TW202237190A - 抗ｃｅａ免疫結合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供式I之免疫結合物，其包含藉由與一或多個8-Het-2-胺基苯并氮呯衍生物結合而鍵聯之抗CEA抗體。本發明亦提供8-Het-2-胺基苯并氮呯衍生物中間物組合物，其包含反應性官能基。此類中間物組合物為適用於透過連接子或鍵聯部分形成該等免疫結合物之基質。本發明進一步提供用該等免疫結合物治療癌症之方法。

Description

抗CEA免疫結合物及其用途
本發明大體上係關於一種免疫結合物，其包含結合至一或多個8-Het-2-胺基苯并氮呯分子之抗癌胚抗原(CEA)抗體。
為了達至不可及之腫瘤及/或擴大癌症患者及其他個體之治療選擇，需要用於遞送抗體及免疫佐劑之新組合物及方法。本發明提供此等組合物及方法。
本發明大體上係關於免疫結合物，其包含藉由與一或多個8-Het-2-胺基苯并氮呯分子結合而鍵聯之抗CEA抗體。本發明進一步係關於8-Het-2-胺基苯并氮呯衍生物中間物組合物，其包含反應性官能基。此等中間物組合物為適合用於形成免疫結合物之基質，其中抗體可藉由連接子L共價結合至具有下式之8-Het-2-胺基苯并氮呯(HxBz)部分：
Figure 02_image001
其中Het選自雜環二基及雜芳二基；且R 1、R 2、R 3及R 4之一連接至L。R 1-4及X 1-4取代基在本文中定義。
本發明進一步係關於此等免疫結合物用於治療疾病(特別是癌症)之用途。
本發明之一態樣為一種包含抗體之免疫結合物，該抗體共價連接至連接子，該連接子共價連接至一或多個8-Het-2-胺基苯并氮呯部分。
本發明之另一態樣為一種8-Het-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物。
本發明之另一態樣為一種用於治療癌症之方法，該方法包含投與治療有效量之免疫結合物，該免疫結合物包含藉由與一或多個8-Het-2-胺基苯并氮呯部分結合而鍵聯之抗體。
本發明之另一態樣為免疫結合物用於治療癌症之用途，該免疫結合物包含藉由與一或多個8-Het-2-胺基苯并氮呯部分結合而鍵聯之抗體。
本發明之另一態樣為一種製備免疫結合物之方法，該方法藉由使一或多個8-Het-2-胺基苯并氮呯部分與抗體結合來進行。
相關申請案之交叉引用
本非臨時申請案主張2020年12月11日申請之美國臨時申請案第63/124,328號之優先權益，該美國臨時申請案以引用方式整體併入本文中。
現將詳細參照本發明之某些實施例，該等實施例之實例以所附結構及式予以說明。雖然將結合所列舉之實施例描述本發明，但應瞭解其不旨在將本發明限於彼等實施例。相反地，本發明旨在涵蓋可包括在如申請專利範圍所限定之本發明範疇內的所有替代、修改以及等效物。
熟習此項技術者將認識到可用於實踐本發明之類似或等效於本文描述的彼等者的許多方法及材料。本發明決不限於所描述之方法及材料。 定義
術語「免疫結合物」或「免疫刺激性抗體結合物」係指藉由連接子共價鍵結至佐劑部分之抗體構築體。術語「佐劑」係指能夠在暴露於佐劑之個體中引發免疫反應之物質。
「佐劑部分」係指如本文所述例如透過連接子共價鍵結至抗體構築體之佐劑。佐劑部分可在鍵結至抗體構築體時或在向個體投與免疫結合物後自抗體構築體裂解(例如酶促裂解)後引發免疫反應。
「佐劑」係指能夠在暴露於佐劑之個體中引發免疫反應之物質。
術語「類鐸受體」及「TLR」係指識別病原體相關分子模式且在先天性免疫中充當主要傳訊元件之高度保守性哺乳動物蛋白質家族之任何成員。TLR多肽共享一特徵結構，該特徵結構包括具有富白胺酸重複之細胞外域、跨膜域及參與TLR傳訊之細胞內域。
術語「類鐸受體7」及「TLR7」係指與公眾可獲得之TLR7序列共享至少約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更大序列同一性之核酸或多肽，該公眾可獲得之TLR7序列例如人類TLR7多肽之GenBank登錄號AAZ99026或鼠類TLR7多肽之GenBank登錄號AAK62676。
術語「類鐸受體8」及「TLR8」係指與公眾可獲得之TLR7序列共享至少約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更大序列同一性之核酸或多肽，該公眾可獲得之TLR8序列例如人類TLR8多肽之GenBank登錄號AAZ95441或鼠類TLR8多肽之GenBank登錄號AAK62677。
「TLR促效劑」為直接或間接結合至TLR (例如TLR7及/或TLR8)以誘導TLR傳訊之物質。任何可偵測之TLR傳訊差異均可表明促效劑刺激或活化TLR。傳訊差異可表現為例如在訊號轉導組分之磷酸化、下游元件(諸如核因子-κB (NF-κB))之細胞內定位、某些組分(諸如IL-1受體相關激酶(IRAK))與其他蛋白質或細胞內結構之締合或諸如激酶(諸如促分裂原活化蛋白激酶(MAPK))之組分的生化活性中靶標基因之表現的變化。
「抗體」係指包含來自免疫球蛋白基因或其片段之抗原結合區(包括互補決定區(CDR))的多肽。術語「抗體」具體地涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及表現出所需生物活性之抗體片段。示範性免疫球蛋白(抗體)結構單位包含四聚體。各四聚體由兩對相同多肽鏈組成，每對具有藉由二硫鍵連接之一條「輕」鏈(約25 kDa)及一條「重」鏈(約50-70 kDa)。各鏈由結構域組成，其稱為免疫球蛋白域。此等域根據大小及功能分類為不同類別，例如輕鏈及重鏈上之可變域或可變區(分別為V L及V H)及輕鏈及重鏈上之恆定域或恆定區(分別為C L及C H)。各鏈之N端確定約100至110或更多個胺基酸之可變區，稱為互補位，主要負責抗原識別，亦即，抗原結合域。輕鏈分類為κ或λ。重鏈分類為γ、μ、α、δ或ε，其又分別將免疫球蛋白類別確定為IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。IgG抗體為約150 kDa之大分子，由四條肽鏈組成。IgG抗體含有兩條約50 kDa之相同γ類重鏈及兩條約25 kDa之相同輕鏈，因此為四聚四級結構。兩條重鏈彼此鍵聯且各自藉由二硫鍵鍵聯至輕鏈。所得四聚體具有相同的兩半，其一起形成Y樣形狀。叉形物之各末端含有相同抗原結合域。人類中存在四個IgG子類(IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)，以其在血清中之豐度順序命名(亦即，IgG1最豐富)。典型地，在結合於癌細胞之特異性及親和力方面，抗體之抗原結合域將最為關鍵。
「抗體構築體」係指包含(i)抗原結合域及(ii) Fc域之抗體或融合蛋白。
在一些實施例中，結合劑為抗原結合抗體「片段」，其為至少包含單獨或與一起構成抗原結合構築體之其他組分一起的抗體之抗原結合區的構築體。許多不同類型之抗體「片段」為此項技術中已知的，包括例如(i) Fab片段，其為由V L、V H、C L及CH 1域組成之單價片段；(ii) F(ab') 2片段，其為包含在鉸鏈區藉由二硫橋鍵聯之兩個Fab片段的二價片段；(iii) Fv片段，其由抗體之單一臂之V L及V H域組成；(iv) Fab'片段，其由使用適度還原條件破壞F(ab') 2片段之二硫橋產生；(v)二硫化物穩定之Fv片段(dsFv)；及(vi)單鏈Fv (scFv)，其為由藉由合成鍵聯子連接之Fv片段之兩個域(亦即，V L及V H)組成之單價分子，該合成鍵聯子能夠將兩個域合成為單一多肽鏈。
抗體或抗體片段可為較大構築體(例如抗體片段與其他區域之結合物或融合構築體)之一部分。舉例而言，在一些實施例中，抗體片段可融合至如本文所描述之Fc區。在其他實施例中，抗體片段(例如Fab或scFv)可為例如藉由融合至跨膜域(視情況具有中間連接子或「莖」(例如鉸鏈區))及視情況存在之細胞間傳訊域而得到的嵌合抗原受體或嵌合T細胞受體之一部分。
「表位」意指抗原之與抗原結合域(亦即，在抗原結合域之互補位處)結合的任何抗原決定位或表位決定位。抗原決定位通常由化學活性表面成組之分子(諸如胺基酸或糖側鏈)組成，且通常具有特定三維結構特徵，以及特定電荷特徵。
術語「Fc受體」或「FcR」係指結合於抗體之Fc區的受體。存在三種主要類別之Fc受體：(1) FcγR，其結合於IgG，(2) FcαR，其結合於IgA，及(3) FcεR，其結合於IgE。FcγR家族包括若干成員，諸如FcγI (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16A)及FcγRIIIB (CD16B)。Fcγ受體對IgG之親和力不同且亦對IgG子類(例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)具有不同親和力。
如本文提及之核酸或胺基酸序列「統一性」可藉由將相關核酸或胺基酸序列與參考核酸或胺基酸序列相比較來確定。同一性百分比為最佳比對之相關序列與參考序列之間相同(亦即，相同)之核苷酸或胺基酸殘基數目除以最長序列之長度(亦即，相關序列或參考序列之長度，以較長者為準)。序列之比對及同一性百分比之計算可使用可獲得之軟體程式來進行。此等程式之實例包括CLUSTAL-W、T-Coffee及ALIGN (用於比對核酸及胺基酸序列)、BLAST程式(例如BLAST 2.1、BL2SEQ、BLASTp、BLASTn及類似程式)及FASTA程式(例如FASTA3x、FASTM及SSEARCH) (用於序列比對及序列相似性檢索)。序列比對算法亦揭示於例如Altschul等人, J. Molecular Biol., 215(3): 403-410 (1990)；Beigert等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(10): 3770-3775 (2009)；Durbin等人編, Biological Sequence Analysis: Probalistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, UK (2009), Soding, Bioinformatics, 21(7): 951-960 (2005)；Altschul等人, Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402 (1997)；及Gusfield, Algorithms on Strings, Trees and Sequences, Cambridge University Press, Cambridge UK (1997))。序列同一性百分比(%)亦可例如經計算為100 x [(相同位置)/min(TG A、TG B)]，其中TG A及TG B為在使TG A及TG B最小化之比對中肽序列A及B中之殘基及內部空隙位置之數目的總和。參見例如Russell等人, J. Mol Biol., 244: 332-350 (1994)。
結合劑包含一起形成抗原結合位點之Ig重鏈及輕鏈可變區多肽。重鏈及輕鏈可變區中之每一者為包含藉由構架區連接之三個互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3)的多肽。結合劑可為此項技術中已知包含Ig重鏈及輕鏈之多種類型之結合劑中之任一者。舉例而言，結合劑可為抗體、抗原結合抗體「片段」或T細胞受體。
「生物仿製藥」係指經批准之抗體構築體，其具有類似於例如靶向CEA之抗體，例如拉貝珠單抗(labetuzumab)(CEA-CIDE TM、MN-14、hMN14，Immunomedics) CAS登記號219649-07-7)之活性特性。
「生物改良藥(biobetter)」係指對先前經批准之抗體構築體(諸如拉貝珠單抗)的改良的經批准之抗體構築體。生物改良藥可以相對於先前經批准之抗體構築體具有一或多個修飾(例如經改變之聚醣型態或獨特表位)。生物改良藥為來自與現有生物藥物相同之類別但並不相同的重組蛋白藥物；且優於原始藥物。生物改良藥不完全為新藥，亦非仿製藥。生物仿製藥及生物改良藥均為生物製劑之變異體；前者為原研藥之近似複製品，而後者在療效、安全性及耐藥性或給藥方案方面得到了改進。
「胺基酸」係指可併入肽、多肽或蛋白質中之任何單體單元。胺基酸包括天然存在之α-胺基酸及其立體異構物，以及非天然(非天然存在之)胺基酸及其立體異構物。給定胺基酸之「立體異構物」係指分子式及分子內鍵相同但鍵及原子之三維排列不同之異構物(例如L-胺基酸及對應D-胺基酸)。胺基酸可經糖基化(例如 N-鍵聯之聚醣、 O-鍵聯之聚醣、磷酸聚醣、 C-鍵聯之聚醣或糖基磷脂醯肌醇化(glypication))或去糖基化。在本文中可藉由通常已知之三字母符號或藉由IUPAC-IUB生物化學命名委員會建議之一字母符號提及胺基酸。
天然存在之胺基酸為由遺傳密碼編碼之彼等胺基酸，以及隨後經修飾之彼等胺基酸，例如羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽及 O-磷酸絲胺酸。天然存在之α-胺基酸包括但不限於丙胺酸(Ala)、半胱胺酸(Cys)、天冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)、苯丙胺酸(Phe)、甘胺酸(Gly)、組胺酸(His)、異白胺酸(Ile)、精胺酸(Arg)、離胺酸(Lys)、白胺酸(Leu)、甲硫胺酸(Met)、天冬醯胺(Asn)、脯胺酸(Pro)、麩醯胺(Gln)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、纈胺酸(Val)、色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)及其組合。天然存在之α-胺基酸之立體異構物包括但不限於D-丙胺酸(D-Ala)、D-半胱胺酸(D-Cys)、D-天冬胺酸(D-Asp)、D-麩胺酸(D-Glu)、D-苯丙胺酸(D-Phe)、D-組胺酸(D-His)、D-異白胺酸(D-Ile)、D-精胺酸(D-Arg)、D-離胺酸(D-Lys)、D-白胺酸(D-Leu)、D-甲硫胺酸(D-Met)、D-天冬醯胺(D-Asn)、D-脯胺酸(D-Pro)、D-麩醯胺(D-Gln)、D-絲胺酸(D-Ser)、D-蘇胺酸(D-Thr)、D-纈胺酸(D-Val)、D-色胺酸(D-Trp)、D-酪胺酸(D-Tyr)及其組合。
天然存在之胺基酸包括在蛋白質中藉由轉譯後修飾形成之彼等胺基酸，諸如瓜胺酸(Cit)。
非天然(非天然存在之)胺基酸包括但不限於呈L-組態或D-組態之胺基酸類似物、胺基酸模擬物、合成胺基酸、 N-取代甘胺酸及 N-甲基胺基酸，其以類似於天然存在之胺基酸的方式發揮功能。舉例而言，「胺基酸類似物」可為非天然胺基酸，其與天然存在之胺基酸具有相同基本化學結構(亦即，鍵結至氫、羧基、胺基之碳)，但具有經修飾之側鏈基團或經修飾之肽骨架，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸及甲硫胺酸甲基鋶。「胺基酸模擬物」係指結構不同於胺基酸之一般化學結構，但以類似於天然存在之胺基酸的方式發揮功能的化合物。
「連接子」係指共價鍵結化合物或材料中之兩個或更多個部分之官能基。舉例而言，鍵聯部分可用以在免疫結合物中使佐劑部分共價鍵結至抗體構築體。
「鍵聯部分」係指共價鍵結化合物或材料中之兩個或更多個部分的官能基。舉例而言，鍵聯部分可用以在免疫結合物中使佐劑部分共價鍵結至抗體。適合用於將鍵聯部分連接至蛋白質及其他材料之鍵包括但不限於醯胺、胺、酯、胺基甲酸酯、尿素、硫醚、硫代胺基甲酸酯、硫代碳酸酯及硫脲。
「二價」係指含有用於鍵聯兩個官能基之兩個連接點的化學部分；多價鍵聯部分可具有用於鍵聯進一步官能基之其他連接點。二價基團可用後綴「二基」表示。舉例而言，二價鍵聯部分包括二價聚合物部分，諸如二價聚(乙二醇)、二價環烷基、二價雜環烷基、二價芳基及二價雜芳基。「二價環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基」係指具有用於共價鍵聯分子或材料中之兩個部分之兩個連接點的環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基。環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基可經取代或未經取代。環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基可經選自以下之一或多個基團取代：鹵基、羥基、胺基、烷基胺基、醯胺基、醯基、硝基、氰基及烷氧基。
波浪線(「
Figure 02_image003
」)表示指定化學部分之連接點。若指定化學部分有兩個波浪線存在，則應瞭解該化學部分可雙向使用，亦即，如自左至右或自右至左讀取。
「烷基」係指具有所指示之碳原子數目的直鏈(線性)或分支鏈、飽和的脂族基。烷基可包括任何數目之碳，例如一個至十二個。烷基之實例包括但不限於甲基(Me，-CH 3)、乙基(Et，-CH 2CH 3)、1-丙基(n-Pr，正丙基，-CH 2CH 2CH 3)、2-丙基(i-Pr，異丙基，-CH(CH 3) 2)、1-丁基(n-Bu，正丁基，-CH 2CH 2CH 2CH 3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu，異丁基，-CH 2CH(CH 3) 2)、2-丁基(s-Bu，第二丁基，-CH(CH 3)CH 2CH 3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu，第三丁基，-C(CH 3) 3)、1-戊基(正戊基，-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 3)、2-戊基(-CH(CH 3)CH 2CH 2CH 3)、3-戊基(-CH(CH 2CH 3) 2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH 3) 2CH 2CH 3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH 3)CH(CH 3) 2)、3-甲基-1-丁基(-CH 2CH 2CH(CH 3) 2)、2-甲基-1-丁基(-CH 2CH(CH 3)CH 2CH 3)、1-己基(-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2CH 3)、2-己基(-CH(CH 3)CH 2CH 2CH 2CH 3)、3-己基(-CH(CH 2CH 3)(CH 2CH 2CH 3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH 3) 2CH 2CH 2CH 3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH 3)CH(CH 3)CH 2CH 3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH 3)CH 2CH(CH 3) 2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH 3)(CH 2CH 3) 2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH 2CH 3)CH(CH 3) 2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH 3) 2CH(CH 3) 2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH 3)C(CH 3) 3、1-庚基、1-辛基及類似基團。烷基可經取代或未經取代。「經取代之烷基」可經選自以下之一或多個基團取代：鹵基、羥基、胺基、側氧基(＝O)、烷基胺基、醯胺基、醯基、硝基、氰基及烷氧基。
術語「烷基二基」係指二價烷基。烷基二基之實例包括但不限於亞甲基(-CH 2-)、伸乙基(-CH 2CH 2-)、伸丙基(-CH 2CH 2CH 2-)及類似基團。烷基二基基團亦可稱為「伸烷基」。
「烯基」係指具有所指示之碳原子數目及至少一個碳-碳雙鍵( sp2)之直鏈(線性)或分支鏈、不飽和、脂族基。烯基可包括兩個至約12個或更多個碳原子。烯基為具有「順式」及「反式」取向或者「E」及「Z」取向之基團。實例包括但不限於乙烯基(ethylenyl/vinyl) (-CH＝CH 2)、烯丙基(-CH 2CH＝CH 2)、丁烯基、戊烯基及其異構物。烯基可經取代或未經取代。「經取代之烯基」可經選自以下之一或多個基團取代：鹵基、羥基、胺基、側氧基(＝O)、烷基胺基、醯胺基、醯基、硝基、氰基及烷氧基。
術語「伸烯基」或「烯基二基」係指直鏈或分支鏈二價烴基。實例包括但不限於伸乙烯基(ethylenylene/vinylene) (-CH＝CH-)、烯丙基(-CH 2CH＝CH-)及類似基團。
「炔基」係指具有所指示之碳原子數目及至少一個碳-碳三鍵( sp)之直鏈(線性)或分支鏈、不飽和、脂族基。炔基可包括兩個至約12個或更多個碳原子。舉例而言，C 2-C 6炔基包括但不限於乙炔基(-C≡CH)、丙炔基(炔丙基，-CH 2C≡CH)、丁炔基、戊炔基、己炔基及其異構物。炔基可經取代或未經取代。「經取代之炔基」可經選自以下之一或多個基團取代：鹵基、羥基、胺基、側氧基(＝O)、烷基胺基、醯胺基、醯基、硝基、氰基及烷氧基。
術語「伸炔基」或「炔基二基」係指二價炔基。
術語「碳環(carbocycle)」、「碳環基」、「碳環(carbocyclic ring)」及「環烷基」係指含有3至12個環原子或所指示之原子數目的飽和或部分不飽和、單環、稠合雙環或橋接多環組件。飽和單環碳環包括例如環丙基、環丁基、環戊基、環己基及環辛基。飽和雙環及多環碳環包括例如降冰片烷、[2.2.2]二環辛烷、十氫萘及金剛烷。碳環基亦可為部分不飽和的，環中具有一或多個雙鍵或三鍵。代表性部分不飽和之碳環基包括但不限於環丁烯、環戊烯、環己烯、環己二烯(1,3-異構體及1,4-異構體)、環庚烯、環庚二烯、環辛烯、環辛二烯(1,3-異構體、1,4-異構體及1,5-異構體)、降冰片烯及降冰片二烯。
術語「環烷基二基」係指二價環烷基。
「芳基」係指藉由自母體芳族環系統之單一碳原子移除一個氫原子衍生而來之6-20個碳原子(C 6-C 20)的單價芳族烴基。芳基可為單環，稠合形成雙環或三環基團，或由鍵鍵聯形成二芳基。代表性芳基包括苯基、萘基及聯苯。其他芳基包括苯甲基，其具有亞甲基鍵聯基團。一些芳基具有6至12個環成員，諸如苯基、萘基或聯苯。其他芳基具有6至10個環成員，諸如苯基或萘基。
術語「伸芳基」或「芳基二基」意指藉由自母體芳族環系統之兩個碳原子移除兩個氫原子衍生而來之6-20個碳原子(C 6-C 20)的二價芳族烴基。一些芳基二基在示範性結構中表示為「Ar」。芳基二基包括包含稠合至飽和、部分不飽和環或芳族碳環之芳族環的雙環基團。典型芳基二基包括但不限於衍生自苯之基團(苯基二基)、經取代苯、萘、蒽、伸聯苯基、伸茚基、伸茚滿基、1,2-二氫萘、1,2,3,4-四氫萘基及類似基團。芳基二基亦稱為「伸芳基」，且視情況經本文所描述之一或多個取代基取代。
術語「雜環(heterocycle)」、「雜環基」及「雜環(heterocyclic ring)」在本文中可互換使用且係指3至約20個環原子之飽和或部分不飽和(亦即，環內具有一或多個雙鍵及/或三鍵)碳環基團，其中至少一個環原子為選自氮、氧、磷及硫之雜原子，剩餘環原子為C，其中一或多個環原子視情況獨立地經下文所描述之一或多個取代基取代。雜環可為具有3至7個環成員(2至6個碳原子及1至4個選自N、O、P及S之雜原子)之單環或具有7至10個環成員(4至9個碳原子及1至6個選自N、O、P及S之雜原子)之雙環，例如：雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統。雜環描述於Paquette, Leo A.; 「 Principles of Modern Heterocyclic Chemistry」 (W.A. Benjamin, New York, 1968), 尤其第1、3、4、6、7及9章；「 The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs」 (John Wiley & Sons, New York, 1950至現在)，特別為第13、14、16、19及28章； 及 J. Am. Chem. Soc.(1960) 82:5566。「雜環基」亦包括雜環基團與飽和、部分不飽和環或芳族碳環或雜環稠合之基團。雜環之實例包括但不限於 嗎啉-4-基、哌啶-1-基、哌嗪基、哌嗪-4-基-2-酮、哌嗪-4-基-3-酮、吡咯啶-1-基、硫代嗎啉-4-基、S-二側氧基硫代嗎啉-4-基、氮雜環辛烷-1-基、氮雜環丁烷-1-基、八氫吡啶並[1,2-a]吡嗪-2-基、[1,4]二氮雜環庚烷-1-基、吡咯啶基、四氫呋喃基、二氫呋喃基、四氫噻吩基、四氫哌喃基、二氫哌喃基、四氫噻喃基、哌啶基、嗎啉基、硫代嗎啉基、噻噁烷基、哌嗪基、高哌嗪基、氮雜環丁烷基、氧雜環丁烷基、硫雜環丁烷基、高哌啶基、氧雜環庚烷基、硫雜環庚烷基、氧氮呯基、二氮呯基、噻氮呯基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、吲哚啉基、2H-哌喃基、4H-哌喃基、二氧雜環己烷基、1,3-二氧雜環戊烷基、吡唑啉基、二硫雜環己烷基、二硫雜環戊烷基、二氫哌喃基、二氫噻吩基、二氫呋喃基、吡唑啶基咪唑啉基、咪唑啶基、3-氮雜雙環[3.1.0]己基、3-氮雜雙環[4.1.0]庚基、氮雜雙環[2.2.2]己基、3H-吲哚基喹嗪基及N-吡啶基脲。螺雜環基部分亦包括在此定義範圍內。螺雜環基部分之實例包括氮雜螺[2.5]辛基及氮雜螺[2.4]庚基。其中2個環原子經側氧基(＝O)部分取代之雜環基之實例為嘧啶酮基及1,1-二側氧基-硫代嗎啉基。本文之雜環基團視情況獨立地經本文所描述之一或多個取代基取代。
術語「雜環基二基」係指3至約20個環原子之二價、飽和或部分不飽和(亦即，環內具有一或多個雙鍵及/或三鍵)碳環基團，其中至少一個環原子為選自氮、氧、磷及硫之雜原子，剩餘環原子為C，其中一或多個環原子視情況獨立地經如所描述之一或多個取代基取代。5-員及6-員雜環基二基之實例包括嗎啉基二基、哌啶基二基、哌嗪基二基、吡咯啶基二基、二氧雜環己烷基二基、硫代嗎啉基二基及S-二側氧基硫代嗎啉基二基。
術語「雜芳基」係指5-員、6-員或7-員環之單價芳族基團，且包括5-20個原子之稠環系統(其中之至少一者為芳族環)，其含有獨立地選自氮、氧及硫之一或多個雜原子。雜芳基之實例為吡啶基(包括例如2-羥基吡啶基)、咪唑基、咪唑并吡啶基、嘧啶基(包括例如，4-羥基嘧啶基)、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、異噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噁唑基、異噻唑基、吡咯基、喹啉基、異喹啉基、四氫異喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲哚嗪基、酞嗪基、噠嗪基、三嗪基、異吲哚基、喋啶基、嘌呤基、噁二唑基、噻二唑基、噻二唑基、呋吖基、苯并呋吖基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喏啉基、萘啶基及呋喃并吡啶基。雜芳基視情況獨立地經本文所描述之一或多個取代基取代。
術語「雜芳基二基」係指5員、6員或7員環之二價芳族基團，且包括5-20個原子之稠環系統(其中之至少一者為芳族環)，其含有獨立地選自氮、氧及硫之一或多個雜原子。5員及6員雜芳基二基之實例包括吡啶基二基、咪唑基二基、嘧啶基二基、吡唑基二基、三唑基二基、吡嗪基二基、四唑基二基、呋喃基二基、噻吩基二基、異噁唑基二基、噻唑基二基、噁二唑基二基、噁唑基二基、異噻唑基二基及吡咯基二基。
可能時，雜環或雜芳基可為碳(碳鍵聯)或氮(氮鍵聯)鍵結的。舉例而言且不限於，碳鍵結之雜環或雜芳基係鍵結於吡啶之位置2、3、4、5或6；噠嗪之位置3、4、5或6；嘧啶之位置2、4、5或6；吡嗪之位置2、3、5或6；呋喃、四氫呋喃、噻吩(thiofuran)、噻吩(thiophene)、吡咯或四氫吡咯之位置2、3、4或5；噁唑、咪唑或噻唑之位置2、4或5；異噁唑、吡唑或異噻唑之位置3、4或5；氮雜環丙烷之位置2或3；氮雜環丁烷之位置2、3或4；喹啉之位置2、3、4、5、6、7或8；或異喹啉之位置1、3、4、5、6、7或8。
舉例而言且不限於，氮鍵結之雜環或雜芳基係鍵結於氮雜環丙烷、氮雜環丁烷、吡咯、吡咯啶、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑啶、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、二氫吲哚、1H-吲唑之位置1；異吲哚或異吲哚啉之位置2；嗎啉之位置4；及咔唑或β-咔啉之位置9。
術語「鹵基」及「鹵素」單獨或作為另一取代基之一部分係指氟、氯、溴或碘原子。
術語「羰基」單獨或作為另一取代基之一部分係指C(＝O)或-C(＝O)-，亦即，碳原子雙鍵鍵結至氧且結合於具有羰基之部分中之兩個其他基團。
如本文所用，片語「四級銨鹽」係指已經烷基取代基(例如C 1-C 4烷基，諸如甲基、乙基、丙基或丁基)四級銨化之三級胺。
術語「治療(treat/treatment/treating)」係指成功治療或改善損傷、病變、疾患(例如癌症)或症狀(例如認知損傷)之任何標誌，包括任何客觀或主觀參數，諸如消除；緩和；症狀減少或使症狀、損傷、病變或疾患對患者來說更可耐受；症狀進展速率降低；症狀或疾患之頻率降低或持續時間縮短；或，在一些情況下，防止症狀發作。症狀之治療或改善可基於任何客觀或主觀參數，包括例如身體檢查之結果。
術語「癌症」、「贅瘤」及「腫瘤」在本文中用於指如下細胞，該等細胞展現自發、不受控制的生長，使得細胞展現以明顯失去對細胞增殖之控制為特徵的異常生長表型。在本發明之情形中用於偵測、分析及/或處理之相關細胞包括癌細胞(例如來自患有癌症之個體的癌細胞)、惡性癌細胞、轉移前癌細胞、轉移性癌細胞及非轉移性癌細胞。幾乎每個組織之癌症均為已知的。片語「癌症負荷」係指個體中癌細胞之量或癌症體積。因此，降低之癌症負荷係指個體中降低之癌細胞數目或癌細胞體積。如本文所用之術語「癌細胞」係指作為癌細胞(例如來自可對個體進行治療之癌症中之任一者的癌細胞，例如自患有癌症之個體分離的癌細胞)或衍生自癌細胞(例如癌細胞純系)的任何細胞。舉例而言，癌細胞可來自已建立之癌細胞株，可為自患有癌症之個體分離的原代細胞，可為來自自患有癌症之個體分離的原代細胞之後代細胞，及類似情況。在一些實施例中，該術語亦可指癌細胞之一部分，諸如亞細胞部分、細胞膜部分或癌細胞之細胞溶解產物。許多類型之癌症為熟習此項技術者已知的，包括實體腫瘤，諸如癌瘤、肉瘤、膠質母細胞瘤、黑色素瘤、淋巴瘤及骨髓瘤；及循環癌症，諸如白血病。
如本文所用，術語「癌症」包括任何形式之癌症，包括但不限於實體腫瘤癌症(例如皮膚癌、肺癌、前列腺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、卵巢癌、胰臟癌、腎癌、肝癌、膠質母細胞瘤、神經管母細胞瘤、平滑肌肉瘤、頭頸鱗狀細胞癌、黑色素瘤及神經內分泌癌)及液體癌(例如血液癌)；癌瘤；軟組織腫瘤；肉瘤；畸胎瘤；黑色素瘤；白血病；淋巴瘤；及腦癌，包括微小殘留病，且包括原發性腫瘤與轉移性腫瘤兩者。
癌症之「病變」包括損害患者健康之所有現象。此包括但不限於異常或不可控制之細胞生長；轉移；干擾相鄰細胞之正常功能；細胞因子或其他分泌產物之異常水準之釋放；炎性或免疫反應之抑制或加重；瘤形成；癌前病變；惡性腫瘤；及侵入周圍或遠處組織或器官，諸如淋巴結。
如本文所用，片語「癌症復發」及「腫瘤復發」及其語法變化型式係指在癌症診斷之後贅生性細胞或癌細胞之進一步生長。特定而言，當癌組織中發生進一步癌細胞生長時可發生復發。類似地，當腫瘤細胞播散至局部或遠處組織及器官中時，發生「腫瘤擴散」，因此，腫瘤擴散涵蓋腫瘤轉移。當腫瘤生長局部擴散從而藉由壓製、破壞或阻止正常器官功能損害累及組織之功能時，發生「腫瘤侵入」。
如本文所用，術語「轉移」係指不直接連接至原始癌性腫瘤器官之器官或身體部位中之癌性腫瘤生長。轉移將被理解為包括微轉移，其為在不直接連接至原始癌性腫瘤器官之器官或身體部位中存在不可偵測量之癌細胞。轉移亦可定義若干步驟之過程，諸如癌細胞偏離原始腫瘤位點及癌細胞遷移至及/或侵入身體之其他部位。
片語「有效量」及「治療有效量」係指諸如免疫結合物之物質產生投與所要達成之治療效應的劑量或量。確切劑量將視治療目的而定，且將可由熟習此項技術者使用已知技術確定(參見例如Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷, 1992)；Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar, Dosage Calculations(1999)； Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第11版(McGraw-Hill, 2006)；及 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第22版, (Pharmaceutical Press, London, 2012))。在癌症之情況下，治療有效量之免疫結合物可降低癌細胞數目；減小腫瘤尺寸；抑制(亦即，在某種程度上減慢且較佳阻止)癌細胞浸潤至外周器官中；抑制(亦即，在某種程度上減慢且較佳阻止)腫瘤轉移；在某種程度上抑制腫瘤生長；及/或在某種程度上緩解與癌症相關之症狀中之一或多者。在免疫結合物可阻止生長及/或殺死現有癌細胞之情況下，其可為細胞抑制的及/或細胞毒性的。對於癌症治療，可例如藉由評估疾病進展時間(TTP)及/或確定反應率(RR)來量測功效。
「接受者」、「個體(individual/subject)」、「宿主」及「患者」可互換使用且係指需要診斷、治療或療法之任何哺乳動物個體(例如人類)。用於治療目的之「哺乳動物」係指分類為哺乳動物之任何動物，包括人類、家養動物及農場動物以及動物園動物、運動動物或寵物動物，諸如狗、馬、貓、牛、綿羊、山羊、豬、駱駝等。在某些實施例中，哺乳動物為人類。
片語「協同佐劑」或「協同組合」在本發明之背景下包括兩種免疫調節劑(諸如受體促效劑、細胞因子及佐劑多肽)之組合，相對於單獨投與任一者其在組合中引發對免疫性之協同效應。特定而言，本文所揭示之免疫結合物包含所主張之佐劑及抗體構築體之協同組合。例如相對於當在不存在另一部分之情況下投與抗體構築體或佐劑時，此等協同組合在投與後對免疫性引發更大的效應。另外，與單獨投與抗體構築體或佐劑時相比，可投與降低量之免疫結合物(如藉由作為免疫結合物之一部分而投與之抗體構築體的總數目或佐劑的總數目所量測)。
如本文所用，術語「投與」係指向個體非經腸、靜脈內、腹膜內、肌內、瘤內、病損內、鼻內或皮下投與、經口投與、作為栓劑投與、表面接觸、鞘內投與或植入緩釋裝置，例如微型滲透泵。
如本文用於修飾數值之術語「約」及「大約」指示數值周圍近距離之範圍。因此，若「X」為該值，則「約X」或「大約X」指示0.9X至1.1X，例如0.95X至1.05X或0.99X至1.01X之值。提及「約X」或「大約X」特定而言至少指示值X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X及1.05X。因此，「約X」及「大約X」旨在教示且為例如「0.98X」之請求項限制提供書面描述支持。 CEA抗體
本發明之免疫結合物包含靶向、結合或識別癌胚抗原(CEA、CD66e、CEACAM5)之抗體。本發明實施例之範圍內包括本文所描述之抗體構築體或抗原結合域之功能性變異體。如本文所用，術語「功能性變異體」係指抗原結合域與母體抗體構築體或抗原結合域具有實質性或顯著序列同一性或相似性之抗體構築體，該功能性變異體保留其作為變異體之抗體構築體或抗原結合域之生物活性。功能性變異體涵蓋例如本文所描述之抗體構築體或抗原結合域(母體抗體構築體或抗原結合域)之彼等變異體，其保留識別表現CEA之靶標細胞的能力之程度與母體抗體構築體或抗原結合域類似、相同或更高。
關於抗體構築體或抗原結合域，功能性變異體之胺基酸序列可例如與抗體構築體或抗原結合域具有至少約30%、約50%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更大同一性。
功能性變異體可例如包含具有至少一個保守胺基酸取代之母體抗體構築體或抗原結合域之胺基酸序列。或者或另外，功能性變異體可包含具有至少一個非保守胺基酸取代之母體抗體構築體或抗原結合域之胺基酸序列。在此情況下，非保守胺基酸取代較佳不干擾或抑制功能性變異體之生物活性。非保守胺基酸取代可增強功能性變異體之生物活性，使得功能性變異體之生物活性與母體抗體構築體或抗原結合域相比有所增加。
構成本發明之免疫結合物之抗體包括Fc經工程改造之變異體。在一些實施例中，Fc區中產生經調節之與一或多個Fc受體之結合的突變可包括以下突變中之一或多者：SD (S239D)、SDIE (S239D/I332E)、SE (S267E)、SELF (S267E/L328F)、SDIE (S239D/I332E)、SDIEAL (S239D/I332E/A330L)、GA (G236A)、ALIE (A330L/I332E)、GASDALIE (G236A/S239D/A330L/I332E)、V9 (G237D/P238D/P271G/A330R)及V11 (G237D/P238D/H268D/P271G/A330R)，及/或以下胺基酸處之一或多個突變：E345R、E233、G237、P238、H268、P271、L328及A330。用於調節Fc受體結合之其他Fc區修飾描述於例如US 2016/0145350及US 7416726及US 5624821中，該等專利以全文引用之方式併入本文中。
構成本發明之免疫結合物之抗體包括聚醣變異體，諸如非岩藻糖基化(afucosylation)。在一些實施例中，結合劑之Fc區經修飾以與天然非修飾Fc區相比具有改變之Fc區之糖基化模式。
本發明抗體構築體或抗原結合域之胺基酸取代較佳為保守胺基酸取代。保守胺基酸取代為此項技術中已知的，且包括其中具有某些物理及/或化學特性之一個胺基酸換成具有相同或類似化學或物理特性之另一胺基酸的胺基酸取代。舉例而言，保守胺基酸取代可為酸性/帶負電荷之極性胺基酸取代另一酸性/帶負電荷之極性胺基酸(例如Asp或Glu)、具有非極性側鏈之胺基酸取代另一具有非極性側鏈之胺基酸(例如Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Cys、Val等)、鹼性/帶正電荷之極性胺基酸取代另一鹼性/帶正電荷之極性胺基酸(例如Lys、His、Arg等)、具有極性側鏈之不帶電荷之胺基酸取代另一具有極性側鏈之不帶電荷之胺基酸(例如Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr等)、具有β-分支鏈側鏈之胺基酸取代另一具有β-分支鏈側鏈之胺基酸(例如Ile、Thr及Val)、具有芳族側鏈之胺基酸取代另一具有芳族側鏈之胺基酸(例如His、Phe、Trp及Tyr)等。
抗體構築體或抗原結合域可基本上由指定胺基酸序列或本文所描述之序列組成，使得其他組分(例如其他胺基酸)不會實質上改變抗體構築體或抗原結合域功能性變異體之生物活性。
在一些實施例中，免疫結合物中之抗體含有經修飾之Fc區，其中該修飾調節Fc區與一或多個Fc受體之結合。
在一些實施例中，免疫結合物中之抗體(例如結合至至少兩個佐劑部分之抗體)在Fc區中含有一或多個修飾(例如胺基酸插入、缺失及/或取代)，從而與Fc區中缺乏該突變之天然抗體相比，產生與一或多個Fc受體(例如FcγRI (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)及/或FcγRIIIB (CD16b))的經調節之結合(例如增加之結合或減少之結合)。在一些實施例中，免疫結合物中之抗體在Fc區中含有一或多個修飾(例如胺基酸插入、缺失及/或取代)，從而減少抗體之Fc區與FcγRIIB之結合。在一些實施例中，免疫結合物中之抗體在抗體之Fc區中含有一或多個修飾(例如胺基酸插入、缺失及/或取代)，從而與Fc區中缺乏該突變之天然抗體相比，減少抗體與FcγRIIB之結合，而對FcγRI (CD64)、FcγRIIA (CD32A)及/或FcRγIIIA (CD16a)維持相同結合或具有增加之結合。在一些實施例中，免疫結合物中之抗體在Fc區中含有一或多個修飾，從而增加抗體之Fc區與FcγRIIB之結合。
在一些實施例中，經調節之結合由抗體之Fc區中相對於抗體之天然Fc區之突變提供。突變可位於CH2域、CH3域或其組合中。「天然Fc區」與「野生型Fc區」同義，且包含與在自然界中發現之Fc區之胺基酸序列相同或與在天然抗體(例如西妥昔單抗(cetuximab))中發現之Fc區之胺基酸序列一致的胺基酸序列。天然序列人類Fc區包括天然序列人類IgG1 Fc區、天然序列人類IgG2 Fc區、天然序列人類IgG3 Fc區及天然序列人類IgG4 Fc區，以及其天然存在之變異體。天然序列Fc包括Fc之各種同種異型(Jefferis等人, (2009) mAbs, 1(4):332-338)。
在一些實施例中，Fc區中產生經調節之與一或多個Fc受體之結合的突變可包括以下突變中之一或多者：SD (S239D)、SDIE (S239D/I332E)、SE (S267E)、SELF (S267E/L328F)、SDIE (S239D/I332E)、SDIEAL (S239D/I332E/A330L)、GA (G236A)、ALIE (A330L/I332E)、GASDALIE (G236A/S239D/A330L/I332E)、V9 (G237D/P238D/P271G/A330R)及V11 (G237D/P238D/H268D/P271G/A330R)，及/或以下胺基酸處之一或多個突變：E233、G237、P238、H268、P271、L328及A330。用於調節Fc受體結合之其他Fc區修飾描述於例如US 2016/0145350及US 7416726及US 5624821中，該等專利以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，免疫結合物之抗體之Fc區經修飾以與天然非修飾Fc區相比具有改變之Fc區之糖基化模式。
人類免疫球蛋白在各重鏈之Cγ2域中在Asn297殘基處發生糖基化。此N-鍵聯寡醣由核心七醣N-乙醯基葡萄糖胺4甘露糖3 (GlcNAc4Man3)組成。已知用內切糖苷酶或PNG酶F移除七醣引起抗體Fc區中之構象變化，此可顯著降低對活化FcγR之抗體結合親和力且引起降低之效應功能。核心七醣常常帶有半乳糖、二等分GlcNAc、岩藻糖或唾液酸，該等組成差異地影響Fc與活化及抑制性FcγR之結合。另外，已證實α2,6-唾液酸化增強活體內消炎活性，同時去岩藻糖基化引起改良之FcγRIIIa結合及增加10倍之抗體依賴性細胞毒性及抗體依賴性噬菌作用。因此，特定糖基化模式可用於控制炎性效應功能。
在一些實施例中，用於改變糖基化模式之修飾為突變。舉例而言，在Asn297處之取代。在一些實施例中，Asn297突變為麩醯胺(N297Q)。用調節FcγR-調控信號傳導之抗體控制免疫反應之方法描述於例如美國專利7,416,726及美國專利申請公開案2007/0014795及2008/0286819中，該等專利以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，免疫結合物之抗體經修飾以含有具有非天然存在之糖基化模式的經工程改造之Fab區。舉例而言，雜交瘤可經基因工程改造以分泌具有能夠增加FcRγIIIa結合及效應功能之特定突變的非岩藻糖基化mAb、去唾液酸化mAb或去糖基化Fc。在一些實施例中，免疫結合物之抗體經工程改造為非岩藻糖基化的。
在一些實施例中，免疫結合物中抗體之整個Fc區與不同Fc區交換，使得抗體之Fab區結合至非天然Fc區。舉例而言，西妥昔單抗之通常包含IgG1 Fc區之Fab區可結合至IgG2、IgG3、IgG4或IgA，或納武單抗(nivolumab)之通常包含IgG4 Fc區之Fab區可結合至IgG1、IgG2、IgG3、IgA1或IgG2。在一些實施例中，具有非天然Fc域之Fc經修飾之抗體亦包含一或多個胺基酸修飾，諸如IgG4 Fc內之S228P突變，從而調節所描述之Fc域之穩定性。在一些實施例中，具有非天然Fc域之Fc經修飾之抗體亦包含本文所描述之調節Fc與FcR之結合的一或多個胺基酸修飾。
在一些實施例中，當與天然非修飾抗體相比時，調節Fc區與FcR之結合的修飾不改變抗體之Fab區與其抗原之結合。在其他實施例中，當與天然非修飾抗體相比時，調節Fc區與FcR之結合的修飾亦增加抗體之Fab區與其抗原之結合。
在一示範性實施例中，本發明之免疫結合物包含抗體構築體，該抗體構築體包含特異性識別及結合CEA之抗原結合域。
在瘤形成之各種生物態樣中已涉及癌胚抗原(CEA、CD66e、CEACAM5)之表現升高，尤其為腫瘤細胞黏附、轉移、阻斷細胞免疫機制及具有抗凋亡功能。CEA為細胞表面抗原且亦用作許多癌瘤之血液標記物。拉貝珠單抗(CEA-CIDE TM，Immunomedics，CAS登記號219649-07-7)亦稱為MN-14及hMN14，為人類化IgG1單株抗體且已針對治療結腸直腸癌進行了研究(Blumenthal, R.等人(2005) Cancer Immunology Immunotherapy 54(4):315-327)。結合至喜樹鹼類似物之拉貝珠單抗(拉貝珠單抗戈維替康(labetuzumab govitecan)，IMMU-130)靶向CEA且正在患有復發性或難治性轉移性結腸直腸癌之患者中進行研究(Sharkey, R.等人 (2018), Molecular Cancer Therapeutics17(1):196-203；Dotan，E.等人 (2017), Journal of Clinical Oncology35(9):3338-3346)。此外，已在臨床試驗中評估了用於治療結腸癌及其他實體惡性腫瘤之與 131I結合之拉貝珠單抗(Sharkey, R.等人(1995), Cancer Research(增補版) 55(23):5935s-5945s；Liersch, T.等人(2005), Journal of Clinical Oncology23(27):6763-6770；Sahlmann, C.-O.等人(2017), Cancer123(4):638-649)。
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含如US 6676924中揭示之hMN-14/拉貝珠單抗SEQ ID NO. 1之可變輕鏈(VL κ)，該專利出於此目的以引用方式併入本文。 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTSVAWYQQKPGKAPKLLIYWTSTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYSLYRSFGQGTKVEIK SEQ ID NO. 1
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含hMN-14/拉貝珠單抗SEQ ID NO. 2-8 (US 6676924)之輕鏈CDR (互補決定區)或輕鏈構架(LFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
LFR1 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC 1 - 23 23 2
CDR-L1 KASQDVGTSVA 24 – 34 11 3
LFR2 WYQQKPGKAPKLLIY 35 – 49 15 4
CDR-L2 WTSTRHT 50 – 56 7 5
LFR3 GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC 57 – 88 32 6
CDR-L3 QQYSLYRS 89 – 96 8 7
LFR4 FGQGTKVEIK 97 – 106 10 8
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含如US 6676924中揭示之hMN-14/拉貝珠單抗SEQ ID NO. 9之可變重鏈(VH)，該專利出於此目的以引用方式併入本文。 EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFDFTTYWMSWVRQAPGKGLEWVAEIHPDSSTINYAPSLKDRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCASLYFGFPWFAYWGQGTPVTVSS        SEQ ID NO. 9
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含hMN-14/拉貝珠單抗SEQ ID NO. 10-16 (US 6676924)之重鏈CDR (互補決定區)或重鏈構架(HFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
HFR1 EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFDFT 1 – 30 30 10
CDR-H1 TYWMS 31 – 35 5 11
HFR2 WVRQAPGKGLEWVA 36 – 49 14 12
CDR-H2 EIHPDSSTINYAPSLKD 50 – 66 17 13
HFR3 RFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCAS 67 – 98 32 14
CDR-H3 LYFGFPWFAY 99 – 108 10 15
HFR4 WGQGTPVTVSS 109 – 119 11 16
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含如US 8642742中揭示之hPR1A3 SEQ ID NO. 17之可變輕鏈(VL κ)，該專利出於此目的以引用方式併入本文。 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIK        SEQ ID NO. 17
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含hPR1A3 SEQ ID NO. 18-24 (US 8642742)之輕鏈CDR (互補決定區)或輕鏈構架(LFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
LFR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 1 - 23 23 18
CDR-L1 KASAAVGTYVA 24 - 34 11 19
LFR2 WYQQKPGKAPKLLIY 35 - 49 15 20
CDR-L2 SASYRKR 50 - 56 7 21
LFR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 57 - 88 32 22
CDR-L3 HQYYTYPLFT 89 - 98 10 23
LFR4 FGQGTKLEIK 99 - 108 10 24
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含hPR1A3 SEQ ID NO. 25-31 (US 8642742)之重鏈CDR (互補決定區)或重鏈構架(HFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
HFR1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT 1 - 30 30 25
CDR-H1 EFGMN 31 - 35 5 26
HFR2 WVRQAPGQGLEWMG 36 - 49 14 27
CDR-H2 WINTKTGEATYVEEFKG 50 - 66 17 28
HFR3 RVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR 67 - 98 32 29
CDR-H3 WDFAYYVEAMDY 99 - 110 12 30
HFR4 WGQGTTVTVSS 111 - 121 11 31
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含如US 7232888中揭示之hMFE-23 SEQ ID NO. 32之可變輕鏈(VL κ)，該專利出於此目的以引用方式併入本文。 ENVLTQSPSSMSASVGDRVNIACSASSSVSYMHWFQQKPGKSPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSMQPEDAATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIK        SEQ ID NO. 32
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含hMFE-23 SEQ ID NO. 33-40 (US 7232888)之輕鏈CDR (互補決定區)或輕鏈構架(LFR)序列。實施例包括LFR1之兩個變異體SEQ ID NO.:33及SEQ ID NO.:34。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
LFR1 ENVLTQSPSSMSASVGDRVNIAC 1 – 23 23 33
LFR1 EIVLTQSPSSMSASVGDRVNIAC 1 – 23 23 34
CDR-L1 SASSSVSYMH 24 – 33 10 35
LFR2 WFQQKPGKSPKLWIY 34 – 48 15 36
CDR-L2 STSNLAS 49 – 55 7 37
LFR3 GVPSRFSGSGSGTDYSLTISSMQPEDAATYYC 56 – 87 32 38
CDR-L3 QQRSSYPLT 88 – 96 9 39
LFR4 FGGGTKLEIK 97 – 106 10 40
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含hMFE-23 SEQ ID NO. 41 (US 7232888)之可變重鏈(VH)。 QVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDSYMHWLRQGPGQRLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSS        SEQ ID NO. 41
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含hMFE-23 SEQ ID NO. 42-49 (US 7232888)之重鏈CDR (互補決定區)或重鏈構架(HFR)序列。實施例包括HFR1之兩個變異體SEQ ID NO.:42及SEQ ID NO.:43。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
HFR1 QVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIK 1 – 30 30 42
HFR1 QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIK 1 – 30 30 43
CDR-H1 DSYMH 31 – 35 5 44
HFR2 WLRQGPGQRLEWIG 36 - 49 14 45
CDR-H2 WIDPENGDTEYAPKFQG 50 - 66 17 46
HFR3 KATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNE 67 - 98 32 47
CDR-H3 GTPTGPYYFDY 99 - 109 11 48
HFR4 WGQGTLVTVSS 110 - 120 11 49
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含SM3E SEQ ID NO. 50 (US 7232888)之可變輕鏈(VL κ)。 ENVLTQSPSSMSVSVGDRVTIACSASSSVPYMHWLQQKPGKSPKLLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSVQPEDAATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIK        SEQ ID NO. 50
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含SM3E SEQ ID NO. 51-56及38-39 (US 7232888)之輕鏈CDR (互補決定區)或輕鏈構架(LFR)序列。實施例包括LFR1之兩個變異體SEQ ID NO.:51及SEQ ID NO.:52。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
LFR1 ENVLTQSPSSMSVSVGDRVTIAC 1 - 23 23 51
LFR1 EIVLTQSPSSMSVSVGDRVTIAC 1 - 23 23 52
CDR-L1 SASSSVPYMH 24 - 33 10 53
LFR2 WLQQKPGKSPKLLIY 34 - 48 15 54
CDR-L2 LTSNLAS 49 - 55 7 55
LFR3 GVPSRFSGSGSGTDYSLTISSVQPEDAATYYC 56 - 87 32 56
CDR-L3 QQRSSYPLT 88 - 96 9 39
LFR4 FGGGTKLEIK 97 - 106 10 40
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含NP-4/阿西莫單抗(arcitumomab) SEQ ID NO. 57之可變輕鏈。 QTVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVTYIHWYQQKPGSSPKSWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQHWSSKPPTFGGGTKLEIK        SEQ ID NO. 57
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含NP-4/阿西莫單抗SEQ ID NO. 58-64之輕鏈CDR (互補決定區)或輕鏈構架(LFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
LFR1 QTVLSQSPAILSASPGEKVTMTC 1 – 23 23 58
CDR-L1 RASSSVTYIH 24 – 33 10 59
LFR2 WYQQKPGSSPKSWIY 34 – 48 15 60
CDR-L2 ATSNLAS 49 – 55 7 61
LFR3 GVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYC 56 – 87 32 62
CDR-L3 QHWSSKPPT 88 – 96 9 63
LFR4 FGGGTKLEIK 97 – 106 10 64
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含NP-4/阿西莫單抗SEQ ID NO. 65之可變重鏈(VH)。 EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYMNWVRQPPGKALEWLGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTLTVSS        SEQ ID NO. 65。
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含NP-4 SEQ ID NO. 66-72之重鏈CDR (互補決定區)或重鏈構架(HFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
HFR1 EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFT 1 – 30 30 66
CDR-H1 DYYMN 31 – 35 5 67
HFR2 WVRQPPGKALEWLG 36 – 49 14 68
CDR-H2 FIGNKANGYTTEYSASVKG 50 – 68 19 69
HFR3 RFTISRDKSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCTR 69 – 100 32 70
CDR-H3 DRGLRFYFDY 101 – 110 10 71
HFR4 WGQGTTLTVSS 111 – 121 11 72
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含如US 7776330中揭示之M5A/hT84.66 SEQ ID NO. 73之可變輕鏈(VL κ)，該專利出於此目的以引用方式併入本文。 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGKAPKLLIYRASNLESGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTNEDPYTFGQGTKVEIK        SEQ ID NO. 73
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含M5A/hT84.66 SEQ ID NO. 74-80 (US 7776330)之輕鏈CDR (互補決定區)或輕鏈構架(LFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
LFR1 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC 1 - 23 23 74
CDR-L1 RAGESVDIFGVGFLH 24 - 38 15 75
LFR2 WYQQKPGKAPKLLIY 39 - 53 15 76
CDR-L2 RASNLES 54 - 60 7 77
LFR3 GVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDFATYYC 61 - 92 32 78
CDR-L3 QQTNEDPYT 93 - 101 9 79
LFR4 FGQGTKVEIK 102 - 111 10 80
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含M5A/hT84.66 SEQ ID NO. 81 (US 7776330)之可變重鏈(VH)。 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYMHWVRQAPGKGLEWVARIDPANGNSKYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSS        SEQ ID NO. 81
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含M5A/hT84.66 SEQ ID NO. 82-88 (US 7776330)之重鏈CDR (互補決定區)或重鏈構架(HFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
HFR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIK 1 - 30 30 82
CDR-H1 DTYMH 31 - 35 5 83
HFR2 WVRQAPGKGLEWVA 36 - 49 14 84
CDR-H2 RIDPANGNSKYADSVKG 50 – 66 17 85
HFR3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAP 67 – 98 32 86
CDR-H3 FGYYVSDYAMAY 99 – 110 12 87
HFR4 WGQGTLVTVSS 111 – 121 11 88
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含如US 9617345中揭示之hAb2-3 SEQ ID NO. 89之可變輕鏈(VL κ)，該專利出於此目的以引用方式併入本文。 DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCRASENIFSYLAWYQQKPGKSPKLLVYNTRTLAEGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPFTFGSGTKLEIK        SEQ ID NO. 89
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含hAb2-3 SEQ ID NO. 90-96 (US 9617345)之輕鏈CDR (互補決定區)或輕鏈構架(LFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
LFR1 DIQMTQSPASLSASVGDRVTITC 1 – 23 23 90
CDR-L1 RASENIFSYLA 24 – 34 11 91
LFR2 WYQQKPGKSPKLLVY 35 – 49 15 92
CDR-L2 NTRTLAE 50 – 56 7 93
LFR3 GVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFATYYC 57 – 88 32 94
