IL-17B誘導的致癌活性中的免疫墨點分析。在以rIL-17B處理後，MLK4的Flag-標記的WT與激酶突變體（Δ130-138、E314K、Y330H）分別在MLK4-KO BxPC3細胞中表現。以指定的抗體直接對相應的細胞裂解物進行免疫墨點分析（圖5H）。（圖5I）透過RT-qPCR（n = 3）測量與（圖5H）相同細胞的 CCL20、 CXCL1以及 TFF1mRNA的表現。

圖6A至6J包括顯示P-Y447 IL-17RB募集TRIM56以在IL-17RB的K470處用於下游致癌訊息傳導的K63連接的泛素化之圖表。（圖6A）圖表說明了在rIL-17B處理後鑑定與WT特異性相互作用但不與IL-17RB的Y447F突變體相互作用的61種候選蛋白質的程序。以rIL-17B處理表現IL-17RB的Flag標記的WT或Y447F突變體的IL-17RB-KO BxPC3細胞。這些細胞用於與抗Flag抗體共免疫沉澱，然後進行質譜分析。（圖6B）免疫墨點分析TRIM56與IL-17RB結合。以rIL-17B處理表現IL-17RB的Flag標記的WT或Y447F以及HA標記的TRIM56的293T細胞，並將細胞裂解物與指定的抗體共免疫沉澱且進行免疫墨點分析，或以指定抗體作為輸入量對照直接進行免疫墨點分析。neo：空載體。（圖6C）反應IL-17B的ERK磷酸化中TRIM56的免疫墨點分析。以shTRIM56或以TRIM56敲除（Tr56-KO）處理的CFPAC1細胞受到rIL-17B的刺激。以指定的抗體對相應的細胞裂解物進行免疫墨點分析。RE表示磷酸化ERK1/2的相對表現。（圖6D）TRIM56結合所需的IL-17RB亞結構域的免疫墨點分析。293T細胞與HA-TRIM56以及Flag標記的WT或如（圖5B）中的八種缺失突變體中的每一種共轉染。細胞在以rIL-17B處理後裂解，用於與抗HA以及抗Flag抗體的相互共免疫沉澱，並以指定的抗體進行免疫墨點分析或以指定抗體作為輸入量對照直接進行免疫墨點分析。（圖6E）對IL-17RB泛素化的TRIM56連接酶活性的墨點分析。以rIL-17B處理具有TRIM56敲除（左），以及TRIM56敲除（右）的CFPAC1細胞，且細胞裂解物用於與指定的抗體共免疫沉澱，接著與抗-K63-Ub、抗-K48-Ub，以及抗-IL-17RB抗體進行免疫墨點分析或以指定抗體作為輸入量對照直接進行免疫墨點分析。（圖6F）由TRIM56泛素化的IL-17RB的離胺酸位點的免疫墨點分析。IL-17RB-KO CFPAC1細胞與IL-17RB的Flag標記的WT或突變體（K333R、K454R、K470R）以及HA-Ub（僅K63）共轉導並處理rIL-17B。透過HA-瓊脂糖對細胞裂解物進行免疫沉澱，接著以指定的抗體進行免疫墨點分析或以指定抗體作為輸入量對照直接進行免疫墨點分析。（圖6G）IL-17RB K470R募集下游效應子的免疫墨點分析。以rIL-17B處理表現IL-17RB的Flag標記的WT、K333R、K454R以及K470R的IL-17RB-KO BxPC3細胞，將細胞裂解物與抗Flag-瓊脂糖共免疫沉澱，並以指定的抗體進行免疫墨點分析或以指定抗體作為輸入量對照直接進行免疫墨點分析。（圖6H至圖6J）在rIL-17B處理後，以RT-qPCR（n=3）分析表現WT或具有K333R、K454R，或K470R的IL-17RB突變體的每一種的IL-17RB敲除CFPAC1細胞的 CCL20以及 TFF1的mRNA表現（圖6H）。分析相同細胞的SACF（n = 4）（圖6I）以及侵入（n = 4）（圖6J）。

