TW202233161A

TW202233161A - 初期突發釋放受控之貯庫組成物及其方法

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Publication number: TW202233161A
Application number: TW110149118A
Authority: TW
Inventors: 林德受; 李恩妵
Original assignee: 南韓商天溫輪治療公司
Priority date: 2021-01-29
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2022-09-01
Also published as: WO2022163966A1; EP4285892A1; US20220296524A1; JP2024507598A

Abstract

本發明關於貯庫組成物，其包括在微球中的疏水性胺基酸，該貯庫組成物能夠控制包括生物可降解聚合物及活性成分之調配物中的初期突發釋放過量之活性成分、具有優異的懸浮能力、且能夠均勻地及連續地獲得該活性成分的效應，即使當普通的使用者使用該組成物作為注射用調配物時。

Description

初期突發釋放受控之貯庫組成物及其方法

本發明關於貯庫組成物，特別地藉由包括在微球中的疏水性胺基酸，該貯庫組成物控制初期突發釋放且通過良好的再懸浮性質提供使用者高便利性。本發明關於患者客製化藥物釋放控制(長效注射技術)改良型醫藥產品之技術開發以進入生物產業技術開發-客製化診斷治療產品業務之中東及ASEAN市場(任務號碼：20014981)，該開發係由韓國工業技術評估研究所(Korea Evaluation Institute of Industrial Technology)的支持與貿易、工業及能源部(the Ministry of Trade, Industry and Energy)的資助下進行。

貯庫為容許持久性藥效的注射調配物之一，且為主要在期望長期投予激素及類似物時使用的調配物。貯庫調配物為持續釋放型調配物，其具有對患者的注射次數可減至最少的優點，但是其在注射之後於整個釋放期內不容易達成恆定的藥物持續緩釋。特別地，當輸注開始時過量釋放貯庫中的藥物之初期突發釋放較高時，可能發生由過量的藥物釋放所引起的副作用且藥效的持續效應在一段特定的時間內可能變差，且非常重要的是控制貯庫的初期突發釋放。 GLP-1促效劑(諸如利拉魯肽(liraglutide)和希馬魯肽(semaglutide))為用於治療糖尿病及肥胖症之藥物，最先經開發以降低糖尿病患者的血糖，且確認此類藥物有效減輕肥胖患者的體重。在腸內分泌之腸促胰液素(incretin hormone)激素的類似物增加餐後分泌之胰島素量及增加胃腸內容物排泄之時間，容許食物自胃緩慢地落入小腸中。另外，作用於中樞神經系統以抑制食慾的各種作用可助於降低血糖及減輕體重。然而，當身體暴露於過量的利拉魯肽時，可能會出現副作用，諸如噁心、腹瀉、心率加快、低血糖症或頭痛，且包括利拉魯肽作為活性成分之貯庫的初期突發釋放之控制為更重要的問題之一。同時，日本專利第5681626號揭示包括磷脂組分及其中結合包括固醇之脂質組分及聚乳酸交酯-共-乙交酯(PLGA)聚合物之微球的持續釋放型製劑可控制釋放速率。然而，在脂質的情況下，其未顯出足以抑制初期突發釋放的效應且由於其強的疏水性本質而具有差的微球性質之缺點。另外，因為形成微球之聚乳酸交酯-共-乙交酯(PLGA)聚合物的修飾導致批准藥物使用的難度，因此以該組成物應用於貯庫有實際使用上的限制。另外，在貯庫的情況下，考慮到藥物的儲存安全性，可將微球以冷凍乾燥狀態儲存且懸浮於注射用水中。在此情況下，當微球的懸浮性差時，有可能投予少於一個劑量的配方藥物且因此難以看出足夠的藥物效應。另外，低的懸浮能力可導致團塊形成及微球沉積，可由於注射期間堵塞注射針的現象而難以注射，且微球的懸浮能力亦為非常重要的因素之一。就此而論，因為習知的持續釋放型微球在提供具有充分受控之初期突發釋放的貯庫上的限制，因此對開發具有適當的再懸浮及初期突發釋放控制性質之貯庫組成物仍有需求。 [相關技術文件] [專利文獻] 1. 專利文獻1：日本專利第5681626號

本發明旨在解決上述問題，且本發明之目的為提供具有優異的再懸浮性及抑制過量的藥物初期突發釋放之貯庫組成物、及至被彼之製備方法。本發明之發明人嘗試開發能夠控制過量的藥物初期突發釋放之貯庫組成物，且因此發現在微球的油層及水相層中包括作為釋放控制物質的疏水性胺基酸可抑制藥物的初期突發釋放。另外，確認包括疏水性胺基酸之微球具有作為貯庫之均勻的性質、優異的懸浮能力及優異的製備特徵，且完成本發明。本發明提供包括微球之貯庫組成物，該微球包括油層(O層)，該油層包括生物可降解聚合物及疏水性胺基酸。微球可進一步包括在水相層中的疏水性胺基酸。微球可具有至少0.1 g/ml之總體密度(BD)及介於-8 mV與-30 mV之間的ζ電位。疏水性胺基酸可選自由纈胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸、苯基丙胺酸、色胺酸、異白胺酸和白胺酸所組成之群組。微球可包括在油相溶液中以100重量份生物可降解聚合物為基準計，少於1.5重量份之疏水性胺基酸。微球可為藉由包括以整體水相溶液為基準計，0.05%(w/v)至25%(w)之疏水性胺基酸所製備之微球。生物可降解聚合物可為包括乳酸交酯及乙交酯作為單體之聚合物。生物可降解聚合物可具有0.35 dL/g至0.65 dL/g之固有黏度。另外，本發明亦提供製備貯庫組成物之方法，其包括製備包括疏水性胺基酸及生物可降解聚合物之油相(O)溶液或將油相(O)溶液與包括水溶性溶劑的第一水相(水相1：W1)溶液混合以製備W1/O乳液；且將油相溶液或W1/O乳液引入第二水相(水相2：W2)中以製備O/W2乳液或W1/O/W2乳液。第二水相(W2)溶液可進一步包括疏水性胺基酸。疏水性胺基酸可以100重量份生物可降解聚合物為基準計，少於1.5重量份的量包括在油相溶液中。疏水性胺基酸含量可為以整體第二水相溶液為基準計之0.05%(w/v)至25.0%(w)。該方法進一步包括在乾燥及/或過濾上文所製備的O/W2乳液或W1/O/W2乳液之後離心以回收微球的步驟。包括疏水性胺基酸的本發明之貯庫組成物的微球可在貯庫注射開始時控制在微球中所包括的活性成分之過量釋放、可具有優異的懸浮能力、且可均勻地及連續地獲得活性成分的效應，即使當以注射投予使用者時。

