TW202229331A - 抗htlv-1抗體 - Google Patents
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Abstract
提供一種抗HTLV-1抗體、及含有該抗體作為有效成分的藥劑,該抗HTLV-1抗體係預防HTLV-1非感染者之感染、或防止或治療HTLV-1感染者之HTLV-1為原因的疾病之發病。
一種抗體,其具有下述(i)~(vi)之性質:
(i)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的單株抗體;
(ii)辨識由序列識別號61所表示的HTLV-1之套膜蛋白質gp46之胺基酸序列的第192~196號之胺基酸序列所構成的表位;
(iii)對HTLV-1 gp46肽180~204號的結合解離常數(KD)為50nM以下;及
(iv)對序列識別號61所表示HTLV-1的套膜蛋白質gp46之胺基酸序列的191~196號各次以Ala取代1殘基而成的6種類之gp46部分肽的親和力,係與未經取代的gp46部分肽相同。
Description
本發明係關於一種抗體、及含該抗體的醫藥組成物,該抗體為與HTLV-1結合並中和的抗體,且防止HTLV-1的感染及預防或治療HTLV-1感染為原因的疾病發病。
人類T細胞白血病病毒1型(Human T-cell Leukemia Virus type 1:HTLV-1)屬於δ-反轉錄病毒(deltaretrovirus),會將CD4陽性T細胞癌化。估計HTLV-1的感染者在全世界中為1000至2000萬人,常見於非洲中南部、南美洲北中部、加勒比海地區、澳洲中部、巴布亞新幾內亞、日本(非專利文獻1)。作為HTLV-1之特徵,可列舉藉由已經被HTLV-1感染的T細胞與未感染的T細胞接觸而感染。即,對於在人類-人類之間的感染,必須有來自感染者的細胞進入體內並進行細胞之間的接觸。關於感染路徑,雖然近年來性行為等為原因的水平感染有所增加,但多數為透過母乳之在母嬰之間的垂直感染(非專利文獻2)。
HTLV-1之感染者的5%左右有成人T細胞白血病(Adult T-cell Leukemia:ATL)、HTLV-1相關的脊髓病(HTLV-1 Associated Myelopathy:HAM)、HTLV-1相關的葡萄膜炎(HTLV-1 associated Uveitis:HU)等發病(非專利文獻3)。又,已知ATL於感染後40~50年後發病。知悉HTLV-1為ATL的流行病學致病病毒以來,已經過近40年(非專利文獻4),但迄今並無對預防HTLV-1感染有效之疫苗開發的報告。另一方面,有關於抗HTLV-1的中和抗體(LAT-27)的報告(非專利文獻5),且藉由將該中和抗體對末梢血人類化小鼠在感染前進行投予,而確認了防止對HTLV-1的感染(非專利文獻6及7)。
由以上而可期待抗HTLV-1抗體對HTLV-1的感染之防止、作為預防或治療ATL等起因於HTLV-1的疾病的藥劑之活用。
[先前技術文獻]
[非專利文獻]
[非專利文獻1] Gassain A, et al. Epidemiological aspects and world distribution of HTLV-1 infection, Frontier in Microbiology, 2012, Volume 3, Article 388
[非專利文獻2] Ishitsuka K, et al. Human T-cell leukemia virus Type I (HTLV-I) and adult T-cell leulkaemia-lymphoma, Lancet Oncology, 2014, Volume 15, pp e517-e526
[非專利文獻3] Uchiyama T. Human T-cell leukemia virus Type I (HTLV-I) and human diseases, Annual Review of Immunology, 1997, Volume 15, pp 15-37
[非專利文獻4] Hinuma Y,et al. Adult T-cell leukemia: antigen in an ATL cell line and detection of antibodies to the antigen in human sera, Proceedings of National Academy of U.S.A., 1981, Volume 78, pp 6476-6480
[非專利文獻5] Tanaka Y, et al. Identification of a neutralization epitope on the envelope gp46 antigen of human T cell leukemia virus type I and induction of neutralizaing antibody by peptide immunization, Journal of Immunology, 1991, Volume 147, pp 354-360
[非專利文獻6] Saito M, et al. The neutralizaingfunction of the anti-HTLV-1 antibody is essential in preventing in vivo transmission of HTLV-1 to human T cells in NOD-SCID/γcnull(NOG) mice, Retrovirology, 2014, Volume 11, Article 74
[非專利文獻7] Fujii H, et al. A potencial of ananti-HTLV-I gp46 neutralizaing monoclonal antibody(LAT-27) for passive immunization against both horizontal and mother-to-child vertical infection with human T cell leukemia virus type-I, Viruses, 2016, Volume 8, Article 41
[發明欲解決之課題]
本發明以提供一種抗HTLV-1抗體、及含有該抗體作為有效成分的藥劑為目的,該抗HTLV-1抗體係預防HTLV-1非感染者之感染、或防止或治療HTLV-1感染者之HTLV-1為原因的疾病之發病。
[用以解決課題之手段]
本發明人等,為了對HTLV-1具有中和活性,而取得將為HTLV-1之套膜(envelope)蛋白質的gp62作為抗原之源自大鼠的抗HTLV-1抗體。為了使其能夠在人類投予,而將該抗體之可變區人類化而成的人類化抗HTLV-1抗體,係在與源自人類化前之大鼠的抗HTLV-1抗體之比較中,確認維持對抗原肽的親和性。為了取得因具有ADCC或ADCP等效應子(effector)功能而具有對感染細胞的殺細胞活性的抗體,將該抗體的子類設為人類IgG1。
即,本發明係如以下。
[1] 一種具有下述(i)~(iv)之性質的抗體:
(i)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的單株抗體;
(ii)辨識由序列識別號61所表示的HTLV-1之套膜蛋白質gp46之胺基酸序列的第192~196號之胺基酸序列所構成的表位;
(iii)對HTLV-1 gp46肽180~204號的結合解離常數(KD)為50nM以下;
(iv)對將序列識別號61所表示HTLV-1的套膜蛋白質gp46之胺基酸序列的191~196號各次以Ala取代1殘基而成的6種類之gp46部分肽的親和力,係與未經取代的gp46部分肽相同。
[2] 如[1]之抗體,其中對HTLV-1 gp46肽180~204號的結合解離常數(KD)為30nM以下。
[3] 如[1]之抗體,其中對HTLV-1 gp46肽180~204號的結合解離常數(KD)為10nM以下。
[4] 如[1]~[3]中任一項之抗體,其進一步對HTLV-1感染細胞具有ADCC活性。
[5] 如[4]之抗體,其進一步對HTLV-1具有中和活性。
[6] 如[5]之抗體,其中中和活性為合胞體(syncytium)形成抑制活性,於4μg/mL以下之濃度顯示合胞體形成抑制活性。
[7] 如[6]之抗體,其於2μg/mL以下之濃度顯示合胞體形成抑制活性。
[8] 如[6]或[7]之抗體,其於1μg/mL以下之濃度顯示合胞體形成抑制活性。
[9] 如[1]~[8]中任一項之抗體,其中該抗體為嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。
[10] 一種辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的單株抗體,其包含輕鏈以及重鏈,
該輕鏈包含:
(a)由序列識別號1表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL1、
(b)由序列識別號2表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL2、及
(c)由序列識別號3表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL3;
該重鏈包含:
(d)由序列識別號7表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH1、
(e)由序列識別號8表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH2、及
(f)由序列識別號9表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH3。
[11] 一種辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的單株抗體,其包含輕鏈可變區以及重鏈可變區,
該輕鏈可變區係:(ai)由序列識別號15表示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、或
(aii)由與序列識別號15表示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成,且具有對HTLV-1之結合活性的輕鏈可變區;
該重鏈可變區係:
(bi)由序列識別號19表示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區、或
(bii)由與序列識別號19表示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成,且具有對HTLV-1之結合活性的重鏈可變區。
[12] 一種辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的單株抗體,其包含輕鏈以及重鏈,
該輕鏈包含:
(a)由序列識別號4表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL1、
(b)由序列識別號5表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL2、及
(c)由序列識別號6表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL3;
該重鏈包含:
(d)由序列識別號10表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH1、
(e)由序列識別號11表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH2、及
(f)由序列識別號12表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH3。
[13] 一種辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的單株抗體,其包含輕鏈可變區以及重鏈可變區,
該輕鏈可變區係:
(ai)由序列識別號16表示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、或
(aii)由與序列識別號16表示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成,且具有對HTLV-1之結合活性的輕鏈可變區;
該重鏈可變區係:
(bi)由序列識別號20表示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區、或
(bii)由與序列識別號20表示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成,且具有對HTLV-1之結合活性的重鏈可變區。
[14] 以下之(1)~(24)中任一項之人類化抗HTLV-1抗體:
(1)包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號32之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體;
(2)包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號32之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體;
(3)包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號34之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體;
(4)包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號34之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體;
(5)包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號36之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體;
(6)包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號36之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體;
(7)包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號38之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體;
(8)包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號38之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體;
(9)包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號40之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體;
(10)包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號40之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體;
(11)包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號42之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體;
(12)包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號42之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體;
(13)包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號32之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體;
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(15)包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號34之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體;
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(18)包含由與由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號36之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體;
(19)包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號38之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體;
(20)包含由與由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號38之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體;
(21)包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號40之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體;
(22)包含由與由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號40之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體;
(23)包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號42之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體;及
(24)包含由與由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號42之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體。
[15] 以下之(1)~(24)中任一項之人類化抗HTLV-1抗體:
(1)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號32之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(2)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號32之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(3)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號34之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(4)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號34之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(5)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號36之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(6)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號36之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(7)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號38之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(8)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號38之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(9)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號40之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(10)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號40之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(11)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號42之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(12)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號42之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(13)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號32之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(14)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號32之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(15)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號34之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(16)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號34之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(17)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號36之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(18)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號36之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(19)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號38之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(20)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號38之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(21)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號40之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(22)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號40之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(23)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號42之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈;及
(24)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號42之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈。
[16] 以下之(1)~(8)中任一項之人類化抗HTLV-1抗體:
(1)包含由序列識別號56之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號54之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈之抗體;
(2)包含由與由序列識別號56之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號54之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈之抗體;
(3)包含由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號48之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈之抗體;
(4)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號48之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(5)包含由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號50之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈之抗體;
(6)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號50之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(7)包含由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號52之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈之抗體;及
(8)包含由與由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號52之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈之抗體。
[17] 以下之(1)~(8)中任一項之人類化抗HTLV-1抗體:
(1)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號56之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號54之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(2)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號56之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號54之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(3)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號48之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(4)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號48之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(5)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號50之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(6)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號50之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈;
(7)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號52之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈;及
(8)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體包含由與由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號52之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈。
[18] 一種抗體,其包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號32之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈。
[19] 一種抗體,其包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號34之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈。
[20] 一種抗體,其包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號40之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈。
[21] 一種抗體,其包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號42之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈。
[22] 一種抗體,其包含由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號48之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈。
[23] 一種抗體,其包含由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號52之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈。
[24] 如[1]~[23]中任一項之抗體,其係包含羧基末端之1至數個胺基酸缺失的重鏈的抗體。
[25] 如[24]之抗體,其於2條重鏈的雙方在羧基末端有1個之胺基酸殘基缺失。
[26] 如[24]或[25]之抗體,其中重鏈之羧基末端的脯胺酸殘基進一步被醯胺化。
[27] 一種多核苷酸,其包含編碼如[1]~[26]中任一項之抗體之重鏈及輕鏈的胺基酸序列的核苷酸序列。
[28] 一種載體,其包含如[27]之多核苷酸。
[29] 一種宿主細胞,其包含如[27]之多核苷酸或如[28]之載體。
[30] 一種如[1]~[26]中任一項之抗體之製造方法,其包含培養如[29]之宿主細胞,並自培養物純化抗體。
[31] 一種以如[30]之方法所製造的抗體。
[32] 一種醫藥組成物,其含有如[1]~[26]及[31]中任一項之抗體作為有效成分。
[33] 如[32]之醫藥組成物,其用於防止對HTLV-1的感染。
[34] 如[33]之醫藥組成物,其中感染為水平感染或母子間的垂直感染。
[35] 如[32]之醫藥組成物,其用以對HTLV-1感染者,預防及治療起因於HTLV-1的疾病之發病,該疾病選自包含成人T細胞白血病・淋巴瘤(ATLL)、HTLV-1相關的脊髓病(HAM)及HTLV-1葡萄膜炎(HU)的群組。
[36] 如[33]~[35]中任一項之醫藥組成物,其中HTLV-1為變異株。
[37] 一種醫藥組成物,其特徵為將如[1]~[26]及[31]中任一項之抗體、以及至少一種抗癌劑,同時地、各別地或連續地投予至個體。
[38] 一種預防或治療起因於HTLV-1的疾病之發病之方法,其包含對HTLV-1感染者,投予如[1]~[26]及[31]中任一項之抗體、及[32]~[37]中任一項之醫藥組成物,而該起因於HTLV-1的疾病選自包含成人T細胞白血病・淋巴瘤(ATLL)、HTLV-1相關的脊髓病(HAM)及HTLV-1葡萄膜炎(HU)的群組。
[39] 如[38]之方法,其中HTLV-1為變異株。
本說明書包含日本專利申請第2020-159654號之揭示內容,其為本案優先權之基礎。
[發明之效果]
本發明之抗HTLV-1抗體,由於與為HTLV-1之套膜蛋白質之gp46強烈地相互作用,藉此對HTLV-1顯示中和作用以防止感染,且具有於活體外的ADCC功能,因此期待利用對HTLV-1感染細胞的殺細胞活性之感染細胞的排除。
[用以實施發明的形態]
以下,詳細地說明本發明。
抗HTLV-1抗體之特性
本發明係辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗HTLV-1抗體。
人類T細胞白血病病毒1型(Human T-cell Leukemia Virus type 1:HTLV-1),係除了編碼構造蛋白質的gag基因、編碼反轉錄酶的pol基因、編碼病毒表面之套膜蛋白質的env基因等構造基因之外,於pX區域編碼Tax基因及HBZ基因等複數個調節基因群。env基因編碼gp62,且藉由蛋白酶,而切割成gp46與gp21兩個區域,gp46係於表面露出並與受體結合,而gp21為跨膜區域。
HTLV-1之套膜蛋白質gp62的胺基酸序列已揭示於UniProt Accession No.:P03381,gp46相當於胺基酸序列之1~312號。
於本發明所使用的單株抗體,係以gp46或其片段作為免疫原,而將小鼠、大鼠、兔子、倉鼠、豚鼠、馬、猴、狗、豬、牛、山羊、綿羊、駱駝、羊駝、駱馬等之哺乳動物或雞、鴕鳥、鯊魚、鯉魚等免疫,將脾臟細胞等與骨髓瘤融合而製作融合瘤,且作為融合瘤所產生分泌的抗體來獲得。融合瘤可藉由周知方法而製作。
作為免疫原之gp46,可基於序列資訊來化學合成,又亦可基於編碼蛋白質的DNA序列資訊,以周知方法作為重組蛋白質來獲得。再者,作為免疫原,可使用編碼HTLV-1的DNA、mRNA、或併入彼等而成的病毒載體、或轉染彼等而成的動物細胞等。
抗體之篩選雖可以任意之方法進行,但較佳為若藉由使用轉染編碼gp62與為HTLV-1之受體分子的GLUT1的DNA而成的動物細胞之流式細胞分析技術來進行篩選即可。將gp62及GLUT1的胺基酸序列示於序列表之序列識別號60、63。
本發明之抗HTLV-1抗體係對於HTLV-1具有中和活性。
此時,抗HTLV-1抗體具有效應子功能,若與自然殺手細胞、巨噬細胞等之吞噬細胞的Fcγ受體等之Fc受體結合,則期待各自藉由ADCC(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity:抗體依存性細胞毒性)及ADCP(Antidoby-Dependent Cellular Phagocytosis:抗體依存性細胞吞噬作用),而攻擊感染了HTLV-1的CD4陽性T細胞。人類IgG1係已知於人類IgG子類之中,藉由補體結合的CDC(Complement-Dependent Cytotoxicity:補體依存性細胞毒性)活性、ADCC活性等效應子功能強,且藉由促進藉由效應子功能的細胞障礙所致的HTLV-1感染細胞之細胞死亡的誘導,而顯示治療效果(J. Exp. Med.(1987),166,p.1351-1361)。
對HTLV-1的中和活性,係例如可以合胞體形成抑制活性來表示,本發明之抗體,係於4μg/mL以下之濃度、較佳為於2μg/mL以下之濃度、進一步較佳為於1μg/mL以下之濃度具有合胞體形成抑制活性。
本發明之抗體之結合解離常數(KD),係例如以SPR法測定的情形,對HTLV-1 gp46肽180~204號的KD値,為50nM以下、40nM以下、35nM以下、30nM以下、25nM以下、20nM以下、15nM以下或10nM以下。
再者,本發明之抗體保持著對下述變異體肽之結合活性,該變異體肽係將HTLV-1之套膜蛋白質gp46的胺基酸序列之191~196號各次以Ala取代1殘基而成。這意味著這樣的抗體對表位部位中任一者之1至2以上的胺基酸被取代為其它胺基酸的HTLV-1變異株亦會結合,並可發揮中和活性。即,本發明之抗體被期待可防止HTLV-1變異株之感染,且亦可預防或治療HTLV-1變異株感染為原因的疾病之發病。
抗體重鏈恆定區包含CH1、鉸鏈、CH2及CH3區域,CH1被定義為EU索引118至215,鉸鏈被定義為EU索引216至230,CH2被定義為EU索引231至340,CH3被定義為EU索引341至446。
又,已知哺乳類培養細胞所生產的抗體之重鏈的羧基末端之離胺酸殘基缺失(Int. J. Biol. Macromol.(2013),52,p.139-147)。然而,此重鏈序列之缺失,對抗體之抗原結合能力及效應子功能並不造成影響。因此,本發明亦包含重鏈羧基末端之離胺酸殘基缺失的抗體。又,本發明亦包含重鏈羧基末端之1至數個胺基酸缺失的抗體。數個為1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個或9個。
人類嵌合抗體及人類化抗體
本發明之抗HTLV-1抗體亦包含為了使對人類的異種抗原性降低而經改變的人類嵌合抗體及人類化抗體。人類化抗體亦稱為CDR移植抗體。
人類嵌合抗體
人類嵌合抗體,係指包含人類以外之動物的抗體的輕鏈可變區及重鏈可變區、與人類抗體之輕鏈恆定區及重鏈恆定區的抗體。人類嵌合抗體可藉由下述而製作:由產生抗HTLV-1抗體的融合瘤採集編碼輕鏈可變區的cDNA及編碼重鏈可變區的cDNA,插入至具有編碼人類抗體之輕鏈恆定區及重鏈恆定區的cDNA的表現載體而構築人類嵌合抗體表現載體,導入至宿主細胞而使表現。
重鏈恆定區係由3個域CH1、CH2及CH3所構成。於本發明中,係如上述,嵌合抗體之人類重鏈恆定區為IgG1子類之重鏈恆定區。又,就輕鏈恆定區而言,若屬於人類Ig即可,為κ或λ恆定區。
作為本發明之抗HTLV-1抗體之人類嵌合抗體之例,可列舉具有大鼠抗HTLV-1單株抗體MAb1及MAb98之可變區的人類嵌合抗體、cMAb1及cMAb98。此等2個抗體為與HTLV-1之結合性高的抗體。其中又較佳為cMAb1,其係具有高活性的抗體。
抗體cMAb1
編碼cMAb1之輕鏈可變區的cDNA之核苷酸序列,為序列表之序列識別號13表示的核苷酸序列(圖8),而cMAb1的輕鏈可變區之胺基酸序列為序列表之序列識別號15表示的胺基酸序列(圖8)。
又,編碼cMAb1之重鏈可變區的cDNA之核苷酸序列,為序列表之序列識別號17表示的核苷酸序列(圖9),而cMAb1的重鏈可變區之胺基酸序列為序列表之序列識別號19表示的胺基酸序列(圖9)。
即,本發明之抗HTLV-1抗體為會與HTLV-1結合的抗HTLV-1抗體,該HTLV-1包含由序列識別號15表示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由序列識別號19表示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區。
又,編碼本發明之抗體之輕鏈可變區或重鏈可變區的DNA,亦包含下述DNA:於使用上述之序列識別號13表示的核苷酸序列或序列識別號17表示的核苷酸序列及CLUSTAL W(對齊工具)等(例如,預設值即初期設定的參數)而計算時,由具有至少85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、特佳為97%以上、98%以上、或99%以上之序列同一性的核苷酸序列所構成的DNA,且編碼具有抗體之輕鏈可變區或重鏈可變區的活性、即對HTLV-1之結合活性的蛋白質的DNA。
又,編碼本發明之抗體之輕鏈可變區或重鏈可變區的DNA,亦包含下述DNA:可於嚴格條件下與由與上述之序列識別號13表示的核苷酸序列或序列識別號17表示的核苷酸序列互補的序列所構成的DNA雜交的DNA,且編碼具有抗體之輕鏈可變區或重鏈可變區之活性、即對HTLV-1之結合活性的蛋白質的DNA。
又,編碼抗體之CDR的核苷酸序列部分,係較佳為與序列識別號13表示的核苷酸序列或序列識別號17表示的核苷酸序列相同。
又,上述之輕鏈可變區或重鏈可變區不僅包含由序列識別號15表示的胺基酸序列或序列識別號19表示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區或重鏈可變區,亦包含由該胺基酸序列中有1或數個、例如1~10個、較佳為1~5個、進一步較佳為1或2個、進一步較佳為1個胺基酸缺失、取代、附加的胺基酸序列所構成,且由具有抗體之重鏈可變區或輕鏈可變區之活性、即對HTLV-1之結合活性的蛋白質所構成的輕鏈可變區或重鏈可變區。