圖7A至7J包括顯示由環胜肽破壞IL-17RB與MLK4之間的相互作用阻斷致癌進展的圖表。（圖7A）胜肽TAT _48-57（對照）（SEQ ID NO: 21）與TAT-IL-17RB _403-416（環）（SEQ ID NO: 30）用於以下實驗。（圖7B）以環胜肽處理的IL-17RB與MLK4結合的免疫墨點分析。以不同劑量（0、0.1、1、10、50、100 ng/ml）的對照胜肽及環胜肽預處理表現Flag-MLK4與HA-IL-17RB的293T細胞30分鐘，然後加入rIL-17B作用30分鐘。將細胞裂解物與抗Flag及抗HA抗體相互共免疫沉澱，並以指定的抗體進行墨點分析或以指定抗體作為輸入量對照直接進行免疫墨點分析。（圖7C至圖7F）CFPAC1細胞以胜肽預處理30分鐘，然後加入rIL-17B作用30分鐘。以指定的抗體對細胞裂解物進行免疫墨點分析或以抗IL-17RB抗體或對照IgG免疫沉澱並以指定的抗體進行墨點分析（圖7C）。CFPAC1細胞以TAT _48-57或TAT-IL-17RB _403-416（50 ng/ml）預處理30分鐘，然後加入rIL-17B作用兩小時。以RT-qPCR（n = 3）（圖7D）測量這些細胞的 CCL20以及 TFF1的mRNA表現，相同的細胞用於侵入分析（n = 4）（圖7E）及SACF分析（n = 4）（圖7F）。（圖7G）以環胜肽治療基因轉殖胰臟癌的EKP小鼠（ LSL-Kras ^+/G12D; p53 ^+/-; Ela-Cre ^ERT ；加藍皮素）的流程圖。（圖7H）以抗P-Y447抗體染色的胰臟的IHC影像。比例尺：50 µm。胰臟組織來自於第42天以對照或環胜肽處理後的EKP小鼠。Kras ^+/+小鼠（ Kras ^+/+; p53 ^+/-; Ela-Cre ^ERT ；加藍皮素）作為非癌症對照。方框表示放大的區域。（圖7I）於第56天將實驗EKP小鼠（每組n=7）安樂死，並計算肺中的轉移性腫瘤結節。（圖7J）實驗EKP小鼠壽命的Kaplan-Meier生存曲線圖（每組n=7）。使用對數秩檢定。

圖8A至8D包括顯示IL-17RB的敲除減少IL-17B/IL-17RB致癌訊息傳導的圖表。IL-17RB-KO CFPAC1與BxPC3細胞由具有兩個gRNA（#1及#2）的CRISPR/Cas9系統建立。（圖8A）免疫墨點分析用於評估在無血清條件下以50 ng/ml的rIL-17B處理30分鐘的IL-17RB-KO細胞中IL-17RB與磷酸化ERK1/2的表現。RE：相對表現。（圖8B至圖8D）在無血清條件下以50 ng/ml的rIL-17B處理2小時後，IL-17RB-KO細胞用於透過RT-qPCR（n = 3）測量 CCL20以及 TFF1的mRNA表現（圖8B），用於軟瓊脂集落形成分析（soft agar colony formation，SACF）（n=6）（圖8C），或在補充rIL-17B（50 ng/ml）後用於侵入分析（n=6）（圖8D）。（圖8B至圖8D）中的數據為平均值±標準差。* P＜ 0.05透過雙尾學生氏t檢定。** P＜ 0.01透過雙尾學生氏t檢定。

圖9A至9D包括顯示IL-17RB的酪胺酸447（Y447）的突變消除IL-17B誘導的致癌訊息傳導的圖表。（圖9A）不同物種間IL-17RB的序列比對（全長序列分別參考SEQ ID NO: 1至9）。箭頭表示Y447。不同物種的IL-17RB全長胺基酸序列為SEQ ID NO: 1至9。（圖9B至圖9D）Y447在IL-17RB致癌訊息傳導中的作用。IL-17RB的野生型（WT）與六種酪胺酸（Y）到苯丙胺酸（F）突變體分別在IL-17RB-KO BxPC3細胞中異位表現，並以指定的抗體對細胞裂解物進行免疫墨點分析（圖9B）。相同的細胞用於透過RT-qPCR（n = 3）（圖9C）測量細胞激素基因表現，以及SACF分析（n = 6）（圖9D）。（圖9C與圖9D）中的數據為平均值±標準差，** P＜ 0.01，透過雙尾學生氏t檢定。