本發明將於下文詳細說明。然而，應理解本發明可採取各種修飾及替代形式，且下文提出之特定實例及說明僅意欲幫助理解本發明，並不意欲限制本發明至特定揭示之形式。應理解本發明之範疇包括落在本發明之精神及範疇內的所有修飾物、等效物及替代物。本發明提供包括微球之貯庫組成物，該微球包括油層(O層)，該油層包括生物可降解聚合物及疏水性胺基酸。本發明之貯庫組成物相當於作為能夠在一段長時間內釋放藥物的調配物之持續釋放型製劑，且更特定言之，可為持續釋放型注射製劑。持續釋放型製劑應在一段時間內以預期的水平緩慢地釋放其中的藥物。出於此目的，有必要在貯庫注射開始時控制其中內部藥物過量釋放的初期突發釋放，且在注射之前製成良好的懸浮液。本發明已生產具有優異的懸浮能力，同時通過混合疏水性胺基酸來控制初期突發釋放之微球，以完成貯庫組成物。本發明之微球可呈包括單一水相層(W層)及單一油層(O層)之O/W的形式。另外，本發明之微球可呈包括水相層(W層)、油層(O層)及水相層(W層)之W/O/W的形式。為了方便說明二或更多個水相層或水相溶液，在此可提及之存在於微球的油層內部之水相層或形成該水相層之水相溶液分別為第一水相(W1層)或第一水相溶液，及在微球的油相外部所形成之水相層或形成該水相層之水相溶液分別為第二水相(W2)層或第二水相。在此情況下，在微球之O/W型中的水相層(W層)或水相溶液應理解為對應於微球之W1/O/W2型中的第二水相(W2層)或第二水相溶液之構型。因此，O/W乳液在本文亦可稱為O/W2乳液，且在以下的說明中，述及之第二水相層(W2層)或第二水相溶液應理解為對應於微球之O/W型的水相層或水相溶液之說明。微球可由單一乳化方法製備，其中將包括生物可降解聚合物及疏水性胺基酸之油相溶液添加至水相溶液中且乳化以形成O/W乳液。微球亦可由雙乳化方法製備，其中將W/O乳液添加至水相溶液中且再乳化以製成W/O/W乳液。特定言之，本發明之微球係由以下方法製備，包括：將疏水性胺基酸及生物可降解聚合物溶解在脂溶性溶劑中以製備油相(O)溶液；或藉由將以活性成分溶解在水溶性溶劑中所製備之第一水相(水相1：W1)溶液與以疏水性胺基酸及生物可降解聚合物溶解在脂溶性溶劑中所製備之油相(O)溶液混合，以製備W1/O乳液；且將油相溶液或W1/O乳液添加至包括水相溶劑的第二水相(水相2：W2)中。本發明之脂溶性溶劑常於所屬技術領域中使用，且可使用任何醫藥上可接受的載劑或溶劑。一個實例可為但不限於二氯甲烷。在本發明中之水溶性溶劑常於所屬技術領域中使用，且可使用任何醫藥上可接受的載劑或溶劑。實例包括但不限於聚乙烯醇(PVA)或乙酸鈉。第二水相溶液可進一步包括在乳液製備期間用於調節溶液的滲透壓之滲透壓調節劑，諸如氯化鈉。本發明之微球可進一步包括在水相層中的疏水性胺基酸。水相層可為第二水相層。特定言之，微球可藉由將油相溶液或W1/O乳液添加至以疏水性胺基酸溶解在水相溶劑中所製備之水相溶液中來製備。在本發明中，當微球的油層及水相層兩者皆包括疏水性胺基酸時，除了抑制微球內部之活性成分過量釋放的初期突發釋放抑制效應以外，亦顯著地改進貯庫組成物之懸浮能力，且因此組成物可有效地用作為可注射劑。本發明之微球可具有0.1 g/ml或更大的總體密度(BD)值。總體密度(BD)係指當粉末或顆粒材料填充至特定容器中時，以包括顆粒間空隙的體積為基準之密度。當貯庫組成物中的微球之總體密度小於0.1 g/ml時，使微球太輕而不能用作為可注射劑。特別地，由於微球的龐大本質，使再懸浮期間於注射用水中有分散性差的問題。本發明之微球具有0.1 g/ml或更大的總體密度、具有優異的再懸浮性能及具有作為可注射劑之優異的性質。本發明之微球可具有-8 mV或更小的ζ電位值。 ζ電位係以粒子之間的吸引力及排斥力的大小為單位表示，且本發明之微球可具有-8 mV或更小的ζ電位。當ζ電位值大於-8 mV時，使關注之微球在注射用水中可具有降低的分散性且快速沉積。微球較佳地具有-8 mV至-40 mV或-10 mV至-30 mV之ζ電位值。當滿足上述範圍時，微球具有優異的分散性，使得微球可很好地懸浮於注射用水中，且在此情況下，可形成均勻的貯庫懸浮液，由此提供特別作為注射製劑之優異的特徵。本發明之微球進一步包括活性成分。亦即，因為本發明之貯庫組成物適合投予體內而在一段特定的時間內釋放活性成分至體內，所以可將活性成分包括在貯庫組成物的內部。可將活性成分包括在微球中，且接受微球的保護及在體內續留一段特定的時間。可將活性成分包括在本發明之微球的第一水相層(W1層)或油層(O層)中。在單一乳液的情況下，活性成分通常可包括在油層中，及在雙乳液的情況下，活性成分通常可包括在第一水相層中。以釋放為目的而於本發明使用之活性成分較佳地可為治療特定疾病或症狀之藥物，更佳為生物醫藥或肽藥物。特定的藥物可為利拉魯肽或希馬魯肽。利拉魯肽或希馬魯肽可用於治療肥胖症或糖尿病，因為GLP-1促效劑涉及類升糖素肽-1 (GLP-1)(其為扮演降低血糖的角色之激素)的作用。當身體暴露於過量的利拉魯肽或希馬魯肽時，可能出現症狀，諸如嘔吐、噁心、低血糖症、頭痛及類似者。因此，當包括利拉魯肽或希馬魯肽作為貯庫組成物之活性成分時，非常重要的是活性成分不自貯庫過量釋放。另外，因為利拉魯肽或希馬魯肽為肽藥物且難以維持或儲存，所以有一種將貯庫組成物乾燥且以粉末形式儲存以解決該問題之方法。在此情況下，應將粉末懸浮於注射用水中以用於注射，且當粉末有差的懸浮能力時，無法形成均勻的製劑。因此，藥效之均勻性降低，發生微球的團聚及沉積，或可產生漂浮之微球，且因此可能難以確保受控之釋放效應。因此，在包括利拉魯肽或希馬魯肽作為活性成分的情況下，非常重要的是抑制初期突發釋放及成就(implement)懸浮能力優異的製劑。為了提供具有此初期突發釋放控制能力之貯庫組成物，因此微球的油層(O層)含有生物可降解聚合物及疏水性胺基酸。在胺基酸之中，疏水性胺基酸不具有極性部分且選自由纈胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸、苯基丙胺酸、色胺酸、異白胺酸和白胺酸所組成之群組。其較佳地可為白胺酸。