就此種序列識別號15表示的胺基酸序列或序列識別號19表示的胺基酸序列中有1或數個胺基酸缺失、取代、或附加的胺基酸序列而言,可列舉:於使用序列識別號15表示的胺基酸序列或序列識別號19表示的胺基酸序列、與CLUSTAL W(對齊工具)等(例如,預設值即初期設定的參數)而計算時,具有至少85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、特佳為97%以上、98%以上、或99%以上之序列同一性者。
具有此種序列識別號15表示的胺基酸序列或序列識別號19表示的胺基酸序列中有1或數個胺基酸缺失、取代、或附加的胺基酸序列的蛋白質,係與具有序列識別號15表示的胺基酸序列或序列識別號19表示的胺基酸序列的蛋白質實質上相同。
又,抗體之CDR序列部分,係較佳為與序列識別號15表示的胺基酸序列或序列識別號19表示的胺基酸序列相同。
再者,cMAb1包含由序列識別號1表示的胺基酸序列(KSSQTLLYSGNQKNYLA)所構成的CDRL1、由序列識別號2表示的胺基酸序列(WASTRQS)所構成的CDRL2、由序列識別號3表示的胺基酸序列(QQYFATPIT)所構成CDRL3作為輕鏈可變區之CDR(Complementarity Determining Region:互補決定區),又包含由序列識別號7表示的胺基酸序列(GFTFGGFPMA)所構成的CDRH1、由序列識別號8表示的胺基酸序列(TISPGAVNTY)所構成的DRH2、由序列識別號9表示的胺基酸序列(EGYGFSSFEY)所構成的CDRH3作為重鏈可變區之CDR(圖30)。
即,本發明之抗HTLV-1抗體,係包含由序列識別號1表示的胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號2表示的胺基酸序列所構成的CDRL2、由序列識別號3表示的胺基酸序列所構成的CDRL3,又包含由序列識別號7表示的胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號8表示的胺基酸序列所構成的CDRH2、由序列識別號9表示的胺基酸序列所構成的CDRH3作為重鏈可變區之CDR的抗體。
上述之各CDR亦包含:由各自所表示的胺基酸序列中有1或數個、較佳為1或2個、更佳為1個胺基酸缺失、取代、附加的胺基酸序列所構成的CDR。
抗體cMAb98
編碼cMAb98之輕鏈可變區的cDNA之核苷酸序列,為序列表之序列識別號14表示的核苷酸序列(圖10),而cMAb98的輕鏈可變區之胺基酸序列為序列表之序列識別號16表示的胺基酸序列(圖10)。
又,編碼cMAb98之重鏈可變區的cDNA之核苷酸序列,為序列表之序列識別號18表示的核苷酸序列(圖11),而cMAb98的重鏈可變區之胺基酸序列為序列表之序列識別號20表示的胺基酸序列(圖13)。
即,本發明之抗HTLV-1抗體為會與HTLV-1結合的抗HTLV-1抗體,其包含由序列識別號16表示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、及由序列識別號20表示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區。
又,編碼本發明之抗體之輕鏈可變區或重鏈可變區的DNA,亦包含下述DNA:於使用上述之序列識別號14表示的核苷酸序列或序列識別號18表示的核苷酸序列與CLUSTAL W(對齊工具)等(例如,預設值即初期設定的參數)而計算時,由具有至少85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、特佳為97%以上、98%以上、或99%以上之序列同一性的核苷酸序列所構成的DNA,且編碼具有抗體之輕鏈可變區或重鏈可變區的活性、即對HTLV-1之結合活性的蛋白質的DNA。
又,編碼本發明之抗體之輕鏈可變區或重鏈可變區的DNA,亦包含下述DNA:可於嚴格條件下與由與上述之序列識別號14表示的核苷酸序列或序列識別號18表示的核苷酸序列互補的序列所構成的DNA雜交的DNA,且編碼具有抗體之輕鏈可變區或重鏈可變區之活性、即對HTLV-1之結合活性的蛋白質的DNA。
又,編碼抗體之CDR的核苷酸序列部分,係較佳為與序列識別號14表示的核苷酸序列或序列識別號18表示的核苷酸序列相同。
又,上述之輕鏈可變區或重鏈可變區不僅包含由序列識別號16表示的胺基酸序列或序列識別號20表示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區或重鏈可變區,亦包含由該胺基酸序列中有1或數個、例如,1~10個、較佳為1~5個、更佳為1或2個、更佳為1個胺基酸缺失、取代、附加的胺基酸序列所構成,且由具有抗體之重鏈可變區或輕鏈可變區之活性,即對HTLV-1之結合活性的蛋白質所構成的輕鏈可變區或重鏈可變區。
就此種序列識別號16表示的胺基酸序列或序列識別號20表示的胺基酸序列中有1或數個胺基酸缺失、取代、或附加的胺基酸序列而言,可列舉:於使用序列識別號16表示的胺基酸序列或序列識別號20表示的胺基酸序列、與CLUSTAL W(對齊工具)等(例如,預設值即初期設定的參數)而計算時,具有至少85%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、特佳為97%以上、98%以上、或99%以上之序列同一性者。
具有此種序列識別號16表示的胺基酸序列或序列識別號20表示的胺基酸序列中有1或數個胺基酸缺失、取代、或附加的胺基酸序列的蛋白質,係與具有序列識別號16表示的胺基酸序列或序列識別號20表示的胺基酸序列的蛋白質實質上相同。
又,抗體之CDR序列部分,係較佳為與序列識別號16表示的胺基酸序列或序列識別號20表示的胺基酸序列相同。
再者,cMAb98包含由序列識別號4表示的胺基酸序列(KSSQSLLFSGYQKNYLA)所構成的CDRL1、由序列識別號5表示的胺基酸序列(WASTRQS)所構成的CDRL2、由序列識別號6表示的胺基酸序列(QQYFDTPLT)所構成的CDRL3作為輕鏈可變區之CDR,又包含由序列識別號10表示的胺基酸序列(GFTFSGSPMG)所構成的CDRH1、由序列識別號11表示的胺基酸序列(TISPTGATTY)所構成的CDRH2、由序列識別號12表示的胺基酸序列(EGYGYSSFDY)所構成的CDRH3作為重鏈可變區之CDR(圖31)。
即,本發明之抗HTLV-1抗體,係包含由序列識別號4表示的胺基酸序列所構成的CDRL1、由序列識別號5表示的胺基酸序列所構成的CDRL2、由序列識別號6表示的胺基酸序列所構成的CDRL3,又包含由序列識別號10表示的胺基酸序列所構成的CDRH1、由序列識別號11表示的胺基酸序列所構成的CDRH2、由序列識別號12表示的胺基酸序列所構成的CDRH3作為重鏈可變區之CDR的抗體。
上述之各CDR亦包含:由各自所表示的胺基酸序列中有1或數個、較佳為1或2個、更佳為1個胺基酸缺失、取代、附加的胺基酸序列所構成的CDR。
人類化抗體
人類化抗體(CDR移植抗體),係指將人類以外之動物的抗體的輕鏈可變區及重鏈可變區之CDR的胺基酸序列移植到人類抗體的輕鏈可變區及重鏈可變區的適當位置的抗體。
本發明之人類化抗HTLV-1抗體,可藉由對動物細胞導入藉由以下之方法所構築的人類化抗體表現載體而使其表現、製造。即,構築編碼下述可變區的cDNA,該可變區係將由會產生與HTLV-1結合並中和的單株抗體之融合瘤所產生的人類以外之動物的抗體的輕鏈可變區及重鏈可變區之CDR的胺基酸序列,移植到任意之人類抗體的輕鏈可變區及重鏈可變區之框架區域而成。可藉由將該cDNA插入至具有編碼人類抗體之輕鏈恆定區及重鏈恆定區的基因的動物細胞用表現載體,而構築人類化抗體表現載體。
具體而言,若合成以連結MAb1或MAb98的CDR與人類抗體的框架區域之方式設計的DNA序列即可。選擇透過CDR而連結的人類抗體之框架區域,使CDR形成良好的抗原結合部位。又,必要的情形,亦可取代抗體之可變區中的框架區域的胺基酸,使人類化抗體之CDR形成適當的抗原結合部位。經移植CDR的人類化抗體之製作,可利用周知之CDR移植(CDR grafting)技術進行。
人類化MAb1抗體
上述之方法中,就具有MAb1之重鏈可變區的CDR(包含序列識別號7~9所示的胺基酸的3個CDR)的人類化抗體之重鏈,且可變區之框架區域之一部分的胺基酸被取代的重鏈而言,可列舉人類化抗體重鏈hMAb1_H1及人類化抗體重鏈hMAb1_H2。又,就具有MAb1之輕鏈可變區的CDR(包含序列識別號1~3所示的胺基酸的3個CDR)的人類化抗體之輕鏈,且可變區之框架區域之一部分的胺基酸被取代的輕鏈而言,可列舉人類化抗體輕鏈hMab1_L11、人類化抗體輕鏈hMAb1_L12、人類化抗體輕鏈hMAb1_L13、人類化抗體輕鏈hMAb1_L41、人類化抗體輕鏈hMAb1_L42及人類化抗體輕鏈hMAb1_L43。
將人類化抗體重鏈hMAb1_H1之全長核苷酸序列示於序列識別號43,將胺基酸序列示於序列識別號44。又,將人類化抗體重鏈hMAb1_H2之全長核苷酸序列示於序列識別號45,將胺基酸序列示於序列識別號46。於序列識別號43及45中,各自由第1~57號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼訊息序列,由第58~414號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼可變區,由第415~1404號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼恆定區。又,於序列識別號44及46中,由第1~19號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為訊息序列,由第20~138號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為可變區,由第139~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為恆定區之胺基酸序列。
本發明之抗HTLV-1抗體包含下述抗體:具有由序列識別號44或46之第20~138號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區與由第139~468號之胺基酸殘基所構成的重鏈恆定區的抗體。
將人類化抗體輕鏈hMAb1_L11之全長核苷酸序列示於序列識別號31,將胺基酸序列示於序列識別號32。又,將人類化抗體輕鏈hMAb1_L12之全長核苷酸序列示於序列識別號33,將胺基酸序列示於序列識別號34。再者,將人類化抗體輕鏈hMAb1_L13之全長核苷酸序列示於序列識別號35,將胺基酸序列示於序列識別號36。將人類化抗體輕鏈hMAb1_L41之全長核苷酸序列示於序列識別號37,將胺基酸序列示於序列識別號38。又,將人類化抗體輕鏈hMAb1_L42之全長核苷酸序列示於序列識別號39,將胺基酸序列示於序列識別號40。再者,將人類化抗體hMAb1_L43之全長核苷酸序列示於序列識別號41,將胺基酸序列示於序列識別號42。於序列識別號31、33、35、37、39及41中,各自由第1~60號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼訊息序列,第61~402號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼可變區,第403~720號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼恆定區。於序列識別號32、34、36、38、40及42中,第1~20號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為訊息序列,第21~134號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為可變區,第135~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為恆定區之胺基酸序列。
本發明之抗HTLV-1抗體包含下述抗體:具有由序列識別號32、34、36、38、40及42之第21~134號之胺基酸殘基所構成的可變區與由第135~240號之胺基酸殘基所構成的輕鏈恆定區的抗體。
人類化抗體之重鏈恆定區為IgG1子類之重鏈恆定區。
作為具有與HTLV-1之結合性的抗體,可列舉由人類化抗體重鏈hMAb1_H1及人類化抗體輕鏈hMAb1_L11所構成的抗體(hMAb1_H1L11)、由人類化抗體重鏈hMAb1_H1及人類化抗體輕鏈hMAb1_L12所構成的抗體(hMAb1_H1L12)、由人類化抗體重鏈hMAb1_H1及人類化抗體輕鏈hMAb1_L13所構成的抗體(hMAb1_H1L13)、由人類化抗體重鏈hMAb1_H1及人類化抗體輕鏈hMAb1_L41所構成的抗體(hMAb1_H1L41)、由人類化抗體重鏈hMAb1_H1及人類化抗體輕鏈hMAb1_L42所構成的抗體(hMAb1_H1L42)、由人類化抗體重鏈hMAb1_H1及人類化抗體輕鏈hMAb1_L43所構成的抗體(hMAb1_H1L43)、由人類化抗體重鏈hMAb1_H2及人類化抗體輕鏈hMAb1_L11所構成的抗體(hMAb1_H2L11)、由人類化抗體重鏈hMAb1_H2及人類化抗體輕鏈hMAb1_L12所構成的抗體(hMAb1_H2L12)、由人類化抗體重鏈hMAb1_H2及人類化抗體輕鏈hMAb1_L13所構成的抗體(hMAb1_H2L13)、由人類化抗體重鏈hMAb1_H2及人類化抗體輕鏈hMAb1_L41所構成的抗體(hMAb1_H2L41)、由人類化抗體重鏈hMAb1_H2及人類化抗體輕鏈hMAb1_L42所構成的抗體(hMAb1_H2L42)、由人類化抗體重鏈hMAb1_H2及人類化抗體輕鏈hMAb1_L43所構成的抗體(hMAb1_H2L43)。
hMAb1_H1L11係具有由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的重鏈及由序列識別號32之第21~240號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體。
hMAb1_H1L12係具有由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的重鏈及由序列識別號34之第21~240號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體。
hMAb1_H1L13係具有由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的重鏈及由序列識別號36之第21~240號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體。
hMAb1_H1L41係具有由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的重鏈及由序列識別號38之第21~240號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體。
hMAb1_H1L42係具有由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的重鏈及由序列識別號40之第21~240號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體。
hMAb1_H1L43係具有由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的重鏈及由序列識別號42之第21~240號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體。
hMAb1_H2L11係具有由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的重鏈及由序列識別號32之第21~240號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體。
hMAb1_H2L12係具有由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的重鏈及由序列識別號34之第21~240號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體。
hMAb1_H2L13係具有由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的重鏈及由序列識別號36之第21~240號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體。
hMAb1_H2L41係具有由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的重鏈及由序列識別號38之第21~240號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體。
hMAb1_H2L42係具有由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的重鏈及由序列識別號40之第21~240號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體。
hMAb1_H2L43係具有由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的重鏈及由序列識別號42之第21~240號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體。
人類化MAb98抗體
就具有MAb98之重鏈可變區的CDR(包含序列識別號10~12所示的胺基酸的3個CDR)的人類化抗體之重鏈,且可變區之框架區域之一部分的胺基酸被取代的重鏈而言,可列舉人類化抗體重鏈hMAb98_H2及人類化抗體重鏈hMAb98_H3。又,就具有MAb98之輕鏈可變區的CDR(包含序列識別號4~6所示的胺基酸的3個CDR)的人類化抗體之輕鏈,且可變區之框架區域之一部分的胺基酸被取代的輕鏈而言,可列舉人類化抗體輕鏈hMab98_L11、人類化抗體輕鏈hMAb98_L13、人類化抗體輕鏈hMAb98_L41及人類化抗體輕鏈hMAb98_L43。
將人類化抗體重鏈hMAb98_H2之全長核苷酸序列示於序列識別號55,將胺基酸序列示於序列識別號56。又,將人類化抗體重鏈hMAb98_H3之全長核苷酸序列示於序列識別號57,將胺基酸序列示於序列識別號58。於序列識別號55及57,各自由第1~57號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼訊息序列,由第58~414號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼可變區,由第415~1404號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼恆定區。又,於序列識別號56及58中,由第1~19號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為訊息序列,由第20~138號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為可變區,由第139~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為恆定區之胺基酸序列。
本發明之抗HTLV-1抗體包含下述抗體:具有由序列識別號56或58之第20~138號之胺基酸殘基所構成的重鏈可變區與由第139~468號之胺基酸殘基所構成的重鏈恆定區的抗體。
將人類化抗體輕鏈hMAb98_L11之全長核苷酸序列示於序列識別號47,將胺基酸序列示於序列識別號48。又,將人類化抗體輕鏈hMAb98_L13之全長核苷酸序列示於序列識別號49,將胺基酸序列示於序列識別號50。將人類化抗體輕鏈hMAb98_L41之全長核苷酸序列示於序列識別號51,將胺基酸序列示於序列識別號52。再者,將人類化抗體輕鏈hMAb98_L43之全長核苷酸序列示於序列識別號53,將胺基酸序列示於序列識別號54。於序列識別號47、49、51及53,各自由第1~60號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼訊息序列,由第61~402號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼可變區,由第403~720號之核苷酸所構成的核苷酸序列編碼恆定區。於序列識別號48、50、52及54中,由第1~20號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為訊息序列,由第21~134號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為可變區,由第135~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列為恆定區之胺基酸序列。
本發明之抗HTLV-1抗體包含下述抗體:具有由序列識別號48、50、52及54之第21~134號之胺基酸殘基所構成的可變區與由第135~240號之胺基酸殘基所構成的輕鏈恆定區的抗體。