圖10A及10B包括顯示使用抗-P-Y447抗體的原發性與轉移性胰臟腫瘤樣品的免疫組織化學影像的圖表。（圖10A）具有抗P-Y447以及抗IL-17RB（A81）抗體的胰臟腫瘤的代表性IHC影像。在癌細胞群中，低表現表示＜10%，高表現表示＞10%陽性染色。三個連續部分用於IHC。方框顯示放大的區域。（圖10B）具有抗P-Y447抗體的肝轉移性胰臟腫瘤的代表性IHC影像。在癌細胞群中，低表現表示＜10%，高表現表示＞10% 陽性染色。比例尺：50 μm。

圖11A至11C包括顯示AAK1、HIPK1以及Syk的消耗並不改變IL-17B誘導的ERK1/2磷酸化的圖表。在無血清條件下以50 ng/ml的rIL-17B處理15分鐘後，由AAK1-（圖11A）、HIPK1-（圖11B）以及Syk-（圖11C）敲低細胞製備的細胞裂解物的免疫墨點分析。以指定的抗體偵測墨點。

圖12A至12D包括顯示MLK4表現的敲低降低IL-17B誘導的ERK1/2磷酸化、CCL20以及TFF1表現，以及胰臟及乳癌細胞的侵入性表型的圖表。胰臟癌細胞（AsPC1與BxPC3）以及乳癌細胞（MB361與MB468）分別以慢病毒shLacZ（對照）或慢病毒shMLK4轉導，細胞裂解物直接以指定的抗體進行免疫墨點分析（圖12A）。相同的細胞用於細胞激素基因表現的RT-qPCR分析（n=3）（圖12B）、SACF分析（n=4）（圖12C）以及侵入分析（n=4）（圖12D）。（圖12B至12D）中的數據為平均值±標準差。* P＜ 0.05透過雙尾學生氏t檢定。** P＜ 0.01 透過雙尾學生氏t檢定。

圖13A至13G包括顯示IL-17B而非IL-17E誘導IL-17RB酪胺酸磷酸化的圖表，且FNmut突變體不能同源二聚化及傳遞下游致癌訊息。（圖13A）圖示說明IL-17RB的功能結構域。FN：類纖網蛋白-III結構域；SEFIR：與纖維母細胞生長因子基因以及IL-17R相似的表現，柔性環：IL-17RB的野生型及FNmut（FN2截短）中的L395-E417以及Y447與K470。灰色陰影表示細胞膜。（圖13B）將WT與突變IL-17RB-Flag分別轉染至BxPC3細胞中。以指定的抗體對膜級分以及全細胞裂解物進行免疫墨點分析。（圖13C）以WT、FNmut、Y447F以及K470R IL-17RB-Flag轉染並以抗Flag抗體染色的BxPC3細胞的代表性免疫螢光影像。（圖13D）用於IL-17RB同二聚化的Duolink原位相互作用分析。將IL-17RB-KO BxPC3細胞與IL-17RB-HA及IL-17RB-Flag，或IL-17RB ^FNmut-Flag共轉染，然後進行血清飢餓後以50 ng/ml的rIL-17B或rIL-17E處理30分鐘，並使用抗HA以及抗Flag抗體進行Duolink原位相互作用分析。比例尺：5 μm。（圖13E與圖13F）以IL-17RB-Flag或IL-17RB ^FNmut-Flag轉染IL-17RB-KO BxPC3細胞，透過RT-qPCR測量這些細胞的細胞激素基因表現（n=3）（圖13E），以及SACF分析（n = 6）（圖13F）。（圖13E與圖13F）中的數據為平均值±標準差。* P＜ 0.05透過雙尾學生氏t檢定。 ** P＜ 0.01透過雙尾學生氏t檢定。（圖13G）BxPC3細胞在無血清條件下分別以50 ng/ml的rIL-17B或rIL-17E處理指定時間。以指定的抗體直接對細胞裂解物進行免疫墨點分析。