當疏水性胺基酸包括在本發明之微球的油層中時，有可能藉由以疏水性胺基酸減少微球表面的小孔且藉由部分抑制存在於第一水相層或油層中的一些活性成分自油相層出來而控制初期突發釋放，因為存在於O層的疏水性胺基酸與水不親近。當疏水性胺基酸只包括在第一水相層中時，使過量的活性成分之初期突發釋放未受到有效的控制，及當疏水性胺基酸只包括在第二水相層中時，有以下問題：由於使用過量的原料(疏水性胺基酸)而使溶解時間增加及由於原料成本增加而使製造程序和程序成本增加。另一方面，當疏水性胺基酸包括在油層中或在油層及第二水相層兩者中時，具有可獲得有效的初期突發釋放控制效應的優點，即使只含有低含量的疏水性胺基酸，且可顯著地改進貯庫之懸浮能力。微球可包括在油相溶液中以100重量份生物可降解聚合物為基準計，少於1.5重量份之疏水性胺基酸。當疏水性胺基酸係以1.5重量份或更多的量混合時，由於微球表面之不均勻性而有貯庫藥物之均勻性降低的問題。更特定言之，微球可包括在油相溶液中以100重量份生物可降解聚合物為基準計，大於0.07至1.1重量份或0.3至1.1重量份之疏水性胺基酸。在此情況下，微球對活性成分具有優異的初期突發釋放抑制效應。在此態樣中，本發明之微球可包括在油層中以100重量份生物可降解聚合物為基準計，少於1.5重量份；大於0.07至1.1重量份；或0.3至1.1重量份之疏水性胺基酸。當疏水性胺基酸係以100重量份聚合物為基準計，1.5重量份或更多的量包括在油層中時，有微球表面變得不均勻且使貯庫藥物之均勻性降低的問題。另外，在其中疏水性胺基酸只包括在僅油層中的情況下，當疏水性胺基酸的含量為0.07重量份或更少時，由於親水性胺基酸而使初期突發釋放控制效應很小。另外，本發明之微球可為那些經製備而包括相對於包括水溶性溶劑及疏水性胺基酸之整體水相溶液，0.05%(w/v)至25%(w)之疏水性胺基酸的微球。在水相層中，當疏水性胺基酸的含量為0.005%(w/v)或更少時，微球的總體密度變得太低，不適合用作為可注射劑。生物可降解聚合物具有在活體內降解且形成本發明之微球的性質，且當聚合物在活體內逐漸降解時，包括在其中的藥物可逐漸釋放。亦即，其適合於藥物釋放期間保護內部的藥物且控制藥物在一段長時間內釋放。經各國家的藥物安全部特定批准用於可注射製劑之生物可降解聚合物可用於本發明中而沒有限制。生物可降解聚合物可具有0.35至0.65 dL/g，較佳為0.50至0.55 dL/g之固有黏度。當固有黏度小於0.35 dL/g時，其可能顯出比所欲時間段更快的藥物釋放，及當固有黏度大於0.65 dL/g時，其顯出比所欲時間段更慢的藥物釋放，所以其可能難以達成充分的藥物效應。在一個較佳的具體例中，使用0.53 dL/g之黏度聚合物以維持一段長時間內的藥物釋放性質，作為最適化維持藥物持久性之貯庫組成物，使其具有生物可利用性。固有黏度可根據由製造商所提供測量聚(乳酸交酯-共-乙交酯)(PLGA)的黏度之方法來測量。特定言之，生物可降解聚合物可為包括乳酸交酯及乙交酯作為單體之聚合物。當包括乳酸交酯及乙交酯作為單體，所有上述聚合物皆包括在本發明中，無關於聚合形式。亦意味著包括其中聚合物的末端經修飾之支鏈聚合物。此等聚合物的實例可選自但不限於由聚乳酸交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(乳酸交酯-共-乙交酯(PLGA)和葡萄糖-PLGA所組成之群組。在此態樣中，可將本發明之微球稱為PLGA微球。生物可降解聚合物可具有以下如凝膠過濾層析術分析所測定之各個分子量的分子量分布：500至4,000之分子量範圍為3%或更大，5,000至16,000之分子量範圍為10%或更大及少於30%，及16,000至40,000之分子量範圍為20%或更大及少於50%，及40,000或更大的分子量範圍為20%或更大。本發明之貯庫組成物可進一步包括醫藥上可接受的載劑或賦形劑等。然而，本發明之貯庫組成物較佳地可不包括穩定劑、pH修飾劑及氧化劑。另外，本發明亦提供製備貯庫組成物之方法，其包括製備包括疏水性胺基酸及生物可降解聚合物之油相(O)溶液，或將油相(O)溶液與包括水溶性溶劑的第一水相(水相1：W1)溶液混合以製備W1/O乳液；且將油相溶液或W1/O乳液引入第二水相(水相2：W2)中以製備O/W2乳液或W1/O/W2乳液。該方法亦可能進一步包括在乾燥及/或過濾之後離心所製備的乳液以回收微球的步驟。第一水相(水相1：W1)溶液可藉由將活性成分溶解在水溶性溶劑中來製備。在本發明中的水溶性溶劑常於所屬技術領域中使用，且可使用任何醫藥上可接受的載劑或溶劑。實例包括但不限於聚乙烯醇(PVA)或乙酸鈉。活性成分係指自本發明之貯庫組成物釋放為目的所包括的藥物，且不受類型的限制及可用於本發明中。特定言之，其可為水溶性藥物且可為生物醫藥或肽藥物。一個實例可為利拉魯肽或希馬魯肽。油相(O)溶液可藉由將生物可降解聚合物及疏水性胺基酸混合且溶解在脂溶性溶劑中來製備。亦可將活性成分混合且溶解在油相溶液中。特別地，在以單一乳化方法生產微球的情況下，在添加其中混合活性成分之油相溶液至水相溶液中的同時，可生產乳液。可使用本發明之技術領域中常使用的溶劑作為包括活性成分之油相溶液中的溶劑。本發明之脂溶性溶劑常於所屬技術領域中使用，且可使用任何醫藥上可接受的載劑或溶劑。一個實例可為但不限於二氯甲烷。疏水性胺基酸可以100重量份生物可降解聚合物為基準計，少於1.5重量份的量包括在油相溶液中。當疏水性胺基酸係以1.5重量份或更多的量包括油相溶液中時，有微球表面變得不均勻且使貯庫藥物之均勻性降低的問題。另外，當疏水性胺基酸只包括在僅油溶液中時，當含量少於0.07重量份時，藉由親水性胺基酸的初期突發釋放控制效應不顯著。 O/W乳液可藉由將油相混合在水相中且以均質機攪拌來製備。可使用的攪拌速率及時間係取決於乳液形成條件及樣本量而定。第二水相(W2)溶液可藉由包括水溶性溶劑來製備。在本發明中的水溶性溶劑常於所屬技術領域中使用，且可使用任何醫藥上可接受的載劑或溶劑。實例包括但不限於聚乙烯醇(PVA)或乙酸鈉。第二水相溶液可進一步包括在乳液製備期間用於調節溶液的滲透壓之滲透壓調節劑，諸如氯化鈉。另外，水溶性溶劑可進一步包括聚乙烯醇、甲基纖維素、聚乙烯基吡咯啶酮、羧甲基纖維素、卵磷脂、明膠、聚氧乙烯、氧乙烯去水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油衍生物及其混合物。