CDR-L3 QHHYGTPFT 89 – 97 9 95
LFR4 FGSGTKLEIK 98 – 107 10 96
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含SEQ ID NO. 97 (US 9617345)之可變重鏈(VH)。 EVQLQESGPGLVKPGGSLSLSCAASGFVFSSYDMSWVRQTPERGLEWVAYISSGGGITYAPSTVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMNSLTSEDTAVYYCAAHYFGSSGPFAYWGQGTLVTVSS        SEQ ID NO. 97
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含hAb2-3 SEQ ID NO. 98-104之重鏈CDR (互補決定區)或重鏈構架(HFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
HFR1 EVQLQESGPGLVKPGGSLSLSCAASGFVFS 1 - 30 30 98
CDR-H1 SYDMS 31 - 35 5 99
HFR2 WVRQTPERGLEWVA 36 - 49 14 100
CDR-H2 YISSGGGITYAPSTVKG 50 - 66 17 101
HFR3 RFTVSRDNAKNTLYLQMNSLTSEDTAVYYCAA 67 - 98 32 102
CDR-H3 HYFGSSGPFAY 99 - 109 11 103
HFR4 WGQGTLVTVSS 110 - 120 11 104
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含如US 9982063中揭示之A240VL-B9VH/AMG-211 SEQ ID NO. 105之可變輕鏈(VL κ)，該專利出於此目的以引用方式併入本文。 QAVLTQPASLSASPGASASLTCTLRRGINVGAYSIYWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDKQQGSGVSSRFSASKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCMIWHSGASAVFGGGTKLTVL        SEQ ID NO. 105
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含A240VL-B9VH/AMG-211 SEQ ID NO. 106-112 (US 9982063)之輕鏈CDR (互補決定區)或輕鏈構架(LFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
LFR1 QAVLTQPASLSASPGASASLTC 1 - 22 22 106
CDR-L1 TLRRGINVGAYSIY 23 - 36 14 107
LFR2 WYQQKPGSPPQYLLR 37 - 51 15 108
CDR-L2 YKSDSDKQQGS 52 - 62 11 109
LFR3 GVSSRFSASKDASANAGILLISGLQSEDEADYYC 63 - 96 34 110
CDR-L3 MIWHSGASAV 97 - 106 10 111
LFR4 FGGGTKLTVL 107 - 116 10 112
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含B9VH SEQ ID NO. 113 (US 9982063)之可變重鏈(VH)。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVSSYWMHWVRQAPGKGLEWVGFIRNKANGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS        SEQ ID NO. 113
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含SEQ ID NO. 114-121 (US 9982063)之重鏈CDR (互補決定區)或重鏈構架(HFR)序列。實施例包括CDR-H2之兩個變異體SEQ ID NO.:117及SEQ ID NO.:118。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
HFR1 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVS 1 – 30 30 114
CDR-H1 SYWMH 31 – 35 5 115
HFR2 WVRQAPGKGLEWVG 36 – 49 14 116
CDR-H2 FIRNKANGGTTEYAASVKG 50 – 68 19 117
CDR-H2 FIRNKANSGTTEYAASVKG 50 – 68 19 118
HFR3 RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 69 – 100 32 119
CDR-H3 DRGLRFYFDY 101 - 110 10 120
HFR4 WGQGTTVTVSS 111 - 121 11 121
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含E12VH SEQ ID NO. 122 (US 9982063)之可變重鏈(VH)。 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVSSYWMHWVRQAPGKGLEWVGFILNKANGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS        SEQ ID NO. 122
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含SEQ ID NO. 123-129 (US 9982063)之重鏈CDR (互補決定區)或重鏈構架(HFR)序列。
區域 序列片段 殘基 長度 SEQ ID NO.
HFR1 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVS 1 – 30 30 123
CDR-H1 SYWMH 31 - 35 5 124
HFR2 WVRQAPGKGLEWVG 36 - 49 14 125
CDR-H2 FILNKANGGTTEYAASVKG 50 - 68 19 126
HFR3 RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 69 - 100 32 127
CDR-H3 DRGLRFYFDY 101 - 110 10 128
HFR4 WGQGTTVTVSS 111 - 121 11 129
在本發明之一實施例中，靶向CEA之抗體構築體或抗原結合域包含PR1A3 VH SEQ ID NO. 130 (US 8642742)之可變重鏈(VH)。 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSS        SEQ ID NO. 130
在一些實施例中，抗體構築體進一步包含Fc域。在某些實施例中，抗體構築體為抗體。在某些實施例中，抗體構築體為融合蛋白。抗原結合域可為單鏈可變區片段(scFv)。單鏈可變區片段(scFv)為包括經由合成肽鍵聯至抗體輕鏈之可變(V)域的抗體重鏈之V域的截短Fab片段，可使用常規重組DNA技術產生。類似地，二硫化物穩定之可變區片段(dsFv)可藉由重組DNA技術製備。抗體構築體或抗原結合域可包含抗CEA抗體之抗原結合域之一或多個可變區(例如兩個可變區)，各可變區包含CDR1、CDR2及CDR3。
在一些實施例中，免疫結合物中之抗體含有經修飾之Fc區，其中該修飾調節Fc區與一或多個Fc受體之結合。
在一些實施例中，藉由包括能夠結合轉型生長因子β1 (TGFβ1)之TGFβ1受體或其片段來修飾Fc區。舉例而言，受體可為TGFβ受體II (TGFβRII)。在一些實施例中，TGFβ受體為人類TGFβ受體。在一些實施例中，如併入本文中之US 9676863中所描述，IgG具有融合至TGFβRII細胞外域(ECD)之C端。「Fc連接子」可用於將IgG連接至TGFβRII細胞外域。Fc連接子可為允許分子之適當三維摺疊同時維持對靶標之結合特異性的短撓性肽。在一些實施例中，TGFβ受體之N端融合至抗體構築體之Fc (在存在或不存在Fc連接子之情況下)。在一些實施例中，抗體構築體重鏈之C端融合至TGFβ受體(在存在或不存在Fc連接子之情況下)。在一些實施例中，抗體構築體重鏈之C端離胺酸殘基突變為丙胺酸。
在一些實施例中，免疫結合物中之抗體經糖基化。
在一些實施例中，免疫結合物中之抗體為半胱胺酸工程改造之抗體，其提供佐劑、標記或藥物部分在經工程改造之半胱胺酸可用於結合但不擾亂免疫球蛋白摺疊及組裝或改變抗原結合及效應功能之位點藉由半胱胺酸取代與抗體之位點特異性結合(Junutula等人, 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932；Dornan等人 (2009) Blood114(13):2721-2729；US 7521541；US 7723485；US 2012/0121615；WO 2009/052249)。「半胱胺酸工程改造之抗體」或「半胱胺酸工程改造之抗體變異體」為其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代之抗體。半胱胺酸工程改造之抗體可以均勻化學計量結合至作為8-Het-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物之8-Het-2-胺基苯并氮呯佐劑部分(例如在具有單一經工程改造半胱胺酸位點之抗體中每個抗體至多兩個8-Het-2-胺基苯并氮呯部分)。
在一些實施例中，用於製備表3之免疫結合物的半胱胺酸工程改造之抗體具有在輕鏈之149-離胺酸位點(LC K149C)處引入之半胱胺酸殘基。在其他實施例中，半胱胺酸工程改造之抗體具有在重鏈之118-丙胺酸位點(EU編號) (HC A118C)處引入之半胱胺酸殘基。此位點或者藉由依序編號而編號為121或藉由Kabat編號而編號為114。在其他實施例中，半胱胺酸工程改造之抗體具有根據Kabat編號在輕鏈中在G64C或R142C處或者根據Kabat編號在重鏈中在D101C、V184C或T205C處引入之半胱胺酸殘基。 8-HET-2-胺基苯并氮呯佐劑化合物S
本發明之免疫結合物包含8-Het-2-胺基苯并氮呯佐劑部分。本文所描述之佐劑部分為引發免疫反應之化合物(亦即，免疫刺激劑)。通常，本文所描述之佐劑部分為TLR促效劑。TLR為在脊椎動物中負責起始先天免疫反應之I型跨膜蛋白。TLR識別來自細菌、病毒及真菌之多種病原體相關分子模式且充當防禦入侵病原體之第一線。TLR歸因於細胞表現及其起始之信號傳導路徑的差異而引發重疊又獨特之生物反應。在接合(例如藉由天然刺激或合成TLR促效劑)後，TLR起始信號轉導級聯反應，引起經由銜接子蛋白骨髓分化主要反應基因88 (MyD88)對核因子-κB (NF-κB)之活化及IL-1受體相關激酶(IRAK)之募集。IRAK之磷酸化然後導致TNF-受體相關因子6 (TRAF6)之募集，這導致NF-κB抑制劑I-κB之磷酸化。因此，NF-κB進入細胞核且起始啟動子含有NF-κB結合位點之基因(諸如細胞介素)之轉錄。其他TLR信號傳導調控方式包括TNF-受體相關因子6 (TRAF6)之含TIR域銜接子誘導干擾素-β (TRIF)依賴性誘導及經由TRIF及TRAF3對MyD88獨立路徑之活化，從而引起干擾素反應因子3 (IRF3)之磷酸化。類似地，MyD88依賴性路徑亦活化若干IRF家族成員，包括IRF5及IRF7，而TRIF依賴性路徑亦活化NF-κB路徑。
典型地，本文所描述之佐劑部分為TLR7及/或TLR8促效劑。TLR7及TLR8均在單核球及樹突細胞中表現。在人類中，TLR7亦在漿細胞樣樹突細胞(pDC)及B細胞中表現。TLR8主要在骨髓來源之細胞(亦即，單核球、顆粒球及骨髓樹突細胞)中表現。TLR7及TLR8能夠偵測細胞內「外來」單股RNA之存在，作為對病毒入侵作出反應之手段。用TLR8促效劑處理表現TLR8之細胞可使得產生高水準之IL-12、IFN-γ、IL-1、TNF-α、IL-6及其他炎性細胞因子。類似地，用TLR7促效劑刺激表現TLR7之細胞(諸如pDC)可使得產生高水準之IFN-α及其他炎性細胞因子。TLR7/TLR8接合及所得細胞介素產生可活化樹突細胞及其他抗原呈遞細胞，驅動各種先天性及後天性免疫反應機制，從而引起腫瘤破壞。
本發明之示範性8-Het-2-胺基苯并氮呯化合物(Hx)展示於表1中。對各化合物進行合成、純化且藉由質譜法表徵且顯示具有所指示之質量。其他實驗程序可在實例中找到。根據實例202量測針對表現人類TLR7或人類TLR8之人類胚腎(HEK) 293 NFKB報告細胞之活性。表1之8-Het-2-胺基苯并氮呯化合物展示了令人驚訝且出乎意料之TLR8促效劑選擇性特性，其可預測可用於治療癌症及其他病症之治療劑活性。 表1：       8-Het-2-胺基苯并氮呯化合物(HxBz)
Hx 編號 結構 MW HEK293 hTLR7 EC50 (nM) HEK293 hTLR8 EC50 (nM)
HxBz-1       
Figure 02_image005
 390.44 2536 163
HxBz-2       
Figure 02_image007
 365.4 2238 276
HxBz-3       
Figure 02_image009
 449.6 562 43
HxBz-4       
Figure 02_image011
 549.7 3259 350
HxBz-5       
Figure 02_image013
 394.5 525 17
HxBz-6       
Figure 02_image015
 423.5 2659 339
HxBz-7       
Figure 02_image017
 512.6 3633 335
HxBz-8       
Figure 02_image019
 601.7      
HxBz-9       
Figure 02_image021
 501.6 8630 397
HxBz-10     
Figure 02_image023
 394.5 9000 814
HxBz-11     
Figure 02_image025
 423.5 4070 161
HxBz-12     
Figure 02_image027
 520.6 159 6
HxBz-13     
Figure 02_image029
 505.6 242 274
HxBz-14     
Figure 02_image031
 605.7      
HxBz-15     
Figure 02_image033
 507.6 35 10
HxBz-16     
Figure 02_image035
 506.6 4602 399
HxBz-17     
Figure 02_image037
 508.6 9000 9000
HxBz-18     
Figure 02_image039
 371.5 6310 281
HxBz-19     
Figure 02_image041
 399.5      
HxBz-20     
Figure 02_image043
 480.6 2943 3691
HxBz-21     
Figure 02_image045
 510.6      
HxBz-22     
Figure 02_image047
 410.5 3916 1147
HxBz-23     
Figure 02_image049
 522.6 6875 6176
HxBz-24     
Figure 02_image051
 436.5      
HxBz-25     
Figure 02_image053
 449.5 9000 3161
HxBz-26     
Figure 02_image055
 408.5 9000 9000
HxBz-27     
Figure 02_image057
 495.6 26 9
HxBz-28     
Figure 02_image059
 480.6 3771 2929
HxBz-29     
Figure 02_image061
 493.6 134 296
HxBz-30     
Figure 02_image063
 408.5 393 40
HxBz-31     
Figure 02_image065
 422.5 763 358
HxBz-32     
Figure 02_image067
 623.8 1280 1519
HxBz-33     
Figure 02_image069
 611.8 7633 2876
HxBz-34     
Figure 02_image071
 625.7 322 79
HxBz-35     
Figure 02_image073
 613.7 684 174
HxBz-36     
Figure 02_image075
 393.5 439 54
HxBz-37     
Figure 02_image077
 723.9      
HxBz-38     
Figure 02_image079
 504.6 56 153
HxBz-39     
Figure 02_image081
 393.5 1780 65
HxBz-40     
Figure 02_image083
 504.6 357 755
HxBz-41     
Figure 02_image085
 446.5 3926 128
HxBz-42     
Figure 02_image087
 463.5 9000 9000
HxBz-43     
Figure 02_image089
 528.6 9000 6164
HxBz-44     
Figure 02_image091
 517.6 9000 6346
HxBz-45     
Figure 02_image093
 505.6 825 325
HxBz-46     
Figure 02_image095
 465.5 9000 3578
HxBz-47     
Figure 02_image097
 506.6 35 12
HxBz-48     
Figure 02_image099
 394.5 9000 2164
8-HET-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物S
本發明之免疫結合物藉由使抗CEA抗體與8-Het-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物HxBzL結合來製備。8-Het-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物包含共價連接至連接子單元之8-Het-2-胺基苯并氮呯(HxBz)部分。連接子單元包含影響免疫結合物之穩定性、滲透性、溶解度及其他藥物動力學、安全性及功效特性之官能基及次單元。連接子單元包括與抗體之反應性官能基反應(亦即結合)之反應性官能基。舉例而言，抗體之親核基團(諸如離胺酸側鏈胺基)與HxBzL連接子化合物之親電反應性官能基反應以形成免疫結合物。另外，舉例而言，抗體之半胱胺酸硫醇與Hx-連接子化合物之順丁烯二醯亞胺或溴乙醯胺基團反應以形成免疫結合物。
適用於HxBzL連接子化合物之親電反應性官能基包括但不限於N-羥基丁二醯亞胺基(NHS)酯及N-羥基磺基丁二醯亞胺基(磺基-NHS)酯(胺反應性)；碳二亞胺(胺及羧基反應性)；羥甲基膦(胺反應性)；順丁烯二醯亞胺(硫醇反應性)；鹵化乙醯胺，諸如 N-碘乙醯胺(硫醇反應性)；芳基疊氮化物(一級胺反應性)；氟化芳基疊氮化物(經由碳-氫(C-H)插入之反應性)；五氟苯基(PFP)酯(胺反應性)；四氟苯基(TFP)酯(胺反應性)；亞胺酸酯(胺反應性)；異氰酸酯(羥基反應性)；乙烯碸(硫醇、胺及羥基反應性)；吡啶基二硫化物(硫醇反應性)；及二苯基酮衍生物(經由C-H鍵插入之反應性)。其他試劑包括但不限於Hermanson, Bioconjugate Techniques 第 2 版, Academic Press, 2008中所描述之彼等試劑。
本發明提供對設計、製備及使用免疫結合物之限制及挑戰的解決方案。一些連接子在血流中可為不穩定的，由此在靶標細胞中內化之前釋放不可接受量之佐劑/藥物(Khot, A.等人(2015) Bioanalysis7(13):1633–1648)。其他連接子可在血流中提供穩定性，但細胞內釋放有效性可能受到負面影響。提供所需細胞內釋放之連接子典型地在血流中具有不良穩定性。或者陳述為，血流穩定性與細胞內釋放典型地逆相關。此外，在標準結合方法中，加載於抗體上之佐劑/藥物部分之量(亦即藥物加載量)、結合反應中形成之聚集物之量及可獲得之最終經純化結合物之產率為相互聯繫的。舉例而言，聚集物形成通常與結合至抗體之佐劑/藥物部分及其衍生物之當量數目正相關。在高藥物加載量下，必須移除所形成之聚集物以用於治療應用。因此，藥物加載介導之聚集物形成降低免疫結合物產率且可使得方法難以放大。
示範性實施例包括式II之8-Het-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物：
Figure 02_image001
其中Het選自雜環二基及雜芳二基； R 1、R 2、R 3及R 4獨立地選自由以下組成之群：H、C 1-C 12烷基、C 2-C 6烯基、C 2-C 6炔基、C 3-C 12碳環基、C 6-C 20芳基、C 2-C 9雜環基及C 1-C 20雜芳基，其中烷基、烯基、炔基、碳環基、芳基、雜環基及雜芳基獨立地且視情況經選自以下之一或多個基團取代： -(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 1-C 12烷基二基)-OR 5； -(C 3-C 12碳環基)； -(C 3-C 12碳環基)-*； -(C 3-C 12碳環基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*； -(C 3-C 12碳環基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 3-C 12碳環基)-NR 5-C(＝NR 5)NR 5-*； -(C 6-C 20芳基)； -(C 6-C 20芳基二基)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-N(R 5)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-(C 2-C 20雜環基二基)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-C(＝NR 5a)N(R 5)-*； -(C 2-C 20雜環基)； -(C 2-C 20雜環基)-*； -(C 2-C 9雜環基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*； -(C 2-C 9雜環基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 2-C 9雜環基)-C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 2-C 9雜環基)-NR 5-C(＝NR 5a)NR 5-*； -(C 2-C 9雜環基)-NR 5-(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 2-C 9雜環基)-(C 6-C 20芳基二基)-*； -(C 1-C 20雜芳基)； -(C 1-C 20雜芳基二基)-*； -(C 1-C 20雜芳基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 1-C 20雜芳基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 1-C 20雜芳基)-NR 5-C(＝NR 5a)N(R 5)-*； -(C 1-C 20雜芳基)-N(R 5)C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -C(＝O)-*； -C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -C(＝O)-(C 2-C 20雜環基二基)-*； -C(＝O)N(R 5) 2； -C(＝O)N(R 5)-*； -C(＝O)N(R 5)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)C(＝O)R 5； -C(＝O)N(R 5)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)C(＝O)N(R 5) 2； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)CO 2R 5； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)C(＝NR 5a)N(R 5) 2； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5C(＝NR 5a)R 5； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 8烷基二基)-NR 5(C 2-C 5雜芳基)； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-N(R 5)-*； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-*； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-(C 2-C 20雜環基二基)-C(＝O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*； -N(R 5) 2； -N(R 5)-*； -N(R 5)C(＝O)R 5； -N(R 5)C(＝O)-*； -N(R 5)C(＝O)N(R 5) 2； -N(R 5)C(＝O)N(R 5)-*； -N(R 5)CO 2R 5； -NR 5C(＝NR 5a)N(R 5) 2； -NR 5C(＝NR 5a)N(R 5)-*； -NR 5C(＝NR 5a)R 5； -N(R 5)C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -N(R 5)-(C 2-C 5雜芳基)； -N(R 5)-S(＝O) 2-(C 1-C 12烷基)； -O-(C 1-C 12烷基)； -O-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -O-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -O-C(＝O)N(R 5) 2； -O-C(＝O)N(R 5)-*； -S(＝O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-*； -S(＝O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -S(＝O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*；及 -S(＝O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-OH； 或R 2及R 3一起形成5-員或6-員雜環基環； X 1、X 2、X 3及X 4獨立地選自由以下組成之群：鍵、C(＝O)、C(＝O)N(R 5)、O、N(R 5)、S、S(O) 2及S(O) 2N(R 5)； R 5獨立地選自由以下組成之群：H、C 6-C 20芳基、C 3-C 12碳環基、C 6-C 20芳基二基、C 1-C 12烷基及C 1-C 12烷基二基，或兩個R 5基團一起形成5員或6員雜環基環； R 5a選自由C 6-C 20芳基及C 1-C 20雜芳基組成之群； 其中星號*指示L之連接位點，且其中R 1、R 2、R 3及R 4中之一者連接至L； L為選自由以下組成之群的連接子： Q-C(＝O)-PEG-； Q-C(＝O)-PEG-C(＝O)N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-C(＝O)-Gluc-； Q-C(＝O)-PEG-O-； Q-C(＝O)-PEG-O-C(＝O)-； Q-C(＝O)-PEG-C(＝O)-； Q-C(＝O)-PEG-C(＝O)-PEP-； Q-C(＝O)-PEG-N(R 6)-； Q-C(＝O)-PEG-N(R 6)-C(＝O)-； Q-C(＝O)-PEG-N(R 6)-PEG-C(＝O)-PEP-； Q-C(＝O)-PEG-N +(R 6) 2-PEG-C(＝O)-PEP-； Q-C(＝O)-PEG-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-； Q-C(＝O)-PEG-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)N(R 6)C(＝O)-(C 2-C 5單雜環基二基)-； Q-C(＝O)-PEG-SS-(C 1-C 12烷基二基)-OC(＝O)-； Q-C(＝O)-PEG-SS-(C 1-C 12烷基二基)-C(＝O)-； Q-C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-C(＝O)-PEP-； Q-C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-； Q-C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-C(＝O)； Q-C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 6)C(＝O)-(C 2-C 5單雜環基二基)-； Q-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-； Q-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-C(＝O)N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-C(＝O)-Gluc-； Q-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-O-； Q-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-O-C(＝O)-； Q-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-C(＝O)-； Q-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-N(R 5)-； Q-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-N(R 5)-C(＝O)-； Q-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-C(＝O)-PEP-； Q-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-SS-(C 1-C 12烷基二基)-OC(＝O)-； Q-(CH 2) m-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-； Q-(CH 2) m-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)N(R 6)C(＝O)-；及 Q-(CH 2) m-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)N(R 6)C(＝O)-(C 2-C 5單雜環基二基)-； R 6獨立地為H或C 1-C 6烷基； PEG具有式-(CH 2CH 2O) n-(CH 2) m-；m為1至5之整數，且n為2至50之整數； Gluc具有下式：
Figure 02_image102
； PEP具有下式：
Figure 02_image104
其中AA獨立地選自天然或非天然胺基酸側鏈，或者一或多個AA及相鄰氮原子形成5員環脯胺酸胺基酸，且波浪線指示連接點； Cyc選自C 6-C 20芳基二基及C 1-C 20雜芳二基，其視情況經一個或多個選自F、Cl、NO 2、-OH、-OCH 3之基團取代，及具有以下結構之葡醣醛酸：
Figure 02_image106
； R 7選自由-CH(R 8)O-、-CH 2-、-CH 2N(R 8)-及-CH(R 8)O-C(＝O)-組成之群，其中R 8選自H、C 1-C 6烷基、C(＝O)-C 1-C 6烷基及-C(＝O)N(R 9) 2，其中R 9獨立地選自由H、C 1-C 12烷基及-(CH 2CH 2O) n-(CH 2) m-OH組成之群，其中m為1至5之整數，且n為2至50之整數，或兩個R 9基團一起形成5員或6員雜環基環； y為2至12之整數； z為0或1； Q選自由以下組成之群：N-羥基丁二醯亞胺基、N-羥基磺基丁二醯亞胺基、順丁烯二醯亞胺及獨立地經一或多個選自F、Cl、NO 2及SO 3 -之基團取代之苯氧基；且 烷基、烷基二基、烯基、烯基二基、炔基、炔基二基、芳基、芳基二基、碳環基、碳環基二基、雜環基、雜環基二基、雜芳基及雜芳基二基獨立地且視情況經獨立地選自以下之一或多個基團取代：F、Cl、Br、I、-CN、-CH 3、-CH 2CH 3、-CH＝CH 2、-C≡CH、-C≡CCH 3、-CH 2CH 2CH 3、-CH(CH 3) 2、-CH 2CH(CH 3) 2、-CH 2OH、-CH 2OCH 3、-CH 2CH 2OH、-C(CH 3) 2OH、-CH(OH)CH(CH 3) 2、-C(CH 3) 2CH 2OH、-CH 2CH 2SO 2CH 3、-CH 2OP(O)(OH) 2、-CH 2F、-CHF 2、-CF 3、-CH 2CF 3、-CH 2CHF 2、-CH(CH 3)CN、-C(CH 3) 2CN、-CH 2CN、-CH 2NH 2、-CH 2NHSO 2CH 3、-CH 2NHCH 3、-CH 2N(CH 3) 2、-CO 2H、-COCH 3、-CO 2CH 3、-CO 2C(CH 3) 3、-COCH(OH)CH 3、-CONH 2、-CONHCH 3、-CON(CH 3) 2、-C(CH 3) 2CONH 2、-NH 2、-NHCH 3、-N(CH 3) 2、-NHCOCH 3、-N(CH 3)COCH 3、-NHS(O) 2CH 3、-N(CH 3)C(CH 3) 2CONH 2、-N(CH 3)CH 2CH 2S(O) 2CH 3、- NHC(＝NH)H、-NHC(＝NH)CH 3、-NHC(＝NH)NH 2、-NHC(＝O)NH 2、-NO 2、＝O、-OH、-OCH 3、-OCH 2CH 3、-OCH 2CH 2OCH 3、-OCH 2CH 2OH、-OCH 2CH 2N(CH 3) 2、-O(CH 2CH 2O) n-(CH 2) mCO 2H、-O(CH 2CH 2O) nH、-OCH 2F、-OCHF 2、-OCF 3、-OP(O)(OH) 2、-S(O) 2N(CH 3) 2、-SCH 3、-S(O) 2CH 3及-S(O) 3H。
式II之8-Het-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物之示範性實施例包括如下情況，其中Q選自：
Figure 02_image108
。
式II之8-Het-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物之示範性實施例包括如下情況，其中Q為經一或多個F取代之苯氧基。
式II之8-Het-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物之示範性實施例包括如下情況，其中Q為2,3,5,6-四氟苯氧基。
8-Het-2-胺基苯并氮呯-連接子(HxBzL)化合物之示範性實施例選自表2a及2b。對各化合物進行合成、純化且藉由質譜法表徵且顯示具有所指示之質量。其他實驗程序可在實例中找到。表2a及2b之8-Het-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物展示令人驚訝且出乎意料之TLR8促效劑選擇性特性，其可預測適用於治療癌症及其他病症之治療劑活性。表2之II化合物8-Het-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物用於藉由實例201之方法與抗體結合以形成表3a及3b之免疫結合物。 表2a：式II化合物8-Het-2-胺基苯并氮呯-連接子中間物(HxBzL)
HxBzL 編號 結構 MW
HxBzL-1       
Figure 02_image110
 1312.5
HxBzL-2       
Figure 02_image112
 1094.1
HxBzL-3       
Figure 02_image114
 1190.3
HxBzL-4       
Figure 02_image116
 1218.3
HxBzL-5       
Figure 02_image118
 1163.2
HxBzL-6       
Figure 02_image120
 1149.2
HxBzL-7       
Figure 02_image122
 1281.3
HxBzL-8       
Figure 02_image124
 1149.2
HxBzL-9       
Figure 02_image126
 1270.3
HxBzL-10     
Figure 02_image128
 1121.2
HxBzL-11     
Figure 02_image130
 1163.2
HxBzL-12     
Figure 02_image132
 1276.3
HxBzL-13     
Figure 02_image134
 1275.3
HxBzL-14     
Figure 02_image136
 1274.3
HxBzL-15     
Figure 02_image138
 1135.1
HxBzL-16     
Figure 02_image140
 1232.3
HxBzL-17     
Figure 02_image142
 1140.2
HxBzL-18     
Figure 02_image144
 1112.2
HxBzL-19     
Figure 02_image146
 1168.3
HxBzL-20     
Figure 02_image148
 1277.3
HxBzL-21     
Figure 02_image150
 1249.3
HxBzL-22     
Figure 02_image152
 1291.3
HxBzL-23     
Figure 02_image154
 1179.2
HxBzL-24     
Figure 02_image156
 1163.2
HxBzL-25     
Figure 02_image158
 1218.2
HxBzL-26     
Figure 02_image160
 1177.2
HxBzL-27     
Figure 02_image162
 1264.3
HxBzL-28     
Figure 02_image164
 1249.3
HxBzL-29     
Figure 02_image166
 1262.3
HxBzL-30     
Figure 02_image168
 1177.2
HxBzL-31     
Figure 02_image170
 1191.2
HxBzL-32     
Figure 02_image172
 1275.3
HxBzL-33     
Figure 02_image174
 1392.5
HxBzL-34     
Figure 02_image176
 1170.3
HxBzL-35     
Figure 02_image178
 1380.5
HxBzL-36     
Figure 02_image180
 1161.2
HxBzL-37     
Figure 02_image182
 1156.3
HxBzL-38     
Figure 02_image184
 1162.2
HxBzL-39     
Figure 02_image186
 1273.3
HxBzL-40     
Figure 02_image188
 1245.3
HxBzL-41     
Figure 02_image190
 1154.3
HxBzL-42     
Figure 02_image192
 1246.3
HxBzL-43     
Figure 02_image194
 1245.3
HxBzL-44     
Figure 02_image196
 1043.2
HxBzL-45     
Figure 02_image198
 1272.5
HxBzL-46     
Figure 02_image200
 1127.2
HxBzL-47     
Figure 02_image202
 1135.2
HxBzL-48     
Figure 02_image204
 1394.5
HxBzL-49     
Figure 02_image206
 1297.3
HxBzL-50     
Figure 02_image208
 1286.3
HxBzL-51     
Figure 02_image210
 1099.2
HxBzL-52     
Figure 02_image212
 1274.3
HxBzL-53     
Figure 02_image214
 1082.1
HxBzL-54     
Figure 02_image216
 1193.3
HxBzL-55     
Figure 02_image218
 1275.3
表2b：     式II化合物8-Het-2-胺基苯并氮呯-連接子中間物(HxBzL)
HxBzL 編號 結構 MW
HxBzL-56     
Figure 02_image220
 1163.2
HxBzL-57     
Figure 02_image222
 1163.2
HxBzL-58     
Figure 02_image224
 1234.2
HxBzL-59     
Figure 02_image226
 1148.2
HxBzL-60     
Figure 02_image228
 1290.3
HxBzL-61     
Figure 02_image230
 1259.3
HxBzL-62     
Figure 02_image232
 1160.2
HxBzL-63     
Figure 02_image234
 1235.3
HxBzL-64     
Figure 02_image236
 1165.2
HxBzL-65     
Figure 02_image238
 1568.7
HxBzL-66     
Figure 02_image240
 1165.2
HxBzL-67     
Figure 02_image242
 1288.4
HxBzL-68     
Figure 02_image244
 1193.2
HxBzL-69     
Figure 02_image246
 1083.1
HxBzL-70     
Figure 02_image248
 1075.1
CEA免疫結合物
免疫刺激性抗體結合物(亦即免疫結合物)將TLR7/8促效劑引導到腫瘤中以活化腫瘤浸潤性骨髓細胞且啟動廣泛的先天性及適應性抗腫瘤免疫反應(Ackerman等人 (2021) Nature Cancer2:18-33。
CEA (CEACAM5)為經過充分驗證之細胞表面抗原，其在多種實體瘤中高度表現。CEA之有利特性，包括強大的細胞表面表現、低內化率及有限的正常組織表現，表明該抗原可為治療表現CEA之癌症之多功能方法中免疫結合物的合適靶標。
免疫結合物之示範性實施例包含藉由連接子共價連接至一或多個8-Het-2-胺基苯并氮呯(Hx)部分之抗CEA抗體，且具有式I： Ab-[L-Hx] pI 或其醫藥學上可接受之鹽， 其中： Ab為具有結合CEA之抗原結合域之抗體構築體； p為1至8之整數； Hx為具有下式之8-Het-2-胺基苯并氮呯部分：
Figure 02_image001
Het選自雜環基二基及雜芳基二基； R 1、R 2、R 3及R 4獨立地選自由以下組成之群：H、C 1-C 12烷基、C 2-C 6烯基、C 2-C 6炔基、C 3-C 12碳環基、C 6-C 20芳基、C 2-C 9雜環基及C 1-C 20雜芳基，其中烷基、烯基、炔基、碳環基、芳基、雜環基及雜芳基獨立地且視情況經選自以下之一或多個基團取代： -(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 1-C 12烷基二基)-OR 5； -(C 3-C 12碳環基)； -(C 3-C 12碳環基)-*； -(C 3-C 12碳環基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*； -(C 3-C 12碳環基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 3-C 12碳環基)-NR 5-C(＝NR 5)NR 5-*； -(C 6-C 20芳基)； -(C 6-C 20芳基二基)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-N(R 5)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-(C 2-C 20雜環基二基)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-C(＝NR 5a)N(R 5)-*； -(C 2-C 20雜環基)； -(C 2-C 20雜環基)-*； -(C 2-C 9雜環基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*； -(C 2-C 9雜環基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 2-C 9雜環基)-C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 2-C 9雜環基)-NR 5-C(＝NR 5a)NR 5-*； -(C 2-C 9雜環基)-NR 5-(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 2-C 9雜環基)-(C 6-C 20芳基二基)-*； -(C 1-C 20雜芳基)； -(C 1-C 20雜芳基)-*； -(C 1-C 20雜芳基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 1-C 20雜芳基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 1-C 20雜芳基)-NR 5-C(＝NR 5a)N(R 5)-*； -(C 1-C 20雜芳基)-N(R 5)C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -C(＝O)-*； -C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -C(＝O)-(C 2-C 20雜環基二基)-*； -C(＝O)N(R 5) 2； -C(＝O)N(R 5)-*； -C(＝O)N(R 5)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)C(＝O)R 5； -C(＝O)N(R 5)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)C(＝O)N(R 5) 2； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)CO 2R 5； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)C(＝NR 5a)N(R 5) 2； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5C(＝NR 5a)R 5； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 8烷基二基)-NR 5(C 2-C 5雜芳基)； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-N(R 5)-*； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-*； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-(C 2-C 20雜環基二基)-C(＝O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*； -N(R 5) 2； -N(R 5)-*； -N(R 5)C(＝O)R 5； -N(R 5)C(＝O)-*； -N(R 5)C(＝O)N(R 5) 2； -N(R 5)C(＝O)N(R 5)-*； -N(R 5)CO 2R 5； -NR 5C(＝NR 5a)N(R 5) 2； -NR 5C(＝NR 5a)N(R 5)-*； -NR 5C(＝NR 5a)R 5； -N(R 5)C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -N(R 5)-(C 2-C 5雜芳基)； -N(R 5)-S(＝O) 2-(C 1-C 12烷基)； -O-(C 1-C 12烷基)； -O-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -O-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -O-C(＝O)N(R 5) 2； -O-C(＝O)N(R 5)-*； -S(＝O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-*； -S(＝O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -S(＝O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*；及 -S(＝O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-OH； 或R 2及R 3一起形成5-員或6-員雜環基環； X 1、X 2、X 3及X 4獨立地選自由以下組成之群：鍵、C(＝O)、C(＝O)N(R 5)、O、N(R 5)、S、S(O) 2及S(O) 2N(R 5)； R 5獨立地選自由以下組成之群：H、C 6-C 20芳基、C 3-C 12碳環基、C 6-C 20芳基二基、C 1-C 12烷基及C 1-C 12烷基二基，或兩個R 5基團一起形成5員或6員雜環基環； R 5a選自由C 6-C 20芳基及C 1-C 20雜芳基組成之群； 其中星號*指示L之連接位點，且其中R 1、R 2、R 3及R 4中之一者連接至L； L為選自由以下組成之群的連接子： -C(＝O)-PEG-； -C(＝O)-PEG-C(＝O)N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-C(＝O)-Gluc-； -C(＝O)-PEG-O-； -C(＝O)-PEG-O-C(＝O)-； -C(＝O)-PEG-C(＝O)-； -C(＝O)-PEG-C(＝O)-PEP-； -C(＝O)-PEG-N(R 6)-； -C(＝O)-PEG-N(R 6)-C(＝O)-； -C(＝O)-PEG-N(R 6)-PEG-C(＝O)-PEP-； -C(＝O)-PEG-N +(R 6) 2-PEG-C(＝O)-PEP-； -C(＝O)-PEG-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-； -C(＝O)-PEG-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)N(R 6)C(＝O)-(C 2-C 5單雜環基二基)-； -C(＝O)-PEG-SS-(C 1-C 12烷基二基)-OC(＝O)-； -C(＝O)-PEG-SS-(C 1-C 12烷基二基)-C(＝O)-； -C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-C(＝O)-PEP-； -C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-； -C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-C(＝O)； -C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 6)C(＝O)-(C 2-C 5單雜環基二基)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-C(＝O)N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-C(＝O)-Gluc-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-O-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-O-C(＝O)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-C(＝O)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-N(R 5)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-N(R 5)-C(＝O)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-C(＝O)-PEP-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-SS-(C 1-C 12烷基二基)-OC(＝O)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)N(R 6)C(＝O)-；及 -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)N(R 6)C(＝O)-(C 2-C 5單雜環基二基)-； R 6獨立地為H或C 1-C 6烷基； PEG具有式-(CH 2CH 2O) n-(CH 2) m-；m為1至5之整數，且n為2至50之整數； Gluc具有下式：
Figure 02_image102
； PEP具有下式：
Figure 02_image104
其中AA獨立地選自天然或非天然胺基酸側鏈，或者一或多個AA及相鄰氮原子形成5員環脯胺酸胺基酸，且波浪線指示連接點； Cyc選自C 6-C 20芳基二基及C 1-C 20雜芳二基，其視情況經一個或多個選自F、Cl、NO 2、-OH、-OCH 3之基團取代，及具有以下結構之葡醣醛酸：
Figure 02_image106
； R 7選自由-CH(R 8)O-、-CH 2-、-CH 2N(R 8)-及-CH(R 8)O-C(＝O)-組成之群，其中R 8選自H、C 1-C 6烷基、C(＝O)-C 1-C 6烷基及-C(＝O)N(R 9) 2，其中R 9獨立地選自由H、C 1-C 12烷基及-(CH 2CH 2O) n-(CH 2) m-OH組成之群，其中m為1至5之整數，且n為2至50之整數，或兩個R 9基團一起形成5員或6員雜環基環； y為2至12之整數； z為0或1；且 烷基、烷基二基、烯基、烯基二基、炔基、炔基二基、芳基、芳基二基、碳環基、碳環基二基、雜環基、雜環基二基、雜芳基及雜芳基二基獨立地且視情況經獨立地選自以下之一或多個基團取代：F、Cl、Br、I、-CN、-CH 3、-CH 2CH 3、-CH＝CH 2、-C≡CH、-C≡CCH 3、-CH 2CH 2CH 3、-CH(CH 3) 2、-CH 2CH(CH 3) 2、-CH 2OH、-CH 2OCH 3、-CH 2CH 2OH、-C(CH 3) 2OH、-CH(OH)CH(CH 3) 2、-C(CH 3) 2CH 2OH、-CH 2CH 2SO 2CH 3、-CH 2OP(O)(OH) 2、-CH 2F、-CHF 2、-CF 3、-CH 2CF 3、-CH 2CHF 2、-CH(CH 3)CN、-C(CH 3) 2CN、-CH 2CN、-CH 2NH 2、-CH 2NHSO 2CH 3、-CH 2NHCH 3、-CH 2N(CH 3) 2、-CO 2H、-COCH 3、-CO 2CH 3、-CO 2C(CH 3) 3、-COCH(OH)CH 3、-CONH 2、-CONHCH 3、-CON(CH 3) 2、-C(CH 3) 2CONH 2、-NH 2、-NHCH 3、-N(CH 3) 2、-NHCOCH 3、-N(CH 3)COCH 3、-NHS(O) 2CH 3、-N(CH 3)C(CH 3) 2CONH 2、-N(CH 3)CH 2CH 2S(O) 2CH 3、- NHC(＝NH)H、-NHC(＝NH)CH 3、-NHC(＝NH)NH 2、-NHC(＝O)NH 2、-NO 2、＝O、-OH、-OCH 3、-OCH 2CH 3、-OCH 2CH 2OCH 3、-OCH 2CH 2OH、-OCH 2CH 2N(CH 3) 2、-O(CH 2CH 2O) n-(CH 2) mCO 2H、-O(CH 2CH 2O) nH、-OCH 2F、-OCHF 2、-OCF 3、-OP(O)(OH) 2、-S(O) 2N(CH 3) 2、-SCH 3、-S(O) 2CH 3及-S(O) 3H。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中抗體選自拉貝珠單抗及阿西莫單抗或其生物仿製藥或生物改良藥。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中抗體構築體包含： a)     包含胺基酸序列SEQ ID NO:3之CDR-L1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:5之CDR-L2、包含胺基酸序列SEQ ID NO:7之CDR-L3、包含胺基酸序列SEQ ID NO:11之CDR-H1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:13之CDR-H2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO:15之CDR-H3； b)     包含胺基酸序列SEQ ID NO:19之CDR-L1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:21之CDR-L2、包含胺基酸序列SEQ ID NO:23之CDR-L3、包含胺基酸序列SEQ ID NO:26之CDR-H1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:28之CDR-H2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO:30之CDR-H3； c)     包含胺基酸序列SEQ ID NO:35之CDR-L1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:37之CDR-L2、包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之CDR-L3、包含胺基酸序列SEQ ID NO:44之CDR-H1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:46之CDR-H2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO:48之CDR-H3； d)     包含胺基酸序列SEQ ID NO:53之CDR-L1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:55之CDR-L2、包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之CDR-L3、包含胺基酸序列SEQ ID NO:44之CDR-H1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:46之CDR-H2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO:48之CDR-H3； e)     包含胺基酸序列SEQ ID NO:59之CDR-L1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:61之CDR-L2、包含胺基酸序列SEQ ID NO:63之CDR-L3、包含胺基酸序列SEQ ID NO:67之CDR-H1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:69之CDR-H2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO:71之CDR-H3； f)      包含胺基酸序列SEQ ID NO:75之CDR-L1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:77之CDR-L2、包含胺基酸序列SEQ ID NO:79之CDR-L3、包含胺基酸序列SEQ ID NO:83之CDR-H1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:85之CDR-H2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO:87之CDR-H3； g)     包含胺基酸序列SEQ ID NO:91之CDR-L1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:93之CDR-L2、包含胺基酸序列SEQ ID NO:95之CDR-L3、包含胺基酸序列SEQ ID NO:99之CDR-H1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:101之CDR-H2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO:103之CDR-H3； h)     包含胺基酸序列SEQ ID NO:107之CDR-L1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:109之CDR-L2、包含胺基酸序列SEQ ID NO:111之CDR-L3、包含胺基酸序列SEQ ID NO:115之CDR-H1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:117或118之CDR-H2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO:120之CDR-H3；或 i)      包含胺基酸序列SEQ ID NO:107之CDR-L1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:109之CDR-L2、包含胺基酸序列SEQ ID NO:111之CDR-L3、包含胺基酸序列SEQ ID NO:124之CDR-H1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:126之CDR-H2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO:128之CDR-H3。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中抗體構築體包含可變輕鏈，其包含與選自SEQ ID NO：1、17、32、50、57、73、89及105之胺基酸序列具有至少95%同一性之胺基酸序列；及可變重鏈，其包含與選自SEQ ID NO: 9、41、65、81、97、113、122及130之胺基酸序列具有至少95%同一性之胺基酸序列。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中抗體構築體包含可變輕鏈，其包含選自SEQ ID NO: 1、17、32、50、57、73、89及105之胺基酸序列；及可變重鏈，其包含選自SEQ ID NO: 9、41、65、81、97、113、122及130之胺基酸序列。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中抗體構築體包含可變輕鏈，其包含來自SEQ ID NO: 105之胺基酸序列；及重鏈CDR(互補決定區)CDR-H2，其包含來自SEQ ID NO: 118之胺基酸序列。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中抗體構築體包含可變輕鏈，其包含來自SEQ ID NO: 105之胺基酸序列；及可變重鏈，其包含來自SEQ ID NO: 113之胺基酸序列。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中Het選自由以下組成之群：吡啶基二基、嘧啶基二基、吡唑基二基、哌嗪基二基、哌啶基二基及吡嗪基二基。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中X 1為鍵，且R 1為H。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中X 2為鍵，且R 2為C 1-C 8烷基。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中X 2及X 3各自為鍵，且R 2及R 3獨立地選自C 1-C 8烷基、-O-(C 1-C 12烷基)、-(C 1-C 12烷基二基)-OR 5、-(C 1-C 8烷基二基)-N(R 5)CO 2R 5、-(C 1-C 12烷基)-OC(O)N(R 5) 2、-O-(C 1-C 12烷基)-N(R 5)CO 2R 5及-O-(C 1-C 12烷基)-OC(O)N(R 5) 2。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中R 2為C 1-C 8烷基且R 3為-(C 1-C 8烷基二基)-N(R 5)CO 2R 5。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中R 2為-CH 2CH 2CH 3且R 3選自-CH 2CH 2CH 2NHCO 2(t-Bu)、-OCH 2CH 2NHCO 2(環丁基)及-CH 2CH 2CH 2NHCO 2(環丁基)。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中R 2及R 3各自獨立地選自-CH 2CH 2CH 3、-OCH 2CH 3、-OCH 2CF 3、-CH 2CH 2CF 3、-OCH 2CH 2OH及-CH 2CH 2CH 2OH。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中R 2及R 3各自為-CH 2CH 2CH 3。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中R 2為-CH 2CH 2CH 3且R 3為-OCH 2CH 3。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中X 3-R 3選自由以下組成之群：