圖14A與14B包括顯示IL-17B誘導的IL-17RB二聚化不受TRIM56、MLK4的敲低或IL-17RB的Y447與K470突變的影響的圖表。（圖14A）以TRIM56或MLK4的shRNA轉導IL-17RB-KO BxPC3細胞以分別敲低TRIM56及MLK4的表現。這些細胞與IL-17RB-HA以及IL-17RB-Flag共轉染。血清飢餓後，以rIL17B（50 ng/ml）處理細胞30分鐘，以抗HA綴合的珠子免疫沉澱細胞裂解物，並以指定的抗體作為輸入量對照進行墨點分析。（圖14B）在IL-17RB-KO BxPC3細胞中分別以Flag標記的WT、Y447F或K470R IL-17RB共轉染IL-17RB-HA。這些細胞在無血清條件下以rIL-17B（50 ng/ml）處理15分鐘，以抗HA綴合的珠子免疫沉澱細胞裂解物，並以指定的抗體進行免疫墨點分析。

圖15A至15D包括顯示CEP-1347抑制IL-17RB Y447磷酸化、ERK1/2磷酸化以及胰臟癌細胞及乳癌細胞的侵入性的圖表。分別以慢病毒 shLacZ（對照）及慢病毒shMLK4轉導胰臟癌細胞（AsPC1與BxPC3）以及乳癌細胞（MB361與MB468）。相較於MLK4敲低細胞，shLacZ轉導的癌細胞以MLK的非選擇性抑制劑CEP-1347（200 nM）預處理，然後於無血清條件下添加50 ng/ml的rIL-17B作用30分鐘。以指定的抗體直接對細胞裂解物進行免疫墨點分析（圖15A）。透過RT-qPCR測量相同細胞的細胞激素基因表現（n = 3）（圖15B）、SACF分析（n = 4）（圖15C），以及侵入分析（n = 4）（圖15D）。所有數據均為平均值±標準差。* P＜ 0.05，** P＜ 0.01透過雙尾學生氏t檢定。

圖16A與16B顯示人類IL-17RB的SEFIR結構域的預測結構以及和Y447的空間構形。（圖16A）使用mIl-17rb（3vbc，紅色）作為模板預測人類IL-17RB SEFIR結構域結構（藍色），指示Y447（綠色）。還顯示mIl-17rb的Y444（橙色）。（圖16B）Y444位於小鼠IL-17rb SEFIR結構域的表面。

圖17A至17F包括顯示TRIM56與IL-17RB的N458~V462結合並對IL-17RB致癌訊息傳導非常重要的圖表。（圖17A）293T細胞以Flag標記的WT、Y447F IL-17RB轉染，細胞裂解物以M2珠子免疫沉澱並以抗-P-Y447以及抗-flag抗體（上）進行免疫墨點分析。WT與Y447F Flag-IL-17RB透過抗FLAG（M2）珠子從這些細胞中純化，而在293T細胞中表現的HA-TIM56則透過抗HA珠子純化。Flag-IL-17RB（WT或Y447F）蛋白與HA-TRIM56混合並在冰上作用30分鐘。然後透過非變性PAGE分離蛋白質混合物，然後進行考馬斯藍染色（下）。（圖17B至圖17E）胰臟癌細胞（CFPAC1、AsPC1與BxPC3）以及乳癌細胞（MB361與MB468）分別以慢病毒shLacZ（對照）以及慢病毒shTRIM56轉導，細胞裂解物以指定的抗體進行免疫墨點分析（圖17B，亦參閱圖6C）。這些細胞用於細胞激素基因表現的RT-qPCR分析（n=3）（圖17C）、SACF分析（n=4）（圖17D）以及侵入分析（n=4）（圖17E）。* P＜ 0.05透過雙尾學生氏t檢定。（圖17C至圖17E）中的數據為平均值±標準差。** P＜ 0.01透過雙尾學生氏t檢定。（圖17F）Flag標記的WT或Del-6（ΔN458~V462）IL-17RB分別轉導到SU.86.86細胞中。在無血清條件下以50 ng/ml的rIL-17B處理30分鐘後，與抗Flag綴合的珠子進行共免疫沉澱，然後以指定的抗體進行免疫墨點分析。