另外，所包括之疏水性胺基酸含量可為以整體第二水相溶液為基準計，0.05%(w/v)至25.0%(w)。當第二水相溶液含有0.005%(w/v)或更少的疏水性胺基酸時，微球的總體密度變得太低，不適合用作為可注射劑。本發明亦提供包括微球之貯庫組成物，其係以上述方法製備。在此情況下，有可能獲得具有優異的懸浮能力，同時對微球中的活性成分具有優異的初期突發釋放抑制效應之貯庫組成物。本發明將於下文以製備例及實驗例的方式詳細說明。以下的實施例及實驗例僅例證本發明且不限制本發明之範疇。 製備例：準備試驗及製備微球製備例1-1：製備微球製備第一水相(水相1：W1)溶液：將作為API的252 mg之利拉魯肽(Polypeptide Laboratories)或希馬魯肽溶解在1.2 mL之1 wt%之乙酸鈉(Daejung Chemicals & Metals Co. Ltd.)溶液中。製備油相(O)溶液：將1350 mg之DL-乳酸-乙醇酸共聚物(聚D,L-乳酸-共-乙交酯；Resomer select 5545 DLG 5Glu, Evonik；固有黏度0.53 dl/g)溶解在5 mL之二氯甲烷(Dichloromethane，Honeywell)中。製備W1/O乳液：將W1與O溶液混合且以均質機在9000 rpm下攪拌2分鐘。接下來，製備第二水相(水相2：W2)溶液：將0.5 g之氯化鈉(NaCl；Daejung Chemicals & Metals Co. Ltd)溶解在100 mL之1 wt%之聚乙烯醇(PVA；Gohsenol EG-40P，Nippon Gohsei)溶液中。製備W1/O/W2乳液：以均質機在9000 rpm下攪拌，同時將W1/O乳液以5 ml/min之速率注入W2相溶液中。將所製備之W1/O/W2乳液在水中於室溫下經3小時乾燥，通過具有 75 um網孔大小的篩網過濾且接著離心以回收微球。將所回收之微球再分散於蒸餾水中且接著離心三次以清洗微球表面。在清洗之後，將微球凍乾，最後獲得包括封裝於其中的藥物之微球。將此方法所製備之微球用作為以下實驗中的本發明之微球的對照物。製備例1-2：製備包括疏水性胺基酸之微球製備用於長效調配物中的初期突發釋放控制的包括疏水性胺基酸之微球，以確認其釋放控制效應。使用纈胺酸、甲硫胺酸、苯基丙胺酸、色胺酸或白胺酸作為疏水性胺基酸。特定的製備方法係與製備例1之方法相同，除了將疏水性胺基酸混合在第一水相(水相1：W1)溶液、油相(O)溶液及/或第二水相(水相2：W2)中以外。當疏水性胺基酸混合在第一水相(水相1：W1)溶液或油相(O)溶液中時，將其與主要組分(利拉魯肽或希馬魯肽)以1：1之莫耳比混合，及當疏水性胺基酸混合在第二水相(水相2：W2)中時，將其與氯化鈉(NaCl)以相同的濃度混合。特定的製備調配物係根據各實驗而改變。 [ 測試方法 ]1. 利拉魯肽或希馬魯肽含量的評估將20 mg之微球放入20 mL量瓶中，以10 mL之乙腈溶解在，以1 wt%之乙酸鈉溶液調整至刻度線，以0.45針筒過濾器過濾且以高性能液相層析術定量利拉魯肽或希馬魯肽的量。在此時，使用Aegispak C18-L管柱，在1.0 mL/min之流速下，在215 nm下使用0.05 M磷酸二氫鉀與乙腈以53：47混合之溶劑作為移動相測量分析條件。 2. 釋放測試將20 mg經凍乾之微球在DISTEK Dissolution system 2500中，在120 rpm及37℃下使用包括0.05%之聚山梨醇酯80的100 mL之磷酸鹽緩衝液(1×PBS)接受釋放測試。取出2 mL之樣本且離心以分離上清液及微球，且以高性能液相層析術定量存在於上清液中的利拉魯肽或希馬魯肽的量。在此時，使用Aegispak C18-L管柱，在1.0 mL/min之流速及215 nm下使用0.05 M磷酸二氫鉀與乙腈以53：47混合之溶劑作為移動相測量分析條件。自微球初期突發釋放之藥物確認在上述方法中經1小時溶析之利拉魯肽的量，且長期釋放確認經35天溶析之利拉魯肽的量。 3. SEM測量將約10 mg之微球固定在鋁台上且在0.1托之真空及高電壓(10 kV)下以鉑塗佈3分鐘，接著安裝在SEM粉末上且使用影像分析程式觀察微球表面。 4. 粒徑測量微球的大小係使用來自Malvern的Mastersizer測量。將約30 mg之微球懸浮在5 ml之蒸餾水中，且將懸浮液加進分散裝置中且接著在2800 rpm及超音波50%的條件下分散1分鐘以測量大小。 5. 懸浮密度測量當本發明之微球再懸浮於注射溶劑中時，確認很好地分散之懸浮密度。懸浮密度係使用來自Mettler Toledo的D5測量。將534 mg之微球懸浮在2 ml之溶劑部分中且注入儀器的小室(cell)中以測量密度。懸浮密度的參考值係以未經處理之微球的1.01 g/cm ³之懸浮密度為基準測定。 6. ζ電位測量在50 mg之微球分散於3 ml之純水之後，使用來自Malvern之Nano-ZS儀器測量ζ電位。 7. 總體密度測量將1 ml之微球填充至微量離心管(Eppendorf tube)且測量經填充之微球的質量。 8. DSC測量 DSC測量係使用微差掃描熱量儀執行。將5至10 mg之各微球放入鋁中且以5℃/min自25℃至250℃測量。 試驗例 1 ：確認藉由混合疏水性胺基酸的初期突發釋放控制效應進行以下實驗以測定在微球中的疏水性胺基酸是否能控制過量的藥物釋放。根據與製備例1之微球製備方法相同的方法，生產包括疏水性胺基酸的微球：將作為疏水性胺基酸之白胺酸在製備微球的各階段混合在第一水相(水相1：W1)溶液、油相(O)溶液及/或第二水相(水相2：W2)之各者中且製備乳液。特定的製備條件係與製備例1之微球製備條件相同，除了將疏水性胺基酸混合在各溶液中以外。當疏水性胺基酸混合在第一水相(水相1：W1)溶液或油相(O)溶液中時，將其與主要組分(利拉魯肽或希馬魯肽)以1：1之莫耳比混合，及當疏水性胺基酸混合在第二水相(水相2：W2)中時，將其與氯化鈉(NaCl)以相同的濃度混合。微球之特定的製備調配物係如表1中所示。