Figure 02_image254
Figure 02_image256
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中X 4為鍵，且R 4為H。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中R 1連接至L。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中R 2及R 3連接至L。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中X 3-R 3-L選自由以下組成之群：
Figure 02_image258
Figure 02_image260
Figure 02_image262
其中波浪線指示與N之連接點。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中R 4為C 1-C 12烷基。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中R 4為-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*；其中星號*指示L之連接點。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中L為-C(＝O)-PEG-或-C(＝O)-PEG-C(＝O)-。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中L連接至抗體之半胱氨酸硫醇。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中對於PEG，m為1或2，且n為2至10之整數。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中L包含PEP且PEP為二肽且具有下式：
Figure 02_image264
。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中AA 1及AA 2獨立地選自H、-CH 3、-CH(CH 3) 2、-CH 2(C 6H 5)、-CH 2CH 2CH 2CH 2NH 2、-CH 2CH 2CH 2NHC(NH)NH 2、-CHCH(CH 3)CH 3、-CH 2SO 3H及-CH 2CH 2CH 2NHC(O)NH 2；或者AA 1及AA 2形成5員環脯氨酸胺基酸。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中AA 1為-CH(CH 3) 2，且AA 2為-CH 2CH 2CH 2NHC(O)NH 2。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中AA 1及AA 2獨立地選自GlcNAc天冬胺酸、-CH 2SO 3H及-CH 2OPO 3H。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中PEP具有下式：
Figure 02_image266
其中AA 1及AA 2獨立地選自天然存在之胺基酸之側鏈。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中L包含PEP且PEP為三肽且具有下式：
Figure 02_image268
。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中L包含PEP且PEP為四肽且具有下式：
Figure 02_image270
。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中： AA 1選自由Abu、Ala及Val組成之群； AA 2選自由Nle(O-Bzl)、Oic及Pro組成之群； AA 3選自由Ala及Met(O) 2組成之群；且 AA 4選自由Oic、Arg(NO 2)、Bpa及Nle(O-Bzl)組成之群。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中L包含PEP且PEP選自由以下組成之群：Ala-Pro-Val、Asn-Pro-Val、Ala-Ala-Val、Ala-Ala-Pro-Ala (SEQ ID NO: 131)、Ala-Ala-Pro-Val (SEQ ID NO: 132)及Ala-Ala-Pro-Nva (SEQ ID NO: 133)。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中L包含PEP且PEP選自以下結構：
Figure 02_image272
；
Figure 02_image274
；
Figure 02_image276
；及
Figure 02_image278
。
式I之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中L選自以下結構：
Figure 02_image280
其中波浪線指示與R 5之連接。
式I之免疫結合物之示範性實施例具有式Ia：
Figure 02_image282
。
式Ia之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中X 4為鍵，且R 4為H。
式Ia之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中X 2及X 3各自為鍵，且R 2及R 3獨立地選自C 1-C 8烷基、-O-(C 1-C 12烷基)、-(C 1-C 12烷基二基)-OR 5、-(C 1-C 8烷基二基)-N(R 5)CO 2R 5、-(C 1-C 12烷基)-OC(O)N(R 5) 2、-O-(C 1-C 12烷基)-N(R 5)CO 2R 5及-O-(C 1-C 12烷基)-OC(O)N(R 5) 2。
式Ia之免疫結合物之示範性實施例選自式Ib-Ii：
Figure 02_image284
Ib；
Figure 02_image286
Ic；
Figure 02_image288
Id；
Figure 02_image290
Ie；
Figure 02_image292
If；
Figure 02_image294
Ig；
Figure 02_image296
Ih；及
Figure 02_image298
Ii。
式Ia之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中X 2及X 3各自為鍵，且R 2及R 3獨立地選自C 1-C 8烷基、-O-(C 1-C 12烷基)、-(C 1-C 12烷基二基)-OR 5、-(C 1-C 8烷基二基)-N(R 5)CO 2R 5及-O-(C 1-C 12烷基)-N(R 5)CO 2R 5。
式Ia之免疫結合物之示範性實施例包括如下情況，其中X 2及X 3各自為鍵，R 2為C 1-C 8烷基，且R 3選自-O-(C 1-C 12烷基)及-O-(C 1-C 12烷基)-N(R 5)CO 2R 5。
本發明包括式I實施例之特徵之所有合理組合及排列。
在某些實施例中，本發明之免疫結合物化合物包括具有免疫刺激活性之彼等者。本發明之抗體-藥物結合物將有效劑量之8-Het-2-胺基苯并氮呯藥物選擇性遞送至腫瘤組織，藉此相對於非經結合之8-Het-2-胺基苯并氮呯可在增加治療指數(「治療窗」)之同時達成更大選擇性(亦即，更低有效劑量)。
藥物加載量由p (式I之免疫結合物中每個抗體之HxBz部分數目)表示。藥物(HxBz)加載量可在每個抗體1至約8個藥物部分(D)之範圍內。式I之免疫結合物包括與1至約8範圍之藥物部分結合的抗體之混合物或集合。在一些實施例中，可結合至抗體之藥物部分之數目受限於反應性或可用胺基酸側鏈殘基(諸如離胺酸及半胱胺酸)之數目。在一些實施例中，藉由本文所描述之方法將遊離半胱胺酸殘基引入到抗體胺基酸序列中。在此類態樣中，p可為1、2、3、4、5、6、7或8及其範圍，例如1到8或2到5。在任何此類態樣中，p及n為相等的(亦即，p ＝ n ＝ 1、2、3、4、5、6、7或8，或在其之間的某個範圍)。示範性式I之免疫結合物包括但不限於具有1、2、3或4個經工程改造半胱氨酸胺基酸之抗體(Lyon, R.等人(2012) Methods in Enzym. 502:123-138)。在一些實施例中，在未使用工程改造之情況下，一或多個遊離半胱胺酸殘基已存在於抗體中，形成鏈內二硫鍵，在此情況下現有遊離半胱胺酸殘基可用於使抗體結合至藥物。在一些實施例中，在結合抗體之前使抗體暴露於還原條件以產生一或多個遊離半胱胺酸殘基。
對於一些免疫結合物，p可受抗體上連接位點之數目限制。舉例而言，如在本文所描述之某些示範性實施例中，在連接為半胱胺酸硫醇時，抗體可具有僅一個或有限數目之半胱胺酸硫醇基，或可具有僅一個或有限數目之充足反應性硫醇基，藥物可與該等基團連接。在其他實施例中，對於與式II之Hx-連接子化合物結合而言，抗體中之一或多個離胺酸胺基可為可用的及反應性的。在某些實施例中，較高藥物加載量( 例如p ＞5)可引起某些抗體-藥物結合物之聚集、不可溶性、毒性或細胞滲透性損失。在某些實施例中，免疫結合物之平均藥物加載量在1至約8；約2至約6；或約3至約5範圍內。在某些實施例中，抗體經受變性條件以揭示反應性親核基團，諸如離胺酸或半胱胺酸。
免疫結合物之加載量(藥物/抗體比)可以不同方式加以控制，且例如藉由以下控制：(i)限制Hx-連接子中間物化合物相對於抗體之莫耳過量，(ii)限制結合反應時間或溫度，及(iii)部分或有限之還原變性條件以獲得經最佳化之抗體反應性。
應瞭解，若抗體之超過一個親核基團與藥物反應，則所得產物為具有一或多個連接至抗體之藥物部分之分佈的免疫結合物化合物之混合物。可藉由對抗體具特異性且對藥物具特異性之雙ELISA抗體分析由混合物計算每個抗體之平均藥物數目。可藉由質譜分析鑑定混合物中之個別免疫結合物分子且藉由HPLC (例如疏水相互作用層析)分離(參見例如McDonagh等人(2006) Prot. Engr. Design 及 Selection19(7):299-307；Hamblett等人(2004) Clin. Cancer Res.10:7063-7070；Hamblett, K.J.等人 「Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate」, 摘要編號624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, 2004年3月27-31日, Proceedings of the AACR, 第45卷, 2004年3月；Alley, S.C.,等人「Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates,」 摘要編號627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, 2004年3月27-31日, Proceedings of the AACR, 第45卷, 2004年3月)。在某些實施例中，可藉由電泳或層析自結合混合物分離具有單一加載值之均質免疫結合物。
式I之免疫結合物之示範性實施例選自表3a及3b抗CEA HxBz免疫結合物。活體外免疫結合物活性之評估根據實例203之方法進行。 表3a 抗CEA HxBz免疫結合物(IC)
免疫結合物編號 HxBzL- 表2a、2b 抗體 DAR PBMC檢定TNFα分泌 EC50 [nM] cDC共培養檢定及IL-12p70 EC50 [nM]
IC-1   HxBzL-1 CEA.9-G1fhL2 2.4 N/A   
IC-2   HxBzL-5 CEA.9-G1fhL2 2.6 1.9   
IC-3   HxBzL-12 CEA.9-G1fhL2 1.8、2.7 N/A 1.0
IC-4   HxBzL-14 CEA.9-G1fhL2 2.5 4.4 2.2
IC-5   HxBzL-15 CEA.9-G1fhL2 1.9 20.4 10.9
IC-6   HxBzL-21 CEA.9-G1fhL2 1.9、2.2、2.8 3.9 10.2
IC-7   HxBzL-13 CEA.9-G1fhL2 2.8 N/A 2.3
IC-8   HxBzL-22 CEA.9-G1fhL2 2.0    2.5
IC-9   HxBzL-26 CEA.9-G1fhL2 2.4    4.4
IC-10 HxBzL-25 CEA.9-G1fhL2 2.3      
IC-11 HxBzL-23 CEA.9-G1fhL2 2.7    2.1
IC-12 HxBzL-27 CEA.9-G1fhL2 2.3      
IC-13 HxBzL-29 CEA.9-G1fhL2 2.6      
IC-14 HxBzL-32 CEA.9-G1fhL2 2.0 0.8 1.2
IC-15 HxBzL-28 CEA.9-G1fhL2 2.2      
IC-16 HxBzL-33 CEA.9-G1fhL2 2.0、2.7    1.9
IC-17 HxBzL-44 CEA.9-G1fhL2 3.2    0.3
IC-18 HxBzL-3 CEA.9-G1fhL2 1.8      
IC-19 HxBzL-4 CEA.9-G1fhL2 2.0    N/A
IC-20 HxBzL-7 CEA.9-G1fhL2 1.9    0.6
IC-21 HxBzL-8 CEA.9-G1fhL2 1.9      
IC-22 HxBzL-10 CEA.9-G1fhL2 2.9    0.5
IC-23 HxBzL-16 CEA.9-G1fhL2 1.8    1.0
IC-24 HxBzL-31 CEA.9-G1fhL2 1.9      
IC-25 HxBzL-38 CEA.9-G1fhL2 2.2    0.9
IC-26 HxBzL-40 CEA.9-G1fhL2 1.9      
IC-27 HxBzL-42 CEA.9-G1fhL2 1.9      
IC-28 HxBzL-43 CEA.9-G1fhL2 2.1      
IC-29 HxBzL-46 CEA.9-G1fhL2 2.0    12.0
IC-30 HxBzL-51 CEA.9-G1fhL2 2.3    3.5
IC-31 HxBzL-36 CEA.9-G1fhL2 2.5      
IC-32 HxBzL-5 CEA.6-G1f 2.2    N/A
IC-33 HxBzL-5 CEA.6-G1f 2.2    3.2
IC-34 HxBzL-45 CEA.9-G1fhL2 4.1      
IC-35 HxBzL-41 CEA.9-G1fhL2 2.2      
IC-36 HxBzL-2 CEA.9-G1fhL2 2.3      
表3b 抗CEA HxBz免疫結合物(IC)
免疫結合物編號 HxBzL- 表2a、2b 抗體 DAR PBMC檢定TNFα分泌 EC50 [nM] cDC共培養檢定及IL-12p70 EC50 [nM]
IC-37 HxBzL-64 CEA.9-G1fhL2 2.6      
IC-38 HxBzL-63 CEA.9-G1fhL2 2.5      
IC-39 HxBzL-59 CEA.9-G1fhL2 2.7      
IC-40 HxBzL-62 CEA.9-G1fhL2 2.5      
IC-41 HxBzL-61 CEA.9-G1fhL2 2.4      
IC-42 HxBzL-60 CEA.9-G1fhL2 2.2      
IC-43 HxBzL-58 CEA.9-G1fhL2 2.2      
IC-44 HxBzL-53 CEA.9-G1fhL2 2.5      
IC-45 HxBzL-57 CEA.9-G1fhL2 2.5      
IC-46 HxBzL-56 CEA.9-G1fhL2 2.4      
IC-47 HxBzL-55 CEA.9-G1fhL2 2.5      
IC-48 HxBzL-54 CEA.9-G1fhL2 2.5      
IC-49 HxBzL-52 CEA.9-G1fhL2 2.6      
IC-50 HxBzL-65 CEA.9-G1fhL2 3.2      
IC-51 HxBzL-68 CEA.9-G1fhL2 2.5      
IC-52 HxBzL-67 CEA.9-G1fhL2 2.5      
IC-53 HxBzL-66 CEA.9-G1fhL2 2.6      
IC-54 HxBzL-5 CEA 9-G1f-N297AhL2 2.4      
IC-55 HxBzL-14 CEA 9-G1f-N297AhL2 2.2      
IC-56 HxBzL-13 CEA 9-G1f-N297AhL2 2.6      
IC-57 HxBzL-70 CEA.9-G1fhL2 2.4      
IC-58 HxBzL-27 CEA 9-G1f-N297AhL2 2.5      
IC-59 HxBzL-13 CEA 3-G1f 2.6      
IC-60 HxBzL-13 CEA 6-G1f 2.7      
IC-61 HxBzL-69 CEA.9-G1fhL2 2.1      
IC-62 HxBzL-13 CEA 9-mG2a 2.6      
IC-63 HxBzL-13 CEA 10-mG2a 2.3      
免疫結合物之組合物
本發明提供一種組合物，例如醫藥學上或藥理學上可接受之組合物或調配物，其包含複數種如本文所描述之免疫結合物及視情況存在之用於其之載劑，例如醫藥學上或藥理學上可接受之載劑。組合物中之免疫結合物可為相同或不同的，亦即，組合物可包含具有鍵聯至抗體構築體上相同位置之相同數目之佐劑的免疫結合物及/或具有鍵聯至抗體構築體上不同位置之相同數目之Hx佐劑、具有鍵聯至抗體構築體上相同位置之不同數目之佐劑或具有鍵聯至抗體構築體上不同位置之不同數目之佐劑的免疫結合物。
在一示範性實施例中，包含免疫結合物化合物之組合物包含免疫結合物化合物之混合物，其中免疫結合物化合物之混合物中每個抗體之平均藥物(Hx)加載量為約2至約5。
本發明之免疫結合物之組合物可具有約0.4至約10之平均佐劑與抗體構築體比(DAR)。熟習此項技術者將認識到，在包含多種本發明之免疫結合物的組合物中結合至抗體構築體之8-Het-2-胺基苯并氮呯佐劑之數目在免疫結合物之間可不同，且因此佐劑與抗體構築體(例如抗體)比可經量測為可稱為藥物與抗體比(DAR)之平均值。佐劑與抗體構築體(例如抗體)比可藉由任何合適的方法評估，該等方法中許多為此項技術中已知的。
在由結合反應製備免疫結合物時每個抗體之平均佐劑部分數目(DAR)可藉由諸如質譜法、ELISA分析及HPLC之習知手段來表徵。亦可測定就p而言組合物中免疫結合物之定量分佈。在一些情況下，其中p為來自具有其他藥物加載量之免疫結合物的某一值之均質免疫結合物的分離、純化及表徵可藉由諸如逆相HPLC或電泳之手段來達成。
在一些實施例中，組合物進一步包含一或多種醫藥學上或藥理學上可接受之賦形劑。舉例而言，本發明之免疫結合物可經調配用於非經腸投與，諸如靜脈內投與或投與至體腔或器官管腔中。或者，可腫瘤內注射免疫結合物。用於注射之組合物將通常包含免疫結合物溶解於醫藥學上可接受之載劑中之溶液。在可接受之媒劑及溶劑中，可採用水及一或多種鹽(諸如氯化鈉)之等張溶液，例如林格氏溶液(Ringer's solution)。此外，可習知採用無菌固定油作為溶劑或懸浮介質。出於此目的，可採用任何溫和固定油，包括合成單甘油酯或二甘油酯。此外，諸如油酸之脂肪酸同樣可用於製備可注射劑。此等組合物理想地為無菌的且通常不含不希望之物質。此等組合物可藉由習知之熟知滅菌技術進行滅菌。組合物可按需要含有醫藥學上可接受之助劑物質以接近生理條件，諸如pH調節及緩衝劑、毒性調節劑，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉及類似物。
組合物可含有任何適合之濃度之免疫結合物。組合物中免疫結合物之濃度可廣泛地改變，且將根據所選之特定投與模式及患者之需要主要基於流體體積、黏度、體重及類似因素加以選擇。在某些實施例中，用於注射之溶液調配物中免疫結合物之濃度將在約0.1% (w/w)至約10% (w/w)範圍內。 免疫結合物之生物活性
免疫結合物IC-2與一組細胞株上表面表現之CEA有差異地結合，且與CEA轉錄水準相關，如下表所示。
細胞株 癌症類型 每個細胞之IC-2位點 結合EC50 IHC H評分
MKN-45 胃癌 ＞2,000,000 30.9 nM 300
HPAF-II 胰臟癌 1,760,000 19.5 nM 220
LoVo 結腸癌 166,000 25.0 nM 110
LS-174T 結腸直腸腺癌 38,400 4.7 nM ND
MDA-MB-231 乳癌 0 ND ND
將人類結腸直腸癌陣列(n＝247)、非小細胞肺癌陣列(n＝69)及胃癌/胃食管癌陣列(n＝114)用CEA31 IHC檢定(Ventana/Cell Marque)染色。H評分經計算為(具有1+染色強度之細胞百分比)+(具有2+染色強度之細胞2X百分比)+(具有3+染色強度之3X細胞百分比)。每個細胞之IC-2結合位點表示給定腫瘤細胞將結合之IC-2分子數目，且與細胞表面抗原表現水準相關。收穫活腫瘤細胞並用100 nM經Alexa Flour 488標記之IC-2或經Alexa Flour 488標記之hIgG1同型對照標記，然後進行流動式細胞測量術分析。使用來自Bangs Laboratories之QSC珠粒確定IC-2結合位點。藉由自IC-2結合位點中減去hIgG1同型對照結合位點來校正非特異性結合位點。
圖1展示了小鼠 活體內異種移植腫瘤模型之圖。量測治療後隨時間推移之腫瘤體積，以比較免疫結合物IC-2與同型免疫結合物(ISAC)及裸抗體CEA.9-G1fhL2在攜帶CEA-高的人類胰臟HPAF-II腫瘤之小鼠的腫瘤抑制方面之功效。免疫結合物IC-2在低至0.5 mg/kg之劑量水準下對CEA高的人類胰臟HPAF-II腫瘤表現出劑量依賴性生長抑制。同型ISAC為抗CD20抗體(利妥昔單抗)與HxBzL-5 (與IC-2相同之佐劑連接子)結合之免疫結合物。同型ISAC具有與IC-2相同之佐劑連接子(HxBzL-5)。同型ISAC充當脫靶陰性對照，顯示出很少或沒有腫瘤生長抑制。在該研究中，裸抗體CEA.9-G1fhL2亦顯示出很少或沒有腫瘤生長抑制。此等結果證實先天效應細胞之劑量依賴性腫瘤募集及免疫刺激細胞介素之誘導，且表明本發明之免疫結合物可有效治療表現CEA之癌症。
圖2a-2e展示了在CEA高的胃癌MKN-45細胞與富含cDC之原代細胞分離物之共培養物中藉由免疫結合物IC-2、IC-3、IC-4、IC-6、IC-14及裸抗體CEA.9-G1fhL2誘導各種細胞介素之圖。量測由細胞分泌到上清液中之細胞介素IL-12p70(圖2a)、TNFα(腫瘤壞死因子α)(圖2b)、IL-6(白細胞介素-6)(圖2c)、IFNγ(干擾素伽瑪)(圖2d)及CCL2 (圖2e)之水準。此等細胞介素之誘導與產生對癌症之免疫反應有關。將不同濃度之免疫結合物IC-2、IC-3、IC-4、IC-6、IC-14及裸抗體CEA.9-G1fhL2與CEA高的MKN-45細胞及富含cDC之原代細胞製劑(E:T ＝ 10:1)一起溫育18小時，然後回收上清液。使用LegendPlexcytokine珠粒陣列套組確定經分泌之細胞介素水準。所測試之免疫結合物在作為佐劑之函數經誘導之細胞介素水準方面有所不同。天然CEA.9-G1fhL2抗體誘導很少或未誘導細胞介素分泌，這表明依賴於TLR7/8活化佐劑。
圖3a-3d展示了藉由在CEA-高的HPAF II細胞(圖3a)、CEA-中等的LoVo細胞(圖3b)、CEA-低的LS-174T細胞(圖3c)及CEA陰性的MDA-MB-231細胞(圖3d)中用不同濃度之免疫結合物IC-2處理之經M-CSF分化之單核球衍生性巨噬球進行的吞噬作用之圖。將經CTG標記之腫瘤IC-2免疫複合物 與經M-CSF分化之單核球衍生性巨噬球以2:1效應物與靶標比率溫育。4小時後，藉由門控對CTG訊號呈陽性之效應細胞之流動式細胞測量術量測吞噬作用。圖中展示了來自三個供體之平均值+/-標準偏差。抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)為抗體調理靶細胞活化巨噬球表面上之FcγR以誘導吞噬作用從而導致靶細胞內化及降解之機制。免疫結合物IC-2誘導CEA高的HPAF II (EC50 ＝ 9.2 ±2.3 nM)及CEA中等的LoVo (EC50 ＝ 11.4 ±3.5 nM)之劑量依賴性吞噬作用。對於CEA低的LS-174T，觀測到最小ADCP。IC-2不會誘導CEA陰性MDA-MB-231之ADCP。此等結果表明IC-2對ADCP之誘導依賴於靶腫瘤細胞之中等/高CEA表現。
圖4a-4f展示了在將不同濃度之免疫結合物IC-2及裸抗體CEA.9-G1fhL2與癌細胞同富含cDC之原代細胞分離物之共培養物溫育後上清液中分泌之細胞介素水準及細胞表面標記物之誘導之圖。將免疫結合物IC-2及裸抗體CEA.9-G1fhL2與CEA陽性腫瘤細胞(HPAF-II、LoVo或LS174-T)及富含cDC之原代細胞製劑(E:T ＝ 10:1)一起溫育18小時，然後回收上清液及細胞。使用LegendPlex細胞介素珠粒陣列套組確定上清液中分泌之細胞介素水準(圖4a-4d)。藉由流動式細胞測量術確定細胞表面標記物之誘導(圖4e-4f)。在癌細胞與富含cDC之原代細胞分離物之共培養物中，靶向CEA之免疫結合物IC-2誘導細胞介素TNFα(圖4a)、IL-6(圖4b)、IL-12p70(圖4c)及CXCL10(圖4d)之分泌，該等細胞介素與產生對癌症之免疫反應有關。此外，CD40(圖4e)及CD86(圖4f)抗原之表面水準升高，這與先天性免疫(髓樣細胞)之活化一致。細胞介素及表面標記物誘導水準在使用CEA高的HPAF-II及CEA中等的LoVo細胞之情況下相似，但在使用CEA低的LS-174T細胞之情況下顯著降低。細胞介素及表面標記物研究表明，當暴露於表現CEA之腫瘤細胞及抗CEAISACIC-2時，髓細胞得到活化。使用CEA高的HPAF-II細胞及CEA中等的LoVo細胞觀測到活化。CEA低的LS-174T細胞及CEA陰性MDA-MB-231細胞之活化很低或無法偵測到。天然抗體CEA.9-G1fhL2不會誘導骨髓活化。圖4a-4f之結果表明IC-2活性依賴於與人類癌症相關之CEA表現水準。天然CEA.9-G1fhL2抗體誘導很少或未誘導細胞介素分泌，這表明依賴於TLR7/8活化有效負荷。 用免疫結合物治療癌症之方法
本發明提供一種用於治療癌症之方法。該方法包括向有需要之個體(例如患有癌症且需要治療癌症之個體)投與治療有效量之如本文所描述之免疫結合物(例如如本文所描述呈組合物形式)。該方法包括投與治療有效量之選自表3a及3b之免疫結合物(IC)。
預期本發明之免疫結合物可用於治療例如以腫瘤抗原之過表現為特徵的各種過度增殖性疾病或病症。示範性過度增殖性病症包括良性或惡性實體腫瘤及血液學病症，諸如白血病及淋巴系統惡性腫瘤。
在另一態樣中，提供一種用作藥劑之免疫結合物。在某些實施例中，本發明提供一種用於包括向個體投與有效量之免疫結合物之治療個體之方法中的免疫結合物。在一個此等實施例中，該方法進一步包括向個體投與有效量之至少一種例如如本文所描述之其他治療劑。
在另一態樣中，本發明提供免疫結合物在藥劑之製造或製備中之用途。在一個實施例中，該藥劑用於治療癌症，該方法包括向患有癌症之個體投與有效量之該藥劑。在一個此等實施例中，該方法進一步包括向個體投與有效量之至少一種例如如本文所描述之其他治療劑。
癌瘤為起源於上皮組織之惡性腫瘤。上皮細胞覆蓋身體之外表面、襯於內部空腔且形成腺組織之內襯。癌瘤之實例包括但不限於腺癌(在腺(分泌)細胞中開始之癌症，諸如乳癌、胰臟癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、胃食管連接部癌及結腸癌)；腎上腺皮質癌；肝細胞癌；腎細胞癌；卵巢癌；原位癌；導管癌；乳癌；基底細胞癌；鱗狀細胞癌；移行細胞癌；結腸癌；鼻咽癌；多室性囊性腎細胞癌；燕麥狀細胞癌；大細胞肺癌；小細胞肺癌；非小細胞肺癌；及諸如此類。癌瘤可見於前列腺、胰臟、結腸、腦(通常呈二次轉移形式)、肺、乳房及皮膚中。在一些實施例中，用於治療非小細胞肺癌之方法包括投與含有能夠結合CEA之抗體構築體(例如拉貝珠單抗或其生物仿製藥或其生物改良藥)之免疫結合物。
軟組織腫瘤為衍生自結締組織之高度多樣化之罕見腫瘤群。軟組織腫瘤之實例包括但不限於肺泡軟組織肉瘤；血管瘤樣纖維組織細胞瘤；軟骨黏液樣纖維瘤；骨骼軟骨肉瘤；骨外黏液樣軟骨肉瘤；透明細胞肉瘤；促結締組織增生性小圓細胞腫瘤；隆凸性皮膚纖維肉瘤；子宮內膜基質瘤；尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)；纖維瘤病(硬纖維瘤)；嬰兒型纖維肉瘤；胃腸道間質瘤；骨骼巨細胞腫瘤；腱鞘巨細胞腫瘤；炎性肌纖維母細胞腫瘤；子宮肌瘤；平滑肌肉瘤；脂胚細胞瘤；典型脂肪瘤；紡錘細胞或多形性脂肪瘤；非典型性脂肪瘤；軟骨樣脂肪瘤；分化良好型脂肪肉瘤；黏液樣/圓細胞脂肪肉瘤；多形性脂肪肉瘤；黏液樣惡性纖維組織細胞瘤；高級惡性纖維組織細胞瘤；黏液纖維肉瘤；惡性周圍神經鞘腫瘤；間皮瘤；神經胚細胞瘤；骨軟骨瘤；骨肉瘤；原始神經外胚層腫瘤；齒槽橫紋肌肉瘤；胚胎性橫紋肌肉瘤；良性或惡性神經鞘瘤；滑膜肉瘤；伊凡氏腫瘤(Evan’s tumor)；結節性筋膜炎；硬纖維瘤型纖維瘤病；孤立性纖維腫瘤；隆凸性皮膚纖維肉瘤(DFSP)；血管肉瘤；上皮樣血管內皮瘤；腱鞘巨細胞腫瘤(TGCT)；色素沈著絨毛結節性滑膜炎(PVNS)；纖維組織發育異常；黏液纖維肉瘤；纖維肉瘤；滑膜肉瘤；惡性周圍神經鞘腫瘤；神經纖維瘤；軟組織多形性腺瘤；及源自纖維母細胞、肌纖維母細胞、組織細胞、維管細胞/內皮細胞及神經鞘細胞之瘤形成。
肉瘤為一種罕見類型之癌症，其產生於間充質來源之細胞中，例如骨骼中或身體之軟組織中，包括軟骨、脂肪、肌肉、血管、纖維組織或其他結締組織或支持組織。不同類型之肉瘤係基於癌症形成於何處。舉例而言，骨肉瘤形成於骨骼中，脂肪肉瘤形成於脂肪中，且橫紋肌肉瘤形成於肌肉中。肉瘤之實例包括但不限於阿金氏腫瘤(askin's tumor)；葡萄樣肉瘤；軟骨肉瘤；尤文氏肉瘤；惡性血管內皮細胞瘤；惡性神經鞘瘤；骨肉瘤；及軟組織肉瘤(例如肺泡軟組織肉瘤；血管肉瘤；囊性肉瘤葉狀柄隆凸性皮膚纖維肉瘤(DFSP)；硬纖維瘤；促結締組織增生性小圓細胞腫瘤；上皮樣肉瘤；骨外軟骨肉瘤；骨外骨肉瘤；纖維肉瘤；胃腸道間質瘤(GIST)；血管外皮細胞瘤；血管肉瘤(hemangiosarcoma) (更通常稱為「血管肉瘤(angiosarcoma)」)；卡波西氏肉瘤(kaposi's sarcoma)；平滑肌肉瘤；脂肪肉瘤；淋巴管肉瘤；惡性周圍神經鞘腫瘤(MPNST)；神經纖維肉瘤；滑膜肉瘤；及未分化多形性肉瘤)。
畸胎瘤為一類生殖細胞腫瘤，其可含有若干不同類型之組織(例如可包括衍生自任何及/或所有三個胚層( 內胚層、中胚層及外胚層)之組織)，包括例如毛、肌肉及骨骼。畸胎瘤最常發生於女性之卵巢、男性之睾丸及兒童之尾骨中。
黑色素瘤為一種開始於黑色素細胞(產生黑色素之細胞)中之癌症形式。黑色素瘤可開始於痣(皮膚黑色素瘤)中，但亦可開始於其他色素沈著組織中，諸如眼睛中或腸道中。
默克細胞癌(Merkel cell carcinoma)為一種罕見類型之皮膚癌，其通常表現為面部、頭部或頸部之肉色或藍紅色結節。默克細胞癌亦稱為皮膚之神經內分泌癌。在一些實施例中，用於治療默克細胞癌之方法包括投與含有能夠結合CEA之抗體構築體(例如拉貝珠單抗、其生物仿製藥或其生物改良藥)的免疫結合物。在一些實施例中，當進行投與時默克細胞癌已轉移。
白血病為開始於血液形成組織(諸如骨髓)中之癌症且引起大量異常血細胞產生且進入血流。舉例而言，白血病可起源於通常在血流中成熟之骨髓源性細胞。白血病係針對疾病多麼快速發展及進展(例如急性相較於慢性)且針對受影響之白血細胞類型(例如骨髓相較於淋巴)而命名。髓樣白血病亦稱為骨髓性或髓母細胞性白血病。淋巴樣白血病亦稱為淋巴母細胞性或淋巴細胞性白血病。淋巴樣白血病細胞可在可變得腫脹之淋巴結中收集。白血病之實例包括但不限於急性髓樣白血病(AML)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性髓樣白血病(CML)及慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。
淋巴瘤為開始於免疫系統之細胞中之癌症。舉例而言，淋巴瘤可起源於通常在淋巴系統中成熟之骨髓源性細胞。存在兩種基本類別之淋巴瘤。一種類別之淋巴瘤為霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)，其以一類稱為里德-斯特恩伯格細胞(Reed-Sternberg cell)之細胞之存在為標記。當前存在6種已識別之HL類型。霍奇金淋巴瘤之實例包括結節性硬化經典霍奇金淋巴瘤(CHL)、混合細胞性CHL、淋巴細胞消耗CHL、富淋巴細胞CHL及結節性淋巴細胞優勢型HL。
其他類別之淋巴瘤為非霍奇金淋巴瘤(NHL)，其包括免疫系統細胞之一大群各種癌症。非霍奇金淋巴瘤可進一步分成具有惰性(生長遲緩)過程之癌症及具有侵襲性(快速生長)過程之彼等癌症。當前存在61種已識別之NHL類型。非霍奇金淋巴瘤之實例包括但不限於AIDS相關淋巴瘤、間變性大細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞性淋巴瘤、母細胞性NK-細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、伯基特氏樣淋巴瘤(小非核裂細胞淋巴瘤)、慢性淋巴細胞性白血病/小淋巴細胞性淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、腸病型T細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、肝脾性γ-δ T細胞淋巴瘤、T細胞白血病、淋巴母細胞性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、鼻T細胞淋巴瘤、兒科淋巴瘤、外周T細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、轉型淋巴瘤、治療相關T細胞淋巴瘤及沃爾德斯特羅姆氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)。
腦癌包括腦組織之任何癌症。腦癌之實例包括但不限於神經膠質瘤(例如膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、寡樹突神經膠質瘤、室管膜瘤及諸如此類)、腦膜瘤、垂體腺瘤及前庭神經鞘瘤、原始神經外胚層腫瘤(神經管母細胞瘤)。
本發明之免疫結合物可單獨或與療法中之其他藥劑組合使用。舉例而言，免疫結合物可與至少一種其他治療劑(諸如化學治療劑)共投與。此等組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括於同一或單獨調配物中)及分開投與，在此情況下，投與免疫結合物可在投與其他治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後進行。免疫結合物亦可與放射療法組合使用。
本發明之免疫結合物(及任何其他治療劑)可藉由任何合適之方式投與，包括經口、非經腸、肺內及鼻內方式，且若需要局部治療，則為病灶內投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。給藥可藉由任何適合之途徑例如藉由注射(諸如靜脈內或皮下注射)進行，此部分取決於投與為短暫的抑或長期的。本文中涵蓋多種給藥方案，包括但不限於經過多個時間點單次或多次投與、快速投與及脈衝輸注。
免疫結合物係使用任何適合之給藥方案(諸如用於拉貝珠單抗、其生物仿製藥或其生物改良藥之給藥方案)以任何治療有效量向有需要之個體投與。舉例而言，該等方法可包括投與免疫結合物以向個體提供約100 ng/kg至約50 mg/kg之劑量。免疫結合物劑量可在約5 mg/kg至約50 mg/kg、約10 μg/kg至約5 mg/kg或約100 μg/kg至約1 mg/kg範圍內。免疫結合物劑量可為約100、200、300、400或500 μg/kg。免疫結合物劑量可為約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 mg/kg。視特定結合物以及所治療癌症之類型及嚴重程度而定，免疫結合物劑量亦可在此等範圍之外。投與頻率可在每週單個劑量至多個劑量範圍內，或更頻繁。在一些實施例中，約每月一次至約每週五次投與免疫結合物。在一些實施例中，每週一次投與免疫結合物。
在另一態樣中，本發明提供一種用於預防癌症之方法。該方法包括向個體投與治療有效量之免疫結合物(例如如上文所描述呈組合物形式)。在某些實施例中，個體易患某一所要預防之癌症。
本發明之一些實施例提供如上文所描述之用於治療癌症之方法，其中癌症為乳癌。乳癌可來源於乳房中之不同區域，且已表徵許多不同類型之乳癌。舉例而言，本發明之免疫結合物可用於治療導管原位癌；侵入性導管癌瘤(例如小管癌；髓樣癌；黏液癌；乳頭狀癌；或乳房篩狀癌)；小葉原位癌；侵入性小葉癌；炎性乳癌；及其他形式之乳癌，諸如三陰性(針對雌激素受體、孕激素受體及過量HER2蛋白測試為陰性)乳癌。在一些實施例中，用於治療乳癌之方法包括投與含有能夠結合CEA或過表現CEA之腫瘤之抗體構築體(例如拉貝珠單抗、其生物仿製藥或生物改良藥)的免疫結合物。
在一些實施例中，癌症易受由TLR7及/或TLR8誘導之促炎性反應影響。
在一些實施例中，向需要治療宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、前列腺癌、胰臟癌、食道癌、膀胱癌、泌尿道癌、尿路上皮癌、肺癌、非小細胞肺癌、默克細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌或乳腺之患者施用治療有效量之免疫結合物。該默克細胞癌可為轉移性默克細胞癌。乳癌可為三陰性乳癌。食管癌可為胃食管結合部腺癌。  實例 實例L-2   4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]吡唑-1-基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-2之合成
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3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環-2-基)吡唑-1-基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯HxBzL-2a之合成
在0℃下向4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環-2-基)-1H-吡唑(1 g，5.15 mmol，1當量)於THF (15 mL)中之溶液中添加PPh 3(1.35 g，5.15 mmol，1當量)及DEAD (0.89 g，5.15 mmol，0.94 mL，1當量)且在25℃下攪拌0.5 h，然後添加3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-羥基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯(3.02 g，5.15 mmol，1當量)，且然後在25℃下攪拌16 h。將反應混合物用水20 mL稀釋且用EtOAc (50 mL * 3)萃取。將經合併之有機層用鹽水(20 mL * 3)洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物。藉由管柱層析(SiO 2，石油醚/乙酸乙酯＝50/1至乙酸乙酯:MeOH＝10:1)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之HxBzL-2a (3.5 g，4.59 mmol，89.04%產率)。  3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]吡唑-1-基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯HxBzL-2c之製備
將HxBzL-2a (625 mg，819 umol，2.5當量)、2-胺基-8-溴-N-乙氧基-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺HxBzL-2b (120 mg，328 umol，1當量)、Na 2CO 3(69.5 mg，655 umol，2當量)於水(0.3 mL)中之溶液及[1,1'-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯化鈀(II)Pd (dppf)Cl 2(23.9 mg，32.8 umol，0.1當量)於DMF (3 mL)中之混合物除氣，且然後在N 2下加熱至120℃達5 h。將混合物過濾且在減壓下濃縮，且藉由製備型HPLC (TFA條件；管柱：Phenomenex luna C18 250*50mm*10 um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：35%-65%，10 min)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之HxBzL-2c(300mg，290umol，88.4%產率，TFA)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]吡唑-1-基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-2d之製備
向HxBzL-2c (300 mg，325 umol，1當量)於水(3 mL)及MeCN (0.5 mL)中之溶液中添加HCl (12 M，407 uL，15當量)，且然後在80℃下攪拌0.5 h。在減壓下濃縮該混合物，得到呈無色油狀之化合物3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]吡唑-1-基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(200 mg，222 umol，68.1%產率，HCl)。 HxBzL-2之製備
向HxBzL-2d (80.0 mg，88.7 umol，1當量，HCl)及2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯磺酸鈉(119 mg，443 umol，5當量)於DCM( 1 mL)及DMA (1 mL)中之溶液中添加1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、EDCI (84.9 mg，443 umol，5當量)，且然後在25℃下攪拌0.5 h。將混合物過濾且在減壓下濃縮，藉由製備型HPLC (TFA條件；管柱：Phenomenex Synergi C18 150*25*10um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：25%-50%，8 min)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之HxBzL-2 (30 mg，24.8 umol，28.01%產率，TFA)。 1H NMR (400MHz, MeOD) δ 8.20 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.65-7.61 (m, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.55-7.52 (m, 1H), 7.40 (s, 1H), 4.36 (t, J ＝ 4.8 Hz, 2H), 3.96 (q, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.89-3.82 (m, 4H), 3.74 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.63-3.52 (m, 36H), 3.42 (s, 2H), 2.95 (t, J ＝ 5.6 Hz, 2H), 1.76 (sxt, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 1.20 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 0.99 (t, J ＝ 7.6 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 1094.4 (計算值)；LC/MS [M+H] 1094.3 (觀測值)。 實例L-4   4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[4-[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]哌嗪-1-基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-4之合成
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2-胺基-N-乙氧基-N-丙基-8-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環-2-基)-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺HxBz-4b之製備
將2-胺基-8-溴-N-乙氧基-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺HxBz-4a (0.5 g，1.37 mmol，1當量)、4,4,5,5-四甲基-2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環-2-基)-1,3,2-二氧雜硼戊環(520 mg，2.05 mmol，1.5當量)、Pd(dppf)Cl 2(99.9 mg，137 umol，0.1當量)、KOAc (335 mg，3.41 mmol，2.5當量)於二噁烷(10 mL)中之混合物在100℃下在N 2下攪拌1 h。粗製HxBz-4b無需純化即可用於下一步驟，獲得黑色液體(564 mg，1.36 mmol，99.96%產率)。 4-[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]哌嗪-1-羧酸三級丁酯HxBz-4之製備
將HxBz-4b (0.45 g，1.09 mmol，1當量)、Pd(dppf)Cl 2(39.8 mg，54.4 umol，0.05當量)、K 2CO 3(376 mg，2.72 mmol，2.5當量)、4-(5-溴嘧啶-2-基)哌嗪-1-羧酸三級丁酯(374 mg，1.09 mmol，1當量)於二噁烷(4 mL)及水(0.5 mL)中之混合物在N 2下在100℃下攪拌1 h。將混合物濃縮以去除二噁烷，將殘餘物用EtOAc (10 mL)及水(5 mL)稀釋。將有機層經Na 2SO 4乾燥，濃縮，得到殘餘物。藉由管柱層析(SiO 2，石油醚/乙酸乙酯＝1/0至0/1，然後EA:MeOH ＝ 1.5:1)純化殘餘物，然後藉由製備型HPLC(管柱：Phenomenex Synergi C18 150*25*10um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：30%-55%，8 min)進一步純化，得到呈棕色油狀之HxBz-4 (0.35 g，637 umol，58.5%產率)。 1H NMR (400MHz, MeOD) δ8.74 (s, 2H), 7.72-7.63 (m, 2H), 7.60 (d, J ＝ 1.6 Hz, 1H), 7.45 (s, 1H), 3.99 (q, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.93-3.88 (m, 4H), 3.77 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.60-3.51 (m, 4H), 3.43 (s, 2H), 1.80-1.75 (m, 2H), 1.51 (s, 9H), 1.22 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 1.02 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 550.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 550.2 (觀測值)。 2-胺基-N-乙氧基-8-(2-哌嗪-1-基嘧啶-5-基)-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺HxBz-3之製備
向HxBz-4 (20 mg，36.4 umol，1當量)於DCM (5 mL)中之混合物中添加HCl/EtOAc (4 M，5 mL，550當量)，且在25℃下攪拌0.5 h。將混合物濃縮，得到呈白色固體狀之HxBz-3 (10.5 mg，21.4 umol，58.9%產率，99.233%純度，HCl)。 1H NMR (400MHz, MeOD) δ8.70 (s, 2H), 7.65-7.47 (m, 3H), 7.32 (s, 1H), 4.14-3.96 (m, 4H), 3.86 (q, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.64 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.31 (s, 2H), 3.25-3.21 (m, 4H), 1.71-1.62 (m, 2H), 1.08(t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 0.89 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 450.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 450.1 (觀測值)。 3-[2-[2-[2-[ 2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[1-[3-[2-胺基-4-[3-(三級丁氧基羰基胺基)丙基-乙氧基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]苯基]磺醯基氮雜環丁烷-3-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-4a之製備
向HxBz-3 (110 mg，176 umol，1當量)於DMF (3 mL)中之混合物中添加DIEA (63.5 mg，491 umol，2.8當量)及3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-側氧基-3-(2,3,5,6-四氟苯氧基)丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(99.2 mg，140 umol，0.8當量)，且然後在25℃下攪拌0.5 h。藉由製備型HPLC(管柱：Waters Xbridge Prep OBD C18 150*40mm*10um；流動相：[水(10mM NH 4HCO 3)-ACN]；B%：20%-55%，8 min)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之HxBzL-4a (28 mg，24 umol，13.7%產率)。 HxBzL-4之製備
向HxBzL-4a (78 mg，78.8 umol，1當量)及2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯磺酸鈉(106 mg，394 umol，5當量)於DCM (3 mL)及DMA (0.3 mL)中之混合物中添加EDCI (75.5 mg，394 umol，5當量)，且然後將其在20℃下攪拌0.5 h。將混合物濃縮，得到殘餘物。藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Synergi C18 150*25*10um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：20%-40%，10 min)純化殘餘物，得到呈無色油狀之HxBzL-4 (39.8 mg，26.4 umol，33.5%產率，95.944%純度，2TFA)。 1H NMR (400MHz, MeOD) δ8.75 (s, 2H), 7.76-7.55 (m, 3H), 7.45 (s, 1H), 4.02-3.73 (m, 16H), 3.68-3.58 (m, 36H), 3.37 (s, 2H), 2.99 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 2.76 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 1.85-1.74 (m, 2H), 1.25-1.20 (m, 3H), 1.02 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 1218.5 (計算值)；LC/MS [M+H] 1218.3 (觀測值)。 實例L-5   4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-5之合成
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Figure 02_image318
5-溴-2-(溴甲基)嘧啶HxBz-5b之製備
在0℃下在N 2下向(5-溴嘧啶-2-基)甲醇HxBz-5a (300 mg，1.59 mmol，1.0當量)於THF (10 mL)中之溶液中一次性添加PPh 3(499 mg，1.90 mmol，1.2當量)及CBr 4(631 mg，1.90 mmol，1.2當量)。將混合物在20℃下攪拌10小時。添加水(10 mL)且將水相用乙酸乙酯(10 mL * 3)萃取，將經合併之有機相用鹽水(10 mL)洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且在真空中濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯＝1/0, 8/1)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之HxBz-5b (290 mg，1.15 mmol，72.4%產率)。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ8.81 (s, 2H), 4.59 (s, 2H)。 N-[(5-溴嘧啶-2-基)甲基]-N-三級丁氧基羰基-胺甲酸三級丁酯HxBz-5c之製備
在20℃下在N 2下向HxBz-5b (290 mg，1.15 mmol，1.0當量)及N-三級丁氧基羰基胺甲酸三級丁酯(250 mg，1.15 mmol，1.0當量)於DMF (3 mL)中之混合物中分批添加Cs 2CO 3(562 mg，1.73 mmol，1.5當量)，將混合物在20℃下攪拌2.5小時。添加水(5 mL)且將水相用乙酸乙酯(5 mL * 3)萃取，將經合併之有機相用鹽水(5 mL)洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且在真空中濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯＝ 1/0, 5/1)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之HxBz-5c (350 mg，901 umol，78.3%產率)。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ8.74 (s, 2H), 5.01 (s, 2H), 1.48 (s, 18H)。 N-[[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基]-N-三級丁氧基羰基胺甲酸三級丁酯HxBz-5d之製備
在N 2下向 HxBz-5c (184 mg，473 umol，1.0當量)及2-胺基-N-乙氧基-N-丙基-8-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環-2-基)-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺(195 mg，474 umol，1.0當量)於二噁烷(10 mL)及H 2O(2 mL)中之混合物中一次性添加Pd(dppf)Cl 2• CH 2Cl 2(19.3 mg，23.7 umol，0.05當量)及K 2CO 3(163 mg，1.18 mmol，2.5當量)，將混合物除氣且在N 2。在真空中去除二噁烷(10 mL)且添加水(20 mL)且將水相用乙酸乙酯(10 mL * 3)萃取，將經合併之有機相用鹽水(10 mL)洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且在真空中濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯＝10/1, 0/1至乙酸乙酯/甲醇＝10/1)純化殘餘物，得到呈灰色固體狀之HxBz-5d (280 mg，470.83 umol，99.35%產率)。 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ9.08 (s, 2H), 7.61 (s, 1H), 7.59 (d, J ＝ 2.8 Hz, 2H), 7.38 (s, 1H), 5.08 (s, 2H), 3.98 (q, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.76 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 1.83-1.75 (m, 2H), 1.47 (s, 18H), 1.20 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 1.02 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。 2-胺基-8-[2-(胺基甲基)嘧啶-5-基]-N-乙氧基-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺HxBz-5之製備
在20℃下在N 2下向HxBz-5d (20.0 mg，33.6 umol，1.0當量)於EtOAc (5 mL)中之溶液中一次性添加HCl/EtOAc (4 M，8.41 uL，1.0當量)，將混合物在20℃下攪拌1小時。將反應混合物在真空中濃縮。藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Synergi C18 150*25*10um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：1%-30%，8min)純化殘餘物，得到呈淺黃色固體狀之HxBz-5 (6.2 mg，9.84 umol，29.2%產率，98.8%純度，2TFA)。 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ9.22 (s, 2H), 7.82 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 7.79-7.75 (m, 2H), 7.47 (s, 1H), 4.49 (s, 2H), 4.00 (q, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.78 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.46 (s, 2H), 1.85-1.77 (m, 2H), 1.22 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 1.03 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 395.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 395.1 (觀測值)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-5a之製備
在25℃下在N 2下向 HxBz-5 (70 mg，149 umol，1.0當量，2HCl)及3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-側氧基-3-(2,3,5,6-四氟苯氧基)丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(127 mg，179 umol，1.2當量)於DMF (0.5 mL)中之混合物中一次性添加DIEA (77.4 mg，599 umol，104 uL，4.0當量)，然後將混合物在25℃下攪拌0.5小時。過濾反應混合物且藉由製備型HPLC(管柱：Phenomenex luna C18 80*40mm*3 um；流動相：[水(0.04%HCl)-ACN]；B%：12%-39%，5.5 min)純化濾液，得到呈黃色油狀之HxBzL-5a (50.0 mg，53.4 umol，35.7% 產率)。 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ9.14 (s, 2H), 7.86-7.81 (m, 1H), 7.78-7.74 (m, 2H), 7.48 (s, 1H), 4.72 (s, 2H), 4.00 (q, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.85-3.71 (m, 8H), 3.69-3.58 (m, 38H), 3.47 (s, 2H), 2.62 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 2.55 (t, J ＝ 6.4 Hz, 2H), 1.85-1.76 (m, 2H), 1.23 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 1.03 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。 HxBzL-5之製備