人類化抗體之重鏈恆定區為IgG1子類之重鏈恆定區。
作為具有與HTLV-1之結合性的抗體,可列舉由人類化抗體重鏈hMAb98_H2及人類化抗體輕鏈hMAb98_L43所構成的抗體(hMAb98_H2L43)、由人類化抗體重鏈hMAb98_H3及人類化抗體輕鏈hMAb98_L11所構成的抗體(hMAb98_H3L11)、由人類化抗體重鏈hMAb98_H3及人類化抗體輕鏈hMAb98_L13所構成的抗體(hMAb98_H3L13)及由人類化抗體重鏈hMAb98_H3及人類化抗體輕鏈hMAb98_L41所構成的抗體(hMAb98_H3L41)。
hMAb98_H2L43係具有由序列識別號56之第20~468號之胺基酸殘基所構成的重鏈及由序列識別號54之第21~240號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體。
hMAb98_H3L11係具有由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的重鏈及由序列識別號48之第21~240號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體。
hMAb98_H3L13係具有由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的重鏈及由序列識別號50之第21~240號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體。
hMAb98_H3L41係具有由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的重鏈及由序列識別號52之第21~240號之胺基酸殘基所構成的輕鏈的抗體。
其它抗體
本發明之抗體可為具有抗體之抗原結合部的抗體之抗原結合性片段或其修飾物。可藉由將抗體以木瓜酵素、胃蛋白酶等之蛋白質分解酵素處理,或將抗體基因藉由基因工程手法改變而於適當培養細胞中使其表現,而獲得該抗體之片段。在此種抗體片段中,可將保持抗體全長分子所保有的功之全部或一部分的片段稱為抗體之抗原結合性片段。就抗體的功能而言,一般而言可列舉抗原結合活性、中和抗原活性的活性、增強抗原活性的活性、ADCC活性、ADCP活性及CDC活性。本發明中的抗體之抗原結合性片段所保持的功能為對HTLV-1之結合活性。
例如,就抗體之片段而言,可列舉Fab、F(ab’)2、可變區(Fv)、或將重鏈及輕鏈之Fv以適當連接子連結的單鏈Fv(scFv)、雙體(diabody(diabodies))、線狀抗體、及由抗體片段所形成的多特異性抗體等。又,抗體之片段亦包含Fab’,其係於還原條件下處理F(ab’)2而成的抗體之可變區之一價片段。
再者,本發明之抗體亦可為對於至少二種類之不同抗原具有特異性之多特異性抗體。通常此種分子為與二種類的抗原結合者(即,雙特異性抗體(bispecific antibody)),但本發明中的「多特異性抗體」包含對於其以上(例如,三種類)之抗原具有特異性的抗體。
本發明之多特異性抗體亦可為包含全長的抗體、或該種抗體之片段(例如,F(ab’)2雙特異性抗體)。雙特異性抗體可使二種類的抗體之重鏈與輕鏈結合來製作,亦可藉由使產生不同單株抗體的融合瘤融合而製作產生雙特異性抗體的融合細胞來製作(Nature(1983),305,p.537-540)。
本發明之抗體可為單鏈抗體(亦記載為scFv)。單鏈抗體可藉由以多肽之連接子連接抗體之重鏈可變區與輕鏈可變區而獲得(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,113(Rosenberg及Moore編、Springer Verlag, New York), p.269-315(1994)、Nature Biotechnology (2005), 23, p.1126-1136)。又,亦可使用以多肽連接子使2個scFv結合所製作之BiscFv片段作為雙特異性抗體。
製作單鏈抗體之方法為本技術領域中所周知(例如,參照美國專利第4,946,778號、美國專利第5,260,203號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,455,030號等)。於此scFv中,重鏈可變區與輕鏈可變區係透過不形成共軛的連接子、較佳為多肽連接子而連接(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1988),85,p.5879-5883)。scFv中的重鏈可變區及輕鏈可變區可源自相同抗體,亦可源自不同抗體。作為連接可變區之多肽連接子,可使用例如由12~19殘基所構成之任意的單鏈肽。
編碼scFv之DNA,可藉由下述方式獲得:在編碼前述抗體之重鏈或重鏈可變區的DNA、及編碼輕鏈或輕鏈可變區的DNA之中,將彼等序列之中編碼全部或所期望的胺基酸序列之DNA部分作為模板,並使用規定其兩端之引子對而藉由PCR法進行增幅,接著來進一步將編碼多肽連接子部分的DNA、及以其兩端分別與重鏈、輕鏈連接之方式而規定之引子對加以組合而進行增幅。
又,一旦製作編碼scFv之DNA,則可依據通常方法獲得含有彼等之表現載體、及藉由該表現載體所轉形之宿主,又,可藉由使用該宿主,而依據通常方法獲得scFv。此等抗體片段可與前述同樣地進行而取得基因且使其表現,並藉由宿主而使其產生。
本發明之抗體,可為進行多量化而提高對抗原之親和性者。作為進行多量化之抗體,可為一種類的抗體,亦可為辨識相同抗原的複數表位之複數的抗體。作為將抗體進行多量化的方法,可列舉IgG CH3域與二個scFv之結合、與鏈黴親和素(Streptavidin)之結合、螺旋-轉折-螺旋模體(helix-turn-helix motif)的導入等。
本發明之抗體可為胺基酸序列不同之複數種類的抗HTLV-1抗體之混合物的多株抗體。作為多株抗體之一例,可列舉CDR不同的複數種類之抗體之混合物。作為該種多株抗體,可將產生不同抗體的細胞的混合物進行培養,而使用自該培養物純化之抗體(參照WO2004/061104號)。
本發明之抗體亦包含抗體之修飾體。該修飾體意指對本發明之抗體施加化學性或生物學性之修飾而成者。化學性之修飾體包含對胺基酸骨架之化學部分之鍵結、N-鍵結或O-鍵結碳水化物鏈之化學修飾體等。生物學的修飾體包含經轉譯後修飾(例如,N-鍵結或O-鍵結型糖鏈加成、N末端或C末端之加工、脱醯胺化、天冬胺酸之異構化、甲硫胺酸之氧化)者、藉由使用原核生物宿主細胞而使其表現而甲硫胺酸殘基加成於N末端有者等。又,為了能夠檢測或單離本發明之抗體或抗原而經標識者,例如,酵素標識體、螢光標識體、親和性標識體亦包含在相關修飾體的意義中。此種本發明之抗體的修飾體,有用於抗體的安定性及血中滯留性的改善、抗原性的減低、抗體或抗原的檢測或單離等。
作為抗體的修飾物,亦可使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子結合而成的抗體。
又,能夠藉由調節結合於本發明之抗體的糖鏈修飾(糖苷化(glycosylation)、脱岩藻糖(fucose)化等),而增強抗體依存性細胞毒殺活性。就抗體之糖鏈修飾之調節技術而言,已知有WO1999/54342、WO2000/61739、WO2002/31140等,但未限定於此等。本發明之抗體亦包含該糖鏈修飾經調節的抗體。
本發明之抗體,進一步可為此等抗體與其它藥劑形成結合物者(免疫結合物(Immunoconjugate))。作為此種抗體的例,可列舉該抗體與放射性物質或具有藥理作用的化合物結合之物(Nature Biotechnology (2005)23, p.1137-1146)。
又,亦已知使用適當連接子將抗體之重鏈及輕鏈之全長序列進行連結,而取得單鏈免疫球蛋白(single chain immunoglobulin)的方法(Molecular Immunology(1999)36, p.61-71; mAbs(2010), 2, p.73-76)。此種單鏈免疫球蛋白能藉由進行二聚體化而保持與原本為四量體之抗體類似的結構與活性。又,本發明之抗體亦可為具有單一的重鏈可變區且不具有輕鏈序列之抗體。此種抗體被稱為單域抗體(single domain antibody:sdAb)或奈米抗體(nanobody),已有報告其實際在駱駝或駱馬觀察到,且保持抗原結合能力(Protein Eng.(1994),7,p.1129-1135;Nature(1993),363,p.446-448)。上述之抗體亦能解釋為本發明中的抗體之抗原結合性片段之一種。
抗體之產生方法
本發明之抗體可藉由將編碼重鏈可變區的DNA或編碼輕鏈可變區的DNA插入表現載體,使用該載體將表現用之宿主細胞轉形,培養宿主細胞,而作為重組抗體使細胞產生。
編碼抗體的DNA,係藉由將編碼重鏈可變區的DNA與編碼重鏈恆定區的DNA連結而獲得編碼重鏈的DNA,且進一步藉由將編碼輕鏈可變區的DNA與編碼輕鏈恆定區的DNA連結而獲得編碼輕鏈的DNA。
本發明之HTLV-1抗體可藉由將編碼上述之重鏈的DNA及編碼輕鏈的DNA插入表現載體,使用該載體將宿主細胞轉形,且培養該宿主細胞而使其產生。此時,可將上述之編碼重鏈的DNA及編碼輕鏈的DNA導入相同表現載體,且使用該載體而使宿主細胞轉形,亦可將編碼重鏈的DNA與編碼輕鏈的DNA插入各別載體,且使用2個載體將宿主細胞轉形。此時,亦可於經預先導入編碼重鏈恆定區的DNA及編碼輕鏈恆定區的DNA的載體中導入編碼重鏈可變區及輕鏈可變區的DNA。又,該載體可含有編碼會促進自宿主細胞的抗體分泌之訊息肽的DNA,此情形,先於框內(in frame)連結編碼訊息肽的DNA與編碼抗體的DNA。可於抗體產生後藉由去除訊息肽,而作為成熟蛋白質獲得抗體。
此時,可將編碼重鏈可變區的DNA、編碼輕鏈可變區的DNA、連結編碼重鏈可變區的DNA及編碼重鏈恆定區的DNA的DNA、連結編碼輕鏈可變區的DNA及編碼輕鏈恆定區的DNA的DNA,與啟動子、增強子、多腺苷酸化訊息等之元件進行功能性地連結。此處功能性地連結係指以元件可發揮其功能的方式進行連結。
表現載體只要是在動物細胞、細菌、酵母等之宿主中能夠複製者即可,並未特別限定,可列舉例如,周知之質體、噬菌體等。就表現載體之構築所使用的載體而言,可列舉例如,pcDNA(商標)(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)、Flexi(註冊商標)載體(Promega公司製)、pUC19(New England Biolabs公司製)、pGEX-4T(Cytiva公司製)、pMAM-neo(Clontech公司製)等。就宿主細胞而言,可使用大腸菌、枯草菌等之原核細胞,亦可使用酵母、動物細胞等之真核細胞,但較佳為使用真核細胞。例如,就動物細胞而言,使用為人類胎兒腎細胞株的HEK293細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞等即可。表現載體係以周知方法導入宿主細胞,將宿主細胞轉形即可。可列舉例如,電穿孔法、磷酸鈣沉澱法、DEAE-聚葡萄醣轉染法等。所產生的抗體可使用通常在蛋白質所使用的分離、純化方法而純化。例如,適當選擇並組合親和性層析、其它之層析、過濾、超過濾、鹽析、透析等即可。
醫藥組成物
本發明由於對HTLV-1具有中和活性,因而期待作為用以防止HTLV-1水平感染和母嬰間之垂直感染的抗體藥物之用途。又,本發明由於對HTLV-1感染細胞特異性地結合而具有ADCC及/或ADCP活性,所以對該細胞具有殺細胞活性,因此亦可期待對HTLV-1感染者,作為起因於HTLV-1的疾病之發病預防藥及治療藥來使用。就起因於HTLV-1的疾病而言,可列舉成人T細胞白血病・淋巴瘤(ATLL)、HTLV-1相關的脊髓病(HAM)、HTLV-1葡萄膜炎(HU)等。
ADCC係指表現Fcγ受體的非特異的細胞傷害性細胞(例如自然殺手細胞、嗜中性白血球、及巨噬細胞等)辨識標的細胞上所結合的抗體,然後引起標的細胞溶解的細胞媒介性反應。於負責ADCC的主要細胞的自然殺手細胞,係表現FcγRIIC及FcγRIIIA,於單核球則表現FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC及FcγRIIIA。另一方面,ADCP係指表現Fc受體的吞噬細胞(例如巨噬細胞、嗜中性白血球等)辨識標的細胞上所結合的抗體,然後將標的細胞吞噬至細胞內的細胞媒介性反應。於負責ADCP的主要細胞的單核球,係表現FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC及FcγRIIIA。
本發明可包含治療上有效量之抗HTLV-1抗體與藥學上可容許的載劑、稀釋劑、助溶劑、乳化劑、保存劑、輔助劑等。「藥學上可容許的載劑」等可因應對象疾病的種類、藥劑之投予形態而自廣泛範圍加以適當選擇。本發明之抗腫瘤劑之投予方法可適當選擇,例如可注射投予,可採用局部注入、腹腔內投予、選擇性靜脈內注入、靜脈注射、皮下注射、臟器灌流液注入等。又,注射用之溶液可使用包含鹽溶液、葡萄糖溶液、或鹽水與葡萄糖溶液之混合物、各種緩衝液等的載劑來進行製劑化。又亦可以粉末狀態進行製劑化,而於使用時與前述液體載劑混合而調製成注射液的方式進行。
關於其它之投予方法,亦可與製劑之開發一起適當選擇。例如,於經口投予的情形,可適用經口液劑、散劑、丸劑、膠囊劑及錠劑等。於經口液劑的情形,作為如懸浮劑及糖漿劑等的經口液體調製物,可使用水、蔗糖、山梨糖醇、果糖等之糖類;聚乙二醇等之二醇類;芝麻油、大豆油等之油類;對羥基苯甲酸烷基酯等之防腐劑;草莓・調味劑、薄荷等之調味劑類等而製造。散劑、丸劑、膠囊劑及錠劑可使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等之賦形劑;澱粉、海藻酸鈉(alginate soda)等之崩解劑;硬脂酸鎂、滑石等之潤滑劑;聚乙烯醇、羥丙基纖維素、明膠等之結合劑;脂肪酸酯等之表面活性劑;甘油等之塑化劑等而製劑化。於所謂容易投予的觀點,錠劑及膠囊劑為此發明之組成物的較佳單位投予形態。於製造錠劑或膠囊劑之際,使用固體之製造載劑。
用於治療的有效抗體之量,依治療的病狀的性質、患者的年齡或狀態而變更,最終由醫師決定即可。例如,1次每1公斤體重為0.0001mg~100mg。指定的投予量可於1~180日投予1次,亦可設為每1日2次、3次、4次或其以上的分次投予且以適當間隔投予。
使用本發明之抗體作為疾病之預防或治療藥的情形,可與其它劑併用。
本發明之抗體使用於成人T細胞白血病・淋巴瘤(ATLL)之預防或治療的情形之併用的其它劑若為抗癌劑則未特別限定,適合地為化學療法劑、分子標的藥、癌治療抗體、荷爾蒙劑,更適合地為拓樸異構酶抑制劑、微小管抑制劑、鉑製劑。就拓樸異構酶抑制劑之適合例而言,可列舉伊立替康(irinotecan)、托普樂肯(topotecan)、依託泊苷(etoposide)等。就微小管抑制劑之適合例而言,可列舉紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)、艾日布林(eribulin)、內包紫杉醇的微胞NK105等。就鉑製劑之之適合例而言,可列舉奥沙利鉑(oxaliplatin)、卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、奈達鉑(nedaplatin)、內包順鉑的微胞NC-6004等。
本發明之抗體使用於HTLV-1相關的脊髓病(HAM)之預防或治療的情形之併用的其它劑,若為類固醇、免疫抑制劑、干擾素α、莫加單抗(mogamulizumab) (抗CCR4抗體)等之治療用抗體等則未特別限定,適合地,就類固醇而言,可列舉培尼皮質醇(prednisolone)、甲基培尼皮質醇(methylprednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、貝皮質醇(betamethasone)、氫化可體松(hydrocortisone)等之腎上腺皮質類固醇劑,就免疫抑制劑而言,可列舉硫唑嘌呤(azathioprine)、黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)、咪唑立賓(mizoribine)等之代謝拮抗劑、環孢素(cyclosporin)、他克莫司(tacrolimus)等之鈣調磷酸酶(calcineurin)抑制劑、托法替布(tofacitinib)或他索西替尼(tasocitinib)等之JAK抑制劑、依維莫司(Everolimus)等之mTOR等。
本發明之抗體使用於HTLV-1葡萄膜炎(HU)之預防或治療的情形之併用的其它劑,若為類固醇、治療用抗體等等則未特別限定,適合地,就類固醇而言,可列舉培尼皮質醇、甲基培尼皮質醇、地塞米松、貝皮質醇、氫化可體松等之腎上腺皮質類固醇劑。
本發明之抗體可與上述之其它劑同時投予,亦可各別投予。又,亦可依序投予。本發明之抗體可於上述之其它劑之投予前投予,亦可於投予後投予。同時投予的情形,可作為各別製劑來投予,亦可作為包含兩者的單一醫藥組成物來投予。本發明之抗體與上述其它劑各別投予的情形,例如,將其它劑於抗體之投予的1~24小時前或後投予,或1~30日前或後投予即可。本發明之抗體與其它劑的投予間隔可相同亦可相異。
本發明包含用以與上述之其它劑併用的抗體,且進一步包含用以與上述之其它劑組合的抗體。
[實施例]
依據以下之實施例而具體地説明本發明,但本發明並未限定於此等實施例。於下述實施例中關於基因操作的各操作只要未特別明示,則依「分子選殖(Molecular Cloning)」(Sambrook, J.Fritsch, E.F.及Maniatis, T.著,由Cold SpringHarbor Laboratory Press於1989年發刊)記載之方法及其它之所屬技術領域中具通常知識者使用的實驗書記載的方法進行,或使用市售的試藥或套組的情形,按照市售品的指示書進行。
實施例1.源自大鼠的抗HTLV-1抗體之製作
1)-1 HTLV-1表現載體之製作
藉由將編碼HTLV-1套膜蛋白質gp62(UniProt ACCESSION編號:P03381)之細胞外區域(序列識別號60之1~312號)之胺基酸序列的cDNA(序列識別號59之1~936號),按照所屬技術領域中具通常知識者周知的方法插入至pcDNA3.1(+)(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)載體之限制酶EcoRI與EcoRV的切割部位之間,而製作表現HTLV-1的載體。表現HTLV-1的載體之大量調製係使用EndoFree Plasmid Giga Kit(QIAGEN公司製)。
1)-2 免疫
免疫係使用WKY/Izm雌性大鼠(日本SLC公司製)。首先於大鼠兩腳小腿部以玻尿酸酶(SIGMA-ALDRICH公司製)進行前處理後,於相同部位肌肉注射實施例1)-1中製作的表現HTLV-1的載體。接著,使用ECM830(BTX公司製),使用針電極,於相同部位實施活體內電穿孔。於隔周重複相同的活體內電穿孔一次之後,採集大鼠的淋巴結或脾臟而用於融合瘤製作。
1)-3 融合瘤製作
將淋巴結細胞或脾臟細胞與小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14細胞(ATCC:CRL-1581)使用LF301-Cell Fusion Unit(BEX公司製)進行電氣細胞融合,稀釋於ClonaCell-HY Selection Medium D (StemCell Technologies公司製)而培養。藉由回收出現的融合瘤殖株而製作單株融合瘤。培養回收的各融合瘤殖株,使用獲得的融合瘤培養上清液,而進行抗HTLV-1抗體產生融合瘤之篩選。
實施例2.源自大鼠的抗HTLV-1抗體之評價
2)-1 利用Cell-ELISA法的結合活性評價
2)-1-1 GLUT1表現載體之製作
藉由將編碼GLUT1蛋白質(GLUT1)(NCBI參考序列登錄號:NM_006516)之胺基酸序列的cDNA(序列識別號62),按照所屬技術領域中具通常知識者周知的方法,插入至pcDNA3.1(+)(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)載體之限制酶EcoRI與XbaI的切割部位之間,而製作表現GLUT1的載體。表現GLUT1的載體之大量調製係使用EndoFree Plasmid Giga Kit(QIAGEN公司製)。
2)-1-2 Cell-ELISA用抗原基因表現細胞之調製
將HEK293細胞於含有10% FBS的DMEM培養基中調製成5×10
5細胞/10mL。按照使用Lipofectamine 2000(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)的轉形程序,對其導入於實施例1)-1中製作的表現HTLV-1的載體及實施例2)-1-1中製作的表現為HTLV-1之受體的GLUT1的載體或作為對照之pcDNA3.1(+)(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製),各分注100μL於96-孔盤(Corning公司製),於含有10% FBS的DMEM培養基中於37℃、5% CO
2之條件下培養24~27小時。將獲得的導入細胞以接著狀態直接使用於Cell-ELISA。