為了確認根據表1的不包括疏水性胺基酸之微球(比較例1)、其中白胺酸混合在第一水相溶液中之微球(實施例1-1)、其中白胺酸混合在第二水相溶液中之微球(實施例1-2)、藉由將白胺酸混合在油相溶液中所製備之微球(實施例1-3)及藉由將白胺酸同時與油相溶液及第二水相溶液混合所獲得之微球(實施例1-4)的初期突發釋放抑制效應，以根據測試方法1和2的條件確定利拉魯肽(API)之含量及釋放速率，且依照測試方法3和4的條件使用SEM照片觀察微球表面，且測量各微球的平均粒徑(D[4,3])。將結果顯示於以下表2及圖1A至1E中。再者，為了確認藉以投予希馬魯肽的不包括疏水性胺基酸之微球(比較例S-1)及其中白胺酸同時混合在油相溶液及第二水相溶液中之微球(實施例S-1)的初期突發釋放抑制效應，以根據測試方法1和2的條件確認希馬魯肽(API)之含量及釋放速率，且根據測試方法3和4的條件使用SEM照片觀察微球表面，且測量各微球的平均粒徑(D[4,3])。將結果顯示於以下表2及圖1F至1G。

如表2及圖1A至1G中所示，可確認許多小孔存在於比較例1和比較例S-1之微球表面上且因此API的初期突發釋放亦較大。另外，即使在第一水相層中包括白胺酸之微球的情況下(實施例1-1)，亦未獲得覆蓋小孔的效應且因此無法獲得初期突發釋放抑制效應。然而，當白胺酸包括在油層(O)及/或第二水相層(W2)中時，可看出微球之小孔被覆蓋且在表面上幾乎觀察不到小孔。特定言之，在其中白胺酸只包括在油層中的情況下(實施例1-3)，微球本身的性質有些差，但是在其中白胺酸包括在油層及第二水相層兩者中的情況下(比較例1至4和S-1)，確認亦具有良好的性質，同時具有API的初期突發釋放控制效應。 試驗例 2 ：確認取決於疏水性胺基酸類型 的 初期突發釋放控制效應為了確認除了白胺酸以外的疏水性胺基酸是否可同樣地抑制微球的初期突發釋放，在微球製備步驟中分別混合纈胺酸、甲硫胺酸、苯基丙胺酸、色胺酸和白胺酸所製備之微球中確認API利拉魯肽之釋放。在與比較例1之微球製備相同的方式製備微球的同時，將疏水性胺基酸在製備微球的階段期間分別與油相(O)溶液及第二水相(水相2：W2)混合，以製備包括親水性胺基酸之微球。特定的製備條件係與比較例1之微球製備條件相同，除了將疏水性胺基酸混合在各溶液中以外。在油相(O)溶液中，將各疏水性胺基酸以相對於主要組分(利拉魯肽)的1：1之莫耳比混合，及在第二水相(水相2：W2)中，將各疏水性胺基酸與氯化鈉以相同的濃度混合。微球之特定的製備調配物係如以下表3中所示。