在25℃下在N 2下向HxBzL-5a (60 mg，61.7 umol，1.0當量，HCl)及(2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯基)磺醯氧基鈉(99.3 mg，370 umol，6.0當量)於DCM (2 mL)及DMA(0.5 mL)中之混合物中一次性添加EDCI (71.0 mg，370 umol，6.0當量)，將混合物在25℃下攪拌1小時。將反應混合物過濾且藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Synergi C18 150*25*10um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：20%-45%，8min)純化濾液，得到呈黃色油狀之HxBzL-5 (38.0 mg，30.5 umol，49.3%產率，93.3%純度)。 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ9.11 (s, 2H), 7.83-7.79 (m, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.76-7.71 (m, 1H), 7.47 (s, 1H), 4.71 (s, 2H), 4.00 (q, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.88 (t, J ＝ 5.6 Hz, 2H), 3.85-3.75 (m, 5H), 3.70-3.57 (m, 38H), 3.47 (s, 2H), 2.99 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 2.62 (t, J ＝ 4 Hz, 2H), 1.85-1.75 (m, 2H), 1.23 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 1.02 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 1163.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 1163.3 (觀測值)。 實例L-7   4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[1-[[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]-3-吡啶基]磺醯基]氮雜環丁烷-3-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-7之合成
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((1-((5-溴吡啶-3-基) 磺醯基)氮雜環丁烷-3-基)甲基)胺甲酸三級丁酯HxBz-7b之製備
在25℃下在N 2下向N-(氮雜環丁烷-3-基甲基)胺甲酸三級丁酯(762 mg，4.09 mmol，1.05當量)及5-溴吡啶-3-磺醯基氯HxBz-7a (1 g，3.90 mmol，2.26 mL，1當量)於DCM (20 mL)中之混合物中添加Et 3N (789 mg，7.80 mmol，1.09 mL，2當量)，且然後在25℃下攪拌1小時。向混合物中添加H 2O (20 mL)，然後在真空中濃縮，以去除DCM。所需固體自混合物中沉澱，過濾，得到呈白色固體狀之所需產物HxBz-7b (1.1 g，2.71 mmol，69.45%產率)。 1H NMR (DMSO-d 6, 400MHz) δ9.09 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 8.93 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 8.40 (t, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 6.90 (t, J ＝ 6.0 Hz, 1H), 3.80 (t, J ＝ 8.4 Hz, 2H), 3.52 (dd, J ＝ 6.0, 8.0 Hz, 2H), 2.93 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 2.56-2.52 (m, 1H), 1.34 (s, 9H)。 ((1-((5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環-2-基) 吡啶-3-基)磺醯基)氮雜環丁烷-3-基)甲基)胺甲酸三級丁酯HxBz-7c之製備
在25℃下在N 2下向HxBz-7b (0.75 g，1.85 mmol，1當量)、4,4,5,5-四甲基-2-(4,4,5,5-四甲基 -1,3,2-二氧雜硼戊環-2-基)-1,3,2-二氧雜硼戊環、Pin 2B 2、雙(頻哪醇)二硼(CAS登記號78183-34-3) (703 mg，2.77 mmol，1.5當量)、KOAc (362 mg，3.69 mmol，2當量)於二噁烷(15 mL)中之混合物中添加Pd(dppf)Cl 2(67.5 mg，92.3 umol，0.05當量)，且然後在100℃下攪拌1小時。將混合物過濾且真空濃縮。得到呈黃色油狀之HxBz-7c (0.85 g，粗製物)。 ((1-((5-(2-胺基-4-(乙氧基(丙基)胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基)吡啶-3-基)磺醯基)氮雜環丁烷-3-基)甲基)胺甲酸三級丁酯HxBz-7d之製備
在25℃下在N 2下向HxBz-7c (0.85 g，1.87 mmol，1當量)及2-胺基-8-溴-N-乙氧基-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺HxBzL-2b (755 mg，2.06 mmol，1.1當量)於二噁烷(15 mL)中之混合物中添加H 2O (3 mL)中之K 2CO 3(518 mg，3.75 mmol，2當量)及Pd(dppf)Cl 2(68.6 mg，93.7 umol，0.05當量)，且將其在100℃下攪拌1小時。將混合物倒入到H 2O (50 mL)中。將水相用乙酸乙酯(150 mL*3)萃取。將經合併之有機相用鹽水(100 mL)洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯＝5/1, 0/1至EtOAc/MeOH＝10/1)純化殘餘物。得到呈灰白色固體狀之HxBz-7d (1 g，1.63 mmol，87.05%產率)。 1H NMR (DMSO-d 6, 400MHz) δ9.18 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 8.95 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 8.42 (t, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 7.55-7.51 (m, 2H), 7.49-7.45 (m, 1H), 7.30 (s, 1H), 3.96 (q, J ＝ 7.6 Hz 2H), 3.90 (t, J ＝ 8.0 Hz, 2H), 3.74 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.60 (dd, J ＝ 6.0, 8.0 Hz, 2H), 3.35 (s, 2H),3.06 (d, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 2.69-2.58 (m, 1H), 1.77 (sxt, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 1.36 (s, 9H), 1.17 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 0.99 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。 2-胺基-8-[5-[3-(胺基甲基)氮雜環丁烷-1-基]磺醯基-3-吡啶基]-N-乙氧基-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺HxBz-7之製備
在25℃下在N 2下向HxBz-7d (0.8 g，1.31 mmol，1當量)於CH 3CN (10 mL)及H 2O (10 mL)中之混合物中添加TFA (1.49 g，13.1 mmol，967 uL，10當量)，且然後在80℃下攪拌1小時。真空濃縮該混合物以去除CH 3CN，將水相用MTBE (20*3)萃取，丟棄，然後直接將水相冷凍乾燥，得到呈灰白色固體狀之HxBz-7 (0.9 g，1.22 mmol，93.07%產率，2TFA)。 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ9.24 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 9.04 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 8.50 (t, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 7.87-7.78 (m, 2H), 7.77-7.72 (m, 1H), 7.46 (s, 1H), 4.06-3.94 (m, 4H), 3.79-3.70 (m, 4H), 3.45 (s, 2H), 3.12 (d, J ＝ 7.6 Hz, 2H), 2.83-2.73 (m, 1H), 1.79 (sxt, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 1.20 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 1.01 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 513.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 513.2 (觀測值)。 1-(1-((5-(2-胺基-4-(乙氧基(丙基)胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基)吡啶-3-基)磺醯基)氮雜環丁烷-3-基)-3-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十氧雜-2-氮雜三十六-36-烷酸HxBzL-7a之製備
在0℃下在N 2下向HxBz-7 (451 mg，638 umol，1當量)於THF (10 mL)中之混合物中添加Et 3N (161 mg，1.60 mmol，222 uL，2.5當量)，且然後在0℃下攪拌1小時。將混合物倒入到H 2O (5 mL)中，在0℃下將混合物之pH用TFA調節至pH約6，然後用MTBE(10 mL)萃取，丟棄，將水相用DCM/i-PrOH(20 mL*3)進一步萃取。將經合併之有機相經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且真空濃縮，得到呈淡黃色油狀之HxBzL-7a (0.6 g，569.68 umol，89.25%產率)。 HxBzL-7之製備
在25℃下在N 2下向HxBzL-7a (0.6 g，570 umol，1當量)及(2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯基)磺醯基氧基鈉(611 mg，2.28 mmol，4當量)於DCM (10 mL)及DMA (1.5 mL)中之混合物中添加EDCI (437 mg，2.28 mmol，4當量)，且然後在25℃下攪拌0.5小時。在真空中濃縮混合物。將殘餘物過濾且藉由製備型HPLC(管柱：Phenomenex luna C18 250*50mm*10 um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：30%-50%,10min)純化，得到呈白色固體狀之HxBzL-7 (370 mg，288.76 umol，50.69%產率)。 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ9.24 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 9.03 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 8.51 (t, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 7.91-7.84 (m, 2H), 7.74 (d, J ＝ 8.8 Hz, 1H), 7.47 (s, 1H), 4.03-3.91 (m, 4H), 3.86 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 3.76 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.66-3.49 (m, 40H), 3.47 (s, 2H), 3.21 (d, J ＝ 6.4 Hz, 2H), 3.01-2.92 (m, 2H), 2.79-2.68 (m, 1H), 2.29 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 1.78 (sxt, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 1.21 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 1.01 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 1281.5 (計算值)；LC/MS [M+H] 1281.6 (觀測值)。 實例L-12 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[2-(環丁氧基-羰基胺基)乙氧基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-12之合成
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Figure 02_image330
Figure 02_image332
N-[2-[[2-胺基-8-[2-[(三級丁氧基羰基胺基)甲基] 嘧啶-5-基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]氧基乙基]胺甲酸環丁酯HxBz-15b之製備
在25℃下在N 2下向2-胺基-8-[2-[(三級丁氧基羰基胺基)甲基]嘧啶-5-基]-3H-1-苯并氮呯-4-羧酸HxBz-15a (250 mg，611 umol，1.0當量)及N-[2-(丙基胺基-氧基)乙基]胺甲酸環丁酯(201 mg，794 umol，1.3當量，HCl)於DCM (4 mL)及DMA (2 mL)中之混合物中一次性添加EDCI (468 mg，2.44 mmol，4.0當量)，且將其在25℃下攪拌2小時。在真空中去除 DCM (4 mL)，添加水(10 mL)且將水相用乙酸乙酯(10 mL * 3)萃取，將經合併之有機相用鹽水(5 mL*2)洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且在真空中濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯＝10/1, 0/1至乙酸乙酯/甲醇＝10/1)純化殘餘物，得到呈棕色油狀之HxBz-15b (190 mg，313 umol，51.2%產率)。 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ9.08 (s, 2H), 7.63 (d, J ＝ 8.0 Hz, 1H), 7.58-7.52 (m, 2H), 7.37 (s, 1H), 4.74-4.67 (m, 2H), 4.54 (s, 2H), 3.96 (t, J ＝ 4.8 Hz, 2H), 3.76 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.33 (s, 2H), 2.20 (dd, J ＝ 2.8, 5.2 Hz, 2H), 1.94-1.86 (m, 2H), 1.82-1.75 (m, 2H), 1.50 (s, 9H), 1.38 (d, J ＝ 1.6 Hz, 2H), 1.01 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。 N-[2-[[2-胺基-8-[2-(胺基甲基)嘧啶-5-基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]氧基乙基]胺甲酸環丁酯HxBz-15之製備
在25℃下在N 2下向HxBz-15b (190 mg，313 umol，1.0當量)於DCM (5 mL)中之溶液中一次性添加CF 3COOH (535 mg，4.69 mmol，347 uL，15當量)，且然後在25℃下攪拌1.5小時。在真空中去除DCM (5 mL)並將殘餘物用水(10 mL)稀釋，將水相用MTBE (5 mL*4)萃取，以去除過量TFA，然後將水相冷凍乾燥，得到呈棕色固體之HxBz-15 (130 mg，169 umol，54.1%產率，95.7%純度，2TFA)。 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ ＝ 9.21 (s, 2H), 7.85-7.76 (m, 3H), 7.49 (s, 1H), 4.66 (t, J ＝ 7.2 Hz, 1H), 4.48 (s, 2H), 3.96 (t, J ＝ 5.2 Hz, 2H), 3.76 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.43 (s, 2H), 3.31 (s, 2H), 2.20-2.10 (m, 2H), 1.91-1.83 (m, 2H), 1.81-1.74 (m, 2H), 1.70-1.60 (m, 1H), 1.57-1.47 (m, 1H), 1.00 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 508.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 508.1 (觀測值)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[2-(環丁氧基羰基 胺基)乙氧基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-12a之製備
在0℃下在N 2下向 HxBz-15 (105 mg，181 umol，1.0當量，2HCl)及Et 3N (73.2 mg，723 umol，100 uL，4.0當量)於DMF (1.5 mL)中之混合物中添加3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-側氧基-3-(2,3,4,5,6-五氟苯氧基)丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸PFP-PEG10-CO2H (131 mg，181 umol，1.0當量)，且將其在0℃下攪拌0.5小時，並且然後在25℃下加熱另外0.5小時。將反應混合物濃縮，將殘餘物用水(5 mL)稀釋並將水相用乙酸乙酯(3 mL*2)萃取，丟棄，然後將水相用DCM/iPrOH＝3/1 (5 mL*3)進一步萃取，將經合併之有機相經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且在真空中濃縮，得到呈黃色油狀之HxBzL-12a (100 mg，95.4 umol，52.7%產率)。 HxBzL-12之製備
在25℃下在N 2下向 HxBzL-12a (100 mg，95.4 umol，1.0當量)及(2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯基)磺醯基氧基鈉(128 mg，477 umol，5.0當量)於DCM (1 mL)及DMA (0.5 mL)中之混合物中一次性添加EDCI (91.4 mg，477 umol，5.0當量)，且然後在25℃下攪拌1小時。將反應混合物過濾且藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Synergi C18 150*25*10um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：15%-35%，8min)純化濾液，得到呈淡黃色油狀之HxBzL-12 (35.1 mg，25.6 umol，26.9%產率，93.3%純度)。 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ9.12 (s, 2H), 7.84-7.77 (m, 3H), 7.52 (s, 1H), 4.75-4.67 (m, 3H), 3.99 (t, J ＝ 5.2 Hz, 2H), 3.88 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 3.82 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 3.78 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.70-3.57 (m, 38H), 3.45 (s, 2H), 3.01-2.97 (m, 2H), 2.62 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 2.24-2.14 (m, 2H), 1.96-1.86 (m, 2H), 1.84-1.75 (m, 2H), 1.73-1.61 (m, 1H), 1.59-1.49 (m, 1H), 1.01 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 1276.5 (計算值)；LC/MS [M+H] 1276.6 (觀測值)。 實例L-13 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[2-(環丁基胺甲醯基胺基)乙氧基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-13之合成
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((5-(2-胺基-4-((2-(3-環丁基脲基)乙氧基)(丙基) 胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基)嘧啶-2-基)甲基)胺甲酸三級丁酯HxBz-16a之製備
向2-胺基-8-[2-[(三級丁氧基羰基胺基)甲基]嘧啶-5-基]-3H-1-苯并氮呯-4-羧酸HxBz-15a (250 mg，611 umol，1當量)、1-環丁基-3-[2-(丙基胺基氧基)乙基]脲(231 mg，916 umol，1.5當量，HCl)於DCM (2 mL)及DMA (2 mL) 中之溶液中添加EDCI (351 mg，1.83 mmol，3當量)，且將其在25℃下攪拌0.5 h。將反應混合物在減壓下濃縮以去除DCM。將殘餘物用水(10 mL)稀釋且用EtOAc (20 mL * 3)萃取。將經合併之有機層用鹽水(20 mL * 2)洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物。藉由管柱層析(SiO 2, 石油醚/乙酸乙酯＝50/1至乙酸乙酯: MeOH ＝ 5:1)純化殘餘物，得到呈棕色固體狀之HxBz-16a (230 mg，380 umol，62.1%產率)。 2-胺基-8-[2-(胺基甲基)嘧啶-5-基]-N-[2-(環丁基胺甲醯基胺基)乙氧基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺HxBz-16之製備
向HxBz-16a (230 mg，0.38 mmol，1當量)於水(2 mL)及MeCN (2 mL)中之溶液中添加TFA (432 mg，3.79 mmol，0.28 mL，10當量)，且然後在80℃下攪拌0.5 h。在減壓下濃縮混合物，將殘餘物用水(2 mL)稀釋且用MTBE (3mL * 3)萃取，丟棄，在減壓下濃縮水相，得到呈棕色固體狀之HxBz-16 (230 mg，371 umol，97.8%產率，TFA)。 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 9.21 (s, 2H), 7.84-7.73 (m, 3H), 7.47 (s, 1H), 4.48 (s, 2H), 4.01-3.89 (m, 3H), 3.75 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.44 (s, 2H), 3.33 (br s, 2H), 2.19-2.10 (m, 2H), 1.81-1.68 (m, 4H), 1.64-1.55 (m, 2H), 1.00 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 507.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 507.2 (觀測值)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[2-(環丁基胺甲醯基胺基)乙氧基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-13a之製備
向HxBz-16 (100 mg，136 umol，1當量, 2TFA)及3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-側氧基-3-(2,3,5,6-四氟苯氧基)丙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(96.2 mg，0.14 mmol，1當量)於THF (1 mL)中之溶液中添加Et 3N (41.3 mg，0.41 mmol，56.8 uL，3當量)，且然後在25℃下攪拌0.5 h。在0℃下將混合物之pH用TFA調節至約6，用EtOAc (5 mL三次)萃取，丟棄，且將水相用DCM/i-PrOH (10 mL * 3，3/1)萃取。將有機層經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。獲得呈黃色油狀之粗產物HxBzL-13a (120 mg，115 umol，84.2%產率)且其無需進一步純化即用於下一步驟中。 HxBzL-13之製備
向HxBzL-13a (70 mg，66.9 umol，1當量)及2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯磺酸鈉(71.7 mg，267 umol，4當量)於DMA (0.5 mL)及DCM (1.5 mL)中之溶液中添加EDCI (51.3 mg，267 umol，4當量)，且將其在25℃下攪拌0.5 h。過濾混合物且在減壓下濃縮。藉由製備型HPLC (TFA條件；管柱：Phenomenex Synergi C18 150*25*10um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：15%-35%,8min)純化殘餘物。然後藉由製備型HPLC (TFA條件；管柱：Phenomenex Synergi C18 150*25*10um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：15%-35%,8min)純化殘餘物，得到呈無色油狀之HxBzL-13 (20 mg，13.3 umol，19.9%產率，2TFA)。 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 9.09 (s, 2H), 7.80-7.71 (m, 3H), 7.47 (s, 1H), 4.69 (s, 2H), 3.95 (br t, J ＝ 5.2 Hz, 2H), 3.86 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 3.80 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 3.75 (br t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.68-3.57 (m, 38H), 3.45 (s, 2H), 2.97 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 2.60 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 2.15 (br d, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 1.83-1.68 (m, 4H), 1.64-1.52 (m, 2H), 0.99 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 1275.5 (計算值)；LC/MS [M+H] 1275.2 (觀測值)。 實例L-14 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[3-(環丁氧基羰基胺基)丙基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-14之合成
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環丁基 N-[3-[[2-胺基-8-[2-[(三級丁氧基羰基胺基)甲基] 嘧啶-5-基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]HxBz-14之製備
在0℃下向2-胺基-8-[2-[(三級丁氧基羰基胺基)甲基]嘧啶-5-基]-3H-1-苯并氮呯-4-羧酸HxBz-14a (0.25 g，611 umol，1.0當量)於DMF (4 mL)中之混合物中一次性添加Et 3N (185 mg，1.83 mmol，255 uL，3.0當量)、N-[3-(丙基胺基)丙基]胺甲酸環丁酯(170 mg，678 umol，1.11當量，HCl)及六氟磷酸酯氮雜苯并三唑四甲基脲鎓HATU (232 mg，611 umol，1.0當量)，且將其在0℃下攪拌0.5 h。然後將該混合物用水稀釋且用EtOAc (20 mL x 3)萃取。將有機層用鹽水洗滌，經由Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯＝1/0, 3/1)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之HxBz-14 (0.28 g，462 umol，75.71%產率)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ9.04 (s, 2H), 7.52 (d, J ＝ 8.4 Hz, 1H), 7.48 (d, J ＝ 1.6 Hz, 1H), 7.45-7.40 (m, 1H), 6.93 (s, 1H), 4.84-4.84 (m, 1H), 4.64 (s, 4H), 3.54-3.47 (m, 2H), 3.46-3.39 (m, 2H), 3.30 (m, 2H), 3.22-3.07 (m, 2H), 2.32-2.28 (m, 2H), 2.10-2.00 (m, 2H), 1.88-1.79 (m, 3H), 1.75-1.60 (m, 3H), 1.48 (s, 9H), 0.90 (s, 3H)。LC/MS [M+H] 606.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 606.2 (觀測值)。 N-[3-[[2-胺基-8-[2-(胺基甲基)嘧啶-5-基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]胺甲酸環丁酯HxBz-13之製備
在25℃下向HxBz-14 (0.26 g，429 umol，1.0當量)於CH 3CN (3 mL)及H 2O (1 mL)中之混合物中一次性添加TFA (489 mg，4.29 mmol，318 uL，10 .0當量)，且然後在80℃下攪拌0.5 h。然後將混合物濃縮且將殘餘物用水(10 mL)稀釋且將混合物用MTBE(10 mL x 2)萃取，以去除過量TFA。將水層冷凍乾燥，得到呈黃色固體之HxBz-13 (0.2 g，323 umol，75.20%產率，TFA)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ9.21 (s, 2H), 7.84-7.71 (m, 3H), 7.12 (s, 1H), 4.85-4.85 (m, 1H), 4.47 (s, 2H), 3.54 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.48 (s, 2H), 3.37 (s, 2H), 3.15 (d, J ＝ 15.6 Hz, 2H), 2.30-2.25 (m, 2H), 2.08-2.00 (m, 2H), 1.89-1.66 (m, 6H), 1.01-0.88 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 506.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 506.2 (觀測值)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[3-(環丁氧基羰基胺基)丙基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-14a之製備
在0℃下向HxBz-13 (0.1 g，161 umol，1.0當量，TFA)於THF (3 mL)中之混合物中一次性添加Et 3N (48.9 mg，484 umol，67.4 uL，3.0當量)及3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-側氧基-3-(2,3,5,6-四氟苯氧基)丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸TFP-PEG10-CO2H (114 mg，161 umol，1.0當量)，且然後在0℃下攪拌0.5 h。在0℃下將混合物之pH用TFA調節至5-6。然後將混合物用水(5 mL)稀釋且用MTBE (10 mL x 3)洗滌。然後將水層用DCM:i-PrOH＝3:1(20 mL x 3)進一步萃取。將有機層經Na 2SO4乾燥，過濾且濃縮，得到呈黃色油狀之HxBzL-14a (0.15 g，129 umol，80.11%產率，TFA)。 HxBzL-14之製備
在25℃下向 HxBzL-14a (0.15 g，129 umol，1.0當量，TFA)於DCM (3 mL)及DMA (0.5 mL)中之混合物中一次性添加2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯磺酸鈉(139 mg，517 umol，4.0當量) 及EDCI (149 mg，776 umol，6.0當量) ，且然後在25℃下攪拌0.5 h。將混合物濃縮且過濾。然後藉由製備型HPLC(管柱：Phenomenex Synergi C18 150*25*10um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：15%-40%,8min)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之HxBzL-14 (75.3 mg，59.1 umol，45.71%產率)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ9.09 (s, 2H), 7.82-7.67 (m, 3H), 7.11 (s, 1H), 4.86-4.82 (m, 1H), 4.69 (s, 2H), 3.86 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 3.80 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 3.66-3.48 (m, 40H), 3.38 (s, 2H), 3.22-3.06 (m, 2H), 2.97 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 2.64-2.58(m, 2H), 2.32-2.25 (m, 2H), 2.09-1.95 (m, 2H), 1.91-1.80 (m, 3H), 1.75-1.61 (m, 3H), 0.93 (s, 3H)。LC/MS [M+H] 1274.5 (計算值)；LC/MS [M+H] 1274.3 (觀測值)。 實例L-15 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-羰基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-15之合成
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2-胺基-8-溴-N-乙氧基-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺HxBz-11b之製備
在25℃下在N 2下向N-乙氧基丙-1-胺(9.6 g，68.8 mmol，1.3當量，HCl)及2-胺基-8-溴-3H-1-苯并氮呯-4-羧酸HxBz-11a (14.8 g，52.9 mmol，1.0當量)於DMA (150 mL)及DCM (150 mL)中之混合物中添加EDCI (40.6 g，211 mmol，4.0當量)。將混合物在25℃下攪拌2小時。將混合物之pH用NaHCO 3調節至約9且在減壓下濃縮，以在45℃下去除DCM。將水相用乙酸乙酯(100 mL x 3)萃取。將經合併之有機相用鹽水(1000 mL x 2)洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且真空濃縮。在25℃下將殘餘物用MTBE/PE＝1/1研磨，得到呈白色固體狀之HxBz-11b (12.5 g，34.1 mmol，64.5%產率)。 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ7.31 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 7.26-7.22 (m, 1H), 7.18 (s, 1H), 7.17-7.14 (m, 1H), 3.92 (q, J ＝ 6.8 Hz, 2H), 3.71 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.31 (s, 2H), 1.79-1.70 (m, 2H), 1.15 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 0.97 (t, J ＝ 7.6 Hz, 3H)。 2-胺基-N-乙氧基-N-丙基-8-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環 -2-基)-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺HxBz-11c之製備
將HxBz-11b (500 mg，1.37 mmol，1.0當量)、Pin 2B 2(416 mg，1.64 mmol，1.2當量)、KOAc (335 mg，3.41 mmol，2.5當量)及Pd(dppf)Cl 2(99.9 mg，136 umol，0.1當量)於二噁烷(10 mL)中之混合物除氣且用N 2吹掃3次，且然後在N 2氣氛下將混合物在95℃下攪拌1 h。在真空中濃縮混合物。將殘餘物倒入到冰水(w/w ＝ 1/1) (10 mL)中且攪拌5 min。將水相用MTBE (10 mL x 1)萃取，然後將水相用DCM/i-PrOH＝3/1 (10 mL x 3)進一步萃取。將經合併之有機相(DCM/i-PrOH)用無水Na 2SO 4乾燥，過濾且在真空中濃縮，得到呈黑色固體狀之HxBz-11c (490 mg，粗製物)，其無需進一步純化即用於下一步驟中。 5-(2-胺基-4-(乙氧基(丙基)胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基)嘧啶-2-羧酸甲酯HxBz-11之製備
將HxBz-11c (390 mg，944 umol，1.0當量)、5-溴嘧啶-2-羧酸甲酯(266 mg，1.23 mmol，1.3當量)、Pd(dppf)Cl 2(69.0 mg，94.3 umol，0.1當量)、K 3PO 4(401 mg，1.89 mmol，2.0當量)於二噁烷(15 mL)及H 2O (2 mL)之混合物除氣且用N 2吹掃3次，且然後在80℃下在N 2氣氛下攪拌1 h。將混合物過濾且將濾液在真空中濃縮。藉由製備型HPLC(管柱：Phenomenex Synergi C18 150*25*10um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：5%-30%,8 min)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之HxBz-11 (105 mg，161 umol，17.1%產率，TFA)。 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ9.30 (s, 2H), 7.89 (dd, J ＝ 2.0, 2.0 Hz, 1H), 7.83-7.74 (m, 2H), 7.47 (s, 1H), 4.06 (s, 3H), 4.00 (t, J ＝ 6.8 Hz, 2H), 3.76 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.45 (s, 2H), 1.83-1.74 (m, 2H), 1.21 (t, J ＝ 6.8 Hz, 3H), 1.01 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 424.1 (計算值)；LC/MS [M+H] 424.1 (觀測值)。 5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-羧酸HxBzL-15a之製備
向HxBz-11 (330 mg，779 umol，1.0當量)於EtOH (5 mL)及H 2O (0.5 mL)中之溶液中添加LiOH.H 2O (131 mg，3.12 mmol，4.0當量)。將混合物在25℃下攪拌2 h。將混合物之pH用HCl(4M)調節至約6且在真空中濃縮，去除EtOH。將殘餘物用水(10 mL)稀釋。將水相用DCM/i-PrOH＝3/1 (10 mL x 3)萃取。將經合併之有機相經無水Na 2SO 4乾燥，過去且在真空中濃縮，得到呈黃色固體狀之HxBzL-15a (200 mg，488 umol，62.7%產率)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[1-[[5-[2-胺基-4-[3-(3,3-二甲基丁醯基胺基)丙基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]-3-吡啶基]磺醯基]氮雜環丁烷-3-基]甲基-甲基-胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯HxBzL-15b之製備
在0℃下向HxBzL-15a (195 mg，332 umol，0.8當量)及3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯tBuOOC-PEG 10-NH 2(390 mg，666 umol，1.0當量)於DMF (5 mL)中之混合物中添加Et 3N (126 mg，1.25 mmol，173 uL，3.0當量)及HATU (158 mg，415 umol，1.0當量)。將混合物在0℃下攪拌1 h。藉由製備型HPLC(管柱：Phenomenex luna C18 80*40mm*3 um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：25%-50%,7min)純化混合物，得到呈黃色油狀之HxBzL-15b (80 mg，66.4 umol，16.0%產率，TFA)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基) 胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-羰基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-15c之製備
向HxBzL-15b (80 mg，66.4 umol，1.0當量，TFA)於MeCN (2 mL)及H2O (1 mL)中之溶液中添加HCl (12 M, 83.0 uL，15.0當量)，且將其在80℃下攪拌1 h。將混合物在真空中濃縮，以得到殘餘物，將殘餘物冷凍乾燥，得到呈無色油狀之 HxBzL-15c (60 mg，62.7 umol，94.4%產率，HCl)。 HxBzL-15之製備
向HxBzL-15c (60 mg，60.4 umol，1.0當量，2HCl)及(2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯基)磺醯基氧基鈉(64.7 mg，241 umol，4.0當量)於DCM (2 mL)及DMA (0.5 mL)中之溶液中添加EDCI (46.3 mg，241 umol，4.0當量)，且然後在25℃下攪拌1 h。將混合物在真空中濃縮且過濾。藉由製備型HPLC(管柱：Phenomenex Synergi C18 150*25*10um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：15%-35%,8min)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之HxBzL-15 (36 mg，31.3 umol，51.9%產率)。 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ9.27 (s, 2H), 7.90-7.81 (m, 2H), 7.75 (d, J ＝ 8.4 Hz, 1H), 7.46 (s, 1H), 3.98 (q, J ＝ 6.8 Hz, 2H), 3.85 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 3.78-3.75 (m, 2H), 3.73-3.72 (m, 2H), 3.70-3.56 (m, 36H), 3.46 (s, 2H), 2.96 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 1.84-1.71 (m, 2H), 1.21 (t, J ＝ 6.8 Hz, 3H), 1.00 (t, J ＝ 7.6 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 1149.4 (計算值)；LC/MS [M+H] 1149.5 (觀測值)。 實例L-16 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-1-[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-羰基]吡咯啶-2-羰基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-16之合成
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Figure 02_image356
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(2S)-1-(5-溴嘧啶-2-羰基)吡咯啶-2-羧酸甲酯HxBzL-16b之製備
在0℃下在N 2下向5-溴嘧啶-2-羧酸HxBzL-16a (400 mg，1.97 mmol，1.0當量)、Et 3N (598 mg，5.91 mmol，822 uL，3.0當量)及(2S)-吡咯啶-2-羧酸甲酯(342 mg，2.07 mmol，1.05當量，HCl)於DMF (8 mL) 中之混合物中一次性添加HATU (749 mg，1.97 mmol，1.0當量)，且然後在0℃下攪拌30 min，然後加熱至25℃且攪拌另外0.5小時。添加水(20 mL)且將水相用乙酸乙酯(20 mL * 4)萃取，將經合併之有機相用鹽水(10 mL*1)洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且在真空中濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯＝10/1, 4/1)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之HxBzL-16b (320 mg，1.02 mmol，51.7%產率)。  (2S)-1-(5-溴嘧啶-2-羰基)吡咯啶-2-羧酸HxBzL-16c之製備
在25℃下在N 2下向HxBzL-16b (320 mg，1.02 mmol，1.0當量)於MeOH (5 mL)及H 2O (5 mL)中之溶液中一次性添加LiOH • H 2O (171 mg，4.07 mmol，4.0當量)，且將其在25℃下攪拌2小時。將反應混合物用HCl (4 M)萃取，直到pH＝7，在真空中去除MeOH (5 mL)，使所需固體自水相沉澱，將其過濾且乾燥，得到呈淡黃色固體狀之HxBzL-16c (300 mg，粗製物)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-1-(5-溴嘧啶-2-羰基)吡咯啶-2-羰基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯HxBzL-16d之製備
在0℃下在N 2下向 HxBzL-16c (200 mg，666 umol，1.0當量)、Et 3N (168 mg，1.67 mmol，232 uL，2.5當量)及3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯(390 mg，666 umol，1.0當量)於DMF (1 mL)中之混合物中一次性添加HATU (253 mg，666 umol，1.0當量)，且將其在0℃下攪拌30 min，然後加熱至25℃並攪拌另外0.5小時。將反應混合物過濾且藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex luna C18 250*50mm*10 um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：20%-60%，10 min)純化濾液，得到呈無色油狀之HxBzL-16d (300 mg，346 umol，51.8%產率)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-1-(5-溴嘧啶-2-羰基) 吡咯啶-2-羰基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-16e之製備
在25℃下在N 2下向 HxBzL-16d (300 mg，345 umol，1.0當量)於MeCN (1 mL)及H 2O (3 mL)中之溶液中一次性添加HCl (12 M, 864 uL，30當量)，且然後在80℃下攪拌1小時。將反應混合物在真空中濃縮，得到呈黃色油狀之HxBzL-16e (250 mg，307.99 umol，89.09%產率)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-1-[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-羰基]吡咯啶-2-羰基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-16f之製備
將HxBzL-16e (150 mg，185 umol，1.0當量)、2-胺基-N-乙氧基-N-丙基-8-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環-2-基)-3H-1 -苯并氮呯-4-甲醯胺 (91.6 mg，222 umol，1.2當量)、Pd(dppf)Cl 2(13.5 mg，18.5 umol，0.1當量)及K 2CO 3(63.8 mg，462 umol，2.5當量)於二噁烷(3 mL)及H 2O (0.3 mL)中之溶液除氣且然後在N 2下加熱至95℃達2小時。將反應混合物過濾且在真空中濃縮濾液，藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex luna C18 80*40mm*3 um；流動相：[水(0.04%HCl)-ACN]；B%：5%-45%,7min)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之HxBzL-16f (110 mg，108 umol，58.4%產率)。 HxBzL-16之製備
在25℃下在N 2下向 HxBzL-16f (110 mg，108 umol，1.0當量)及(2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯基)磺醯基氧基鈉(145 mg，540 umol，5.0當量)於DCM (2 mL)及DMA (0.5 mL) 中之混合物中一次性添加EDCI (103 mg，540 umol，5.0當量)，且將其在25℃下攪拌1小時。將反應混合物過濾且藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Synergi C18 150*25*10um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：10%-40%,8min)純化濾液，得到呈淡黃色油狀之HxBzL-16 (66.5 mg，50.9 umol，47.1%產率，95.3%純度)。 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ9.28-9.24 (m, 2H), 7.91-7.81 (m, 2H), 7.80-7.74 (m, 1H), 7.50-7.47 (m, 1H), 4.00 (q, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.88 (dt, J ＝ 3.2, 5.6 Hz, 4H), 3.81-3.74 (m, 4H), 3.70-3.53 (m, 37H), 3.50-3.32 (m, 5H), 3.02-2.96 (m, 2H), 2.16-1.97 (m, 4H), 1.84-1.76 (m, 2H), 1.23 (t, 7.2 Hz, 3H), 1.03 (t, 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 1246.5 (計算值)；LC/MS [M+H] 1246.7 (觀測值)。 實例L-21 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[2-(二甲基胺甲醯基胺基)乙氧基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-21之合成
Figure 02_image362
Figure 02_image364
Figure 02_image366
((5-(2-胺基-4-((2-(3,3-二甲基脲基)乙氧基)(丙基)胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基)嘧啶-2-基)甲基)胺甲酸三級丁酯HxBz-20a之製備
向2-胺基-8-[2-[(三級丁氧基羰基胺基)甲基]嘧啶-5-基]-3H-1-苯并氮呯-4-羧酸HxBz-14a (250 mg，611 umol，1當量)及1,1-二甲基-3-[2-(丙基胺基氧基)乙基]脲(165 mg，733 umol，1.2當量, HCl)於DCM (3 mL)及DMA (1 mL)中之混合物中添加EDCI (468 mg，2.44 mmol，4當量)，且將其在25℃下攪拌1 h。將混合物在真空中濃縮以去除DCM，將殘餘物用水(10 mL)稀釋，將混合物之pH用Na 2CO 3水溶液調節至約8. 將水相用乙酸乙酯 (10 mL*4)萃取。將經合併之有機相用鹽水(20 mL*1)洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯＝1/0, 0/1，乙酸乙酯/甲醇＝1/0,3/1)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之HxBz-20a (260 mg，447.75 umol，73.33%產率)。 HxBz-20之製備
向HxBz-20a (130 mg，224 umol，1當量)於EtOAc (3.00 mL)中之溶液中添加HCl/EtOAc (4 M, 3.00 mL，53.60當量)，且然後在25℃下攪拌1 h。將混合物濃縮，得到呈淡紅色固體狀之HxBz-20 (115 mg，207.77 umol，92.81%產率，2HCl)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ9.22 (s, 2H), 7.86-7.80 (m, 2H), 7.80-7.74 (m, 1H), 7.50 (s, 1H), 4.48 (s, 2H), 3.97 (t, J ＝ 5.2 Hz, 2H), 3.76 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.45 (s, 2H), 3.38-3.34 (m, 2H), 2.74 (s, 6H), 1.83-1.73 (m, 2H), 1.00 (t, J ＝ 7.6 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 481.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 481.1 (觀測值)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[2-(二甲基胺甲醯基 胺基)乙氧基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-21a之製備
向HxBz-20 (65.0 mg，117 umol，1當量，2HCl)於DMF (1.00 mL)中之溶液中添加Et 3N (48.0 mg，470 umol，4當量)及3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-側氧基-3-(2,3,5,6-四氟苯氧基)丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-21a (83.0 mg，117 umol，1當量)，且然後在0℃下攪拌1 h。將混合物用水(10 mL)稀釋且藉由連續添加TFA將混合物之pH調節至約6且用MTBE (10 mL)萃取，丟棄，將水相用DCM:i-PrOH ＝ 3:1 (20 mL x 3)進一步萃取。將有機層經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮，得到呈淡黃色油狀之HxBzL-21a (95 mg，93.03 umol，79.22%產率)。 HxBzL-21之製備
向HxBzL-21a (90.0 mg，88.1 umol，1當量)及(2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯基)磺醯基氧基鈉(95.0 mg，353 umol，4當量)於DCM (2.00 mL)及DMA (0.10 mL) 中之溶液中添加EDCI (68.0 mg，353 umol，4當量)，且將其在25℃下攪拌1 h。將混合物濃縮且過濾。藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Synergi C18 150*25*10um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：5%-35%，8min)純化殘餘物，得到呈淡黃色油狀之HxBzL-21 (51 mg，37.41 umol，42.45%產率，TFA)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ9.10 (s, 2H), 7.83-7.70 (m, 3H), 7.48 (s, 1H), 4.69 (s, 2H), 3.97 (t, J ＝ 5.2 Hz, 2H), 3.86 (t, J ＝ 5.6 Hz, 2H), 3.80 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 3.78-3.74 (m, 2H), 3.65-3.55 (m, 36H), 3.45 (s, 2H), 3.37-3.34 (m, 2H), 2.97 (t, J ＝ 5.6 Hz, 2H), 2.74 (s, 6H), 2.60 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 1.83-1.72 (m, 1H), 1.00 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 1249.5 (計算值)；LC/MS [M+H] 1249.6 (觀測值)。 實例L-23 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[2-羥基乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-23之合成
Figure 02_image368
Figure 02_image370
Figure 02_image372
N-[[5-[2-胺基-4-[2-羥基乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基]胺甲酸三級丁酯HxBz-22a之製備