2)-1-3 Cell-ELISA
去除實施例2)-1-2中調製的表現載體導入HEK293細胞之培養上清液後,對各自之表現HTLV-1的載體及表現GLUT1的載體或pcDNA3.1導入HEK293細胞,添加融合瘤培養上清液,於4℃靜置1小時。將孔中之細胞以含有5% FBS的PBS(+)洗淨1次後,添加以含有5% FBS的PBS(+)稀釋為500倍之於兔中產生的抗大鼠IgG-過氧化酶抗體(SIGMA-ALDRICH公司製),於4℃靜置1小時。將孔中之細胞以含有5% FBS的PBS(+)洗淨3次後,以100μL/孔添加OPD呈色液(於OPD溶解液(0.05M檸檬酸3鈉、0.1M磷酸氫2鈉・12水 pH4.5)各自溶解鄰苯二胺二鹽酸鹽(富士軟片和光純藥公司製)、H
2O
2成為0.4mg/mL、0.6%(v/v))。一邊不時地攪拌一邊進行呈色反應,以100μL/孔添加1M HCL而使呈色反應停止後,以平盤讀取儀ENVISION(PerkinElmer公司製)測定490nm之吸光度。為了選擇產生與細胞膜表面上表現的HTLV-1套膜蛋白質gp62特異性結合的抗體的融合瘤,而與對照之pcDNA3.1導入HEK293細胞進行比較,選擇在表現HTLV-1及GLUT1的載體導入HEK293細胞產生顯示更高吸光度的培養上清液的融合瘤,作為抗HTLV-1抗體產生陽性。
2)-2 利用流式細胞分析技術的結合活性評價
2)-2-1 流式細胞分析技術解析用HTLV-1表現細胞之調製
將293T細胞以成為5×10
4細胞/cm
2的方式接種於225cm
2燒瓶(Sumitomo Bakelite公司製),於含有10% FBS的DMEM培養基中,在37℃、5% CO
2的條件下,培養一晩。次日,使用Lipofectamine 2000 (ThermoFisher SCIENTIFIC公司製),將表現HTLV-1的載體及表現GLUT1的載體或作為對照之pcDNA3.1(+)(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)各自導入293T細胞,於37℃、5% CO
2的條件下,再培養一晩。次日,將導入表現載體的293T細胞以TrypLE Express(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)處理,以含有10% FBS的DMEM將細胞洗淨後,懸浮於含有5% FBS的PBS。將獲得的細胞懸浮液使用於流式細胞分析技術解析。
2)-2-2 流式細胞分析技術解析
利用流式細胞分析技術法確認在實施例2)-1之Cell-ELISA判定為陽性的融合瘤所產生的抗體之對HTLV-1的特異性結合再現性。將實施例2)-2-1中調製的暫時性表現293T細胞之懸浮液離心,並去除上清液後,對各自添加融合瘤培養上清液而懸浮,於4℃靜置1小時。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後,添加以含有5% FBS的PBS稀釋為500倍的山羊抗大鼠IgG抗體FITC結合物(Goat Anti-Rat IgG Antibody, FITC Conjugate)(SIGMA-ALDRICH公司製)而懸浮,於4℃靜置1小時。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後,再懸浮於含有2μg/mL 7-胺基放線菌素D(Molecular Probes公司製)的含有5% FBS的PBS,以流式細胞儀FC500(Beckman Coulter公司製)進行檢測。資料解析係以Flowjo(TreeStar公司製)進行。利用閘門排除7-胺基放線菌素D陽性之死細胞後,作成活細胞之FITC螢光強度的直方圖。將產生相對於為對照的pcDNA3.1導入293T細胞之螢光強度直方圖而導入有表現HTLV-1及GLUT1的載體的293T細胞之直方圖位移至強螢光強度側之抗體的融合瘤,當作與HTLV-1特異性結合的抗體產生融合瘤,而選擇76個殖株。
2)-3 合胞體形成抑制活性
對於實施例2)-2中利用流式細胞分析技術解析所選出的76個殖株,確認合胞體形成抑制活性。將為源自健康人類的HTLV-1感染細胞的YT#1細胞,於含有20U/mL IL-2、10% FBS的RPMI1640培養基(SIGMA-ALDRICH公司製)中調製成2×10
6細胞/mL,各分注25μL於96孔盤。之後隨即添加融合瘤培養上清液50μL/孔或作為陽性對照之抗HTLV-1的抗體LAT-27(最終濃度5μg/mL),或作為陰性對照之同型對照(isotype control)IgG抗體(最終濃度200μg/mL),並培育5分鐘。然後,各添加25μL同樣地於含有10% FBS的RPMI1640培養基中調製成2×10
6細胞/mL之為非感染CD4陽性T細胞株的CEM細胞,於37℃、5% CO
2的條件下,培養16小時,於倒立顯微鏡下觀察合胞體形成之有無。選擇與陽性對照之LAT-27同樣地完全阻止了合胞體形成的2種融合瘤培養上清液中所含的抗體(rMAb1、rMAb98),當作合胞體形成抑制活性陽性抗HTLV-1抗體。
2)-4 同型決定
實施例2)-3中選定的合胞體形成抑制活性陽性抗HTLV-1抗體(rMAb1、rMAb98)之同型,係利用Rat Monoclonal Antibody Isotyping Test Kit(DS Pharma Biomedical公司製)而決定。其結果確認rMAb1為IgG1、κ鏈,rMAb98為IgG2a、κ鏈。
2)-5 抗HTLV-1單株抗體之調製
2)-5-1 培養上清液之調製
抗HTLV-1單株抗體係自大鼠融合瘤之培養上清液純化。以ClonaCell-HY Selection Medium E(StemCell Technologies公司製)使大鼠抗HTLV-1單株抗體產生融合瘤增殖至充分量,將培養基交換為添加20%Ultra Low IgG FBS(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)的Hybridoma SFM(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)之後,將8~9×10
7細胞之融合瘤接種於1272cm
2燒瓶(Corning公司製),並培養7日。利用離心將本培養上清液回收,通過0.8μm的過濾器後,再通過0.45μm之過濾器(Corning公司製)而滅菌。
2)-5-2 抗體之純化
自實施例2)-5-1中調製的融合瘤之培養上清液,將rMAb1及rMAb98以Protein G親和性層析純化。使抗體吸附於Protein G Sepharose管柱(Cytiva公司製),以PBS將管柱洗淨後,以0.1M 甘胺酸/鹽酸水溶液(pH2.7)析出。於析出液中添加1M Tris-HCl(pH9.0)而調整為pH7.0~7.5後,以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(截流分子量UF30K、Sartorius公司)進行對HBSor(25mM組胺酸/5%山梨醇、pH6.0)的緩衝液取代的同時,進行抗體之濃縮,將抗體濃度調製為2mg/mL以上。最後以Minisart-Plus Filter(Sartorius公司製)過濾,當作純化樣品。
2)-6 純化抗體的結合活性評價
2)-6-1 利用流式細胞分析技術的解析
以與實施例2)-2之流式細胞分析技術解析同樣的方法,確認實施例2)-5-2中調製的大鼠抗HTLV-1單株純化抗體對HTLV-1的特異的結合性。對導入表現HTLV-1的載體及表現GLUT1的載體或作為對照的pcDNA3.1的暫時性表現293T細胞,各自以稀釋系列溶液10μg/mL至10倍公比的3系列添加大鼠抗HTLV-1單株純化抗體或作為陽性對照之LAT-27、或作為陰性對照之同型・對照IgG抗體,並使抗大鼠IgG抗體FITC結合物(Anti-Rat IgG FITC Conjugate)(SIGMA-ALDRICH公司製)反應,以流式細胞儀FC500(Beckman Coulter公司製)檢測。數據解析係以Flowjo(TreeStar公司製)進行並作成活細胞的FITC螢光強度之直方圖。確認僅於添加大鼠抗HTLV-1單株純化抗體及LAT-27的細胞,相對於對照的pcDNA3.1導入293T細胞之螢光強度直方圖,而表現HTLV-1及GLUT1的載體導入293T細胞之直方圖位移至強螢光強度側。於圖1顯示因應對HTLV-1表現細胞特異性結合的抗體之稀釋率的螢光強度之中央値。
2)-6-2對HTLV-1 gp46肽抗原之結合活性評價(SPR)
將實施例2)-6-1中可確認到對HTLV-1表現細胞的特異的結合性的rMAb1對為抗原的HTLV-1 gp46肽180~204之結合活性,使用Biacore T200(Cytiva公司製),將抗體作為配位體而進行固相化,將抗原作為分析物而測定。使用HBS-EP+(Cytiva公司製)作為Running buffer,Series S Sensor Chip CM5(Cytiva公司製)使用作為感測晶片。按照Amine Coupling Kit(Cytiva公司製)之使用程序,於晶片上以10μL/分鐘添加以AcOH 5.0(Cytiva公司製)稀釋為5μg/mL的rMAb1 360秒而進行固相化。將抗原之稀釋系列溶液(由3μg/mL起3倍公比之8系列)以流速10μL/分鐘添加1200秒,獲得結合時之反應。以流速20μL/分鐘添加作為再生溶液之3M氯化鎂(Cytiva公司製)30秒。使用親和性解析而算出的KD値為3.49nM。
實施例3.人類嵌合抗體之製作
3)-1 rMAb1之可變區之核苷酸序列的決定
3)-1-1 rMAb1生產融合瘤之總RNA的調製
為了增幅rMAb1之可變區的cDNA,而由產生rMAb1的融合瘤,使用TRIzol Reagent(Ambion公司製)而調製總RNA。
3)-1-2 利用5’-RACE PCR的rMAb1之輕鏈可變區的cDNA的增幅及序列的決定
輕鏈可變區之cDNA的增幅係使用實施例3)-1-1中調製的總RNA約1μg與SMARTer RACE 5’/3’ Kit(Clontech公司製)而實施。作為用以將rMAb1之輕鏈可變區的cDNA以PCR進行增幅的引子,而使用UPM(Universal Primer A Mix:附屬於SMARTer RACE 5’/3’ Kit)、及自周知之大鼠輕鏈之恆定區的序列所設計的引子。
將以5’-RACE PCR增幅的輕鏈可變區的cDNA選殖至質體,接著實施輕鏈可變區的cDNA之核苷酸序列的定序解析。
將所決定的rMAb1之輕鏈可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號13,將胺基酸序列示於序列識別號15。
3)-1-3 利用5’ -RACE PCR的rMAb1之重鏈可變區的cDNA的增幅及序列的決定
重鏈可變區之cDNA的增幅係使用實施例3)-1-1中調製的總RNA約1μg與SMARTer RACE 5’/3’ Kit(Clontech公司製)而實施。作為用以將rMAb1之重鏈可變區的cDNA以PCR進行增幅的引子,而使用UPM(Universal Primer A Mix:附屬於SMARTer RACE 5’/3’ Kit)、及自周知之大鼠重鏈之恆定區的序列所設計的引子。
將以5’ -RACE PCR增幅的重鏈可變區之cDNA選殖至質體,接著實施重鏈可變區之cDNA的核苷酸序列之定序解析。
將所決定的rMAb1之重鏈可變區的cDNA的核苷酸序列示於序列識別號17,將胺基酸序列示於序列識別號19。
3)-2 rMAb98之可變區之cDNA的核苷酸序列的決定
以與實施例3)-1同樣的方法實施。將所決定的rMAb98之輕鏈可變區的cDNA的核苷酸序列示於序列識別號14,將胺基酸序列示於序列識別號16。將所決定的rMAb98之重鏈可變區的cDNA的核苷酸序列示於序列識別號18,將胺基酸序列示於序列識別號20。
3)-3 輕鏈表現載體pCMA-LK之構築
使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司製),將以限制酶XbaI及PmeI消化質體pcDNA3.3-TOPO/LacZ(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)而得之約5.4kb之片段、與序列識別號21所示的包含編碼人類輕鏈訊息序列及人類κ鏈恆定區的核苷酸序列的DNA片段加以結合,而製作pcDNA3.3/LK。
藉由自pcDNA3.3/LK去除新黴素(neomycin)表現單元而構築pCMA-LK。
3)-4 重鏈表現載體pCMA-G1之構築
使用In‐Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司),將以XbaI及PmeI消化pCMA-LK而移除輕鏈訊息序列及人類κ鏈恆定區的DNA片段、與序列識別號22所示的包含編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG1恆定區之胺基酸的核苷酸序列的DNA片段加以結合,而構築pCMA-G1。
3)-5 人類嵌合抗HTLV-1抗體cMAb1表現載體之構築
3)-5-1 cMAb1之輕鏈表現載體之構築
於cMAb1輕鏈可變區之框架上有非保存性之半胱胺酸殘基存在。以迴避雙硫鍵所致的會合體的形成之目的,而使Cys55(IMGT numbering;Immunol Today (1997),18,p.509)變異為Ser。合成經導入變異之序列識別號23所示的cMAb1輕鏈之核苷酸序列的核苷酸編號37~420所示的DNA片段(GENEART公司製)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司製),藉由將所合成的DNA片段插入以限制酶BsiWI切割pCMA-LK之處,而構築cMAb1輕鏈表現載體。將cMAb1輕鏈之胺基酸序列示於序列識別號25。
3)-5-2 cMAb1之重鏈表現載體之構築
合成序列識別號27所示的cMAb1重鏈之核苷酸序列的核苷酸編號36~431所示的DNA片段(GENEART公司製)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司製),藉由將所合成的DNA片段插入以限制酶BlpI切割pCMA-G1之處,而構築cMAb1重鏈表現載體。將cMAb1重鏈之胺基酸序列示於序列識別號29。
3)-6 人類嵌合抗HTLV-1抗體cMAb98表現載體之構築
3)-6-1 cMAb98之輕鏈表現載體之構築
合成序列識別號24所示的cMAb98輕鏈之核苷酸序列之核苷酸編號37~420所示的DNA片段(GENEART公司製)。以與實施例3)-5-1同樣的方法,構築cMAb98輕鏈表現載體。將cMab98輕鏈之胺基酸序列示於序列識別號26。
3)-6-2 cMAb98之重鏈表現載體之構築
合成序列識別號28所示的cMAb98重鏈之核苷酸序列之核苷酸編號36~431所示的DNA片段(GENEART公司製)。以與實施例3)-5-2同樣的方法,構築cMAb98重鏈表現載體。將cMAb98重鏈之胺基酸序列示於序列識別號30。
3)-7 人類嵌合抗HTLV-1抗體之生產
FreeStyle 293F細胞(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)係按照手冊,進行繼代、培養。將對數增殖期之2×10
8個FreeStyle 293F細胞接種於500mL Fernbach Erlenmeyer燒瓶(Corning公司製),以FreeStyle293 expression medium(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)稀釋而調製成2.0×10
6細胞/mL。將300μg之聚乙亞胺(Polyethyleneimine)(Polyscience公司製)添加於2mL之 Opti-Pro SFM培養基(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)。接著,添加40μg之重鏈表現載體及60μg之輕鏈表現載體至2mL之Opti-Pro SFM培養基。於聚乙亞胺/Opti-Pro SFM混合液中,添加表現載體/Opti-Pro SFM混合液並溫和地攪拌,再放置5分鐘後,添加至FreeStyle 293F細胞。於37℃、8% CO
2恆溫箱中,以90rpm振盪培養4小時後,添加100mL之EX-CELL VPRO培養基(SAFC Biosciences公司製)、3mL之GlutaMAX I(GIBCO公司製)、及5mL之Yeastolate Ultrafiltrate(GIBCO公司製),於37℃、8% CO
2恆溫箱中,將於90rpm振盪培養7日而得之培養上清液以Disposable Capsule Filter(Advantec公司製)過濾。
3)-8 人類嵌合抗HTLV-1抗體之純化
自實施例3)-7中所得之培養上清液,在4~6℃下藉由rProteinA親和性層析1階段步驟而純化抗體。rProteinA親和性層析純化後之緩衝液取代步驟,係於4~6℃下實施。最初,將培養上清液供至以50mM NaPi、1.5M NaCl、10mM EDTA、0.1M L-精胺酸鹽酸鹽、pH7.0平衡化的HiTrap Protein A HP(Cytiva公司製)。培養液全部進入管柱後,以管柱容量的2倍以上之經平衡化的緩衝液將管柱洗淨。接著,以0.1M L-精胺酸鹽酸鹽、0.1M NaCl、pH3.8析出,收集含抗體的流份。進行對HBSor(25mM 組胺酸、5% 山梨醇、pH6.0)的液取代。最後,於4℃下以Amicon Ultra 50kDa cutoff(Merck公司製)濃縮,與HBSor(25mM 組胺酸、5% 山梨醇、pH6.0)進行緩衝液交換,最後,將IgG濃度調製成10mg/mL,當作純化樣品。
3)-9 人類嵌合抗HTLV-1抗體之物性評價
使用實施例2)-5-2中製作的大鼠抗HTLV-1單株抗體rMAb1、及於3)-8製作的人類嵌合抗HTLV-1抗體cMAb1,藉由粒徑篩析層析法(size exclusion chromatography)而測定高分子量流份的存在比。使用LC1260(Agilent Techinogies公司製)作為送液裝置,使用Advancebio SEC 300Å、2.7μm、4.6×300mm(Agilent Techinogies公司製)作為管柱,3×PBS作為移動層,以流速0.2mL/min,注入40μg抗HTLV-1抗體。將結果示於表1。由rMAb1及cMAb1的結果確認:藉由實施例3)-5-1所示的變異之導入,而與rMAb1比較,在cMAb1係多量體減少。
[表1]
rMAb1及cMAb1之高分子量流份的存在比 (SEC)
高分子量流份的存在比 (%) | |
rMAb1 | 7.5 |
cMAb1 | 0.6 |
實施例4.人類化抗HTLV-1抗體之設計
4)-1 可變區之分子模擬
可變區之分子模擬係利用作為同一性模擬之周知的方法(Methods in Enzymology(1991),203,p.121-153)。將相對於可變區具有高序列相同性之Protein Data Bank(Nuc. Acid Res.(2007),35,p.D301-D303)所登録的構造作為模板,而使用市售之蛋白質立體構造解析程式BioLuminate(Schrodinger公司製)進行。
4)-2 設計方法
藉由作為CDR移植(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1989) 86,p.10029-10033)之一般而言為周知的方法,實施人類化抗HTLV-1抗體之構築。MAb1及MAb98之框架區域係於Kabat等人(Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service National Institutes of Health,Bethesda, MD.(1991))所定的人類κ鏈亞群1及人類κ鏈亞群4與人類γ鏈亞群3之一致序列(consensus sequence)具有高相同性,因而分別選擇彼等作為MAb1及MAb98之輕鏈與重鏈的接受者。應移入至接受者上的供予體殘基係參考Queen等人(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1989), 86,p.10029-10033)所給予的基準等而分析三維模型,起且因應各序列而獨立地設計。
4)-3 MAb1輕鏈之人類化