為了確認根據表3的不包括疏水性胺基酸之微球(比較例1)、包括纈胺酸之微球(實施例2-1)、包括甲硫胺酸之微球(實施例2-2)、包括苯基丙胺酸之微球(實施例2-3)、包括色胺酸之微球(實施例2-4)及包括白胺酸之微球(實施例2-5)中的初期突發釋放抑制效應，以根據測試方法1和2的條件確定利拉魯肽(API)之含量及釋放速率，根據測試方法3和4使用SEM照片觀察微球表面，且測量各微球的平均粒徑(D[4,3])，且將結果顯示於以下表4及圖2A至2E中。

如表4及圖2A至2E中所示，與比較例1之微球的表面及API釋放量相比(圖1A)，包括纈胺酸、甲硫胺酸、苯基丙胺酸、色胺酸或白胺酸之所有微球(實施例2-1至2-5)的小孔減少，表明API(利拉魯肽)的初期突發釋放亦受到抑制。這意指當製備微球時，使得疏水性胺基酸包括在油相及W2相中，可使疏水性胺基酸起作用以抑制微球釋放。 試驗例 3 ：確認微球之塗佈的初期突發釋放抑制效應之差異與其中疏水性胺基酸包括在微球中的情況相比，確認即使當微球在製備之後以疏水性胺基酸塗佈時是否亦能抑制初期突發釋放。特定言之，製備調配物係如表5中所示，且微球係根據製備例1所述之條件及方法製備(比較例2)。將上文所製備的比較例2之微球再懸浮於白胺酸溶液中且接著凍乾(比較例3)。製備白胺酸溶液：將每1 g之微球混合0.5 g之白胺酸，維持懸浮液10分鐘且接著執行凍乾。

因此，為了確認以上所製備的比較例2和比較例3之微球的初期突發釋放抑制效應，以根據測試方法1和2的條件測定利拉魯肽(API)之含量及釋放速率，且根據測試方法3和4使用SEM照片觀察微球表面，且測量各微球表面的平均粒徑(D[4,3])，且將結果顯示於以下表6及圖3A和3B中。