在25℃下向 2-胺基-8-[2-[(三級丁氧基羰基胺基)甲基]嘧啶-5-基]-3H-1-苯并氮呯-4-羧酸HxBz-14a (0.35 g，855 umol，1.0當量)及2-(丙基胺基氧基)乙醇(200 mg，1.28 mmol，1.5當量，HCl)於DCM (6 mL)及DMA (0.5 mL)中之混合物中一次性添加EDCI (492 mg，2.56 mmol，3.0當量)，且然後在25℃下攪拌0.5 h。將混合物濃縮以去除DCM且將殘餘物用H 2O (10 mL)稀釋。將混合物之pH用NaHCO 3水溶液調節至約8。然後將水相用EtOAc (20 mL x 3)萃取。將有機層用鹽水洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，乙酸乙酯/MeOH＝1/0, 10/1)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之HxBz-22a (0.37 g，725 umol，84.77%產率)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ9.08-9.01 (m, 2H), 7.59 (d, J ＝ 8.0 Hz, 1H), 7.54-7.46 (m, 2H), 7.40 (s, 1H), 4.56-4.49 (m, 2H), 4.02-3.95 (m, 2H), 3.81-3.74 (m, 2H), 3.73-3.66 (m, 2H), 1.88-1.72 (m, 2H), 1.48 (s, 9H), 0.99 (t, J ＝ 7.6 Hz, 3H)。 2-胺基-8-[2-(胺基甲基)嘧啶-5-基]-N-(2-羥基乙氧基)-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺HxBz-22之製備
在25℃下向 HxBz-22a (0.35 g，685 umol，1.0當量)於H 2O (4 mL)及CH 3CN (0.5 mL)中之混合物中一次性添加TFA (1.17 g，10.3 mmol，761 uL，15.0當量)，且然後在80℃下攪拌0.5 h。將混合物用MTBE (10 mL x 2)萃取以去除過量TFA。然後將水層冷凍乾燥。藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：1%-20%,8min)進一步純化殘餘物，得到呈白色固體狀之HxBz-22 (0.32 g，501umol，73.11%產率，2TFA)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ9.20 (s, 2H), 7.84-7.72 (m, 3H), 7.56 (s, 1H), 4.47 (s, 2H), 4.03-3.96 (m, 2H), 3.79 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.74-3.66 (m, 2H), 3.53-3.36 (m, 2H), 1.88-1.72 (m, 2H), 1.00 (t, J ＝ 7.6 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 411.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 411.1 (觀測值)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[2-羥基乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-23a之製備
在0℃下向 HxBz-22 (0.23 g，560 umol，1.0當量，2TFA)於THF (6 mL)中之混合物中一次性添加Et 3N (170 mg，1.68 mmol，234 uL，3.0當量)及3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-側氧基-3-(2,3,5,6-四氟苯氧基)丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]丙酸(396 mg，560 umol，1.0當量)，且然後在0℃下攪拌0.5 h。將混合物用水(5 ml)稀釋且在0℃下將混合物之pH用TFA稀釋至約6。將水相用EtOAc (10 mL)萃取，丟棄。將水層用DCM:i-PrOH＝3:1(20 mL x 2)進一步萃取。將有機層經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮，獲得呈黃色油狀之HxBzL-23a (0.53 g，粗製物，TFA)。 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[2-羥基乙氧基 (丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-23之製備
在25℃下向HxBzL-23a (0.35 g，329 umol，1.0當量，TFA)及2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯磺酸鈉(352 mg，1.31 mmol，4.0當量)於DCM (4 mL)及DMA (0.5 mL)中之混合物中一次性添加EDCI (378 mg，1.97 mmol，6.0當量)，且然後在25℃下攪拌0.5 h。將混合物濃縮且過濾。然後藉由製備型HPLC(管柱：Phenomenex luna C18 250* 50mm*10 um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：20%-50%，10 min)純化殘餘物，得到呈淡黃色油狀之HxBzL-23 (80.4 mg，68.2 umol，20.75%產率)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ9.08 (s, 2H), 7.82-7.70 (m, 3H), 7.56 (s, 1H), 4.69 (s, 2H), 4.06-3.97 (m, 2H), 3.86 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 3.83-3.76 (m, 4H), 3.74-3.69 (m, 2H), 3.65-3.57 (m, 36H), 3.46 (s, 2H), 3.02-2.92 (m, 2H), 2.60 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 1.87-1.72 (m, 2H), 1.00 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 1179.4 (計算值)；LC/MS [M+H] 1179.3 (觀測值)。 實例L-27 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[2-(異丙氧基羰基胺基)乙氧基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-27之合成
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Figure 02_image378
N-[2-[[2-胺基-8-[2-[(三級丁氧基羰基胺基)甲基]嘧啶-5-基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]氧基乙基]胺甲酸異丙酯HxBz-27a之製備
向2-胺基-8-[2-[(三級丁氧基羰基胺基)甲基]嘧啶-5-基]-3H-1-苯并氮呯-4-羧酸HxBz-14a (350 mg，855 umol，1.0當量)及N-[2-(丙基胺基氧基)乙基]胺甲酸異丙酯(268 mg，1.11 mmol，1.3當量，HCl)於DCM (5 mL)及DMA (3 mL)中之混合物中添加EDCI (656 mg，3.42 mmol，4.0當量)，且將其在25℃下攪拌1 h。在30℃下在減壓下濃縮混合物。將殘餘物倒入到冰水(w/w ＝ 1/1) (10 mL)中且攪拌5 min。將混合物之pH用NaHCO 3水溶液調節至約8。將水相用乙酸乙酯(20 mL x 3)萃取。將經合併之有機相用鹽水(10 mL x 3)洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯＝1/0, 1/1，乙酸乙酯/甲醇＝1/0,10/1)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之HxBz-27a (460 mg，772 umol，90.3%產率)。 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ 9.04 (s, 2H), 7.57 (d, J ＝ 8.0 Hz, 1H), 7.51-7.44 (m, 2H), 7.32 (s, 1H), 4.74-4.68 (m, 1H), 4.52 (s, 2H), 3.94 (t, J ＝ 5.2 Hz, 2H), 3.73 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.30-3.26 (m, 2H), 1.76 (sxt, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 1.47 (s, 9H), 1.12 (d, J ＝ 6.0 Hz, 6H), 0.98 (t, J ＝ 7.4 Hz, 3H)。 N-[2-[[2-胺基-8-[2-(胺基甲基)嘧啶-5-基] -3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]氧基乙基]胺甲酸異丙酯HxBz-27之製備
向HxBz-27a (410 mg，688 umol，1.0當量)於MeCN (0.5 mL)及H 2O (5 mL) 中之溶液中添加TFA (1.18 g，10.3 mmol，764 uL，15.0當量)，且然後在80℃下攪拌1 h。在真空中濃縮混合物，以去除CH 3CN，將水相用MTBE (5 mL x 3)萃取以去除過量TFA。將水相冷凍乾燥，得到呈白色固體狀之HxBz-27 (400 mg，553 umol，80.3%產率，2TFA)。 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ 9.21 (s, 2H), 7.86-7.74 (m, 3H), 7.51 (s, 1H), 4.76-4.63 (m, 1H), 4.48 (s, 2H), 3.98 (t, J ＝ 5.2 Hz, 2H), 3.77 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.43 (s, 2H), 1.78 (sxt, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 1.12 (d, J ＝ 6.4 Hz, 6H), 1.00 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 496.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 496.1 (觀測值)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[2-(異丙氧基羰基胺基)乙氧基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-27a之製備
在0℃下向HxBz-27 (130 mg，180 umol，1.0當量，2TFA)於THF (2 mL)中之溶液中添加Et 3N (54.5 mg，539 umol，75.0 uL，3.0當量)及3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-側氧基-3-(2,3,5,6-四氟苯氧基)丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(127 mg，180 umol，1.0當量)，且然後在0℃下攪拌0.5 h。在真空中濃縮混合物。將殘餘物用水(10 mL)稀釋，將混合物之pH用TFA調節至約6。將水相用MTBE (5 mL x 3)萃取，丟棄。將水相用DCM/i-PrOH ＝ 3/1 (10 mL x 3)進一步萃取。將有機相在真空中濃縮，得到呈黃色油狀之HxBzL-27a (180 mg，174 umol，96.7%產率)。 HxBzL-27之製備
向HxBzL-27a (180 mg，174 umol，1.0當量)及(2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯基)磺醯基氧基鈉(186 mg，695 umol，4.0當量)於DCM (2 mL)及DMA (0.5 mL)中之混合物中添加EDCI (266 mg，1.39 mmol，8.0當量)，且然後在25℃下攪拌0.5 h。將混合物在真空中濃縮且過濾。藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Synergi C18 150*25*10um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：15%-35%,8min)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之HxBzL-27 (91 mg，66.0 umol，38.0%產率，TFA)。 1H NMR (MeOD, 400MHz) δ 9.08 (s, 2H), 7.82-7.73 (m, 3H), 7.50 (s, 1H), 4.75-4.66 (m, 3H), 3.97 (t, J ＝ 5.2 Hz, 2H), 3.86 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 3.80 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 3.75 (br t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.66-3.56 (m, 36H), 3.45-3.42 (m, 2H), 2.96 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 2.60 (t, J ＝ 6.4 Hz, 2H), 1.84-1.70 (m, 2H), 1.12 (d, J ＝ 6.0 Hz, 6H), 0.99 (t, J ＝ 7.6 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 1264.4 (計算值)；LC/MS [M+H] 1264.7 (觀測值)。 實例L-32 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[丙基-[2-(吡咯啶 -1-羰基胺基)乙氧基]胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-32之合成
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Figure 02_image382
Figure 02_image384
N-[[5-[2-胺基-4-[丙基-[2-(吡咯啶-1-羰基胺基)乙氧基]胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基]胺甲酸三級丁酯HxBzL-32a之製備
在25℃下向2-胺基-8-[2-[(三級丁氧基羰基胺基)甲基]嘧啶-5-基]-3H-1-苯并氮呯-4-羧酸HxBz-14a (0.25 g，611 umol，1.3當量)於DCM (4 mL)及DMA (0.5 mL) 中之混合物中一次性添加N-[2-(丙基胺基氧基)乙基]吡咯啶-1-甲醯胺(118 mg，469 umol，1.0當量，HCl)及EDCI (270.12 mg，1.41 mmol，3.0當量)，且然後在25℃下攪拌0.5 h。然後將混合物濃縮且過濾。藉由製備型HPLC(管柱：Phenomenex luna C18 100*40mm*5 um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：7%-38%,8min)純化混合物，得到呈黃色固體狀之HxBzL-32a (0.1 g，165 umol，35.09%產率)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ9.08 (s, 2H), 7.88-7.68 (m, 3H), 7.50 (s, 1H), 4.54 (s, 2H), 4.02-3.89 (m, 2H), 3.76 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.44 (s, 2H), 3.36 (t, J ＝ 5.6 Hz, 2H), 3.19-3.07 (m, 4H), 1.86-1.68 (m, 6H), 1.47 (s, 9H), 1.00 (t, J ＝ 7.6 Hz, 3H)。 2-胺基-8-[2-(胺基甲基)嘧啶-5-基]-N-丙基-N-[2-(吡咯啶-1-羰基胺基)乙氧基]-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺HxBzL-32b之製備
在25℃下向 HxBzL-32a (0.09 g，148 umol，1.0當量)於H 2O (4 mL)及CH 3CN (0.5 mL)中之混合物中一次性添加TFA (254 mg，2.23 mmol，165 uL，15.0當量)，且然後在80℃下攪拌0.5 h。然後將混合物用MTBE (10 mL x 3)萃取且丟棄。將水層冷凍乾燥，獲得呈黃色固體狀之HxBzL-32b (0.1 g，136 umol，91.76%產率，2TFA)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ9.21 (s, 2H), 7.86-7.70 (m, 3H), 7.49 (s, 1H), 4.48 (s, 2H), 3.97 (t, J ＝ 5.6 Hz, 2H), 3.76 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.48-3.43 (m, 2H), 3.37 (t, J ＝ 5.2 Hz, 2H), 3.13 (s, 4H), 1.81-1.71 (m, 6H), 1.00 (t, J ＝ 7.6 Hz, 3H)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[丙基-[2-(吡咯啶-1-羰基胺基)乙氧基]胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-32c之製備
在0℃下向HxBzL-32b (70 mg，82.5 umol，1.0當量，3TFA)於THF (2 mL)中之混合物中一次性添加Et 3N (25.0 mg，247 umol，34.4 uL，3.0當量)及3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-側氧基-3-(2,3,5,6-四氟苯氧基)丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(69.9 mg，98.9 umol，1.2當量)，且然後在0℃下攪拌0.5 h。將混合物用水(5 mL)稀釋且在0℃下將pH用TFA調節至約6。然後將混合物用EtOAc (10 mL)萃取且丟棄。將水層用DCM:i-PrOH＝3:1(10 mL x 2)進一步萃取。將有機層經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮，獲得呈黃色油狀之HxBzL-32c (0.1 g，粗製物，TFA)。 HxBzL-32之製備
在25℃下向HxBzL-32c (0.1 g，86.1 umol，1.0當量，TFA)於DCM (2 mL)及DMA (0.5 mL)中之混合物中一次性添加2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯磺酸鈉(115 mg，431 umol，5.0當量)及 EDCI (116 mg，603 umol，7.0當量)，且然後在25℃下攪拌0.5 h。將混合物濃縮。然後藉由製備型HPLC(管柱：Phenomenex Synergi C18 150*25*10um；流動相：[水(0.1%TFA) -ACN]；B%：10%-35%,8min)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之HxBzL-32 (46.4 mg，33.4 umol，38.78%產率，TFA)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ9.09 (s, 2H), 7.85-7.66 (m, 3H), 7.49 (s, 1H), 4.70 (s, 2H), 3.97 (t, J ＝ 5.6 Hz, 2H), 3.90-3.84 (m, 2H), 3.80 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 3.66-3.58 (m, 38H), 3.45 (s, 2H), 3.37 (t, J ＝ 5.2 Hz, 2H), 3.13 (s, 4H), 3.01-2.93 (m, 2H), 2.60 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 1.86-1.68 (m, 6H), 1.00 (t, J ＝ 7.6 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 1275.5 (計算值)；LC/MS [M+H] 1275.6 (觀測值)。 實例L-33 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[1-[[5-[2-胺基-4-[3-(環丁氧基羰基胺基)丙基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]-3-吡啶基]磺醯基]氮雜環丁烷-3-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-33之合成
Figure 02_image386
Figure 02_image388
Figure 02_image390
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2-胺基-8-(5-((3-(((三級丁氧基羰基)胺基)甲基)氮雜環丁烷-1-基)磺醯基)吡啶-3-基)-3H-苯并[b]氮呯-4-羧酸乙酯HxBz-32b之製備
在25℃下在N 2下向N-[[1-[[5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環-2-基)-3-吡啶基]磺醯基]氮雜環丁烷-3-基]甲基]胺甲酸三級丁酯HxBz-32a (5 g，11.0 mmol，1當量)及2-胺基-8-溴-3H-1-苯并氮呯-4-羧酸乙酯(3.41 g，11.0 mmol，1當量)於二噁烷(50 mL)及H 2O (5 mL)中之溶液中添加K 2CO 3(3.05 g，22.1 mmol，2當量)及Pd(dppf)Cl 2(403 mg，551 umol，0.05當量)，且然後在90℃下攪拌2 h。將混合物過濾並濃縮，得到殘餘物。將殘餘物用水(100 mL)稀釋且用EtOAc (50 mL x 3)萃取。將水層用鹽水(50 mL)洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮，得到HxBz-32a，在25℃下將其用CH 3CN研磨15 min，獲得呈灰色固體狀之HxBz-32b (5.5 g，9.90 mmol，89.75%產率)。 1H NMR (DMSO-d 6, 400MHz) δ9.29 (s, 1H), 8.94 (s, 1H), 8.32 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.60 (d, J ＝ 8.0 Hz, 1H), 7.50-7.41 (m, 2H), 7.04-6.85 (m, 3H), 4.25 (q, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.82 (t, J ＝ 8.0 Hz, 2H), 3.58-3.52(m, 2H), 2.99-2.85 (m, 4H), 2.56-2.51 (m, 1H), 1.35-1.30 (m, 12H)。 2-胺基-8-(5-((3-(((三級丁氧基羰基)胺基)甲基)氮雜環丁烷-1-基)磺醯基)吡啶-3-基)-3H-苯并[b]氮呯-4-羧酸HxBz-32c之製備
向HxBz-32b (3.2 g，5.76 mmol，1當量)於MeOH (40 mL)及H 2O (5 mL)中之溶液中添加LiOH.H 2O (725 mg，17.3 mmol，3當量)，且然後在 60℃下攪拌4 h。將反應混合物在減壓下濃縮，以去除EtOH。在0℃下將混合物之pH用HCl (12 M)調節至約5且然後過濾，在減壓下乾燥濾餅，得到粗產物。在25℃下將粗產物用CH 3CN研磨20 min，獲得呈灰色固體狀之HxBz-32c (2.7 g，5.12 mmol，88.86%產率)。 1H NMR (DMSO-d 6, 400MHz) δ9.34 (s, 1H), 9.02 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.98-7.92 (m, 2H), 7.89-7.83 (m, 2H), 3.83 (t, J ＝ 8.0 Hz, 2H), 3.59-3.49 (m, 4H), 2.90 (d, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 2.56-2.54 (m, 1H), 1.30 (s, 9H)。 N-[3-[[2-胺基-8-[5-[3-[(三級丁氧基羰基胺基)甲基]氮雜環丁烷-1-基]磺醯基-3-吡啶基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]胺甲酸環丁酯HxBz-32d之製備
向HxBz-32c (400 mg，758 umol，1當量)於DMF (10.0 mL)中之溶液中添加HATU (317 mg，834 umol，1.1當量)、DIEA (490 mg，3.79 mmol，660 uL，5當量)及N-[3-(丙基胺基)丙基]胺甲酸環丁酯(380 mg，1.52 mmol，2當量，HCl)，且將其在25℃下攪拌1 h。將該混合物用水(50 mL)稀釋且用EtOAc (30 mL × 3)萃取。將有機層用鹽水(20 mL x 3)洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮。藉由急速矽膠層析(ISCO®；1 g SepaFlash® Silica Flash管柱，0~30%乙酸乙酯/MeOH之溶析液，在35 mL/min下)純化殘餘物，得到呈淡黃色固體狀之HxBz-32d (340 mg，469.69 umol，61.95%產率)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ9.18 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 8.95 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 8.42 (t, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 7.58-7.50 (m, 2H), 7.49-7.43 (m, 1H), 6.93 (s, 1H), 4.85-4.76 (m, 1H), 3.90 (t, J ＝ 8.4 Hz, 2H), 3.64-3.56 (m, 2H), 3.54-3.48 (m, 2H), 3.47-3.39 (m, 2H), 3.32 (br s, 2H), 3.22-3.02 (m, 4H), 2.70-2.57 (m, 1H), 2.35-2.01 (m, 4H), 1.90-1.80 (m, 2H), 1.77-1.47 (m, 4H), 1.37 (s, 9H), 1.05-0.76 (m, 3H)。 N-[3-[[2-胺基-8-[5-[3-(胺基甲基)氮雜環丁烷-1-基]磺醯基-3-吡啶基] -3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]胺甲酸環丁酯HxBz-32之製備
向HxBz-32d (340 mg，470 umol，1當量)於CH 3CN (2.00 mL)及H 2O (1.00 mL)中之溶液中添加TFA (428 mg，3.76 mmol，278 uL，8當量)，且然後在80℃下攪拌1 h。將混合物濃縮且過濾。藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex luna C18 100*40mm*5 um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：5%-35%,8min)純化殘餘物，得到呈淡黃色固體狀之HxBz-32 (400 mg，470 umol，99.98%產率，2TFA)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ9.24 (d, J ＝ 1.6 Hz, 1H), 9.04 (d, J ＝ 1.6 Hz, 1H), 8.49 (s, 1H), 7.88-7.71 (m, 3H), 7.13 (br s, 1H), 4.85-4.80 (m, 1H), 4.03 (t, J ＝ 8.4 Hz, 2H), 3.73 (dd, J ＝ 5.6, 8.4 Hz, 2H), 3.59-3.43 (m, 4H), 3.38 (br s, 2H), 3.12 (br d, J ＝ 7.6 Hz, 4H), 2.83-2.73 (m, 1H), 2.37-2.12 (m, 2H), 2.00-2.10 (m, 4H), 1.78-1.43 (m, 4H), 1.05-0.83 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 624.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 624.2 (觀測值)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[1-[[5-[2-胺基-4-[3-(環丁氧基羰基胺基)丙基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]-3-吡啶基]磺醯基]氮雜環丁烷-3-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-33a之製備
向HxBz-32 (200 mg，235 umol，1當量，2TFA)於THF (2.00 mL)中之溶液中添加Et 3N (71.0 mg，704 umol，98.0 uL，3當量)及3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-側氧基-3-(2,3,5,6-四氟苯氧基)丙氧基] 乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(166 mg，235 umol，1當量)，且然後在0℃下攪拌1 h。將混合物濃縮且用水(10 mL)稀釋且藉由連續添加TFA將混合物之pH調節至約6且用MTBE (10 mL)萃取，丟棄，將水相用DCM:i-PrOH＝3:1 (20 mL x 3)進一步萃取。將有機層經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮，得到呈淡黃色油狀之HxBzL-33a (210 mg，180.36 umol，76.81%產率)。 HxBzL-33之製備
向HxBzL-33a (210 mg，180 umol，1當量)及2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯磺酸 (178 mg，721 umol，4當量)於DCM (4.00 mL)及DMA (0.20 mL)中之溶液中添加EDCI (138 mg，721 umol，4當量)，且然後在25℃下攪拌1 h。將混合物濃縮且過濾。藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.2%FA)-ACN]；B%：15%-40%,8min)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之HxBzL-33 (98 mg，68.13 umol，37.77%產率，FA)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ9.23 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 9.02 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 8.48 (t, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 7.91-7.67 (m, 3H), 7.13 (s, 1H), 4.85-4.80 (m, 1H), 3.93 (t, J ＝ 8.4 Hz, 2H), 3.86 (t, J ＝ 5.6 Hz, 2H), 3.66-3.55 (m, 40H), 3.54-3.48 (m, 4H), 3.40 (br s, 2H), 3.25-3.08 (m, 4H), 2.97 (t, J ＝ 5.6 Hz, 2H), 2.79-2.68 (m, 1H), 2.29 (br t, J ＝ 6.0 Hz, 3H), 1.93-1.80 (m, 3H), 1.77-1.52 (m, 4H), 1.01-0.88 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 1392.5 (計算值)；LC/MS [M+H] 1392.3 (觀測值)。 實例L-34 (2-((2-胺基-8-(2-(39-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,37-二側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十氧雜-2,36-二氮雜三十九烷基)嘧啶-5-基)-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺基)氧基)乙基)胺甲酸環丁酯HxBzL-34之合成
Figure 02_image394
向(2-((2-胺基-8-(2-(胺基甲基)嘧啶-5-基)-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺基)氧基)乙基)胺甲酸環丁酯HxBzL-34a (23.6 mg，0.046 mmol，1當量)及1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3-側氧基-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34-十氧雜-4-氮雜三十七-37-烷酸(31.7 mg，0.046 mmol，1當量)於DMF (1 ml)中之溶液中添加DIPEA (49 µl, 0.28 mmol，6當量)，隨後添加((7-氮雜苯并三唑-1-基氧基)三吡咯啶鏻六氟磷酸酯)PyAOP(CAS登記號156311-83-0) (59 mg，0.113 mmol，2.4當量)。將反應物在室溫下攪拌2小時，然後濃縮且藉由製備型HPLC純化，得到HxBzL-34 (4.9 mg，0.0042 mmol，9%)。LC/MS [M+H] 1170.6 (計算值)；LC/MS [M+H] 1170.9 (觀測值)。 實例L-37 (2-((2-胺基-8-(2-(38-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,37-二側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十氧雜-2,36-二氮雜三十八烷基)嘧啶-5-基)-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺基)氧基)乙基)胺甲酸環丁酯HxBzL-37之合成
Figure 02_image396
向(2-((2-胺基-8-(2-(胺基甲基)嘧啶-5-基)-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺基)氧基)乙基)胺甲酸環丁酯HxBzL-37a (12.4 mg，0.024 mmol，1當量)及1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十氧雜-3-氮雜三十六-36-烷酸(16.3 mg，0.024 mmol，1當量)於DMF (0.5 ml)中之經攪拌溶液中添加DIPEA (25.5 µl, 0.15 mmol，6當量)，隨後添加PyAOP (31.0 mg，0.059 mmol，2.4當量)。將反應物在室溫小攪拌且藉由LC/MS監測，然後濃縮且藉由製備型HPLC純化，得到HxBzL-37 (6.7 mg，0.0058 mmol，24%)。LC/MS [M+H] 1156.6 (計算值)；LC/MS [M+H] 1156.9 (觀測值)。 實例L-38 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]-2-吡啶基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-38之合成
Figure 02_image398
Figure 02_image400
Figure 02_image402
Figure 02_image404
Figure 02_image406
N-[(5-溴-2-吡啶基)甲基]胺甲酸三級丁酯HxBz-36b之製備
在0℃下向5-溴吡啶-2-甲醛HxBz-36a (5.00 g，26.9 mmol，1當量)及胺甲酸三級丁酯(6.30 g，53.8 mmol，2當量)於CH 3CN (250 mL)中之溶液中添加TFA (9.19 g，80.6 mmol，5.97 mL，3當量)及Et 3SiH (31.3 g，268.8 mmol，42.9 mL，10當量)且將其在25℃下攪拌3 h。在0℃下藉由添加Na 2CO 3水溶液(200 mL)淬滅反應混合物，在減壓下濃縮。將殘餘物用(200 mL)稀釋且用EtOAc (100 mL x 3)萃取。將經合併之有機層用鹽水(50 mL)洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。藉由管柱層析(SiO 2，石油醚:乙酸乙酯 ＝ 1:0至1:1)純化殘餘物。獲得呈淡黃色固體狀之HxBz-36b (9 g，粗製物)。 1H NMR (CDCl 3, 400 MHz) δ8.59 (d, J ＝ 2.4 Hz, 1H), 7.78 (dd, J ＝ 2.4, 8.4 Hz, 1H), 7.20 (d, J ＝ 8.4 Hz, 1H), 5.50 (br s, 1H), 4.58-4.29 (m, 2H), 1.45 (s, 9H) N-[[5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環-2-基)-2-吡啶基]甲基]胺甲酸三級丁酯HxBz-36c之製備
將HxBz-36b (8.00 g，27.9 mmol，1當量)、Pin 2B 2(8.49 g，33.4 mmol，1.2當量)、Pd(dppf)Cl 2(1.02 g，1.39 mmol，0.05當量)及KOAc (5.47 g，55.7 mmol，2當量)於二噁烷(80 mL)中之混合物除氣且用N 2吹掃3次。將混合物在90℃下在N 2氣氛下攪拌2 h且然後不經處理即直接用於下一步驟中，獲得呈深棕色油狀之HxBz-36c (9.4 g，粗製物)。  2-胺基-8-[6-[(三級丁氧基羰基胺基)甲基]-3-吡啶基]-3H -1-苯并氮呯-4-羧酸乙酯HxBz-36d之製備
將HxBz-36c (9.30 g，27.82 mmol，2當量)、2-胺基-8-溴-3H-1-苯并氮呯-4-羧酸乙酯(4.30 g，13.9 mmol，1當量)、Pd(dppf)Cl 2(509 mg，695 umol，0.05當量)及K 2CO 3(3.84 g，27.8 mmol，2當量)於二噁烷(80 mL)及H 2O (8 mL)中之混合物除氣且用N 2吹掃3次，且然後將其在90℃下在N 2氣氛下攪拌3 h。將反應混合物過濾且在減壓下濃縮。將殘餘物用H 2O (50 mL) 稀釋且用EtOAc (50 mL x 3)萃取。將經合併之有機層用鹽水(30 mL x 3)洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。藉由管柱層析(SiO 2，石油醚:乙酸乙酯＝ 1:0至0:1)且然後(SiO 2, EtOAc:MeOH ＝ 1:0至5:1)純化殘餘物，獲得呈淡黃色固體狀之HxBz-36d (2.40 g，5.50 mmol，39.5%產率)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ8.76 (s, 1H), 8.10 (br d, J ＝ 8.0 Hz, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.58-7.33 (m, 4H), 4.40 (s, 2H), 4.32 (q, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.05 (s, 2H), 1.48 (s, 9H), 1.38 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。 2-胺基-8-[6-[(三級丁氧基羰基胺基)甲基]-3-吡啶基]-3H-1-苯并氮呯-4-羧酸HxBz-36e之製備
向HxBz-36d (2.40 g，5.50 mmol，1當量)於EtOH (30 mL)中之溶液中添加LiOH.H 2O (923 mg，22.0 mmol，4當量)於H 2O (6 mL)中之溶液且然後將其在40℃下攪拌2 h。在0℃下藉由添加1 M HCl將反應混合物之pH調節至5-6且然後在減壓下濃縮，以去除EtOH。將殘餘物用H 2O (10 mL)稀釋且過濾且在減壓下乾燥濾餅，獲得呈灰色固體狀之HxBz-36e (1.88 g，4.60 mmol，83.7%產率)。 1H NMR (DMSO, 400 MHz) δ9.01 (s, 1H), 8.50 (br d, J ＝ 8.4 Hz, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.83 (s, 2H), 7.75 (s, 1H), 7.73-7.66 (m, 1H), 4.41 (br s, 2H), 3.51 (s, 2H), 1.40 (s, 9H)。 N-[[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]-2-吡啶基]甲基]胺甲酸三級丁酯HxBz-36f之製備
向HxBz-36e (0.35 g，857 umol，1當量)及N-乙氧基丙-1-胺(144 mg，1.03 mmol，1.2當量，HCl)於DCM (3 mL)及DMA (3 mL)中之溶液中添加EDCI (493 mg，2.57 mmol，3當量)且然後將其在25℃下攪拌1 h。將反應混合物在減壓下濃縮以去除DCM。將殘餘物用H 2O (10 mL)稀釋且在0℃下藉由添加Na 2CO 3水溶液將混合物之pH調節至約9，用EtOAc (10 mL x 3)萃取。將經合併之有機層用鹽水(5 mL x 3)洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。藉由管柱層析(SiO 2，石油醚:乙酸乙酯 ＝ 1:0至0:1)且然後(SiO 2, EtOAc:MeOH ＝ 1:0至3:1)純化殘餘物，得到呈淡黃色固體狀之HxBz-36f (0.33 g，669 umol，78.0%產率)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ8.76 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 8.11 (br d, J ＝ 8.4 Hz, 1H), 7.47 (d, J ＝ 8.4 Hz, 2H), 7.43 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 7.40-7.34 (m, 1H), 7.29 (s, 1H), 4.40 (s, 2H), 3.95 (q, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.73 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.31 (s, 2H), 1.82-1.70 (m, 2H), 1.48 (s, 9H), 1.17 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 0.99 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。 2-胺基-8-[6-(胺基甲基)-3-吡啶基]-N-乙氧基-N-丙基-3H -1-苯并氮呯-4-甲醯胺HxBz-36之製備
向HxBz-36f (0.33 g，669 umol，1當量)於CH 3CN (3 mL)及H 2O (3 mL)中之溶液中添加TFA (610 mg，5.35 mmol，396 uL，8當量)，且然後在80℃下攪拌0.5 h。將反應混合物在減壓下濃縮以去除溶劑。將殘餘物用H 2O (5 mL)稀釋且用MTBE (5 mL x 3)萃取且丟棄。在減壓下濃縮水相，得到呈淡黃色固體狀之HxBz-36 (0.33 g，530.95 umol，79.42%產率，2TFA)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ8.99 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 8.20 (dd, J ＝ 2.4, 8.4 Hz, 1H), 7.79-7.67 (m, 3H), 7.59 (d, J ＝ 8.4 Hz, 1H), 7.45 (s, 1H), 4.36 (s, 2H), 3.98 (q, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.76 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.43 (s, 2H), 1.83-1.72 (m, 2H), 1.26-1.16 (m, 3H), 1.01 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 394.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 394.2 (觀測值)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]-2-吡啶基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-38a之製備
在0℃下向HxBz-36 (0.15 g，241 umol，1當量，2TFA)於THF (3 mL)中之溶液中添加TEA (73.3 mg，724 umol，3當量)及3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-側氧基-3-(2,3,5,6-四氟苯氧基)丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(171 mg，241 umol，1當量)且將其在20℃下攪拌0.5 h。在0℃下將反應混合物之pH用TFA調節至5-6，且然後用H 2O (10 mL)稀釋且用EtOAc (5 mL x 3)萃取並丟棄。將水相用DCM:i-PrOH ＝ 3:1(5 mL x 3)進一步萃取。將經合併之有機層經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到呈無色油狀之HxBzL-38a (0.23 g，219 umol，90.9%產率，TFA)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ8.91 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 8.33 (dd, J ＝ 2.0, 8.0 Hz, 1H), 7.83-7.77 (m, 1H), 7.75-7.69 (m, 3H), 7.47 (s, 1H), 4.64 (s, 2H), 3.98 (q, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.83-3.74 (m, 4H), 3.71 (t, J ＝ 6.4 Hz, 2H), 3.66-3.50 (m, 36H), 3.45 (s, 2H), 2.58 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 2.53 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 1.83-1.73 (m, 2H), 1.21 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 1.01 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H) HxBzL-38之製備
向HxBzL-38a (0.18 g，172 umol，1當量，TFA)於DCM (3 mL)及DMA (0.3 mL)中之溶液中添加(2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯基)磺醯基氧基鈉(184 mg，687 umol，4當量)及EDCI (132 mg，687 umol，4當量)且將其在20℃下攪拌0.5 h。在減壓下濃縮反應混合物，以去除DCM，且過濾。藉由製備型HPLC (TFA條件；管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：10%-35%,8min)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之HxBzL-38 (116.7 mg，91.4 umol，53.2%產率，TFA)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ9.01 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 8.57 (dd, J ＝ 2.0, 8.4 Hz, 1H), 7.92 (d, J ＝ 8.4 Hz, 1H), 7.84-7.79 (m, 2H), 7.75-7.68 (m, 1H), 7.45 (s, 1H), 4.72 (s, 2H), 3.98 (q, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.85 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 3.82-3.72 (m, 4H), 3.67-3.51 (m, 36H), 3.45 (s, 2H), 2.96 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 2.59 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 1.83-1.73 (m, 2H), 1.21 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 1.01 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 1162.5 (計算值)；LC/MS [M+H] 1162.5 (觀測值)。 實例L-39 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[3 -(環丁氧基羰基胺基)丙基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]-2-吡啶基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-39之合成
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Figure 02_image412
N-[3-[[2-胺基-8-[6-[(三級丁氧基羰基胺基)甲基]-3-吡啶基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]胺甲酸環丁酯HxBz-38b之製備
向2-胺基-8-[6-[(三級丁氧基羰基胺基)甲基]-3-吡啶基]-3H-1-苯并氮呯-4-羧酸HxBz-38a (0.35 g，857 umol，1當量)及N-[3-(丙基胺基)丙基]胺甲酸環丁酯(258 mg，1.03 mmol，1.2當量，HCl)於DMF (5 mL)中之溶液中添加HATU (326 mg，857 umol，1當量)及DIEA (332 mg，2.57 mmol，448 uL，3當量)，且然後在20℃下攪拌2 h。在0℃下藉由添加H 2O (20 mL)淬滅反應混合物，且將其用EtOAc (20mL x 3)萃取。將經合併之有機層用鹽水(50 mL)洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物。藉由管柱層析(SiO2，MeOH/乙酸乙酯 ＝ 1/5)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之HxBz-38b (0.45 g，744.12 umol，86.84%產率)。  N-[3-[[2-胺基-8-[6-[(三級丁氧基羰基胺基)甲基] -3-吡啶基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基]胺甲酸環丁酯HxBz-38之製備
向HxBz-38b (0.45 g，744 umol，1當量)於MeCN (5 mL)及H 2O (5 mL)中之溶液中添加TFA (679 mg，5.95 mmol，441 uL，8當量)，且將其在80℃下攪拌0.5 h。在減壓下濃縮反應混合物以去除MeCN，且然後用MTBE (5mL)萃取以去除過量TFA。將水層濃縮，得到殘餘物，藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：10%-40%，8 min)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之HxBz-38 (0.4 g，646 umol，86.89%產率，TFA)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 8.99 (d, J ＝ 1.8 Hz, 1H), 8.20 (dd, J ＝ 2.4, 8.2 Hz, 1H), 7.80-7.66 (m, 3H), 7.59 (d, J ＝ 8.4 Hz, 1H), 7.10 (br s, 1H), 4.85-4.80 (m, 1H), 4.36 (s, 2H), 3.54 (br t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.47 (br s, 2H), 3.36 (br s, 2H), 3.13 (br s, 2H), 2.42-1.96 (m, 2H), 1.92-1.79 (m, 3H), 1.77-1.59 (m, 3H), 0.94 (br s, 3H)。LC/MS [M+H] 505.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 505.3 (觀測值)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4 -[3-(環丁氧基羰基胺基)丙基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]-2-吡啶基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-39a之製備
向HxBzL-39 (0.15 g，204 umol，1當量，2TFA)於THF (5 mL)中之溶液中添加Et 3N (62.1 mg，614 umol，85.49 uL，3當量)及3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-側氧基-3-(2,3,5,6-四氟苯氧基)丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(145 mg，205 umol，1當量)，且然後在0℃下攪拌2 h。藉由添加H 2O (5mL)淬滅反應混合物，且將混合物之pH用TFA調節至約6，且然後用EtOAc (10 ml)萃取且丟棄，將水相用DCM/PrOH＝3/1(20 mL x 3)進一步萃取，經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到呈黃色油狀之殘餘物HxBzL-39a (0.2 g，191 umol，93.46%產率)。 HxBzL-39之製備
向HxBzL-39a (0.2 g，191 umol，1當量)及2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯磺酸鈉(154 mg，574 umol，3當量)於DCM (2 mL)及DMA (1 mL)中之溶液中添加EDCI (110 mg，574 umol，3當量)，且然後在20℃下攪拌1 h。在減壓下濃縮反應混合物，以去除DCM，且過濾。藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：20%-40%, 8min)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之HxBzL-39 (0.08 g，62.83 umol，32.83%產率)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 9.03 (d, J ＝ 1.8 Hz, 1H), 8.61 (br d, J ＝ 8.4 Hz, 1H), 7.95 (d, J ＝ 8.4 Hz, 1H), 7.87-7.78 (m, 2H), 7.73 (br s, 1H), 7.11 (s, 1H), 4.73 (s, 3H), 3.85 (t, J ＝ 5.6 Hz, 2H), 3.80 (t, J ＝ 5.6 Hz, 2H), 3.67-3.50 (m, 38H), 3.64 (br s, 1H), 3.38 (br s, 2H), 3.13 (br s, 2H), 2.95 (t, J ＝ 5.6 Hz, 2H), 2.59 (t, J ＝ 5.6 Hz, 2H), 2.35-1.96 (m, 2H), 1.94-1.81 (m, 3H), 1.77-1.64 (m, 4H), 0.93 (br s, 3H)。LC/MS [M+H] 1273.5 (計算值)；LC/MS [M+H] 1273.7 (觀測值)。 實例L-40 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-1-[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]吡啶-2-羰基]吡咯啶-2-羰基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-40之合成
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Figure 02_image416
(2S)-1-(5-溴吡啶-2-羰基)吡咯啶-2-羧酸三級丁酯HxBzL-40a之製備
在0℃下在N 2下向5-溴吡啶-2-羧酸(2.00 g，9.90 mmol，1.0當量)、Et 3N (2.50 g，24.7 mmol，3.45 mL，2.5當量)及(2S)-吡咯啶-2-羧酸三級丁酯(2.06 g，9.90 mmol，1.0當量，HCl)於DMF (10 mL)中之混合物中一次性添加HATU (3.76 g，9.90 mmol，1.0當量)，將混合物在0℃下攪拌30 min，然後加熱至25℃且攪拌另外0.5小時。添加水(30 mL)且將水相用乙酸乙酯(30 mL*3)萃取，將經合併之有機相用鹽水(30 mL*1)洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且在真空中濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯＝20/1, 2/1)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之HxBzL-40a (3.40 g，9.57 mmol，96.6%產率)。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ8.65 (d, J ＝ 1.6 Hz, 1H), 7.96-7.92 (m, 2H), 5.03 (dd, J ＝ 3.2, 8.4 Hz, 1H), 3.91-3.85 (m, 2H), 2.33-2.28 (m, 2H), 2.18-2.12 (m, 2H), 1.55-1.48 (m, 9H)。 (2S)-1-[5-(4, 4, 5, 5-四甲基-1, 3, 2-二氧雜硼戊環-2-基)吡啶-2-羰基]吡咯啶-2-羧酸三級丁酯HxBzL-40b之製備
將HxBzL-40a (3.40 g，9.57 mmol，1.0當量)、4,4,5,5-四甲基-2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環-2-基)-1,3,2-二氧雜硼戊環(2.92 g，11.5 mmol，1.2當量)、Pd(dppf)Cl 2(700 mg，957 umol，0.1當量)及AcOK (2.35 g，23.9 mmol，2.5當量)於二噁烷(30 mL)中之溶液除氣且然後在N 2下加熱至100℃達3小時。將反應混合物在真空中濃縮，得到呈黑色油狀之HxBzL-40b (3.60 g，粗製物)，其不經純化即直接用於下一步驟中。 2-胺基-8-[6-[(2S)-2-三級丁氧基羰基吡咯啶-1-羰基]-3-吡啶基]-3H-1-苯并氮呯-4-羧酸乙酯HxBzL-40c之製備
將HxBzL-40b (3.60 g，8.95 mmol，1.0當量)、2-胺基-8-溴-3H-1-苯并氮呯-4 -羧酸乙酯(2.77 g，8.95 mmol，1.0當量)、Pd(dppf)Cl 2(655 mg，895 umol，0.1當量)及K 3PO 4(3.80 g，17.9 mmol，2.0當量)於二噁烷(45 mL)及H 2O (5 mL)中之溶液除氣且然後在N 2下加熱至95℃達2小時。去除二噁烷(45 mL)且將水相用乙酸乙酯(30 mL*3)萃取，將經合併之有機相用鹽水(30 mL*1)洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且在真空中濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯＝10/1, 0/1)純化殘餘物，得到呈淡黃色固體狀之HxBzL-40c (1.60 g，3.17 mmol，35.4%產率)。 2-胺基-8-[6-[(2S)-2-三級丁氧基羰基吡咯啶-1-羰基]-3-吡啶基]-3H-1-苯并氮呯-4-羧酸HxBzL-40d之製備
在25℃下在N 2下向HxBzL-40c (1.60 g，3.17 mmol，1.0當量)於MeOH (10 mL)及H 2O (5 mL)中之溶液中一次性添加LiOH • H 2O (399 mg，9.51 mmol，3.0當量)，且將其在25℃下攪拌10小時。將反應混合物用HCl (4 M)淬滅，直到pH＝7，然後去除MeOH (10 mL)且過濾出沉澱，將其乾燥，得到呈白色固體狀之HxBzL-40d (1.10 g，2.31 mmol，72.8%產率)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ8.86 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 8.32-8.26 (m, 1H), 8.01 (d, J ＝ 8.4 Hz, 1H), 7.95-7.65 (m, 5H), 5.04-5.01 (m, 1H), 3.79-3.82 (m, 2H), 3.52 (s, 2H), 2.36-2.27 (m, 1H), 2.03-1.94 (m, 1H), 1.89-1.77 (m, 2H), 1.45-1.23 (m, 9H)。 (2S)-1-[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]吡啶-2-羰基]吡咯啶-2-羧酸三級丁酯HxBzL-40e之製備