設計將人類IgG1之κ鏈恆定區接續於所設計的MAb1之人類化抗體輕鏈可變區的人類化抗體輕鏈,且作為接受者而將源自人類κ鏈亞群1者各自命名為hMAb1_L11、hMAb1_L12、hMAb1_L13,將源自人類κ鏈亞群4者各自命名為hMAb1_L41、hMAb1_L42、hMAb1_L43。將hMAb1_L11之全長胺基酸序列記載於序列識別號32。將編碼序列識別號32之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號31。將hMAb1_L12之全長胺基酸序列記載於序列識別號34。將編碼序列識別號34之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號33。將hMAb1_L13之全長胺基酸序列記載於序列識別號36。將編碼序列識別號36之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號35。將hMAb1_L41之全長胺基酸序列記載於序列識別號38。將編碼序列識別號38之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號37。將hMAb1_L42之全長胺基酸序列記載於序列識別號40。將編碼序列識別號40之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號39。將hMAb1_L43之全長胺基酸序列記載於序列識別號42。將編碼序列識別號42之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號41。亦各自將序列識別號31及序列識別號32之序列示於圖16,將序列識別號33及序列識別號34之序列示於圖17,將序列識別號35及序列識別號36之序列示於圖18,將序列識別號37及序列識別號38之序列示於圖19,將序列識別號39及序列識別號40之序列示於圖20,將序列識別號41及序列識別號42之序列示於圖21。
4)-4 MAb1重鏈之人類化
設計將人類IgG1之γ鏈恆定區接續於所設計的MAb1人類化抗體重鏈可變區的人類化抗體重鏈,且作為接受者而將源自人類γ鏈亞群3者分別命名為hMAb1_H1、hMAb1_H2。hMAb1_H1之全長胺基酸序列記載於序列識別號44。將編碼序列識別號44之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號43。將hMAb1_H2之全長胺基酸序列記載於序列識別號46。將編碼序列識別號46之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號45。亦各自將序列識別號43及序列識別號44之序列示於圖22,將序列識別號45及序列識別號46之序列示於圖23。
4)-5 MAb98輕鏈之人類化
設計將人類IgG1之κ鏈恆定區接續於所設計的MAb98之人類化抗體輕鏈可變區的人類化抗體輕鏈,且作為接受者而將源自人類κ鏈亞群1者各自命名為hMAb98_L11、hMAb98_L13,各自將源自人類κ鏈亞群4者命名為hMAb98_L41、hMAb98_L43。將hMAb98_L11之全長胺基酸序列記載於序列識別號48。將編碼序列識別號48之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號47。將hMAb98_L13之全長胺基酸序列記載於序列識別號50。將編碼序列識別號50之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號49。將hMAb98_L41之全長胺基酸序列記載於序列識別號52。將編碼序列識別號52之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號51。將hMAb98_L43之全長胺基酸序列記載於序列識別號54。將編碼序列識別號54之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號53。亦各自將序列識別號47及序列識別號48之序列示於圖24,將序列識別號49及序列識別號50之序列示於圖25,將序列識別號51及序列識別號52之序列示於圖26,將序列識別號53及序列識別號54之序列示於圖27。
4)-6 MAb98重鏈之人類化
設計將人類之IgG1之γ鏈恆定區接續於設計的MAb98之人類化抗體重鏈可變區的人類化抗體重鏈,各自命名為hMAb98_H2、hMAb98_H3。將hMAb98_H2之全長胺基酸序列記載於56。將編碼序列識別號56之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號55。將hMAb98_H3之全長胺基酸序列記載於58。將編碼序列識別號58之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號57。亦各自將序列識別號55及序列識別號56之序列示於圖28,將序列識別號57及序列識別號58之序列示於圖29。
4)-7 使用重鏈及輕鏈之組合的人類化抗體之設計
於MAb1中,將由hMAb1_H1及hMAb1_L11構成的抗體稱為「hMAb1_H1L11」。將由hMAb1_H1及hMAb1_L12構成的抗體稱為「hMAb1_H1L12」。將由hMAb1_H1及hMAb1_L13構成的抗體稱為「hMAb1_H1L13」。將由hMAb1_H1及hMAb1_L41構成的抗體稱為「hMAb1_H1L41」。將由hMAb1_H1及hMAb1_L42構成的抗體稱為「hMAb1_H1L42」。將由hMAb1_H1及hMAb1_L43構成的抗體稱為「hMAb1_H1L43」。將由hMAb1_H2及hMAb1_L11構成的抗體稱為「hMAb1_H2L11」。將由hMAb1_H2及hMAb1_L12構成的抗體稱為「hMAb1_H2L12」。將由hMAb1_H2及hMAb1_L13構成的抗體稱為「hMAb1_H2L13」。將由hMAb1_H2及hMAb1_L41構成的抗體稱為「hMAb1_H2L41」。將由hMAb1_H2及hMAb1_L42構成的抗體稱為「hMAb1_H2L42」。將由hMAb1_H2及hMAb1_L43構成的抗體稱為「hMAb1_H1L43」。
於MAb98中,將由hMAb98_H2及hMAb1_L43構成的抗體稱為「hMAb98_H2L43」。將由hMAb98_H3及hMAb98_L11構成的抗體稱為「hMAb98_H3L11」。將由hMAb98_H3及hMAb98_L13構成的抗體稱為「hMAb98_H3L13」。將由hMAb98_H3及hMAb98_L41構成的抗體稱為「hMAb98_H3L41」。
實施例5.人類化抗HTLV-1抗體之製作
5)-1 人類化抗HTLV-1抗體之輕鏈表現載體之構築
5)-1-1 hMAb1_L11表現載體之構築
合成序列識別號31所示的hMAb1_L11之核苷酸序列之核苷酸編號37~420所示的DNA片段(GENEART公司製)。以與實施例3)-5-1同樣之方法,構築hMAb1_L11表現載體。
5)-1-2 hMAb1_L12表現載體之構築
合成序列識別號33所示的hMAb1_L12之核苷酸序列之核苷酸編號37~420所示的DNA片段(GENEART公司製)。以與實施例3)-5-1同樣之方法,構築hMAb1_L12表現載體。
5)-1-3 hMAb1_L13表現載體之構築
合成序列識別號35所示的hMAb1_L13之核苷酸序列之核苷酸編號37~420所示的DNA片段(GENEART公司製)。以與實施例3)-5-1同樣之方法,構築hMAb1_L13表現載體。
5)-1-4 hMAb1_L41表現載體之構築
合成序列識別號37所示的hMAb1_L41之核苷酸序列之核苷酸編號37~420所示的DNA片段(GENEART公司製)。以與實施例3)-5-1同樣之方法,構築hMAb1_L41表現載體。
5)-1-5 hMAb1_L42表現載體之構築
合成序列識別號39所示的hMAb1_L42之核苷酸序列之核苷酸編號37~420所示的DNA片段(GENEART公司製)。以與實施例3)-5-1同樣之方法,構築hMAb1_L42表現載體。
5)-1-6 hMAb1_L43表現載體之構築
合成序列識別號41所示的hMAb1_L43之核苷酸序列之核苷酸編號37~420所示的DNA片段(GENEART公司製)。以與實施例3)-5-1同樣之方法,構築hMAb1_L43表現載體。
5)-1-7 hMAb98_L11表現載體之構築
合成序列識別號47所示的hMAb98_L11之核苷酸序列之核苷酸編號37~420所示的DNA片段(GENEART公司製)。以與實施例3)-5-1同樣之方法,構築hMAb98_L11表現載體。
5)-1-8 hMAb98_L13表現載體之構築
合成序列識別號49所示的hMAb98_L13之核苷酸序列之核苷酸編號37~420所示的DNA片段(GENEART公司製)。以與實施例3)-5-1同樣之方法,構築hMAb98_L13表現載體。
5)-1-9 hMAb98_L41表現載體之構築
合成序列識別號51所示的hMAb98_L41之核苷酸序列之核苷酸編號37~420所示的DNA片段(GENEART公司製)。以與實施例3)-5-1同樣之方法,構築hMAb98_L41表現載體。
5)-1-10 hMAb98_L43表現載體之構築
合成序列識別號53所示的hMAb98_L43之核苷酸序列之核苷酸編號37~420所示的DNA片段(GENEART公司製)。以與實施例3)-5-1同樣之方法,構築hMAb98_L43表現載體。
5)-2 人類化抗HTLV-1抗體之重鏈表現載體之構築
5)-2-1 hMAb1_H1表現載體之構築
合成序列識別號43所示的hMAb1_H1之核苷酸序列之核苷酸編號36~431所示的DNA片段(GENEART公司製)。以與實施例3)-5-2同樣之方法,構築hMAb1_H1表現載體。
5)-2-2 hMAb1_H2表現載體之構築
合成序列識別號45所示的hMAb1_H2之核苷酸序列之核苷酸編號36~431所示的DNA片段(GENEART公司製)。以與實施例3)-5-2同樣之方法,構築hMAb1_H2表現載體。
5)-2-3 hMAb98_H2表現載體之構築
合成序列識別號55所示的hMAb98_H2之核苷酸序列之核苷酸編號36~431所示的DNA片段(GENEART公司製)。以與實施例3)-5-2同樣之方法,構築hMAb98_H2表現載體。
5)-2-4 hMAb98_H3表現載體之構築
合成序列識別號57所示的hMAb98_H3之核苷酸序列之核苷酸編號36~431所示的DNA片段(GENEART公司製)。以與實施例3)-5-2同樣之方法,構築hMAb98_H3表現載體。
5)-3 人類化抗HTLV-1抗體之小規模生產
藉由對應實施例4)-7所示的H鏈與L鏈之組合的H鏈表現載體與L鏈表現載體之組合,而生產各種人類化抗體。
FreeStyle 293F細胞(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)係按照手冊,進行繼代、培養。將對數增殖期之1×10
7個FreeStyle 293F細胞以FreeStyle293 Expression Medium(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)稀釋成9.6mL後,接種於30mL Square Storage Bottle(Nalgene公司製)。將30μg之聚乙亞胺(Polyscience公司製)添加至Opti-Pro SFM培養基(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)200μL。接著,將4μg之重鏈表現載體及6μg之輕鏈表現載體添加至200μL之Opti-Pro SFM培養基。於聚乙亞胺/Opti-Pro SFM混合液,添加表現載體/Opti-Pro SFM混合液並平穩地攪拌,再放置5分鐘後,添加至FreeStyle 293F細胞。將於37℃、8% CO
2恆溫箱,於90rpm振盪培養7日而得之培養上清液以Minisart-Plus Filter(Sartorius公司製)過濾而作為純化用樣品。
5)-4 人類化抗HTLV-1抗體之小規模純化
將實施例5)-3中獲得的培養上清液,使用MonoSpin ProA管柱(GL Sciences公司製),按照手冊,將培養上清液裝載於管柱,進行洗淨・析出。
5)-5 人類化抗HTLV-1抗體之合胞體形成抑制活性評價
與實施例2)-3同樣地,於包含20U/mL IL-2、10% FBS、100U/mL青黴素、100μg/mL鏈黴素的RPMI1640培養基(SIGMA-ALDRICH公司製)存在下,將2×10
6細胞/mL之為源自健康人類的HTLV-1感染CD4陽性T細胞的YT#1細胞25μL、及實施例5)-4中製作的人類化抗HTLV-1抗體溶液(作為與CEM細胞混合後之濃度,hMAb1為4.69μg/mL,hMAb98為6.25μg/mL)50μL,於96孔盤懸浮5分鐘後,添加2×10
6細胞/mL之HTLV-1非感染CEM細胞25μL,並於5% CO
2恆溫箱內於37℃培養16小時。合胞體形成係以顯微鏡確認。其結果,所製作的人類化抗體16種類全部顯示抑制活性。於hMAb1中,自人類序列之取代度、輕鏈之接受者之種類,選出hMAb1_H1L11、hMAb1_H1L12、hMAb1_H1L42、hMAb1_H1L43之4種類,於hMAb98中亦以與hMAb1相同基準,選出hMAb98_H3L11、hMAb98_H3L41之2種類。
5)-6 人類化抗HTLV-1抗體之生產
藉由對應實施例4)-7所示的H鏈與L鏈之組合的H鏈表現載體與L鏈表現載體之組合,而生產hMAb1_H1L11、hMAb1_H1L12、hMAb1_H1L42、hMAb1_H1L43、hMAb98_H3L11、及hMAb98_H3L41。
FreeStyle 293F細胞(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)係按照手冊,進行繼代、培養。將對數增殖期之1.2×10
9個FreeStyle 293F細胞接種於3L Fernbach Erlenmeyer燒瓶(Corning公司製),以FreeStyle 293 Expression Medium(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)稀釋而調製成2.0×10
6細胞/mL。將1.8mg之聚乙亞胺(Polyscience公司製)添加至Opti-Pro SFM培養基(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)20mL。接著,將0.24mg之重鏈表現載體與0.36mg之輕鏈表現載體添加至20mL之Opti-Pro SFM培養基。於聚乙亞胺/Opti-Pro SFM混合液中,添加表現載體/Opti-Pro SFM混合液並平穩地攪拌,再放置5分鐘後,添加至FreeStyle 293F細胞。於37℃、8% CO
2恆溫箱中,4小時、90rpm振盪培養後,添加600mL之EX‐CELL VPRO培養基(SAFC Biosciences公司製)、18mL之GlutaMAX I(GIBCO公司製)、及30mL之Yeastolate Ultrafiltrate(GIBCO公司製),將於37℃、8% CO
2恆溫箱中,將於90rpm振盪培養7日而得之培養上清液以Disposable Capsule Filter (Advantec公司製)過濾。
5)-7 人類化抗HTLV-1抗體之純化
自實施例5)-6所獲得的培養上清液,以rProtein A親和性層析及陶瓷羥磷灰石之2階段步驟,將抗體純化。於將培養上清液供至填充有經PBS平衡化的MabSelect SuRe的管柱(Cytiva公司製)後,以管柱容量之2倍以上之PBS將管柱洗淨。接著,以2M L-精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0),將抗體析出。將含有抗體的流份藉由使用Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製)的透析,而進行對PBS的緩衝液取代,於以5mM磷酸鈉/50mM MES/pH7.0之緩衝液進行5倍稀釋後,供至經5mM NaPi/50mM MES/30mM NaCl/pH7.0之緩衝液平衡化的Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite Column(日本Bio-Rad公司製)。實施利用氯化鈉的直線的濃度梯度析出,收集含有抗體的流份。將此流份藉由使用Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette(ThermoFisher Scientific公司製)的透析,而進行對HBSor(25mM組胺酸/5%山梨醇、pH6.0)的緩衝液取代。以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(截流分子量10kDa,Sartorius公司製)將抗體濃縮,將IgG濃度調製成50mg/mL以上。最後,以Minisart-Plus Filter(Sartorius公司製)過濾,作為純化樣品。
實施例6.人類化抗HTLV-1抗體之活體外活性評價
6)-1 合胞體形成抑制活性評價
於包含20U/mL IL-2、10% FBS、100U/mL青黴素、100μg/mL鏈黴素的RPMI1640培養基(SIGMA-ALDRICH公司製)存在下,將2×10
6細胞/mL之源自健康人類的HTLV-1感染CD4陽性T細胞YT#1細胞25μL、及人類化抗HTLV-1抗體之稀釋系列溶液(作為與CEM細胞的混合後之濃度,為1.5、3、6、12μg/mL之4濃度系列)50μL,於96孔盤懸浮5分鐘後,添加2×10
6細胞/mL之HTLV-1非感染Jarkat細胞25μL,於37℃、5% CO
2的條件下,培養16小時。合胞體形成係以顯微鏡確認。將結果示於圖2。將於3μg/mL之濃度顯示合胞體形成抑制的hMAb1_H1L12,認定為具有最強合胞體形成抑制活性的抗體。
以同樣的實驗程序,評價hMAb1_H1L12與LAT-27之合胞體形成抑制活性。稀釋系列溶液之濃度設定係設為0.4、0.8、1.5、3、6μg/mL。將結果示於表2。由於相對於LAT-27僅於6μg/mL顯示抑制活性,而hMAb1_H1L12則於0.8μg/mL之濃度亦觀察到抑制活性,因此確認hMAb1_H1L12係與LAT-27比較而具有更強的合胞體形成抑制活性。
[表2]
人類化抗HTLV-1抗體(hMAb1_H1L12)及LAT-27之合胞體形成抑制活性
6 μg/mL | 3 μg/mL | 1.5 μg/mL | 0.8 μg/mL | 0.4 μg/mL | |
hMAb1_H1L12 | + | + | + | + | - |
LAT-27 | + | - | - | - | - |
6)-2 對HTLV-1 gp46抗原肽的結合性評價(SPR)
實施例5)-7中製作的hMAb1_H1L11、hMAb1_H1L12、hMAb1_H1L42、hMAb98_H3L41及LAT-27、與為抗原的HTLV-1 gp46肽180-204之結合活性,係使用Biacore T200(Cytiva公司製),將抗體作為配位體而進行固相化,將抗原作為分析物而進行測定。使用HBS-EP+(Cytiva公司製)作為Running buffer,使用Series S Sensor Chip CM5(Cytiva公司製)作為感測晶片。將以Amine Coupling Kit(Cytiva公司製)稀釋成5μg/mL的各人類化抗HTLV-1抗體及LAT-27,以10μL/分鐘添加360秒,而進行固相化。將抗原之稀釋系列溶液(由3μg/mL起3倍公比的8系列,對於LAT-27則為由27μg/mL起3倍公比的8系列),以流速10μL/分鐘添加1200秒,獲得結合時之反應。作為再生溶液,而以流速20μL/分鐘添加3M 氯化鎂(Cytiva公司製)30秒。使用親和性解析而算出的LAT-27之KD値為67.5nM。將其它人類化抗HTLV-1抗體之KD値示於表3。
[表3]
人類化抗HTLV-1抗體對HTLV-1 gp46抗原肽之結合活性 (SPR)
KD (nM) | |
hMAb1_H1L11 | 8.70 |
hMAb1_H1L12 | 5.80 |
hMAb1_H1L42 | 5.21 |
hMAb98_H3L41 | 41.7 |
6)-3 使用gp46部分肽的表位之鑑定(ELISA)
將由10殘基構成的gp46部分肽,從186~195號向羧基末端側各次位移1殘基,而到195~204號為止共計準備10種類。各自以PBS稀釋成5μg/mL,各添加50μL至96-Well ELISA Plates(Nunc公司製)後,於4℃固相化一晩。次日,去除平盤的緩衝液,以含0.05%Tween的PBS(T-PBS)洗淨2次後,各添加100μL之含1%明膠的T-PBS,於室溫靜置1小時。以T-PBS洗淨2次後,各添加5μL之抗HTLV-1抗體50μg/ml,於室溫靜置2小時。抗體之稀釋係以含0.2%BSA及0.05%Tween20的PBS(縮寫為AAD)進行。以T-PBS洗淨2次後,各添加50μL之以AAD稀釋500倍的HRP山羊抗大鼠IgG(最小X-反應性)抗體(Biolegend公司製)或HRP驢抗人類IgG (最小X-反應性)抗體(Biolegend公司製),於室溫靜置1小時。以T-PBS洗淨5次後,以75μL/孔添加高感度TMB(Sigma-Aldrich Japan公司製)。一邊偶而攪拌一邊進行呈色反應,添加50μL/孔2M HCl而使呈色反應停止後,以平盤讀取儀(Bio-Rad公司製)測定450nm之吸光度。將結果示於圖3。由於對胺基末端為193號以後的部分肽並未觀察到結合活性,且對羧基末端為196號以後的部分肽具有結合活性,因此確認gp46之第192~196號為表位。