圖18A至18E包括顯示TRIM56作為用於IL-17RB的K63連接的泛素化的E3連接酶的圖表。（圖18A）Flag-IL-17RB與HA標記的WT以及Ub突變體分別共轉染到293T細胞中。然後在無血清條件下以50 ng/ml的rIL-17B處理這些細胞30分鐘。收集全細胞裂解物用於與抗HA-瓊脂糖共免疫沉澱，並以指定的抗體進行免疫墨點分析。（圖18B）圖示說明IL-17RB胞內結構域表面上的三個離胺酸殘基（K333、K454以及K470，藍色）與Y447（紅色）。（圖18C）將IL-17RB構築的帶有Flag標籤的WT、K333F、K454F以及K470F轉染至IL-17RB-KO BxPC3細胞中。這些細胞在無血清條件下以50 ng/ml的rIL-17B處理30分鐘。收集全細胞裂解物用於與抗Flag-瓊脂糖共免疫沉澱並以指定抗體進行免疫墨點分析。（圖18D）親和純化的Flag-IL-17RB（WT或Y470F）蛋白以及HA-TRIM56（WT或Δ31-50）蛋白用於重組E1、E2以及泛素的體外泛素化分析。然後透過SDS-PAGE分離蛋白質混合物，然後以抗K48-Ub與K63-Ub抗體（上）及考馬斯藍染色（下）進行免疫墨點分析。（圖18E）Act-敲低、TRAF6-敲除以及對照AsPC1細胞以50 ng/ml的rIL-17B處理，且細胞裂解物與抗IL-17RB（D9）-綴合的珠子共免疫沉澱並以指定的抗體進行免疫墨點分析。

圖19A至19D包括顯示以環胜肽治療抑制源自患者的胰臟腫瘤細胞的攻擊行為的圖表。（圖19A）CFPAC1細胞分別以Alexa Fluor 568標記或未標記的TAT _48-57（對照）以及TAT-IL-17RB _403-416（環）冷胜肽處理30分鐘。共聚焦顯微鏡用於觀察胜肽滲透到細胞中。（圖19B）PDX衍生的腫瘤細胞（左PC080，右PC084）以胜肽預處理30分鐘，然後在無血清條件下以50 ng/ml的rIL-17B處理2小時。（圖19C與圖19D）這些細胞透過RT-qPCR測量細胞激素基因的mRNA表現（n=3），或用於侵入分析（n=4）（圖19C）以及SACF分析（n=4）（圖19D）。（圖19B~圖19D）中的數據為平均值±標準差。* P＜0.05，** P＜ 0.001透過雙尾學生氏t檢定。

圖20A至20D包括顯示TAT-IL-17RB _403-416胜肽的處理減少MDSC與M2巨噬細胞募集的圖表。（圖20A）透過流式細胞儀分析以指定的特定的細胞表面標記，對以TAT-IL-17RB _403-416（環）胜肽處理的EKP小鼠 LSL-Kras+/G12D; p53+/-; Ela-Cre ^ERT ；加藍皮素）（每組n = 7）的胰臟組織檢測腫瘤免疫調節能力。（圖20B至圖20D）代表性點圖揭示CD45+免疫細胞（上）以及CD11b+/Gr1+ MDSC（下）中存在F4/80與CD206。該圖顯示CD11b+/Gr1+MDSC（圖20B）、CD45+細胞中F4/80+巨噬細胞（圖20C）以及CD45+/F4/80+細胞中CD206+M2巨噬細胞（圖20D）的百分比的定量。數據為平均值±標準差。* P＜ 0.05，** P＜ 0.01透過雙尾學生氏t檢定。

圖21A至21G包括顯示環胜肽破壞IL-17RB與MLK4相互作用抑制胰臟腫瘤進展的圖表。（圖21A）該圖說明在原位異種移植胰臟癌小鼠模型中測試胜肽的抗腫瘤作用的小鼠異種移植實驗的時間表及時間線。將大約2x10 ⁵個CFPAC1-GFP/Luc細胞移植到NOD-SCID小鼠的胰臟中7天。分別以腹膜內注射PBS、對照以及環胜肽（160 μg/100 μl PBS，每週兩次，每組n=7）。（圖21B）胜肽處理後來自荷瘤小鼠的胰臟中P-Y447的代表性IHC影像。方框顯示放大的區域。比例尺：50 µm。（圖21C與圖21D）在胰臟癌細胞（CFPAC1-GFP/Luc）植入後透過IVIS成像系統監測小鼠在指定時間的腫瘤生長（圖21C）。透過來自IVIS成像的生物發光訊息的強度繪製腫瘤生長曲線（圖21D）。數據為平均值±標準差。* P＜ 0.05，** P＜ 0.01透過雙尾學生氏t檢定。（圖21E）以胜肽處理後胰臟腫瘤小鼠的Kaplan-Meier存活分析。使用對數秩檢定。（圖21F）以胜肽治療後胰臟腫瘤的肺及肝轉移。於第34天，對荷瘤小鼠（每組n = 5）實施安樂死並收集肝臟及肺臟以檢查胰臟癌細胞的遠處轉移。IVIS成像揭示胜肽處理小鼠肝臟及肺臟中的轉移性胰臟腫瘤。（圖21G）肝及肺轉移性腫瘤中生物發光訊息的量化結果圖。數據為平均值±標準差。* P＜ 0.05，** P＜ 0.01透過雙尾學生氏t檢定。