在25℃下在N 2下向HxBzL-40d (200 mg，420 umol，1.0當量)及N-乙氧基丙-1-胺(64.5 mg，462 umol，1.1當量，HCl)於DCM (4 mL)及DMA (2 mL)中之混合物中一次性添加EDCI (322 mg，1.68 mmol，4.0當量)，且然後在25℃下攪拌1小時。去除DCM (4 mL)且添加水(8 mL)，然後將水相之pH用飽和NaHCO 3調節至約8，用乙酸乙酯(5 mL*3)萃取，將經合併之有機相用鹽水(5 mL*1)洗滌，用無水Na 2SO 4乾燥，過濾且在真空中濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯＝10/1, 0/1至乙酸乙酯/甲醇＝10/1)純化殘餘物，得到呈棕色油狀之HxBzL-40e (200 mg，356 umol，84.8%產率)。 (2S)-1-[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基] 吡啶-2-羰基]吡咯啶-2-羧酸HxBzL-40f之製備
在25℃下在N 2下向HxBzL-40e (200 mg，356 umol，1.0當量)於MeCN (1 mL)及H 2O (2 mL)中之溶液中一次性添加HCl (12 M, 890 uL，30當量)，將混合物在80℃下攪拌1小時，在真空中濃縮反應混合物，得到呈黃色油狀之HxBzL-40f (175 mg，346 umol，97.2%產率)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-1-[5-[2-胺基-4-[乙氧基 (丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]吡啶-2-羰基]吡咯啶-2-羰基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯HxBzL-40g之製備
在0℃下在N 2下向 HxBzL-40f (175 mg，346 umol，1.0當量)、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯(203 mg，346 umol，1.0當量)及Et 3N (105 mg，1.04 mmol，145 uL，3.0當量)於DMF (2 mL)中之混合物中一次性添加HATU (132 mg，346 umol，1.0當量)，且將其在0℃下攪拌30 min，然後加熱至25℃且攪拌另外0.5小時。將反應混合物過濾且藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex luna C18 250*50mm*10 um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：20%-50%,10min)純化濾液，得到呈淡黃色油狀之HxBzL-40g (150 mg，126 umol，36.5%產率，TFA)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-1-[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基) 胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]吡啶-2-羰基]吡咯啶-2-羰基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-40h之製備
在25℃下在N 2下向HxBzL-40g (150 mg，140 umol，1.0當量)於MeCN (0.2 mL)及H 2O (2 mL)中之溶液中一次性添加HCl (12 M, 349 uL，30當量)，且然後在80℃下攪拌1小時。在真空中濃縮反應混合物，以去除CH 3CN，且將水相冷凍乾燥，得到呈棕色油狀之HxBzL-40h (140 mg，137.64 umol，98.48%產率)。 HxBzL-40之製備
在20℃下在N 2下向HxBzL-40h (140 mg，138 umol，1.0當量)及(2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯基)磺醯基氧基鈉(185 mg，688 umol，5.0當量)於DCM (1.5 mL)及DMA (0.5 mL)中之混合物中一次性添加EDCI (132 mg，688 umol，5.0當量)，且然後在20℃下攪拌1小時。將反應混合物過濾且藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：10%-40%, 8min)純化濾液，得到呈淡黃色油狀之HxBzL-40 (46.3 mg，35.5 umol，25.8%產率，95.5%純度)。 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ8.96 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 8.28 (dd, J ＝ 2.4, 8.4 Hz, 1H), 8.01 (d, J ＝ 8.4 Hz, 1H), 7.84 (s, 2H), 7.82 (d, J ＝ 1.6 Hz, 1H), 7.48 (s, 1H), 5.16 (dd, J ＝ 4.4, 8.0 Hz, 1H), 4.00 (q, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.90-3.84 (m, 3H), 3.77 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.68-3.56 (m, 36H), 3.53-3.43 (m, 6H), 3.22-3.14 (m, 2H), 3.01-2.96 (m, 2H), 2.42-2.35 (m, 1H), 2.13-1.96 (m, 3H), 1.85-1.75 (m, 2H), 1.23 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 1.03 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 1245.5 (計算值)；LC/MS [M+H] 1245.4 (觀測值)。 實例L-42 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2R)-1-[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-羰基]吡咯啶-2-羰基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-42之合成
Figure 02_image418
Figure 02_image420
Figure 02_image422
(R)-1-(5-溴嘧啶-2-羰基)吡咯啶-2-羧酸三級丁酯HxBzL-42b之製備
在0℃下向5-溴嘧啶-2-羧酸HxBzL-42a (200 mg，985 umol，1當量)於DMF (3 mL)中之溶液中添加DIEA (509 mg，3.94 mmol，686 uL，4當量)及HATU (412 mg，1.08 mmol，1.1當量)且然後攪拌10 min，將(2S)-吡咯啶-2-羧酸三級丁酯(186 mg，1.08 mmol，1.1當量)添加到混合物中且將其在25℃下攪拌另外3 h。將反應混合物用水20 mL稀釋且用EtOAc (20 mL x 3)萃取。將經合併之有機層用鹽水(20 mL x 2)洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物。藉由管柱層析(SiO 2，石油醚/乙酸乙酯＝50/1至1/1)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之HxBzL-42b (200 mg，561 umol，56.99%產率)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.18-9.10 (m, 2H), 4.70-4.41 (m, 1H), 3.75-3.48 (m, 2H), 2.42-1.87 (m, 4H), 1.56-1.30 (m, 9H) (R)-1-(5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環-2-基)嘧啶-2-羰基)吡咯啶-2-羧酸三級丁酯HxBzL-42c之製備
在N 2保護下向HxBzL-42b (200 mg，561 umol，1當量)及Pin 2B 2(214 mg，842 umol，1.5當量)於二噁烷(5 mL)中之溶液中添加KOAc (110 mg，1.12 mmol，2當量)及Pd(dppf)Cl 2(41.1 mg，56.2 umol，0.1當量)，且然後在90℃下攪拌2 h. 過濾混合物且在減壓下濃縮。呈棕色固體狀獲得之粗產物HxBzL-42c (230 mg，粗製物)不經進一步純化即用於下一步驟中。 (R)-1-(5-(2-胺基-4-(乙氧基(丙基)胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基)嘧啶-2-羰基)吡咯啶-2-羧酸三級丁酯HxBzL-42d之製備
在N 2保護下向HxBzL-42c (230 mg，570 umol，1當量)及2-胺基-8-溴-N-乙氧基-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺(209 mg，570 umol，1當量)於二噁烷(5 mL)中之溶液中添加K 2CO 3(158 mg，1.14 mmol，2當量)於水(0.2 mL)及Pd(dppf)Cl 2(41.7 mg，57 umol，0.1當量)中之溶液，且然後在90℃下攪拌16 h。過濾混合物且在減壓下濃縮。藉由管柱層析(SiO 2，石油醚/乙酸乙酯＝50/1至乙酸乙酯: MeOH ＝5:1)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之HxBzL-42d (240 mg，427 umol，74.8%產率)。 (R)-1-(5-(2-胺基-4-(乙氧基(丙基)胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基)嘧啶-2-羰基)吡咯啶-2-羧酸HxBzL-42e之製備
向HxBzL-42d (240 mg，427 umol，1當量)於H 2O (5 mL)及MeCN (2 mL)中之溶液中添加HCl (12 M, 355 uL，10當量)，且然後在80℃下攪拌1 h。過濾混合物且在減壓下濃縮，獲得呈黃色油狀之HxBzL-42e (170 mg，336 umol，78.7%產率)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2R)-1-[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-羰基]吡咯啶-2-羰基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯HxBzL-42f之製備
在0℃下向3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯(167 mg，284 umol，1.2當量)及HxBzL-42e (120 mg，237 umol，1當量)及DIEA (91.9 mg，711 umol，124 uL，3當量)於DMF (2 mL)中之溶液中添加HATU (90.1 mg，237 umol，1當量)，且將其在0℃下攪拌2 h。將混合物過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物。藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：20%-45%,8min)純化殘餘物，得到呈淡黃色油狀之HxBzL-42f (120 mg，112 umol，47.2 %產率)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2R)-1-[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-羰基]吡咯啶-2-羰基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-42g之製備
向HxBzL-42f (115 mg，107 umol，1當量)於H 2O (3 mL)中之混合物中添加HCl (12 M, 89.2 uL，10當量)，且然後在80℃下攪拌1 h。將混合物過濾且在減壓下濃縮，得到呈無色油狀之HxBzL-42g (105 mg，103 umol，96.3%產率)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ9.39-9.04 (m, 2H), 7.88-7.80 (m, 2H), 7.78-7.74 (m, 1H), 7.48 (d, J ＝ 3.0 Hz, 1H), 4.90-4.62 (m, 1H), 4.03-3.95 (m, 2H), 3.92-3.80 (m, 2H), 3.76 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.72-3.67 (m, 2H), 3.66-3.57 (m, 38H), 3.48-3.38 (m, 4H), 3.29-3.11 (m, 2H), 2.47 (dt, J ＝ 2.8, 6.2 Hz, 2H), 2.15-1.98 (m, 4H), 1.84-1.73 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.22 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 1.01 (t, J ＝ 7.4 Hz, 3H) HxBzL-42之製備
向HxBzL-42g (105 mg，103 umol，1當量)及2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯磺酸鈉(111 mg，413 umol，4當量)於DCM (2 mL)及DMA (0.5 mL)中之溶液中添加EDCI (79.1 mg，413 umol，4當量)，且然後在20℃下攪拌1 h。將混合物過濾且在減壓下濃縮。藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：10%-40%,8min)純化殘餘物，得到呈淡黃色油狀之HxBzL-42 (60.0 mg，44.1 umol，42.8%產率，TFA)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ9.27-9.21 (m, 2H), 7.89-7.81 (m, 2H), 7.77-7.72 (m, 1H), 7.48-7.44 (m, 1H), 5.05-4.62 (m, 1H), 3.99 (q, J ＝ 7.0 Hz, 2H), 3.89-3.83 (m, 4H), 3.76 (br t, J ＝ 7.0 Hz, 2H), 3.66-3.53 (m, 36H), 3.50-3.42 (m, 4H), 3.28-3.20 (m, 2H), 3.16-3.05 (m, 1H), 2.99-2.94 (m, 2H), 2.46-2.26 (m, 1H), 2.12-1.97 (m, 3H), 1.82-1.74 (m, 2H), 1.21 (dt, J ＝ 1.8, 7.2 Hz, 3H), 1.04-0.98 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 1246.5 (計算值)；LC/MS [M+H] 1246.4 (觀測值)。 實例L-43 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2R)-1-[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]吡啶-2-羰基]吡咯啶-2-羰基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-43之合成
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Figure 02_image426
(2R)-1-(5-溴吡啶-2-羰基)吡咯啶 -2-羧酸三級丁酯HxBzL-43b之製備
向5-溴吡啶-2-羧酸HxBzL-43a (2.19 g，10.8 mmol，1當量)於DMF (50 mL)中之混合物中添加HATU (4.53 g，11.9 mmol，1.1當量)及Et 3N (3.29 g，32.5 mmol，4.52 mL，3當量)，然後添加(2R)-吡咯啶-2-羧酸三級丁酯(2.25 g，10.8 mmol，1當量，HCl)。將混合物在20℃下攪拌0.5 h。將反應混合物分配在EtOAc(150 mL)與水(100 mL)之間。將有機層分離，經Na 2SO 4乾燥，濃縮，得到殘餘物。藉由管柱層析(SiO 2，石油醚/乙酸乙酯＝1/0至2/1)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之HxBzL-43b (3.8 g，10.7 mmol，98.8%產率)。 1H NMR (400MHz, MeOD) δ8.76-8.61 (m, 1H), 8.17-8.13 (m, 1H), 7.91-7.74 (m, 1H), 5.07-4.51 (m, 1H), 3.96-3.67 (m, 2H), 2.43-2.27 (m, 1H), 2.18-1.90 (m, 3H), 1.51 (s, 3H), 1.37 (s, 6H)。 (2R)-1-[5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環-2-基)吡啶-2-羰基]吡咯啶-2-羧酸三級丁酯HxBzL-43c之製備
向tert HxBzL-43b (3.5 g，9.85 mmol，1當量)、4,4,5,5-四甲基-2-(4,4,5,5-四甲基 -1,3,2-二氧雜硼戊環-2-基)-1,3,2-二氧雜硼戊環、Pin2B2雙(頻哪醇)二硼(CAS登記號78183-34-3) (3.75 g，14.8 mmol，1.5當量)、KOAc (2.42 g，24.6 mmol，2.5當量)於二噁烷(80 mL)中之混合物中添加Pd(dppf)Cl 2(721 mg，985 umol，0.1當量)，且然後在100℃下攪拌2 h。混合物無需處理及純化即用於下一步驟。獲得呈黑色液體之HxBzL-43c (3.96 g，9.84 mmol，100.00%產率)。 2-胺基-8-[6-[(2R)-2-三級丁氧基羰基吡咯啶-1-羰基]-3-吡啶基]-3H-1-苯并氮呯-4-羧酸乙酯HxBzL-43d之製備
將HxBzL-43c (3.96 g，9.84 mmol，1當量)、2-胺基-8-溴-3H-1-苯并氮呯-4-羧酸乙酯(3.04 g，9.84 mmol，1當量)、Pd(dppf)Cl 2(360 mg，492 umol，0.05當量)及K 2CO 3(3.40 g，24.6 mmol，2.5當量)於二噁烷(100 mL)及H 2O (8 mL)中之混合物在100℃下攪拌2 h。將反應混合物濃縮，得到殘餘物。將殘餘物溶解於EtOAc (100 mL)中且藉由水(50 mL)洗滌。將有機相分離，經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物。藉由管柱層析(SiO 2，石油醚/乙酸乙酯＝1/0至0/1，EA:MeOH ＝ 5:1)純化粗製物，得到呈黃色固體狀之HxBzL-43d (4 g，7.93 mmol，80.5%產率)。 1H NMR (400MHz, MeOD) δ9.07-8.72 (m, 1H), 8.29-8.16 (m, 1H), 8.12-7.78 (m, 2H), 7.62-7.40 (m, 3H), 5.17-4.47 (m, 1H), 4.34 (q, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 4.04-3.75 (m, 2H), 3.67-2.94 (m, 2H), 2.49-2.27 (m, 1H), 2.22-1.88 (m, 3H), 1.53 (s, 3H), 1.43-1.34 (m, 9H)。 2-胺基-8-[6-[(2R)-2-三級丁氧基羰基 吡咯啶-1-羰基]-3-吡啶基]-3H-1-苯并氮呯-4-羧酸HxBzL-43e之製備
向HxBzL-43d (3.5 g，6.94 mmol，1當量)於THF (20 mL)及H 2O (40 mL)中之混合物中添加LiOH.H 2O (582 mg，13.9 mmol，2當量)，且然後在20℃下攪拌3 h。將混合物濃縮，以去除THF，然後將混合物之pH用HCl (4M)調節至約5，且所形成之固體形成混合物。過濾混合物，且在真空中乾燥所過濾之餅，獲得呈白色固體之HxBzL-43e (3.3 g，6.93 mmol，99.8%產率)。 (2R)-1-[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基) 胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]吡啶-2-羰基]吡咯啶-2-羧酸三級丁酯HxBzL-43f之製備
向HxBzL-43e (0.4 g，839 umol，1當量)及N-乙氧基丙-1-胺(117 mg，839 umol，1當量，HCl)於DCM (5 mL)及DMA (5 mL)中之混合物中添加EDCI (483 mg，2.52 mmol，3當量)，且然後在20℃下攪拌1 h。將反應混合物濃縮以去除DCM，將殘餘物分配於EtOAc (20 mL)與水(20 mL)之間。將有機相分離，經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物。藉由管柱層析(SiO 2，石油醚/乙酸乙酯＝ 1/0至0/1，EA:MeOH ＝ 5:1 )純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之HxBzL-43f (0.32 g，570 umol，67.9%產率)。 1H NMR (400MHz, MeOD) δ9.06-8.77 (m, 1H), 8.26-8.17 (m, 1H), 8.07-7.87 (m, 1H), 7.53- 7.36 (m, 3H), 7.30 (s, 1H), 5.17-4.50 (m, 1H), 4.01-3.69 (m, 6H), 3.01-2.88 (m, 2H), 2.45- 2.30 (m, 1H), 2.18-2.03 (m, 2H), 2.02-1.94 (m, 1H), 1.82-1.73 (m, 2H), 1.52 (s, 3H), 1.36 (s, 6H), 1.18 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 1.00 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。 (2R)-1-[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]吡啶-2-羰基]吡咯啶-2-羧酸HxBzL-43g之製備
向HxBzL-43f (260 mg，463 umol，1當量)於H 2O (5 mL)中之混合物中添加HCl (12 M，579 uL，15當量)，且然後在80℃下攪拌1 h。將混合物濃縮，得到呈黃色油狀之HxBzL-43g (0.25 g，461 umol，99.6%產率，HCl)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2R)-1-[5-[2-胺基-4-[乙氧基 (丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]吡啶-2-羰基]吡咯啶-2-羰基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯HxBzL-43h之製備
在0℃下向HxBzL-43g (200 mg，369 umol，1當量，HCl)及3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯(216 mg，369 umol，1當量)於DMF (5 mL)中之混合物中添加HATU (154 mg，406 umol，1.1當量)及DIEA (143 mg，1.11 mmol，193 uL，3當量)，且將其在0℃下攪拌1 h。將混合物濃縮，得到殘餘物。藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：25%-51%,8min)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之HxBzL-43h (340 mg，286 umol，77.6%產率，TFA)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[(2R)-1-[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]吡啶-2-羰基]吡咯啶-2-羰基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-43i之製備
向HxBzL-43h (340 mg，286 umol，1當量，TFA)於H 2O (20 mL)中之混合物中添加HCl (12 M, 358 uL，15當量)，且然後在80℃下攪拌0.5 h。將殘餘物濃縮至殘餘物。藉由製備型HPLC(管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：10%-40%,8min)純化粗製物，得到呈黃色油狀之HxBzL-43i (220 mg，209 umol，72.9%產率，HCl)。 HxBzL-43之製備
向HxBzL-43i (180 mg，171 umol，1當量，HCl)及2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯磺酸鈉(183 mg，683 umol，4當量)於DMA (0.3 mL)及DCM (3 mL)中之混合物中添加EDCI (164 mg，854 umol，5當量)，且將其在15℃下攪拌0.5 h。將殘餘物濃縮至殘餘物。藉由製備型HPLC(管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：15%-45%,8min)純化殘餘物，得到呈無色油狀之HxBzL-43 (94 mg，72.6 umol，42.5%產率，96.2%純度)。 1H NMR (400MHz, MeOD) δ9.10-8.85 (m, 1H), 8.43-8.16 (m, 1H), 8.11-7.94 (m, 1H), 7.91- 7.71 (m, 3H), 7.48 (s, 1H), 5.18-4.65 (m, 1H), 4.07-3.72 (m, 8H), 3.69-3.39 (m, 40H), 3.30- 3.13 (m, 2H), 3.00-2.97 (m, 2H), 2.59-2.23 (m, 1H), 2.19-1.66 (m, 5H), 1.25-1.21 (m, 3H), 1.05-1.00 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 1245.5 (計算值)；LC/MS [M+H] 1245.4 (觀測值)。 實例L-44 2-胺基-8-(2-(38-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,37-二側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十氧雜-2,36-二氮雜三十八烷基)嘧啶-5-基)-N-乙氧基-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺HxBzL-44之合成
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將2-胺基-8-(2-(胺基甲基)嘧啶-5-基)-N-乙氧基-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺HxBz-5 (0.0283 g，0.072 mmol，1當量)及1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十氧雜-3-氮雜三十六-36-烷酸HxBzL-44a (0.0478 g，0.072 mmol，1當量)溶解於二甲基甲醯胺DMF中。添加二異丙基乙胺DIPEA (0.075 mol, 0.43 mmol，6當量)，隨後添加((7-氮雜苯并三唑-1-基氧基)三吡咯啶鏻六氟磷酸酯)PyAOP(CAS登記號156311-83-0) (0.091 g，0.18 mmol，2.4當量)。將反應物在室溫下攪拌，然後濃縮且藉由RP-HPLC純化，得到HxBzL-44 (0.0346 g，0.033 mmol，46%)。LC/MS [M+H] 1043.53 (計算值)；LC/MS [M+H] 1043.84 (觀測值)。 實例L-47 (2,3,5,6-四氟苯基) 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[丙基(1H-吡唑-5-基甲氧基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸酯HxBzL-47之合成
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5-(氯甲基)-1H-吡唑HxBz-41b之製備
向1H-吡唑-5-基甲醇HxBz-41a (4 g，40.8 mmol，1當量)於DCM (10 mL)中之溶液中添加亞硫醯氯SOCl 2(9.70 g，81.55 mmol，5.92 mL，2當量)，且然後在0℃至20℃下攪拌2 h。在減壓下濃縮反應混合物，得到呈白色固體狀之HxBz-41b (4.5 g，38.6 mmol，94.70%產率)。LC/MS [M+H] 117.0 (計算值)；LC/MS [M+H] 117.0 (觀測值)。 N-丙基-N-(1H-吡唑-5-基甲氧基)胺甲酸三級丁酯HxBz-41c之製備
在0℃下向HxBz-41b (3.01 g，17.2 mmol，1當量)於DMF (20 mL)中之溶液中添加NaH (1.03 g，25.7 mmol，60%純度，1.5當量)，將混合物在此溫度下攪拌0.5 h，然後添加KI (285 mg，1.72 mmol，0.1當量)及5-(氯甲基)-1H-吡唑(2 g，17.16 mmol，1當量)。將所得混合物在20℃下攪拌12 h。在0℃下藉由添加NH 4Cl 20 mL淬滅反應混合物，且將其用EtOAc (20mL x 3)萃取。將經合併之有機層用鹽水(50 mL)洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物。藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex luna C18 (250*70mm，15 um)；流動相：[水(0.1%TFA) -ACN]；B%：20%-45%，20 min)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之HxBz-41c (0.6 g，2.35 mmol，13.69%產率)。LC/MS [M+H] 256.1 (計算值)；LC/MS [M+H] 256.1 (觀測值)。 N-(1H-吡唑-5-基甲氧基)丙-1-胺HxBz-41d之製備
向HxBz-41c (0.5 g，1.96 mmol，1當量)於MeCN (2 mL)及H 2O (2 mL)中之溶液中添加TFA (2.23 g，19.58 mmol，1.45 mL，10當量)，且然後在80℃下攪拌1 h。將反應混合物在減壓下濃縮以去除MeCN。將水相用MTBE 20 mL萃取，以去除過量TFA。將水層凍乾，得到呈黃色油狀之HxBz-41d (0.25 g，粗製物，TFA)。 1H NMR (MeOH, 400 MHz) δ 7.10 (d, J ＝ 2.4 Hz, 1H), 6.47 (d, J ＝ 2.4 Hz, 1H), 5.13 (s, 2H), 3.30-3.20 (m, 2H), 1.78-1.71 (m, 2H), 1.02 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H)。LC/MS [M+H] 156.1 (計算值)；LC/MS [M+H] 156.1 (觀測值)。 N-[[5-[2-胺基-4-[丙基(1H-吡唑-5-基甲氧基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基]胺甲酸三級丁酯HxBz-41f之製備
向HxBz-41d (0.2 g，743 umol，1當量，TFA鹽)及2-胺基-8-[2-[(三級丁氧基羰基胺基)甲基]嘧啶-5-基]-3H-1-苯并氮呯-4-羧酸HxBz-41e (304 mg，743 umol，1當量)於DCM (2 mL)及DMA (1 mL)中之溶液中添加EDCI (854 mg，4.46 mmol，6當量)，且然後在20℃下攪拌2 h。將混合物用NaHCO 3淬滅以調節pH ＝約8，且然後用EtOAc (30 mL x 4)萃取。將經合併之有機層用鹽水(30 mL)洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物。藉由管柱層析(SiO 2，MeOH /乙酸乙酯＝1/5)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之HxBz-41f (0.35 g，640.30 umol，86.19%產率)。LC/MS [M+H] 547.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 547.3 (觀測值)。 2-胺基-8-[2-(胺基甲基)嘧啶-5-基]-N-丙基-N-(1H-吡唑-5-基甲氧基)-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺HxBz-41之製備
向HxBz-41f (0.35 g，640 umol，1當量)於MeCN (2 mL)及H 2O (2 mL)中之溶液中添加TFA (584 mg，5.12 mmol，379 uL，8當量)，且然後在80℃下攪拌1 h。將反應混合物在減壓下濃縮，得到殘餘物。藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA) -ACN]；B%：1%-25%, 8min)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之HxBz-41 (0.25 g，371 umol，57.88%產率，2TFA)。 1H NMR (MeOH, 400 MHz) δ 9.20 (s, 2H), 7.82-7.78 (m, 1H), 7.74 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 7.69 (d, J ＝ 8.4 Hz, 1H), 7.55 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 7.26 (s, 1H), 6.31 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 4.96 (s, 2H), 4.48 (s, 2H), 3.80 (t, J ＝ 7.4 Hz, 2H), 3.26 (s, 2H), 1.88-1.73 (m, 2H), 1.01 (t, J ＝ 7.4 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 447.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 447.2 (觀測值)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[丙基(1H-吡唑-5-基甲氧基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯HxBzL-47a之製備
向HxBz-41 (0.2 g，296 umol，1當量，2TFA)於THF (10mL)中之溶液中添加Et 3N (90.0 mg，889 umol，124 uL，3當量)及(2,3,5,6-四氟苯基)3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(3-三級丁氧基-3-側氧基-丙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸酯t-Bu-COO-PEG10-COOTFP (226 mg，296 umol，1當量)，且然後在0℃下攪拌2 h。藉由添加H 2O 5 mL淬滅反應混合物，且在0℃下將混合物之pH用TFA調節至約6，將水相用EtOAc (10 ml *2)萃取，以去除副產物，且將水相用DCM/PrOH ＝ 10/1(20 mL x 3)進一步萃取，將經合併之有機相經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到呈黃色油狀之化合物HxBzL-47a。LC/MS [M+H] 1043.56 (計算值)；LC/MS [M+H] 1043.6 (觀測值)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[丙基(1H-吡唑-5-基甲氧基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-47b之製備
向HxBzL-47a (0.2 g，192 umol，1當量)於MeCN (2 mL)及H 2O (2 mL)中之溶液中添加HCl (12 M, 320 uL，20當量)，且然後在80℃下攪拌2 h。將反應混合物在減壓下濃縮，得到殘餘物。藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA) -ACN]；B%：5%-35%, 8min)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之HxBzL-47b (0.13 g，132 umol，68.69%產率)。LC/MS [M+H] 987.5 (計算值)；LC/MS [M+H] 987.6 (觀測值)。 HxBzL-47之製備
向HxBzL-47b (0.1 g，101 umol，1當量)及2,3,5,6-四氟苯酚(67.3 mg，405 umol，4當量)於DCM (1 mL)及DMA (1 mL)中之溶液中添加EDCI (77.7 mg，405 umol，4當量)，且然後在20℃下攪拌1 h。將反應混合物過濾。藉由製備型HPLC (管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA) -ACN]；B%：20%-40%, 8min)純化殘餘物，得到呈淡黃色固體狀之HxBzL-47 (0.0216 g，19.0 umol，18.78%產率)。 1H NMR (MeOH, 400 MHz) δ 9.10 (s, 2H), 7.78 (dd, J ＝ 1.6, 8.0 Hz, 1H), 7.71-7.66 (m, 2H), 7.57 (d, J ＝ 2.4 Hz, 1H), 7.48-7.37 (m, 1H), 7.26 (s, 1H), 7.28-7.24 (m, 1H),6.31 (d, J ＝ 2.4 Hz, 1H), 4.96 (s, 2H), 4.69 (s, 2H), 3.86 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 3.83-3.76 (m, 4H), 3.68-3.55 (m, 36H), 3.26 (s, 2H), 3.02-2.91 (m, 2H), 2.60 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 1.80 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 1.01 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H). LC/MS [M+H] 1135.5 (計算值)；LC/MS [M+H] 1135.6 (觀測值)。 實例L-52 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[3-(環丁基胺甲醯基氧基)丙基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-52之合成
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N-[[5-[2-胺基-4-[3-(環丁基胺甲醯基氧基)丙基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基]胺甲酸三級丁酯HxBz-45b之製備
在0℃下向2-胺基-8-[2-[(三級丁氧基羰基胺基)甲基]嘧啶-5-基]-3H-1-苯并氮呯-4-羧酸HxBz-45a (180 mg，440 umol，1當量)於DMF (3 mL)中之溶液中添加HATU (167 mg，440 umol，1當量)及DIPEA (284 mg，2.20 mmol，383 uL，5當量)。在添加後，將混合物在此溫度下攪拌5 min，且然後在0℃下添加N-環丁基胺甲酸3-(丙基胺基)丙基酯(110 mg，440 umol，1當量，HCl)。將所得混合物在20℃下攪拌25 min。在0℃下藉由添加H 2O (15 mL)淬滅反應混合物且然後用EtOAc (10 mL x 3)淬滅。將經合併之有機層用鹽水(5 mL x 3)洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。藉由製備型HPLC (TFA條件：管柱：Phenomenex luna C18 250*50mm*10 um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：25%-55%,10min)純化殘餘物，獲得呈黃色油狀之HxBz-45b (0.15 g，208 umol，47.4%產率，TFA)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ9.07 (s, 2H), 7.86-7.65 (m, 3H), 7.13 (s, 1H), 4.53 (s, 2H), 4.09-4.06 (m, 3H), 3.63-3.56 (m, 2H), 3.51-3.45 (m, 2H), 3.36 (br s, 2H), 2.25-2.21 (m, 2H), 2.04-1.87 (m, 4H), 1.78-1.61 (m, 4H), 1.48 (s, 9H), 0.98-0.94 (m, 3H)。 3-[[2-胺基-8-[2-(胺基甲基)嘧啶-5-基]-3H-1-苯并氮呯-4-羰基]-丙基-胺基]丙基N-環丁基胺甲酸酯HxBz-45之製備
向HxBz-45b (0.15 g，208 umol，1當量，TFA)於EtOAc (1 mL)中之溶液中添加HCl/EtOAc (4 M, 10 mL，192當量)，且然後在15℃下攪拌0.5 h。在減壓下濃縮反應混合物，得到呈黃色固體狀之HxBz-45 (135 mg，粗製物，2HCl)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ9.21 (s, 2H), 7.88-7.71 (m, 3H), 7.13 (s, 1H), 4.48 (s, 2H), 4.16-3.97 (m, 3H), 3.62-3.58 (m, 2H), 3.51-3.45 (m, 2H), 3.38 (br s, 2H), 2.26-2.20 (m, 2H), 2.04-1.85 (m, 4H), 1.75-1.53 (m, 4H), 1.01-0.89 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 506.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 506.3 (觀測值)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[3-(環丁基胺甲醯基氧基)丙基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯HxBzL-52a之製備
在0℃下向HxBz-45 (75 mg，130 umol，1當量，2HCl)於DMF (1 mL)中之溶液中添加三乙胺Et 3N TEA (39.4 mg，389 umol，54.1 uL，3當量)及(2,3,5,6-四氟苯基) 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(3-三級丁氧基-3-側氧基-丙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸酯 (98.9 mg，130 umol，1當量)。將混合物在15℃下攪拌1 h。在0℃下將反應混合物之pH用TFA調節至約6，且然後在減壓下濃縮。藉由製備型HPLC (TFA條件：管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：25%-55%,8min)純化殘餘物，獲得呈淡黃色油狀之HxBzL-52a (0.13 g，107 umol，82.4%產率，TFA)。LC/MS [M+H] 1102.6 (計算值)；LC/MS [M+H] 1102.6 (觀測值)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[3-(環丁基胺甲醯基氧基)丙基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-52b之製備
向HxBzL-52a (0.13 g，107 umol，1當量，TFA)於CH 3CN (1 mL)及H 2O (5 mL)中之溶液中添加TFA (97.5 mg，855 umol，63.3 uL，8當量)，且然後在80℃下攪拌1 h。將反應混合物在減壓下濃縮以移除CH 3CN。將水相用MTBE (5 mL x 3)萃取且丟棄。在減壓下濃縮水相，得到呈淡黃色油狀之HxBzL-52b (0.14 g，粗製物，TFA)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ9.09 (s, 2H), 7.85-7.78 (m, 1H), 7.77-7.69 (m, 2H), 7.13 (s, 1H), 4.69 (s, 2H), 4.09-4.05 (m, 2H), 3.80 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 3.76-3.69 (m, 3H), 3.66-3.58 (m, 38H), 3.50-3.45 (m, 2H), 3.37 (br s, 2H), 2.60 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 2.56-2.51 (m, 2H), 2.35-2.07 (m, 2H), 2.06-1.81 (m, 4H), 1.75-1.66 (m, 4H), 0.98-0.91 (m, 3H) HxBzL-52之製備
向HxBzL-52b (0.13 g，112 umol，1當量，TFA)於DCM (2 mL)及DMA (0.2 mL)中之溶液中添加(2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯基)磺醯基氧基鈉(90.1 mg，336 umol，3當量)及EDCI (85.9 mg，448 umol，4當量)，且然後在15℃下攪拌1 h。在減壓下濃縮反應混合物，以去除DCM，且過濾。藉由製備型HPLC (TFA條件：管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：15%-40%,8min)純化殘餘物，獲得呈淡黃色油狀之HxBzL-52 (32.3 mg，25.4 umol，22.6%產率)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ9.08 (s, 2H), 7.83-7.67 (m, 3H), 7.11 (s, 1H), 4.69 (s, 2H), 4.09-4.05 (m, 2H), 3.86 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 3.80 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 3.70-3.55 (m, 36H), 3.51-3.45 (m, 3H), 3.38 (br s, 2H), 3.32 (br s, 2H), 2.97 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 2.60 (t, J ＝ 5.6 Hz, 2H), 2.25-2.20 (m, 2H), 2.07-1.84 (m, 4H), 1.80-1.54 (m, 4H), 1.10-0.82 (m, 3H). LC/MS [M+H] 1274.5 (計算值)；LC/MS [M+H] 1274.7 (觀測值)。 實例L-53 (2,3,5,6-四氟苯基) 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]-3-吡啶基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸酯HxBzL-53之合成
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((5-溴吡啶-3-基)甲基)胺甲酸三級丁酯HxBz-39b之製備
在0℃下向(5-溴-3-吡啶基)甲胺HxBz-39a (1 g，5.35 mmol，1當量)及TEA (649 mg，6.42 mmol，893 uL，1.2當量)於MeOH (10 mL)中之溶液中添加Boc 2O (1.40 g，6.42 mmol，1.47 mL，1.2當量)，且然後在25℃下攪拌2 h。在減壓下濃縮混合物。藉由管柱層析(SiO 2，石油醚/乙酸乙酯＝50/1至1/1)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之HxBz-39b (1.5 g，5.22 mmol，97.7%產率)。 ((5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環-2-基)吡啶-3-基)甲基)胺甲酸三級丁酯HxBz-39c之製備
在N 2下向HxBz-39b (750 mg，2.61 mmol，1當量)及Pin 2B 2(995 mg，3.92 mmol，1.5當量)於二噁烷(10 mL)中之溶液中添加KOAc (513 mg，5.22 mmol，2當量)及Pd(dppf)Cl 2(191 mg，262 umol，0.1當量)，且然後在90℃下攪拌2 h。將混合物過濾且在減壓下濃縮，得到呈棕色油狀之HxBz-39c (800 mg，2.39 mmol，91.7%產率)，其不經進一步純化即用於下一步驟中。 ((5-(2-胺基-4-(乙氧基(丙基)胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基)吡啶-3-基)甲基)胺甲酸三級丁酯HxBz-39d之製備
在N 2保護下向HxBz-39c (800 mg，2.39 mmol，1當量)及2-胺基-8-溴-N-乙氧基-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺(877 mg，2.39 mmol，1當量)於二噁烷(3 mL)中之溶液中添加K 2CO 3(992 mg，7.18 mmol，3當量)於水(3 mL)中之溶液及Pd(dppf)Cl 2(175 mg，239 umol，0.1當量)，且然後在90℃下攪拌16 h。過濾混合物且在減壓下濃縮。藉由管柱層析(SiO 2，石油醚/乙酸乙酯＝50/1至乙酸乙酯: MeOH ＝ 5:1)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之HxBz-39d (900 mg，1.82 mmol，76.2%產率)。 2-胺基-8-(5-(胺基甲基)吡啶-3-基)-N-乙氧基-N-丙基-3H-苯并[b]氮呯-4-甲醯胺HxBz-39之製備
向HxBz-39d (350 mg，709 umol，1當量)於CH 3CN (2 mL)及H 2O (2 mL)中之溶液中添加TFA (646 mg，5.67 mmol，420 uL，8當量)，且將其在80℃下在N 2氣氛下攪拌2 h。過濾混合物且在減壓下濃縮，得到殘餘物，且添加H 2O (15 mL)，將水相用MTBE (20 mL x 3)萃取且丟棄，將水相冷凍乾燥。藉由製備型HPLC(管柱：Phenomenex Luna C18 150*30mm*5um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：5%-35%，9 min)純化殘餘物，獲得呈淡黃色固體狀之HxBz-39 (201 mg，396 umol，55.9 %產率，TFA)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ8.96 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 8.72 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 8.33-8.27 (m, 1H), 7.80-7.72 (m, 3H), 7.46 (s, 1H), 4.31 (s, 2H), 3.98 (q, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.76 (t, J ＝ 7.2 z, 2H), 3.44 (s, 2H), 1.82-1.74 (m, 2H), 1.20 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 1.01 (t, J ＝ 7.4 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 394.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 394.2 (觀測值)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]-3-吡啶基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-53a之製備
向HxBz-39 (150 mg，296 umol，1當量, TFA)及3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-側氧基-3-(2,3,5,6-四氟苯氧基)丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(209 mg，296 umol，1當量)於THF (5 mL)中之溶液中添加Et 3N (89.7 mg，887 umol，123 uL，3當量)，且將其在25℃下攪拌1 h。在0℃下將混合物之pH用TFA調節至4~5，添加H 2O(5 ml)且用EtOAc (10 mL)萃取並丟棄，將水相用DCM/i-prOH (20 mL * 3，3/1)進一步萃取，將有機層經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到呈黃色油狀之HxBzL-53a (200 mg，214 umol，72.4%產率)。 HxBzL-53之製備
在25℃下向HxBzL-53a (0.13 g，139 umol，1.0當量)於DCM (3 mL)及DMA (0.5 mL)中之混合物中一次性添加2,3,5,6-四氟苯酚(92.5 mg，557 umol，4.0當量)及EDCI (133 mg，696 umol，5.0當量)，且然後在25℃下攪拌0.5 h。將混合物濃縮且過濾。藉由製備型HPLC(管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA) -ACN]；B%：25%-55%,8min)純化殘餘物，得到呈淡黃色油狀之HxBzL-53 (78 mg，65.2 umol，46.85%產率，TFA)。 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ8.98 (d, J ＝ 2.0 Hz, 1H), 8.72 (d, J ＝ 1.6 Hz, 1H), 8.47 (s, 1H), 7.86-7.81 (m, 1H), 7.79-7.72 (m, 2H), 7.49-7.37 (m, 2H), 4.63 (s, 2H), 3.98 (q, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.85 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 3.81-3.73 (m, 4H), 3.64-3.54 (m, 36H), 3.45 (s, 2H), 2.96 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 2.59-2.50 (m, 2H), 1.87-1.72 (m, 2H), 1.21 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 1.01 (t, J ＝ 7.6 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 1082.5 (計算值)；LC/MS [M+H] 1082.6 (觀測值)。 實例L-61 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[2-(1-乙基-2-側氧基-咪唑啶-4-基)乙基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-61之合成
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N-丁-3-烯基-4-硝基-N-丙基-苯磺醯胺HxBzL-61b之製備
向4-硝基-N-丙基-苯磺醯胺HxBzL-61a (12 g，49.1 mmol，1.0當量)於DMF (150 mL)中之溶液中添加Cs 2CO 3(40.0 g，123 mmol，2.5當量)、KI (8.16 g，49.1 mmol，1.0當量)及4-溴丁-1-烯(19.9 g，147 mmol，15.0 mL，3.0當量)，且然後在40℃下在N 2下攪拌12 h。將反應混合物倒入到冰水(w/w ＝ 1/1) (150 mL)中且攪拌10 min。將水相用乙酸乙酯(100 mL x 3)萃取。將經合併之有機相用鹽水(100 mL x 2)洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯＝1/0, 10/1)純化殘餘物，得到呈黃色固體之HxBzL-61b (11 g，36.9 mmol，75.1%產率)。 1H NMR (MeOD, 400MHz)δ 8.51-8.36 (m, 2H), 8.14-7.94 (m, 2H), 5.77-5.70 (m, 1H), 5.10-4.96 (m, 2H), 3.25 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 3.15 (t, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 2.31 (q, J ＝ 7.2 Hz, 2H), 1.67-1.44 (m, 2H), 0.88 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 299.1 (計算值)；LC/MS [M+H] 299.0 (觀測值)。 4-硝基-N-[2-(環氧乙烷-2-基)乙基]-N-丙基-苯磺醯胺HxBzL-61c之製備
在0℃下向HxBzL-61b (13.5 g，45.3 mmol，1.0當量)於DCM (200 mL)中之溶液中添加間-氯過氧苯甲酸m-CPBA (18.4 g，90.5 mmol，85%純度，2.0當量)，且然後在20℃下攪拌12 h。將混合物過濾且將濾液用飽和NaHSO 3(30 mL x 1)及鹽水(100 mL)洗滌。將有機相用無水Na 2SO 4乾燥，過濾且在真空中濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯＝1/0, 3/1)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之HxBzL-61c (12 g，38.2 mmol，84.4%產率)。LC/MS [M+H] 315.1 (計算值)；LC/MS [M+H] 315.0 (觀測值)。 N-[4-(乙基胺基)-3-羥基-丁基]-4-硝基-N-丙基-苯磺醯胺HxBzL-61d之製備
在0℃下向HxBzL-61c (7 g，22 mmol，1.0當量)於THF (100 mL)中之溶液中添加乙胺(33.5 g，445 mmol，48.6 mL，60%純度，20當量)，且然後在30℃下攪拌2 h。在45℃下在真空中濃縮混合物。粗產物HxBzL-61d (8 g，22.3 mmol，99.95%產率)以黃色固體形式不經進一步純化即用於下一步驟中。LC/MS [M+H] 360.1 (計算值)；LC/MS [M+H] 360.2 (觀測值)。 N-乙基-N-[2-羥基-4-[(4-硝基苯基)磺醯基-丙基-胺基]丁基]胺甲酸三級丁酯HxBzL-61e之製備
向HxBzL-61d (7.6 g，21.1 mmol，1.0當量)於THF (70 mL)及H 2O (10 mL)中之溶液中添加NaHCO 3(3.55 g，42.3 mmol，1.64 mL，2.0當量)及Boc 2O (9.23 g，42.3 mmol，9.71 mL，2.0當量)。將混合物在25℃下攪拌1 h。將所得混合物倒入到冰水(w/w ＝ 1/1) (50 mL)中且攪拌10 min。將水相用乙酸乙酯(50 mL x 3)萃取。將經合併之有機相用鹽水(50 mL x 1)洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯＝1/0, 2/1)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之HxBzL-61e (8.6 g，18.7 mmol，88.5%產率)。 1H NMR (MeOD, 400MHz)δ 8.46-8.39 (m, 2H), 8.13-8.04 (m, 2H), 3.78-3.70 (m, 1H),3.39-3.2 (m, 3H), 3.29-3.22 (m, 2H), 3.20-3.14 (m, 2H), 3.10-3.00 (m, 1H), 1.79-1.69 (m, 1H), 1.65-1.53 (m, 3H), 1.45 (s, 9H), 1.09 ( t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 0.90 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。 N-[2-(1,3-二側氧基異吲哚啉-2-基)-4-[(4-硝基苯基)磺醯基-丙基-胺基]丁基]-N-乙基-胺甲酸三級丁酯HxBzL-61f之製備