6)-4 使用gp46部分肽之丙胺酸變異體的結合活性評價(ELISA)
使用由188~199號的12殘基構成,且將第191~196號各次以Ala取代1殘基而成的6種類之gp46部分肽(原本的肽序列為PPLLPHSNLDHI(序列識別號68),將191號至196號之LPHSNL各次以Ala取代1殘基而製造共計6種類之肽,BEX公司製)。於表4呈示原本的肽(1)及經取代的6種類之肽(2~7,各自為序列識別號69~74)之胺基酸序列。以與實施例6)-2相同的實驗程序,評價對LAT-27、rMAb1及hMAb1_H1L12之6種類之肽的親和性。將結果示於圖4。相對於rMAb1與hMAb1_H1L12係於6種類之變異體全部未觀察到親和性的減弱,而確認LAT-27藉由特別是以Ala取代192號之Pro、193號之His、195號之Asn,而對肽的親和性大幅地減弱。
[表4]
6)-5 活體外ADCC活性評價
於經放射線同位素51Cr標識的ATL-040(1-1)細胞中以10、5、2.5、1.25、0.625μg/ml之濃度添加hMAb1_H1L12後,以ATL-040(1-1)細胞之50倍的比率添加健康人類PBMC作為效應子細胞,於37℃、5%CO
2存在下培養16小時。使用伽馬計數器測定被釋放於上清液中的51Cr,獲得總釋放値。將以Triton X-100處理經51Cr標識的ATL-040(1-1)細胞所釋放的51Cr之測定値設為最大釋放値,將由未添加PBMC的抗體處理細胞所釋放的51Cr之測定値設為自發釋放値,由下述之式算出特異性釋放%,彙整於圖5。作為陰性對照樣品,而針對10μg/ml之經源自非感染者的人類IgG處理之樣品同樣地實施測定,並一起呈現。測定重複實施3次,算出平均値、標準偏差而一起呈現。
特異性釋放%=(總釋放-自發釋放)/最大釋放
於經hMAb1_H1L12處理之組中,係與經源自非感染者的人類IgG處理之組比較,而觀察到較高特異性釋放%,表示hMAb1_H1L12具有ADCC活性。
實施例7.抗HTLV-1抗體之活體內評價
7)-1 使用周邊血液單核細胞移植人類化小鼠的人類化抗HTLV-1抗體之感染預防評價
7)-1-1 使用流式細胞分析技術之源自HTLV-1的Tax基因之表現確認
於實驗使用前以SPF條件化馴養5-6週齡之雌NOG小鼠(NOD-SCID/γcnull、In-Vivo Science公司製)4~7日。對小鼠餵飼經滅菌的固形飼料(FR-2、Funabashi Farm公司製),給予經滅菌的自來水(添加5-15ppm次亞氯酸鈉溶液)。對NOG小鼠,每一隻各腹腔內投予0.5mL之稀釋於PBS而為4mg/mL之hMAb1_H1L12(n=6)或對照抗體(抗螢光素抗體,n=6),1日後,將源自ATL患者的CD4陽性T細胞株(026i細胞)(HTLV-1產生細胞,n=12,已完成投予抗HTLV-1抗體或對照抗體)或mock細胞(n=3,未投予抗體)以添加10%FCS的RPMI1640培養基(SIGMA-ALDRICH公司製)稀釋成5×10
6細胞/mL,腹腔內投予各0.5mL後,腹腔內投予各0.5mL之以相同培養基稀釋為4×10
7細胞/mL的人類末梢血單核細胞(Lonza公司製)。2週後,對經以二氧化碳氣體使其安樂死的NOG小鼠之腹腔,注射5mL之含5U/mL肝素的添加10%FCS的RPM11640培養基,將小鼠上下搖晃後,以注射器採集腹腔洗淨細胞。所取得的細胞,係添加含10% FBS的RPMI1640培養基並洗淨2次後,以成為1×10
6細胞/mL的方式再懸浮在於相同培養基中含50U/mL的IL-2(Milteny公司製)的RPMI1640培養基。於超低接著表面24孔U底微量盤(Sumitomo Bakelite公司製)中添加0.5mL/孔之細胞後,於37℃、5% CO
2的條件下靜置16小時。
將所培養的細胞於4℃以1200rpm離心5分鐘而去除上清液後,以200μL/孔之FACS緩衝液(含有0.2% BSA、0.1%疊氮化鈉的PBS)洗淨後,使其游離於100μL/孔之含1%多聚甲醛的PBS,於室溫固定10分鐘。之後,將細胞以200μL/孔之FACS緩衝液洗淨,使其游離於100μL/孔之含0.5%皂素的FACS緩衝液,添加5μL/孔之經PE標識的抗人類CD4抗體(OKT-4、Biolegend公司製)、及5μL/well之經Hilyte Fluor 647標識套組(同仁化學研究所公司製)標識的抗HTLV-1 Tax抗體,於室溫靜置30分鐘。之後,以200μL/孔之FACS緩衝液洗淨2次。於300μL/孔之含1%多聚甲醛的PBS中懸浮,以流式細胞分析技術FACSCalibur(Becton Dickinson公司製)測定。將結果示於圖6。於Mock細胞組及hMAb1_H1L12投予組並未檢測到Tax抗原,另一方面,於對照抗體投予組則檢測到Tax抗原,因此確認到抗HTLV-1抗體所致的HTLV-1感染之預防。
7)-1-2 使用PCR的HTLV-1原病毒之半定量
使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN公司製),從在7)-1-1中回收的1×10
6細胞/mL之腹腔洗淨細胞抽取基因體DNA。使用序列識別號64及65所示的檢測HTLV-1之pX區域的2種類引子、或序列識別號66及67所示的內在性對照用之檢測β-肌動蛋白區域的2種類引子而進行PCR。使含100ng之基因體DNA(約10
4細胞分)、引子及TaKaRa Ex Taq(Takara-Bio公司製)的反應液,以98℃-10秒、60℃-30秒、72℃-30秒、33次循環進行反應。所得之PCR產物係進行瓊脂糖凝膠電泳,以GelRed Nucleic Acid Gel Stain(Biotium公司製)染色。將結果示於圖7。於Mock細胞及hMAb1_H1L12投予組並未檢測到pX區域之帶,但對照抗體投予組中則檢測到,因此與實施例7)-1-1同樣地確認到抗HTLV-1抗體所致的HTLV-1感染之預防。
[產業上利用之可能性]
藉由使用本發明提供的抗體,而能夠防止HTLV-1之感染,及預防或治療HTLV-1感染成為原因的疾病、即成人T細胞白血病(Adult T-cell Leukemia:ATL)、HTLV-1相關的脊髓病(HTLV-1 Associated Myelopathy:HAM)、HTLV-1相關的葡萄膜炎(HTLV-1 associated Uveitis:HU)等之發病。
[序列表非關鍵詞文字]
序列識別號1:MAb1 CDRL1之胺基酸序列
序列識別號2:MAb1 CDRL2之胺基酸序列
序列識別號3:MAb1 CDRL3之胺基酸序列
序列識別號4:MAb98 CDRL1之胺基酸序列
序列識別號5:MAb98 CDRL2之胺基酸序列
序列識別號6:MAb98 CDRL3之胺基酸序列
序列識別號7:MAb1 CDRH1之胺基酸序列
序列識別號8:MAb1 CDRH2之胺基酸序列
序列識別號9:MAb1 CDRH3之胺基酸序列
序列識別號10:MAb98 CDRH1之胺基酸序列
序列識別號11:MAb98 CDRH2之胺基酸序列
序列識別號12:MAb98 CDRH3之胺基酸序列
序列識別號13:編碼rMAb1的輕鏈可變區之核苷酸序列
序列識別號14:編碼rMAb98的輕鏈可變區之核苷酸序列
序列識別號15:rMAb1的輕鏈可變區之胺基酸序列
序列識別號16:rMAb98的輕鏈可變區之胺基酸序列
序列識別號17:編碼rMAb1的重鏈可變區之核苷酸序列
序列識別號18:編碼rMAb98的重鏈可變區之核苷酸序列
序列識別號19:rMAb1的重鏈可變區之胺基酸序列
序列識別號20:rMAb98的重鏈可變區之胺基酸序列
序列識別號21:包含編碼人類輕鏈訊息序列及人類κ輕鏈之恆定區的核苷酸序列的DNA片段
序列識別號22:包含編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG1重鏈恆定區的核苷酸序列的DNA片段
序列識別號23:編碼cMAb1的輕鏈之核苷酸序列
序列識別號24:編碼cMAb98的輕鏈之核苷酸序列
序列識別號25:cMAb1的輕鏈之胺基酸序列
序列識別號26:cMAb98的輕鏈之胺基酸序列
序列識別號27:編碼cMAb1的重鏈之核苷酸序列
序列識別號28:編碼cMAb98的重鏈之核苷酸序列
序列識別號29:cMAb1的重鏈之胺基酸序列
序列識別號30:cMAb98的重鏈之胺基酸序列
序列識別號31:編碼hMAb1_L11之核苷酸序列
序列識別號32:hMAb1_L11之胺基酸序列
序列識別號33:編碼hMAb1_L12之核苷酸序列
序列識別號34:hMAb1_L12之胺基酸序列
序列識別號35:編碼hMAb1_L13之核苷酸序列
序列識別號36:hMAb1_L13之胺基酸序列
序列識別號37:編碼hMAb1_L41之核苷酸序列
序列識別號38:hMAb1_L41之胺基酸序列
序列識別號39:編碼hMAb1_L42之核苷酸序列
序列識別號40:hMAb1_L42之胺基酸序列
序列識別號41:編碼hMAb1_L43之核苷酸序列
序列識別號42:hMAb1_L43之胺基酸序列
序列識別號43:編碼hMAb1_H1之核苷酸序列
序列識別號44:hMAb1_H1之胺基酸序列
序列識別號45:編碼hMAb1_H2之核苷酸序列
序列識別號46:hMAb1_H2之胺基酸序列
序列識別號47:編碼hMAb98_L11之核苷酸序列
序列識別號48:hMAb98_L11之胺基酸序列
序列識別號49:編碼hMAb98_L13之核苷酸序列
序列識別號50:hMAb98_L13之胺基酸序列
序列識別號51:編碼hMAb98_L41之核苷酸序列
序列識別號52:hMAb98_L41之胺基酸序列
序列識別號53:編碼hMAb98_L43之核苷酸序列
序列識別號54:hMAb98_L43之胺基酸序列
序列識別號55:編碼hMAb98_H2之核苷酸序列
序列識別號56:hMAb98_H2之胺基酸序列
序列識別號57:編碼hMAb98_H3之核苷酸序列
序列識別號58:hMAb98_H3之胺基酸序列
序列識別號59:編碼gp62之核苷酸序列
序列識別號60:gp62之胺基酸序列
序列識別號61:gp46之胺基酸序列
序列識別號62:編碼GLUT1之核苷酸序列
序列識別號63:GLUT1之胺基酸序列
序列識別號64:用於HTLV-1原病毒檢測的正向引子之序列
序列識別號65:用於HTLV-1原病毒檢測的反向引子之序列
序列識別號66:作為內在性對照之用於β-肌動蛋白區域檢測的正向引子之序列
序列識別號67:作為內在性對照之用於β-肌動蛋白區域檢測的反向引子之序列
序列識別號68:gp46部分肽(188~199號之12殘基)之序列
序列識別號69:gp46部分肽(188~199號之12殘基)之序列第191號的L取代為Ala的序列
序列識別號70:gp46部分肽(188~199號之12殘基)之序列192號的P取代為Ala的序列
序列識別號71:gp46部分肽(188~199號之12殘基)之序列193號的H取代為Ala的序列
序列識別號72:gp46部分肽(188~199號之12殘基)之序列194號的S取代為Ala的序列
序列識別號73:gp46部分肽(188~199號之12殘基)之序列195號的N取代為Ala的序列
序列識別號74:gp46部分肽(188~199號之12殘基)之序列196號的L取代為Ala的序列
於本說明書引用的全部刊物、專利及專利申請案藉由直接引用而併入本說明書。
無。
圖1為對gp62表現細胞之結合活性(流式細胞分析技術)。
圖2為人類化抗HTLV-1抗體之合胞體形成抑制活性。A係作為活性判定之基準的顯微鏡觀察影像,B表示各抗體之合胞體形成抑制活性。
圖3為對將gp46部分區域各次位移1殘基而成的肽群組之結合活性(ELISA)。
圖4為對gp46部分肽各次1殘基變異導入丙胺酸而成的肽群組之結合活性(ELISA)。A表示所使用的肽之胺基酸序列,B表示LAT-27之結合活性,C表示rMAb1之結合活性,D表示hMAb1_H1L12之結合活性。
圖5為人類化抗HTLV-1抗體(hMAb1_H1L12)之ADCC活性。
圖6-1為周邊血液單核細胞移植人類化小鼠中的人類化抗HTLV-1抗體投予後源自HTLV-1的Tax基因之表現確認(流式細胞分析技術)(其1)。
圖6-2為周邊血液單核細胞移植人類化小鼠中的人類化抗HTLV-1抗體投予後源自HTLV-1的Tax基因之表現確認(流式細胞分析技術)(其2)。
圖6-3為周邊血液單核細胞移植人類化小鼠中的人類化抗HTLV-1抗體投予後源自HTLV-1的Tax基因之表現確認(流式細胞分析技術)(其3)。
圖7為周邊血液單核細胞移植人類化小鼠中的人類化抗HTLV-1抗體投予後之HTLV-1原病毒(provirus)之半定量(PCR)。A表示半定量的結果,B表示標準品(standard)的檢測帶(band)。
圖8為編碼rMAb1輕鏈可變區的核苷酸序列及rMAb1輕鏈可變區之胺基酸序列。
圖9為編碼rMAb1重鏈可變區的核苷酸序列及rMAb1重鏈可變區之胺基酸序列。
圖10為編碼rMAb98輕鏈可變區的核苷酸序列及rMAb98輕鏈可變區之胺基酸序列。
圖11為編碼rMAb98重鏈可變區的核苷酸序列及rMAb98重鏈可變區之胺基酸序列。
圖12為編碼cMAb1輕鏈的核苷酸序列及cMAb1輕鏈之胺基酸序列。
圖13為編碼cMAb1重鏈的核苷酸序列及cMAb1重鏈之胺基酸序列。
圖14為編碼cMAb98輕鏈的核苷酸序列及cMAb98輕鏈之胺基酸序列。
圖15為編碼cMAb98重鏈的核苷酸序列及cMAb98重鏈之胺基酸序列。
圖16為編碼hMAb1_L11的核苷酸序列及hMAb1_L11之胺基酸序列。
圖17為編碼hMAb1_L12的核苷酸序列及hMAb1_L12之胺基酸序列。
圖18為編碼hMAb1_L13的核苷酸序列及hMAb1_L13之胺基酸序列。
圖19為編碼hMAb1_L41的核苷酸序列及hMAb1_L41之胺基酸序列。
圖20為編碼hMAb1_L42的核苷酸序列及hMAb1_L42之胺基酸序列。
圖21為編碼hMAb1_L43的核苷酸序列及hMAb1_L43之胺基酸序列。
圖22為編碼hMAb1_H1的核苷酸序列及hMAb1_H1之胺基酸序列。
圖23為編碼hMAb1_H2的核苷酸序列及hMAb1_H2之胺基酸序列。
圖24為編碼hMAb98_L11的核苷酸序列及hMAb98_L11之胺基酸序列。
圖25為編碼hMAb98_L13的核苷酸序列及hMAb98_L13之胺基酸序列。
圖26為編碼hMAb98_L41的核苷酸序列及hMAb98_L41之胺基酸序列。
圖27為編碼hMAb98_L43的核苷酸序列及hMAb98_L43之胺基酸序列。
圖28為編碼hMAb98_H2的核苷酸序列及hMAb98_H2之胺基酸序列。
圖29為編碼hMAb98_H3的核苷酸序列及hMAb98_H3之胺基酸序列。
圖30為MAb1之CDR序列。
圖31為MAb98之CDR序列。
無。
Claims (39)
- 一種抗體,其具有下述(i)~(iv)之性質: (i)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的單株抗體; (ii)辨識由序列識別號61所表示的HTLV-1之套膜蛋白質gp46之胺基酸序列的第192~196號之胺基酸序列所構成的表位; (iii)對HTLV-1 gp46肽180~204號的結合解離常數(KD)為50nM以下;及 (iv)對將序列識別號61所表示HTLV-1的套膜蛋白質gp46之胺基酸序列的191~196號殘基各次以Ala取代1殘基而成的6種類之gp46部分肽的親和力,係與未經取代的gp46部分肽相同。
- 如請求項1之抗體,其對HTLV-1 gp46肽180~204號的結合解離常數(KD)為30nM以下。
- 如請求項1之抗體,其對HTLV-1 gp46肽180~204號的結合解離常數(KD)為10nM以下。
- 如請求項1至3中任一項之抗體,其進一步對HTLV-1感染細胞具有ADCC活性。
- 如請求項4之抗體,其進一步對HTLV-1具有中和活性。
- 如請求項5之抗體,其中中和活性為合胞體(syncytium)形成抑制活性,於4μg/mL以下之濃度顯示合胞體形成抑制活性。
- 如請求項6之抗體,其於2μg/mL以下之濃度顯示合胞體形成抑制活性。
- 如請求項6或7之抗體,其於1μg/mL以下之濃度顯示合胞體形成抑制活性。
- 如請求項1至8中任一項之抗體,其中該抗體為嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。
- 一種辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的單株抗體,其包含輕鏈以及重鏈, 該輕鏈包含: (a)由序列識別號1表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL1、 (b)由序列識別號2表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL2、及 (c)由序列識別號3表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL3; 該重鏈包含: (d)由序列識別號7表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH1、 (e)由序列識別號8表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH2、及 (f)由序列識別號9表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH3。
- 一種辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的單株抗體,其包含輕鏈可變區以及重鏈可變區, 該輕鏈可變區係: (ai)由序列識別號15表示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、或 (aii)由與序列識別號15表示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成,且具有對HTLV-1之結合活性的輕鏈可變區; 該重鏈可變區係: (bi)由序列識別號19表示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區、或 (bii)由與序列識別號19表示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成,且具有對HTLV-1之結合活性的重鏈可變區。
- 一種辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的單株抗體,其包含輕鏈以及重鏈, 該輕鏈包含: (a)由序列識別號4表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL1、 (b)由序列識別號5表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL2、及 (c)由序列識別號6表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDRL3; 該重鏈包含: (d)由序列識別號10表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH1、 (e)由序列識別號11表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH2、及 (f)由序列識別號12表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDRH3。
- 一種辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的單株抗體,其包含輕鏈可變區以及重鏈可變區, 該輕鏈可變區係: (ai)由序列識別號16表示的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區、或 (aii)由與序列識別號16表示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成,且具有對HTLV-1之結合活性的輕鏈可變區; 該重鏈可變區係: (bi)序列識別號20表示的胺基酸序列所構成的重鏈可變區、或 (bii)由與序列識別號20表示的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成,且具有對HTLV-1之結合活性的重鏈可變區。