如以上表6及圖3A和3B中所示，當微球經疏水性胺基酸簡單地塗佈時(比較例3)，可看出即使與未經塗佈之微球(比較例2)相比時，亦無法獲得釋放抑制效應，反而使釋放量增加。因此，可看出在本發明包括疏水性胺基酸之微球中所獲得的釋放抑制效應為藉由乳液製備步驟中控制微球的小孔及表面可獲得的疏水性胺基酸之獨特效應。 試驗例 4 ：確認根據其他的疏水性材料類型的初期突發釋放控制效應為了確認是否可在本發明的疏水性胺基酸之微球中獲得初期突發釋放抑制效應，即使在使用其他材料的情況下，以藉由使用膽固醇(其為疏水性材料之一)及DOTAP(其為陽離子脂質)來確認是否可抑制微球的初期突發釋放。在與比較例1之微球製備相同的方式製備微球的同時，將膽固醇或DOTAP在製備微粒的階段期間混合在油相(O)中，以製備包括膽固醇或DOTAP之微球。在油相(O)溶液中，將膽固醇或DOTAP以相對於主要組分(利拉魯肽)的1：1之莫耳比混合。微球之特定的製備調配物顯示於以下表7中。

為了確認根據表7的不包括疏水性胺基酸之微球(比較例1)、包括膽固醇之微球(比較例4-1)及包括DOTAP之微球(比較例4-2)中的利拉魯肽(API)之釋放，以根據測試方法1和2的條件確認利拉魯肽(API)之含量及釋放速率，依照測試方法3和4的條件使用SEM照片觀察微球表面，且測量各微球表面的平均粒徑(D[4,3])，且將結果顯示於以下表8及圖4A和4B中。

如表8及圖4A和4B中所示，當與比較例1之微球的表面及API釋放量(圖1A)相比時，可看出包括膽固醇或DOTAP之微球的比較例4-1和4-2未抑制API(利拉魯肽)的初期突發釋放，或發生API含量降低的現象。另外，即使當以SEM確認表面時，亦可確認微球中有大量小孔或無法產生光滑的表面。因此，以上結果顯示本發明之微球的初期突發釋放抑制效應為疏水性胺基酸在PLGA微球中的特定效應。 試驗例 5 ：藉由疏水性胺基酸的含量確認釋放控制抑制效應為了測定對本發明之微球中的微球內部之藥物的釋放抑制效應受否受到疏水性胺基酸含量的影響，以疏水性胺基酸的含量來測定微球中的API之釋放及微球本質。在根據比較例1所述之微球製備方法製備微球的同時，使用白胺酸作為疏水性胺基酸，且油相及/或第二水相之製備差別只在於白胺酸的混合。另外，製備不包括疏水性胺基酸之微球(比較例5)且使用其作為對照物。用於各實驗組之製備微球的配方及釋放控制組分之特定含量及混合步驟係如以下表9中所示。釋放控制組分係以相對於形成微球的生物可降解聚合物(PLGA)量之%(w/w)釋放控制組分表示。

為了確認根據表9的不包括疏水性胺基酸之微球(比較例5)、在油層中包括白胺酸之微球(實施例3-1、3-2和3-2)及在油層及W2層中包括白胺酸之微球(實施例4-1、4-2、4-3和4-4)中的利拉魯肽(API)之釋放，以根據測試方法1和2的條件確定利拉魯肽(API)之含量及釋放速率，根據測試方法3和4的條件使用SEM照片觀察微球表面，且測量各微球表面的平均粒徑(D[4,3])，且將結果顯示於以下表表10、圖5A至5C及圖6A至6D中。

另外，各微球的物理化學性質(總體密度(BD)、懸浮密度、ζ電位)係根據測試方法5至8測量且顯示於表11中。

如以上表10和11中所示，可確認白胺酸(其為實施例3-1至3-3和實施例4-1至4-4之疏水性胺基酸)對包括在O層或O及W2層中之微球中的API具有初期突發釋放抑制效應。特別在實施例3-2之微球的情況下，可確認其為具有優異的API釋放抑制作用及均勻的表面和微球形狀之製劑。再者，在此情況下，注射分散性為良好的，ζ電位為適當的，且當微球懸浮於注射用水中時，分散性為優異的，且發現組成物具有適合作為注射用調配物的特徵。然而，確認當白胺酸包括在僅O層中及與聚合物相比的白胺酸含量為0.07%(w/w)時，釋放控制效應略微降低。另外，即使在其中白胺酸包括在O層中的情況下，當白胺酸的含量係相對於整體W2水相溶液為0.05%(w/v)或更少時，粒子的總體密度值(總體密度，BD，g/ml)太低，且發現粒子顯出難以用作為注射用調配物的性質。然而，在實施例4-1和4-2之微球的情況下，可看出在O層及W2層兩者中包括白胺酸容許更好的API之初期突發釋放控制且提供具有非常均勻的微球形狀之調配物。特別地可看出懸浮密度為適當的，注射分散性為良好的，且ζ電位值為顯著優異的。這意指微球在注射用水中的分散性為優異的，且本發明之微球具有作為注射製劑之顯著優異的性質。再者，如圖7中所示，比較例5、比較例4-2和實施例4-1之微球的DSC分析確認沒有改變聚合物及藥物的熱行為及晶形，即使當白胺酸包括在微球中時。如圖8中所示，比較例5、實施例3-2和實施例4-2之微球的長期釋放行為經確認為35天，且因此確認藥物係以零級方式連續釋放4週，同時本發明包括白胺酸之微球的初期溶析控制1天內維持在5%或更少及經4天在15%或更少。這顯示本發明在油層或油層及W2層中包括白胺酸之PLGA微球具有抑制初期突發釋放及維持持續釋放之非常優異的效應，且具有用作為貯庫的性質。 試驗例 6 ：測定活體內初期突發釋放抑制及持續釋放效應執行該實驗以確認微球的活體內藥物釋放行為。將根據表1的實施例1-4和比較例1所製備之微球(28 mg /kg，利拉魯肽)經皮下投予具有300 g平均體重的5隻8週齡SD大鼠(雄性)，且在0、1、2、4、8、10、12、24、48、96、168、336、504、672、1008小時收集血液。隨後，在SD大鼠之血漿樣本中，在各時間點之血液中的利拉魯肽濃度係使用酵素連結免疫吸附檢定法(ELISA)測量。在此時，GLP-1 (活性) ELISA (IBL，德國)係作為套組使用。利拉魯肽濃度隨時間的變化顯示於圖9中。在圖9中的結果說明在實驗中所使用的5隻小鼠之平均值。如圖9中所示，與比較例1之微球(其為一般的微球形式)相比，可看出包括疏水性胺基酸之微球(實施例1至4)具有降低4.4倍的生理活性物質之最大血液濃度(Cmax)，且直到第42天仍具有卓越的持續釋放效應。