在0℃下向HxBzL-61e (5 g，10.9 mmol，1.0當量)及異吲哚啉-1,3-二酮(1.76 g，12.0 mmol，1.1當量)於THF (50 mL)中之混合物中添加三苯基膦PPh 3(4.28 g，16.3 mmol，1.5當量)及氮雜二羧酸二乙酯DEAD (2.84 g，16.3 mmol，2.97 mL，1.5當量)，且然後在20℃下攪拌1 h。將混合物倒入到冰水(w/w ＝ 1/1) (50 mL)中且攪拌10 min。將水相用乙酸乙酯(30 mL x 3)萃取。將經合併之有機相用鹽水(30 mL)洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯＝1/0, 1/1)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之HxBzL-61f (8.8 g，粗製物)。LC/MS [M+H] 589.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 589.2 (觀測值)。 N-[2-胺基-4-[(4-硝基苯基)磺醯基-丙基-胺基]丁基]-N-乙基-胺甲酸三級丁酯HxBzL-61g之製備
在20℃下向HxBzL-61f (4.4 g，7.47 mmol，1.0當量)於MeOH (50 mL)中之溶液中添加NH 2NH 2.H 2O (2.25 g，44.9 mmol，2.18 mL，6.0當量)，且然後在80℃下攪拌12 h。將混合物過濾且在真空中濃縮濾液，得到呈黃色油狀之HxBzL-61g (3.4 g，7.41 mmol，99.2%產率)。LC/MS [M+H] 459.2 (計算值)；LC/MS [M+H] 459.2 (觀測值)。 N-[3-胺基-4-(乙基胺基)丁基]-4-硝基-N-丙基-苯磺醯胺HxBzL-61h之製備
向HxBzL-61g (2.9 g，6.32 mmol，1.0當量)於EtOAc (30 mL)中之溶液中添加HCl/EtOAc (4 M, 29.0 mL，18.3當量)，且然後在20℃下攪拌1 h。在真空中濃縮混合物，得到呈黃色固體狀之HxBzL-61h (2.7 g，粗製物，2HCl)。 1H NMR (MeOD, 400MHz)δ 8.35 (d, J ＝ 8.8 Hz, 2H), 8.09 (d, J ＝ 8.8 Hz, 2H), 3.78-3.69 (m, 1H), 3.45-3.31 (m, 4H), 3.17-3.05 (m, 4H), 2.12-1.99 (m, 2H), 1.57-1.43 (m, 2H), 1.32 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 0.80 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。LC/MS [M+H] 359.17 (計算值)；LC/MS [M+H] 359.1 (觀測值)。 N-[2-(1-乙基-2-側氧基-咪唑啶-4-基)乙基]-4-硝基-N -丙基-苯磺醯胺HxBzL-61i之製備
在0℃下向HxBzL-61h (2.7 g，7.53 mmol，1.0當量)及Et 3N (1.91 g，18.8 mmol，2.62 mL，2.5當量)於THF (30 mL)中之混合物中添加羰基二咪唑CDI (2.44 g，15.1 mmol，2.0當量)。將混合物在25℃下攪拌12 h。將所得混合物倒入到冰水(w/w ＝ 1/1) (50 mL)中且攪拌10 min。將水相用乙酸乙酯(30 mL x 3)萃取。將經合併之有機相用鹽水(50 mL)洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯＝1/0, 0/1)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之HxBzL-61i (300 mg，780 umol，10.4%產率)。 1H NMR (MeOD, 400MHz)δ 8.39 (d, J ＝ 8.8 Hz, 2H), 8.02 (d, J ＝ 8.8 Hz, 2H), 3.99-3.95 (m, 1H), 3.77-3.63 (t, J ＝ 8.8 Hz, 1H), 3.48-3.38 (m, 1H), 3.35-3.23 (m, 2H), 3.22-3.04 (m, 4H), 1.98-1.74 (m, 2H), 1.66-1.45 (m, 2H), 1.15 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 0.87 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H) 1-乙基-4-[2-(丙基胺基)乙基]咪唑啶-2-酮HxBzL-61j之製備
向HxBzL-61i (300 mg，780 umol，1.0當量)於MeCN (10 mL)中之溶液中添加LiOH.H 2O (196 mg，4.68 mmol，6.0當量)及2-氫硫基乙酸甲酯(0.45 g，4.24 mmol，384 uL，5.43當量)，且然後在25℃下攪拌2 h。將混合物過濾且將濾液在真空中濃縮。將殘餘物用H 2O (20 mL)稀釋，然後將水相之pH用HCl (1M)調節至3-4且然後用EtOAc (20 mL x 3)萃取，以去除副產物，然後將水相冷凍乾燥，得到呈無色油狀之HxBzL-61j (180 mg，763 umol，97.8%產率，HCl)。 1H NMR (MeOD, 400MHz)δ 3.83-3.73 (m, 1H), 3.65 (t, J ＝ 8.8 Hz, 1H), 3.28-3.13 (m, 3H), 3.12-3.03 (m, 2H), 3.02-2.93 (m, 2H), 2.01-1.84 (m, 2H), 1.79-1.67 (m, 2H), 1.11 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 1.03 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H)。 N-[[5-[2-胺基-4-[2-(1-乙基-2-側氧基-咪唑啶-4-基)乙基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基]胺甲酸三級丁酯HxBzL-61l之製備
向2-胺基-8-[2-[(三級丁氧基羰基胺基)甲基]嘧啶-5-基]-3H-1-苯并氮呯-4-羧酸HxBzL-61k (210 mg，513 umol，1.0當量)於DMF (6 mL)中之溶液中添加HATU (205 mg，539 umol，1.05當量)、DIEA (331 mg，2.56 mmol，447 uL，5.0當量)及HxBzL-61j (145 mg，615 umol，1.2當量，HCl)，且然後在25℃下攪拌1 h。將所得混合物倒入到冰水(w/w ＝ 1/1) (10 mL)中且攪拌5 min。將水相用乙酸乙酯(10 mL x 3)萃取。將經合併之有機相用鹽水(10 mL x 2)洗滌，經無水Na 2SO 4乾燥，過濾且真空濃縮。藉由矽膠層析(管柱高度：250 mm，直徑：100 mm，100-200目矽膠，石油醚/乙酸乙酯＝1/0, 1/0，乙酸乙酯/甲醇＝1/0,3/1)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之HxBzL-61l (300 mg，508 umol，99.0%產率)。LC/MS [M+H] 591.3 (計算值)；LC/MS [M+H] 591.3 (觀測值)。 2-胺基-8-[2-(胺基甲基)嘧啶-5-基]-N-[2-(1-乙基-2-側氧基-咪唑啶-4-基)乙基]-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺HxBzL-61m之製備
向HxBzL-61l (300 mg，508 umol，1.0當量)於EtOAc (5 mL)中之溶液中添加HCl/EtOAc (4 M, 6.00 mL，47.3當量)，且然後在25℃下攪拌1 h。在真空中濃縮混合物。藉由製備型HPLC(管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：1%-30%,8min)純化殘餘物，得到呈黃色固體狀之HxBzL-61m (142 mg，198 umol，38.91%產率，2TFA)。 1H NMR (MeOD, 400MHz)δ 9.22 (s, 2H), 7.88-7.71 (m, 3H), 7.15 (s, 1H), 4.49 (s, 2H), 3.75-3.60 (m, 2H), 3.57-3.50 (m, 4H), 3.39 (s, 2H), 3.28-3.18 (m, 3H), 2.02-1.97 (s, 1H), 1.88-1.83 (m, 1H), 1.81-1.65 (m, 2H), 1.15-1.10 (m, 3H), 1.01-0.95 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 491.28 (計算值)；LC/MS [M+H] 491.3 (觀測值)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[2-(1-乙基-2-側氧基-咪唑啶-4-基)乙基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯HxBzL-61n之製備
在0℃下向HxBzL-61m (90 mg，125 umol，1.0當量，2TFA)及Et 3N (38.02 mg，376 umol，52.3 uL，3.0當量)於DMF (1 mL)中之溶液中添加(2,3,5,6-四氟苯基) 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(3-三級丁氧基-3-側氧基 -丙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸酯t-Bu-COO-PEG10-COOTFP (95.5 mg，125 umol，1.0當量)，且然後在25℃下攪拌1 h。添加水(10 mL)，然後將混合物之pH用TFA調節至約6。將水相用MTBE (5 mL x 3)萃取以去除副產物。將水相用DCM/i-PrOH＝3/1 (10 mL x 3)進一步萃取。在真空中濃縮有機相(DCM/i-PrOH)，得到呈黃色油狀之HxBzL-61n (130 mg，120 umol，95.5%產率)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[2-(1-乙基-2-側氧基-咪唑啶-4-基)乙基-丙基-胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-61o之製備
向HxBzL-61n (100 mg，92.0 umol，1.0當量)於MeCN (0.5 mL)及H 2O (1 mL)中之溶液中添加TFA (83.9 mg，735 umol，54.5 uL，8.0當量)，且然後在80℃下攪拌1 h。在真空中濃縮混合物，得到殘餘物，將殘餘物用水(10mL)稀釋且將水相用MTBE (10 mL)萃取，以去除過量TFA，且將水相凍乾，得到呈黃色油狀之HxBzL-61o (100 mg，87.3 umol，94.9%產率，TFA)。 HxBzL-61之製備
向HxBzL-61o (100 mg，87.3 umol，1.0當量，TFA)及2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯磺酸鈉(70.2 mg，262 umol，3.0當量)於DCM (1 mL)及DMA (0.5 mL)中之溶液中添加EDCI (67.0 mg，349 umol，4.0當量)，且然後在20℃下攪拌1 h。在真空中濃縮混合物。藉由製備型HPLC(管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：10%-35%,8min)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之HxBzL-61 (30 mg，23.8 umol，27.3%產率)。 1H NMR (MeOD, 400MHz)δ 9.10 (s, 2H), 7.81-7.68 (m, 3H), 7.14 (s, 1H), 4.71 (s, 2H), 3.88 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 3.80 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 3.68-3.59 (m, 37H), 3.55-3.50 (m, 3H), 3.40 (s, 2H), 3.26-3.20 (m, 3H), 2.98 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 2.62 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 2.06-1.82 (m, 2H), 1.80-1.67 (m, 2H), 1.15-1.10 (m, 3H), 1.01-0.93 (m, 3H)。LC/MS [M+H] 1259.5 (計算值)；LC/MS [M+H] 1259.6 (觀測值)。 實例L-65 4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-[[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺甲醯基氧基甲基]苯基]胺甲醯基]-4-脲基-丁基]胺甲醯基]-2-甲基-丙基]胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基氧基]-2,3,5,6-四氟-苯磺酸HxBzL-65之合成
Figure 02_image470
Figure 02_image472
Figure 02_image474
4-((S)-2-((S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苄基((5-(2-胺基-4-(乙氧基(丙基)胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基)嘧啶-2-基)甲基)胺甲酸酯HxBzL-65a之製備
在0℃下向2-胺基-8-[2-(胺基甲基)嘧啶-5-基]-N-乙氧基-N-丙基-3H-1-苯并氮呯-4-甲醯胺HxBz-5 (41.2 mg，96 umol，1當量，HCl)及Et 3N (29.0 mg，287 umol，39.9 uL，3當量)於DMF (0.5 mL)中之溶液中添加((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)胺基)-1-側氧基-5-脲基戊-2-基)胺基)-1-側氧基丁-2-基)胺甲酸(9H-茀-9-基)甲基酯Fmoc-Val-Cit-PNC (110 mg，143 umol，1.5當量)，且然後在25℃下攪拌1 h。將哌啶(24.4 mg，287 umol，28.3 uL，3當量)添加到混合物中且在25℃下攪拌另外1 h。過濾混合物且在減壓下濃縮。藉由製備型HPLC (TFA條件；管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：5%-30%,8min)純化殘餘物，得到呈黃色油狀之HxBzL-65a (60 mg，75.0 umol，78.4%產率)。LC/MS [M+H] 800.4 (計算值)；LC/MS [M+H] 800.6 (觀測值)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-[[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺甲醯基氧基甲基]苯基]胺甲醯基]-4-脲基-丁基]胺甲醯基]-2-甲基-丙基]胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸三級丁酯HxBzL-65b之製備
向HxBzL-65a (60 mg，65.7 umol，1當量，TFA)於THF (2 mL)中之溶液中添加Et 3N (19.9 mg，197 umol，27.4 uL，3當量)及(2,3,5,6-四氟苯基) 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(3-三級丁氧基-3-側氧基-丙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸酯t-Bu-COO-PEG10-COOTFP (50.1 mg，66 umol，1當量)，且然後在25℃下攪拌1 h。將反應混合物用水2 mL稀釋，然後將水相之pH用TFA調節至5~6，且用DCM/i-prOH (5 mL x 3, 3/1)萃取，將經合併之有機相經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到呈黃色油狀之HxBzL-65b (90 mg，64.4 umol，98.2%產率)，其不經進一步純化即用於下一步驟中。LC/MS [M+H] 1396.8 (計算值)；LC/MS [M+H] 1396.7 (觀測值)。 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[4-[[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺甲醯基氧基甲基]苯基]胺甲醯基]-4-脲基-丁基]胺甲醯基]-2-甲基-丙基]胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-65c之製備
向HxBzL-65b (90 mg，64 umol，1當量)於水(3 mL)及MeCN (1 mL)中之溶液中添加TFA (73.5 mg，644 umol，47.7 uL，10當量)，且然後在80℃下攪拌2 h。將反應混合物用水2 mL稀釋，然後將水相之pH用TFA調節至5~6，且用DCM/i-prOH (5 mL x 3，3/1)萃取，將經合併之有機相經Na 2SO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，獲得呈黃色油狀之HxBzL-65c (100 mg，粗製物)。LC/MS [M+H] 1340.7 (計算值)；LC/MS [M+H] 1340.6 (觀測值)。 HxBzL-65之製備
向HxBzL-65c (100 mg，74.6 umol，1當量)及2,3,5,6-四氟-4-羥基-苯磺酸鈉(80.0 mg，298 umol，4當量)於DCM (1 mL)及DMA (0.5 mL)中之溶液中添加EDCI (57.2 mg，298 umol，4當量)，且然後在25℃下攪拌1 h。過濾混合物且在減壓下濃縮。藉由製備型HPLC (TFA條件；管柱：Phenomenex Luna 80*30mm*3um；流動相：[水(0.1%TFA)-ACN]；B%：15%-40%,8min)純化殘餘物，得到呈白色固體狀之HxBzL-65 (20 mg，12.75 umol，17.09%產率)。 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 9.08 (s, 2H), 7.83-7.78 (m, 1H), 7.77-7.71 (m, 2H), 7.65 (br d, J ＝ 7.6 Hz, 2H), 7.47 (s, 1H), 7.42-7.34 (m, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.62 (s, 2H), 4.54-4.48 (m, 1H), 4.23-4.18 (m, 1H), 4.02-3.98 (m, 2H), 3.87 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 3.80-3.75 (m, 2H), 3.65-3.60 (m, 36H), 3.52-3.49 (m, 2H), 3.47 (s, 2H), 3.21-3.14 (m, 2H), 2.98 (t, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 2.61-2.53 (m, 2H), 2.20-2.10 (m, 1H), 2.02-1.88 (m, 1H), 1.85-1.71 (m, 3H), 1.70-1.52 (m, 2H), 1.23 (t, J ＝ 7.2 Hz, 3H), 1.05-0.99 (m, 9H)。LC/MS [M+H] 1568.6 (計算值)；LC/MS [M+H] 1568.6 (觀測值)。 實例L-70 1-(5-(2-胺基-4-(乙氧基(丙基)胺甲醯基)-3H-苯并[b]氮呯-8-基)嘧啶-2-基)-3-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十氧雜-2-氮雜三十六-36-烷酸2,3,5,6-四氟苯基酯HxBzL-70
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Figure 02_image478
遵循實例L-5之程序，向3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-胺基-4-[乙氧基(丙基)胺甲醯基]-3H-1-苯并氮呯-8-基]嘧啶-2-基]甲基胺基]-3-側氧基-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸HxBzL-5a (5.00 g，5.35 mmol，1.00當量)於50 ml DCM中之溶液中依次添加2,3,5,6-四氟苯酚(1.77 g，10.7 mmol，2.00當量)、丙烷膦酸酐(PPAA，T3P)(CAS登記號68957-94-8) (MeCN中之50 wt%溶液，17.0 g溶液，26.8 mmol，5.00當量)及N-甲基咪唑NMI (2.15 mL，26.8 mmol，5.00當量)。將混合物在20℃下攪拌2 h且然後用20% NaCl (50 mL)水溶液稀釋。將水層用DCM (25 mL)萃取且將經合併之有機層用水(25 mL)洗滌，乾燥(Na2SO4)，過濾，且在真空中濃縮，獲得呈深棕色油狀形式之粗製HxBzL-70。將材料加載到Biotage管柱上(250 mL 於MeCN/水2:8中之7.5 mM HCl，v/v)且使用梯度步驟(20個柱體積MeCN/水2:8，然後15個柱體積MeCN/水3:7)純化。將所需級分合併且然後萃取(2 x 300 mL DCM)且在真空中濃縮，得到呈深黃色油狀形式之純的HxBzL-70 (5.34 g，55.6 wt%純度，藉由qNMR得到，56%產率)，將其在氮氣下儲存在–20℃下，之後將其用DMA稀釋，製備20 mM HxBzL-70溶液。LC/MS [M+H] 1083.1 (計算值)；LC/MS [M+H] 1083.1 (觀測值)。 實例201免疫結合物(IC)之製備
為了製備離胺酸結合之免疫結合物，使用G-25 SEPHADEX TM脫鹽管柱(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)或Zeba™ Spin脫鹽管柱(Thermo Fisher Scientific)將抗體緩衝液交換至含有100 mM硼酸、50 mM氯化鈉、1 mM乙二胺四乙酸(pH 8.3)之結合緩衝液中。然後使用緩衝液將析出液各自調節至約1-10 mg/ml之濃度且然後無菌過濾。將抗體預升溫至20-30℃並與在二甲亞碸(DMSO)或二甲基乙醯胺(DMA)中溶解至濃度為5至20 mM的2-20 (例如7-10)莫耳當量之式II之8-Het-2-胺基苯并氮呯-連接子(HxBzL)化合物之四氟苯基(TFP)或磺酸四氟苯基(sulfoTFP)酯快速混合。使反應在30℃下進行約16小時，且然後藉由在以pH 7.2磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)平衡之兩個連續G-25脫鹽管柱或Zeba™ Spin 脫鹽管柱上運行，將免疫結合物(IC)自反應物分離，提供表3a及3b之免疫結合物(IC)。在連接至XEVO TMG2-XS TOF質譜儀(Waters Corporation)之ACQUITY TMUPLC H級(Waters Corporation, Milford, MA)上使用C4反相管柱藉由液相層析質譜分析確定佐劑-抗體比(DAR)。
為了製備經半胱氨酸結合之免疫結合物，使用Zeba™ Spin脫鹽管柱(Thermo Fisher Scientific)將抗體緩衝液交換到含有PBS pH 7.2及2 mM EDTA之結合緩衝液中。使用2-4莫耳過量之三(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫蘇糖醇(DTT)在37℃下還原鏈間二硫化物達30 min – 2小時。使用以結合緩衝液預平衡之Zeba™ Spin脫鹽管柱去除過量TCEP或DTT。使用結合緩衝液將經緩衝液交換之抗體之濃度調節至大約5至20 mg/ml且進行無菌過濾。將順丁烯二醯亞胺-HxBzL化合物溶解於二甲基亞碸(DMSO)或二甲基乙醯胺(DMA)中，至5至20 mM濃度。對於結合，將抗體與10至20莫耳當量之順丁烯二醯亞胺-HxBzL混合。在某些情況下，添加多至20% (v/v)之額外DMA或DMSO以提高順丁烯二醯亞胺-HxBzL於結合緩衝液中之溶解度。使反應在20℃下進行大約30 min至4小時。使用兩個連續Zeba™ Spin脫鹽管柱將所得結合物自未經反應之順丁烯二醯亞胺-HxBzL中純化。將該等管柱用pH 7.2磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)預平衡。在連接至XEVO TMG2-XS TOF質譜儀(Waters Corporation)之ACQUITY TMUPLC H級(Waters Corporation, Milford, MA)上使用C4反相管柱藉由液相層析質譜分析評估佐劑與抗體比(DAR)。
對於結合，可將抗體溶解於此項技術中已知不會不利地影響抗體之穩定性或抗原結合特異性之水性緩衝系統中。可使用磷酸鹽緩衝鹽水。將HxBzL化合物溶解於包含如本文別處所描述之至少一種極性非質子溶劑的溶劑系統中。在一些此等態樣中，將HxBzL在pH 8 Tris緩衝液(例如50 mM Tris)中溶解至濃度為約5 mM、約10 mM、約20 mM、約30 mM、約40 mM或約50 mM，及其範圍，諸如約5 mM至約50 mM或約10 mM至約30 mM。在一些態樣中，將8-Het-2-胺基苯并氮呯-連接子中間物溶解於DMSO (二甲亞碸)、DMA (二甲基乙醯胺)、乙腈或另一種適合的偶極非質子溶劑中。
或者，在結合反應中，可將當量過量之HxBzL溶液稀釋且與抗體溶液組合。可將HxBzL溶液適當地用至少一種極性非質子溶劑及至少一種極性質子溶劑稀釋，該等溶劑之實例包括水、甲醇、乙醇、正丙醇及乙酸。8-Het-2-胺基苯并氮呯-連接子中間物與抗體之莫耳當量可為約1.5:1、約3:1、約5:1、約10:1、約15:1或約20:1及其範圍，諸如約1.5:1至約20:1、約1.5:1至約15:1、約1.5:1至約10:1、約3:1至約15:1、約3:1至約10:1、約5:1至約15:1或約5:1至約10:1。可適當地藉由此項技術中已知之方法(諸如LC-MS)監測反應是否完成。結合反應通常在約1小時至約16小時範圍內完成。反應完成後，可將試劑添加至反應混合物中以淬滅反應。若抗體硫醇基與8-Het-2-胺基苯并氮呯-連接子中間物之硫醇-反應性基團(諸如順丁烯二醯亞胺)反應，則未經反應之抗體硫醇基可與封端試劑反應。適合封端試劑之實例為乙基順丁烯二醯亞胺。
結合後，可藉由此項技術中已知之純化方法(諸如且不限於尺寸排阻層析、疏水相互作用層析、離子交換層析、層析聚焦、超濾、離心超濾、切向流過濾及其組合)將免疫結合物純化且與未結合之反應物及/或結合物聚集物分離。舉例而言，可在純化之前將免疫結合物諸如於20 mM丁二酸鈉(pH 5)中稀釋。將經稀釋之溶液施加於陽離子交換管柱，隨後用例如至少10管柱體積之20 mM丁二酸鈉(pH 5)洗滌。可適當地將結合物用諸如PBS之緩衝液溶離。 實例202   HEK報告檢定
遵循供應商方案使用表現人類TLR7或人類TLR8之HEK293報告細胞(InvivoGen, San Diego CA)以用於細胞繁殖及實驗中。簡言之，使細胞在5% CO 2下在補充有10% FBS、ZEOCIN™及殺稻瘟菌素(Blasticidin)之DMEM中生長至80-85%匯合。然後將細胞以4x10 4個細胞/孔接種於具有含有HEK偵測培養基及免疫刺激分子之基質的96孔平板中。使用讀板儀在620-655 nm波長下量測活性。  實例203   活體外免疫結合物活性之評估
此實例顯示本發明之免疫結合物有效引發免疫活化，且因此可用於治療癌症。 a)     人類抗原呈遞細胞之分離： 人類骨髓抗原呈遞細胞(APC)係藉由密度梯度離心使用含有針對CD14、CD16、CD40、CD86、CD123及HLA-DR之單株抗體的ROSETTESEP TM人類單核球富集混合物(Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)自獲自健康供血者之人類外周血(Stanford Blood Center, Palo Alto, California)負向選擇。隨後經由負向選擇使用無CD16消耗且含有針對CD14、CD16、CD40、CD86、CD123及HLA-DR之單株抗體的EASYSEP TM人類單核球富集套組(Stem Cell Technologies)將不成熟APC純化至＞90%純度。 b)     骨髓APC活化檢定： 將2 x 10 5個APC在含有伊斯科夫改良杜爾貝科氏培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium，IMDM) (Lonza)之96孔板(Corning, Corning, NY)中溫育，該培養基補充有10% FBS、100 U/mL青黴素、100 μg/mL (每毫升微克數)鏈黴素、2 mM L-麩醯胺、丙酮酸鈉、非必需胺基酸及(在指出的情況下)各種濃度之未經結合之抗體及本發明之免疫結合物(如根據以上實例所製備)。α18小時後經由ELISA對無細胞上清液進行分析，以量測TNF 分泌作為促炎性反應之讀出。 c)     PBMC活化檢定：藉由密度梯度離心自獲自健康獻血者之人類外周血(Stanford Blood Center, Palo Alto, California)中分離人類外周血單核細胞(PBMC)。將PBMC在96孔板(Corning, Corning, NY)中在與表現CEA之腫瘤細胞(例如MKN-45、HPAF-II)以10:1效應細胞與靶細胞比率之共培養物中溫育。用不同濃度之未經結合之(裸)抗體及本發明之免疫結合物(如根據以上實例所製備)刺激細胞。根據製造商指南(BioLegend®, San Diego, CA)，藉由細胞介素珠陣列使用LegendPlex™套組分析無細胞上清液。 d)     人類常規樹突細胞之分離： 人類常規樹突細胞(cDC)係藉由密度梯度離心自獲自健康獻血者之人類外周血(Stanford Blood Center, Palo Alto, California)負向選擇。簡言之，首先藉由使用ROSETTESEP TM人類CD3消耗混合物(Stem Cell Technologies，Vancouver，Canada)自細胞製備物中去除T細胞來富集細胞。然後藉由負向選擇使用EASYSEP TM人類骨髓DC富集套組(Stem Cell Technologies)進一步富集cDC。 e)     cDC活化檢定：將 8 x 10 4個APC與表現ISAC靶抗原之腫瘤細胞以10:1效應物(cDC)與靶(腫瘤細胞)之比率共培養。將細胞在含有RPMI-1640培養基之96孔板(Corning, Corning, NY)中溫育，該培養基補充有10% FBS及(在所指示之情況下)不同濃度之本發明之指定免疫結合物(如根據以上實例製備)。在隔夜溫育約18小時後，收集無細胞上清液並使用BioLegend LEGENDPLEX細胞介素珠粒陣列分析細胞介素分泌(包括TNFα)。
除了所描述之利用不同骨髓細胞群之檢定以外，亦可以使用各種篩選檢定來量測骨髓細胞類型之活化。此等細胞可包括以下：自健康供體血液中分離之單核球、經M-CSF分化之巨噬球、經GM-CSF分化之巨噬球、GM-CSF+IL-4單核球衍生性樹突細胞、自健康供體血液中分離之常規樹突細胞(cDC)，及極化到免疫抑制狀態之骨髓細胞(亦稱為骨髓來源之抑制細胞或MDSC)。MDSC極化細胞之實例包括向免疫抑制狀態分化之單核球，例如M2a MΦ (IL4/IL13)、M2c MΦ (IL10/TGFb)、GM-CSF/IL6 MDSC及腫瘤誘導單核球(TEM)。可以使用腫瘤條件培養基(例如 786.O、MDA-MB-231、HCC1954)進行TEM分化。原代腫瘤相關骨髓細胞亦可以包括存在於經分離之腫瘤細胞懸液中的原代細胞(Discovery Life Sciences)。
所描述骨髓細胞群之活化評估可以作為單一培養物或作為與表現感興趣抗原之細胞之共培養物進行，免疫結合物可以藉由抗體之CDR區結合該感興趣抗原。在溫育18-48小時後，可以藉由使用流動式細胞測量術上調細胞表面共刺激分子或藉由量測經分泌之促炎細胞介素來評估活化。對於細胞介素量測，收穫無細胞上清液且藉由細胞介素珠粒陣列(例如來自Biolegend之LegendPlex)使用流動式細胞測量術進行分析。
本文中引用之所有參考文獻(包括公開案、專利申請及專利)皆以引用方式併入本文，達到如同逐一個別地及特別地指出之將各參考文獻以引用方式將各參考文獻併入本文以及並且在本文中全部闡述之相同程度。
圖1展示了小鼠 活體內異種移植腫瘤模型之圖。量測治療後隨時間推移之腫瘤體積，以比較免疫結合物IC-2與同型免疫結合物(ISAC) 及裸抗體CEA.9-G1fhL2在攜帶CEA-高的人類胰臟HPAF-II腫瘤之小鼠的腫瘤抑制方面之功效。 圖2a展示了在CEA高的MKN-45細胞與富含人類習知樹突細胞(cDC)之原代細胞分離物之共培養物中藉由免疫結合物IC-2、IC-3、IC-4、IC-6、IC-14 (表3a)及裸抗體CEA.9-G1fhL2誘導細胞介素IL-12p70之圖。 圖2b展示了在CEA高的MKN-45細胞與富含cDC之原代細胞分離物之共培養物中藉由免疫結合物IC-2、IC-3、IC-4、IC-6、IC-14及裸抗體CEA.9-G1fhL2誘導細胞介素TNFα (腫瘤壞死因子α)之圖。 圖2c展示了在CEA高的MKN-45細胞與富含cDC之原代細胞分離物之共培養物中藉由免疫結合物IC-2、IC-3、IC-4、IC-6、IC-14及裸抗體CEA.9-G1fhL2誘導IL-6 (介白素-6)之圖。 圖2d展示了在CEA高的MKN-45細胞與富含cDC之原代細胞分離物之共培養物中藉由免疫結合物IC-2、IC-3、IC-4、IC-6、IC-14及裸抗體CEA.9-G1fhL2誘導細胞介素IFNγ (干擾素γ)之圖。 圖2e展示了在CEA高的MKN-45細胞與富含cDC之原代細胞分離物之共培養物中藉由免疫結合物IC-2、IC-3、IC-4、IC-6、IC-14及裸抗體CEA.9-G1fhL2誘導細胞介素CCL2之圖。 圖3a展示了在CEA高的HPAF II細胞中用不同濃度之免疫結合物IC-2處理的經M-CSF分化之單核球衍生性巨噬球之吞噬作用的圖。將經CTG標記之腫瘤IC-2免疫複合物與經M-CSF分化之單核球衍生性巨噬球以2:1效應物與靶標比率溫育。4小時後，藉由門控對CTG訊號呈陽性之效應細胞之流動式細胞測量術量測吞噬作用。圖中展示了來自三個供體之平均值+/-標準偏差。 圖3b展示了在CEA中等的LoVo細胞中用不同濃度之免疫結合物IC-2處理的經M-CSF分化之單核球衍生性巨噬球之吞噬作用的圖。將經CTG標記之腫瘤IC-2免疫複合物與經M-CSF分化之單核球衍生性巨噬球以2:1效應物與靶標比率溫育。4小時後，藉由門控對CTG訊號呈陽性之效應細胞之流動式細胞測量術量測吞噬作用。圖中展示了來自三個供體之平均值+/-標準偏差。 圖3c展示了在CEA低的LS-174T細胞中用不同濃度之免疫結合物IC-2處理的經M-CSF分化之單核球衍生性巨噬球之吞噬作用的圖。將經CTG標記之腫瘤IC-2免疫複合物與經M-CSF分化之單核球衍生性巨噬球以2:1效應物與靶標比率溫育。4小時後，藉由門控對CTG訊號呈陽性之效應細胞之流動式細胞測量術量測吞噬作用。圖中展示了來自三個供體之平均值+/-標準偏差。 圖3d展示了在CEA陰性MDA-MB-231細胞中用不同濃度之免疫結合物IC-2處理的經M-CSF分化之單核球衍生性巨噬球之吞噬作用的圖。將經CTG標記之腫瘤IC-2免疫複合物與經M-CSF分化之單核球衍生性巨噬球以2:1效應物與靶標比率溫育。4小時後，藉由門控對CTG訊號呈陽性之效應細胞之流動式細胞測量術量測吞噬作用。圖中展示了來自三個供體之平均值+/-標準偏差。 圖4a展示了在將不同濃度之免疫結合物IC-2及裸抗體CEA.9-G1fhL2與癌細胞及富含cDC之原代細胞分離物之共培養物溫育後分泌的TNFα(腫瘤壞死因子α)細胞介素水準之圖。 圖4b展示了在將不同濃度之免疫結合物IC-2及裸抗體CEA.9-G1fhL2與癌細胞及富含cDC之原代細胞分離物之共培養物溫育後分泌的IL-6 (介白素-6)細胞介素水準之圖。 圖4c展示了在將不同濃度之免疫結合物IC-2及裸抗體CEA.9-G1fhL2與癌細胞及富含cDC之原代細胞分離物之共培養物溫育後分泌的CXCL10細胞介素水準之圖。 圖4d展示了在將不同濃度之免疫結合物IC-2及裸抗體CEA.9-G1fhL2與癌細胞及富含cDC之原代細胞分離物之共培養物溫育後分泌的TNFα(腫瘤壞死因子α)細胞介素水準之圖。 圖4e展示了在將不同濃度之免疫結合物IC-2及裸抗體CEA.9-G1fhL2與癌細胞及富含cDC之原代細胞分離物之共培養物溫育後分泌的CD40表面標記物誘導水準之圖。 圖4f展示了在將不同濃度之免疫結合物IC-2及裸抗體CEA.9-G1fhL2與癌細胞及富含cDC之原代細胞分離物之共培養物溫育後分泌的CD86表面標記物誘導水準之圖。 
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                          85                  90                  95      
          Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 
          <![CDATA[<210> 10]]>
          <![CDATA[<211> 30]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 10]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Asp Phe Thr 
                      20                  25                  30  
          <![CDATA[<210> 11]]>
          <![CDATA[<211> 5]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 11]]>
          Thr Tyr Trp Met Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210> 12]]>
          <![CDATA[<211> 14]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 12]]>
          Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210> 13]]>
          <![CDATA[<211> 17]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 13]]>
          Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys 
          1               5                   10                  15      
          Asp 
          <![CDATA[<210> 14]]>
          <![CDATA[<211> 32]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 14]]>
          Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln 
          1               5                   10                  15      
          Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Ser 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210> 15]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 15]]>
          Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 16]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 16]]>
          Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210> 17]]>
          <![CDATA[<211> 108]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 17]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu 
                          85                  90                  95      
          Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105             
          <![CDATA[<210> 18]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 18]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 
                      20              
          <![CDATA[<210> 19]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 19]]>
          Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Val Ala 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210> 20]]>
          <![CDATA[<211> 15]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 20]]>
          Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210> 21]]>
          <![CDATA[<211> 7]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 21]]>
          Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg 
          1               5           
          <![CDATA[<210> 22]]>
          <![CDATA[<211> 32]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 22]]>
          Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 
          1               5                   10                  15      
          Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210> 23]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 23]]>
          His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Phe Thr 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 24]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 24]]>
          Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 25]]>
          <![CDATA[<211> 30]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 25]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 
                      20                  25                  30  
          <![CDATA[<210> 26]]>
          <![CDATA[<211> 5]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 26]]>
          Glu Phe Gly Met Asn 
          1               5   
          <![CDATA[<210> 27]]>
          <![CDATA[<211> 14]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 27]]>
          Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210> 28]]>
          <![CDATA[<211> 17]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 28]]>
          Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210> 29]]>
          <![CDATA[<211> 32]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 29]]>
          Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210> 30]]>
          <![CDATA[<211> 12]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 30]]>
          Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210> 31]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 31]]>
          Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210> 32]]>
          <![CDATA[<211> 106]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 32]]>
          Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Asn Ile Ala Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 
                      20                  25                  30          
          His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 
                  35                  40                  45              
          Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Gln Pro Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105     
          <![CDATA[<210> 33]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 33]]>
          Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Asn Ile Ala Cys 
                      20              
          <![CDATA[<210> 34]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 34]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Asn Ile Ala Cys 
                      20              
          <![CDATA[<210> 35]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 35]]>
          Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 36]]>
          <![CDATA[<211> 15]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 36]]>
          Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 
          1               5                   10                  15  
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 37]]>
          Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210> 38]]>
          <![CDATA[<211> 32]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 38]]>
          Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 
          1               5                   10                  15      
          Leu Thr Ile Ser Ser Met Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210> 39]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 39]]>
          Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210> 40]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 40]]>
          Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 41]]>
          <![CDATA[<211> 120]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 41]]>
          Gln Val Lys Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser 
                      20                  25                  30          
          Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Gly Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gly Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210> 42]]>
          <![CDATA[<211> 30]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 42]]>
          Gln Val Lys Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 
                      20                  25                  30  
          <![CDATA[<210> 43]]>
          <![CDATA[<211> 30]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 43]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 
                      20                  25                  30  
          <![CDATA[<210> 44]]>
          <![CDATA[<211> 5]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 44]]>
          Asp Ser Tyr Met His 
          1               5   
          <![CDATA[<210> 45]]>
          <![CDATA[<211> 14]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 45]]>
          Trp Leu Arg Gln Gly Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210> 46]]>
          <![CDATA[<211> 17]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 46]]>
          Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gln 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210> 47]]>
          <![CDATA[<211> 32]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 47]]>
          Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Glu 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210> 48]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 48]]>
          Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210> 49]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 49]]>
          Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210> 50]]>
          <![CDATA[<211> 106]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 50]]>
          Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met 
                      20                  25                  30          
          His Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
                  35                  40                  45              
          Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105     
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 51]]>
          Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys 
                      20              
          <![CDATA[<210> 52]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
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          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 52]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys 
                      20              
          <![CDATA[<210> 53]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 53]]>
          Ser Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met His 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 54]]>
          <![CDATA[<211> 15]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 54]]>
          Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210> 55]]>
          <![CDATA[<211> 7]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 55]]>
          Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210> 56]]>
          <![CDATA[<211> 32]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 56]]>
          Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 
          1               5                   10                  15      
          Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 
                      20                  25                  30          
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          <![CDATA[<400> 57]]>
          Gln Thr Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile 
                      20                  25                  30          
          His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Ser Trp Ile Tyr 
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105     
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          <![CDATA[<400> 58]]>
          Gln Thr Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Lys Val Thr Met Thr Cys 
                      20              
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 59]]>
          Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 60]]>
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          <![CDATA[<400> 60]]>
          Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Ser Trp Ile Tyr 
          1               5                   10                  15  
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          <![CDATA[<400> 61]]>
          Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 
          1               5           
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          <![CDATA[<400> 62]]>
          Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser 
          1               5                   10                  15      
          Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 
                      20                  25                  30          
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          <![CDATA[<400> 63]]>
          Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr 
          1               5                   
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 64]]>
          Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 65]]>
          <![CDATA[<211> 121]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 65]]>
          Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 
                  35                  40                  45              
          Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Gln Ser Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210> 66]]>
          <![CDATA[<211> 30]]>
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          <![CDATA[<400> 66]]>
          Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr 
                      20                  25                  30  
          <![CDATA[<210> 67]]>
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          Asp Tyr Tyr Met Asn 
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          <![CDATA[<210> 68]]>
          <![CDATA[<211> 14]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 68]]>
          Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210> 69]]>
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 69]]>
          Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Gly 
          <![CDATA[<210> 70]]>
          <![CDATA[<211> 32]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 70]]>
          Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln 
          1               5                   10                  15      
          Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210> 71]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 71]]>
          Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 72]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 72]]>
          Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210> 73]]>
          <![CDATA[<211> 111]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 73]]>
          Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe 
                      20                  25                  30          
          Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110     
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 74]]>
          Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 
                      20              
          <![CDATA[<210> 75]]>
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          Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe Gly Val Gly Phe Leu His 
          1               5                   10                  15  
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          <![CDATA[<400> 76]]>
          Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
          1               5                   10                  15  
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          <![CDATA[<211> 7]]>
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          Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser 
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          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 78]]>
          Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 
          1               5                   10                  15      
          Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210> 79]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 79]]>
          Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Tyr Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210> 80]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 80]]>
          Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 81]]>
          <![CDATA[<211> 121]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 81]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
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          <![CDATA[<210> 82]]>
          <![CDATA[<211> 30]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 82]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 
                      20                  25                  30  
          <![CDATA[<210> 83]]>
          <![CDATA[<211> 5]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 83]]>
          Asp Thr Tyr Met His 
          1               5   
          <![CDATA[<210> 84]]>
          <![CDATA[<211> 14]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 84]]>
          Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 
          1               5                   10                  
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          <![CDATA[<211> 17]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 85]]>
          Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210> 86]]>
          <![CDATA[<211> 32]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 86]]>
          Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 
          1               5                   10                  15      
          Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Pro 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210> 87]]>
          <![CDATA[<211> 12]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 87]]>
          Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210> 88]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 88]]>
          Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210> 89]]>
          <![CDATA[<211> 107]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 89]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Phe Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Tyr Asn Thr Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Phe 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210> 90]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 90]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 
                      20              
          <![CDATA[<210> 91]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 91]]>
          Arg Ala Ser Glu Asn Ile Phe Ser Tyr Leu Ala 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210> 92]]>
          <![CDATA[<211> 15]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 92]]>
          Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210> 93]]>
          <![CDATA[<211> 7]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 93]]>
          Asn Thr Arg Thr Leu Ala Glu 
          1               5           
          <![CDATA[<210> 94]]>
          <![CDATA[<211> 32]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 94]]>
          Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser 
          1               5                   10                  15      
          Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210> 95]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 95]]>
          Gln His His Tyr Gly Thr Pro Phe Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210> 96]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 96]]>
          Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 97]]>
          <![CDATA[<211> 120]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 97]]>
          Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ile Thr Tyr Ala Pro Ser Thr Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ala His Tyr Phe Gly Ser Ser Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210> 98]]>
          <![CDATA[<211> 30]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 98]]>
          Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Ser 
                      20                  25                  30  
          <![CDATA[<210> 99]]>
          <![CDATA[<211> 5]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 99]]>
          Ser Tyr Asp Met Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210> 100]]>
          <![CDATA[<211> 14]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 100]]>
          Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Gly Leu Glu Trp Val Ala 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210> 101]]>
          <![CDATA[<211> 17]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 101]]>
          Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ile Thr Tyr Ala Pro Ser Thr Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210> 102]]>
          <![CDATA[<211> 32]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 102]]>
          Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 
          1               5                   10                  15      
          Met Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210> 103]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 103]]>
          His Tyr Phe Gly Ser Ser Gly Pro Phe Ala Tyr 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210> 104]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
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          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 104]]>
          Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210> 105]]>
          <![CDATA[<211> 116]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 105]]>
          Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr 
                  35                  40                  45              
          Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 
                      100                 105                 110         
          Leu Thr Val Leu 
                  115     
          <![CDATA[<210> 106]]>
          <![CDATA[<211> 22]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 106]]>
          Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Ser Leu Thr Cys 
                      20          
          <![CDATA[<210> 107]]>
          <![CDATA[<211> 14]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 107]]>
          Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Ser Ile Tyr 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210> 108]]>
          <![CDATA[<211> 15]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 108]]>
          Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Arg 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210> 109]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 109]]>
          Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210> 110]]>
          <![CDATA[<211> 34]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 110]]>
          Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Cys 
          <![CDATA[<210> 111]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 111]]>
          Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 112]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 112]]>
          Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 113]]>
          <![CDATA[<211> 121]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 113]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210> 114]]>
          <![CDATA[<211> 30]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400> 114]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser 
                      20                  25                  30  
          <![CDATA[<210> 115]]>
          <![CDATA[<211> 5]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 115]]>
          Ser Tyr Trp Met His 
          1               5   
          <![CDATA[<210> 116]]>
          <![CDATA[<211> 14]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 116]]>
          Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210> 117]]>
          <![CDATA[<211> 19]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 117]]>
          Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Gly 
          <![CDATA[<210> 118]]>
          <![CDATA[<211> 19]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 118]]>
          Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Ser Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Gly 
          <![CDATA[<210> 119]]>
          <![CDATA[<211> 32]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 119]]>
          Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 
          1               5                   10                  15      
          Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210> 120]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 120]]>
          Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 121]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 121]]>
          Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210> 122]]>
          <![CDATA[<211> 121]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 122]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Gly Phe Ile Leu Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210> 123]]>
          <![CDATA[<211> 30]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 123]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser 
                      20                  25                  30  
          <![CDATA[<210> 124]]>
          <![CDATA[<211> 5]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 124]]>
          Ser Tyr Trp Met His 
          1               5   
          <![CDATA[<210> 125]]>
          <![CDATA[<211> 14]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 125]]>
          Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210> 126]]>
          <![CDATA[<211> 19]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 126]]>
          Phe Ile Leu Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Gly 
          <![CDATA[<210> 127]]>
          <![CDATA[<211> 32]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 127]]>
          Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 
          1               5                   10                  15      
          Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 
                      20                  25                  30          
          <![CDATA[<210> 128]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 128]]>
          Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 129]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 129]]>
          Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210> 130]]>
          <![CDATA[<211> 121]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成多肽]]>
          <![CDATA[<400> 130]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe 
                      20                  25                  30          
          Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210> 131]]>
          <![CDATA[<211> 4]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 131]]>
          Ala Ala Pro Ala 
          1               
          <![CDATA[<210> 132]]>
          <![CDATA[<211> 4]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<400> 132]]>
          Ala Ala Pro Val 
          1               
          <![CDATA[<210> 133]]>
          <![CDATA[<211> 4]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 人工序列之描述：合成肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222> (4)..(4)]]>
          <![CDATA[<223> Nva]]>
          <![CDATA[<400> 133]]>
          Ala Ala Pro Xaa 
          1
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048

Claims (58)

  1. 一種免疫結合物，其包含藉由連接子共價連接至一或多個8-Het-2-胺基苯并氮呯部分之抗體，且具有式I： Ab-[L-HxBz] pI 或其醫藥學上可接受之鹽， 其中： Ab為具有結合CEA之抗原結合域之抗體構築體； p為1至8之整數； HxBz為具有下式之該8-Het-2-胺基苯并氮呯部分：
    Figure 03_image001
    Het選自雜環基二基及雜芳基二基； R 1、R 2、R 3及R 4獨立地選自由以下組成之群：H、C 1-C 12烷基、C 2-C 6烯基、C 2-C 6炔基、C 3-C 12碳環基、C 6-C 20芳基、C 2-C 9雜環基及C 1-C 20雜芳基，其中烷基、烯基、炔基、碳環基、芳基、雜環基及雜芳基獨立地且視情況經選自以下之一或多個基團取代： -(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 1-C 12烷基二基)-OR 5； -(C 3-C 12碳環基)； -(C 3-C 12碳環基)-*； -(C 3-C 12碳環基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*； -(C 3-C 12碳環基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 3-C 12碳環基)-NR 5-C(＝NR 5)NR 5-*； -(C 6-C 20芳基)； -(C 6-C 20芳基二基)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-N(R 5)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-(C 2-C 20雜環基二基)-*； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-C(＝NR 5a)N(R 5)-*； -(C 2-C 20雜環基)； -(C 2-C 20雜環基)-*； -(C 2-C 9雜環基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*； -(C 2-C 9雜環基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 2-C 9雜環基)-C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 2-C 9雜環基)-NR 5-C(＝NR 5a)NR 5-*； -(C 2-C 9雜環基)-NR 5-(C 6-C 20芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 2-C 9雜環基)-(C 6-C 20芳基二基)-*； -(C 1-C 20雜芳基)； -(C 1-C 20雜芳基)-*； -(C 1-C 20雜芳基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -(C 1-C 20雜芳基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -(C 1-C 20雜芳基)-NR 5-C(＝NR 5a)N(R 5)-*； -(C 1-C 20雜芳基)-N(R 5)C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -C(＝O)-*； -C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -C(＝O)-(C 2-C 20雜環基二基)-*； -C(＝O)N(R 5) 2； -C(＝O)N(R 5)-*； -C(＝O)N(R 5)-(C 1-C 12烷基二基)-*； -C(＝O)N(R 5)-(C 1-C 12烷基二基)-C(＝O)N(R 5)-*； -C(＝O)N(R 5)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)C(＝O)R 5； -C(＝O)N(R 5)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)C(＝O)N(R 5) 2； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)CO 2R 5； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)C(＝NR 5a)N(R 5) 2； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5C(＝NR 5a)R 5； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 8烷基二基)-NR 5(C 2-C 5雜芳基)； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-N(R 5)-*； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-*； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -C(＝O)NR 5-(C 1-C 20雜芳基二基)-(C 2-C 20雜環基二基)-C(＝O)NR 5-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*； -N(R 5) 2； -N(R 5)-*； -N(R 5)C(＝O)R 5； -N(R 5)C(＝O)-*； -N(R 5)C(＝O)N(R 5) 2； -N(R 5)C(＝O)N(R 5)-*； -N(R 5)CO 2R 5； -NR 5C(＝NR 5a)N(R 5) 2； -NR 5C(＝NR 5a)N(R 5)-*； -NR 5C(＝NR 5a)R 5； -N(R 5)C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -N(R 5)-(C 2-C 5雜芳基)； -N(R 5)-S(＝O) 2-(C 1-C 12烷基)； -O-(C 1-C 12烷基)； -O-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -O-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*； -O-C(＝O)N(R 5) 2； -O-C(＝O)N(R 5)-*； -S(＝O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-*； -S(＝O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5) 2； -S(＝O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-NR 5-*；及 -S(＝O) 2-(C 2-C 20雜環基二基)-(C 1-C 12烷基二基)-OH； 或R 2及R 3一起形成5-員或6-員雜環基環； X 1、X 2、X 3及X 4獨立地選自由以下組成之群：鍵、C(＝O)、C(＝O)N(R 5)、O、N(R 5)、S、S(O) 2及S(O) 2N(R 5)； R 5獨立地選自由以下組成之群：H、C 6-C 20芳基、C 3-C 12碳環基、C 6-C 20芳基二基、C 1-C 12烷基及C 1-C 12烷基二基，或兩個R 5基團一起形成5員或6員雜環基環； R 5a選自由C 6-C 20芳基及C 1-C 20雜芳基組成之群； 其中星號*指示L之連接位點，且其中R 1、R 2、R 3及R 4中之一者連接至L； L為選自由以下組成之群的連接子： -C(＝O)-PEG-； -C(＝O)-PEG-C(＝O)N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-C(＝O)-Gluc-； -C(＝O)-PEG-O-； -C(＝O)-PEG-O-C(＝O)-； -C(＝O)-PEG-C(＝O)-； -C(＝O)-PEG-C(＝O)-PEP-； -C(＝O)-PEG-N(R 6)-； -C(＝O)-PEG-N(R 6)-C(＝O)-； -C(＝O)-PEG-N(R 6)-PEG-C(＝O)-PEP-； -C(＝O)-PEG-N +(R 6) 2-PEG-C(＝O)-PEP-； -C(＝O)-PEG-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-； -C(＝O)-PEG-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)N(R 6)C(＝O)-(C 2-C 5單雜環基二基)-； -C(＝O)-PEG-SS-(C 1-C 12烷基二基)-OC(＝O)-； -C(＝O)-PEG-SS-(C 1-C 12烷基二基)-C(＝O)-； -C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-C(＝O)-PEP-； -C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-； -C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-C(＝O)； -C(＝O)-(C 1-C 12烷基二基)-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 6)C(＝O)-(C 2-C 5單雜環基二基)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-C(＝O)N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-C(＝O)-Gluc-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-O-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-O-C(＝O)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-C(＝O)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-N(R 5)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-N(R 5)-C(＝O)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-C(＝O)-PEP-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)N(R 6)-PEG-SS-(C 1-C 12烷基二基)-OC(＝O)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)-； -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)N(R 6)C(＝O)-；及 -丁二醯亞胺基-(CH 2) m-C(＝O)-PEP-N(R 6)-(C 1-C 12烷基二基)N(R 6)C(＝O)-(C 2-C 5單雜環基二基)-； R 6獨立地為H或C 1-C 6烷基； PEG具有式-(CH 2CH 2O) n-(CH 2) m-；m為1至5之整數，且n為2至50之整數； Gluc具有下式：
    Figure 03_image102
    ； PEP具有下式：
    Figure 03_image104
    其中AA獨立地選自天然或非天然胺基酸側鏈，或者一或多個AA及相鄰氮原子形成5員環脯胺酸胺基酸，且波浪線指示連接點； Cyc選自C 6-C 20芳基二基及C 1-C 20雜芳二基，其視情況經一個或多個選自F、Cl、NO 2、-OH、-OCH 3之基團取代，及具有以下結構之葡醣醛酸：
    Figure 03_image106
    ； R 7選自由-CH(R 8)O-、-CH 2-、-CH 2N(R 8)-及-CH(R 8)O-C(＝O)-組成之群，其中R 8選自H、C 1-C 6烷基、C(＝O)-C 1-C 6烷基及-C(＝O)N(R 9) 2，其中R 9獨立地選自由H、C 1-C 12烷基及-(CH 2CH 2O) n-(CH 2) m-OH組成之群，其中m為1至5之整數，且n為2至50之整數，或兩個R 9基團一起形成5員或6員雜環基環； y為2至12之整數； z為0或1；且 烷基、烷基二基、烯基、烯基二基、炔基、炔基二基、芳基、芳基二基、碳環基、碳環基二基、雜環基、雜環基二基、雜芳基及雜芳基二基獨立地且視情況經獨立地選自以下之一或多個基團取代：F、Cl、Br、I、-CN、-CH 3、-CH 2CH 3、-CH＝CH 2、-C≡CH、-C≡CCH 3、-CH 2CH 2CH 3、-CH(CH 3) 2、-CH 2CH(CH 3) 2、-CH 2OH、-CH 2OCH 3、-CH 2CH 2OH、-C(CH 3) 2OH、-CH(OH)CH(CH 3) 2、-C(CH 3) 2CH 2OH、-CH 2CH 2SO 2CH 3、-CH 2OP(O)(OH) 2、-CH 2F、-CHF 2、-CF 3、-CH 2CF 3、-CH 2CHF 2、-CH(CH 3)CN、-C(CH 3) 2CN、-CH 2CN、-CH 2NH 2、-CH 2NHSO 2CH 3、-CH 2NHCH 3、-CH 2N(CH 3) 2、-CO 2H、-COCH 3、-CO 2CH 3、-CO 2C(CH 3) 3、-COCH(OH)CH 3、-CONH 2、-CONHCH 3、-CON(CH 3) 2、-C(CH 3) 2CONH 2、-NH 2、-NHCH 3、-N(CH 3) 2、-NHCOCH 3、-N(CH 3)COCH 3、-NHS(O) 2CH 3、-N(CH 3)C(CH 3) 2CONH 2、-N(CH 3)CH 2CH 2S(O) 2CH 3、- NHC(＝NH)H、-NHC(＝NH)CH 3、-NHC(＝NH)NH 2、-NHC(＝O)NH 2、-NO 2、＝O、-OH、-OCH 3、-OCH 2CH 3、-OCH 2CH 2OCH 3、-OCH 2CH 2OH、-OCH 2CH 2N(CH 3) 2、-O(CH 2CH 2O) n-(CH 2) mCO 2H、-O(CH 2CH 2O) nH、-OCH 2F、-OCHF 2、-OCF 3、-OP(O)(OH) 2、-S(O) 2N(CH 3) 2、-SCH 3、-S(O) 2CH 3及-S(O) 3H。
  2. 如請求項1之免疫結合物，其中該抗體選自拉貝珠單抗(labetuzumab)及阿西莫單抗(arcitumomab)或其生物仿製藥或生物改良藥。
  3. 如請求項1之免疫結合物，其中該抗體構築體包含： a)   包含胺基酸序列SEQ ID NO:3之CDR-L1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:5之CDR-L2、包含胺基酸序列SEQ ID NO:7之CDR-L3、包含胺基酸序列SEQ ID NO:11之CDR-H1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:13之CDR-H2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO:15之CDR-H3； b)   包含胺基酸序列SEQ ID NO:19之CDR-L1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:21之CDR-L2、包含胺基酸序列SEQ ID NO:23之CDR-L3、包含胺基酸序列SEQ ID NO:26之CDR-H1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:28之CDR-H2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO:30之CDR-H3； c)   包含胺基酸序列SEQ ID NO:35之CDR-L1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:37之CDR-L2、包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之CDR-L3、包含胺基酸序列SEQ ID NO:44之CDR-H1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:46之CDR-H2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO:48之CDR-H3； d)   包含胺基酸序列SEQ ID NO:53之CDR-L1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:55之CDR-L2、包含胺基酸序列SEQ ID NO:39之CDR-L3、包含胺基酸序列SEQ ID NO:44之CDR-H1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:46之CDR-H2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO:48之CDR-H3； e)   包含胺基酸序列SEQ ID NO:59之CDR-L1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:61之CDR-L2、包含胺基酸序列SEQ ID NO:63之CDR-L3、包含胺基酸序列SEQ ID NO:67之CDR-H1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:69之CDR-H2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO:71之CDR-H3； f)   包含胺基酸序列SEQ ID NO:75之CDR-L1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:77之CDR-L2、包含胺基酸序列SEQ ID NO:79之CDR-L3、包含胺基酸序列SEQ ID NO:83之CDR-H1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:85之CDR-H2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO:87之CDR-H3； g)   包含胺基酸序列SEQ ID NO:91之CDR-L1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:93之CDR-L2、包含胺基酸序列SEQ ID NO:95之CDR-L3、包含胺基酸序列SEQ ID NO:99之CDR-H1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:101之CDR-H2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO:103之CDR-H3； h)   包含胺基酸序列SEQ ID NO:107之CDR-L1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:109之CDR-L2、包含胺基酸序列SEQ ID NO:111之CDR-L3、包含胺基酸序列SEQ ID NO:115之CDR-H1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:117或118之CDR-H2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO:120之CDR-H3；或 i)    包含胺基酸序列SEQ ID NO:107之CDR-L1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:109之CDR-L2、包含胺基酸序列SEQ ID NO:111之CDR-L3、包含胺基酸序列SEQ ID NO:124之CDR-H1、包含胺基酸序列SEQ ID NO:126之CDR-H2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO:128之CDR-H3。
  4. 如請求項1之免疫結合物，其中該抗體構築體包含可變輕鏈，其包含與選自SEQ ID NO: 1、17、32、50、57、73、89及105之胺基酸序列具有至少95%同一性之胺基酸序列；及可變重鏈，其包含與選自SEQ ID NO: 9、41、65、81、97、113、122及130之胺基酸序列具有至少95%同一性之胺基酸序列。
  5. 如請求項1之免疫結合物之，其中該抗體構築體包含可變輕鏈，其包含選自SEQ ID NO: 1、17、32、50、57、73、89及105之胺基酸序列；及可變重鏈，其包含選自SEQ ID NO: 9、41、65、81、97、113、122及130之胺基酸序列。
  6. 如請求項5之免疫結合物之，其中該抗體構築體包含可變輕鏈，其包含來自SEQ ID NO: 105之胺基酸序列；及重鏈CDR (互補決定區) CDR-H2，其包含來自SEQ ID NO: 118之胺基酸序列。
  7. 如請求項6之免疫結合物之，其中該抗體構築體包含可變輕鏈，其包含來自SEQ ID NO: 105之胺基酸序列；及可變重鏈，其包含來自SEQ ID NO: 113之胺基酸序列。
  8. 如請求項1至7中任一項之免疫結合物，其中Het選自選自由以下組成之群：吡啶基二基、嘧啶基二基、吡唑基二基、哌嗪基二基、哌啶基二基及吡嗪基二基。
  9. 如請求項1至7中任一項之免疫結合物，其中X 1為鍵，且R 1為H。
  10. 如請求項1至7中任一項之免疫結合物，其中X 2為鍵，且R 2為C 1-C 8烷基。
  11. 如請求項1至7中任一項之免疫結合物，其中X 2及X 3各自為鍵，且R 2及R 3獨立地選自C 1-C 8烷基、-O-(C 1-C 12烷基)、-(C 1-C 12烷基二基)-OR 5、-(C 1-C 8烷基二基)-N(R 5)CO 2R 5、-(C 1-C 12烷基)-OC(O)N(R 5) 2、-O-(C 1-C 12烷基)-N(R 5)CO 2R 5及-O-(C 1-C 12烷基)-OC(O)N(R 5) 2。
  12. 如請求項11之免疫結合物，其中R 2為C 1-C 8烷基，且R 3為-(C 1-C 8烷基二基)-N(R 5)CO 2R 5。
  13. 如請求項12之免疫結合物，其中R 2為-CH 2CH 2CH 3且R 3選自-CH 2CH 2CH 2NHCO 2(t-Bu)、-OCH 2CH 2NHCO 2(環丁基)及-CH 2CH 2CH 2NHCO 2(環丁基)。
  14. 如請求項12之免疫結合物，其中R 2及R 3各自獨立地選自-CH 2CH 2CH 3、-OCH 2CH 3、-OCH 2CF 3、-CH 2CH 2CF 3、-OCH 2CH 2OH及-CH 2CH 2CH 2OH。
  15. 如請求項12之免疫結合物，其中R 2及R 3各自為-CH 2CH 2CH 3。
  16. 如請求項12之免疫結合物，其中R 2為-CH 2CH 2CH 3且R 3為-OCH 2CH 3。
  17. 如請求項1至7中任一項之免疫結合物，其中X 3-R 3選自由以下組成之群：
    Figure 03_image484
    Figure 03_image486
  18. 如請求項1至7中任一項之免疫結合物，其中X 4為鍵，且R 4為H。
  19. 如請求項1至7中任一項之免疫結合物，其中R 1連接至L。
  20. 如請求項1至7中任一項之免疫結合物，其中R 2或R 3連接至L。
  21. 如請求項20之免疫結合物，其中X 3-R 3-L選自由以下組成之群：
    Figure 03_image258
    Figure 03_image260
    Figure 03_image262
    其中波浪線指示與N之連接點。
  22. 如請求項1至7中任一項之免疫結合物，其中R 4為C 1-C 12烷基。
  23. 如請求項1至7中任一項之免疫結合物，其中R 4為-(C 1-C 12烷基二基)-N(R 5)-*；其中星號*指示L之連接點。
  24. 如請求項1至7中任一項之免疫結合物，其中L為-C(＝O)-PEG-或-C(＝O)-PEG-C(＝O)-。
  25. 如請求項1至7中任一項之免疫結合物，其中L連接至該抗體之半胱氨酸硫醇。
  26. 如請求項1至7中任一項之免疫結合物，其中對於該PEG，m為1或2，且n為2至10之整數。
  27. 如請求項26之免疫結合物，其中n為10。
  28. 如請求項1至7中任一項之免疫結合物，其中L包含PEP且PEP為二肽且具有下式：
    Figure 03_image264
    。
  29. 如請求項28之免疫結合物，其中AA 1及AA 2獨立地選自H、-CH 3、-CH(CH 3) 2、-CH 2(C 6H 5)、-CH 2CH 2CH 2CH 2NH 2、-CH 2CH 2CH 2NHC(NH)NH 2、-CHCH(CH 3)CH 3、-CH 2SO 3H及-CH 2CH 2CH 2NHC(O)NH 2；或者AA 1及AA 2形成5員環脯氨酸胺基酸。
  30. 如請求項28之免疫結合物，其中AA 1為-CH(CH 3) 2，且AA 2為-CH 2CH 2CH 2NHC(O)NH 2。
  31. 如請求項28之免疫結合物，其中AA 1及AA 2獨立地選自GlcNAc天冬胺酸、-CH 2SO 3H及-CH 2OPO 3H。
  32. 如請求項28之免疫結合物，其中PEP具有下式：
    Figure 03_image266
    其中AA 1及AA 2獨立地選自天然存在之胺基酸之側鏈。
  33. 如請求項1至7中任一項之免疫結合物，其中L包含PEP且PEP為三肽且具有下式：
    Figure 03_image268
    。
  34. 如請求項1至7中任一項之免疫結合物，其中L包含PEP且PEP為四肽且具有下式：
    Figure 03_image270
    。
  35. 如請求項34之免疫結合物，其中 AA 1選自由Abu、Ala及Val組成之群； AA 2選自由Nle(O-Bzl)、Oic及Pro組成之群； AA 3選自由Ala及Met(O) 2組成之群；且 AA 4選自由Oic、Arg(NO 2)、Bpa及Nle(O-Bzl)組成之群。
  36. 如請求項1至7中任一項之免疫結合物，其中L包含PEP且PEP選自由以下組成之群：Ala-Pro-Val、Asn-Pro-Val、Ala-Ala-Val、Ala-Ala-Pro-Ala (SEQ ID NO: 131)、Ala-Ala-Pro-Val (SEQ ID NO: 132)及Ala-Ala-Pro-Nva (SEQ ID NO: 133)。
  37. 如請求項1至7中任一項之免疫結合物，其中L包含PEP且PEP選自以下結構：
    Figure 03_image272
    ；
    Figure 03_image274
    ；
    Figure 03_image276
    ；及
    Figure 03_image278
    。
  38. 如請求項1至7中任一項之免疫結合物，其中L選自以下結構：
    Figure 03_image280
    其中波浪線指示與R 5之連接。
  39. 如請求項1至7中任一項之免疫結合物，其具有式Ia：
    Figure 03_image500
    。
  40. 如請求項39之免疫結合物，其中X 4為鍵，且R 4為H。
  41. 如請求項39之免疫結合物，其中X 2及X 3各自為鍵，且R 2及R 3獨立地選自C 1-C 8烷基、-O-(C 1-C 12烷基)、-(C 1-C 12烷基二基)-OR 5、-(C 1-C 8烷基二基)-N(R 5)CO 2R 5、-(C 1-C 12烷基)-OC(O)N(R 5) 2、-O-(C 1-C 12烷基)-N(R 5)CO 2R 5及-O-(C 1-C 12烷基)-OC(O)N(R 5) 2。
  42. 如請求項39之免疫結合物，其中X 2為O。
  43. 如請求項39之免疫結合物，其選自式Ib-Ii：
    Figure 03_image284
    Ib；
    Figure 03_image286
    Ic；
    Figure 03_image288
    Id；
    Figure 03_image290
    Ie；
    Figure 03_image292
    If；
    Figure 03_image294
    Ig；
    Figure 03_image296
    Ih；及
    Figure 03_image298
    Ii。
  44. 如請求項43之免疫結合物，其中X 2及X 3各自為鍵，且R 2及R 3獨立地選自C 1-C 8烷基、-O-(C 1-C 12烷基)、-(C 1-C 12烷基二基)-OR 5、-(C 1-C 8烷基二基)-N(R 5)CO 2R 5及-O-(C 1-C 12烷基)-N(R 5)CO 2R 5。
  45. 如請求項43之免疫結合物，其中X 2及X 3各自為鍵，R 2為C 1-C 8烷基，且R 3選自-O-(C 1-C 12烷基)及-O-(C 1-C 12烷基)-N(R 5)CO 2R 5。
  46. 一種選自表2a及2b之8-Het-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物。
  47. 一種免疫結合物，其藉由將抗體與選自表2a及2b之8-Het-2-胺基苯并氮呯-連接子化合物結合而製備。
  48. 一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如請求項1至7中任一項之免疫結合物及一或多種醫藥學上可接受之稀釋劑、媒劑、載劑或賦形劑。
  49. 一種用於治療癌症之方法，其包含向有需要之患者投與治療有效量之如請求項1至7中任一項之免疫結合物，其中該癌症選自宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、前列腺癌、胰臟癌、食道癌、膀胱癌、泌尿道癌、尿路上皮癌、肺癌、非小細胞肺癌、默克細胞癌(Merkel cell carcinoma)、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌及乳腺。
  50. 如請求項49之方法，其中該癌症易受由TLR7及/或TLR8促效作用誘導之促炎性反應影響。
  51. 如請求項49之方法，其中該癌症為表現CEA之癌症。
  52. 如請求項49之方法，其中該乳癌為三陰性乳癌。
  53. 如請求項49之方法，其中該默克細胞癌為轉移性默克細胞癌。
  54. 如請求項49之方法，其中該癌症為胃食管結合部腺癌。
  55. 如請求項49之方法，其中該免疫結合物向該患者靜脈內、瘤內或皮下投與。
  56. 如請求項49之方法，其中該免疫結合物以約0.01至20 mg/kg體重之劑量向該患者投與。
  57. 如請求項1至47中任一項之免疫結合物用於治療癌症之用途，其中該癌症選宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、前列腺癌、胰臟癌、食道癌、膀胱癌、泌尿道癌、尿路上皮癌、肺癌、非小細胞肺癌、默克細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌及乳腺。
  58. 一種製備如請求項1之式I之免疫結合物的方法，其中如請求項46之8-Het-2-胺基-噻吩並氮呯-連接子化合物與該抗體結合。
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