圖22A至22D包括顯示IL-17RA的過度表現或以IL-17E處理減少IL-17B調節的IL-17RB二聚化及酪胺酸磷酸化的圖表。（圖22A與圖22B）將IL-17RB-HA、IL-17RB-Flag以及IL-17RA-HA共轉染到IL-17RB-KO BxPC3細胞中。這些細胞在無血清條件下以rIL17B、rIL17E或兩者處理15分鐘。將細胞裂解物與抗HA綴合的珠子共免疫沉澱並以指定的抗體進行墨點分析（圖22A），並以柱狀圖顯示定量結果（圖22B）。（圖22C與圖22D）在無血清條件下，單獨或表現IL-17RA的BxPC3細胞與rIL-17B（50ng/ml）以及指定量的IL-17E共同處理30分鐘。以指定的抗體對細胞裂解物進行免疫墨點分析（圖22C），定量結果以柱狀圖顯示（圖22D）。

圖23所示為圖形總結：以IL-17RB/B驅動的致癌訊息傳導為目標的關鍵步驟的策略。IL-17B的結合特異性誘導IL-17RB同源二聚化，導致MLK4的募集以及隨後在Y447位置上IL-17RB的磷酸化。P-Y447被TRIM56識別並結合，在IL-17RB（Ub-K470）的K470處進行K63連接的多泛素化，進而啟動下游致癌訊息傳導。反之，環胜肽（TAT-IL-17RB _403-416）中斷IL-17RB與MLK4之間的相互作用會抑制IL-17B/IL-17RB致癌訊息的活化，進而抑制胰臟腫瘤的生長及轉移。

圖24A至24G包括顯示環胜肽不抑制PBMCs中IL-17E誘導的IL-4與IL-13的mRNA表現或影響骨髓來源的樹突細胞活化的圖表。（圖24A）描述用於測試抗IL-17RB抗體以及環胜肽對IL-17E誘導的周邊血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中IL-4與IL-13表現的影響的實驗設計的流程圖。PBMCs透過Ficoll-paque純化並用於以下實驗。（圖24B至圖24E）在分別以mIgG或抗IL-17RB抗體預處理（圖24B與圖24C）以及對照或環胜肽預處理（圖24D與圖24E）後，透過RT-qPCR分析PBMC中由IL-17B或IL-17E誘導的IL-4與IL-13的表現。（圖24F與圖24G）分別以對照或環胜肽處理源自小鼠骨髓的樹突細胞(DCs)。（圖24F）使用抗CD80、CD86以及MHC-II抗體進行流式細胞儀分析以確定DCs在與對照或環胜肽作用48小時後的活性。（圖24G）透過門控CD80、CD86以及MHC-II陽性細胞（n＝3）的面積來量化DCs的活性。數據為平均值±標準差。