- 一種以下之(1)~(24)中任一者之人類化抗HTLV-1抗體: (1)包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號32之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體; (2)包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號32之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體; (3)包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號34之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體; (4)包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號34之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體; (5)包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號36之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體; (6)包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號36之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體; (7)包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號38之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體; (8)包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號38之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體; (9)包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號40之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體; (10)包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號40之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體; (11)包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號42之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體; (12)包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號42之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體; (13)包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號32之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體; (14)包含由與由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號32之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體; (15)包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號34之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體; (16)包含由與由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號34之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體; (17)包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號36之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體; (18)包含由與由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號36之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體; (19)包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號38之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體; (20)包含由與由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號38之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體; (21)包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號40之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體; (22)包含由與由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號40之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體; (23)包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號42之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體;及 (24)包含由與由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號42之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈的抗體。
- 一種以下之(1)~(24)中任一者之人類化抗HTLV-1抗體: (1)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號32之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈; (2)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號32之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈; (3)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號34之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈; (4)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號34之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈; (5)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號36之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈; (6)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號36之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈; (7)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號38之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈; (8)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號38之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈; (9)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號40之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈; (10)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號40之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈; (11)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號42之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈; (12)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號42之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈; (13)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號32之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈; (14)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號32之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈; (15)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號34之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈; (16)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號34之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈; (17)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號36之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈; (18)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號36之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈; (19)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號38之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈; (20)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號38之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈; (21)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號40之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈; (22)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號40之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈; (23)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號42之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈;及 (24)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號46之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號42之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈。
- 一種以下之(1)~(8)中任一者之人類化抗HTLV-1抗體: (1)包含由序列識別號56之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號54之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈之抗體; (2)包含由與由序列識別號56之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號54之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈之抗體; (3)包含由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號48之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈之抗體; (4)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號48之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈; (5)包含由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號50之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈之抗體; (6)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號50之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈; (7)包含由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號52之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈之抗體;及 (8)包含由與由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號52之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈之抗體。
- 一種以下之(1)~(8)中任一者之人類化抗HTLV-1抗體: (1)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號56之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號54之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈; (2)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號56之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號54之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈; (3)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號48之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈; (4)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號48之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈; (5)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號50之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈; (6)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號50之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈; (7)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號52之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈;及 (8)辨識HTLV-1之套膜蛋白質gp46並與之結合的抗體,其包含由與由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的重鏈及由與由序列識別號52之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列具有95%以上之序列同一性的胺基酸序列所構成的輕鏈。
- 一種抗體,其包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號32之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈。
- 一種抗體,其包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號34之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈。
- 一種抗體,其包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號40之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈。
- 一種抗體,其包含由序列識別號44之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號42之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈。
- 一種抗體,其包含由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號48之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈。
- 一種抗體,其包含由序列識別號58之第20~468號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由序列識別號52之第21~240號之胺基酸殘基所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈。
- 如請求項1至23中任一項之抗體,其係包含羧基末端之1至數個胺基酸缺失的重鏈的抗體。
- 如請求項24之抗體,其於2條重鏈的雙方在羧基末端有1個胺基酸殘基缺失。
- 如請求項24或25之抗體,其中重鏈之羧基末端的脯胺酸殘基進一步被醯胺化。
- 一種多核苷酸,其包含編碼如請求項1至26中任一項之抗體之重鏈及輕鏈的胺基酸序列的核苷酸序列。
- 一種載體,其包含如請求項27之多核苷酸。
- 一種宿主細胞,其包含如請求項27之多核苷酸或如請求項28之載體。
- 一種如請求項1至26中任一項之抗體之製造方法,其包含培養如請求項29之宿主細胞,並自培養物純化抗體。
- 一種以如請求項30之方法所製造的抗體。
- 一種醫藥組成物,其含有如請求項1至26及31中任一項之抗體作為有效成分。
- 如請求項32之醫藥組成物,其用於防止對HTLV-1的感染。
- 如請求項33之醫藥組成物,其中感染為水平感染或母子間的垂直感染。
- 如請求項32之醫藥組成物,其用以對HTLV-1感染者,預防及治療起因於HTLV-1的疾病之發病,該疾病選自包含成人T細胞白血病・淋巴瘤(ATLL)、HTLV-1相關的脊髓病(HAM)及HTLV-1葡萄膜炎(HU)的群組。
- 如請求項33至35中任一項之醫藥組成物,其中HTLV-1為變異株。
- 一種醫藥組成物,其特徵為將如請求項1至26及31中任一項之抗體、以及至少一種抗癌劑,同時地、各別地或連續地投予至個體。
- 一種預防或治療起因於HTLV-1的疾病之發病之方法,其包含對HTLV-1感染者,投予如請求項1至26及31中任一項之抗體、以及如請求項32至37中任一項之醫藥組成物,而該起因於HTLV-1的疾病選自包含成人T細胞白血病・淋巴瘤(ATLL)、HTLV-1相關的脊髓病(HAM)及HTLV-1葡萄膜炎(HU)的群組。
- 如請求項38之方法,其中HTLV-1為變異株。
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