[圖1A至1G]顯示根據本發明之具體例所製備之PLGA微球的SEM照片。特定言之，圖1A至1E顯示使用利拉魯肽作為API的情況下，其中圖1A顯示不包括疏水性胺基酸之微球；圖1B顯示包括在第一水相層中的疏水性胺基酸之微球；圖1C顯示包括在第二水相層中的疏水性胺基酸之微球；圖1D顯示包括在油層中的疏水性胺基酸之微球，及圖1E顯示包括在油層及第二水相中的疏水性胺基酸之微球。另外，圖1F至1G顯示使用希馬魯肽作為API的情況，其中圖1F顯示不包括疏水性胺基酸之微球；及圖1G顯示包括在油層及第二水相層中的疏水性胺基酸之微球。 [圖2A至2E]顯示依照本發明之具體例所製備之PLGA微球的SEM照片，其中圖2A顯示包括纈胺酸之微球；圖2B顯示包括甲硫胺酸之微球；圖2C顯示包括苯基丙胺酸之微球；圖2D顯示包括色胺酸之微球；及圖2E顯示包括白胺酸之微球。 [圖3A和3B]顯示根據本發明之具體例所製造之PLGA微球的SEM照片，其中圖3A顯示不包括疏水性胺基酸之微球；及圖3B顯示不包括親水性胺基酸且以白胺酸塗佈之微球。 [圖4A和4B]顯示根據本發明之具體例所製備之PLGA微球的SEM照片，其中圖4A顯示包括膽固醇之微球；及圖4B顯示包括二油醯基-3-三甲基銨丙烷(DOTAP)(其為陽離子脂質)之微球。 [圖5A至5C]顯示根據本發明之具體例所製備之PLGA微球的SEM照片，該微球包括在油層中的白胺酸。 [圖6A至6D]顯示根據本發明之具體例所製造之PLGA微球的SEM照片，該微球包括在油層及第二水相層中的白胺酸。 [圖7]為顯示根據本發明之具體例所製備之微球的DSC分析結果之圖形。 [圖8]為顯示根據本發明之具體例所製備之微球的長期釋放特徵之圖形。 [圖9]為顯示鑑定根據本發明之具體例所製備之微球的活體內藥物釋放行為的結果之圖形。

Claims

一種包含微球之貯庫組成物，該微球包含油層(O層)，該油層包含生物可降解聚合物及疏水性胺基酸。
如請求項1之貯庫組成物，其中該微球進一步包含在水相層中的疏水性胺基酸。
如請求項1或2之貯庫組成物，其中該微球具有0.1 g/ml或更大的總體密度(BD)及介於-8 mV與-30 mV之間的ζ電位。
如請求項1或2之貯庫組成物，其中該疏水性胺基酸係選自由纈胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸、苯基丙胺酸、色胺酸、異白胺酸和白胺酸所組成之群組。
如請求項1之貯庫組成物，其中該微球包含在油相溶液中以100重量份之該生物可降解聚合物為基準計，少於1.5重量份之疏水性胺基酸含量。
如請求項2之貯庫組成物，其中該微球包含以整體水相溶液為基準計，0.05%(w/v)至25%(w)之疏水性胺基酸含量。
如請求項1或2之貯庫組成物，其中該生物可降解聚合物為包含乳酸交酯及乙交酯作為單體之聚合物。
如請求項7之貯庫組成物，其中該生物可降解聚合物具有0.35至0.65 dL/g之固有黏度(25℃)。
一種製備貯庫組成物之方法，其包含：製備包含疏水性胺基酸及生物可降解聚合物之油相(O)溶液，或將包含水溶性溶劑的第一水相(水相1：W1)溶液與油相(O)溶液混合以製備W1/O乳液；且將該油相溶液或W1/O乳液引入第二水相(水相2：W2)溶液中以形成O/W2乳液或W1/O/W2乳液。
如請求項9之方法，其中該第二水相(水相2：W2)溶液進一步包含疏水性胺基酸。
如請求項9之方法，其中該疏水性胺基酸係以100重量份之該生物可降解聚合物為基準計，少於1.5重量份的量包含在油相溶液中。
如請求項10之方法，其中該疏水性胺基酸含量為以整體第二水相溶液為基準計之0.05%至25.0%(w/v)。
如請求項9或10之方法，進一步包含在乾燥及/或過濾上文所製備的該O/W2乳液或該W1/O/W2乳液之後離心以回收微球之步驟。