無

Claims

一種用於抑制細胞激素-17B（interleukin-17B，IL-17B）/細胞激素-17受體B（interleukin-17 receptor B，IL-17RB）活化及/或治療與IL-17B/IL-17RB活化相關的疾病或病症之方法，包括對有此需要的個體施用有效量之IL-17RB拮抗劑，其中該IL-17RB拮抗劑靶向IL-17RB與混合譜系激酶4（mixed-lineage kinase 4，MLK4）之間的相互作用、Y447磷酸化，及/或K470泛素化。
如請求項1之方法，其中該IL-17RB拮抗劑為抑制MLK4與IL-17RB結合的胜肽或小分子。
如請求項1或2之方法，其中該IL-17RB拮抗劑不抑制該個體的細胞激素-17E（IL-17E）/IL-17RB調節的第2型免疫。
如請求項1至3中任一項之方法，其中該IL-17RB拮抗劑為包含第一區段的IL-17RB抑制胜肽，該第一區段包含如SEQ ID NO: 10所示之胺基酸序列X ₁CDX ₂X ₃CX ₄X ₅X ₆EGX ₇X ₈X ₉，其中X ₁為纈胺酸（V）、異白胺酸（I）、白胺酸（L）、丙胺酸（A）、甲硫胺酸（M），X ₂為甘胺酸（G）或絲胺酸（S），X ₃為蘇胺酸（T）或丙胺酸（A），X ₄為甘胺酸（G）、絲胺酸（S）或天門冬胺酸（D），X ₅為離胺酸（K）、組胺酸（H）或天門冬醯胺（N），X ₆為絲胺酸（S）、離胺酸（K）或天門冬醯胺（N），X ₇為絲胺酸（S）或甘胺酸（G），X ₈為脯胺酸（P）或丙胺酸（A），X ₉為絲胺酸（S）、半胱胺酸（C）、蘇胺酸（T）、精胺酸（R）或組胺酸（H）。
如請求項4之方法，其中該第一區段包含如SEQ ID NO: 11所示之胺基酸序列X ₁CDX ₂X ₃CGX ₅X ₆EGSX ₈X ₉，其中X ₁為纈胺酸（V）、異白胺酸（I）或白胺酸（L），X ₂為甘胺酸（G）或絲胺酸（S），X ₃為蘇胺酸（T）或丙胺酸（A），X ₅為離胺酸（K）或組胺酸（H），X ₆為絲胺酸（S）、離胺酸（K）或天門冬醯胺（N），X ₈為脯胺酸（P）或丙胺酸（A），X ₉為絲胺酸（S）、半胱胺酸（C）、蘇胺酸（T）、精胺酸（R）或組胺酸（H）。
如請求項4之方法，其中該第一區段包含如SEQ ID NO: 12所示之胺基酸序列X ₁CDGTCGKSEGSPX ₉，其中X _l為纈胺酸（V）或異白胺酸（I），且X ₉為絲胺酸（S）、半胱胺酸（C）或組胺酸（H）。
如請求項4所述之方法，其中該第一區段包含如SEQ ID NO: 13所示之胺基酸序列VCDGTCGKSEGSPX ₉，其中X ₉為絲胺酸（S）或組胺酸（H）。
如請求項2至7中任一項之方法，其中該胜肽具有小於100個胺基酸的長度，例如，80個胺基酸或更少、60個胺基酸或更少、40個胺基酸或更少、或30個胺基酸或更少。
如請求項4-8中任一項所述之方法，其中該第一區段包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列： VCDGTCGKSEGSPS（SEQ ID NO: 14）、 ICDGTCGKSEGSPC（SEQ ID NO: 15）、 LCDSACGHKEGSAT（SEQ ID NO: 16）、 LCDSACGHNEGSAR（SEQ ID NO: 17）、 VCDGTCGKSEGSPH（SEQ ID NO: 18）、 ACDGTCSNSEGGPH（SEQ ID NO: 19），以及 MCDSTCDKSEGSPH（SEQ ID NO: 20）。
如請求項4至9中任一項之方法，其中該第一區段融合至包含細胞穿透胜肽序列的第二區段。
如請求項10之方法，其中該細胞穿透胜肽序列選自由下列所組成之群組： RKKRRQRRR（SEQ IDNO: 21）、 RQIKIWFQNRRMKWKK（SEQ ID NO: 22）、 VRLPPPVRLPPPVRLPPP（SEQ ID NO: 23）、 TRQARRNRRRWRERQR（SEQ ID NO: 24）、 RRRNRTRRNRRRVR（SEQ ID NO: 25）、 TRRQRTRRARRNR（SEQ ID NO: 26）、 KRPAAIKKAGQAKKKK（SEQ ID NO: 27）、 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL（SEQ ID NO: 28），以及 LLIILRRRIRKQAHAHSK（SEQ ID NO: 29）。
如請求項11之方法，其中該IL-17RB抑制胜肽包含或由如RKKRRQRRRVCDGTCGKSEGSPS（SEQ ID NO: 30）所示之胺基酸序列所組成。
如請求項4至12中任一項之方法，其中該IL-17RB抑制胜肽為環狀胜肽。
如請求項1至13中任一項之方法，其中該疾病或病症為IL-17B/IL-17RB調節的增殖病症。
如請求項14之方法，其中該疾病或病症為癌症及其轉移。
如請求項15之方法，其中該癌症係選自由下列所組成之群組：肺癌、胰臟癌、乳癌、大腸直腸癌、肝癌、腎癌、頭頸癌、食道癌、胃癌、膽道癌、膽囊及膽管癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮體癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸腫瘤、成骨及軟組織肉瘤、血癌、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、皮膚癌、腦瘤，以及惡性胸膜間皮瘤。
如請求項16之方法，其中該癌症為乳癌。
如請求項16之方法，其中該癌症為胰臟癌。
一種如請求項4至13中任一項所定義之抑制MLK4與IL-17RB結合的IL-17RB抑制胜肽。
一種重組核酸，包含編碼如請求項4至13中任一項所定義之抑制MLK4與IL-17RB結合的IL-17RB抑制胜肽的核苷酸序列。
如請求項20之重組核酸，其為一載體。
一種組合物，包含如請求項4至13中任一項所定義之抑制MLK4與IL-17RB結合的IL-17RB抑制胜肽或如請求項20或21所述之重組核酸，以及生理學上可接受的載體。
如請求項22之組合物，其為醫藥組合物。
一種如請求項4至13中任一項所定義之抑制MLK4與IL-17RB結合的IL-17RB抑制胜肽或編碼該胜肽的核酸或包含該胜肽或該編碼核酸的組合物用於在有此需要的個體中抑制IL-17B/IL-17RB活化及/或治療與該活化相關之疾病或病症。
如請求項24之IL-17RB抑制胜肽、核酸或組合物，其中該疾病或病症為IL-17B/IL-17RB調節的增殖病症。
如請求項24或25之IL-17RB抑制胜肽、核酸或組合物，其中該疾病或病症為癌症及其轉移。
如請求項26之IL-17RB抑制胜肽、核酸或組合物，其中該癌症係選自由下列所組成之群組：肺癌、胰臟癌、乳癌、大腸直腸癌、肝癌、腎癌、頭頸癌、食道癌、胃癌、膽道癌、膽囊及膽管癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮體癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸腫瘤、成骨及軟組織肉瘤、血癌、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、皮膚癌、腦瘤，以及惡性胸膜間皮瘤。
如請求項27之IL-17RB胜肽、核酸或組合物，其中該癌症為乳腺癌。
如請求項27所述之IL-17RB胜肽、核酸或組合物，其中該癌症為胰臟癌。
一種如請求項4至13中任一項所定義之抑制MLK4與IL-17RB結合的IL-17RB抑制胜肽或編碼該胜肽的核酸或包含該胜肽或編碼核酸的組合物的用途，供製造用於抑制IL-17B/IL-17RB活化及/或在有此需要的個體中治療與這種活化相關的疾病或病症的藥物。
如請求項30之用途，其中該疾病或病症為IL-17B/IL-17RB調節的增殖病症。
如請求項30或31之用途，其中該疾病或病症為癌症及其轉移。
如請求項32之用途，其中該癌症係選自由下列所組成之群組：肺癌、胰臟癌、乳癌、大腸直腸癌、肝癌、腎癌、頭頸癌、食道癌、胃癌、膽道癌、膽囊及膽管癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮體癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸腫瘤、成骨及軟組織肉瘤、血癌、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、皮膚癌、腦瘤，以及惡性胸膜間皮瘤。
如請求項33之用途，其中該癌症為乳癌。
如請求項33之用途，其中該癌症為胰臟癌。
一種預測癌症預後之方法，包括測量獲自癌症患者的樣品中磷酸化IL-17RB的表現量，並基於該樣品中磷酸化IL-17RB的表現量確定該患者的癌症預後，其中該樣品中磷酸化IL-17RB表現量升高表示預後不良。
一種監測癌症患者中癌症進展之方法，包括（a）測量在第一時間點自該患者所獲得的第一生物樣品中的磷酸化IL-17RB蛋白的含量；（b）測量在第二時間點自該患者所獲得的第二生物樣品中的磷酸化IL-17RB蛋白的含量；以及（c）基於該第一及第二生物樣品中的含量確定該患者的癌症進展，其中相較於該第一生物樣品，該第二生物樣品中的磷酸化IL-17RB蛋白含量升高表示癌症進展。
如請求項36或37之方法，其中該癌症為胰臟癌。